Tipificación VPH PCRtr - comanes.org · o sugestivo de vph nic 1 nic2 nic 3 carcinoma h.e 460 ......

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  • Tipificacin VPH PCRtrResultados en medio privado

    Dr. Jos de J. Curiel ValdsAnatomopatlogo

    Patlogo ClnicoColposcopista

    Academia Mexicana de Ciruga

  • Evolucin en la deteccin del Cncer de Crvix

    ThinPrep SurePath

    1996 19991949

    LBC: Citologa lquida

    2003

    Revisin de las pautas de screening

    1990s LBC 2000sTest de Papanicolau

    VHP 99,7% Cnceres de Crvix1

    1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )

    PCR

    1980

    P16 CINTecCervatec p16 ELISA

    L1Ag CytoactivONCOTEC mRNA E6/E7Screening 1 basado en

    DNA HPV

    HC-2 / H VentanaAmplicor* RocheDNA Invader* WD

    2008PREVENCION PRIMARIA

    ESCENARIO POSTVACUNAL

    Prevencin SecundariaProg. Base PoblacionalFinlandia 1963-2008

    Meisels and Fortin 1976Purola and Savia 1977Coilocito / Efecto citopatico HPV

    Drst et al. 1983

  • 1.- Estudio de Papanicolaou citologa cervical.

    2.- Colposcopa

    3.- Biopsia Estndar de

    4.- Pruebas moleculares

    Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?

    FORMA TRADICIONAL

    FORMA MODERNAMAS SEGURA

    BASE LIQUIDA

  • Es el mtodo de deteccin recomendado Se considera en NIC 1 poco sensible y especfica. Solo es positiva por definicin si existe una fase

    productiva. NIC 2 y 3 es mas sensible y especfica. En base lquida sube la sensibilidad y especificidad. Es estndar para medir esta sensibilidad y

    especificidad ha sido la biopsia.

    Citologa

  • Indicada cuando existe una citologa anormal

    Usada de rutina y en personas de 20 a 30 aos es causa de sobre diagnstico

    Imgenes en mosaico de diversos tipos, relieves, patrn de vasos etc.

    Algunos muy caractersticos.

    Siempre requiere de biopsia que lo corrobore.

    Colposcopa

  • 2.- Colposcopa

    3.- Biopsia Estndar de Oro (?)

    4.- Pruebas moleculares

    Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?

    NORMAL

    VIRUS

  • ALGUNAS IMGENES COLPOSCPICAS Y SU CORRELACIN HISTOLGICA

    FinoMetaplasia Madura

    Metaplasia InmaduraRara vez NIC

    DensoNIC Alto Grado

    Liso

    FinoMetaplasia Maduracon paraqueratosis

    GruesoNIC Alto Grado

    a Carcinoma Invasor

    Mosaico

    FinoNIC I

    GruesoNIC II y III

    Punteado

    Metaplasia queratinizante

    Siempre ver quehay por debajo

    Leucoplasia

    Aceto Blanco

  • 1.- Estudio de

    2.- Colposcopa

    3.- Biopsia Estndar de Oro (?)

    4.- Pruebas mol

    Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?

    NORMAL

    VIRUS

  • TODAS LESIONES ACETOBLANCAS

    NINFLAMATORIO/REACTIVO

    O SUGESTIVO DE VPH NIC 1 NIC2 NIC 3 CARCINOMA

    H.E 460 R /S 128 296 28 5 3

    NEGATIVO 46.3 %POSITIVO

    53.7 % DE + A +++ NUCLEAR O CITOPLASM

    P16 460 213 212 20 12 3

    P16 VS HISTOLOGA

    Curiel-Valds Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008

  • Valor Predictivo positivo: VP(+) = 0.5650

    Valor Predictivo Negativo: VP(-) = 0.5986

    Sensibilidad: Se = 0.7540

    Especificidad: Es = 0.3872

    ESTADSTICA ENTRE H.E. Y P16

    Curiel-Valds Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008

  • CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR EXPERTOS

    CONCORDANCIA INTEROBSERVADORCON H.E Y P16

    NORMAL L. No Dx NIC 1 NIC 2 NIC 3 CARCINOMA TOTAL CONCORDANCIA

    NORMAL 71% 3% 52% 35% 72% 94% 3800 71%

    P 16 94% * 91% 100% 99% 100% 96%

    KLAES AM. J. SURG PATH. NOV 2002

    NIC DE 40 A 97 %

  • FRAG 1 NIC 1

    FRAG 2 NIC 2

    100 % OBJETIVO

    PATOLOGOSMEXICANOS

    POSITIVO FOCAL

    POSITIVO DIFUSOCuriel-Valds Rev Mex de G y obstet 2008

  • No todo lo que parece es!!!

  • UNIVERSO POSIBLE A ESTUDIAR

    80-90% < 25 aos~20 % > 30 aos

    40-50% < 25 aos~20 % 30 aos

    30 aos

    A quienes seleccionar

  • UNIVERSO CON ENFERMEDAD GRAVENUESTRO OBJETIVO A ENCONTRAR

    P16

    PCR Y CH II

    A quienes seleccionar

  • J.J.C.V.

    PORTADOR

    Debemos situar de manera segura a nuestra paciente en este esquema

    antes de cualquier tratamiento

    METAPLASIAS

    HS

  • Espectros molecular y visiblepara diagnstico de VPH

  • DETECTAR LAS INFECCIONES PERSISTENTES PREDOMINATEMENTE POR VIRUS DE ALTO RIESGO

    DEFINICIN DE ALTO RIESGO POR BIOLOGA MOLECULAR Y DATOS

    EPIDEMIOLGICOS. CASOS CON Dx HISTOLGICO DE CNCER Y NIC

    META

  • PCR CH2 OTROS

    Inmunohistoqumica: P16 L 1 DE Cpsula otros

    METODOS MOLECULARES

  • PRODUCTIVA: L1 Y L2 TRANSFORMANTE: E6 (P53) Y E7 (gRb) (ONCOGNICA)

    AMBAS EN TRES ETAPAS CLNICAS PORTADOR SANO INFECCIN SUBCLNICA INFECCIN CLNICA

    INFECCION POR VPHDOS MODALIDADES

    TRES ETAPAS

  • Deteccin

    Como riesgo

    Enfermedad

    Diagnstico yCapacidad de progresin

    Estudio citolgico

    Sensibilidad medianaEspecificidad alta

    Colposcopa

    Sensibilidad altaEspecificidad baja

    Biopsia

    Sensibilidad alta Especificidad mediana a alta

    Clnico GineclogoColposcopista

    Colposcopa y Toma de muestras

    AnatomopatlogoCitopatlogo

    Interpretacin y diagnstico

    Patlogo

    Deteccin a confirmacin

    Donde est el Patlogo en el diagnstico del VPH

  • EPIDEMIOLOGIADETECCION: Presencia de VPH como mtodo primario de tamizaje antes de citologa

    CONFIRMACION DE DX ?

    SEGUIMIENTO DESPUS DE TRATAMIENTO

    CURIOSIDAD (POSITIVO EN LA PAREJA) USO EN HOMBRES (?) EN TEJIDOS FRESCO Y PARAFINA

    Involucrados: Bilogos molecularesAnatomopatlogos Patlogos Clnicos, Qumicos

    Para que se usan las pruebas moleculares

  • EVOLUCIN DE VIRUS PRESENTE A VIRUS TRANSFORMANTE

  • HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age

    15-19

    20-24

    25-29

    30-34

    35-39

    40-44

    45-49

    50-54

    55-59

    60-65

    Age (Years)

    HPV

    Pre

    vale

    nce

    (%) HPV (HC2)

    Cancer

    1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    Canc

    er in

    cide

    nce

    per 1

    00,0

    00

  • Porque? Involucionan o evolucionan

  • Ciclo viral productivo y transformante

  • Replicacin, y electroforesis con comparacin de un codigo de barras contra controles ya establecidos.

    No es absoluta la comparacin, similitud de un % decreciente 95 % virus de alto riesgo 89 % virus de bajo riesgo 70 Virus de alto riesgo.

    PCR secuencial o de punto final

  • Los tipos pueden variar dentro de los grupos ya que se parecen molecularmente

  • Como un mtodo de Dx epidemiolgico.

    Detecta desde portadores y enfermedad transitoria hasta enfermos

    No distingue fase productiva o transformante

    Selecciona a quienes vigilar de los 30 aos en adelante.

    PCR de punto finalIndicaciones de uso

  • Hibridacin ADN/ARN. Cctel de sondas:

    - Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.

    - Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44. Sensibilidad adecuada a procesos de

    tamizaje de VPH (1 pg/mL). Aprobado por la FDA. Posibilidad de semicuantificar. Estandarizada y automatizable.

    (Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)

    Deteccin del VPH mediante amplificacin de la seal. Tecnologa de captura de hbridos (HC2)

  • Al ser menos sensible a travs de estudio se ha comprobado que detecta a los mas capaces de inducir neoplasia.

    Factor pronstico de progresin.

    Aprobado por FDA

    Posteriormente su fuerza especificidad de no LAG o CaCu

    CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA

  • Una prueba negativa de CH2 no significa que no se tenga virus

    El mtodo ha sido estandarizado de manera que las unidades relativas de luz detectadas se compararon con la evolucin a Ca Cu

    Se requiere un nmero relativamente elevado de copias para que sea oncognico

    Por ello es que se requiere realizar la prueba cada 3 aos

    CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA

  • El mismo mtodo para subir la temperatura y desdoblar la cadena de DNA

    Ciclos con temperatura controlada con sustratos que emiten luz

    Medida a diferentes temperatura y diferentes colores para los tipos especficos de virus

    El proceso dura unas horas y se realiza en una termociclador programado que lee EN TIEMPO INMEDIATO (REAL) la progresin de la replicacin viral.

    PRC en tiempo real

  • Deteccin segura del tipo viral: la lectura de la electroforesis es dependiente de la calidad de la electroforesis, en PCR TR esta dada por la temperatura de unin y el color en cada ciclo

    Deteccin de enfermedades mixtas (varios tipos virales) PCR de punto final el tipo que predomina inhibe a los otros y no se detectan.

    Tiempo de proceso: el mismo da (se requieren cuando menos 16 muestras por corrida) PCR tradicional mnimo 10 das

    Costo: es semejante

    PRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto final

  • Mtodo de tamizaje Es mas senisble que el estudio citolgico (pero es mas caro) Si se realiza de manera simultnea obliga a revisar la

    citologa de manera mas minuciosa, evita falsos negativos sobre todo el LAG

    Detecta mas mujeres en riesgo sin enfermedad (CCV detecta solo las que tienen enfermedad)

    CH2 y PCR tiempo real FUTURO

  • Es preferible hacer colposcopa y tomar biopsia. La Positividad de PCR, CH2 no indica necesariamente

    NIC, puede ser metaplasia atpica o inmadura con virus en reposo.

    En EU la colposcopa y la biopsia son mucho mas caras que una prueba de PCR o CH2.

    Si sale positiva en EU ya se manda a Colposcopa y biopsia.

    En ASC US o H en Mxico

  • PCR tr REPORTE

  • Detalles de informe

  • Controles detalles

  • PCRtr permite la cuantificacin de los virus y ello permitehacer una homologa con CH2 ya que esta no significa queen realidad no se tenga VPH

    Reporte grfica

  • Ejemplos de infeccin mixta

  • Ejemplos de infeccin mixta

  • Ejemplos de infeccin mixta

  • Se realizaron 1234 estudios de PCRtr para determinar la presencia y en su caso, el genotipo de VPH

    3 aos (2013-2015) en pacientes atendidos en nuestra clnica de patologa.

    En el 98% de las determinaciones se realizaron en mujeres (cervicales), el resto en hombres (no cervicales).

    El promedio de la edad global fue de 33.74+9.39 aos, con un rango de los 11 a los 83 aos de edad. La edad en relacin al sexo no fue diferente (p>0.05), sin embargo, la edad de los hombres fue 3 aos mayor a la edad de las mujeres (36.9+11.91 vs 33.5+9.0).

    El 36.2% de las muestras realizadas pertenecan a personas menores de 30 aos

    Deteccin de tipo viral en medio privado D.F. 2.5 aos

  • Estudio estadstico

    Se determin media y desviacin estndar, frecuencias y porcentajes.

    Se aplicaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov, T de Student, ANOVA y Chi cuadrada.

    Se calcularon los parmetros de prueba diagnstica con un intervalo de confianza del 95%.

    El anlisis se realiz con el programa SPSSv19 y con el programa Epidat3.1.

    Se tom como significancia estadstica un valor de p

  • Resultados

    Tabla 1. Intervalos de la edad de las personas evaluadas con la tcnica de PCR

    Frecuencia

    Porcentaje vlido

    Intervalos de edad (aos)

    11-18

    10

    0,8

    19-25

    206

    17,0

    26-33

    472

    39,0

    34-43

    365

    30,2

    44-53

    106

    8,8

    54-63

    41

    3,4

    64-73

    8

    0,7

    74-83

    2

    0,2

    Total

    1210

    100,0

  • PCR en relacin al sexo

    Tabla 2. Relacin del resultado de la PCR y el sexo.

    P=0.17

    pcr

    Total

    pos

    neg

    Sexo

    mujeres

    442

    657

    1099

    40,2%

    59,8%

    100,0%

    hombres

    12

    11

    23

    52,2%

    47,8%

    100,0%

    Total

    454

    668

    1122

    40,5%

    59,5%

    100,0%

  • Tabla 3. Asociacin del resultado de la PCR de acuerdo a los intervalos de edad.

    P=0.001

    pcr

    Total

    pos

    neg

    edad cat1

    11-18

    4

    6

    10

    0,9%

    0,8%

    0,8%

    19-25

    104

    102

    206

    23,3%

    13,4%

    17,0%

    26-33

    175

    297

    472

    39,1%

    38,9%

    39,0%

    34-43

    116

    249

    365

    26,0%

    32,6%

    30,2%

    44-53

    30

    76

    106

    6,7%

    10,0%

    8,8%

    54-63

    16

    25

    41

    3,6%

    3,3%

    3,4%

    64-73

    2

    6

    8

    ,4%

    ,8%

    ,7%

    74-83

    0

    2

    2

    ,0%

    ,3%

    ,2%

    Total

    447

    763

    1210

    100,0%

    100,0%

    100,0%

  • 05

    10152025303540

    11 a 25aos

    26 a 33 34 a 43 44 a 53 54 a 83

    PositivosNegativosColumna1

  • PCR y citologa

    *

    * Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba

    Tabla 4. Relacin entre el resultado de la PCR y del PAP.

    P=0.0001

    pcr

    Total

    pos

    neg

    papResul

    Neg I y II

    236

    560

    796

    82,8%

    99,5%

    93,9%

    ASCUS

    16

    0

    16

    5,6%

    ,0%

    1,9%

    NIC

    33

    3

    36

    11,6%

    ,5%

    4,2%

    Total

    285

    563

    848

    100,0%

    100,0%

    100,0%

  • PCR y Biopsia

    * Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba

    Tabla 5. Relacin del resultado de la PCR con los resultados de la Biopsia.

    P=0.43

    pcr

    Total

    positivo

    negativo

    BIOPSIA

    Metaplasia

    66

    17

    83

    56,9%

    68,0%

    58,9%

    NIC 1

    38

    4 *

    42

    32,8%

    16,0%

    29,8%

    NIC2

    3

    0

    3

    1,7%

    ,0%

    1.7%

    NIC3

    2

    0

    2

    1,7%

    ,0%

    1,4%

    No cervical

    8

    3

    11

    6,9%

    12,0%

    7,8%

    Total

    116

    25

    141

    100,0%

    100,0%

    100,0%

  • Sensibilidad y especificidad de PCRtr

    Tabla 6. Resultados de la PCR como prueba diagnstica tomando en cuenta a la biopsia como estndar de oro

    Sensibilidad

    (IC 95%)

    Especificidad

    (IC 95%)

    VPP

    (IC 95%)

    VPN

    (IC95%)

    ndice de Validez

    IC95%)

    Prevalencia (IC95%)

    PCR (n=141)

    85.71%

    (75.66-95.77)

    20%

    (10.91-29.09)

    41.38%

    (31.99-50.77)

    68%

    (47.71-88.29)

    46.1%

    (37.5-54.6)

    39%

    (31.29-48.15)

  • Los genotipos de AR se asociaron a la Citologa positiva (P=0.0001)

    Los genotipos de bajo riesgo estn asociados tanto a Citologa como a la Biopsia positiva (P=0.0001)

    En relacin a sexo, (mujer) (p=0.0001)

    No hubo validez estadstica con la edad (p=0.035)

  • PCR de punto final dos etapas 1994 a 2004 2013

  • Positivos AR 76 43.6% 16 27 15.5 % 18 12 6.9% 31 7 4.0% 16 y 18 5 2.9%

    Positivos BR 24 6 7 29% 11 5 20.8% 37 4 16.7%

    PCR punto final o secuencia 2013174 casos Poblacin con E anormal

  • Pareja con PCRtr correlacin 80% Pareja con PCR tradicional 20%

    En relacin a persistencia: Con PCR tradicional se opt por inicial tipificar y despus con

    CH2. Haba cambios de tipo viral frecuente

    Con PCRtr en infecciones mltiples se aprecia eliminacin de varios y se conservan algunos o es negativo en su totalidad.

    Seguimiento y correlacin con la pareja

  • Mujer de 40 aos de edad con estudio citolgico anormal, LAG

    Colposcopa normal, UEC en el orificio muy pequeo PCRtr positiva VPH 16 y 31 Cono diagnstico

    Caso clnico 1

  • Cono diagnstico

  • PCR RT es una metodologa que se est usando en forma alterna y mas segura que CH2 y PCR de punto final

    1.- Detecta infecciones mltiples 2.- El tipo viral detectados en el mas real 3.- Mismo costo 4.- Menos tiempo de proceso 5.- En ETS es mas segura y con un costo similar a los

    dos cultivos.

    Conclusin

    Tipificacin VPH PCRtrResultados en medio privadoEvolucin en la deteccin del Cncer de CrvixCmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?CitologaColposcopaCmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?ALGUNAS IMGENES COLPOSCPICAS Y SU CORRELACIN HISTOLGICACmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?P16 VS HISTOLOGAESTADSTICA ENTRE H.E. Y P16CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR EXPERTOSNmero de diapositiva 12No todo lo que parece es!!!Nmero de diapositiva 14A quienes seleccionarA quienes seleccionarNmero de diapositiva 17Espectros molecular y visiblepara diagnstico de VPHMETANmero de diapositiva 20METODOS MOLECULARESINFECCION POR VPHDOS MODALIDADESTRES ETAPASDonde est el Patlogo en el diagnstico del VPHPara que se usan las pruebas molecularesNmero de diapositiva 27Nmero de diapositiva 28Nmero de diapositiva 29Nmero de diapositiva 30Nmero de diapositiva 31HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by AgeNmero de diapositiva 36Nmero de diapositiva 37Porque? Involucionan o evolucionanCiclo viral productivo y transformantePCR secuencial o de punto finalNmero de diapositiva 47Los tipos pueden variar dentro de los grupos ya que se parecen molecularmente PCR de punto finalIndicaciones de usoNmero de diapositiva 52CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICACAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICAPRC en tiempo realPRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto finalCH2 y PCR tiempo real FUTURONmero de diapositiva 61En ASC US o H en MxicoPCR tr REPORTEDetalles de informeControles detallesReporte grficaEjemplos de infeccin mixtaEjemplos de infeccin mixtaEjemplos de infeccin mixtaDeteccin de tipo viral en medio privado D.F. 2.5 aosEstudio estadsticoResultadosPCR en relacin al sexoNmero de diapositiva 84Nmero de diapositiva 85PCR y citologaPCR y BiopsiaSensibilidad y especificidad de PCRtrNmero de diapositiva 89PCR de punto final dos etapas 1994 a 2004 2013PCR punto final o secuencia 2013174 casos Poblacin con E anormalSeguimiento y correlacin con la parejaCaso clnico 1Cono diagnsticoConclusin