METODOS DE METODOS DE OBSERVACION DE LOS OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS

DEPARTAMENTO DE DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA

Observación microbiana

• En vivo: exámen en fresco de una suspensión bacteriana, se usa principalmente para visualizar Hongos unicelulares, protozoos y helmintios.

• Ayuda a observar movimiento y forma de los Mo,s

•Preparado coloreado: frotis o extendido que al ser teñido permite visualizar la forma, tamaño y disposición de los diferentes tipos de bacterias o la observación de elementos no habituales (flagelos, cápsula ó esporas).

Técnica (observación in vivo)

• Colocar parafina o vaselina en los bordes del cubreobjeto.

• Depositar una gota en el cubreobjetos

• Cubrir con el cubreobjetos primero desde una arista al total de la superficie.

• Observación.

• Desventajas: falta de contraste y resolución,

Técnica ( observación coloreada)

• Con un portaobjeto limpio y desgrasado y con el asa y la pipeta se le coloca una gota de agua destilada estéril.

• Se toma con el asa y se coloca en el portaobjeto y se le homogeniza con el agua estéril,

• Se extiende la muestra sin tocar los cuatro bordes del cubreobjetos

• Se deja que el portaobjeto se seque al aire o se le mantiene a 40 cm de la llaman y se fija

• La fijación tiene el objeto de que las bacterias queden adheridas al vidrio.

fijación

• Existen dos métodos:• 1. Método de Koch (físico):• Consiste en hacer tres pasajes lentos sobre

el mechero dejando enfriar entre cada uno de ellos.

• 2. Metanol (químico): • Extendido con alcohol metílico por 5

minutos y despues colorear

Colorantes

• Productos químicos derivados del Alquitrán, especialmente el benceno

• La molécula del colorante está formada por dos segmentos el Cromóforo y el auxócromo, el primero tiene color y el segundo la afinidad

• La afinidad esta dada por la disociación electrolítica de este segmento y la formación de sales insolubles con las proteínas, glucoproteínas y lipoproteinas de los tejidos y paredes.

• El grupo auxocromo determina que se los clasifique en básicos o catiónicos, ácidos o aniónicos.

• Colorantes Básicos: violeta de Genciana, Fucsina básica, rojo neutro, etc.

• Colorantes Acidos: Fucsina ácida, eosina

• Neutros: eosianato de azul de metileno.

Coloración Simple

• Son las que emplean un solo colorante y tiñen todos los elementos por igual.

• Técnica: fijar, cubrir, lavar y observar

• Ventajas: Observ. Rápida y sencilla de la morfología bacteriana.

• Desventajas: no es posible diferenciar si la muestra es monoespecífica o mixta.

Compuestas o diferenciales

• Usan dos colorantes lo que permite teñir de distintos modos las diversas clases de bacterias, los métodos más empleados son:

• Tinción de Gram. y de Ziehl-Neelsen

• En estas coloraciones se usan cuatro componentes de manera progresiva:

• 1. Colorante principal o primario: colorante básico que al entrar en contacto con las células cargadas negativamente las colorea

• 2. Mordiente: le da mas intensidad y más fijación (sales metálicas, solución yodada o lugol, taninos y fenol)

• 3. Agente decolorante: Disolvente orgánico como el alcohol, ácido o alcohol acetona

• 4. Contracolor o colorante secundario:

• Colorante básico de distinto color que el primero.

Tinción de Gram

• Utilizada más habitualmente

• Facilita la observación bacteriológica

• Permite diferenciar entre gram positivo y gram negativo.

Fundamento

• La afinidad por el color depende en gran medida de la composición química de la pared celular

• Después de realizar los primeros cuatro pasos, todas las bacterias se ven color violeta.

• Al finalizar la técnica las que conservan el color violeta se denominan Gram Positivas

• Y las que no lo conservan Gram Negativas.

Cont. fundamento

• Los decolorantes orgánicos utilizados abren los poros de la membrana externa de las bacterias gram negativas (constituidas principalmente por lipoproteínas y lipopolisacáridos) y permiten la salida del colorante principal quedando desprovistos de color.

• Al agregar el contracolor éstos quedan teñidos de rojo (fucsina o safranina).

Diferencias estructurales

Técnica

1. Una vez fijado el extendido cubrir la superficie con cristal violeta (colorante primario) y dejar en contacto un minuto

2. Lavar con agua abundantemente.

3. Cubrir con Lugol(mordiente) por 1 minuto.

4. Lavar con abundante agua

Cont. Tinción de gram.

• Inclinar el portaobjeto y dejar gotear el alcohol acetona (decolorante) hasta que el preparado deje de perder color.

• Lavar con agua

• Agregar el (contracolor) fucsina básica por 1 minuto

• Lavar, secar al aire, observar.

Ventajas y desventajas

• Es un método rápido y sencillo

• Permite observar: forma, tamaño y disposición.

• Hace diferenciación entre biota mixta o monoespecífica

• Proporciona orientación terapéutica.

• Se conservan los preparados.

• Gram. + vrs. Gram -

• Algunas micobacterias y hongos pueden no tomar la coloración

• Bacterias sin pared las tiñe débilmente (mollicutes)

• La técnica es más laboriosa que la técnica simple.

Otras tinciones

• Coloración de Zielh Nielsen:• Bacterias del género Mycobacterium, la

especie Nocardia, las especies Corynebacterium y ocasionalmente actinomicetos no se tiñen con la coloración Gram.

• Estas bacterias tiene la capacidad de resistir la decoloración por ácidos y alcohol

Cont. Otras tinciones

• Esta propiedad se debe al alto contenido de lípidos complejos (ácidos micólicos) y ceras que poseen algunos microorganismos en su pared celular.

• Acido Alcohol resistentes (AAR): Mo,s que resisten la decoloración se ven de color rojo.

• No Acido Alcohol resistentes (No AAR):• No resisten la acción de los decolorantes y se ven

de color azul.

Coloración de Giemsa

• Utilizada para la diferenciación intra y extracelular de parásitos en sangre circulante. (plasmodium y especies de Leishmania, Candida, Hisptoplasma capsulatum, y Pneumocystis carinii, inclusiones virales, Mollicutes, Rickettsia y Chlamydia.

• Se observan también los elementos celulares de la respuesta inflamatoria.

• La Cápsula: Por sus características químicas no se tiñe con colorantes básicos para ello se utiliza la Tinción negativa o indirecta.

• No tiñe sino que se deposita alrededor resaltando los contornos.

• Se utiliza Tinta china (suspensión de partículas de carbón coloidal) Moléculas grandes que no entran en la cápsula.

• La utilidad de esta técnica es que revela cápsulas bacterianas y micóticas.

Tinción de endosporas

• Sin teñir se ven como estructuras refringentes intracelulares

• Con la tinción de gram se ven como zonas incoloras dentro de las células teñidas

• Con calor + verde de malaquita y safranina. (El calor permite la penetración del del colorante).

Tinción de flagelos y cilios

• Fuera del poder de resolución del microscopio óptico común por delgadas.

• Para verlos se agrega una suspensión coloidal de sales de ácido tánico (mordiente)

• Formara un precipitado que engrosara el tamaño de las estructuras

• Se aplica fucsina ácida y se visualizan como estructuras rojas.