Title コメットアッセイを用いた膀胱上皮における遺...

Title コメットアッセイを用いた膀胱上皮における遺伝毒性評価法の開発( 本文(Fulltext) )

Author(s) 和田, 邦生

Report No.(DoctoralDegree) 博士(獣医学) 乙第141号

Issue Date 2016-03-14

Type 博士論文

Version ETD

URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/54519

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

コメットアッセイを用いた膀胱上皮に

おける遺伝毒性評価法の開発

2015 年

岐阜大学大学院連合獣医学研究科

和田邦生

コメットアッセイを用いた膀胱上皮に

おける遺伝毒性評価法の開発

和田邦生

1

【目次】

序論 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 2

第 1 章肝臓と胃を用いたコメットアッセイの基礎検討 ------------------------------ 6

諸言 ---------------------------------------------------------------------------------------------- 7

材料および方法 ---------------------------------------------------------------------------------- 9

結果 --------------------------------------------------------------------------------------------- 16

考察 --------------------------------------------------------------------------------------------- 20

小括 --------------------------------------------------------------------------------------------- 26

第 2 章膀胱における DNA 損傷評価のための膀胱上皮細胞の回収方法の

比較検討 ------------------------------------------------------------------------------------------ 27

緒言 --------------------------------------------------------------------------------------------- 28

材料および方法 --------------------------------------------------------------------------------- 31

結果 --------------------------------------------------------------------------------------------- 35

考察 --------------------------------------------------------------------------------------------- 38

小括 --------------------------------------------------------------------------------------------- 43

第 3 章膀胱発がん関連物質 7 剤を用いた遺伝毒性物質と非遺伝毒性物質の

鑑別 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 44

緒言 --------------------------------------------------------------------------------------------- 45

材料および方法 --------------------------------------------------------------------------------- 47

結果 --------------------------------------------------------------------------------------------- 51

考察 --------------------------------------------------------------------------------------------- 54

小括 --------------------------------------------------------------------------------------------- 61

第 4 章酸化損傷認識酵素を用いた改良コメットアッセイによる

2-ニトロアニソールの膀胱における酸化的 DNA 損傷の検出 ---------------------- 63

緒言 --------------------------------------------------------------------------------------------- 64

材料および方法 --------------------------------------------------------------------------------- 66

結果 --------------------------------------------------------------------------------------------- 70

考察 --------------------------------------------------------------------------------------------- 73

小括 --------------------------------------------------------------------------------------------- 77

結論 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 79

謝辞 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 82

要旨 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 83

Abstract ----------------------------------------------------------------------------------------------- 86

Figures ------------------------------------------------------------------------------------------------ 89

Tables ------------------------------------------------------------------------------------------------- 95

文献 ---------------------------------------------------------------------------------------------- 107

2

序論

農薬，医薬品，一般化学品など新規化学物質が開発される際に，その安全性に

ついて数多くの動物を用いて評価する必要がある。特に，発がん性試験について

は，一つの化学物質に対し 2 年以上の試験期間とそれに伴う多額の費用が発生す

ることから，すべての物質に対して発がん性試験を行うことは不可能である。そ

こで，発がん性の懸念を軽減するためのスクリーニング試験として遺伝毒性試験

が利用されている。すなわち，遺伝毒性試験は遺伝子や染色体に傷害を起こす物

質を短期間で評価し，発がん性，催奇形性および遺伝病を引き起こす可能性のあ

る物質を開発早期に検出するために用いられる。遺伝子突然変異は一度固定され

ると，正常な元の遺伝子に戻ることができないので，生体内で幹細胞の重要な遺

伝子に遺伝子突然変異が起こった場合，生体にとってがんや奇形などの非常に重

篤な影響をもたらす可能性がある。したがって，遺伝毒性の検出，すなわち「陽

性」の結果は，安全性の評価に多大な影響を及ぼすことから，新規化学物質のみ

ならず既存化学物質の再評価においても，遺伝毒性試験は極めて重要な試験法と

して位置づけられる。

しかしながら，遺伝毒性試験は限定的な異常を検出するために単純化されたス

クリーニング試験であり，一つの試験法のみでは多種多様な遺伝毒性物質をすべ

て検出することが出来ない(46)。したがって，通常はいくつかの試験を組み合わ

せて行われ，一般的には，細菌を用いる復帰突然変異試験(3)，哺乳類培養細胞を

用いる染色体異常試験(41)またはマウスリンフォーマアッセイ(12)，ならびに小核

試験(86)が汎用されている。これらの試験系の中で生体を用いた試験は，げっ歯

類の骨髄における染色体分裂異常を指標とする小核試験だけである。小核試験は，

3

通常，マウスまたはラットに被験物質を単回あるいは反復投与した後，骨髄また

は末梢血を採取し，造血細胞由来の小核の出現を指標に遺伝毒性を評価するもの

で，造血細胞が遺伝毒性物質に対する感受性が高いため，古くから利用されてき

た試験法である。しかしながら，投与された化学物質は肝臓で代謝され活性化す

ることで，遺伝毒性物質として肝臓あるいはその他の臓器に発がん性を示す場合

も多いが，造血細胞を用いる小核試験では陰性を示す例が少なくない(105)。これ

は，代謝物が十分な濃度で骨髄に到達できない事が理由として挙げられる。した

がって，生体における遺伝毒性を骨髄のみで評価する小核試験では臓器特異的な

遺伝毒性を見逃す恐れがあると考えられる。

In vivo で遺伝毒性を評価できる試験として，小核試験以外にもトランスジェニ

ック動物を用いた遺伝子突然変異試験(24)があり，各臓器での遺伝子変異の検出

が可能な試験法として，発がん性との関連性を明確にできる点など有用性が非常

に高いことが知られている。しかしながら，遺伝子改変動物を利用するため，カ

ルタヘナ法に対応した施設が必要な事と，実験工程が他試験と比べやや複雑で，

試験期間も若干長い事からスクリーニングには適しておらず，現時点では試験が

実施できる大学，企業あるいは研究施設が限られている。この他，特定の臓器に

おける DNA 修復を評価できる遺伝毒性試験として，不定期 DNA 合成試験(75)が

知られているが，感度が低いことから，近年，その使用頻度は減少してきている。

そこで，動物種によらず簡便に短期間で，かつ，臓器別に DNA 損傷を評価で

きる可能性のある方法として，単細胞ゲル電気泳動法(90)に注目が集まった。単

離した細胞の細胞膜を溶かし，アルカリ条件化で DNA を電気泳動することによ

り，アルカリ不安定部位，DNA 除去修復途中の DNA 鎖切断，DNA の一本鎖切

4

断，二本鎖切断などの断片，あるいは一ヶ所の切断によりスーパーコイルからほ

どけた DNA が核から電気的に泳動漕の陽極側に泳動される。この状態が蛍光顕

微鏡下で Fig. 1 (a) に示すように，あたかも彗星（コメット）のように見えるた

め，コメットアッセイと呼ばれるようになった。コメットアッセイは単細胞のみ

ならず，生体内の臓器をとりだし，単一にした細胞または核も利用することがで

きることから，近年，「in vivo コメットアッセイ」として応用されるようになっ

てきた。In vivo コメットアッセイは，感度が低いとされる不定期 DNA 合成試験

に変わる試験法として，また，臓器別に評価できる短期の遺伝毒性試験として，

国際的なガイドライン化が待ち望まれていた。そこで，国際的な毒性試験法の合

意の場である経済協力開発機構（OECD）におけるガイドライン化を最終目標と

して，コメットアッセイを評価するための国際共同研究(111,112)が開始された。

第 1 章では国際共同研究の一部として，コメットアッセイが未知の物質の遺伝毒

性を正しく評価することが可能か否かの検討を行った。化学物質名を伏せた条件

下で試験を行い，試験データが出た後に名称が明らかになった物質の遺伝毒性と

得られた試験データの関係について考察した。第 2 章では臓器別に評価できるコ

メットアッセイの利点から，発がん性の標的となりやすい膀胱に着目し，膀胱に

おけるコメットアッセイを検討した。実験に先立ち，膀胱に発生するがんの多く

は移行上皮細胞由来であるため(13)，移行上皮細胞をコメットアッセイ用に回収

する検討を行った。コメットアッセイは DNA 損傷を検出する方法ゆえに，壊死

やアポトーシスなどの細胞毒性に起因する DNA 損傷を誤って検出する（偽陽性）

可能性がある。したがって，第 3 章では膀胱発がん関連物質 7 剤を用いて，病理

組織学的検査による細胞毒性を評価した上で，遺伝毒性物質と非遺伝毒性物質を

5

区別できるか否かを検討した。第 3 章で用いた 2-ニトロアニソールは遺伝毒性物

質として報告されているが，標準的なコメットアッセイで遺伝毒性を検出する事

ができなかった。そこで，第 4 章では 2-ニトロアニソールによる DNA の酸化損

傷を疑い，主たる酸化損傷である 8-OH-dG (8-hydroxydeoxyguanosine) を認識する

修復酵素 Human 8-oxoguanine DNA-glycosylase 1 (hOGG1) の前処理により，

8-OH-dG を修復するため一時的に切断された DNA を電気泳動するコメットアッ

セイの変法を導入して，2-ニトロアニソールによる酸化的 DNA 損傷の検出を検

討した。

6

第 1 章肝臓と胃を用いたコメットアッセイの基礎検討

7

諸言

Singh ら(90)によって開発された細胞個別単位で DNA 損傷を検出する方法は，

その後，コメットアッセイとして in vivo 遺伝毒性を検出するために応用されてい

る。現在，in vivo コメットアッセイは，遺伝毒性物質によって誘発される DNA

損傷を検出するために世界中で使用されている。日米 EU 医薬品規制調和国際会

議 (ICH) は，ICH-S2（R1）ガイダンス(38)において，現在用いられている骨髄お

よび末梢血小核試験に加えて，コメットアッセイが第 2 の in vivo 遺伝毒性アッセ

イとして推奨されることを明言している。In vivo コメットアッセイでは，まず，

組織から単一細胞/核懸濁液を得るために，酵素的な単離(85)，鋭いハサミで刻む

(103)，ホモジナイザーを用いる(57)などの種々の方法が報告されている。膀胱な

どの中空臓器は上皮から腫瘍の多くが発生するため，in vivo コメットアッセイで

それらの臓器を評価する際，上皮から単一になった細胞/核懸濁液を得ることが重

要である。コメットアッセイの実験方法や結果の解釈について，いくつかの総説

(10,26,104)が発表されているが，コメットアッセイにおける試験方法は標準化さ

れておらず，国際的に統一した試験方法で様々な物質の遺伝毒性を評価する必要

がある。そのため，日本動物実験代替法評価センター（JaCVAM）は，in vivo コ

メットアッセイの国際バリデーション試験を開始した。先行する試験施設が，ま

ず第 1〜第 3 段階として事前に検証を行った後，著者は第 4 段階の試験 1（予備

検証試験）と試験 2（本試験）に参加した。本試験においては，日米欧カナダの

施設が 40 化学物質を評価した。この検証研究の目的は，げっ歯類の発がん性の

予測因子となりうる遺伝毒性物質を検出する in vivo コメットアッセイの妥当性

を評価することであった。第 4 段階の試験 2，すなわち本試験の一部として，著

8

者は，塩化カドミウム，クロロホルムおよび D,L-メントールの遺伝毒性を調べた。

これらの被験物質は，JaCVAM から物質名が伏せられた状態で配布され，それら

は実験終了後に開示された。塩化カドミウム，クロロホルムおよび D,L-メントー

ルは，それぞれ，遺伝毒性発がん物質，非遺伝毒性発がん物質および非遺伝毒性

非発がん物質として分類されている(60,111)。第 1 章では，肝臓と胃（腺胃）を

用いて，in vivo コメットアッセイが物質名が伏せられた条件下で各剤の遺伝毒性

を正しく判定することが可能か否か評価した。同時に，in vivo コメットアッセイ

で陽性の結果が出た際に，細胞毒性による DNA 損傷の一因となる可能性のある

壊死およびアポトーシスの程度を病理組織学的検査(10)により確認した。

9

材料および方法

被験物質等

塩化カドミウム（CAS 番号 10108-64-2），クロロホルム（CAS 番号 67-66-3），

D,L-メントール（CAS 番号 15356-70-4）は物質名が伏せられた被験物質として

JaCVAM から配付され，試験結果が出そろった後に被験物質名が開示された。陽

性対照物質としてメタンスルホン酸エチル (EMS，和光純薬工業株式会社，大阪

府) を用いた。

試薬等

SYBR Gold およびハンクス平衡塩溶液（HBSS，Ca2+および Mg

2+ 不含，pH 7.5，

は Invitrogen Corp.（カリフォルニア，米国），通常融点アガロース（NMP, Normal

melting point, GP-42）は，ナカライテスク株式会社（京都府），低融点（LMP, Low

melting poing）アガロース（NuSieve GTG）は Lonza（Bazel，スイス）から購入し

た。NMP および LMP アガロースをダルベッコリン酸緩衝液（DPBS, Ca2+，Mg

2+

およびフェノールレッド不含，Invitrogen）に溶解した。ジメチルスルホキシド

（DMSO）は東京化成工業株式会社（東京都）から購入した。水酸化ナトリウム，

塩化ナトリウム，トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris），エチレン

ジアミン四酢酸二ナトリウム塩（Na2-EDTA），10%中性緩衝ホルマリンおよびエ

タノールは和光純薬工業株式会社から購入した。

供試動物

日本チャールス・リバー株式会社（神奈川県）で生産された Sprague-Dawley (SD)

10

ラットの雄動物を用いた。7 週齢にて試験動物を購入し，6-10 日間試験環境に馴

化させた後，供試した。動物は温度 22 ± 3C，湿度 50 ± 20%，換気回数 10 回以

上／時間（オールフレッシュエアー法），照明時間 12 時間／日（午前 7 時点灯，

午後 7 時消灯）に設定された動物飼育室で飼育した。基礎飼料には標準的な固型

飼料である MF（オリエンタル酵母工業株式会社，東京都）を用い，ステンレス

鋼製給餌器に入れて動物に自由に摂取させた。飲料水は，市上水（茨城県常総市）

をプラスチック製給水びんに入れて動物に自由に摂取させた。なお，動物の取り

扱いに関しては一般財団法人残留農薬研究所（茨城県）に定める動物実験倫理規

定に従い実施した。

投与方法

塩化カドミウムと EMS は生理食塩液 (日本薬局方大塚生食注，株式会社大塚

製薬工場，徳島県) に溶かして用いた。クロロホルムと D,L-メントールはコーン

油（和光）に混和した。生理食塩水およびコーン油は，溶媒対照物質として使用

した。被験物質および溶媒対照物質は，10 mL/kg の容量で強制経口投与により

24 および 21 時間間隔（2 回目の投与は初回投与 24 時間後，3 回目の投与は，2

回目投与 21 時間後）で 3 回投与した。コメットアッセイは単回投与で DNA 損傷

を検出できるが，本研究では使用動物数削減を目的とした 3 回投与を用いた。3

回投与を用いるとコメットアッセイと同じ動物で小核試験が実施可能となる。す

なわち，1 試験につき数十匹の動物数削減が可能となるため，本研究において 3

回投与を用いるコメットアッセイの妥当性を評価した。EMS は動物の安楽殺 24

時間前および 3 時間前に強制経口投与法を用いた。これは，2 回の投与で遺伝毒

11

性を十分に検出できるためであった。被験物質投与後は動物の臨床症状および体

重の変化を記録した。すべての動物を最終投与 3 時間後に二酸化炭素吸入により

安楽死させ試験に用いた。

被験物質の投与用量は，用量設定試験の結果に基づいて決定した。塩化カドミ

ウムとクロロホルムは，最大耐量（それ以上の用量で死亡例あるいは重篤例が認

められる用量）を用いた。D,L-メントールは死亡例が認められなかったため，急

性経口毒性試験や小核試験などの短期試験において，OECD ガイドライン 425 や

474 で定められている上限の用量である 2,000 mg/kg を用いた。EMS は 200 mg/kg

を用いた。用量設定試験は各群 3 匹を用いた。本試験では，溶媒対照群および陽

性対照群を含め各群 5 匹を用いた。

体重の測定

投与初日，二日目，三日目の体重を測定し，3 日間の体重増加量を計算し，被

験物質投与による動物への影響を調べた。

コメットアッセイ（ヘッジホッグ解析を含む）

肝臓の外側左葉の一部を切り出し，4C に冷却したミンス液 (20 mM Na2-EDTA，

10% DMSO 含有ハンクス平衡塩類溶液（Ca および Mg イオン不含，pH 7.5）で洗

った後，数十分間 4C でインキュベートした。その後，組織片を 4C の冷却した

ミンス液の中で眼科鋏により 30 秒間刻んだ。得られた細胞/核懸濁液は数十秒間

静置した後，上清をコメットアッセイに用いた。また別の肝臓外側左葉の一部は

10%中性緩衝ホルマリン液で固定し，病理組織学的検査に用いた。

12

胃を切開し，4C の冷ミンス液を使用して胃内容物を洗浄した。前胃を取り出

し廃棄した後，腺胃を半分に切断し，胃体部を含む半分は 4C の冷ミンス液に入

れ 15~50 分間 4C でインキュベートした。インキュベーション後，スクレーパー

を使用して腺胃の表面を 2 回穏やかにかきとり，それらは廃棄した。露出した胃

上皮を 4C の冷ミンス液で洗浄した。次に，胃上皮細胞を採取するため，胃の表

面をスクレーパーで数回かき取りサンプルを得た。サンプルをミンス液に浮遊さ

せた懸濁液は大きな細胞塊が沈降するように数十秒間静置した。その後，上清を

コメットスライド作製に用いた。腺胃の幽門側の残りの部分は，病理組織学的検

査のために 10%中性緩衝ホルマリン液に保存した。

コメットアッセイはアルカリ条件下で行った(90)。上清（細胞/核浮遊液）と 0.5%

低融点アガロース DPBS 溶液を 1:10 の割合で混和し，予め 1.0%通常融点アガロ

ース DPBS 溶液でコーティングしたスライドグラス（松浪硝子工業株式会社，大

阪府）に 80 µL 滴下し，カバーグラスを用いて寒天を広げた。

寒天を固化後，4C に冷却した細胞溶解液（2.5M NaCl, 100 mM Na2-EDTA, 10

mM Tris, 1% Triton X-100, 10% DMSO, pH 10）に浸した。1 動物あたり 2 枚のスラ

イド標本を作製し，暗号化したコード番号を記載した。細胞溶解液に浸したスラ

イドは 3 日以内に電気泳動に用いた。4C の純水（Simpli Lab，メルク株式会社（東

京都）を用いて製造）で細胞溶解液を洗い流した標本を，サブマリン型電気泳動

槽（BE-540，株式会社バイオクラフト，東京都）に並べ，予め 4C に冷えた電気

泳動液（300 mM NaOH, 1 mM Na2-EDTA, pH>13）を標本が完全に浸るまで静かに

注いだ。20 分間静置した後，25 V (0.7 V/cm) , 300 mA で 20 分間，4C 暗所の条

件下で電気泳動を行った。電気泳動が終了した標本は中和液（400 mM Tris-HCl,

13

pH 7.5）に 5 分間中和した後，エタノールで 5 分間脱水し乾燥させた。TE 緩衝液

（10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2-EDTA, pH 7.5）で 10,000 倍に希釈した SYBR Gold を

標本に滴下し 10 分間染色後，純水で洗浄し，カバーグラスをかぶせた。スライ

ド標本は B 励起のミラーユニットを備えた落射蛍光顕微鏡（BX51，オリンパス

光学株式会社，東京都）で観察した。電気泳動によって得られた各組織からのサ

ンプルの泳動像（コメット像）は CCD カメラを通して，コメットアッセイ解析

装置（Komet 5.5, Andor Technology plc, Belfast, UK）に取り込んだ後，画像解析を

実施した。スライド標本 1 枚当たり 50 個（1 動物 1 臓器あたり 100 個）のコメッ

ト像を解析した。計測したパラメーターは，DNA 損傷の検出において信頼ある

測定指標である% tail DNA (像全体に対するテールで検出される蛍光の割合) (48)

とした。非特異的 DNA 損傷の指標となる 90%以上の% tail DNA を示した細胞，

すなわちヘッジホッグ Fig. 1 (b) はコメットアッセイにおける画像解析から除外

した。ヘッジホッグの原因は不明であるが，激しい DNA 損傷を示しており，自

動画像解析の妨げとなるため，一動物一組織あたり 200 個の細胞（スライドあた

り 100 個）を目視によってカウントし出現頻度を求めた。

病理組織学的検査

病理組織学的検査は，常法に従ってパラフィン包埋切片を作製し，ヘマトキシ

リン･エオジン染色（H&E）を施して，光学顕微鏡を用いて実施した。

試験結果を判定する上で，細胞毒性の有無の判断を行った。肝臓において，溶

媒対照および投与物質による細胞毒性の影響が最も大きいと考えられる各被験

物質の高用量のサンプル，および% tail DNA が高用量とほぼ同じ値を示したクロ

14

ロホルムの中用量のサンプルについて病理組織学的検査を実施した。胃において

は，溶媒対照，% tail DNA が高用量群より高い値を示した塩化カドミウムの中用

量，細胞毒性の影響が最も大きいと考えられるクロロホルムおよび D,L-メントー

ルの高用量のサンプルについて病理組織学的検査を実施した。病変は，+（軽度），

++（中程度），+++（重度）に分類してスコア化した。

統計処理

各個体から得られたデータ (% tail DNA) は，スライド一枚 (50 個のコメット

像) を観察した値の中央値を採用した。2 枚のスライドから得られた中央値の平

均を 1 サンプル（一匹・一臓器）の値とし，それを用いて各群の平均値および標

準偏差を算出した。被験物質処理群の% tail DNA は Dunnett の多重比較検定

(Dunnett 検定) を用いて，溶媒対照群と統計学的に比較した。さらに用量相関性

について直線回帰分析を行った。

各臓器において，Dunnett 検定を用いて少なくとも一つの用量群で溶媒対照群

と比較して% tail DNA の統計的有意な変化と，直線回帰分析による統計学的に有

意な用量相関性の両方が得られた場合に陽性と判定した。一方，Dunnett 検定と

直線回帰分析の両方で有意差が認められない場合は陰性と判定した。Dunnett 検

定または直線回帰分析のいずれかの統計的に有意な変化が認められた場合は「不

確か (Equivocal) 」と定義した。

最終的な試験の判定は以下の 3 つとした。肝臓または胃のいずれかで，Dunnett

検定および直線回帰分析による統計学的に有意な差が認められた場合は，その物

質の遺伝毒性は「陽性」であると判断し，2 つの臓器とも Dunnett 検定および直

15

線回帰分析による統計学的有意差が認められなかった場合は「陰性」とした。そ

れ以外の場合，すわなち，一つの統計学的検定のみで有意差がつき，陽性とも陰

性と判断がつかない場合は，「不確か (Equivocal)」とした。なお，いずれの検定

法も有意水準を 5%以下に設定した。

溶媒対照群と陽性対照物質投与群の% tail DNA について，等分散性の F 検定を

実施し，データが等分散の場合は Student の t 検定（片側，P <0.025）を用いて群

間の有意差の有無を調べ，等分散でない場合は Aspin-Welch の t 検定（片側，P

<0.025）を行った。

体重増加量については，Dunnett検定を行った。有意水準は 5%以下に設定した。

病理組織学的検査の結果に対して統計学的処理は行わなかった。

16

結果

用量設定試験

本試験における用量設定の目的で予備的な用量設定試験を実施した。各物質の

結果を下に記載した。

塩化カドミウム

18.8, 37.5, 75, 150 および 300 mg/kg の用量を用いて塩化カドミウムの用量設定

試験を行った。その結果，初回投与 45時間以内に 300 mg/kg群の全例が死亡した。

150 mg/kg 投与群は腹部膨満，自発運動低下，立毛，被毛の汚れが認められた。

他の用量で臨床症状は認められなかった。すべての用量で体重減少が認められた。

以上の結果より，塩化カドミウムの本試験の用量は 20, 40および 80 mg/kgとした。

クロロホルム

125, 250, 500, 1,000および 2,000 mg/kgの用量を用いてクロロホルムの用量設定

試験を行った。その結果，2,000 mg/kg 群において 3 匹中 2 匹の動物が初回投与

45 時間以内に死亡した。1,000 mg/kg 群における全例と 500 mg/kg 群における 1

例に削痩を含む激しい臨床症状が認められた。以上の結果より，クロロホルムの

本試験の用量は 125, 250 および 500 mg/kg とした。

D,L-メントール

125, 250, 500, 1,000 および 2,000 mg/kg の用量を用いて D,L-メントールの用量設

定試験を行った。その結果，全群で死亡例は認められなかった。2,000 mg/kg 群に

おいて 3 匹中 1 匹の動物に自発運動低下と被毛の湿潤が認められた。以上の結果

より，D,L-メントールの本試験の用量は 500, 1,000 および 2,000 mg/kg とした。

17

本試験における動物の体重変化と臨床症状

Table 1 に本試験における体重変化と臨床症状を示した。塩化カドミウムおよび

クロロホルムを投与した全群のラットに有意な体重増加量の抑制が認められた。

一方，D,L-メントールを投与した動物に有意な体重増加量の抑制は認められなか

った。臨床症状は，すべての被験物質の高用量群のラットと D,L-メントールを投

与した中用量の 1 匹のラットに認められた。

コメットアッセイ

Table 2 に 3 剤の肝臓と胃におけるコメットアッセイの結果を示した。以下に各

剤の詳細な結果を記載した。


肝臓において，Dunnett 検定を用いて，溶媒対照（% tail DNA：1.16）と処理群

（% tail DNA：1.43～1.63）を比較した場合に有意差は観察されなかった。一方，

直線回帰分析を用いた場合，統計学的に有意な増加が認められた。

胃において，Dunnett 検定を用いて，溶媒対照群（% tail DNA：4.58）と処理群

（% tail DNA：21.57～25.30）を比較した場合，統計学的に有意な差が 40 および

80 mg/kg 群に認められた。一方，直線回帰分析を用いた場合，有意差は観察され

なかった。

EMS を投与した陽性対照群の% tail DNA は肝臓と胃でそれぞれ 24.20%および

53.34%であり，Student の t 検定により有意な増加が認められた。

クロロホルム

肝臓において，Dunnett 検定と直線回帰分析の両方を用いて，溶媒対照群（% tail

18

DNA：1.57）と処理群（% tail DNA：1.42～1.76）を比較した結果，% tail DNA の

有意な差は観察されなかった。

胃において，Dunnett 検定を用いて，溶媒対照群（% tail DNA：14.45）と処理

群（% tail DNA：7.74～13.60）を比較した場合，統計学的に有意差は認められな

かった。一方，直線回帰分析を用いた場合，統計学的に有意な減少が認められた。



D,L-メントール

肝臓において，Dunnett 検定と直線回帰分析の両方を用いて，溶媒対照群（% tail

DNA：1.54）と処理群（% tail DNA：1.48～1.61）を比較した場合，統計学的に有

意な差は認められなかった。

胃において，両検定を用いて，溶媒対照群（% tail DNA：11.57）と処理群（% tail

DNA：12.32～23.49）を比較した場合，統計学的に有意な差は認められなかった。



ヘッジホッグ

Fig. 1 (b) にヘッジホッグを図示し，Table 2にヘッジホッグの頻度をまとめた。

肝臓において，各物質投与群と陽性対照群のヘッジホッグの頻度は，クロロホル

ム投与動物を除いて 2.7%以下だった。クロロホルム投与群における頻度は，250

および 500 mg/kg の用量でそれぞれ 5.5%と 5.3%であった。胃におけるヘッジホ

ッグの頻度は，各被験物質投与群で 6.7～21.8%の範囲であり，溶媒対照群の 3.9

19

～21.7%の範囲と概ね一致した。


Table 3 に病理組織学的検査の結果を示す。各溶媒対照群において，肝臓または

胃で異常は観察されなかった。各剤における低用量群の検査は肝臓および胃で実

施していない。250 と 500 mg/kg のクロロホルム投与群で，炎症性細胞浸潤およ

び出血に続く空胞化を伴う小葉中心性部の限局性の肝細胞壊死あるいは単一細

胞壊死など，いくつかの病理組織学的変化が観察された。その他，コメットアッ

セイの結果に影響を与えないと考えられる細胞死に関わらない病理組織学的変

化を Table 3 に示した。

20

考察

本章では，塩化カドミウム，クロロホルムおよび D,L-メントールを用いて肝臓

と胃（腺胃）由来の細胞を用いてコメットアッセイを行った。肝臓は化学物質が

代謝され遺伝毒性を示す臓器として，胃は化学物質に直接曝露される臓器として

重要であるため標準的にこれら 2 臓器を対象として試験が行われる(111)。以下に，

各剤について既知の遺伝毒性と発がん性との関連について考察し，コメットアッ

セイで得られた結果が妥当であったかどうか検証した。


塩化カドミウムを投与した動物における臨床症状と有意な体重増加量の抑制

から (Table 1) ，試験に用いた用量は適切と判断した。

塩化カドミウムは，肝臓・胃ともに Dunnett 検定と直線回帰分析の二つのうち

一つの統計結果のみで有意差が認められ (Table 2) ，結果は「不確か

(Equivocal) 」と判定された。塩化カドミウムは肝臓の壊死やアポトーシスを誘

発するが(4,61,108,109)，本試験条件ではこれらの異常を含む病理組織学的変化は

肝臓および胃に観察されておらず (Table 3)，それら「不確な」DNA 損傷の増加

は細胞毒性に起因するものではないことが確認された。

これまでの塩化カドミウムを用いたラットの発がん性試験においては，肝臓お

よび胃は発がん標的臓器ではなく，大顆粒リンパ球性白血病，精巣腫瘍，前立腺

腫瘍の発生率が増加すると報告されている(37)。カドミウムの遺伝毒性について

は様々な結果が得られており，共通した結論は得られていない。既存の報告によ

ると，細菌において変異原性は陰性であるが(50)，in vitro では染色体異常を誘発

することが報告されている(71)。In vivo でのマウス小核試験では矛盾する結果が

21

得られており，反復腹腔内投与 (48 時間間隔) による 18 週間の曝露により骨髄

において陽性結果(11)が得られているが，1, 3,もしくは 7 日間の飲水投与試験か

らは骨髄において陰性の結果(53)が得られている。また，これまでに報告されて

いるコメットアッセイの結果にも不整合がみられる。塩化カドミウムの吸入曝露

後のマウスの骨髄を含む複数臓器で陽性結果(113)が得られているが，腹腔内投与

を用いると骨髄を含む複数臓器で陰性であった(83)。Waalkes ら(114)は，多くの

研究の結果から，カドミウムの変異原性は不十分であり，発がんにはおそらく，

間接的なDNA損傷またはDNAに直接的な変異のないエピジェネティックなメカ

ニズムが関係していると考察している。また，塩化カドミウムによる発がんメカ

ニズムには酸化ストレスが関連する可能性が指摘されている。カドミウム投与に

よりグルタチオンおよびタンパク質結合スルフヒドリル基が枯渇し，その結果，

活性酸素種が生成されることが知られている(98)。

コメットアッセイを遺伝毒性のスクリーニング試験として用いる場合は，一般

的に肝臓と胃が選択される。塩化カドミウムの遺伝毒性が「不確か」であった今

回の結果は，本剤の変異原が不十分であるとする過去の報告と一致したことから，

スクリーニング試験としてのコメットアッセイは，塩化カドミウムの遺伝毒性を

正しく評価したと結論した。

クロロホルム

クロロホルムを投与した動物における臨床症状と有意な体重増加量の抑制か

ら (Table 1) ，試験に用いた用量は適切と判断した。

クロロホルムは，本実験条件下では肝臓における DNA 損傷を誘発しなかった

(Table 2)。クロロホルムは in vitro および in vivo 遺伝毒性において，Ames(59)，染

22

色体異常(42)，小核(23)，コメットアッセイ(83)，およびトランスジェニックげっ

歯類の遺伝子突然変異試験(49)で陰性である。クロロホルムの反復投与により，

発がん臓器である肝臓に細胞傷害とそれに伴う再生性の細胞増殖が誘導される

ことが知られている(35)。今回の病理組織学的検査で，炎症性細胞浸潤および出

血に続く空胞化を伴う小葉中心性部の限局性肝細胞壊死や単一細胞壊死が認め

られており (Table 3) ，明らかな肝臓での細胞毒性が検出された。非遺伝毒性物

質の四塩化炭素投与の肝臓では，肝細胞壊死に伴い，コメットアッセイで非特異

的な DNA 損傷が増加する結果が得られ，「偽陽性」と判定されている(82)。本研

究ではこの点を考慮して，病理組織学検査を併用したコメットアッセイを行った。

クロロホルムの場合は，細胞毒性を示唆するこれらの病理組織学的所見は，ヘッ

ジホッグ出現頻度増加と関連性があった可能性があり，中用量および高用量でヘ

ッジホッグの出現頻度が 5%以上と高い値であった (Table 2) 。しかしながらこれ

らは DNA 損傷計測時に測定対象とならないため，% tail DNA に有意差は認めら

れなかった (Table 2) 。したがって，細胞毒性はコメットアッセイの結果に影響

を与えなかったと判定した。

一方，胃においてはコメットアッセイにより「不確か」な結果が得られた。す

なわち，Dunnett 検定では陰性であったが，直線回帰分析では有意な減少を示し

た (Table 2) 。DNA 同士を架橋するような作用を持つ化学物質は，DNA 断片を

みかけ上減少させる事により，コメットアッセイにおける測定値 (% tail DNA)

の減少を誘発すると考えられるが，クロロホルムにそのような作用の報告は無い。

また，病理組織学的検査では細胞毒性は確認できなかった (Table 3) 。したがっ

て，この DNA 損傷の低下は意味のある生物学的な反応とは考えられず，また，

23

これまでの遺伝毒性試験の陰性の結果も考慮し，今回のコメットアッセイの結果

は｢陰性｣と判定した。

まとめるとクロロホルムの投与により，肝臓と胃で有意な DNA 損傷は認めら

れず，コメットアッセイはラットに対するクロロホルムの遺伝毒性を正しく｢陰

性｣と判定した。

D,L-メントール

D,L-メントールを投与した動物において有意な体重増加量の抑制は認められな

かった (Table 1) 。しかしながら最高用量において臨床症状が認められ (Table 1) ，

また短期試験で一般的な上限用量である 2,000 mg/kg を用いていることから，試

験に用いた用量は適切であった。また，肝臓の病理組織学的変化 (Table 3) は，

D,L-メントールが標的臓器である胃および肝臓に到達したことを示していた。

適切な用量で投与された D,L-メントールは，肝臓や腺胃の細胞に DNA 損傷を

引き起こさなかった (Table 2) 。D,L-メントールの遺伝毒性は，Ames 試験で陰性

(120)であったが，代謝活性化のための肝ホモジネート (S9) を加えない条件下で

の染色体異常試験で陽性であったことが報告されている(31)。また，動物を用い

た in vivo 遺伝毒性試験では，マウスの小核試験(47)とコメットアッセイ(83)にお

いて陰性であった。このマウスのコメットアッセイでは，今回の試験と同様に肝

臓と腺胃が検査臓器として評価されている。2 年間の D,L-メントール摂取におい

てラットまたはマウスのいずれにも発がん性は認められていない(68)。これらの

結果により D,L-メントールは，非遺伝毒性非発がん物質として分類されているこ

とから，コメットアッセイの結果は D,L-メントールの遺伝毒性を正しく判定した

と結論した。D,L-メントールによって細胞複製（すなわち，有糸分裂）の増加が

24

報告されており(119)，今回の試験においても病理組織学的検査において肝細胞有

糸分裂像として観察されたが（Table 3），それはコメットアッセイの結果に関連

していなかった。

本研究において，塩化カドミウムにおいて｢不確か｣な結果，クロロホルムおよ

び D,L-メントールでは｢陰性｣の結果が得られた。これらの結果は，過去の研究に

よる遺伝毒性の報告と一致しており，標準化されたコメットアッセイは物質名が

伏せられた状態においても 3 剤の遺伝毒性を的確に検出できると結論した。

コメットアッセイが適切に行われたことの指標となる% tail DNAの許容範囲が

報告されており，溶媒対照群の肝臓では 1〜8%，胃では 1〜20%である(111)。こ

の値は，スライド平均値の群平均から算出されたものであり，本章で得られた結

果を同じ計算式にあてはめて値を算出した結果，3 物質において肝臓では 2.75〜

3.01%，胃では 10.16〜18.33%の範囲であった（Table には示さず）。よって，そ

れぞれ許容範囲内であることが確認された。一方，EMS で処理した陽性対照群の

肝臓，胃における% tail DNA の平均値は，それぞれ% tail DNA が 16.61～24.20%

および 40.22～53.34%であり，有意な増加（P <0.025）を示し，明らかな｢陽性｣

の結果が得られた（Table 2）。したがって，塩化カドミウム，クロロホルムおよ

び D,L-メントールを用いたコメットアッセイは有効と判断した。

国際バリデーション試験に参加した各国の研究施設においても，肝臓と胃を検

査臓器とした場合，概ね適切な検査結果が得られたことが示され，コメットアッ

セイが未知の物質の遺伝毒性を正しく評価できると結論されている(111)。今回の

バリデーション試験では 3 回投与を採択したことにより，将来，小核試験と併合

してコメットアッセイを行うことにより，同一試験内で複数の遺伝毒性が評価可

25

能となり，また，試験数を少なくすることにより動物数の削減にも繋がることが

期待できる。コメットアッセイの国際バリデーション試験をまとめた結果は，

OECD ガイドライン（No.489）の採択へ寄与し，本研究はその一部として貢献し

た。

26

小括

ラットを用いたコメットアッセイの国際バリデーション試験の一環として，

JaCVAM により物質名が伏せられた状態で配付された塩化カドミウム，クロロホ

ルムおよび D,L-メントールについて，肝臓と胃を用いたコメットアッセイを実施

し，コメットアッセイの信頼性を評価した。コメットアッセイの結果，塩化カド

ミウムの遺伝毒性は「不確か」であった。これは，塩化カドミウムが不確かな変

異原性を示すこと，肝臓と胃に対しては発がん作用がないという過去の報告と一

致した。非遺伝毒性発がん物質であるクロロホルムは，肝臓と胃において DNA

損傷を引き起こさず，その遺伝毒性は「陰性」と判定された。クロロホルムによ

り壊死や変性などの一部の病理組織学的変化が肝臓で観察されたが，それらはコ

メットアッセイの結果に影響を及ぼさなかった。非遺伝毒性かつ非発がん性物質

である，D,L-メントールは，肝臓および胃で DNA 損傷を引き起こさず「陰性」と

判定された。なお，各剤に対する陽性対照物質である EMS については「陽性」

の結果が得られ，試験が適正であった事が示された。これらの結果より，コメッ

トアッセイは，物質名が伏せられた条件下で化学物質の遺伝毒性を適切に評価で

きていることを示した。コメットアッセイの国際バリデーション試験をまとめた

結果は，OECD ガイドライン（No.489）の採択へ寄与し，本研究はその一部とし

て貢献した。

27

第 2 章膀胱における DNA 損傷評価のための膀胱上皮細胞の回収方法の

比較検討

28

緒言

第 1 章にて肝臓と胃を対象に，遺伝毒性試験としてのコメットアッセイの妥当

性を検証した。肝臓は化学物質が代謝され遺伝毒性を示す臓器として，胃は投与

した化学物質に直接曝露される臓器として重要であるためである。しかしながら，

多くの遺伝毒性物質は様々の臓器に発がん性を示すため，肝臓と胃以外の臓器に

ついても検討を加える必要がある。

個々の細胞レベルで DNA 損傷を検出するための単純な方法として，Singh らに

よって単細胞ゲル電気泳動法が開発された(90)。本アッセイでは，DNA の二本鎖

切断，一本鎖切断，アルカリに不安定な部位，酸化的塩基損傷，不完全切除修復

部位，および DNA の DNA またはタンパク質との架橋を検出することができる。

動物を用いた単細胞ゲル電気泳動法，いわゆる in vivo コメットアッセイには，3

つの利点がある。まず，他のアッセイを用いて評価することが容易でない臓器（例

えば膀胱）に対し，臓器特異的な遺伝毒性を評価するためのツールとして利用で

きることである。第二に，コメットアッセイは，臓器特異的な検査ができるが，

検出感度が劣る in vivo 不定期 DNA 合成試験の代替として特に有用である(8)。第

三に in vivo コメットアッセイは，げっ歯類の長期試験において腫瘍性の変化が観

察された化学物質について，標的臓器を用いて，その発がんメカニズムに遺伝毒

性が関与するのか，あるいは関与しないのかを判断するために使用することがで

きる。In vivo コメットアッセイによって得られた「陰性」の結果は，化学物質が

DNA に直接作用しないことを示しており，化学物質の生体影響に閾値の存在を

示唆することができる。新規に開発された化学物質において，閾値の存在の有無

は，化学物質の登録上（例えば，無毒性量による 1 日摂取許容量の算出をする上

29

で）極めて重要である。

古くから皮革，ゴム，塗料，染料等の化学工業従事者における職業曝露が膀胱

発がんの疫学的要因であることが指摘されている。現在のところ，労働衛生環境

の改善により，これらによる危険度は減少傾向にあるものの，膀胱は米国成人男

性におけるがん罹患率が高く，日本においても男性，女性ともに発がん死亡数が

年々増加しており，今後も増加する予測値が示されている

(http://www.tokyo-eiken.go.jp/sage/yosoku/japan/c_blad_m/)。遺伝毒性物質の多くが，

げっ歯類の膀胱発がん物質として同定されており，これらのうち，芳香族アミン，

ニトロソアミン，シクロフォスファミドなどはヒトにおける発がん物質である。

(13)。膀胱における遺伝毒性を検出するために，不定期 DNA 合成アッセイ(100)

および 32P ポストラベリング(115)等のいくつかの試験が試みられている。コメッ

トアッセイは，敏感，迅速，かつ安価な方法であるため，膀胱についても方法論

の確立が望まれる。膀胱は移行上皮，平滑筋，結合組織，血管など様々な組織成

分から構成されるため，膀胱全体をアッセイに供すると非特異的な反応（偽陽性

や偽陰性）が検出されることが懸念される。また，膀胱の悪性腫瘍の多くは移行

上皮細胞から生じるため(13)，膀胱に対する遺伝毒性を評価する場合は効率よく

上皮分画を回収する必要がある。しかし，膀胱の細胞を採取するための最良の方

法，すなわち，上皮細胞を効率良く回収する方法については，国際的に合意され

た方法はない。

いくつかの研究で膀胱の細胞を用いてコメットアッセイが実施されているが，

それぞれ異なる細胞採取法を使用しており，それらは以下の 3 つのタイプに大別

することができる。膀胱から消化酵素により移行上皮細胞を回収する方法（消化

30

酵素法） (76,116)，摘出した膀胱から物理的に粘膜細胞をかき取る方法

(51,66,80,87,106)（スクレイピング法）あるいはハサミでそのまま膀胱を刻んで得

られたサンプルを用いるもの（ミンス法）(78,103)である。上皮細胞を選択収集

することができる消化酵素法は，in vivo コメットアッセイにおいて有用な方法と

考えられるが，消化酵素を膀胱内に注入し上皮細胞を剥離すると，細胞毒性を評

価するための標準的な手段である病理組織学的検査(10)の実施が不可能となる。

また消化酵素により DNA 損傷が増加するとの報告がある(91)。したがって，スク

レイピング法またはミンス法が，病理組織学的検査を併用するコメットアッセイ

には適切であると考えられる。しかし，これまでこの 2 つの方法を同一の膀胱組

織で比較・検討した報告はなく，どちらの方法がより簡便で，適切に結果が検出

されるかは不明である。本章では，膀胱を用いてミンス法とスクレイピング法を

同時に行い，得られたデータを比較した。ラットに 3 つの既知の発がん物質（N-

メチル-N-ニトロソウレア，メタンスルホン酸エチルおよび o-アニシジン）を投

与し，ミンス方法については，得られたサンプルを用いて，膀胱の構成細胞を形

態学的に定量解析した。本研究において，上皮成分の回収方法の簡便さを検討す

るとともに，病理組織学的検査に適した組織を得ることについても合わせて考察

を加えた。

31


化学物質

メチルニトロソウレア（MNU，CAS 番号 684-93-5），2-メトキシアニリン

（o-anisidine，OA，CAS 番号 90-04-0）および 3,3'-ジアミノベンチジンは和光純

薬工業株式会社から，抗サイトケラチン抗体と Envision キット (二次抗体，

Envision + System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit) は Dako（Glostrup，デンマー

ク）から，4%ブロック・エースは大日本製薬株式会社（大阪府）から入手した。

メタンスルホン酸エチル (EMS), SYBR Gold，ハンクス平衡塩溶液，通常融点ア

ガロース，低融点アガロース，ダルベッコリン酸緩衝液，DMSO，水酸化ナトリ

ウム，塩化ナトリウム，Tris，Na2-EDTA およびエタノールは第 1 章と同様のもの

を使用した。

供試動物

動物の取り扱いに関しては一般財団法人残留農薬研究所に定める動物実験倫

理規定に従い実施した。日本チャールス・リバー株式会社（神奈川県）で生産さ

れた雌雄 SD ラットを用いた。試験動物は 7 週齢にて購入し，ランダムに 4 匹に

群わけ後，7 日間試験環境に馴化し，8 週齢で試験に用いた。基礎飼料と水は第 1

章で用いたものと同等であった。動物飼育室は温度 22 ± 3℃，湿度，50 ± 20%，

12 時間の明/暗サイクルの条件に維持された。動物の体重は雌で 185～232 g，雄

で 277～320 g であった。

32

実験スケジュール

MNU および EMS は，生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に溶解した。OA

はコーン油（和光）に混和した。生理食塩水およびコーン油は，溶媒対照として

使用した。これらの化学物質または溶媒対照を，各群 4 匹の動物に 21 時間間隔

で 2 回強制経口投与した。投与用量は予備検討から以下のように設定した。MNU

および EMS の用量は，それぞれ，41 mg/kg と 200 mg/kg を用いた。これらの用

量は，臨床症状なしに DNA 損傷が得られることが予想される用量であった。OA

の用量は予備検討より最大耐量の 700 mg/kg を用いた。すべての動物について，

化学物質の 2 回目の投与後 3 時間に二酸化炭素吸入により安楽死させた。

サンプル採取

膀胱は，安楽死直後のラットから取り出して，コメットアッセイおよび形態学

的分析のために下記のように処理した。OA を投与したラットの尿は，尿試験紙

（Uriace®-Kc，テルモ株式会社，東京都）を使用して血尿を調べた。

採取した膀胱は 4C のミンス液（20mM の Na2-EDTA，10% DMSO 含有ハンク

ス液[Ca2+，Mg

2+不含]，pH 7.5）に 20〜40 分間インキュベートした。袋状の曲面

の膀胱上皮をかきとるため，薄く平らなステンレス製の棒を膀胱の頭側から挿入

することにより裏返し，平面として粘膜を露出させた。上皮細胞を単離するため

に，小さなスクレイパーで粘膜の片側を数回こすり取り，単離された少量の粘膜

を 4C の冷ミンス液に入れた (スクレイピング法) 。かきとった後の組織は眼科

鋏で切り取り廃棄し，残った未使用の面を含む膀胱はマイクロチューブに入れ，

30 秒間ハサミで刻んだ。大きな塊が沈降した後に，組織ホモジネートの上清をミ

33

ンス法で得られた細胞/核とし，コメットアッセイおよび形態学的分析のために使

用した。


スライド作製から観察まで，第 1 章で用いた方法と同様の材料と方法を用いて

行った。

形態学的検査

ミンス方法によって得られた上皮細胞の割合を調べるために，サンプルを遠心

（5 分間，70 × g）し，塗抹標本を作製し，メイ・グリュンワルドおよびギムザ染

色液（メルク株式会社，東京都）により染色を行った。雌雄それぞれの群におい

て計 400 個の細胞を光学顕微鏡下で計数し，核の形状(7)によって下記 5 種類に分

類した。1）複数ある円状の核（被蓋細胞），2）大きな楕円形の核を有する上皮

細胞，3）小さな丸い核を有する上皮細胞，4）紡錘状の核を有する間葉系細胞，

5）他の形状の核を有する間葉系細胞。さらにサイトケラチン免疫染色により上

皮細胞の確認を行った。標本をリン酸緩衝液 (pH 7.2) で洗浄し，その後，4%ブ

ロック・エースによる処理を室温で 20 分間行った。一次抗体反応は，希釈済み

抗サイトケラチン抗体を用いて 4℃で一晩行った。一次抗体反応後，二次抗体を

用いて室温で 1 時間反応させ，最後に 3,3'-ジアミノベンチジンを用いて陽性反応

を可視化（黄土色）し，ヘマトキシリンで対比染色（水色）した。スクレイピン

グ法により得られた細胞は少量であったため，形態学的検査を行うことができな

かった。

34

統計処理

個々の動物の平均% tail DNAから求めた 1群の平均値±標準偏差をTable 4（雌）

および Table 5（雄）にまとめた。各化学物質の DNA 損傷誘発性を評価するため

に，各投与群の平均% tail DNA を統計学的に各溶媒対照群と比較した。投与群ご

とに大きく損傷を受けた細胞（ヘッジホッグ）の頻度を，同時対照群と統計学的

に比較した。データは，最初に F 検定を用いて分散の均一性について分析した。

分散が均一であった場合，Student の t 検定を用いて評価した。分散が均一でなか

った場合は，Aspin-Welch の t 検定を用いて評価した。0.05 未満の p 値を統計学的

に有意であると判断した。

35

結果

雌ラットの結果

雌ラットのコメットアッセイの結果を Table 4 に示す。各化学物質投与群を溶

媒対照群と比較した場合，MNU および EMS の投与群の% tail DNA に統計学的に

有意な増加が認められた。一方，細胞回収方法に関係なく，OA 投与群では統計

学的に有意な増加は認められなかった。

各投与群で大きく損傷した細胞（ヘッジホッグ）の頻度は，スクレイピング法

に比べミンス法で低かった (Table 4) 。大きく損傷を受けた細胞の統計学的に有

意な増加が，スクレイピング法の MNU 投与群と，ミンス法およびスクレイピン

グ法における MNU および EMS の投与群に認められた。

臨床症状および肉眼所見の異常は，MNU および EMS 投与群のいずれの動物で

も観察されなかった。一方，OA の投与群のいくつかの動物において，自発運動

低下，自発運動消失，および流涙などの臨床症状が認められた。加えて OA で投

与した動物で赤褐色の尿が観察されたが，尿試験紙により血尿ではないことが確

認された。この異常着色尿は，色調が OA の色に類似していたので，OA または

その代謝物の排尿に起因するものと考えられた。解剖時の肉眼的変化は観察され

なかった。

雄ラットの結果

雄ラットにおけるコメットアッセイの結果を Table 5 に示す。雌ラットと同じ

プロトコールを使用したが，溶媒対照群における DNA 損傷のバックグラウンド

レベルは，雌ラットに比べ，雄ラットで明らかに高かった。MNU 投与群は，溶

36

媒対照群と比較したとき，細胞回収方法にかかわらず% tail DNA に統計学的に有

意な増加が認められた。EMS の投与群は，溶媒対照群と比較した場合，スクレイ

ピング法で% tail DNA に統計学的に有意な増加が認められなかったのに対して，

ミンス方法で有意な増加が認められた。OA の投与群は，溶媒対照群と比較した

とき，細胞回収方法に関係なく% tail DNA に統計学的に有意な増加は認められな

かった。

各投与における大きく損傷した細胞の頻度は，スクレイピング法に比べミンス

法で低かった (Table 5) 。大きく損傷した細胞の頻度は，両方法のいずれの投与

群においても統計学的に有意な増加は認められなかった (Table 5) 。スクレイピ

ング法における OA 投与群において，一動物あたり 200 個，大きく損傷した細胞

をカウントし，出現頻度を求めた結果，33.9%であったが (Table 5) ，それらはコ

メットアッセイにおける陽性反応に影響を与えなかった。

OA の投与群の動物で自発運動活性の低下が認められた。一方，MNU および

EMS の投与群における動物のいずれにおいても臨床症状および剖検所見の異常

は観察されなかった。雌と同様に OA 投与群において，剖検所見は認められなか

ったが，赤みがかった褐色尿が観察され，尿試験紙により血尿ではないことが確

認された。

ミンス法で得られた細胞

ミンス法により得られたサンプルを Fig. 2 に示す。大きな楕円核を有する上皮

細胞は，サイトケラチンの免疫染色に陽性反応を示したが (Fig. 3 (a) ) ，小さな

紡錘形の核を有する間葉系細胞 (Fig. 3 (b) ) は陰性であった。細胞の形態によっ

37

て分類された上皮細胞の頻度は，雌ラットで 82.6%であり，雄ラットで 87.4%で

あった（Table 6）。これらの結果は，ミンス法によって上皮細胞が優先的に回収

されたことを示していた。

38

考察

本章では，ラットに 3 つの既知の発がん物質（MNU，EMS および OA）を投

与し，ミンス法とスクレイピング法で採取したサンプルを用いてコメットアッセ

イの結果を比較した。ミンス法で採取したサンプルでは，スクレイピング法で採

取したサンプルと同様に，MNU あるいは EMS を投与したラット膀胱で DNA 損

傷が検出され，ミンス法が DNA 損傷を十分に検出する能力を持っていたことを

示した (Table 4, 5) 。ミンス方法は，臓器をハサミで刻むだけなので，作業の単

純さでは，上皮をかきとって回収しなければならないスクレイピング法よりも優

れている。通常，遺伝毒性を評価するための in vivo コメットアッセイは，片性あ

たり少なくとも 20 匹の動物（溶媒および陽性対照を含む 5 つの用量レベル，1 用

量当たり最低 4 匹の動物）を用い，安楽死後できるだけ早く標的組織を一定時間

内に採材し，単一細胞/核に分離する必要がある。このため，細胞の回収手順が技

術的に単純であり，かつ短時間で処理できることが重要なポイントである。ミン

ス法ではコメットアッセイ用に採取したサンプルは担当者間のばらつきも少な

くわずか数十秒でミンスすることができる。ミンス法によりコメットアッセイお

よび病理組織学的検査の両方を行うために，膀胱を半分に切断し，片側をコメッ

トアッセイ用に，残りの半分を病理組織学検査用に使用する事が可能である。一

方，スクレイピング法は，膀胱を反転させる際に病理組織学的検査で組織を観察

する場合の障害になることが懸念される。本実験における異なる方法，すなわち，

膀胱を反転させずにかきとる場合でも，半分に分けた膀胱組織は薄くて，かつ，

小さく，作業中に簡単にカールするため，作業に習熟した熟練技術者でないと粘

膜をかきとることが難しい。作業における担当者間の手技のばらつきも懸念され，

39

作業時間もミンス法のように数十秒で終了することは極めて困難である。よって，

ミンス方法がスクレイピング法よりも明らかに優れたサンプル採取方法である

と結論した。

MNU 投与の雌雄ラットでは，ミンス法あるいはスクレイピング法のいずれの

細胞回収法に関係なく，コメットアッセイで「陽性」の結果が得られた (Table 4,

5)。この結果は，後述する EMS に比べて，MNU が膀胱で非常に強力な遺伝毒性

物質であるためと考えられた。アルキル化剤である MNU をラットあるいはマウ

スに経口投与すると，膀胱を含む多くの臓器にがんが発生し，ラットの膀胱内に

MNU を直接投与すると膀胱がんが引き起こされる(95)。今回の結果は，MNU に

よる膀胱がんの原因は，本剤によって直接誘導される膀胱内 DNA 損傷であるこ

とを示しており，過去に報告された MNU の膀胱内投与によりラット膀胱内に検

出された DNA 損傷の結果(17)と一致した。

EMS 投与群の雌ラットにおいて，ミンス法とスクレイピング法の両方でコメッ

トアッセイの結果は陽性であった (Table 4) 。しかし，雄ラットにおいては，ミ

ンス法で陽性結果が得られたが，スクレイピング法では陰性の結果となった

(Table 5) 。これは，スクレイピング法の対照群において，バックグラウンドレベ

ル（31.68%）が極めて高いことが原因であり，処置群の値がそのレベル幅に含ま

れてしまったため，DNA 損傷の検出感度が低下した可能性が推察された。スク

レイピング法により得られた EMS 投与群における雄の平均% tail DNA は，ミン

ス法の値とほぼ同等であったため，EMS により膀胱における DNA 損傷が誘発さ

れたと結論した。EMS は染色体異常誘発物質(18)であり，トランスジェニックマ

ウス試験において骨髄や肝臓に遺伝子突然変異が検出され(99)，マウスのコメッ

40

トアッセイにより経口投与により肝臓，腎臓および肺など種々の臓器に DNA 損

傷が誘導される(79)。ラットの発がん性試験では，乳腺の腺がん，腎臓の間葉系

腫瘍，子宮の平滑筋肉腫が誘発され(110)，膀胱には尿路上皮過形成を誘発したが，

腫瘍は認められなかったという(107)。佐々木らによると，コメットアッセイによ

り DNA 損傷の増加を示すマウスまたはラットの臓器は，必ずしも発がん性の標

的臓器ではなかったことを報告しており(83)，本研究における陽性所見は，膀胱

上皮に対する本剤の弱い DNA 損傷を反映した結果であると考えられた。

OA を雌雄ラットに最大耐量まで投与したが，いずれの細胞回収法においても

陰性の結果が得られた (Table 4, 5) 。OA は，国際的な発がん物質の評価機関であ

る国際がん研究機関（IARC）においてグループ 2B に分類され，ヒトに対する発

がん性が疑われており(36)，マウスとラットの雌雄ともに膀胱の移行上皮がんを

引き起こすことが知られている(33)。その明確な膀胱に対する発がん性にもかか

わらず，これまでのほとんどすべての in vivo 遺伝毒性試験では，OA を遺伝毒性

物質として検出することができていない(5)。しかしながら，Ashby らは膀胱にお

いて明らかな OA-DNA 付加体は検出できなかったが，遺伝子突然変異頻度のわ

ずかな増加を報告している(6)。また，佐々木ら(81)は，雄 CD-1 マウスのスクレ

イピング法による膀胱コメットアッセイで陽性反応を報告している。今回の結果

は，佐々木らの研究結果と矛盾しており，使用される動物種間の代謝活性化系の

違いや試験条件によってこの不一致が説明されるかもしれない。以前の研究では，

OA は代謝活性型の遺伝毒性物質と報告されており，OA を遺伝毒性物質へ代謝活

性化する酵素として，数種のペルオキシダーゼ酵素種の関与が示唆されている

(96,101)。この酵素種のヒトとげっ歯類の種差等は明らかになっていないが，OA

41

の遺伝毒性メカニズムについては，酵素種の種差や臓器における発現の違いなど

を考慮にいれて，今後，さらなる解明を進める必要があろう。

ミンス法により約 80%の上皮細胞を含むサンプルが回収できた (Table 6) 。上

皮細胞はサイトケラチン染色で確認され (Fig. 3 (a)) ，単離された単一細胞になる

傾向があったが，間葉系細胞は集塊状に認められる傾向にあった。Fig. 3 (b) にミ

ンス法により得られた間葉系細胞の塊を示す。これらの塊は，マイクロチューブ

の底に速やかに沈殿し，コメットアッセイに使用されなかった結果，単離した上

皮細胞がミンス法で高頻度に得られたと考えられた。スクレイピング法では，上

皮細胞を含む組織成分を物理的に効率よく収集することができたと考えられる

ため，組織損傷を考慮にいれなければ，DNA 損傷を検出できる感度はミンス法

よりスクレイピング法が優れているかもしれない。しかし，前述のように，サン

プリングの過程で人工的な組織傷害を誘導してしまうスクレイピング法は，国際

的な統一手順には不向きと考えられた。

本研究では雌雄差について興味深い知見が得られた。「大きな損傷を受けた細

胞」は，画像解析装置による自動的な解析が困難であったため，マニュアル操作

により出現頻度を計測し，両回収法による雌と雄の出現頻度を Table 4 および 5

にそれぞれ記載した。その結果，雄において，ミンス法に比べてスクレイピング

過程に由来すると考えられる大きな損傷を受けた細胞が高い出現頻度で認めら

れ，サンプリング操作による組織傷害が雌に比べて雄では強くでることが明らか

となった。雄の組織は雌に比べて脆弱な可能性が示唆され，サンプリングの際は，

より繊細な作業が必要と考えられた。さらに，雌雄ともに同一の細胞回収方法を

使用したにもかかわらず，各溶媒対照群の平均% tail DNA は雌ラットに比べ雄の

42

方が高値を示した (Table 5) 。理由は不明であるが，同様の傾向が，本実験の前

に行われた予備実験でも認められた（データは示さず）。Fischer 344 (F344) ラッ

ト，Wistar Hannover GALAS ラットの背景データにも類似の雌雄差があることを

確認している（未発表）。

結論として，ミンス法ではスクレイピング法に比べて，組織損傷が少なく，ま

た，より簡便に膀胱上皮細胞が単離でき，国際的な標準手順として推奨できると

考えられた。本結果は OECD ガイドライン（No. 489）の参考文献の一つとして

掲載されたため，将来的にミンス法を利用した膀胱コメットアッセイが国際的に

実施されると予想される。

43

小括

第 1 章でバリデートされたコメットアッセイを，膀胱を用いた遺伝毒性評価に

応用するにあたり，膀胱発がんの発生母地となる上皮細胞を効率よく回収する必

要がある。しかし，膀胱は小さく薄いため，短時間で膀胱上皮細胞をかきとり，

コメットアッセイを実施することは技術的に困難であると考えられる。そこで膀

胱をハサミで刻む単純なミンス法により得られたサンプルでコメットアッセイ

を行い，スクレイピング法を用いて得られたデータと比較した。既知の発がん物

質である MNU，EMS または OA をそれぞれ雌雄の SD ラットに 2 回投与 3 時間

後に，各ラットの膀胱を二つに分割し，ミンス法とスクレイピング法からそれぞ

れサンプルを得た。両サンプルで遺伝毒性物質 MNU および EMS による DNA 損

傷が検出された。すなわち，ミンス法は DNA 損傷剤を検出するのに十分な能力

を持っていた。ミンス法により得られたサンプルを形態学的に観察すると，回収

した細胞の 80%以上は上皮由来であり，サイトケラチン免疫染色により上皮細胞

の存在を確認した。ミンス法は膀胱の半分のみを利用するので，残り半分は細胞

毒性の評価が必要な場合，病理組織学的検査に使用することができる。スクレイ

ピング法よりも簡単に実施できるミンス法は，膀胱コメットアッセイにより適切

な方法と結論した。OA による DNA 損傷は検出されなかったため，さらなる試験

法の改良が必要と考えられた。本結果は OECD ガイドラインの参考文献の一つと

して掲載された。

44

第 3 章膀胱発がん関連物質 7 剤を用いた遺伝毒性物質と非遺伝毒性物質の

鑑別

45

緒言

第 2 章の結果から，コメットアッセイ用の上皮回収方法として，より簡便なミ

ンス法が膀胱にも応用できることを明らかにした。一方，コメットアッセイは

DNA 損傷を感度よく検出するため，壊死またはアポトーシスなどの細胞毒性の

影響に起因する偽陽性反応が生じることが懸念されている(26)。実際，非遺伝毒

性物質である四塩化炭素を投与されたマウスの肝臓において，病理組織学的検査

により小葉中心性肝細胞壊死が認められ，それに起因すると考えられるコメット

アッセイ偽陽性反応が誘導されることが報告されている(82)。そのため，in vivo

コメットアッセイで陽性の結果が得られた場合，病理組織学的検査が壊死および

アポトーシスによる偽陽性反応を否定するための標準的方法と位置付けられる

(10)。

第 1 章の成果を含めたコメットアッセイの国際バリデーション試験において，

肝臓と胃に生じる病理組織学的変化と DNA 損傷の関連データが蓄積されてきた

(111)。しかし，その他の臓器のデータは十分でなく，現在のところ，膀胱におけ

るコメットアッセイの結果と病理組織学的検査の関係を精査した報告は皆無で

ある。膀胱がんは，米国男性の間で最も一般的に診断されるがんの一つである(89)。

いくつかの化学物質はラットにおける膀胱がんを誘導することが知られており，

それらは遺伝毒性または非遺伝毒性発がん物質に分類されている(13)。本章では，

ラットに遺伝毒性または非遺伝毒性膀胱発がん関連物質を 2 日間投与し，第 2 章

で確立した簡便なミンス法を用いる膀胱コメットアッセイが，遺伝毒性と非遺伝

毒性物質を区別する事が可能か否かを検討した。

本研究では，膀胱発がんを誘導または促進することが知られている以下の 7 物

46

質をそれぞれ投与したラットの膀胱を用いて，尿路上皮細胞のコメットアッセイ

と病理組織学的検査を組み合わせて検査を行った。N-ブチル-N-（4-ヒドロキシブ

チル）ニトロソアミン (BBN) (43)，グリシドール(70)，2,2-ビス（ブロモメチル）

-1,3-プロパンジオール (BMP) (19)，そして，2 ニトロアニソール (2-NA) (40)の 4

物質は代謝活性化条件下で Ames 試験陽性(28,64,102,121)であることから，遺伝毒

性物質と考えられ，細胞毒性を介さずに DNA 損傷を誘導することが期待される。

残りの 3 物質，ベンジルイソチオシアネート（BITC），ウラシルおよびメラミン

は，非遺伝毒性発がん物質またはプロモーターとして分類される。BITC は膀胱

発がんの強力なプロモーターである(32)。BITC は酸化的 DNA 損傷を引き起こす

が(62)，代謝活性化条件下の Ames 試験で陰性であり(44)，発がん抑制作用がある

ことも知られている(30)。ウラシルおよびメラミンは Ames 試験陰性(118,122)だ

が，膀胱がんの発症の原因となる細胞毒性を引き起こす(69,88)。これら 3 つの化

学物質は，細胞毒性によって誘導されうる DNA 損傷を区別できるかどうか，す

なわち，非遺伝毒性物質を正しく陰性と判定できるコメットアッセイの特異性を

検証するために使用した。これらの化学物質は膀胱発がんに関連することが明ら

かとなっているが，標的臓器が未知の被験物質の場合，代謝活性化による遺伝毒

性を調べる必要がある。その際，肝臓が優先選択臓器(19)となっているため，比

較のため肝臓コメットアッセイも同時に行った。

47


化学物質等

投与に用いた化学物質名，略語，CAS 番号，供給元，媒体は Table 7 に記載し

た。SYBR Gold，ハンクス平衡塩溶液，通常融点アガロース，低融点アガロース，

ダルベッコリン酸緩衝液，DMSO，水酸化ナトリウム，塩化ナトリウム，Tris，

Na2-EDTA，10%中性緩衝ホルマリンおよびエタノールは第 1 章と同様のものを使

用した。

動物

試験は一般財団法人残留農薬研究所の動物実験規程に従って行った。予備検討

として BBN を雄の SD ラットに投与した場合，雌の SD ラット，もしくは雌雄の

F344 または Wistar ラットより高い DNA 損傷を示したので，7 週齢の雄性 SD 系

ラット (Crl:CD(SD) ) を日本チャールス・リバー株式会社（茨城県）から購入し

た。動物は無作為に 5 匹ずつのグループに割り当てられ，動物室（温度 22±3℃，

湿度，50±20%，12 時間の明/暗サイクル）で 7 日間順応させ実験に用いた。飼料

と水は第 1 章と同様であった。

投与方法

BBN，2-NA および BITC は，コーン油（和光）に混和した。BMP，ウラシル，

およびメラミンを 0.5%メチルセルロース（MC, 信越化学工業株式会社，東京都）

に懸濁した。グリシドールは，生理食塩液（大塚）に溶解した。コメットアッセ

イでは，中・長期試験に使用される用量とは異なり，短期間で高い用量が用いら

48

れるため(104)，以下の用量を用いて各物質を投与した。予備的な BBN の用量設

定試験において，500 mg/kg の用量を投与したラットの剖検により膀胱の赤色化

が観察され，病理組織学的検査により上皮細胞にアポトーシスが認められた。コ

メットアッセイにおいては適切な投与量の選択が，偽陽性の結果を回避するため

に重要である。もし，500 mg/kg 以上の用量を投与した場合，膀胱に細胞死を含

む強い毒性が発生する恐れがあり，それがコメットアッセイにおいて「偽陽性」

の結果をもたらす可能性があった。そのため，本試験では，細胞毒性が生じない

と考えられる 250 mg/kg を選択した。他の 6 つの化学物質については 2 つの用量

（高用量と，その半分の低用量）を選択した。グリシドール，2-NA および BITC

は，死亡または顕著な毒性症状を示す用量を高用量（最大耐量）として選択した

(104)。ウラシルおよびメラミンは 2,000 mg/kg の限界用量を高用量に使用した

(104)。BMP は用量設定試験で認められた DNA 損傷から高および低用量を決定し

た。化学物質または溶媒対照を 10 mL/kg の容量を用いて 21 時間間隔で 2 回強制

経口投与した。各化学物質投与後は，動物の臨床症状および体重の変化を記録し

た。また，ケージ内の尿は，尿試験紙（Uriace®-Kc）を使用して，血尿を調べた。

すべての動物は，2 回目投与 3 時間後に二酸化炭素吸入により安楽死させ，それ

らの膀胱および肝臓を分析のために採材した。

体重の測定

投与初日および二日目の体重を測定し，2 日間の体重増加量を計算し，投与物

質による動物への影響を調べた。

49


膀胱を半分に切断し，片側半分をコメットアッセイに用いた。肝臓は外側左葉

の一部分を切り出した。採材組織は 4C に冷却したミンス緩衝液中（20mM の

Na2-EDTA，10% DMSO 含有ハンクス平衡塩溶液[Ca2+および Mg

2+不含]，肝臓用

pH 7.5，膀胱用 pH 9.0）で洗浄した。その後，眼科ハサミで 20 秒間ミンスし単一

細胞/核を得た。5 分間，260×g，4℃の条件で遠心分離後，細胞/核を新鮮な緩衝

液に懸濁し，氷上に置いて大きな塊を沈降させた後に上清をコメットアッセイに

用いた。膀胱の残りの半分および肝臓外側左側の残りの部分は，病理組織学的検

査のために 10%中性緩衝ホルマリン液で固定した。

スライド作製から観察までは，第 1 章で用いた方法と同様の材料と方法を用い

て行った。ただし，作業効率化のため 4 つの区画に分かれたスライド（S2193A7，

松浪硝子株式会社）を用い，カバーガラスにより寒天を伸ばす作業は行わなかっ

た。

病理組織学的検査は，0.5% MC，コーン油および BBN を投与したすべてのラ

ットの膀胱について実施した。他の 6 つの化学物質については，高用量で投与し

た群の膀胱でのみ病理組織学的検査を実施した。同様に肝臓については，グリシ

ドール，BMP，2-NA および BITC の高用量で投与されたラットからのサンプル

と，0.5%の MC，コーン油および BBN のサンプルで病理組織学的検査を実施し

た。臓器をパラフィン中に包埋し，定法に従い切片を作製した。顕微鏡検査は，

H&E 染色した切片で行った。病変の評価には以下のスコアを用いた。正常または

異常なし=0; ごく少数または一部に軽度な所見=1; 軽度から中程度，巣状/びまん

性，一部あるいは多く=2; 中等度の所見，びまん性，多い=3; 重度の所見が多く，

50

びまん性またはほぼ全域にわたる=4。病理組織学的なスコアは，最終的に個々の

スコアを平均することによって計算した。

統計学的解析

DNA 損傷を評価するために，個々の動物の平均% tail DNA から求めた各投与

群における平均% tail DNA を，対応する溶媒対照群と比較した。生理食塩液に溶

解したグリシドール群は 0.5%MC 群と比較した。BBN 投与群は，Student の t 検

定を用いて，溶媒対照群と投与群を比較した（P<0.05）。他の投与群は Dunnett

検定を用いて，複数群を各溶媒対照群と比較した（P<0.05）。体重増加量につい

ては，BBN 投与群は t 検定，その他の群は Dunnett 検定（P<0.05）を行った。

51

結果

各物質投与後の動物の体重変化および臨床症状

各物質投与後の体重変化および臨床症状を Table 8 に示す。2-NA の高用量群の

動物と，BITC の低用量および高用量群の動物で，重篤な臨床症状（削痩および

自発運動の消失）が観察された。グリシドール，BMP，2-NA，BITC，ウラシル

およびメラミンを投与した動物に有意な体重増加抑制が認められた。一方 BBN

を投与した動物では有意な体重増加抑制が観察されなかった。2-NAの高用量と，

BITC，ウラシルおよびメラミンの低および高用量を投与したラットに肉眼的に認

められた血尿は，尿試験紙によって潜血陽性であった。


コメットアッセイの結果を Table 9 に示す。以下の遺伝毒性発がん物質を投与

した動物において有意な DNA 損傷（% tail DNA）増加が認められた。膀胱では，

BBN（250 mg/kg，P <0.01），グリシドール（高用量 400 mg/kg，P <0.05），およ

び BMP（高用量 600 mg/kg，P <0.05）の投与群で% tail DNA が増加した。肝臓で

は，BBN 投与群（250 mg/kg，P <0.05），およびグリシドール投与群（低用量 200

mg/kg および高用量 400 mg/kg，P <0.01）で% tail DNA が増加した。これとは対

照的に，2-NA，BITC，ウラシルおよびメラミン投与群における膀胱もしくは肝

臓の% tail DNA と，対応する溶媒対照群との間に統計学的に有意差は認められな

かった。

ヘッジホッグ頻度の増加は，膀胱または肝臓のいずれの投与群にも認められな

かった (Table 9) 。膀胱では，ヘッジホッグの全体的な平均頻度は各化学物質投

52

与群で 0.8 から 4.3%の範囲であり，溶媒対照群の頻度（コーン油投与群：2.6%，

MC 投与群：3.2%）に近かった。興味深いことに，1,000 mg/kg のウラシルで処理

された一匹の動物において，ヘッジホッグ頻度は 58.0%と著しく増加し，これは

外れ値であると判断し，この値は分析に含めなかった。肝臓では投与群でヘッジ

ホッグ平均出現頻度は 0.2～1.7%であり，コーン油と MC の溶媒対照群のヘッジ

ホッグ平均出現頻度はそれぞれ 1.4%と 1.8%であった。

剖検所見

剖検において，ウラシルを 2,000 mg/kg で投与した 1 匹のラットの膀胱内に白

色固体（結石ほど固くない塊）が観察された（画像は示さず）。そのような白色

固体は他の処理動物では見られなかったが，BITC，ウラシルおよびメラミンの低

用量および高用量で投与したラットの膀胱壁の色調が赤く変色した（画像は示さ

ず）。また，膀胱壁の肥厚が，BITC の低用量群で観察された（画像は示さず）。

肝臓では，高用量の BITC を投与したラットの 5 匹中 4 匹で暗赤色に著しく変色

した（画像は示さず）。他の群で異常剖検所見は認められなかった。


膀胱で観察された病理組織学的変化を Table 10 に要約した。BBN 処理群におい

て粘膜下浮腫が 5 匹中 3 匹のラットに観察された。他の遺伝毒性物質で処理した

3 つのグループ（グリシドール，BMP および 2-NA）では，溶媒対照群で観察さ

れた程度のわずかな所見が観察された。対照的に，非遺伝毒性物質で処理した 3

つのグループ（BITC，ウラシルおよびメラミン）において，いくつかの病理組織

53

学的変化が観察された。5 匹中 3 匹以上のラットで見られた変化は以下の通りで

あった。BITC 投与群における尿路上皮細胞の過形成，空胞形成ならびに粘膜下

浮腫，ウラシル投与群における有糸分裂，メラミン投与群における尿路上皮細胞

の過形成と有糸分裂が観察された。BITC を投与したラットの膀胱の顕微鏡画像

を Fig. 4 に示す。他のマイナーな変化は，出血，好中球浸潤，尿路上皮細胞のア

ポトーシスおよび尿路上皮のびらんであった。

肝臓において，細胞毒性は観察されなかったが，肝細胞肥大のスコアの増加が

以下の投与群で認められた。肝細胞肥大のスコア（平均値±標準偏差）は，対照

群のスコア（0.0 ± 0）に比べ，BBN 群（0.2 ± 0.4），グリシドール群（1.0 ± 0），

2-NA 群（0.8 ± 0.4），および BITC 群（1.0 ± 0）と増加した (Table には示さず) 。

投与群のその他のマイナーな病理組織学的所見は，肝細胞空胞化，髄外造血，小

肉芽腫，および巣状肝細胞壊死であり，これらの所見は対照群のスコアの範囲内

であった。メラミンおよびウラシルの投与ラットでは，肝臓における剖検所見に

異常は認められず，さらに両物質は肝臓の遺伝毒性および発がん性の報告もない

ため，肝臓の病理組織学的検査は実施しなかった。

54

考察

本研究では，ラットに 4 つの遺伝毒性物質と 3 つの非遺伝毒性物質をそれぞれ

投与し，採取した膀胱組織を用いて，細胞毒性に関連した DNA 損傷（偽陽性）

と真の DNA 損傷（陽性）をコメットアッセイが識別可能か検討した。各 7 剤の

コメットアッセイの結果を Table 9 にまとめた。4 つの遺伝毒性物質の内，3 つ

（BBN，グリシドールおよび BMP）は，コメットアッセイで「陽性」結果であ

った。遺伝毒性物質 2-NA と 3 つの非遺伝毒性化学物質（BITC，ウラシルおよび

メラミン）は「陰性」結果を示した。いずれの化学物質投与によっても「偽陽性」

の結果は得られなかった。各 7 剤について既知の遺伝毒性と発がん性との関連性

を中心に，コメットアッセイで得られた結果が妥当であったかどうか，病理組織

学的検査で認められた細胞毒性がコメットアッセイの結果に及ぼす影響も含め

て，以下に考察した。

BBN

BBN は 250 mg/kg の 2 回投与により，肝臓において細胞毒性を示すことなく

DNA 損傷を引き起こした (Table 9) 。膀胱においても DNA 損傷が引き起こされ

たが (Table 9) ，壊死またはアポトーシスは観察されなかった (Table 10) 。すな

わち，観察された DNA 損傷は，いずれの臓器においても真の DNA 損傷であるこ

とを示していた。BBN を投与した動物において，臨床症状と有意な体重増加量の

抑制は認められず (Table 8) ，試験に用いた用量は最大耐量に達していない比較

的低い用量であった。しかしながら，コメットアッセイはそのような低用量を用

いても DNA 損傷を十分に検出できた。その機序として，BBN を投与したラット

の標的臓器内にButylating 4- hydroxybutylating種およびDNA付加体が形成された

55

という報告がある(1)。コメットアッセイでは，これらの付加体，あるいは付加体

の修復に関連するアルカリに不安定な箇所や鎖切断を検出することができるた

め，両臓器において明瞭な「陽性」結果が得られたと考えられた。BBN は，臓器

特異性の高い膀胱発がん物質であるが，過去の論文で肝発がん物質としても作用

することが報告されている(25)。したがって，今回得られた BBN 投与後における

肝臓の DNA 損傷の結果は，これらの公表された発がん性の報告と一致している。

グリシドール

グリシドールは，肝臓および膀胱で DNA 損傷を引き起こした (Table 9) 。膀胱

において，細胞死を含む細胞毒性を示唆する病理学的所見は認められなかった

(Table 10) 。肝臓では肝細胞肥大が認められたが，おそらく化学物質の曝露に対

する肝細胞の適応反応であった。F344 ラットの発がん性試験における腫瘍発生臓

器は，ジンバル腺，精巣，腸，乳腺，口腔および陰核腺であり(70)，限られた知

見ではあるが，ラットの膀胱および肝臓は，グリシドールによって誘発される発

がん性の標的臓器ではない。一方，B6C3F1 マウスにおいて，肝臓を含む複数の

臓器が発がん性の標的であることが報告されており，膀胱もまたグリシドール投

与に関連してがんが発生した可能性が指摘されている(70)。本章のコメットアッ

セイにおける肝臓および膀胱の陽性結果は，ラットにおける発がん性の報告と一

致しておらず，一つの理由としてラットの系統差の違いが考えられる。コメット

アッセイで用いたラットの系統が SD ラットであるため，今後，SD ラットを用い

た発がん性試験との比較も必要となってくる。一方，佐々木ら(83)によって示唆

されているように，DNA 損傷の増加を示すマウスおよびラットの臓器が必ずし

も発がんの標的臓器ではないことから，検出された DNA 損傷が発がん性に関連

56

する遺伝毒性であるかは化学物質ごとに慎重に考察する必要がある。

BMP

BMP は，肝臓において DNA 損傷を引き起こさなかったが，膀胱においては高

用量群で，細胞毒性を伴わない DNA 損傷を引き起こした (Table 9) 。BMP の遺

伝毒性は Ames 試験によって陽性結果が示されており(121)，その結果と概ね一致

した。これらの組織におけるコメットアッセイの結果は，BMP をげっ歯類に 2

年間にわたり混餌投与した結果，肝臓には発がん性がみられなかったが，膀胱に

は発がん性がみられたという報告と一致した(19)。なお，BMP を投与した動物に

有意な体重増加抑制が認められたものの，臨床症状が認められておらず (Table

8) ，選択した高用量が最大耐量に達していない可能性がある。よって，さらに高

用量の試験を行わなければ，肝臓におけるコメットアッセイの結果が陰性である

とは判断できないと考えられた。

2-NA

2-NA は，コメットアッセイにより肝臓および膀胱とも陰性の結果となった

(Table 9) 。2-NA の遺伝毒性と発がん性は広く検討されている。2-NA は Ames 試

験で陽性(28)であり，染色体異常試験では高濃度の沈殿または非混和性条件下で

染色体異常をわずかに増加させることが知られている(22)。発がん性については，

2-NA を飼料中に混合して 27 週間与え，その後，77 週間は通常の飼料で飼育した

雌雄ラットの膀胱，大腸および腎臓において腫瘍の発生率の増加が報告されてい

る(40)。本章における肝臓でのコメットアッセイの陰性の結果は，肝臓が発がん

標的臓器ではないことと一致している。一方で膀胱の陰性結果は発がん性試験で

標的臓器となっている結果と一致しなかった。2-NA の投与により有意な体重増

57

加抑制および重篤な臨床症状が確認されたことから (Table 8) ，この研究で使用

した用量が最大耐量であり，用量設定は適切であったことを示している。2-NA

の臓器標的性を考える場合，代謝物の尿中排泄等に留意する必要がある。2-NA

の代謝経路の報告によると(56)，主要な経路では，酸化および脱メチル化により

2 ニトロフェノールとなり，その硫酸抱合体が主に尿中に排出される。第 2 の経

路では，2-メトキシアニリン（o-アニシジン，OA）に還元される。OA は膀胱発

がん物質であることが指摘されており(67)，2-NA により誘発される膀胱発がんの

原因が OA である可能性が高い。しかしながら，2-NA の明確な発がん性にもか

かわらず，第 3 章の結果を含め，ほぼすべてのげっ歯類遺伝毒性試験は，OA の

遺伝毒性を in vivo で検出することができなかった。これまでに Ashby らは，2-NA

を投与したラットの膀胱において DNA 付加体が検出されなかったことから，フ

リーラジカル種が膀胱発がんに関与し得ることを考察している(6)。実際にOAは，

出芽酵母を用いた実験系でスーパーオキシドラジカルを増加させる(9)。2-NA の

代謝産物である OA による酸化的 DNA 損傷は，DNA コメットアッセイに使用す

るグリコシラーゼによって認識され，AP-リアーゼ活性により切断されない限り，

通常のアルカリコメットアッセイで検出することは困難であろう。これについて

は，第 4 章で検討を行う。

BITC

BITC を投与した動物における臨床症状と有意な体重増加量の抑制 (Table 8)

から，試験に用いた用量は適切であった。今回の in vivo 条件下で，BITC は膀胱

および肝臓における DNA 損傷を誘発せず (Table 9) ，非遺伝毒性物質であること

が明らかとなった。以前の報告において，飼料中に 0.1%の BITC を給餌された

58

F344 ラットでは，膀胱上皮に単細胞壊死が認められ(2)，BITC を含むイソチオシ

アネートの細胞傷害活性は，経口投与後に尿中に検出される抱合代謝物から遊離

した物質に由来するとされている(52)。しかし，本試験条件下では，病理組織学

的検査によって単細胞壊死は観察されず，また，コメットアッセイによる偽陽性

反応（すなわち細胞死に関連した DNA 損傷）も認められなかった。この結果は，

ラットの系統差による違い，あるいは混餌投与と単回投与による違いなど試験条

件による差によるものと考えられた。

ウラシル

ウラシルを投与した動物において，臨床症状は認められなかったが，有意な体

重増加量の抑制と (Table 8) ，上限の 2000 mg/kg を最高用量に用いたことから，

試験に用いた用量は適切であった。しかしながら，ウラシルは，ラットの膀胱ま

たは肝臓において DNA 損傷を誘発しなかった (Table 9) 。ウラシル投与により病

理組織学的検査では膀胱粘膜上皮に壊死またはアポトーシスが観察されたが

(Table 10) ，コメットアッセイにおいて偽陽性は誘発されなかった。また，両臓

器ともコメットアッセイにおけるヘッジホッグの増加は認められなかった。一匹

の雄ラットで外れ値と考えられるヘッジホッグが膀胱において検出されたが，著

者は過去に，無処理雄 SD ラットの膀胱において多数のヘッジホッグを認めた経

験がある（雌ラットでは認めなかった）。よって，今回，一匹の雄ラットで認め

られた異常に高い頻度のヘッジホッグは，細胞毒性によるものではなく，雄特有

のサンプリング処理に関連した組織の脆弱性に起因するものであろう。ウラシル

投与に起因する膀胱がんは，膀胱内の結石による慢性的な物理的刺激が関連して

いることはよく知られている(21)。本章における実験では，わずか 2 回の投与で，

59

1 匹のラットの膀胱に白色固形物を認めたが，この固形物はコメットアッセイに

おいて偽陽性を誘発するものではなかった。

メラミン

ウラシルを投与した動物において，臨床症状は認められなかったが，有意な体

重増加量の抑制と (Table 8) ，上限の 2,000 mg/kg を最高用量に用いたことから，

試験に用いた用量は適切であった。しかしながら，メラミンに関して，雄ラット

で膀胱結石と膀胱がんの間に有意な関連が報告されている(54)。今回の試験条件

下では，メラミンは，膀胱において DNA 損傷を引き起こさなかった (Table 9) 。

メラミンの高用量を投与したラットにおける% tail DNA は，メラミンの低用量ま

たは溶媒対照を投与したラットに比べ低かった (Table 9) 。病理組織学的検査で

は，わずかな粘膜びらんがメラミンの高用量群に認められたが (Table 10) ，壊死

を伴う損傷した尿路上皮細胞は，サンプリングの前に除去された可能性がある。

今回観察された好中球の浸潤，出血および尿路上皮びらんは，膀胱コメットアッ

セイにおいて「偽陽性」を導く原因とはならないことが明らかとなった。

要約すると，調べた 4 つの遺伝毒性発がん物質のうち 3 つが細胞毒性とは無関

係に膀胱コメットアッセイで「陽性」の結果を示した。また，BBN とグリシドー

ルは，肝臓で細胞毒性を伴わない「陽性」結果を示した。これらの結果は，検出

された DNA 損傷が細胞毒性に関連しておらず，真の DNA 損傷を反映しているこ

とを示している。残り 1 つの遺伝毒性発がん物質 2-NA については，本試験条件

におけるコメットアッセイでは「陰性」の結果が得られており，2-NA の発がん

メカニズムを解明するためにコメットアッセイに改良を加え，第 4 章で再検討す

る。一方，3 つの非遺伝毒性発がん物質について，膀胱と肝臓コメットアッセイ

60

の両方で「陰性」の結果が得られた。3 つの化学物質の作用機序を考慮すると，

ラットの膀胱に細胞死を含む細胞毒性の発生が予測され，そのためコメットアッ

セイによる偽陽性の結果が生じることが懸念された。しかし，それらは幸いコメ

ットアッセイの結果に影響を与えなかった。この結果は他剤による過去の報告と

も一致しており，腎臓(55)または精巣(84)に若干の細胞毒性が観察された条件下で

は DNA 損傷が認められなかった。また，肝臓や空腸にアポトーシスおよび壊死

が生じる条件下においても，DNA 損傷を引き起こさなかった(27)。したがって，

組織における細胞毒性は膀胱を含む種々の臓器で，in vivo コメットアッセイにお

ける「偽陽性」の結果を常に引き起こすわけではなさそうである。今回の結果は，

7 つの化学物質を用いたコメットアッセイの中で，一つの「偽陰性」があったが

(2-NA) ，3 つの遺伝毒性物質を検出することができた。また，膀胱内でいくつか

のマイナーな病理組織学的変化を誘発した非遺伝毒性物質 3 剤を用いても「偽陽

性」は認められなかった。したがって，本試験条件下では遺伝毒性および非遺伝

毒性物質を区別することができたが，2-NA については，酸化的 DNA 損傷の検出

を含め，試験法の改良が必要であることが明らかとなった。

61

小括

In vivo コメットアッセイは，げっ歯類の様々な臓器における DNA 損傷および

修復の評価に使用することが可能である。しかしながら，コメットアッセイは

DNA の断片化を検出するため，細胞死由来の非特異的 DNA 損傷により，偽陽性

の結果を導く可能性がある。一方，膀胱では細胞毒性とコメットアッセイの関係

を検討した報告はない。そこで本研究では，げっ歯類の膀胱発がんに関連する 7

つの化学物質，BBN，グリシドール，BMP，2-NA，BITC，ウラシルおよびメラ

ミンを使用することにより，膀胱上皮細胞における遺伝毒性および非遺伝毒性を

区別しうるかどうかを第 2 章で確立した方法により検討した。BBN，グリシドー

ル，BMP および 2-NA は，Ames 試験において陽性の報告があり，細胞毒性が認

められない条件下で DNA 損傷が生じることが予想された。一方，代謝活性化を

用いた Ames 試験で陰性の結果が得られている膀胱発がん関連物質の BITC，ウラ

シルおよびメラミンは，細胞毒性に起因する非特異的 DNA 損傷を誘発する可能

性があった。そこで各物質を雄 SD ラット（1 群あたり 5 匹）に 2 回連続経口投

与し，最終投与 3 時間後に膀胱をサンプリングし，膀胱の片側半分からミンス法

により採取した上皮細胞をコメットアッセイに使用し，残りの半分の膀胱を，細

胞毒性を評価するために病理組織学的検査に供した。その結果，BBN，グリシド

ールおよび BMP で処理したラットの膀胱において，DNA 損傷が検出されたが，

それに関連する病理組織学的変化はなかった。対照的に，2-NA は DNA 損傷や細

胞毒性が観察されなかった。3 剤の非遺伝毒性化学物質（BITC，ウラシルおよび

メラミン）の投与により，いくつかの病理組織学的変化が観察されたが，膀胱に

DNA 損傷を誘発しなかった。以上のように，コメットアッセイにより，膀胱を

62

標的臓器とした遺伝毒性と非遺伝毒性化学物質の区別が可能であり，得られた結

果にはいずれも偽陽性反応はなかった。本研究は，膀胱におけるコメットアッセ

イの結果と病理組織学的検査の関係を初めて報告した研究である。標準的なコメ

ットアッセイで遺伝毒性が検出されなかった 2-NA については，酸化的 DNA 損

傷の検出を含めさらなる試験法の改良が必要であると考えられた。

63

第 4 章酸化損傷認識酵素を用いた改良コメットアッセイによる

2-ニトロアニソールの膀胱における酸化的 DNA 損傷の検出

64

緒言

2-ニトロアニソール（2-NA，1-メトキシ-2-ニトロベンゼン）は，医薬品製造過

程で産生される中間体として知られ，アゾ染料の製造に使用される o-アニシジン

(OA) の前駆体としても使用されている(34)。2-NA は，F344 ラットを用いた発が

ん性試験において，膀胱，腎臓および腸に腫瘍性病変を誘発し(40)，国際的な発

がん物質の評価機関である国際がん研究機関（IARC）においてグループ 2B（ヒ

トに対する発がん性が疑われる）に分類されている。OA もげっ歯類の膀胱がん

の原因物質である(67)。げっ歯類における 2-NA の強力な発がん性にもかかわら

ず，Ames 試験では弱い変異原性を示し，代謝活性化のネズミチフス菌 TA100 株

で弱陽性である(28)。細胞遺伝学的試験でも低い活性を示し，2-NA は代謝活性化

系を用いた沈殿または非混和性を示す高濃度（1060 μg/mL）の条件下で，染色体

異常のわずかな増加を誘発する(22)。また，マウスリンフォーマアッセイでは，

非代謝活性化条件下の 50%以上の相対細胞増殖抑制率を示す 0.15 μL/mL 以上の

濃度で陽性である(117)。In vivo 小核試験は行われていない。第 3 章において，2-NA

を経口投与したラットの標準的な膀胱コメットアッセイでは DNA 損傷を検出で

きなかった。しかしながら，2-NA を腹腔内投与したラットでは，膀胱内に DNA

付加体が形成されるという報告がある(97)。DNA 付加体は必ずしも DNA 損傷と

結びつかないが，標準的なコメットアッセイではこの種の化学物質の遺伝毒性が

検出できないという弱点が明らかとなった。2-NA の弱い変異原性と，in vitro に

おける陽性結果が代謝活性化の存在下または非存在下という異なる条件から得

られるという不整合を考慮すると，直接的な DNA 損傷以外の機序，すなわち酸

化的 DNA 損傷の検出を含めた試験法の改良を含めたアプローチが必要であると

65

考えられる。

飲料水中のヒ素化合物を含むいくつかの膀胱発がん物質(116)，喫煙(74)および

4-aminobyphenyl(63)は膀胱において酸化的 DNA 損傷を誘導することが知られて

いる。酸化的 DNA 損傷を検出するために，その修復酵素を作用させ，酸化損傷

修復過程の DNA 切断を検出する改良法が細胞株を用いたコメットアッセイにお

いて有効であるとの報告がある(14)。精製された修復酵素の作用により，コメッ

トアッセイの感度および特異性が非常に増加するという(15)。修復酵素として用

いられる human 8-oxoguanine DNA-glycosylase 1 (hOGG1) は，ホルムアミドピリ

ミジン DNA グリコシラーゼまたはエンドヌクレアーゼ III よりも酸化的 DNA 損

傷部位（主たる酸化損傷である 8-OH-dGを含む）に対する高い特異性を示す(92)。

そのため，2-NA により膀胱内に誘導される可能性のある酸化的 DNA 損傷をコメ

ットアッセイで検出するためには，hOGG1 酵素の処理が有効であるとの仮説を

立てた。

本研究では，この仮説を確かめるために，hOGG1 存在下と非存在下で膀胱コ

メットアッセイを実施した。また，抗酸化剤である還元型グルタチオン（GSH,

Glutathione-SH）は，酸化的 DNA 損傷を低減すると予想されるため，2-NA 単独

と 2-NA と GSH を同時に投与する群を設けてそれぞれのデータを比較した。第 3

章で 2-NA の標準コメットアッセイで陰性結果を示した非標的臓器の肝臓も合わ

せて検討した。さらに，2-NA の遺伝毒性の有無をコメットアッセイとは別の試

験系で確認するために，骨髄小核試験を用いて in vivo における骨髄細胞中の染色

体異常誘発性を評価した。

66


化学物質等

2-NA（CAS 番号 91-23-6）と GSH（CAS 番号 70-18-8）は東京化成工業株式会

社から，N-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-N'エタンスルホン酸（HEPES），

アクリジンオレンジおよびウシ血清アルブミン（BSA）は和光純薬工業株式会社

から，hOGG1 は New England Biolabs Japan（東京都）から購入した。EMS, SYBR

Gold，ハンクス平衡塩溶液，通常融点アガロース，低融点アガロース，ダルベッ

コリン酸緩衝液，DMSO，水酸化ナトリウム，塩化ナトリウム，Tris，Na2-EDTA，

およびエタノールは第 1 章と同様のものを使用した。SYBR Gold，HBSS，ダルベ

ッコリン酸緩衝液の購入先は Invitrogen Corp.の合併のため，Life Technologies（カ

リフォルニア，米国）に変更した。

供試動物

動物実験は，一般財団法人残留農薬研究所の動物実験規定に従って行った。本

研究では，発がん性試験で使用されたラットの系統と一致させるために，以前に

2-NAの 2年間の発がん性試験で使用された系統である F344ラットを用いた(32)。

雄性ラットを日本チャールス・リバー株式会社（神奈川県）から購入し，7 週齢

で試験に使用した。ラットの平均体重±標準偏差は，初回投与時で 152 ± 5.8 g

であった。動物室と動物飼料は第 3 章と同様であった。水道水は自動給水装置を

用いて動物に供給した。

67

試験方法

2-NA は，コーン油（和光）に溶解した。EMS は，生理食塩水（株式会社大塚

製薬工場）に溶解した。GSH は生理食塩水に均一に懸濁した。700 mg/kg を用い

た予備的な用量設定試験の結果から，2-NA の投与用量を 125，250 および 500

mg/kg に設定した。EMS の投与用量は第 1 章と同じ 200 mg/kg であった。投与容

量は，2-NA，溶媒対照（コーン油）および EMS について体重あたり 10 mL/kg で

あった。また，2-NA 500 mg/kg と GSH 1,000 mg/kg（各容量：5 mL/kg）を連続し

て同時刻に投与した（同時投与群）。動物数削減のためコメットアッセイと小核

試験を同じ動物で行った。第 1 章で用いたプロトコールを用いて，陽性対照物質

である EMS の投与群では 2 日間，2-NA，溶媒対照群を含むその他の投与群では

3 日間，強制経口投与を行った後，臨床症状および体重の変化を記録した。すべ

ての動物は，最終投与 3 時間後に二酸化炭素吸入によって安楽死させた後に，膀

胱，肝臓および骨髄を採材し，検査に用いた。

hOGG1 処理および非処理によるコメットアッセイ

第 3章に記載された方法を用いて膀胱上皮および肝臓のサンプルから単一細胞

ないし核を採取した。スライド作製までは，第 3 章で用いた方法と同様の材料と

方法を用いて行った。細胞溶解液に浸した翌日に以下のように hOGG1 処理を行

った。

hOGG1 処理によるコメットアッセイ(92)はいくつかの変更を加えて実施した。

細胞溶解液を洗い流すために，スライドを 4C に冷却した緩衝液 F（40mM HEPES，

0.1 M KCl，0.5mM K2-EDTA，および 0.2 mg/mL BSA，pH 8.0）中に 5 分間，2 回

68

浸漬した。hOGG1 は緩衝液 F で 10,000 倍に希釈し使用した。緩衝液 F のみを用

いた hOGG1 非処理群は hOGG1 処理群に対応する溶媒対照群であり，標準的なコ

メットアッセイとみなした。同じスライド上の 4 つのうち 2 つの区画に，hOGG1

または緩衝液 F を各々添加し，液漏れを防ぐために蓋をした。スライドを 37℃で

30 分間，水蒸気を 100%飽和させたチャンバー（MIR-262，三洋電機株式会社，

大阪府）内でインキュベートした。

処理後，スライド上の寒天を 4℃で再固化し，4C に冷却した純水でリンスし

た。DNA unwinding 以降，スライド観察までの作業は，第 1 章の方法で行った。

骨髄小核試験

骨髄小核試験の解析は，Schmid(86)の標準的な方法に従った。サンプルチュー

ブに入れた両端を切断した大腿骨を，5 分間，260 × g で遠心分離した後に大腿骨

を取り除き，得られた骨髄を少量の血清（顕微鏡観察しやすいような細胞密度に

なるように）に再懸濁した後，3 μL の細胞懸濁液をスライドガラス上に置き，

カバーガラスを用いて均一に塗抹した。骨髄塗抹標本は空気乾燥させ，5 分間メ

タノール（>99.0%, 和光純薬工業株式会社）で固定した。固定された塗抹標本は，

幼若赤血球（多染性赤血球）および成熟赤血球（正染性赤血球）を蛍光顕微鏡で

観察した後，アクリジンオレンジ(29)を用いて染色した。一動物当たり 4,000 個

の幼若赤血球を観察し，小核を有する幼若赤血球の出現頻度を算出した。骨髄毒

性を評価するために，各動物あたり 1,000 個の赤血球を計数することにより，総

赤血球数のうちの幼若赤血球数の割合を算出した。

69

統計学的処理

DNA 損傷を評価するために，個々の動物の% tail DNA(48)の中央値の各投与群

の平均値(72)について，Bartlett の検定を使用して分散の均一性を評価し，パラメ

トリックまたはノンパラメトリック Dunnett 検定を用いて溶媒対照群と比較した。

溶媒対照群と陽性対照物質投与群のデータについては，等分散性の F 検定を実施

し，等分散の判定が出た場合には，Student の t 検定を用いて群間の有意差の有無

を調べ，等分散でない判定が出た場合には，Aspin-Welch の t 検定を行った。なお，

いずれの検定法も有意水準を 5%以下に設定した。

2-NA 投与群における小核を有する幼若赤血球の出現頻度は

Kastenbaum-Bowman(45)の標準的な表を使用して，溶媒対照群と比較した。陽性

対照群の小核を有する幼若赤血球の出現頻度は，カイ二乗検定を用いて溶媒対照

群と比較した。全赤血球に対する幼若赤血球の比率は Wilcoxon の順位和検定を

用いて統計解析を行った。すべての統計学的検定は有意水準を 5%とした。

70

結果

臨床症状と体重変化

予備的な用量設定試験において，2-NA を 700 mg/kg の用量で投与した結果，動

物は昏睡状態に陥ったため二酸化炭素吸入により安楽死させた。したがって 125，

250 および 500 mg/kg の用量を用いて本試験を実施した。2-NA の 500 mg/kg の用

量で投与した群および同時投与群（2-NA および GSH）では，いずれも歩行失調，

衰弱，自発運動活性の消失および赤色尿を含むいくつかの臨床症状が認められた。

溶媒対照群の動物の平均体重は投与期間中に 6.3 g 増加したが，2-NA 投与群およ

び同時投与群の体重はそれぞれ 11.4 g，6.7 g 減少した。観察された臨床症状と体

重の減少は，投与用量が適切な高用量（最大耐量）に到達していることを示した。

膀胱コメットアッセイの結果

膀胱におけるhOGG1処理および非処理によるコメットアッセイの結果をFig. 5

（a）に示す。

hOGG 非処理コメットアッセイでは，溶媒対照群の% tail DNA（4.33%）と比較

して，2-NA のいずれの用量または同時投与群においても% tail DNA の有意な増

加は観察されなかった。しかし，hOGG1 処理したコメットアッセイでは，溶媒

対照群の% tail DNA（5.19%）と比較して，2-NA 500 mg/kg 投与群における% tail

DNA に陽性対照レベルの劇的な増加（21.90%，P <0.01）が認められた。2-NA と

GSH の同時投与群において，2-NA の酸化的 DNA 損傷は抑制（13.76%）され，

溶媒対照群との間に有意な差は認められなかった。2-NA を 125 または 250 mg/kg

の用量で投与した群は，溶媒対照群と比べ% tail DNA の有意な増加は認められな

71

かった。しかし，hOGG1 非処理群と比較した場合に，hOGG1 処理群の% tail DNA

は，125 mg/kg 投与群では 2.0 倍，250 mg/kg 投与群では 5.8 倍の増加が認められ

た。

EMS 処理群では% tail DNA の統計学的に有意な増加が観察された。EMS 投与

群における hOGG1 非処理群の平均% tail DNA は 16.88%であり，hOGG1 処理群

では 23.71%であった。ヘッジホッグの発生頻度の増加は，hOGG1 処理の有無に

かかわらず 2-NA 投与群のいずれのサンプルでも観察されなかった。hOGG1 非処

理群におけるすべての投与群の平均ヘッジホッグ頻度は 3.0%以下であり，hOGG1

処理群におけるすべての投与群では 3.4%以下であった (Fig には示さず) 。

肝臓コメットアッセイの結果

肝臓におけるhOGG1処理および非処理によるコメットアッセイの結果をFig. 5

（b）に示す。

hOGG1 非処理によるコメットアッセイでは，溶媒対照群の% tail DNA（0.90%）

と比較して，2-NA のいずれの用量または同時投与群において% tail DNA の有意

な増加は観察されなかった。また，hOGG1 処理によるコメットアッセイでも，

溶媒対照群の% tail DNA（1.29%）と比較して，2-NA のいずれの用量または同時

投与群に% tail DNA の有意な増加は観察されなかった。

EMS 処理群では溶媒対照群と比べ統計学的に有意な% tail DNA の増加が観察

された。EMS 投与群における hOGG1 非処理処理群の平均% tail DNA は 31.55%

であり，hOGG1 処理群では 35.79%であった。ヘッジホッグの頻度の増加は，

hOGG1 処理の有無にかかわらずいずれの 2-NA 投与群でも観察されなかった。

72

hOGG1 非処理処理群におけるすべての投与群の平均ヘッジホッグ頻度は 2.2%以

下であり，hOGG1 処理群におけるすべての投与群では 1.2%以下であった (Fig に

は示さず) 。

骨髄小核試験の結果

骨髄小核試験の結果を Table 11 に示す。溶媒対照群における小核を有する幼若

赤血球の出現頻度は 0.200%であった。それに対して，2-NA 投与群の小核を有す

る幼若赤血球の出現頻度は 0.180～0.280%であり，いずれの用量群においても溶

媒対照群と比べて有意な増加は認められなかった。一方，EMS を投与した陽性対

照群の小核を有する幼若赤血球の出現頻度は 2.605%であり，溶媒対照群と比べて

有意な増加が認められた。溶媒対照群における幼若赤血球の割合が 57.32%であっ

たのに対して，2-NA 投与群の幼若赤血球の割合は 54.74～58.40%であり，いずれ

の群においても 2-NA による骨髄抑制は認められなかった。また，500 mg/kg 投与

では体重減少と重篤な臨床症状が観察されたが，いずれも骨髄毒性に影響を及ぼ

さなかった。

73

考察

F344 に 2-NA を経口投与し，膀胱および肝臓を用いて標準コメットアッセイを

実施した結果，いずれの臓器においても陰性の結果が得られた (Fig. 5 (a, b)) 。こ

れらは SD ラットで得られた第 3 章の結果 (Table 9) と一致した。対照的に，

hOGG1 処理コメットアッセイでは，2-NA 投与動物から得られた膀胱サンプルに

おいて明らかな陽性結果が得られた (Fig. 5 (a)) 。この結果は，標準コメットアッ

セイで検出することができなかった 8-OH-dG (8-hydroxydeoxyguanosine) が，

hOGG1 によって認識され，その修復過程に生じた DNA 切断を hOGG1 コメット

アッセイが検出したことを示唆していた。2-NA の非発がん標的臓器である肝臓

の hOGG1 コメットアッセイでは，陰性の結果が得られたため，発がん標的臓器

である膀胱において特異的に発生したDNA損傷をhOGG1が認識したことを示し

ていた。

確認のため，2-NA の遺伝毒性の有無をコメットアッセイとは別の試験系で評

価した。骨髄小核試験は in vivo において染色体異常の有無を検出できるため，農

薬，医薬品等の開発時に広く用いられている試験である。2-NA を投与したラッ

トにおいて骨髄小核試験に実施した結果，小核を有する幼若赤血球の頻度は，適

切な用量および検査に必要な十分な細胞数を用いた条件下でも増加しなかった

(Table 11) 。よって 2-NA は in vivo 条件下においても染色体異常を誘発する可能

性がない事が示された。これは，in vitro 染色体異常試験における 2-NA の析出が

無い生理的条件下で，2-NA により染色体異常が誘発されなかった報告とも一致

した(22)。

これまでの研究では，0.15 mg/kg の 2-NA の腹腔内投与後に，2-NA の代謝物で

74

ある N-（2-メトキシフェニル）ヒドロキシルアミンおよびそのニトレニウムまた

はカルベニウムイオンが 32P標識されたDNA付加体を形成すると報告されている

(65)。この報告は標準コメットアッセイによって DNA 損傷が検出されなかった著

者の結果と矛盾する。この結果の不整合は，おそらく投与経路の違いを含む実験

条件の違いを反映している。一般的に腹腔内注射は，経口投与よりも投与薬物の

吸収率がよいため，DNA 付加体の検出には高濃度で薬物が吸収される条件設定

が必要と考えられる。経口による曝露は 2-NA のヒトに対する主な曝露経路であ

ると考えられ，また，2-NA のラットの発がん性試験においても混餌投与が行わ

れているため(40)，本試験では経口投与を選択した。2-NA の経口投与では腹腔内

投与に比較し，膀胱における DNA 付加体の形成の可能性は低いが，2-NA の代謝

物により，標準コメットアッセイによって検出されなかったある種の DNA 付加

体が膀胱に生じている可能性は否定できない。例えば，アルキル化損傷によって

誘発される脱プリン/脱ピリミジン（AP）部位の多くの部分は，コメットアッセ

イで行うアルカリ処理によっても一本鎖切断に変換されないという(20)。また，

メタンスルホン酸メチル (MMS) もしくは EMS によって誘導されたアルキル化

損傷は，標準的なコメットアッセイで検出できるが，エンドヌクレアーゼ III(14)

あるいはホルムアミドピリミジン DNA グリコシラーゼ(93)による酵素処理はコ

メットアッセイの検出感度を増加させる。さらに，かさ高い DNA 損傷はコメッ

トアッセイで検出が難しい可能性が指摘されている(94)。従って，DNA 損傷のい

くつかのタイプは，アルカリ性条件下で全て切断に変換されていない事が示され，

これらを効率よく検出できるコメットアッセイの改良が今後の検討課題である。

本研究によって，膀胱における 2-NA による酸化的 DNA 損傷が明らかに実証

75

された。膀胱における DNA の酸化は，おそらく 2-NA の一部の尿中代謝物が有

していると考えられる。2-NA の経口投与後に検出された尿中代謝物は，その量

の順に o-ニトロフェニルスルフェート，o-ニトロフェニルグルクロニド，o-ニト

ロフェノールおよび OA である(56)。抱合代謝産物は，一般にその高い水溶性の

ため活性を持たないので，ここでは考慮しない。o-ニトロフェノールについては，

その還元生成物 o-アミノフェノールが酸化的 DNA 損傷を引き起こすため(73)，

酸化的 DNA 損傷の誘発能を有すると考えられる。OA も同様に酸化的 DNA 損傷

を誘発すると考えられている。OA は膀胱発がん物質であるが，第 2 章で示され

たようにラットの 2 回経口投与後の膀胱において DNA 損傷を誘発しなかった。

Ashby ら(6)は，ラットの膀胱では OA-DNA 付加体が検出できなかったため，フ

リーラジカル種が膀胱発がんに関与し得ることを示唆している。酵母中での DNA

の欠失の頻度を抗酸化剤処理により減少させた研究では，OA がスーパーオキシ

ドラジカルを生成することを示唆している(9)。o-ニトロフェノールおよび OA に

よる酸化損傷の誘導に加えて，おそらく還元代謝の過程においても酸化的 DNA

損傷が誘導される。ニトロ芳香族化合物は，ニトロ基の還元代謝経路における無

益回路でスーパーオキシドアニオンを生成する(77)。よって 2-NA の還元的な代

謝によって生成されるスーパーオキシドアニオンはスーパーオキシドジスムタ

ーゼにより過酸化水素に変換され，その結果，ヒドロキシルラジカルが生成する

と考えられる。

GSH の同時投与により，2-NA により引き起こされた酸化的 DNA 損傷が明ら

かに減少したことは (Fig. 5 (a)) ，GSH によって 2-NA の還元過程で生成されるヒ

ドロキシルラジカルが捕捉されたことを示唆する。ウサギの膀胱では，一部の

76

GSH関連酵素の活性が低く，これに伴いGSH濃度も他臓器に比べて極めて低い。

そのため，膀胱移行上皮は，酸化ストレスが関与する化学発がんに対し感受性が

比較的高い可能性が指摘されている(58)。また，マウスにおいて，Nrf2 を介する

抗酸化応答配列の転写活性が BBN による膀胱発がんの抑制に関与すると報告が

ある(39)。これらはヒトにおいても同様であると推察されるため，2-NA 等の化学

物質によって誘発される酸化的 DNA 損傷の防止には，GSH のような抗酸化剤を

適用することが有効であろうと考えられる。

酸化的 DNA 損傷はがんを含む多くの疾患に関係している(16)。しかしながら，

酸化的 DNA 損傷をコメットアッセイで検出することは難しく，in vitro 試験では

部位特異的酵素の使用の有効性が指摘されているが，in vivo 試験に応用した例は

極めて少ない(94)。本章では，hOGG1 コメットアッセイが，標準コメットアッセ

イに簡単な前処理手順を加えることで，様々な臓器へ応用できる事を示した。今

後 in vivo における hOGG1 コメットアッセイは，様々な臓器における酸化的 DNA

損傷を検出するための有用なツールとなるであろう。

77

小括

2-NA は膀胱発がん物質であり，Ames 陽性の遺伝毒性物質でもあるが，第 3 章

で示したように，標準的なコメットアッセイでは膀胱における DNA 損傷を検出

できないことが明らかとなった。2-NA は第 2 章で用いた OA の還元代謝物であ

り，構造の類似性からこれら二つの膀胱発がん物質には標準的なコメットアッセ

イでは検出できない別の遺伝毒性メカニズムの存在が示唆された。いくつかの膀

胱発がん性物質は酸化的 DNA 損傷を誘導することが報告されており，2-NA も酸

化的 DNA 損傷を誘導する可能性が報告されている。そこで酸化的 DNA 損傷の一

つである 8-OH-dG に特異的に作用する hOGG1 の処理条件下，非処理条件下で，

ラット膀胱および肝臓を用いたコメットアッセイを行った。また，コメットアッ

セイとは別の試験系で生体内での 2-NA の遺伝毒性を評価するために，コメット

アッセイで使用される各動物から骨髄を取り出し小核試験を実施した。2-NAは，

雄性 F344 ラットに 3 日間経口投与した。ラットは以下の 6 つの投与群に分けた。

それらは 125，250，および 500 mg/kg の用量で 2-NA を投与した群，2-NA と還元

型グルタチオンの同時投与群，溶媒対照群および陽性対照群であった。hOGG1

を処理しないコメットアッセイでは，膀胱および肝臓で DNA 損傷は検出されな

かった。小核試験においても骨髄細胞における染色体異常誘発作用は検出されな

かった。しかし，hOGG1 処理条件下ではコメットアッセイにより，500 mg/kg 群

のラット膀胱における強い陽性結果が得られた。一方，肝臓では陰性であった。

また，2-NA の 500 mg/kg と GSH 同時投与群は，2-NA によって生じる陽性反応を

減少させた。これらの結果により，2-NA を投与したラットの膀胱では酸化的 DNA

損傷が生じている可能性が考えられ，本剤の膀胱発がんのメカニズムのひとつと

78

して有用な結果が得られた。hOGG1 コメットアッセイの手順は簡便であり，標

準的コメットアッセイと併用しながら，酸化的 DNA 損傷を検出できる有用なツ

ールとして今後利用できると考えられる。

79

結論

本研究では，in vivo 遺伝毒性評価法としてのコメットアッセイの確立と膀胱上

皮への応用を検討した。

第 1 章ではまず，塩化カドミウム，クロロホルムおよび D,L-メントールの遺伝

毒性の有無を，物質名が伏せられた条件下で肝臓と胃のコメットアッセイを行う

ことにより，各剤の遺伝毒性をコメットアッセイが正しく判定することが可能か

否か評価した。試験の結果，塩化カドミウムの遺伝毒性は「不確か」であり，ク

ロロホルムと D,L-メントールはともに「陰性」であった。これらの結果は，各剤

とも既知の遺伝毒性の報告と一致していた。一方，陽性対照物質は｢陽性｣であり，

試験は適切な条件下で行われていたと考えられた。したがって，コメットアッセ

イは，物質名が伏せられた条件下で化学物質の遺伝毒性を適切に評価できる試験

系であることを示した。以上の結果から，本試験法は肝臓と胃において適切に遺

伝毒性を判定できると結論した。国際バリデーション試験をまとめた結果は，

OECD ガイドラインの採択へ寄与し，本研究はその一部となった。今後，農薬・

医薬品・一般化学物質の遺伝毒性評価を行う際のコメットアッセイの重要性が高

まるだろう。

第 2 章では第 1 章でバリデートされた肝臓と胃のコメットアッセイを膀胱に応

用した。ここでは，遺伝毒性の標的であり膀胱発がんの発生母地となる上皮細胞

を効率よく回収する必要があったため，膀胱上皮細胞をかきとる方法（スクレイ

ピング法）と，膀胱全体をハサミで刻むより簡便なミンス法により得られたサン

プルでコメットアッセイを行い，得られたデータを比較・検討した。その結果，

両方法とも遺伝毒性物質の MNU と EMS を検出した。ミンス法により調製した細

80

胞/核懸濁液を形態学的に観察すると，回収した細胞の 80%以上は上皮由来であり，

サイトケラチン免疫染色で上皮細胞の存在を確認した。よって，スクレイピング

法より簡便なミンス方法は，膀胱コメットアッセイに有用な細胞回収法であると

結論した。

第 3 章では，さらに，主要な 7 剤の膀胱発がん関連化学物質を用いて，膀胱コ

メットアッセイにより遺伝毒性および非遺伝毒性物質を区別可能か否か検討し

た。非遺伝毒性物質による細胞毒性によりコメットアッセイ偽陽性が誘発される

懸念があったため，病理組織学的検査を用いて各剤の細胞毒性を評価した。その

結果，遺伝毒性物質 3 剤からコメットアッセイにより DNA 損傷が検出され，問

題となる病理組織学的変化は認められなかった。3剤の非遺伝毒性化学物質（BITC，

ウラシルおよびメラミン）の投与により，投与に関連した病理組織学的変化が観

察されたが，膀胱に DNA 損傷を誘発しなかった。この結果は，これまでの in vitro

での遺伝毒性の報告とほぼ矛盾なく，膀胱におけるコメットアッセイが，偽陽性

を生じることなく遺伝毒性物質と非遺伝毒性物質を区別して検出できることが

示された。

最後に第 3 章で陰性であった 2-NA について酸化的 DNA 損傷の一つ 8-OH-dG

の間接的な検出を試みた。その結果，hOGG1 コメットアッセイにより，2-NA 500

mg/kg 投与群ラットの膀胱における強い酸化的 DNA 損傷を検出した。また，2-NA

の 500 mg/kg と GSH 同時投与群では，2-NA によって生じると考えられる酸化的

DNA 損傷が減少した。これらの結果により，2-NA を投与したラットの膀胱で検

出された酸化的 DNA 損傷が以後のがん化に関与する可能性が示唆された。

本研究により，農薬・医薬品・一般化学物質の遺伝毒性評価を行う際のコメッ

81

トアッセイのガイドライン化に対する一定の貢献と，このアッセイを膀胱に応用

することで，膀胱における遺伝毒性あるいは非遺伝毒性の評価が可能となった。

酸化的DNA損傷の検出にはhOGG1コメットアッセイが有用であることが示され，

今後，様々な種類の DNA 損傷を検出できる改良法の開発とともに，肝臓・胃・

膀胱以外の他の臓器への検討も推進していく必要がある。さらに，コメットアッ

セイで検出される DNA 損傷がどの程度，がんを含むヒトの疾患に関連している

かについても，研究を展開していく必要がある。

82

謝辞

本稿を終えるにあたり，本研究に関して長年に渡るご指導，ご鞭撻，ご協力を

賜りました岐阜大学大学院連合獣医学研究科ならびに東京農工大学大学院農学

研究院動物生命科学部門吉田敏則准教授に深甚たる謝意を表します。

本稿作成に際し，懇篤な御指導，御助言を賜りました，帯広畜産大学原虫病研

究センター鈴木宏志教授，岩手大学農学部共同獣医学科実験動物学研究室古市

達哉教授，東京農工大学農学部共同獣医学科獣医薬理学研究室佐々木一昭准教

授，岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科病態獣医学分野酒井洋樹准教授，国

立医薬品食品衛生研究所安全性生物試験研究センター西川秋佳先生に謹んで陳

謝の意を表します。

本研究の全般にわたる，親身な御指導と研究環境の提供にご配慮いただきまし

た一般財団法人残留農薬研究所毒性部松元郷六副部長に深く感謝申し上げます。

実験期間中，貴重な御助言を賜りました東京農工大学大学院農学研究院動物生命

科学部門三森国敏元教授，渋谷淳教授，国立医薬品食品研究所変異遺伝部山田

雅巳先生に厚くお礼申し上げます。

最後に，本研究は一般財団法人残留農薬研究所の多くの方々の御協力がなけれ

ば成し得ませんでした。ここに心から感謝いたします。

83

要旨

遺伝毒性試験は，化学物質の開発や再評価の過程において，遺伝子に変化を及

ぼす可能性のある物質を in vivo あるいは in vitro により短期でスクリーニングす

るために用いられる。細菌，培養細胞あるいは動物を用いて，様々なエンドポイ

ント，すなわち，DNA 損傷，染色体異常および遺伝子突然変異を指標に遺伝毒

性の評価をするため，種々の試験法が開発されている。その中で DNA 損傷を評

価するコメットアッセイを用いた in vivo の遺伝毒性試験法は，投与は数日と短期

間で済み，さらに臓器ごとに遺伝毒性を評価できるため，非常に有用な試験法と

して近年注目されている。その有用性から農薬・医薬品・一般化学物質の登録の

際に用いる新規の in vivo 遺伝毒性試験としての需要が国際的に高まり，OECD ガ

イドライン化が期待されていたため，標準化した方法で各種物質を評価する必要

が出てきた。そうした背景からコメットアッセイを用いた in vivo 遺伝毒性試験の

国際的なバリデーションが開始された。

第 1 章では，国際バリデーションの一環として，肝臓と胃を用いたコメットア

ッセイが未知の物質の遺伝毒性を正しく評価できるかどうか検討を行った。化学

物質名を伏せた条件下で試験を行い，試験データを作出した後に名称が明らかに

なった 3 つの化学物質，すなわち，塩化カドミウム，クロロホルム，D,L-メント

ールに対して，得られた試験データと既知の遺伝毒性の関係について考察した。

試験の結果，塩化カドミウムの遺伝毒性は「不確か」であり，クロロホルムと D,L-

メントールはともに「陰性」と判定された。これらの結果は，各剤とも既知の遺

伝毒性の報告と一致していた。一方，陽性対照物質は｢陽性｣と判断され，試験は

適切な条件下で行われていた。他機関におけるバリデーション結果を総合して，

84

標準化されたコメットアッセイは，ブラインド条件下で化学物質の肝臓と胃に対

する遺伝毒性を適切に評価できていることが示された。国際バリデーション試験

をまとめた結果は，OECD ガイドライン化の推進へ寄与し，本研究はその一部と

して採用された。

第 2 章では，第 1 章でバリデートされた肝臓と胃のコメットアッセイを多くの

化学物質の標的となり得る膀胱に応用した。まず，膀胱発がんの発生母地となる

上皮細胞を効率よく回収する必要があったため，膀胱上皮細胞を「かきとる方法

=スクレイピング法」と，膀胱全体をハサミで刻むより簡便な「ミンス法」によ

り得られたサンプルを用いてコメットアッセイを行い，得られたデータを比較し

た。その結果，両方法とも MNU および EMS の投与動物から得られた膀胱サンプ

ルにおいて DNA 損傷が検出され，OA の投与動物のサンプルでは DNA 損傷は認

められなかった。「ミンス法」により調製した細胞/核懸濁液を形態学的に観察す

ると，回収した細胞の 80%以上は上皮細胞由来であり，サイトケラチン免疫染色

で上皮細胞の存在が確認できた。よって，より簡便な「ミンス法」は，膀胱コメ

ットアッセイに適した採取方法であると結論した。本結果は OECD ガイドライン

（No. 489）の参考文献の一つとして掲載された。

第 3 章では，主要な 7 剤の膀胱発がん関連化合物を用いて，「ミンス法」を利

用した膀胱コメットアッセイにより，遺伝毒性物質と非遺伝毒性物質を区別可能

かどうか検討した。非遺伝毒性物質による細胞毒性はコメットアッセイで偽陽性

を誘発する懸念があったため，コメットアッセイと同時に，病理組織学的検査を

用いて各剤の細胞毒性を評価した。その結果，4 剤の遺伝毒性物質のうち，3 剤

（BBN，グリシドールおよび BMP）は膀胱において DNA 損傷を誘発したが，1

85

剤（2-NA）は誘発しなかった。4 剤いずれもの剤も細胞毒性を引き起こさなかっ

た。一方，3 剤の非遺伝毒性物質（BITC，ウラシルおよびメラミン）投与動物の

膀胱では，種々の病理組織学的変化で示される細胞毒性が観察されたが，膀胱に

DNA 損傷は観察されなかった。これらの結果は，これまでの遺伝毒性の報告と

も類似しており，膀胱におけるコメットアッセイにより，少なくとも偽陽性を生

じることなく遺伝毒性物質と非遺伝毒性物質を区別して検出できることが示さ

れた。本研究は，膀胱におけるコメットアッセイの結果と病理組織学的検査の関

係を初めて詳細に報告した研究となった。

第 4 章では，酸化的 DNA 損傷を検出するための改良コメットアッセイを実施

した。第 3 章でコメットアッセイ陰性であった 2-NA について，酸化的 DNA 損

傷の一つ 8-OH-dGが膀胱細胞内で誘発されている可能性を検討するため，hOGG1

の存在下，非存在下においてラットの膀胱および肝臓を調査した。その結果，ラ

ット膀胱において hOGG1 無処理コメットアッセイでは陰性の結果が得られたが，

hOOG1処理コメットアッセイにより，酸化的DNA損傷が強く検出された。また，

2-NA によって生じる酸化的 DNA 損傷は，GSH の同時投与により減少した。肝

臓では hOGG1 の処理に関わらず，コメットアッセイの結果は陰性であった。こ

れらの結果により，2-NA を投与したラットの膀胱には酸化的 DNA 損傷が誘発さ

れることが明らかとなり，膀胱発がんのメカニズムには酸化的 DNA 損傷が関与

している可能性が示唆された。

本研究により，農薬・医薬品・一般化学物質の遺伝毒性評価を行う際のコメッ

トアッセイのガイドライン化に対する一定の貢献がなされ，このアッセイを膀胱

に応用することで，膀胱における遺伝毒性と非遺伝毒性物質の評価を可能とした。

86

Abstract

Genotoxicity tests are used as in vivo or in vitro screening tests to detect genotoxicants

for the safety assessment in development of chemicals or re-evaluation of known

substances using bacteria, cultured cells, or animals to evaluate a variety of endpoints,

i.e., DNA damage, chromosomal abnormalities, or gene mutation. A variety of tests have

been developed to evaluate genotoxicity. The comet assay, which is one of the

genotoxicity tests, has especially attracted attention as an in vivo study requiring only a

short-term testing period with its wide applicability to various organs. Due to such a

utility, there has been a demand for a new OECD guideline to employ the comet assay as

a new in vivo genotoxicity test for the registration of pesticides, pharmaceuticals, or

general chemical substances. Therefore, an international validation study for the comet

assay as in vivo genotoxicity test has been conducted to evaluate substances by the

standardized method.

In Chapter I，as part of the international validation study of the comet assay, the study

was performed to confirm whether the liver and stomach comet assay can properly

evaluate the genotoxic potential of unknown chemicals using three test chemicals

(cadmium chloride, chloroform, and D,L-menthol) which were coded for blind conditions.

After the experiments, these chemicals were decoded and the relationship between the

obtained data in the studies and previously reported data on genotoxicity was discussed.

As a result, cadmium chloride showed equivocal responses. Chloroform and D,L-menthol

gave negative results. These results were in accordance with the previous genotoxic

reports. The positive result in the positive control indicated that the study was acceptable

for evaluation. The comprehensive results in the validation study including my result

indicate that the standardized liver and stomach comet assay can reflect genotoxic

87

properties under blind conditions. The results of the international validation study was

summarized and contributed to the adoption for OECD guideline, and this study was a

part of the validation study.

In Chapter II，the validated comet assay in the liver and stomach was applied to the

urinary bladder. Epithelial cells, which are important for the urinary bladder

carcinogenesis, should be collected effectively for the assay. Therefore, the comet assay

was conducted using the simple mincing method in which tissues are minced with

scissors and the scraping method, and the both data were compared. Both mincing and

scraping methods detected DNA damage in MNU-, EMS-, but not OA-treated rats. The

morphological analysis of the prepared cell suspensions revealed that more than 80% of

the cells collected by the mincing method were from the epithelium. In addition,

epithelial cells were confirmed by immunostaining for cytokeratin. This study indicates

that the mincing method is easier and more appropriate for the comet assay in urinary

bladder tissue than the scraping method. This study was cited as one of the references in

the OECD guideline (No. 489).

In Chapter III，I examined whether the in vivo comet assay using the mincing method

can distinguish between genotoxic and non-genotoxic DNA damage in urinary bladder

cells using major seven chemicals related to urinary bladder carcinogenesis in rodents.

Cytotoxicity was simultaneously evaluated by the histopathological examination as the in

vivo comet assay can give false-positive results due to non-specific DNA damage

associated with cell death. In the urinary bladders of rats treated with the three

genotoxicants (BBN, glycidol, and BMP), DNA damage was detected. In contrast, a

genotoxicant of 2-NA induced neither DNA damage nor cytotoxicity. The non-genotoxic

chemicals (BITC, uracil, and melamine) did not induce DNA damage in the urinary

88

bladders under conditions where some histopathological changes were observed. The

results were almost in accordance with previous reports and indicate that the comet assay

could distinguish between genotoxic and non-genotoxic chemicals and that no

false-positive responses were obtained. This study was the first report for the relationship

between the results of the comet assay and the histopathological examination in the

urinary bladder.

In Chapter IV，I tried to detect one of the oxidative DNA damage, 8-OH-dG, to

confirm the potential of 2-NA, which was negative in the comet assay in Chapter 3, to

induce oxidative DNA damage via the comet assay with and without hOGG1 treatment

in the urinary bladder and liver. As a result, the comet assay without hOGG1 treatment

gave negative results; however, the comet assay with hOGG1 treatment significantly

induced oxidative DNA damage in the urinary bladder in the group treated with 500

mg/kg 2-NA. Moreover, an antioxidant GSH significantly reduced oxidative DNA

damage caused by 2-NA. The liver comet assay produced negative results regardless of

the treatment of hOGG1. These results indicate that oxidative DNA damage is a possible

mode of action for carcinogenesis in the urinary bladder of rats treated with 2-NA.

This study partially contributed to establishment of the in vivo comet assay guideline

which will be used for genotoxic evaluation of pesticides, pharmaceuticals, or general

chemical substances. When this assay is applied to the bladder, a genotoxic or

non-genotoxic substance for urinary bladder carcinogenesis can be evaluated properly.

89

Figures

90

(a)

(b)

Fig.1 Image of the comet (% tail DNA, 25.16) (a) and hedgehog (% tail DNA, 94.23)

(heavily damaged cell) (b)

91

Fig. 2 Bladder cells (nuclei) from a female rat treated with corn oil, obtained by the mincing

method. Almost all of the cells in this figure are epithelial cells.

May–Grünwald stain (×400).

92

Fig. 3 (a) Epithelial cells from a male rat treated with physiological saline, obtained by the

mincing method. Cytokeratin positive cells (arrow, pale yellow) (×400).

Fig. 3 (b) A clump of mesenchymal cells from a male rat treated with physiological saline,

obtained by the mincing method. Cytokeratin negative cells (light blue) (×400).

93

Fig. 4 Microphotograph of the urinary bladders of a male SD rat treated with BITC at a dose of

800 mg/kg × 2. Hemorrhage, urothelial cell hyperplasia, neutrophil infiltration, and submucosal

edema are observed. Scale bar, 50 μm.

94

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Control 125 250 500 500+GSH

1000

EMS 200

% T

ail

DN

A

Dose (mg/kg)

(a) Urinary bladder

*

****

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Control 125 250 500 500+GSH

1000

EMS 200

% T

ail

DN

A

Dose (mg/kg)

(b) Liver ***

***

Fig. 5 2-NA-induced DNA damage measured by the comet assay with (filled bar)

and without (open bar) hOGG1 treatment in rats. (a) Urinary bladder, (b) liver.

The % tail DNA in the treatment groups was compared with that of the negative

control group. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. All values are expressed as

mean ± SD (5 animals per group). GSH, glutathione-SH; EMS, ethyl

methanesulfonate.

95

Tables

96

Table 1 Effects of the test substances on body weight gain or loss and clinical signs of toxicity in male SD rats.

PS 0 × 3 319 329 10 Normal

Cadmium chloride 20 × 3 302 303 1 * Normal

Cadmium chloride 40 × 3 319 316 -3 ** Normal

Cadmium chloride 80 × 3 309 308 -1 ** Decrease in spontaneous

motor activity (3/5)

Corn oil 0 × 3 323 334 11 Normal

Chloroform 125 × 3 325 318 -7 * Normal

Chloroform 250 × 3 326 310 -16 ** Normal

Chloroform 500 × 3 339 304 -35 ** Coarse fur (5/5),

Decrease in spontaneous

motor activity (5/5),

Emaciation (1/5), Loose stool (1/5)

Corn oil 0 × 3 270 280 10 Normal

D,L-Menthol 500 × 3 270 277 7 Normal

D,L-Menthol 1000 × 3 275 276 1 Wetted fur (1/5)

D,L-Menthol 2000 × 3 274 275 1 Ananastasia (1/5), Ataxic gait (2/5),

Decrease of spontaneous

motor activity (5/5),

Loss of spontaneous

motor activity (1/5)

PS, physiological saline.

Five animals per group.

Day 1, the day of the first administration.

Significantly different from the vehicle control group (*, p < 0.05; **, p < 0.01; Dunnett's multiple comparison test).

TreatmentDose

(mg/kg)

Avg. weight

Day 1 (g)

Avg. weight

Day 3 (g)

Avg. weight

change (g)

Clinical signs

(observed animal/treated animal)

97

Table 2 DNA damage in liver and glandular stomach following three oral administrations of the test substances in male SD rats.

PS 0 × 3 1.16 ± 0.19 0.4 ± 0.4 4.58 ± 1.43 3.9 ± 2.1

Cadmium chloride 20 × 3 1.43 ± 0.14 b 0.4 ± 0.2 21.57 ± 10.00 8.6 ± 5.9

Cadmium chloride 40 × 3 1.63 ± 0.18 b 0.8 ± 0.3 25.30 ± 17.77 d 21.8 ± 15.4

Cadmium chloride 80 × 3 1.58 ± 0.53 b 1.1 ± 0.7 22.30 ± 6.99 d 17.5 ± 9.2

EMS 200 × 2 24.20 ± 6.30 c 2.7 ± 0.6 53.34 ± 6.21 c 38.4 ± 20.0

Corn oil 0 × 3 1.57 ± 0.31 1.2 ± 0.8 14.45 ± 4.39 21.7 ± 22.4

Chloroform 125 × 3 1.42 ± 0.07 1.4 ± 1.4 13.60 ± 7.27 b 17.0 ± 16.3

Chloroform 250 × 3 1.74 ± 0.26 5.5 ± 3.8 13.48 ± 6.39 b 11.9 ± 5.6

Chloroform 500 × 3 1.76 ± 0.17 5.3 ± 4.6 7.74 ± 2.46 b 6.7 ± 5.9

EMS 200 × 2 16.61 ± 5.72 c 1.2 ± 1.3 40.22 ± 7.14 c 11.9 ± 4.3

Corn oil 0 × 3 1.54 ± 0.56 0.9 ± 0.7 11.57 ± 3.80 5.9 ± 7.4

D,L-Menthol 500 × 3 1.48 ± 0.19 1.3 ± 1.0 16.09 ± 13.45 9.3 ± 8.0

D,L-Menthol 1000 × 3 1.58 ± 0.49 1.3 ± 1.4 12.32 ± 1.08 7.7 ± 2.0

D,L-Menthol 2000 × 3 1.61 ± 0.46 0.8 ± 0.4 23.49 ± 12.79 19.8 ± 18.1

EMS 200 × 2 23.88 ± 8.07 c 1.6 ± 0.7 43.16 ± 6.13 c 8.3 ± 4.0

PS, physiological saline; EMS, ethyl methanesulfonate

Mean of five animals per group ± S.D.

The mean of medians of each slide was used for the calculation.a Frequency of cells with 90% or more of DNA in the tail.

b Significantly different from the vehicle control group (p < 0.05, Liner trend test).

c Significantly different from the vehicle control group (p < 0.025, Student's t -test).

d Significantly different from the vehicle control group (p < 0.05, Dunnett's multiple comparison test).

TreatmentDose

(mg/kg)

Liver Glandular Stomach

% Tail DNAHeadgehogs

% Tail DNAHeadgehogs

(%) a

(%) a

98

Table 3 Histopathology findings in the liver and stomach of rats treated with the test substances.

Control Low

dose

Liver : [N=] 5 0

Microgranuloma 0 - 1 (+)

Periportal hepatocellular vacuolation 0 - 4 (+)

Glandular stomach : [N=] 5 0

Thinning of surface mucous cells 0 - 5 (+)

Liver : [N=] 5 0

Centrilobular hepatocellular single cell necrosis 0 - 3 (+) 4 (+)

Centrilobular hepatocellular necrosis 0 - 1 (+) 1 (++)

Centrilobular hepatocellular vacuolation 0 - 3 (+) 2 (+)

2 (++) 3 (++)

Centrilobular hepatocellular enlargement/granular change 0 - 1 (+) 1 (+)

2 (++) 4 (++)

Centrilobular inflammatory cell infiltration 0 - 1 (+) 5 (+)

2 (++)

Centrilobular hemorrhage 0 - 1 (++) 1 (++)

Granuloma 0 - 1 (++)


No abnormalities detected 5 -

Liver : [N=] 5 0

Diffuse hepatocellular hypertrophy 0 - 1 (+)

4 (++)

Diffuse hepatocellular vacuolation 0 - 5 (+)

Increased hepatocyte mitotic figures 0 - 5 (++)


Ulcer/erosion in area of pyloric mucosa 0 - 2 (+)

[N=]: Number of animals examined at the site.


The grade of severity as + (slight) and ++ (moderate) is shown in parentheses.

D,L-Menthol

0 5

-

-

-

0 5

-

Chloroform

5 5

0

0 5

- 5

Cadmium

chloride

0 5

-

-

5 0

-

Test

chemicalSite & Lesion

Incidence of microscopic lesions

Medium High

dose dose

99

Table

4

DN

A d

am

age in t

he u

rinary

bla

dders

of

fem

ale

rats

by t

he c

om

et

ass

ay w

ith t

he m

incin

g a

nd s

cra

pin

g m

eth

ods.

PS

0×

24

6.8

8±

1.6

71.0

±0.9

5.7

0±

2.3

92.5

±1.1

Corn

oil

0×

24

8.2

9±

2.8

32.6

±1.6

9.0

9±

2.7

06.3

±4.6

MN

U (

in P

S)

41

× 2

448.0

8±

3.3

1*

**

3.9

±1.4

*48.3

8±

2.1

0*

**

13.0

±5.8

*

EM

S (

in P

S)

200

× 2

433.9

4±

4.0

6*

**

4.1

±1.7

*28.4

7±

4.0

4*

**

10.4

±6.0

OA

(in

corn

oil)

700

× 2

49.8

8±

2.5

92.6

±2.8

8.9

1±

2.1

85.5

±3.7

PS

, physi

olo

gic

al sa

line;

MN

U, N

-meth

yl-

N-n

itro

soure

a;

EM

S, eth

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S.D

.

*, *** S

ignif

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from

the c

oncurr

ent

contr

ol gro

up (

p <

0.0

5, p

< 0

.001).

a Fre

quency o

f cells

with 9

0%

or

more

of

DN

A in t

he t

ail.

cells

(%

) a

Tre

atm

ent

Dose

(mg/k

g)

No.o

f

anim

als

Min

cing

Scr

apin

g

% T

ail D

NA

Hea

vily

dam

aged

% T

ail D

NA

Hea

vily

dam

aged

cells

(%

) a

100

Table

5

D

NA

dam

age in t

he u

rinary

bla

dders

of

male

rats

by t

he c

om

et

ass

ay w

ith t

he m

incin

g a

nd s

cra

pin

g m

eth

ods.

PS

0×

24

24.6

8±

6.2

45.8

±2.7

31.6

8±

7.3

218.1

±11.9

Corn

oil

0×

24

17.4

9±

4.8

93.1

±2.0

20.9

4±

9.6

85.9

±3.0

MN

U (

in P

S)

41

× 2

444.4

8±

3.0

0*

*4.3

±2.2

47.1

8±

2.2

0*

12.5

±8.0

EM

S (

in P

S)

200

× 2

438.6

7±

7.4

0*

4.5

±3.0

37.7

5±

12.2

29.0

±6.1

OA

(in

corn

oil)

700

× 2

437.6

1±

17.5

111.0

±8.0

42.6

0±

26.7

133.9

±25.4

PS

, physi

olo

gic

al sa

line;

MN

U, N

-meth

yl-

N-n

itro

soure

a;

EM

S, eth

yl m

eth

anesu

lfonate

; O

A,

o-a

nis

idin

e.

Mean o

f fo

ur

anim

als

per

gro

up ±

S.D

.

*, ** S

ignif

icantly d

iffe

rent

from

the c

oncurr

ent

contr

ol gro

up (

p <

0.0

5, p

< 0

.01).

a Fre

quency o

f cells

with 9

0%

or

more

of

DN

A in t

he t

ail.

cells

(%

) a

Tre

atm

ent

Dose

(mg/k

g)

No.o

f

anim

als

Min

cing

Scr

apin

g

% T

ail D

NA

Hea

vily

dam

aged

% T

ail D

NA

Hea

vily

dam

aged

cells

(%

) a

101

Table

6

P

rofi

les

of

the u

rinary

bla

dder

cells

obta

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y t

he m

incin

g m

eth

od in f

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ale

and m

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rats

.

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cell

Larg

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elli

pso

id

Sm

all

round

Tota

l S

pin

dle

Oth

ers

Tota

l

Fem

ale

3.5

43.1

36.0

82.6

12.9

4.5

17.4

Male

4.4

47.2

35.8

87.4

10.1

2.5

12.6

Four

hundre

d c

ells

were

score

d in e

ach s

ex.

Tra

nsi

tional epithelia

l cell

(%)

Mese

nchym

al cell

(%)

102

Table 7 The list of test chemicals and the sources used in the study.

Chemical Abbreviation CAS No. Supplier Vehicle

Genotoxic carcinogens (Ames positive with S9 mix) in the urinary bladder

N -butyl-N -(4-hydroxybutyl)nitrosamine BBN 3817-11-6 TCI Corn oil

Glycidol - 556-52-5 Sigma PS

2,2-Bis (bromomethyl)-1,3-propanediol BMP 3296-90-0 TCI 0.5% MC

2-Nitroanisole 2-NA 91-23-6 TCI Corn oil

Non-genotoxic carcinogens (Ames negative with S9 mix) in the urinary bladder

Benzyl isothiocyanate BITC 622-78-6 TCI Corn oil

Uracil - 66-22-8 Wako 0.5% MC

Melamine - 108-78-1 Wako 0.5% MC

PS: Physiological saline, MC: Methylcellulose.

TCI: Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japan).

Sigma: Sigma-Aldrich Inc. (MO, USA).

Wako: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan).

103

Table 8 Effects of test articles on body weight gain or loss and the clinical signs of toxicity in male SD rats.

0.5% MC 0 × 2 282 290 8.0 Normal

Corn oil 0 × 2 259 264 5.0 Normal

BBN (in corn oil) 250 × 2 267 272 5.0 Normal

Glycidol a (in PS) 200 × 2 271 270 -1.0 * Normal

400 × 2 274 267 -7.0 ** Normal

BMP (in 0.5% MC) 300 × 2 270 274 4.0 * Normal

600 × 2 273 277 4.0 * Normal

2-NA (in corn oil) 350 × 2 273 272 -1.0 * D

700 × 2 265 260 -5.0 ** D, E, L, Coma, Prone position,

BITC (in corn oil) 400 × 2 270 257 -13.0 ** D, E, L, Loose stool, Soiled fur

800 × 2 277 258 -19.0 ** D, E, L, Eye discharge, Soiled fur

Uracil (in 0.5% MC) 1000 × 2 266 262 -4.0 ** Normal

2000 × 2 274 262 -12.0 ** Normal

Melamine (in 0.5% MC) 1000 × 2 259 257 -2.0 Normal

2000 × 2 265 251 -14.0 * Normal

MC: Methylcellulose, PS: Physiological saline. Abbreviations for each chemical are shown in Table 7.


D: Decrease in spontaneous motor activity, E: Emaciation, L: Loss of spontaneous motor activity.

Significantly different from the vehicle control group (*, p < 0.05; **, p < 0.01; Dunnett's multiple comparison test).

a: Body weight change in glycidol-treated group was compared with that of the 0.5% MC group.

TreatmentDose

(mg/kg)

Avg. initial

weight (g)

Avg. terminal

weight (g)

Weight

change (g)Clinical signs

104

Table 9 Average % tail DNA measured by the comet assay and the frequency of hedgehog in urinary bladder and liver of

male SD rats treated with vehicle controls and different doses of test chemicals.

0.5% MC - 9.38 ± 4.73 3.66 ± 1.37 3.2 ± 4.0 1.8 ± 2.2

Corn oil - 6.49 ± 4.62 3.70 ± 1.02 2.6 ± 1.1 1.4 ± 1.1

BBN (in corn oil) 250 × 2 24.74 ± 7.63 ** 5.80 ± 1.02 * 2.9 ± 1.9 0.3 ± 0.4

Glycidol a (in PS) 200 × 2 6.50 ± 1.15 9.51 ± 1.59 ** 1.8 ± 0.8 1.7 ± 1.4

400 × 2 19.79 ± 10.26 * 14.15 ± 2.31 ** 2.0 ± 1.0 0.5 ± 0.5

BMP (in 0.5% MC) 300 × 2 16.32 ± 3.80 4.90 ± 0.67 1.7 ± 0.8 0.8 ± 0.8

600 × 2 20.69 ± 8.41 * 5.27 ± 1.49 1.5 ± 0.9 1.3 ± 1.2

2-NA (in corn oil) 350 × 2 6.12 ± 4.80 4.13 ± 1.21 1.4 ± 1.5 0.3 ± 0.4

700 × 2 5.85 ± 1.45 5.20 ± 4.53 3.0 ± 2.3 0.4 ± 0.5

BITC (in corn oil) 400 × 2 4.41 ± 0.44 3.59 ± 1.09 3.5 ± 1.1 0.7 ± 0.4

800 × 2 4.63 ± 2.26 5.12 ± 0.62 2.6 ± 2.6 0.6 ± 1.3

Uracil (in 0.5% MC) 1000 × 2 12.77 ± 11.54 3.66 ± 1.31 2.5 ± 3.1 b 1.4 ± 2.6

2000 × 2 10.30 ± 8.64 3.88 ± 1.69 3.1 ± 3.1 0.8 ± 0.8

Melamine (in 0.5% MC) 1000 × 2 12.92 ± 11.99 3.74 ± 1.12 4.3 ± 4.8 0.2 ± 0.4

2000 × 2 4.49 ± 1.03 4.31 ± 1.77 0.8 ± 0.4 1.0 ± 1.0

MC: Methylcellulose, PS: Physiological saline. Abbreviations for each chemical are shown in Table 7.


*, **: The mean % tail DNA was significantly higher than that of the corresponding vehicle control at p < 0.05 and p < 0.01, respectively

(Dunnett's multiple comparison test).

a: % Tail DNA in glycidol-treated group was compared with that of the 0.5% MC group.

b: One outlier (58.6%) was observed and was excluded from the calculation.

No statistical analysis was conducted for the frequency of hedgehog.

TreatmentDose

(mg/kg)

% Tail DNA (mean ± S.D.)

Urinary bladder Liver

Hedgehog (%) (mean ± S.D.)

Urinary bladder Liver

105

Table

10

H

isto

path

olo

gy f

indin

gs

in t

he u

rinary

bla

dder

of

treate

d r

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- c

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.

Do

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(mg

/kg

)

0.5

% M

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00

00

00

(0.2

± 0

.4)

00

Co

rn o

il-

00

00

00

00

0

BB

N250 ×

20

(0.2

± 0

.4)

0(0

.4 ±

0.9

)(1

.4 ±

1.3

)(0

.2 ±

0.4

)0

00

Gly

cid

ol

400 ×

20

00

00

0(0

.2 ±

0.4

)0

0

BM

P600 ×

20

00

00

(0.4

± 0

.9)

00

0

2-N

A700 ×

20

00

00

0(0

.4 ±

0.9

)0

(0.2

± 0

.4)

BIT

C800 ×

2(0

.6 ±

1.3

)(1

.4 ±

0.9

)(0

.4 ±

0.9

)(1

.0 ±

1.4

)(1

.2 ±

1.3

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(0.6

± 0

.9)

0(1

.2 ±

0.8

)

Ura

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2000 ×

2(0

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0.9

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.2 ±

0.4

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0)

(0.8

± 1

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(0.6

± 0

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00

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0.9

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0.8

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1.1

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1.1

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1.4

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0.9

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ltra

tio

n

Su

bm

uco

sal

ed

em

a

106

Table 11 Micronucleus frequency and ratio of polychromatic (immature) erythrocytes

in bone marrow cells of rats treated with 2-NA.

Corn oil 0 × 3 0.200 ± 0.085 57.32 ± 10.61

2-NA 125 × 3 0.255 ± 0.054 58.16 ± 11.31

250 × 3 0.280 ± 0.119 58.00 ± 8.01

500 × 3 0.230 ± 0.105 54.74 ± 6.25

2-NA 500 × 3

+ GSH 1000 × 3

EMS 200 × 2 2.605 ± 0.810 *** 55.94 ± 16.91

Mean ± standard deviation

MNPCE: micronucleated polychromatic (immature) erythrocytes

PCE: polychromatic (mature) erythrocytes

2-NA: 2-nitroanisole

GSH: glutathione-SH

EMS: ethyl methanesulfonate

*** : significantly different from the concurrent vehicle control at p < 0.001 (chi-square test).

Five animals per group

TreatmentDose

(mg/kg)MNPCE (%) PCE (%)

0.180 ± 0.096 58.40 ± 5.39

107

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