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UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
FACULTAD DE INGENIERÍA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIÓN
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
“EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA
EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA DE ACEITE DE MICROALGA
(Botryococcus braunii)”
LETICIA ALEJANDRA DURÁN MANOSALVA
2012
UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
FACULTAD DE INGENIERÍA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIÓN
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
“EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA
EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA DE ACEITE DE MICROALGA
(Botryococcus braunii)”
TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE
INGENIERO EN ALIMENTOS
Profesor Guía: Dr.Edgar Uquiche Carrasco
LETICIA ALEJANDRA DURÁN MANOSALVA
2012
“EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA
EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA DE ACEITE DE MICROALGA
(Botryococcus braunii)”
LETICIA ALEJANDRA DURÁN MANOSALVA
2012
COMISIÓN EXAMINADORA
EDGAR UQUICHE CARRASCO
Profesor guía
CAROLINA SHENE DE VIDTS XIMENA INOSTROZA HOFFMANN
Profesor examinador Profesor examinador
Nota trabajo escrito :
Nota examen :
Nota final :
RESUMEN
Las microalgas son una fuente importante de componentes naturales de alto valor biológico como
proteínas, pigmentos carotenoides, ácidos grasos, aminoácidos, etc. Estos componentes pueden
ser aislados y empleados como ingredientes funcionales en la industria farmacéutica, cosmética y
alimentaria. Actualmente, la tecnología de extracción con CO2 supercrítico (SC-CO2) se perfila
como una técnica innovadora para extraer y aislar estas sustancias, por ser más seguro que el
hexano (sin dejar restos de solvente), ser una tecnología amigable con el medio ambiente y
limpia, ofreciendo una alta calidad del producto final en comparación a los extractos obtenidos a
través de técnicas convencionales. Dentro de los factores que se deben considerar para este tipo
de extracción se encuentran la densidad del fluido, temperatura, presión, entre otros.
El objetivo principal de este trabajo fue estudiar el efecto de la temperatura y la densidad del SC-
CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extracción de aceite de microalga Botryococcus
braunii junto con evaluar el rendimiento y concentración de carotenoides, esteroles y tocoferoles
presentes en el extracto. Para ello, se realizaron extracciones basadas en un diseño central
compuesto rotatorio con 5 niveles de cada variable independiente (temperatura de extracción y
densidad SC-CO2), con 2 factoriales, 2 axiales y 1 punto central. De acuerdo a los resultados
obtenidos, el mayor rendimiento de extracción de aceite fue 87,0 g aceite/kg SS, obtenido a 69 °C
y 957 kg CO2/m3. En carotenoides el mayor rendimiento fue 1550,0 mg car/kg SS obtenido a 69
°C y 957 kg CO2/m3. En tocoferoles se observó la mayor concentración a 41 °C y 957 kg CO2/m
3
siendo ésta 18,0 g tocoferoles/ kg aceite. La mayor concentración de carotenoides se obtuvo a 69
°C y una densidad de 957 kg CO2/m3 y fue 17,0 g car/kg aceite. En cuanto a la concentración de
esteroles, la mayor concentración fue 23,0 g esteroles/ kg aceite obtenida a 41°C y 957 kg
CO2/m3 Las variables densidad SC-CO2 y temperatura de extracción afectaron significativamente
(p≤0,05) el rendimiento de extracción de aceite explicando su comportamiento en un 89% siendo
la temperatura el factor que más afectó el rendimiento con un 46,36% de contribución a la
respuesta.
Se agradece al Proyecto Corfo Desert Bioenergy 09CTEI-6860 por el financiamiento para la
realización de este trabajo.
INDICE DE CONTENIDOS
Página
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
1.1. Objetivos ............................................................................................................................................. 3
1.1.1. Objetivo general ............................................................................................................. 3
1.1.2. Objetivos específicos...................................................................................................... 3
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES ..................................................................... 4
2.1 Microalga (Botryococcus braunii). ...................................................................................................... 4
2.2 Lípidos ................................................................................................................................................. 5
2.3 Antioxidantes naturales ........................................................................................................................ 5
2.4 Importancia de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en la nutrición. ............................................ 6
2.4.1 Carotenoides .................................................................................................................... 6
2.4.2 Esteroles .......................................................................................................................... 7
2.4.3 Tocoferoles ...................................................................................................................... 8
2.5 Fluidos Supercríticos y sus propiedades .............................................................................................. 9
2.6 Extracción con FSC ........................................................................................................................... 10
2.7 Antecedentes de extracción con SC-CO2 en microalgas. ................................................................... 11
2.8 Aplicación industrial de FSC. ............................................................................................................ 11
2.8.1 Extracción de aceites esenciales .................................................................................... 12
2.8.2 Fraccionamiento de la grasa láctea ................................................................................ 13
2.8.3 Desalcoholización de bebidas alcohólicas .................................................................... 13
2.8.4 Obtención de sustancias antioxidantes a partir de microalgas. ..................................... 14
CAPÍTULO 3: MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................... 15
3.1. Materiales ......................................................................................................................................... 15
3.1.1 Materia prima ................................................................................................................ 15
3.1.2. Equipos e instrumentos ................................................................................................ 15
3.1.3. Material de vidrio y otros ............................................................................................. 15
3.1.4. Reactivos ...................................................................................................................... 16
3.2 Métodos de análisis ............................................................................................................................ 16
3.2.1. Determinación de humedad .......................................................................................... 16
3.2.2. Extracción de aceites utilizando SC-CO2 ..................................................................... 17
3.3. Análisis del aceite ............................................................................................................................. 17
3.3.1 Contenido de carotenoides totales ................................................................................. 17
3.3.2 Contenido de esteroles .................................................................................................. 18
3.3.3 Contenido de tocoferoles ............................................................................................... 19
3.4 Diseño de experimentos ..................................................................................................................... 20
3.4.1 Análisis estadístico ........................................................................................................ 20
CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 22
4.1 Contenido de humedad de la muestra inicial ..................................................................................... 22
4.2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de
las respuestas. ........................................................................................................................................... 22
4.3 Análisis estadístico ............................................................................................................................ 24
4.3.1. Análisis del rendimiento de extracción de aceite ......................................................... 26
4.3.2 Análisis de concentración de carotenoides.................................................................... 28
4.3.3 Análisis de concentración de esteroles .......................................................................... 29
4.3.4 Análisis de concentración de tocoferoles ...................................................................... 31
4.3.5 Análisis de rendimiento de extracción de carotenoides ................................................ 32
4.3.6 Rendimiento de extracción de esteroles ........................................................................ 34
4.3.7 Rendimiento de extracción de tocoferoles .................................................................... 35
4.4 Discusión General .............................................................................................................................. 37
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 39
BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 42
ANEXOS ...................................................................................................................................... 51
Anexo A. Determinación de la humedad del sustrato .......................... ¡Error! Marcador no definido.51
Anexo B. Determinación del rendimiento de extracción de aceite de microalga B. braunii. ......... ¡Error!
Marcador no definido.52
Anexo C. Determinación de la cinética de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). . 58
Anexo. D Análisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii). .................................... 64
Anexo E Análisis Estadístico…...……………………………………………..………………………..67
INDIDE DE TABLAS
Página
Tabla 2.1.Condiciones de extracción con CO2 supercrítico utilizadas en algunas especies de
algas y microalgas....................................................................................................... 12
Tabla 3.1. Diseño experimental Central Compuesto Rotatorio. .................................................. 22
Tabla 4.1 Rendimiento de extracción y concentración de carotenoides, esteroles y tocoferoles
con CO2 supercrítico. .................................................................................................. 23
Tabla 4.2. Tabla de análisis de varianza para el modelo cuadrático ............................................ 24
Tabla 4.3. Indicadores estadísticos para el modelo de superficie de respuesta ............................ 26
Tabla A-1. Determinación de la humedad del sustrato………………………………...………...51
Tabla B-1.Extracción de aceite de microalga B. braunii a 45 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 1…………………………………………………………………………….52
Tabla B-2. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 65 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 2)...………………………………………………………………………….52
Tabla B-3. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 45 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 3)…………...……………………………………………………………….53
Tabla B-4. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 65 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 4)…………………...……………………………………………………….53
Tabla B-5. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 41 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 5)………...………………………………………………………………….54
Tabla B-6. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 69 °C y 900 kg CO2/m3
(punto de
diseño 6)……………...…………………………………………………………….54
Tabla B-7. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 843 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 7)…………...……………………………………………………………….55
Tabla B-8. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 957 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 8)………...………………………………………………………………….55
Tabla B-9. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 9)………...………………………………………………………………….56
Tabla B-10. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de
diseño (10)…..……………………………………………………………………...56
Tabla B-11 Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 11)…………….…………………………………………………….....……57
Tabla B-12 Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de
diseño 12)………….………………………………………………………..……...57
Tabla D-1 Datos curva de calibración para la concentración de carotenoides en el aceite de
microalga B. braunii……………………………………………...………………...64
Tabla D-2 Datos curva de calibración para la concentración de esteroles en el aceite de microalga
B. braunii. ………………………….………………….…………………………….65
Tabla D-3 Datos curva de calibración para la concentración de tocoferoles en aceite de microalga
(Botryococcus braunii)……….…...……………….………….………………..……66
Tabla E-1. Análisis de varianza para el rendimiento de extracción de aceite…………………...70
Tabla E-2. Análisis de varianza para la concentración de carotenoides en el aceite. …………...71
Tabla E-3. Análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite………………...71
Tabla E-4. Análisis de varianza para la concentración de tocoferoles en el aceite……………...72
Tabla E-5. Análisis del rendimiento de carotenoides……………………………………………72
Tabla E-6. Análisis del rendimiento de esteroles………………………………………………..73
Tabla E-7. Análisis del rendimiento de tocoferoles……………………………………………..73
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 2.1. Forma estructural B. braunii………………...………………………………………..4
Figura 2.2. Diagrama de fases que muestra la región de un fluido supercrítico………………….9
Figura 4.1 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de aceite (Y1) como función de
la temperatura (ºC) y densidad (kg CO2/m3). ............................................................. 27
Figura 4.2. Superficie de respuesta de la concentración de carotenoides (Y2) como función de la
temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 29
Figura 4.3. Superficie de respuesta de la concentración de esteroles (Y3) como función de la
temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 30
Figura 4.4. Superficie de respuesta de la concentración de tocoferoles (Y4) como función de la
temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 32
Figura 4.5. Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) como
función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3) ............................................ 33
Figura 4.6. Superficie de respuesta de la rendimiento de extracción esteroles (Y6) como función
de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). ........................................................ 35
Figura 4.7. Superficie de respuesta del rendimiento de tocoferoles (Y7) como función de la
temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 36
Figura C-1. Curva cinética de extracción a 45 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseño 1)……....58
Figura C-2. Curva cinética de extracción a 65 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseño 2)……....58
Figura C-3. Curva cinética de extracción a 45 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseño 3)……....59
Figura C-4. Curva cinética de extracción a 65 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseño 4)…..…..59
Figura C-5. Curva cinética de extracción a 41 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 5)….…...60
Figura C-6. Curva cinética de extracción a 69 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño).………..60
Figura C-7. Curva cinética de extracción a 55 °C y 843 kg CO2/m3 (Punto de diseño).….…….61
Figura C-8. Curva cinética de extracción a 55 °C y 957 kg CO2/m3 (Punto de diseño 8)………61
Figura C-9. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 9)……....62
Figura C-10. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 10)……62
Figura C-11. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 11)...….63
Figura C-12. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 12)…....63
Figura D-1. Curva calibración carotenoides totales……………………………………………..64
Figura D-2. Curva de calibración esteroles totales………………………………………………65
Figura D-3. Curva de calibración para tocoferoles totales………………………………………66
Figura E-1. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extracción de aceite
(Y1)……………………………………………………………………………………………….67
Figura E-2. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de carotenoides (Y2).
................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.67
Figura E-3. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de esteroles (Y3).
................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.68
Figura E-4. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4).
................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.68
Figura E-5. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5). .. 69
Figura E-6. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6) ......... 69
Figura E-7. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7).
................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.70
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
Capítulo 1. Introducción
Efecto de la densidad y temperatura deCO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii) 1
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
Actualmente existe una tendencia del consumidor por cambiar continuamente de gustos y escoger
productos innovadores, saludables y atractivos a la vista, lo cual es una señal de alerta en la
industria alimentaria que día a día busca la forma de satisfacer las demandas del mercado. Es por
ello, que resulta necesario buscar nuevas metodologías para desarrollar y extraer compuestos
altamente beneficiosos, por ejemplo: esteroles, carotenoides, tocoferoles, entre otros a partir de
sustancias naturales. Estos compuestos actúan en una o varias funciones del organismo, de modo
específico y positivo, contribuyendo a mantener y/o mejorar el estado de salud y reducir el riesgo
de sufrir determinadas enfermedades o alteraciones (Palou et al., 2005). Estos ingredientes son
preferidos por los consumidores debido a su origen natural, tales como plantas, subproductos de
alimentos o incluso algas y microalgas, las cuales están recibiendo mucha atención, debido a su
capacidad de realizar fotosíntesis y a su adaptación a la vida en medios marinos o en aguas
continentales (Mendiola, 2008).
Las algas en general han desarrollado compuestos de gran interés para la industria alimentaria,
pueden ser empleadas como fuente de ingredientes funcionales, ya que son reconocidas como una
importante fuente renovable de lípidos bioactivos con una alta proporción de ácidos grasos
poliinsaturados (PUFA, β-caroteno y otros pigmentos (antioxidantes), polisacáridos
sulfatados (antivirales) y esteroles) (Herrero et al., 2006).
Para la extracción de aceite a partir de microalgas, la tecnología con CO2 supercrítico (SC-CO2)
se mira con interés, por ser más seguro que el hexano, ser una tecnología amigable con el medio
ambiente y limpia, ofreciendo un tiempo de extracción corto y alta calidad del producto final
(Andrich et al., 2005).
La extracción con fluido supercrítico (EFS) es una operación unitaria que aprovecha el poder
solvente de los fluidos supercríticos en condiciones por encima de su temperatura y presión
crítica (31,1 °C y 7,9 MPa). Tiene las características tanto de un gas como de un líquido, su poder
solvente depende sólo de su densidad, la cual puede ajustarse fácilmente combinando las
variables presión y temperatura. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades
solventes de un fluido supercrítico; ya que, están ligados a la solubilidad y de este modo, la
selectividad del fluido puede ser modificada de acuerdo a los componentes que se requieran
Capítulo 1. Introducción
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 2
extraer y para ello es necesario realizar pequeños cambios en las variables de presión y
temperatura del flujo solvente. Además, la temperatura tiene un efecto positivo sobre la
volatilidad del soluto. Se espera que a mayor temperatura, se aumente la presión de vapor del
soluto y de esta forma se mejore la transferencia del soluto a la fase supercrítica. Por otra parte,
se ha señalado que la solubilidad de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en el SC-CO2
aumenta con la densidad a temperatura constante y viceversa (Saldaña et al., 2010).
El presente trabajo de título tiene como objetivo estudiar el efecto de la temperatura de extracción
y densidad del CO2 supercrítico, sobre el rendimiento de extracción de aceite y velocidad de
extracción de microalga (Botryococcus braunii) incluyendo las características químicas del
extracto obtenido mediante la determinación del contenido de carotenoides, esteroles y
tocoferoles. Se empleará un diseño central compuesto rotatorio para la realización de los ensayos
de extracción y obtención de resultados experimentales, los que serán analizados con la
Metodología Superficie de Respuesta.
Capítulo 1. Introducción
Efecto de la densidad y temperatura de CO2sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 3
1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo general
Estudiar el efecto de la temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de la velocidad
y rendimiento de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii) usando CO2
supercrítico.
1.1.2. Objetivos específicos
Estudiar el efecto de la temperatura de extracción y densidad de CO2 sobre la velocidad y el
rendimiento de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii).
Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de
extracción de carotenoides, esteroles y tocoferoles.
Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la concentración de
carotenoides, esteroles y tocoferoles.
Caracterizar el aceite de microalga obtenido bajo condiciones de extracción seleccionadas.
CAPÍTULO 2
ANTECEDENTES GENERALES
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 4
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES
2.1 Microalga (Botryococcus braunii).
Existen al menos 30.000 especies conocidas de microalgas, tanto de agua dulce como salada,
pero sólo unas cuantas son de importancia comercial donde se incluyen: Chlorella, Spirulina,
Dunaliella, Haematococcus, Botryococcus, entre otras, a partir de las cuales se extraen
componentes de alto valor biológico como proteínas, pigmentos, vitaminas, minerales, enzimas
y ácidos grasos. El número de especies de color azul-verde es muy grande y se caracteriza por
tener un alto contenido de lípidos (Loera-Quezada y Olguín, 2010), además, algunas especies
marinas como Isochrysis, Nannochloropsis, Skeletonema, Chaetoceros etc., también se utilizan
para la alimentación de moluscos u otros propósitos de acuicultura (Bruton et al., 2009).
La microalga verde Botryococcus braunii es una especie de agua dulce perteneciente a la
familia Chlorophyceae, se distribuye en oligotróficos y eutróficos y según Fang et al. (2004),
posee niveles inusualmente altos de ácidos grasos libres. El verde alga colonial de esta microalga
(Figura 2.1) es bien conocido por su alto contenido de hidrocarburos, y se ha propuesto como una
fuente renovable para las necesidades futuras de energía en beneficio de la protección del medio
ambiente, ya que dentro de sus ventajas se encuentra su cultivo, que puede ser en agua de mar, en
agua salobre o en aguas residuales, creciendo en una amplia variedad de climas no compitiendo
por el agua dulce ni suelos requeridos para la producción de alimentos (Loera-Quezada y Olguín,
2010).
Figura 2.1. Forma estructural B.braunii (Barker et al., 2012).
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 5
2.2 Lípidos
El contenido de lípidos en las microalgas oleaginosas se encuentra dentro de un 20 a 50%,
llegando a alcanzar un 70% de la biomasa seca cuando las células están sometidas a condiciones
de estrés fisiológico o un medio ambiente desfavorable en cuanto a la limitación de nutrientes (Li
et al., 2008; Dorval et al., 2009). El contenido de lípidos, su composición y las proporción de los
diversos ácidos grasos en una microalga puede variar, ya que éstos pueden ser afectados por una
serie de variables ambientales como: intensidad de luz y fotoperiodo, temperatura, salinidad,
concentración de dióxido de carbono, concentración de nitrógeno, fósforo y la intensidad de la
radiación UV-B (Mansour et al., 2003).
Ahlgren et al. (1992) analizaron los ácidos grasos en 24 muestras de microalgas de un grupo
verde-azul (por ejemplo, Oscillatoria y Microcystis) procedentes de diferentes lotes de cultivos
continuos y en diversas fases de crecimiento. Encontraron altas cantidades de ácidos grasos de
18 carbonos de la familia ω-3 y ω-6, así como también, en el grupo de flagelados (grupo
taxonómicamente diverso) encontraron altas cantidades de ácidos grasos poliinsaturado de
cadena larga (20-22 carbonos), especialmente del tipo ω-3. Se determinó una relación ω3/ω6 más
alta en las algas en la fase de crecimiento exponencial. Las familias ω-6 y ω-3 destacan por sus
importantes funciones fisiológicas, como por ejemplo, son necesarios para el crecimiento y
desarrollo del sistema nervioso central y la retina, y el correcto funcionamiento del sistema
cardiovascular (Sahena et al., 2009).
Se han determinado los principales ácidos grasos que constituyen los lípidos de la microalga
verde B. braunii estos son: 2,3% ácido láurico (C12:0), 2,87% ácido mirístico (C14:0), 4,32%
ácido esteárico (C18:0), 13,2% ácido linolénico (C18:3), 14,5% ácido linoleico (C18:2), 22,3%
ácido oleico (C18:1) y finalmente 40,6% de ácido palmítico (C16:0) (Dayananda et al., 2007). La
investigación realizada por Dayananda et al. (2007) fue similar a las observaciones realizadas por
Fang et al. (2004) ya que ambas informan que el ácido palmítico y ácido oleico son los
principales ácidos grasos presentes en la microalga Botryococcus braunii.
2.3 Antioxidantes naturales
Los antioxidantes naturales están ampliamente distribuidos en la naturaleza formando parte de
semillas, frutos, hojas, raíces, etc. de una amplia variedad de plantas (Valenzuela et al., 2000)
presentándose como compuestos fenólicos, compuestos nitrogenados, flavonoides, tocoferoles,
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 6
aminas, o carotenoides. Una fuente inagotable de exploración es el mar y su biodiversidad, siendo
las algas marinas uno de los recursos potenciales de dichos compuestos, ya que se ha informado
que la actividad antioxidante de los extractos de algas depende de los componentes químicos de
los extractos que principalmente consisten en carotenoides, polifenoles, tocoferoles y vitamina C
(Díaz, 2012).
2.4 Importancia de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en la nutrición.
2.4.1 Carotenoides
Los colores rojo, amarillo y naranjo en muchos vegetales son originados por la presencia de
carotenoides, pigmentos de origen vegetal que se clasifican dentro de los pigmentos liposolubles.
Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos de
carbono, en su mayoría son solubles en solventes apolares, se clasifican en dos grupos: carotenos
y xantofilas. Los carotenos solo contienen carbono e hidrógeno (por ejemplo el ß-caroteno, el
licopeno, etc.), mientras que las xantofilas contienen además oxígeno (por ejemplo la luteína).
(Yeverino, 1997).
Los carotenoides debido a la alta conjugación de enlaces dobles presentes en sus moléculas se
descomponen por efecto de la luz, la temperatura y el aire. La luz favorece reacciones
fotoquímicas que cambian la estructura original del carotenoide (por ejemplo isomerismo cis y
trans), el calor también favorece reacciones térmicas de degradación y finalmente el aire debido
al oxígeno favorece la oxigenación de los enlaces dobles a funciones epóxido, hidroxilos y
peróxidos, entre otros (Martínez, 2003). Es debido a estas razones que la extracción de
carotenoides se debe realizar preferentemente en condiciones de ausencia de luz, a temperatura
ambiente o menor, y en ausencia de oxígeno, realizándose a partir de tejidos frescos, para evitar
la degradación por la acción conjunta de estos factores adversos.
Los carotenoides son muy utilizados como pigmentos y antioxidantes en diversos sectores
industriales, principalmente en la industria farmacéutica, nutracéutica y alimentaria. En los
últimos años se ha conducido a estimular la producción de carotenoides procedentes de
microalgas para su uso como colorantes y aditivos naturales (Mendiola 2008). Entre las
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 7
microalgas con mayor potencial para la producción de carotenoides se encuentran, Dunaliella
salina, Dunaliella viridis, Haematococcus y Chlorococcum (García, 1998).
Los carotenoides que se encuentran frecuentemente en las microalgas incluyen: astaxantina, β-
caroteno, cantaxantina, equinenona, luteína, neoxantina, violaxantina y zeaxantina.
(Abrahamsson et al., 2012). Entre las principales fuentes naturales de astaxantina está la
microalga Haematococcus pluvialis que tiene la capacidad de acumularla en altas
concentraciones (2 a 5% en base seca) (Borowitzka et al., 1991). Otro estudio realizado en
Spirulina platensis informa que contiene 5,53 mg/g de carotenoides totales dentro de los cuales
se identificaron cantaxantina, equinenona, mixoxantina y zeaxantina (Marquez et al., 1995).
2.4.2 Esteroles
Los esteroles se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y vegetal; y se les
encuentra en forma libre, como ésteres o como glicósidos, se caracterizan por ser sustancias
esteroideas en cuya estructura química aparece una agrupación de cuatro anillos, específica del
sistema fenantreno, portador del grupo OH en posición C-3 que le permite estar enlazado a
moléculas de ácidos grasos (Bello, 2000). La mayoría de esteroles naturales poseen una cadena
lateral de 8 a 10 átomos de carbono y un enlace doble en el C-5.
El gran interés despertado por los alimentos enriquecidos con esteroles vegetales se debe,
principalmente, a que disminuyen las concentraciones sanguíneas de colesterol, sin efectos
adversos colaterales. Por lo tanto, el aumento de la cantidad de esteroles vegetales en una
variedad de alimentos puede ser una ayuda importante en la protección de las personas con
hipercolesterolemia frente a la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares relacionadas,
causa principal de la mortalidad en las sociedades más desarrolladas (Palou et al., 2005).
En cuanto a las microalgas existen estudios que señalan que a partir de las especies Scenedesmus
obliquus y Navicula pelliculosa se obtienen esteroles precursores de la hormona cortisona,
hormona que reduce la inflamación, evitando que los glóbulos blancos (leucocitos
polimorfonucleares) viajen a la zona de inflamación del cuerpo (Molina y Morales, 2008).
Volkman et al., (1994.) estudiaron el contenido de esteroles en cinco especies de algas y
microalgas (viz. Tetraselmis chui, cordata Pyramimonas, pusilla Micromonas, Micromonas aff
pusilla. y provasolii Pycnococcus) las cuales se analizaron por cromatografía de gases y
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 8
espectrometría de masa. Los principales esteroles encontrados fueron: 24-methylcholesta-5, 24
(28)-dien-3β-ol, 24-methylcholest-5-en-3β-ol y 24-ethylcholesta-5 y 24 Methylcholest-5-en-3β-ol
entre otros.
2.4.3 Tocoferoles
Solamente los organismos fotosintéticos sintetizan tocoferoles, encontrándose presentes en
semillas oleaginosas, hojas y otras partes de plantas verdes de plantas superiores. Los tocoferoles
y tocotrienoles engloban un grupo de 8 compuestos liposolubles que reciben el nombre genérico
de vitamina E, con carácter esencial reconocido hace más de 40 años. Los tocoferoles tienen una
estructura química que consiste en dos anillos, uno fenólico y otro heterocíclico y una cadena
lateral de 16 átomos de carbono saturada. Dependiendo del número y la posición de los grupos
metilo en el anillo fenólico, estos compuestos se denominan como α-, β- γ y σ- tocoferoles (Calvo
et al., 2011). El α-tocoferol es el más abundante en la dieta y el que presenta mayor actividad
antioxidante in vivo.
La “vitamina E” es un término genérico que describe un grupo de antioxidantes que incluye los
tocoferoles y tocotrienoles. La vitamina E o α -tocoferol, presenta un gran interés debido a que es
una vitamina liposoluble que actúa como antioxidante, es decir, defiende las células reduciendo el
estrés oxidativo, estimula el sistema inmunológico y se ha comprobado que detiene el desarrollo
del Alzheimer. Además, ayuda a reducir los niveles de colesterol en la prevención de trombos en
las arterias es aún discutible (Belitz y Grosch, 1997).
El contenido de α-tocoferol en microalgas se ve afectado tanto por la fuente de nitrógeno de la
cual se alimenta y el tiempo de cosecha. Durmaz, (2007) evaluó el contenido de α-tocoferol en la
microalga Nannochloropsis oculata registrando una concentración de 2326 ± 39 mg g-1
(peso
seco), donde, además pudo predecir un aumento de la producción de α-tocoferol durante el ciclo
de vida debido a la necesidad de la microalga por obtener antioxidantes durante el proceso de
envejecimiento. Otra investigación realizada por Mendiola et al. (2008) determinaron el
contenido de α-tocoferol en Spirulina platensis, con valores que van desde 0,011 hasta 0,014 mg
de tocoferol/g Spirulina seca.
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 9
2.5 Fluidos Supercríticos (FSC) y sus propiedades
Un FSC es un material que se encuentra en condiciones de presión y temperatura por encima de
sus valores correspondientes de presión crítica (pc) y temperatura crítica (Tc). La pc es la presión
por encima de la cual el gas no condensa al disminuir la temperatura isobáricamente y la Tc es la
temperatura por encima de la cual el gas no condensa al aumentar la presión isotérmicamente (del
Valle y Aguilera, 1999). Los FSC poseen diferentes propiedades físico-químicas, entre las que
destaca: densidad, viscosidad y difusividad, las que se encuentran en rangos de valores
intermedios entre líquidos y gases (Figura 2.2); es debido a su baja viscosidad, difusividad
relativamente alta y poder solvente que los líquidos supercríticos tienen mejores propiedades de
transporte y penetrabilidad que los líquidos y, por lo tanto, pueden obtener mejores rendimientos
de extracción, por lo tanto, una de las principales características de un FSC es la posibilidad de
modificar la densidad del fluido, cambiando la presión y/o temperatura, ya que la densidad está
directamente relacionada con la solubilidad (del Valle y Aguilera, 1999), mediante la alteración
de la presión de extracción, la fuerza disolvente del fluido puede ser modificada.
Figura 2.2. Diagrama de fases que muestra la región de un FSC.
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 10
Otras ventajas, en comparación a otras técnicas de extracción, son el uso de disolventes
generalmente reconocido como seguro (GRAS), y alta eficiencia del proceso de extracción (en
términos de aumento de los rendimientos y la posibilidad de acoplamiento directo con técnicas de
análisis cromatográficas tales como cromatografía de gases (GC) o cromatografía de FSC)
(Herrero et al., 2006). En general, la EFS en lugar de extracciones tipo Sohxlet es justificada por
la reducción de los tiempos de extracción, por la selectividad que se puede llegar a obtener de
acuerdo a las condiciones de extracción y además, la eliminación de posibles compuestos que
puedan intervenir en el análisis (Mendiola, 2008).
2.6 Extracción con FSC
El CO2 es el FSC más utilizado en EFS debido a que es no tóxico, no inflamable, no corrosivo,
incoloro, no es costoso, se elimina fácilmente, no deja residuos, sus condiciones críticas son
relativamente fáciles de alcanzar y se consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar
a baja temperatura; por tanto, se pueden separar compuestos termo-sensibles (del Valle y
Aguilera, 1999).
En la EFS, además de seleccionar el solvente (fluido supercrítico), se deben considerar diversas
variables que influyen significativamente en la operación de extracción. Las principales variables
a tener en cuenta son: presión y temperatura que determinan la densidad del fluido, velocidad del
fluido, tamaño de partícula, humedad de la muestra, entre otros. La densidad del fluido por sobre
sus condiciones supercríticas (31,1 °C y 7,9 MPa), está estrechamente relacionada con los
cambios de presión y temperatura, debido a que un cambio en estas variables modifica su
magnitud. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades solventes del FSC ya que,
la densidad está ligada a la solubilidad y de este modo, la selectividad del fluido puede ser
modificada de acuerdo a los componentes que se requieran extraer. Esta propiedad hace que los
FSC sean solventes muy versátiles y que se pueden aplicar en la extracción de diversos
componentes naturales de materiales biológicos (Luque de Castro et al., 1993).
El efecto significativo de la presión sobre el rendimiento de extracción (g soluto/g sustrato seco)
se debe al aumento de la solubilidad de aceites y pigmentos carotenoides como también al
incremento del poder solvente del SC-CO2 (Li et al., 2010).
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 11
Al aumentar la temperatura permite aumentar el rendimiento de extracción debido al incremento
en la presión de vapor del soluto, aumenta la solubilidad permitiendo una mejor transferencia
desde el sustrato hacia la fase supercrítica, aumentando la velocidad de extracción (del Valle et
al., 2001). Otras variables que influyen son la humedad y el tamaño de partícula del sustrato, la
velocidad de flujo de solvente, el consumo específico de solvente. Se ha recomendado que los
sustratos posean una baja humedad, puesto que el agua reduce el poder solvente del CO2 a
condiciones supercríticas inhibiendo el contacto entre el SC-CO2 y el sustrato (Li et al., 2010).
Para conseguir una mejor velocidad de extracción y más completa posible del sustrato sólido, se
tiene que ofrecer al disolvente superficies de intercambio grandes y recorridos de difusión cortos.
Esto se puede lograr a través de la molienda de la matriz. Las muestras sólidas de diferente
granulometría deben ser molturadas para homogeneizar el tamaño de partícula, y, por ende, evitar
la variabilidad originada por la frecuente diferencia en composición de las porciones que tienen
distinto tamaño (Luque de Castro et al., 1993).
2.7 Antecedentes de extracción con SC-CO2 en microalgas.
En la Tabla 2.1 se observan algunas condiciones de las variables presión, temperatura y densidad
de CO2 que se han utilizado para extraer y analizar el aceite de diferentes microalgas. Se observa
que las temperaturas utilizadas están dentro de un rango de 40-85 ºC siendo las temperaturas
cercanas a 40 ºC las más utilizadas, ya que, en la gran mayoría se necesitan extraer componentes
termolábiles y a esta temperatura no van a ser perjudicados.
Las investigaciones expuestas utilizan diferentes rangos de presión, lo cual se debe a los
componentes que se desean extraer; por ejemplo, en el caso de Mendes et al. (2003) utilizan
presiones entre 125 y 300 bar para la extracción de hidrocarburos los cuales son altamente
volátiles y por lo tanto de menor peso molecular, en cambio, Andrich et al. (2005) utiliza un
rango de presión 550-700 bar para la extracción de lípidos, los cuales tienen un alto peso
molecular.
2.8 Aplicación industrial de FSC.
Los FSC se están utilizando a escala industrial principalmente en los sectores agroalimentario,
químico, farmacéutico, y cosmético. Entre otras aplicaciones se dirigen a la obtención de
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 12
extractos herbales a partir de plantas aromáticas, de extractos de especias para colorantes
alimentarios, aceites esenciales, etc. (Tornero, 2011).
2.8.1 Extracción de aceites esenciales
La extracción de aceites esenciales y especias con SC-CO2 es la aplicación industrial más
extendida, produciéndose más de 60.000 ton/año por esta tecnología, existiendo plantas
industriales en Europa, EEUU, Canadá, el Sudeste Asiático y Nueva Zelanda (Cocero, 2006).
En España, la empresa Solutex construyó, en el año 2004, una instalación para la producción de
alimentos funcionales mediante SC-CO2 en Mallén (Zaragoza). Esta planta dispone de
instalaciones de extracción y cromatografía en SC-CO2 produciendo 50 toneladas anuales de
EPA y DHA mediante cromatografía supercrítica a partir de aceite de pescado.
Flavex, otra destacada compañía ubicada en Rehlingen (Alemania) produce ingredientes
botánicos activos desde 1986 y en la actualidad produce más de 50 extractos obtenidos con SC-
CO2 operando con una presión máxima de diseño de 500 bar y logrando una producción anual
de 1000 toneladas. Entre los extractos obtenidos destacan: extracto de jengibre (40% aceites
Tabla 2.1. Condiciones de extracción con CO2 supercrítico utilizadas en algunas especies de algas y microalgas.
Tipo de microalga Temperatura
(°C)
Presión
(bar)
Densidad
(KgCO2/m3)
Componentes de interés
extraídos
Fuente
Haematococcus pluvialis 40-80 200−550 841,1- 897,4 Astaxantina Machmudah et al., 2006
Botryococcus braunii 40 125-300 731,5- 911,1 Hidrocarburos Mendes et al., 2003
Chlorella vulgaris 40 300 911,1 Carotenoides Palavra et al., 2011
Nannochloropsis sp 40-55 550-700 1007,5- 1009,3 Lípidos Andrich et al., 2005
Spirulina platensis
Nannoclhoropsis gaditana
Sargassum hemiphyllum
83,3
40-60
40-50
361
100-500
241-379
785,6
625,9-934,4
874,4-914,7
Vitamina E
Carotenoides y clorofila
Ácidos grasos
poliinsaturados
Mendiola et al., 2008
Macías-Sánchez et
al., 2005
Cheung et al., 1998
Arthrospira maxima 50-60 250-350 835,2-863,8 ácido γ-linolénico Mendes et al., 2006
Nannochloropsis oculata 40 250-300 880,7-911,1 Zeaxantina Liau et al., 2011
Dunaliella salina 40-60 100-500 625,9-934,4 Carotenoides y clorofilas Macías-Sánchez et
al., 2009
Ca
pítu
lo 2
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Efec
to d
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ii). 12
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii) 13
esenciales y 30% gingeroles), extracto de romero rico en ácido carnosílico, extracto de vainilla
(10 veces más concentrado que mediante técnicas convencionales) y otros extractos como:
cúrcuma, orégano y pimienta con una producción de una tonelada al año aproximadamente
(Tornero, 2011).
2.8.2 Fraccionamiento de la grasa láctea
La grasa láctea es una mezcla de triglicéridos saturados (70%) e insaturados (30%) y contiene
también un pequeño porcentaje de colesterol. Los puntos de fusión están entre -40 y 40 °C y esto
hace que su utilización sea muy reducida. En el fraccionamiento de la grasa de leche con SC-CO2
generalmente se obtienen 3 fracciones de triglicéridos de peso molecular elevado (C54-42),
medio (C40-36) y bajo (C34-24).
Las condiciones de fraccionamiento se realizan después de mezclarlos en el extractor (en 3 o 4
separadores), reduciendo progresivamente la presión de 240 a 34 bar y aumentando gradualmente
la temperatura de 40 a 70 °C. De este modo se obtiene un producto lácteo refinado que contiene
menos colesterol, es rico en triglicéridos insaturados y antioxidantes como β-caroteno. Resulta
ser muy apreciado en leches funcionales enriquecidas, mantequillas, helados y quesos (Raventós,
2005).
2.8.3 Desalcoholización de bebidas alcohólicas
El contenido final de alcohol con EFS en estos productos oscila entre un 0,5 y un 1% en volumen
y ha tenido éxito en bebidas de bajo contenido alcohólico como cerveza, sidra, vino y licores de
aromas. El proceso de extracción del etanol de una bebida con este método se realiza
normalmente en continuo, sin tiempos muertos y con menos costes que el sistema discontinuo. Se
realiza en columnas extractoras de etapas de contacto múltiple donde se introducen, bombeados
continuamente, el SC-CO2 y la bebida alcohólica. La bebida fluye descendiendo y se pone en
contacto con la corriente ascendente del CO2. Las condiciones óptimas para la extracción del
etanol dependen del tipo de bebida, pero generalmente los valores oscilan entre los 80 y 120 bar a
temperaturas de 15 y 40 ºC (Carretero, 2012).
Capítulo 2. Antecedentes generales
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii) 14
2.8.4 Obtención de sustancias antioxidantes a partir de microalgas.
En Chile más específicamente en la Región de Tarapacá se encuentra la empresa biotecnológica
Atacama Bio Natural products S.A., la cual utiliza SC-CO2 para extraer complejo de Astaxantina
natural a partir de oleorresinas de biomasa de microalga Haematococcus pluvialis. Esta empresa
elabora dos productos: Supreme Asta Oil y Supreme Asta Powder (Atacama Bio Natural
Products, 2012).
CAPÍTULO 3
MATERIALES Y MÉTODOS
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 15
CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Materiales
3.1.1 Materia prima
Se utilizó como sustrato microalga Botryococcus braunii, la cual fue proporcionada por la
Universidad de Antofagasta. Ésta viene en suspensión acuosa con 20% de sólidos totales. Fue
secada por convección con aire caliente y molida hasta obtener un diámetro de partícula menor a
1 mm. La muestra fue tamizada para trabajar con el mismo diámetro de partícula en todas las
extracciones. Finalmente, se almacenó bajo refrigeración (5 °C) hasta su posterior uso en ensayos
de extracción y análisis.
3.1.2. Equipos e instrumentos
Extractor supercrítico (Applied Separation Spe-ed SFE-2, modelo 7071, INC Allentown,
Estados Unidos)
Espectrofotómetro (Bausch & Lomb Spectronic, modelo SP-2000 UV, Estados Unidos)
Estufa rango 30-220 ºC (Electron Thermostatic Oven, modelo DHG-9037A, Japón)
Balanza analítica, sensibilidad ± 0,0001 g (Shimadzu, modelo AUX 220, Japón)
Balanza granataria (Shimadzu, modelo ELB600S, Japón)
Refrigerador (Frigidaire, modelo FRD22, China)
Cronómetro digital (Q&Q HS45, China)
Agitador tubos vortex (VELP Scientifica, Italia).
3.1.3. Material de vidrio y otros
Desecador con sílica gel
Frascos de vidrio (viales) 15 mL
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 16
Matraz aforado de 10 mL y 25 mL
Cubetas de cuarzo y vidrio
Matraz Erlenmeyer 250 mL
Pipeta total de 1, 3, 5 y10 mL
Micropipeta 10:100 μL y 100:1000 μL
Probeta de 50 mL y 100 mL
Vasos precipitados de 50, 100, 250 mL
Mortero y pistilo
3.1.4. Reactivos
CO2 99 % de pureza, AGA, Chile
Cloroformo p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania
Anhídrido acético p.a. A.C.S., Cicarelli, San Lorenzo, Argentina
Tolueno p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania
Etanol p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania
Ácido sulfúrico p.a. JT, Baker, México
Estigmasterol, 95%, Sigma, Estados Unidos.
2,2’-bipiridina, AcrosOrganics, New Jersey, Estados Unidos.
3.2 Métodos de análisis
3.2.1. Determinación de humedad
La humedad del sustrato se determinó a través del método gravimétrico (AOAC, 1990), el cual se
basa en la deshidratación de la muestra hasta peso constante mediante el secado en estufa a 105
°C. Este análisis se realizó en duplicado tanto al sustrato inicial como al agotado obtenido luego
de la extracción.
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 17
Se expresó el peso perdido por la muestra como el porcentaje de humedad en base húmeda (bh)
mediante la Ecuación (3.1).
( ) (m -mS)
m 100
Donde:
mH: masa muestra húmeda (g)
mS: masa muestra seca (g)
3.2.2. Extracción de aceites utilizando SC-CO2
Los ensayos de extracción de aceite se realizaron cargando 7 g de sustrato seco de B. braunii en
un extractor supercrítico de capacidad de 50 mL y un diámetro interno de 14 mm. Las
extracciones se realizaron bajo condiciones de extracción que combinan distintos niveles de
temperatura (41-69 °C) y densidad de CO2 (843-957 kg CO2/m3), presentadas en la Tabla 3.1.
Los extractos obtenidos se recuperaron en viales de vidrio de 60 mL de capacidad previamente
pesados para obtener la cantidad de aceite extraído por diferencia de masa entre el vial con aceite
y el vial vacío. El rendimiento de extracción de aceite se expresó como g aceite/kg sustrato seco
(Anexo B, Tabla B-1 a B-12) y el análisis del extracto consta de: concentración de carotenoides
(g car/kg aceite), concentración de esteroles (g est/kg aceite), concentración de tocoferoles (g
toc/kg aceite), rendimiento de carotenoides (mg car/kg sólido seco), rendimiento de esteroles (mg
est/kg sólido seco) y rendimiento de tocoferoles (mg toc/kg sólido seco).
3.3. Análisis del aceite
3.3.1 Contenido de carotenoides totales
El contenido de carotenoides totales se determinó por espectrofotometría UV, basado en la
metodología informada por Malaysian Palm oil Board. (2005). Las muestras de aceite obtenidas
fueron disueltas en cloroformo y a continuación fueron llevadas al espectrofotómetro UV donde
se estableció la absorbancia a una longitud de onda de 452 nm. En el Anexo D, Figura D-1 se
observa la curva de calibración del método de carotenoides totales.
(3.1)
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 18
Cd (mA) FD V
g 100
Donde:
Cd: Concentración de carotenoides totales (mg carotenoides/kg aceite)
m: pendiente de la curva patrón β-caroteno
A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 452 nm
FD: factor de dilución de la muestra
V: volumen del solvente utilizado en la preparación del extracto (mL)
g: masa de aceite analizado (g)
3.3.2 Contenido de esteroles
La concentración de esteroles se determinó a través del método espectrofotométrico informado
por Sabir et al. (2003).
Para este análisis se prepararon los siguientes reactivos:
Solución patrón de estigmasterol: Se disolvieron 10 mg de patrón estigmasterol en 10 mL
de cloroformo y luego se agitó.
Reactivo Liberman-Burchard: Se disolvieron 0,5 mL de ácido sulfúrico en 10 mL de
anhídrido acético. La solución se cubrió con papel aluminio para protegerla de la luz.
En primer lugar, se preparó una curva de calibración, adicionando a seis matraces de aforo de 10
mL la solución patrón (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 mL a cada matraz, el primero se considera como
blanco). A continuación, 2 mL del reactivo Liberman-Burchard fueron añadidos a cada matraz y
se aforaron con cloroformo a un volumen final de 10 mL. Los matraces fueron cubiertos por
papel aluminio y mantenidos en la oscuridad durante 15 min. Luego se estableció el cero de la
absorbancia del blanco a 640 nm y se midió la absorbancia de las demás soluciones, obteniéndose
de esta forma el gráfico de la curva patrón. En el Anexo D, Figura D-2 se observa la curva de
calibración de los esteroles totales.
(3.2)
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 19
Para el análisis de aceites se pesaron 100 mg de éste utilizando cloroformo como solvente. Se
tomaron 3 mL de la solución diluida y se determinó su absorbancia luego de añadir el reactivo
Liberman-Burchard mas cloroformo. La Ecuación (3.3) se utilizó para determinar el contenido de
esteroles totales presentes en el aceite.
C (mA) FD V
g 1000
Donde:
C: concentración de esteroles totales (mg esterol/kg de aceite)
m: pendiente de la curva patrón estigmasterol
A: absorbancia del aceite analizado en longitud 640 nm
FD: factor de dilución
V: volumen del solvente utilizado en la preparación de aceite (mL)
g: masa de aceite analizado (g)
3.3.3 Contenido de tocoferoles
La concentración de tocoferoles totales se determinó a través de espectrofotometría UV-VIS,
usando el método colorimétrico Emmerie-Engel informado por Wong et al. (1988).
Para este análisis fue necesario preparar los siguientes reactivos:
Reactivo α- tocoferol: disolver 0,0150 g de α- tocoferol en 30 mL de tolueno y agitar.
Solución 2,2’-bipiridina: disolver 0,0700g de 2,2’-bipiridina en 100 mL de etanol-
agua (95%).
Solución FeCl3x 6H2O: disolver 0,0400 g de FeCl3*6H2O en 20 mL de etanol-agua
(95%).
En primer lugar se preparó una curva de calibración. A continuación, 3,5 mL de 2,2 fueron
añadidos a cada matraz más 0,5 mL la solución de Fe y se aforó con tolueno a volumen final de
(3.3)
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 20
10 mL. Se estableció el cero de la absorbancia del blanco a 520 nm y luego se procedió a medir
la absorbancia de las siguientes soluciones, para obtener de esta forma el gráfico de la curva
patrón observado en el Anexo D, Figura D-3.
Para el análisis de las muestras se disolvieron 0,2 g de aceite en 5 mL tolueno y se adicionaron
3,5 mL de 2,2’-bipiridina y 0,5 mL de Fe. La solución se aforó con tolueno a 10 mL y luego se
leyó a una absorbancia de 520 nm. La Ecuación (3.4) se utilizó para determinar la concentración
de trolox equivalente presente en la muestra extraída.
C (mA) V FD
g 1000
Donde:
C: concentración de Tocoferoles totales (mg tocoferoles/kg de aceite)
m: pendiente de la curva de patrón de α-tocoferol
A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 520 nm
V: volumen del solvente utilizado en la preparación de aceite (mL)
g: masa de aceite analizado (g)
3.4 Diseño de experimentos
3.4.1 Análisis estadístico
Se utilizó la metodología Superficie de Respuesta (MSR) que permitió evaluar el efecto de las
variables independientes temperatura codificada (X1) y densidad de CO2 codificada (X2)
(Ecuación 3.5 y 3.6 respectivamente) sobre las variables dependientes; rendimiento de extracción
de aceite (Y1), concentración de carotenoides (Y2), concentración de esteroles (Y3),
concentración de tocoferoles (Y4), rendimiento de extracción de carotenoides (Y5), rendimiento
de extracción de esteroles (Y6) y rendimiento de extracción de tocoferoles (Y7).
(3.4)
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 21
10
551
TX
Donde:
T: temperatura ° C
40
9002
DX
Donde:
D: densidad (kg/m3)
Se utilizó un polinomio de segundo orden para expresar la variables respuestas como una función
de las variables independientes como sigue:
2
222
2
111211222110 XAXAXXAXAXAAY
Donde:
A0: es una constante
A1 y A2: coeficientes lineales
A12: coeficiente de interacción
A11 y A22: los coeficientes cuadráticos.
El diseño experimetal (Tabla 3.1) está basado en un diseño central compuesto rotatorio; el cual
consiste de un diseño factorial de 2 factores independientes con niveles de trabajo (-1,+1). El
diseño tiene 4 (2n) puntos experimentales y 4 (2n) puntos axiales con una distancia axial de 1,41
( = 2n/4
), y 4 replicas en el punto central (total 12 puntos de diseño). El ajuste del modelo fue
evaluado por el coeficiente de determinación R2 y mediante un análisis de varianza (ANOVA),
para estimar el efecto y significancia de las variables independientes (temperatura y densidad de
CO2) sobre las variables respuestas; rendimiento de extracción de aceite, concentración de
carotenoides, concentración de esteroles, concentración de tocoferoles, rendimiento de extracción
de carotenoides, rendimiento de extracción de esteroles y rendimiento de extracción de
(3.7)
(3.5)
(3.6)
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 22
tocoferoles en el aceite. Los coeficientes de la ecuación de segundo orden fueron estimados
usando el programa Design-Expert Versión 6.0.1 (Stat-Easy, Inc. Minneapolis, MN). La
significación estadística se basó en los criterios de error total con un nivel de confianza del 95%.
Tabla 3.1. Diseño experimental Central Compuesto Rotatorio.
Puntos de Temperatura (T) Densidad (D) X1 X2
diseño °C kg CO2/m3 ( - ) ( - )
1 45 860 -1 -1
2 65 860 1 -1
3 45 940 -1 1
4 65 940 1 1
5 41 900 -1,41 0
6 69 900 1,41 0
7 55 843 0 -1,41
8 55 957 0 1,41
9 55 900 0 0
10 55 900 0 0
11 55 900 0 0
12 55 900 0 0
CAPÍTULO 4
RESULTADOS Y DISCUSION
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 22
CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Contenido de humedad de la muestra inicial
El contenido de humedad de la muestra inicial de microalga (Botryococcus braunii) fue 3,41 ±
0,21% (b.h) obtenido según el método gravimétrico (AOAC, 1990) (Anexo A, Tabla A-1). Según
Li et al. (2010), el agua interfiere en la eficiencia de la extracción, inhibiendo el contacto entre el
SC-CO2 y el sustrato, además, de actuar como anti-solvente y reducir la solubilidad de
carotenoides (Sun y Temelli, 2006) En este ensayo la humedad inicial del sustrato es baja y
favorable para la extracción de aceite como de carotenoides con SC-CO2.
4.2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO2 sobre el
comportamiento de las respuestas.
Utilizando un diseño central compuesto rotatorio con dos variables independientes: temperatura
(X1) y densidad de CO2 (X2), se estudió el efecto de éstas sobre las respuestas: rendimiento de
extracción de aceite (Y1), concentración de carotenoides (Y2), concentración de esteroles (Y3),
concentración de tocoferoles (Y4), rendimiento de carotenoides (Y5), rendimiento de esteroles
(Y6) y rendimiento de tocoferoles (Y7) para, de esta forma, observar cuales son las mejores
condiciones de extracción en los rangos establecidos en el diseño estadístico utilizando el
programa Design Expert.
En la Tabla 4.1 se puede observar los valores de las respuestas antes citadas, donde Y1 presenta
valores de rendimiento que varían entre 60,9 y 84,2 (g aceite/kg SS), la respuesta Y2 presenta una
concentración de carotenoides que varía en un rango de 8,1 a 16,1 (g car/kg aceite), en cuanto a la
concentración de esteroles (Y3) presenta concentraciones comprendidas entre 15,9- 22,0 (g est/kg
aceite), la concentración de tocoferoles (Y4) se encuentra entre 16 y 17,6 (g toc/kg aceite),
mientras que el rendimiento de carotenoides (Y5) presenta valores comprendidos entre 497,4 y
1276,8 (mg car/ kg SS), en la respuesta Y6 se observan rendimientos entre 972,4 y 1676,9 (mg
est/kg SS) y finalmente, el rendimiento de tocoferoles (Y7) presenta valores que varían desde
974,5 a 1386,8 (mg toc/kg SS). El efecto de las variables se evaluará a continuación mediante la
metodología de superficie de respuesta usando la ecuación cuadrática (Ecuación 3.7) que describe
la respuesta Y en función de las variables independientes temperatura y densidad.
Tabla 4.1 Rendimiento de extracción y concentración de carotenoides, esteroles y tocoferoles con SC-CO2.
Temperatura (T,
°C)
Densidad
(D, kg / m3)
X1
( )
X2
( )
Y1
(g aceite/
kg SS)
Y2
(g car/
kg aceite)
Y3
(g est/
kg aceite)
Y 4
(g toc/
kg aceite)
Y 5
(mg car/
kg SS)
Y 6
(mg est/
kg SS)
Y7
(mg toc/
kg SS)
45 860 -1 -1 61,5
6
8,1 17,0 16,2 497,4 1044,3 993,8 65 860 1 -1 62,3
60
12,4 17,5 16,2 769,5
828,
1087,4 1009,6
45 940 -1 1 60,9 13,6 21,1 17,6 828,7
1282,0 1070,7
65 940 1 1 80,0 16,0 18,5 16,6 1276,8 1481,2 1330,2
41 900 -1,41 0 61,1 9,6 19,6 16,0 589,4 1193,4 977,9
69 900 1,41 0 84,2 14,6 15,9 16,5 1228,2 1337,1 1386,8
55 843 0 -1,41 60,9 8,8 16,0 16,0 533,1 972,4 974,5
55 957 0 1,41 76,1 16,1 22,0 17,5 1228,2 1676,9
1331,7
55 900 0 0 73,2 12,2 18,5 16,5 890,1 1353,1 1207,6
55 900 0 0 67,8 12,2 18,8 17,1 825,0 1270,8 1160,0
55
900 0 0 73,4 12,2 18,3 17,0 896,7 1340,5 1250,3
55 900 0 0 72,9 12,7 19,5 16,7 923,6 1421,5 1216,0
Y1: rendimiento de extracción de aceite; Y2: concentración de carotenoides; Y3: concentración de esteroles; Y4:
concentración tocoferoles; Y5: rendimiento de extracción de carotenoides; Y6: rendimiento de extracción de esteroles;
Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles.
Efec
to d
e la d
ensid
ad
y temp
eratu
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e CO
2 sob
re la ex
tracc
ión
sup
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ii). 23
Ca
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sión
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 24
4.3 Análisis estadístico
La evaluación estadística del modelo se efectuó mediante el análisis de varianza (ANOVA) el
cual permite determinar de forma analítica el comportamiento de los datos obtenidos a partir de
los ensayos de extracción. Mediante este análisis se podrá evaluar la significación y la adecuación
del modelo cuadrático propuesto (Ecuación 3.7). En la Tabla 4.2 se presentan los resultados del
análisis de varianza entregado por el programa Design Expert, versión 6.0.1.
Tabla 4.2. Tabla de análisis de varianza para el modelo cuadrático
Modelo Suma de
cuadrados
gl Cuadrado
medio
F Valor p
Y1
Regresión 663,48 5 132,7 9,5 < 0,0081
Residuo 83,81 6 13,97
Total 747,29 11
Y2
Regresión 72,12 5 14,42 170,72 < 0,0001
Residuo 0,51 6 0,084
Total 72,62 11
Y3
Regresión 34,24 5 6,85 11,36 < 0,0051
Residuo 3,62 6 0,6
Total 37,85 11
Y4
Regresión 2,64 5 0,53 5,30 < 0,0330
Residuo 0,60 6 0,10
Total 3,24 11
Y5
Regresión 7,53E+5 5 1,5E+5 51,97 < 0,0001
Residuo 12156,94 6 2900,14
Total 7,7E+5 11
Y6
Regresión 3,86E+5 5 77253,23 12,05 < 0,0044
Residuo 38459,13 6 6409,86
Total 4.2E+5 11
Y7
Regresión 2,2E5 5 44650,70 10,31 < 0,0066
Residuo 25982,21 6 4330,37
Total 2,4E+5 11
Y1: rendimiento de extracción de aceite; Y2: concentración de carotenoides; Y3: concentración
de esteroles; Y4: concentración de tocoferoles; Y5: rendimiento de extracción de carotenoides;
Y6: rendimiento de extracción de esteroles; Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles.
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 25
En la Tabla 4.2 se puede observar los valores F para cada modelo de regresión. Para la respuesta
Y1 el valor de F es 9,5 lo que indica que el modelo utilizado es significativo ya que presenta un
valor p≤0,01. El valor p es el nivel de significancia observado en el modelo, cuanto más pequeño
sea su valor mayor será la evidencia para rechazar la hipótesis nula (H0), en este caso H0 indica
que el modelo utilizado no es apropiado para predecir el comportamiento de la respuesta en
función de las variables en estudio. Para la respuesta Y1 existe menos del 1 % de cometer un error
tipo I, es decir, rechazar una hipótesis nula cuando es cierta, en esta ocasión es improbable, por lo
tanto, se rechaza H0, y se establece que el modelo es adecuado. Esta situación se repite para las
respuestas Y2, Y3, Y5, Y6, Y7, lo cual indica que el modelo es significativo para predecir el
comportamiento de estas respuestas en función de las variables no codificadas temperatura de
extracción y densidad de CO2. La respuesta Y4 (concentración de tocoferoles), presenta un valor
p<0,033 lo que indica que existe una probabilidad menor 0,05 que el modelo pueda fallar debido
a perturbaciones experimentales.
En la Tabla 4.3 se observan los indicadores estadísticos para cada una de las respuestas, donde se
encuentran los valores del modelo (F), razón señal/ruido, coeficiente de variación, coeficiente de
determinación (R2) y falta de ajuste. El coeficiente de determinación R
2, indica la contribución de
todos los componentes de la ecuación a la respuesta, para Y1 es de 0,89, lo que quiere decir que el
89% del rendimiento de extracción de aceite está explicado por el modelo representado en la
ecuación. Este valor, al ser alto, le confiere validez al modelo obtenido, el 11% restante es la
contribución del error a la respuesta. Para las demás respuestas, el indicador R2 se encuentra
alrededor de 0,90 lo cual señala que el comportamiento de éstas está explicado adecuadamente
por las variables independientes involucradas en la ecuación cuadrática. En cuanto a la razón
señal/ruido estas presentan un valor mayor a 4 lo que indica que las respuestas obtenidas tienen
robustez y son de calidad, siendo consistentes en el tiempo sin importar las fuentes de ruido que
pueden comprometer su calidad.
Otro de los indicadores estadísticos que pueden observarse en la Tabla 4.3 es la falta de ajuste, la
cual no resultó significativa (p≥0,05) para ninguna de las respuestas, esto debido a que no existen
grandes diferencias entre el valor experimental y el valor predicho como se puede observar en el
Anexo E, (Figura E-1 a E-7), no se observa una alta dispersión de los datos.
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 26
Tabla 4.3. Indicadores estadísticos para el modelo de superficie de respuesta
Indicadores
estadísticos
Variable respuesta
Y1 (g /
kg SS)
Y2 (g car /
kg aceite)
Y3(g est /
kg aceite)
Y4 (g toc/
kg aceite)
Y5(mg car/
kg SS)
Y6 (mg est/
kg SS)
Y7 (mg toc/
kg SS)
F 9,50* 170,72* 11,36* 5,30* 51,97* 12,05* 10,31*
R2 0,89 0,99 0,90 0,82 0,97 0,91 0,91
Falta de
ajuste 61,93
ns 0,34
ns 2,78
ns 0,35
ns 12156,9
ns 26980,0
ns 21821,6
ns
Señal/ruido 9,4 40,4 9,6 7,5 22,6 10,2 9,8
CV 5,38 2,35 4,19 1,89 6,16 6,21 5,68
Y1: rendimiento de extracción de aceite; Y2: concentración de carotenoides; Y3: concentración de esteroles;
Y4: concentración de tocoferoles; Y5: rendimiento de extracción de carotenoides; Y6: rendimiento de
extracción de esteroles; Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles; CV: coeficiente de variación;*
significativo p≤0,05* Significante (p≤0,01); ** Significante (p≤0,05); y ns
No-significante (p≥0,05).
En base a los resultados estadísticos obtenidos, el modelo cuadrático resulta adecuado y permite
utilizar las superficies de respuesta para analizar el efecto de las variables independientes
temperatura de extracción y densidad del CO2 sobre cada una de las respuestas en estudio.
4.3.1. Análisis del rendimiento de extracción de aceite
Para la respuesta rendimiento de extracción de aceite de microalga B. braunii (Y1), se obtuvo la
Ecuación 4.1 que indica la relación causa/efecto que existe con las variables independientes
(temperatura de extracción y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se
indican con (*).
1 71,82+ *6,56 (T-55
10)+ *4,83 (
D-900
40) -0,71 (
T-55
10)2
-2,76 (D-900
40)2
+ *4,57 (T-55
10) (
D-900
40) (4.1)
A partir de la Ecuación 4.1 y el análisis de varianza para la contribución de cada término presente
en la ecuación polinómica (Anexo E, Tabla E-1), se puede observar que el rendimiento de
extracción de aceite fue afectado significativamente (p≤0,05) por los componentes lineales de
temperatura y densidad y la interacción de ambos componentes con un 45,9%, 24,8% y 11,2% de
contribución en la respuesta, respectivamente. Esto se observa en la Figura 4.1, donde el efecto
positivo de la temperatura se ve a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se observa a
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 27
alta temperatura. Los coeficientes de las variables lineales y la interacción de éstas fueron
significativos y positivos existiendo una relación directamente proporcional a condiciones de
densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 °C) aproximadamente.
Figura 4.1 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de aceite (Y1) como función de
la temperatura (ºC) y densidad (kg CO2/m3).
En la Figura 4.1 se observa que el mayor rendimiento de extracción se encuentra en la zona de
alta temperatura de extracción y alta densidad de CO2, ya que, de acuerdo al modelo cuadrático,
el mejor rendimiento de extracción de aceite fue 90,0 g aceite/kg SS, obtenido a 69 °C y 957 kg
CO2/m3. Además, se observa una mayor pendiente para la variable temperatura, representando
gráficamente el mayor % de contribución a la respuesta. Finalmente, la Figura 4.1, muestra que el
menor rendimiento de extracción se encuentra a temperaturas entre 41 y 48°C en el rango de
densidades de 843 a 872 kg CO2/m3, de acuerdo al modelo cuadrático el valor fue 53,0 kg
aceite/kg SS.
53
63
72
81
90
41
48
55
62
69
843
872
900
929
957
Temperatura (°C) Densidad (kg CO2/m3)
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 28
4.3.2 Análisis de concentración de carotenoides
Para la respuesta concentración de carotenoides (Y2) se obtuvo la ecuación polinómica (4.2), la
cual indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes
temperatura de extracción y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se
indican con (*).
2 12,30+ 1,7 (T-55
10)+ 2,45 (
D-900
40) -0,036 (
T-55
10)2
+0,13 (D-900
40)2
- 0,47 (T-55
10) (
D-900
40) (4.2)
Del análisis de varianza (Anexo E, Tabla E-2) se establece que la concentración de carotenoides
(Y2) fue afectada principalmente por el componente lineal densidad de CO2 con un 65,9% de
contribución en la respuesta, también influyó significativamente (p≤0,05) el componente lineal
temperatura con un 32,0% y finalmente la interacción de los componentes temperatura y
densidad de CO2 influyó un 1,2% en la concentración de carotenoides en el aceite extraído. Se
puede decir entonces, que estos tres componentes explican en un 99,2% la respuesta Y2. En la
Ecuación 4.2 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo, lo que
indica una relación directamente proporcional de la temperatura de extracción y densidad de CO2
sobre la concentración de carotenoides (Y2), es decir, a medida que aumenta la densidad a
temperatura constante, se produce un aumento en la concentración de carotenoides (Y2), como se
observa en la Figura 4.2, la superficie sigue esta tendencia presentando una mayor concentración
en condiciones sobre el punto central (55°C y 900 kg CO2/m3).
A partir de la Ecuación 4.2 se obtuvo la superficie de respuesta observada en la Figura 4.2, donde
se ve un comportamiento lineal de la respuesta, presentando una mayor pendiente la variable
densidad de CO2, lo que gráficamente representa la contribución que realiza esta variable a la
respuesta. De acuerdo a los valores entregados por el modelo cuadrático la mayor concentración
de carotenoides es 17,0 g car/kg aceite encontrada a una temperatura de 69 °C y una densidad de
957 kg CO2/m3, a su vez la menor concentración de carotenoides presenta un valor de 6,0 g
car/kg aceite a una temperatura de 42 °C y densidad de 843 kg CO2/m3.
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 29
Figura 4.2 Superficie de respuesta de la concentración de carotenoides (Y2) como función de la
temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).
4.3.3 Análisis de concentración de esteroles
Los valores experimentales de la concentración de esteroles se ajustaron a un modelo cuadrático
con la finalidad de generar la Ecuación 4.3 que indica la relación causa/efecto que existe con las
variables independientes (temperatura y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos
(p≤0,05) se indican con (*).
3 18,76 - 0,90 (T-55
10)+ 1,71 (
D-900
40) - 0,48 (
T-55
10)2
+0,16 (D-900
40)2
- 0,76 (T-55
10) (
D-900
40) (4.3)
A partir del análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite (Anexo E, Tabla
E-3) y al analizar la Ecuación 4.3, se observa que la variable lineal densidad de CO2 influye
significativamente (p≤0,05) en la respuesta contribuyendo un 62,6%, presentando un coeficiente
de signo positivo lo que indica una relación directamente proporcional a la respuesta (Y3) a bajas
temperaturas. Otro de los factores que influyó significativamente en la respuesta (Y3) es la
Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C)
6
9
12
14
17
41
48
55
62
69
843
872
900
929
957
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 30
variable lineal temperatura aportando un 17,4% a la respuesta, su coeficiente es negativo lo que
indica una relación indirecta entre temperatura y concentración de esteroles, este comportamiento
se observa en la Figura 4.3 donde, a medida que aumenta la temperatura a densidad de CO2
constante, la concentración de esteroles disminuye.
Figura 4.3 Superficie de respuesta de la concentración de esteroles (Y3) como función de la
temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).
En la Figura 4.3 se observa una mayor concentración de esteroles a temperaturas entre 41 a 48 °C
y densidad de CO2 entre 929 y 957 kg CO2/m3 y de acuerdo al valor entregado por el modelo
cuadrático la mayor concentración es 23,0 g esteroles/ kg aceite, a su vez la menor concentración
de esteroles presenta un valor de 15,0 g esteroles /kg aceite a una temperatura de 69 °C y
densidad de 860 kg CO2/m3.
15
17
19
21
23
41
48
55
62
69
843
872
900
929
957
Temperatura (°C) Densidad (kg CO2/m3)
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 31
4.3.4 Análisis de concentración de tocoferoles
Para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4) se obtuvo la ecuación polinómica (4.4), la
cual indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes
temperatura de extracción y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se
indican con (*).
4 16,83-0,03 (T-55
10)+ 0,49 (
D-900
40) - *0,25 (
T-55
10)2
-3,12 10-3 (D-900
40)2
-0,25 (T-55
10) (
D-900
40) (4.4)
El análisis de varianza para la concentración de tocoferoles (Anexo E, Tabla E-4) y la Ecuación
4.4 indican que la respuesta fue afectada significativamente (p≤0,05) por la variable lineal
densidad de CO2 y la variable cuadrática temperatura de extracción, presentando una
contribución de 60,4% y 12,7% respectivamente. Al observar los signos que acompañan los
coeficientes, en el caso de la variable lineal densidad es positivo y su comportamiento se puede
observar en la Figura 4.4 donde a valores de temperatura bajo el punto central (55 °C) se observa
un comportamiento directamente proporcional a la respuesta (Y4). Mientras que el signo negativo
que acompaña el coeficiente de la variable cuadrática temperatura indica que dentro de un rango
de trabajo, desde una determinada temperatura la concentración de tocoferoles disminuye al
aumentar esta variable, presentándose un máximo en la respuesta lo que se observa en la Figura
4.4.
En la Figura 4.4 se observa que a valores bajos de densidad de CO2 la concentración de
tocoferoles aumenta a medida que aumenta la temperatura, mientras que a valores altos de
densidad de CO2, la concentración de tocoferoles disminuye con el aumento de la temperatura.
Este comportamiento explica porque el componente cuadrático de la variable temperatura es
negativo y significativo (p≤0,05). De acuerdo al valor entregado por el modelo cuadrático, la
mayor concentración de tocoferoles es 18,0 g tocoferoles/ kg aceite observada a condiciones de
41 °C y 957 kg CO2/m3, a su vez la menor concentración de tocoferoles presenta un valor de 15,0
g tocoferoles/ kg aceite a una temperatura de 41 °C y densidad de 843 kg CO2/m3
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 32
Figura 4.4 Superficie de respuesta de la concentración de tocoferoles (Y4) como función de la
temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).
4.3.5 Análisis de rendimiento de extracción de carotenoides
Del análisis estadístico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de
extracción de carotenoides en el aceite. La Ecuación 4.5 indica la relación causa/efecto que existe
entre la respuesta rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) y las variables independientes
temperatura y densidad de CO2, donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se indican con (*).
5 883,85+ *202,99 (T-55
10) + *227,71 (
D-900
40) -0,40 (
T-55
10)2
-14,53 (D-900
40)2
+43,99 (T-55
10) (
D-900
40) (4.5)
Temperatura (°C) Densidad (kg CO2/m3)
15
16
16
17
18
41
48
55
62
69
843
872
900
929
957
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 33
El análisis de varianza realizado para el rendimiento de extracción de carotenoides en el aceite
(Anexo E, Tabla E-5) y la ecuación polinómica (4.5) indican que la respuesta (Y5) fue afectada
significativamente (p≤0,05) por los componentes lineales densidad de CO2 y temperatura de
extracción presentando una contribución a la respuesta de 53,8% y 42,8% respectivamente. En la
Ecuación 4.5 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo, lo que
indica una relación directamente proporcional de la temperatura de extracción y densidad de CO2
sobre el rendimiento de extracción de carotenoides (Y5), es decir, a medida que aumenta la
densidad a temperatura constante, se produce un aumento en el rendimiento de extracción de
carotenoides (Y5), como se observa en la Figura 4.5, la superficie sigue esta tendencia
presentando un mayor rendimiento en condiciones sobre el punto central (55 °C y 900 kg
CO2/m3).
En la Figura 4.5 se observa un comportamiento lineal de la superficie de respuesta y según los
valores entregados por el modelo cuadrático el mejor rendimiento es 1550,0 mg car/kg SS
obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3, a su vez, el menor rendimiento de extracción de carotenoides
es 333,0 mg car/kg SS, encontrado a 41 °C y 843 kg CO2/m3.
Figura 4.5. Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) como
función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3)
333
637
941
1246
1550
41
48
55
62
69
843
872
900
929
957
Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C)
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 34
4.3.6 Rendimiento de extracción de esteroles
Del análisis estadístico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de
extracción de esteroles en el aceite. Los coeficientes significativos (p≤0,05) indicados con (*) se
observan en la Ecuación 4.6, ecuación polinómica que indica la relación causa/efecto que existe
entre la respuesta rendimiento de extracción de esteroles (Y6) y las variables independientes
temperatura y densidad de CO2.
6 1347,22+55,68 (T-55
10)+ 203,48 (
D-900
40) -58,81 (
T-55
10)2
-29,09 (D-900
40)2
+39,03 (T-55
10) (
D-900
40) (4.6)
Del análisis de varianza (Anexo E, Tabla E-6) y al observar la Ecuación 4.6 se establece que el
rendimiento de extracción de esteroles (Y6) fue afectado mayoritariamente por el componente
lineal densidad de CO2 con un 77,4% de contribución, presentando un coeficiente positivo el cual
indica un comportamiento directamente proporcional a la respuesta, lo que quiere decir que a
medida que la densidad de CO2 aumenta a temperatura constante el rendimiento de extracción de
esteroles aumenta, esta situación se puede observar en la Figura 4.6 tanto a bajas como a altas
temperaturas de extracción.
En la Figura 4.6 se observa que el mayor rendimiento de extracción se encuentra en condiciones
sobre el punto central (55 °C y 900 kg CO2/m3) presentando un valor de 1631,0 mg est/ kg SS,
además, el modelo cuadrático señala que el menor rendimiento de esteroles es 883,0 mg est/ kg
SS observado a 41°C y 843 kg CO2/m3.
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 35
Figura 4.6. Superficie de respuesta de la rendimiento de extracción esteroles (Y6) como función
de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).
4.3.7 Rendimiento de extracción de tocoferoles
A partir del análisis de varianza (ANOVA) desarrollado para el rendimiento de extracción de
tocoferoles (Anexo E, Tabla E-7) se observa que las variables de los componentes lineales
temperatura de extracción y densidad de CO2 influyen significativamente (p<0,05) en la
respuesta Y7 aportando un 36,2% y un 40,4% respectivamente.
Los valores experimentales del rendimiento de extracción de tocoferoles, se ajustaron a un
modelo cuadrático con la finalidad de generar la Ecuación 4.7 que indica la relación causa/efecto
que existe con las variables independientes (temperatura de extracción y densidad de CO2).
7 1208,47+ *106,70 (T-55
10)+ *112,83 (
D-900
40) -29,74 (
T-55
10)2
-44,34 (D-900
40)2
+60,94 (T-55
10) (
D-900
40) (4.7)
Densidad (kg CO2/m3)
Temperatura (°C)
883
1070
1257
1444
1631
41
48
55
62
69
843
872
900
929
957
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 36
En la Ecuación 4.7 se observa el signo positivo que acompaña los coeficientes lineales
temperatura de extracción y densidad de CO2 lo que se ve en la Figura 4.7, donde el efecto
positivo de la temperatura se observa a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se
observa a alta temperatura existiendo una relación directamente proporcional que se observa solo
a condiciones de densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 °C)
aproximadamente.
Figura 4.7 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de tocoferoles (Y7) como
función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).
En la Figura 4.7 se observa que el mayor rendimiento de extracción de tocoferoles se encuentra
en la zona de alta temperatura de extracción y alta densidad de CO2, ya que, de acuerdo a los
valores entregados por el modelo cuadrático el mejor rendimiento de extracción fue 1492,0 mg
toc/kg SS, obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3. Finalmente, a partir de la Figura 4.7, también se
puede ver que el menor rendimiento de extracción se encuentra a temperaturas de 41 a 48 °C en
Temperatura (°C) Densidad (kgCO2/m3)
872
1027
1182
1337
1492
41
48
55
62
69
843
872
900
929
957
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 37
un rango de densidades de 843 a 872 kg CO2/m3 y de acuerdo al modelo cuadrático fue 872,0 mg
toc/kg SS.
4.4 Discusión general
Existen muchos factores que pueden influenciar el rendimiento de extracción supercrítica, estos
pueden ser: humedad del sustrato, presión de CO2, temperatura de extracción, tamaño de
partícula, densidad del CO2 entre otras. En este caso, se estudia el efecto de la temperatura de
extracción y densidad del CO2 sobre el rendimiento de extracción de aceite de la microalga
(Botryococcus braunii), donde, de acuerdo a los resultados presentados en la Tabla 4.1 existe
relación entre estas variables y cada una de las respuestas en estudio, observando un efecto
significativo de la temperatura sobre el rendimiento de extracción encontrando el mayor a una
temperatura de 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3 lo cual concuerda con Maróstica et al.
(2010) que señalan que el aumento de la temperatura acelera la transferencia de masa,
aumentando la presión de vapor de los compuestos extractables y mejorando el rendimiento de
extracción.
Maróstica et al. (2010), indican que la solubilidad de los solutos está influenciada claramente por
dos factores: la densidad del SC-CO2, que aumenta con la presión trabajando a temperaturas
constantes, y la presión de vapor de los solutos, la cual aumenta por el incremento de la
temperatura, es decir, la solubilidad de los solutos cambiará de acuerdo al factor más
predominante.
En cuanto al contenido de aceite de microalga Botryococcus braunii, Antilaf (2011), extrajo
aceite a condiciones de 40 °C y 911,1 kg CO2/m3 logrando un rendimiento de 86,3 g aceite/ kg
SS, rendimiento similar al obtenido en esta investigación. Por otro lado, estudios realizados por
Chen y Walker (2012), lograron el mayor rendimiento de extracción de aceite de microalga
Chlorella protothecoides a condiciones de 50 °C y 900 kg CO2/m3, condiciones de extracción
dentro de nuestro rango de estudio, mientras que, Andrich et al. (2005), extrajo aceite a partir de
la microalga Nannochloropsis sp., obteniendo el mayor rendimiento (118,04 g aceite/kg SS) a 55
ºC de temperatura y una densidad de 1000 kg CO2/m3. Como se puede observar la densidad es
mayor a la utilizada en esta investigación y por ende el rendimiento de extracción también es
mayor. Este hecho se debe a la alta presión del solvente lo que genera una menor distancia entre
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 38
las moléculas provocando un aumento en la solubilidad del aceite como también un incremento
del poder solvente del SC-CO2 (Li et al., 2010).
Cabe mencionar que el aceite obtenido de microalgas y de otros sustratos en general se extrae
como mezcla de varias fracciones de lípidos, en el caso de B. braunii, Fang et al. (2004)
determinó que un 55,4% del extracto corresponde a ácidos grasos como ácido oleico, palmítico,
linoleico entre otros.
Los mejores resultados, en términos de rendimiento de extracción de carotenoides, se obtuvieron
trabajando con las densidades de CO2 más altas (sobre 900 kg CO2/m3), con valores superiores a
1500 mg car/ kgSS. Esto puede ser debido a que la extracción de carotenoides está favorecida por
el empleo de elevadas densidades de CO2 cuando se trabaja en intervalos supercríticos (Ibañez et
al., 1998).
Los carotenoides son pigmentos termolábiles y fotodegradables cuyas propiedades antioxidantes
están ampliamente estudiadas y para los que la extracción con CO2 supercrítico ha sido
ampliamente utilizada. Debido a la baja polaridad de estos compuestos y a la alta selectividad de
este método se ha llegado a calificar la extracción con fluidos supercríticos como “el método más
apropiado para la obtención de ácidos grasos, pigmentos, etc., a partir de biomasa de microalgas”
(Careri et al., 2001).
En el proceso de extracción de carotenoides tanto la densidad de SC-CO2 como la temperatura de
extracción influyeron significativamente en el rendimiento de carotenoides, logrando el mayor
rendimiento por sobre los 55 ºC y densidades sobre los 900 kg CO2/m3, resultados similares a la
investigación realizada por Macías-Sánchez et al. (2010), quienes utilizaron extracción con SC-
CO2, en la microalga S. almeriensis trabajando a temperaturas entre 32 y 60 ºC, densidades de
882 a 957 kg CO2/m3, obteniendo los mejores rendimientos de carotenoides a condiciones de
trabajo de 60 ºC, 890 kg CO2/m3. Por otro lado, los resultados obtenidos por Macias-Sánchez et
al. (2005), en Nannoclhoropsis gaditana utilizando SC-CO2 indican que a temperaturas de 60 ºC
y densidad de 890 kg CO2/m3 se obtiene el mayor rendimiento en la extracción de carotenoides,
esto puede ser debido a que la extracción de carotenoides está favorecida por el empleo de
elevadas densidades del CO2 cuando se trabaja en intervalos supercríticos (Favati et al., 1998).
Mendiola (2008) señala que a pesar de que en el rendimiento de extracción de carotenoides se
debe tener en cuenta la presencia de otros compuestos en el extracto, el rendimiento de
Capítulo 4. Resultados y discusión
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 39
carotenoides tiene una relación directa con el total del aceite extraído. Esta relación se refleja en
los resultados obtenidos en esta investigación, ya que, el mayor rendimiento de carotenoides y el
mayor rendimiento de aceite se obtuvieron a las mismas condiciones (69 °C y 957 kg CO2/m3).
En cuanto al rendimiento de extracción de tocoferoles tanto la densidad de CO2 como la
temperatura de extracción influyeron significativamente p≥ 0,05 sobre el rendimiento. Estos
resultados coinciden con la aseveración de que los tocoferoles son compuestos fácilmente
extraíbles, dado que la temperatura afecta positivamente su extracción (King et al., 1996), por
tanto, es lógico pensar que el rendimiento estará favorecido a elevadas temperaturas. Otro estudio
realizado por Mendiola (2008) en extractos de Spirulina también concuerda con lo anteriormente
descrito, obteniendo el mayor rendimiento a condiciones máximas de temperatura (83 °C).
Finalmente, en este estudio el mayor rendimiento de extracción de tocoferoles se obtuvo a la
máxima temperatura del rango de trabajo (69 °C).
La velocidad de extracción de aceite de microalga Botryococcus braunii se puede observar en el
Anexo C, (Figua C-1 a C-12) donde se ven claramente dos fases predominantes en las curvas del
modelo de extracción. En la primera fase se observa una velocidad de extracción rápida durante
los primeros 10 minutos, esto ocurre debido a que en esta fase se encuentra todo el aceite
disponible para la extracción, luego se observa que la tasa de extracción va disminuyendo (fase
de transición), durante esta fase, una gran proporción del aceite ha sido extraído lo que
gráficamente se representa por una asíntota. Este comportamiento indica que el proceso sería
controlado por la transferencia de masa (difusión del CO2 al interior de la matriz vegetal y
difusión del CO2 mas el aceite desde el interior de las partículas hacia la superficie) (Macías-
Sánchez et al., 2009) Finalmente, a condiciones de 69 °C y 900 kg CO2/m3
(finalizada la
extracción) se obtuvo el mayor rendimiento. .
CAPÍTULO 5
CONCLUSIONES
Capítulo 5. Conclusiones
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 41
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES
La temperatura y la densidad de CO2 afectaron significativamente (p≤0,05) el rendimiento
de extracción de aceite de microalga (B. braunii), explicando su comportamiento en un
89,0%, siendo la temperatura de extracción la variable que más afectó con un 46,4%, El
mayor rendimiento de extracción de aceite se obtuvo a 69 °C, con una densidad de 957
kg CO2/m3.
El comportamiento del rendimiento de extracción de carotenoides fue explicado en un
82,0% por las variables en estudio, siendo la densidad de CO2 la variable que más afectó
con un 53,9%, seguido por la temperatura con un 42,8%.
La densidad del CO2 afectó significativamente (p≤0,05) la concentración de carotenoides
en el extracto con un 66,1% de contribución seguido por el 32,0% de influencia de
temperatura. La mayor concentración de carotenoides fue 17,0 g car/kg aceite registrada a
una temperatura de 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3.
La concentración de esteroles y tocoferoles en el extracto fueron afectadas
significativamente (p≤0,05) por las 2 variables en estudio, siendo la densidad del CO2 la
variable que más contribuyó a la respuesta con un 62,6% y un 60,4% respectivamente.
El aceite obtenido bajo condiciones seleccionadas (55 °C, 900 kg CO2/m3) presentó un
contenido de esteroles totales de 18,8 g esterol/kg aceite, un contenido de carotenoides de
12,2 g car/kg aceite y un contenido de tocoferoles totales de 16,8 g toc/kg aceite.
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Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus
braunii). 43
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ANEXOS
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 51
ANEXOS
ANEXO A. Determinación de la humedad del sustrato
Tabla A-1: Determinación de la humedad inicial de la microalga (Botryococcus braunii).
N° de
réplica
Peso
placa
(g)
Peso muestra
húmeda
(g)
Peso placa +
Muestra seca
(g)
%
humedad
(b.h)
%
humedad
(b.s)
1 27,5029 28,5072 28,4737 3,3357 3,4508
2 27,8300 28,8315 28,7952 3,6246 3,7609
Promedio 4,480±0,205 3.606±0,220
ANEXO B. Determinación del rendimiento de extracción de aceite de microalga B. braunii.
Tabla B-1. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 45°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 1)
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 10,5 18,9 30,5457 30,6284 0,0827 0,0827 0,1639 2,8 24,20
2 5 17,5 31,5 30,9924 31,0069 0,0145 0,0972 0,1927 4,6 28,45
3 10 35 63,0 30,4248 30,4585 0,0337 0,1309 0,2595 9,3 38,31
4 20 70 126,0 30,3473 30,3828 0,0355 0,1664 0,3299 18,6 48,70
5 39 136,5 245,6 30,5223 30,566 0,0437 0,2101 0,4165 36,3 61,49
Tabla B-2. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 65°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 2).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 10,5 18,9 30,5872 30,6728 0,0856 0,0856 0,1068 2,8 15,79
2 5 17,5 31,5 30,5784 30,6369 0,0585 0,1441 0,1799 4,7 26,59
3 10 35 63,0 30,547 30,6289 0,0819 0,226 0,2821 9,3 41,70
4 20 70 126,0 30,7289 30,78 0,0511 0,2771 0,3459 18,6 51,13
5 39 136,5 245,6 30,5709 30,6312 0,0603 0,3374 0,4212 36,3 62,25
An
exos
Efecto
de la
den
sidad y tem
pera
tura
sobre
la ex
tracció
n su
percrítica
de a
ceite de m
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lga (B
otry
oco
ccus b
rau
nii) 5
2
Tabla B-3. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 45°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 3).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,7 21,1 33,5708 33,6366 0,0658 0,0658 0,1182 3,1 17,49
2 5 19,5 35,1 33,3936 33,4343 0,0407 0,1065 0,1914 5,2 28,30
3 10 39 70,2 33,643 33,684 0,041 0,1475 0,2651 10,4 39,20
4 20 78 140,3 34,0229 34,0623 0,0394 0,1869 0,3359 20,8 49,67
5 40 156 280,7 34,0169 34,0592 0,0423 0,2292 0,4119 41,5 60,91
Tabla B-4. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 65°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 4).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,7 21,1 33,6488 33,7939 0,1451 0,1451 0,2226 3,1 32,91
2 5 19,5 35,1 33,5871 33,6186 0,0315 0,1766 0,2709 5,2 40,05
3 10 39 70,2 33,8261 33,8819 0,0558 0,2324 0,3565 10,4 52,70
4 20 78 140,3 34,1826 34,2442 0,0616 0,294 0,4510 20,7 66,67
5 40 156 280,7 33,8335 33,8921 0,0586 0,3526 0,5409 41,5 79,96
An
exo
s
Efecto
de la
den
sidad y tem
pera
tura
sobre
la ex
tracció
n su
percrítica
de a
ceite de m
icroalg
a (B
otry
oco
ccus b
rau
nii) 5
3
An
exos
Tabla B-5. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 41°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 5).
Vial Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,1 20,0 30,3695 30,4398 0,0703 0,0703 0,1369 3,0 20,24
2 5 18,5 33,3 30,7299 30,7652 0,0353 0,1056 0,2056 4,9 30,41
3 10 37 66,6 30,6032 30,635 0,0318 0,1374 0,2676 9,8 39,56
4 20 74 133,2 30,6739 30,7071 0,0332 0,1706 0,3322 19,7 49,12
5 38 140,6 253,0 30,6121 30,6535 0,0414 0,2120 0,4128 37,4 61,05
Tabla B-6. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 69°C y 900kg CO2/m3
(punto de diseño 6)
. Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,1 20,0 30,6479 30,696 0,0481 0,0481 0,0776 3,0 11,48
2 5 18,5 33,3 30,7255 30,7845 0,059 0,1071 0,1729 4,9 25,56
3 10 37 66,6 30,5671 30,6616 0,0945 0,2016 0,3254 9,8 48,11
4 20 74 133,2 30,6063 30,6835 0,0772 0,2788 0,4501 19,7 66,53
5 38 140,6 253,0 30,5292 30,6031 0,0739 0,3527 0,5694 37,4 84,17
An
exo
s
Efecto
de la
den
sidad y tem
pera
tura
sobre
la ex
tracció
n su
percrítica
de a
ceite de m
icroalg
a (B
otry
oco
ccus b
rau
nii) 5
4
Tabla B-7. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55°C y 843kg CO2/m3 (Punto de diseño 7).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 10,5 18,9 30,6681 30,731 0,0629 0,0629 0,1256 2,8 18,56
2 5 17,5 31,5 30,7081 30,7292 0,0211 0,084 0,1677 4,7 24,79
3 10 35 63,0 30,5137 30,5532 0,0395 0,1235 0,2466 9,3 36,45
4 20 70 126,0 30,5791 30,6183 0,0392 0,1627 0,3249 18,6 48,01
5 40 140 251,9 30,6725 30,7162 0,0437 0,2064 0,4121 37,2 60,91
Tabla B-8. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55°C y 957kg CO2/m3 (Punto de diseño 8).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,7 21,1 34,0924 34,2434 0,151 0,151 0,2311 3,1 34,17
2 5 19,5 35,1 34,1318 34,1689 0,0371 0,1881 0,2879 5,2 42,57
3 10 39 70,2 34,0229 34,0687 0,0458 0,2339 0,3580 10,4 52,93
4 20 78 140,3 33,6095 33,6719 0,0624 0,2963 0,4535 20,8 67,05
5 40 156 280,7 34,0595 34,0995 0,04 0,3363 0,5147 41,5 76,10
An
exos
Efecto
de la
den
sidad y tem
pera
tura
sobre
la ex
tracció
n su
percrítica
de a
ceite de m
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a (B
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oco
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nii) 5
5
Tabla B-9. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 9).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,1 20,0 33,3068 33,371 0,0642 0,0642 0,0365 3,0 5,40
2 5 18,5 33,3 33,8312 33,8792 0,048 0,1122 0,0638 4,9 9,43
3 10 37 66,6 33,0507 33,7102 0,6595 0,7717 0,4390 9,8 64,89
4 20 74 133,2 34,1085 34,1559 0,0474 0,8191 0,4659 19,7 68,87
5 40 148 266,3 33,6374 33,6884 0,051 0,8701 0,4949 39,4 73,16
Tabla B-10. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 10).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,1 20,0 34,116 34,2167 0,1007 0,1007 0,1724 3,0 25,49
2 5 18,5 33,3 33,6449 33,6799 0,035 0,1357 0,2323 4,9 34,34
3 10 37 66,6 33,3696 33,4122 0,0426 0,1783 0,3052 9,8 45,13
4 20 74 133,2 34,0313 34,0765 0,0452 0,2235 0,3826 19,7 56,57
5 40 148 266,3 33,8631 33,9074 0,0443 0,2678 0,4585 39,4 67,78
An
exo
s
Efecto
de la
den
sidad y tem
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tura
sobre
la ex
tracció
n su
percrítica
de a
ceite de m
icroalg
a (B
otry
oco
ccus b
rau
nii) 5
6
Tabla B-11. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 11).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,1 20,0 33,8759 33,9593 0,0834 0,0834 0,1543 3,0 22,81
2 5 18,5 33,3 33,8559 33,8984 0,0425 0,1259 0,2330 4,9 34,44
3 10 37 66,6 33,8495 33,8989 0,0494 0,1753 0,3244 9,8 47,95
4 20 74 133,2 33,6447 33,6931 0,0484 0,2237 0,4139 19,7 61,19
5 40 148 266,3 33,5921 33,6368 0,0447 0,2684 0,4966 39,4 73,41
Tabla B-12. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 12).
Vial
Tiempo
(min)
Consumo
L NPT
CO2
g
Peso
Inicial
vial (g)
Final
Peso
extracto (g)
Peso acumulado kg CO2
/ kg SS
g aceite
/ kg MP recuperado corregido
1 3 11,1 20,0 33,6106 33,6832 0,0726 0,0726 0,1289 3,0 19,05
2 5 18,5 33,3 33,9505 33,9992 0,0487 0,1213 0,2153 4,9 31,82
3 10 37 66,6 34,0323 34,091 0,0587 0,18 0,3195 9,8 47,22
4 20 74 133,2 34,2318 34,2809 0,0491 0,2291 0,4066 19,7 60,10
5 40 148 266,3 33,8668 33,9157 0,0489 0,2780 0,4934 39,4 72,93
An
exos
Efecto
de la
den
sidad y tem
pera
tura
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la ex
tracció
n su
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oco
ccus b
rau
nii) 5
7
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 58
ANEXO C. Determinación de la cinética de extracción de aceite de microalga (Botryococcus
braunii).
Figura C-1. Curva cinética de extracción de aceite a 45°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 1).
Figura C-2 Curva cinética de extracción de aceite a 65°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 2).
0
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g S
S)
tiempo (min)
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Ren
dim
ien
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ceit
e/k
g S
S)
tiempo (min)
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 59
.
Figura C-3. Curva cinética de extracción de aceite a 45°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 3).
.
Figura C-4 Curva cinética de extracción de aceite a 65°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 4).
0
10
20
30
40
50
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70
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e/k
g S
S
Tiempo (min)
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0 10 20 30 40 50
Ren
dim
ien
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g a
ceit
e/k
g S
S
Tiempo (min)
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 60
Figura C-5 Curva cinética de extracción de aceite a 41°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 5).
Figura C-6. Curva cinética de extracción de aceite a 69°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 6).
0
10
20
30
40
50
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70
0 5 10 15 20 25 30 35 40
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ien
to (
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ceit
e/k
g S
S)
tiempo (min)
0
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40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Re
nd
imie
nto
(g
ace
ite
/kg
SS
Tiempo (min)
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 61
Figura C-7.Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 843kg CO2/m3 (Punto de diseño 7).
.
Figura C-8. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 957kg CO2/m3 (Punto de diseño 8).
0
10
20
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g S
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Tiempo (min)
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Ren
dim
ien
to (
g a
ceit
e/k
g S
S
Tiempo (min)
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 62
.
Figura C. 9 Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 9).
.
Figura C-10. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño
10).
0
10
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g a
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g S
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Tiempo (min)
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Ren
dim
ien
to (
g a
ceit
e/k
g S
S
Tiempo (min)
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 63
.
Figura C-11. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño
11)
.
Figura C-12. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3
(Punto de diseño
12)
0
10
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Ren
dim
ien
to (
g a
ceit
e/k
g S
S
Tiempo (min)
0
10
20
30
40
50
60
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80
0 10 20 30 40 50
Ren
dim
ien
to (
g a
ceit
e/k
g S
S
Tiempo (min)
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 64
ANEXO. D Análisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii).
Tabla D-1. Datos curva de calibración para la concentración de carotenoides en el aceite de
microalga B. braunii
Diluciones β-caroteno
(mg/mL)
Absorbancia
1 0 0
2 0,05 0,895
3 0,04 0,716
4 0,03 0,545
5 0,02 0,366
6 0,01 0,184
Figura D-1. Curva calibración carotenoides totales.
y = 0,0556x R² = 0,9998
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
β-c
aro
ten
o (
mg/m
L)
Absorbancia
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 65
Tabla D-2. Datos curva de calibración para la concentración de esteroles en el aceite de
microalga B. braunii.
Figura D-2.Curva de calibración esteroles totales.
Diluciones Absorbancia a
15mn
Estigmasterol
(mg /mL)
1 0,951 0,40
2 0,678 0,30
3 0,574 0,25
4 0,442 0,20
5 0,357 0,15
6 0,234 0,10
7 0,102 0,05
8 0,000 0,00
y = 0,425x + 0,0039 R² = 0,9979
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000
mg e
stig
mast
erol/
ml
absorbancia a 15mn
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 66
Tabla D-3. Datos curva de calibración para la concentración de tocoferoles en aceite de
microalga (Botryococcus braunii).
Diluciones α-Tocoferol
(mg/mL) Absorbancia
1 0,05 0,979
2 0,04 0,813
3 0,03 0,616
4 0,02 0,428
5 0,01 0,212
Figura D-3. Curva de calibración para tocoferoles totales.
y = 0,0497x R² = 0,9976
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
α-t
oco
fero
l (m
g/m
L)
Absorbancia
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 67
ANEXO E
Análisis Estadístico
Figura E-1 Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extracción de aceite
(Y1).
Figura E-2. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de carotenoides (Y2).
60
65
70
75
80
85
90
60 70 80 90
Y P
red
ich
o
Yac Experimental
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
8 10 12 14 16 18
Y P
red
ich
o
Y Ac Experimental
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 68
Figura E-3. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de esteroles (Y3).
Figura E-4. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4).
15
16
17
18
19
20
21
22
23
15 16 17 18 19 20 21 22 23
Y P
red
ich
o
Y Ac Experimental
15,5
16,0
16,5
17,0
17,5
18,0
15,5 16,5 17,5 18,5
Y P
red
ich
o
Y Ac Experimental
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 69
Figura E-5. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5).
Figura E-6. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6)
480
580
680
780
880
980
1080
1180
1280
1380
1480
490 690 890 1090 1290 1490
Y P
red
ich
o
Y Ac Experimental
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
960 1060 1160 1260 1360 1460 1560 1660 1760
Y P
red
ich
o
Y Ac Experimental
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 70
Figura E-7. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7).
Tabla E-1. Análisis de varianza para el rendimiento de extracción de aceite.
Fuente Suma de
cuadrados Gl Varianza
Valor F
exp Probabilidad
R2
%
X1 344,62 1 344,2 24,67 0,0025* 45,93
X2 186,36 1 186,36 13,34 0,0107* 24,84
X12
3,19 1 3,19 0,23 0,6495 0,43
X22
48,71 1 48,71 3,49 0,1111 6,49
X1X2 83,63 1 83,63 5,99 0,0500* 11,15 X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m
3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo
(p<0,05).
970
1020
1070
1120
1170
1220
1270
1320
1370
1420
1470
990 1090 1190 1290 1390 1490
Y P
red
ich
o
Y Ac Experimental
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 71
Tabla E-2. Análisis de varianza para la concentración de carotenoides en el aceite.
Fuente Suma de
cuadrados Gl Varianza
Valor F
exp Probabilidad
R2
%
X1 23,21 1 23,21 274,7 0,0001* 31,97
X2 47,88 1 47,88 566,69 0,0001* 65,94
X12 0,0081 1 -0,0081 0,096 0,767 0,01
X22 0,1 1 0,1 1,22 0,3118 0,14
X1X2 0,9 1 0,9 10,68 0,0171* 1,24
X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo
(p<0,05).
Tabla E-3. Análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite.
Fuente Suma de
cuadrados Gl Varianza
Valor F
exp Probabilidad
R2
%
X1 6,51 1 6,51 10,8 0,0167* 17,32
X2 23,52 1 23,52 39,04 0,0008* 62,57
X12 1,5 1 1,5 2,49 0,166 3,99
X22 0,16 1 0,16 0,26 0,6288 0,43
X1X2 2,28 1 2,28 3,78 0,0997 6,07
X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo
(p<0,05).
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 72
Tabla E-4. Análisis de varianza para la concentración de tocoferoles en el aceite.
Fuente Suma de
cuadrados Gl Varianza
Valor F
exp Probabilidad
R2
%
X1 0,0071 1 0,0071 0,072 0,797 0,22
X2 1,95 1 1,95 19,61 0,004* 60,42
X12 0,41 1 0,41 4,12 0,089* 12,70
X22 0,000062 1 0,000062 0,00062 0,981 0,00
X1X2 0,26 1 0,26 2,56 0,161 8,06
X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo
(p<0,05).
Tabla E-5. Análisis del rendimiento de carotenoides.
Fuente Suma de
cuadrados Gl Varianza
Valor F
exp Probabilidad
R2
%
X1 329600 1 329600 113,66 0,0001* 42,76
X2 414800 1 414800 143,03 0,0001* 53,81
X12 1,05 1 1,05 0,00036 0,9854 0,00
X22 1350,71 1 1350,71 0,47 0,5204 0,18
X1X2 7739,6 1 7739,6 2,67 0,1535 1,00
X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo
(p<0,05).
Anexos
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga
(Botryococcus braunii). 73
Tabla E-6. Análisis del rendimiento de esteroles
Fuente Suma de
cuadrados Gl Varianza
Valor F
exp Probabilidad
R2
%
X1 24800,15 1 24800,15 3,87 0,0968 5,79
X2 331200 1 331200 51,68 0,0004* 77,36
X12 22136,55 1 22136,55 3,45 0,1125 5,17
X22 5415,63 1 5415,63 0,84 0,3935 1,27
X1X2 6093,36 1 6093,36 0,95 0,3672 1,42
X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo
(p<0,05).
Tabla E-7. Análisis del rendimiento de tocoferoles
Fuente Suma de
cuadrados Gl Varianza
Valor F
exp Probabilidad
R2
%
X1 91071,51 1 91071,51 21,03 0,0037* 36,15
X2 101800 1 101800 23,52 0,0029* 40,41
X12 5660,12 1 5660,12 1,31 0,2965 2,25
X22 12580,5 1 12580,5 2,91 0,1392 4,99
X1X2 14853,52 1 14853,52 3,43 0,1135 5,90
X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo
(p<0,05).