T I T U L O D E L P R O Y E C T O

I

I

I NTRODUCC I ON

El tetracloruro de carbcrno (CC14) es un agente tdxico que #

afecta principalmente al higado. Dependiendo de la d o s i s y

frecuencia de administracidn puede producir hepat it is tztxica o

bien cirrosis hepzft ica.

La atenci6n se centrari en este trabaJo, en la .hepatitis

tbxica producida por una dosis unica y alta del CC14. Despu& de i I

1 la intoxicacidn aguda con CC14 se observa en el hfgadcr acurnctlacidn i

I de grasa y necrosis celular. 'I

- ~" i I

Mecanismo de acclin del CC14

La hepatotoxicidad del CC14 se conoce'desde hace 58 a n o s y

desde entonces se ha tratado de establecer el rnecanismcg causal de

la muerte celular hepática. i

i En los primeros trabaJos sobre hepatoxicidad del CC14 se

creyd que la necrosis hepática era fundamentalmente una

degeneracidn mitocondrial, ya que en &Sta se ertcuentr-an severas I I

danos. Sin embargo, después de los estudios de Oberling y

Rouiller en 1956, quienes siguierorr el curso ternporal de las

alteraciones producidas por el t6xico; encontraron que en las

primeras etapas despues de la intoxiracich aparecian alteraciones

estructurales y funcionales en el reticulo endopl&mico. La

actividad de muchas enzirnas hicrosomales est; disminuida, asi como

-

\

i

El CC14 es metabolizado por el sistema metabolirante de

drogas (sistema de oxidasas de funciin rnixta utilizando

Nf4DPH-citocrumo P45rZ1) en el retrculo endoplásmico liscl. En este

proeesc, ocurre una ruptura homolit i c a produciendo radicales libres

holoalcanos, los m45 importantes son el

radical triclorometil (CC13.1 y el triclorometil per-&xido (CC1300)

(1,2,3).

Los radicales libres pueden actuar en dos formas: por ataqlte

d irecto, est o es uni& covalente a pr-otelnas de rnernbrana o

lipidcss, en particular a los del reticulo endopldsmico (RE), cs de

*

insaturados y prumocion de la lipaperoxidacidn. Urnbas hipdtesis

de .action del CC14 han sido probados en distintos laborator-ios

HipStesis de lipoperoxidacich. El r-adical triclorometil

puede sustraer hidr¿tgenos de los dcidos insaturadcvs, k t o s se

rearreglan para formar dienos conJugados con un' caracterlst ico

espectro de absorcidn. Los radicales libres de los &idos grasos

resultantes del ataque del CC13 puede sufrir polirflerizaciones can

un segundo radical CC13.o con dcidos grasos no saturados. Los

&idos grasos pueden tambien reaccionar con el ox$germ molecular ' .

formandose rapidamente el radical per-dxido (ROO. 1 y eventualemte

el perkxido orgánico. El ROO. puede tambien sustraer hidr&genos

de l a cadena paliinsaturada y formar hidroperóxidus o

endopergxidos. Los pergxidos organicos sbrl compuestos muy

-

. , - ".

. ~. _111 . _"

F'ag 3

inestables que conducen a rupt urds de cadenas hidrocarbcanadas curl

la formaci6n de aldehidos y cetonas altamente or-garlsldpt icas,

compuestos carbonilicos hidroxiinsaturados, malondialdehido,

hidrocarburos de cadena corta como etano y pentano ( 4 ) .

Posiblemente debido a la corta vida y reactividad de los

radicales libres, estus rm logran difundirse leJos de su

microambiente generador. Se han identificado productos de

lipoperoxidacidn estables y capaces de difundirse grandes

distancias. Benedetti y Comporti fueron capaces de aislar

productos consistentes de 4-hidroxialquenales que parecen producir

todos los efectos citopatnldgicos que provoca el CC14, inhibicidn

de la glucosa 6-fosfatasa rnitocondrial, inhibicidn de la s l n f e s i s

de proteínas, efectos citotdxicos en hepatocitos aislados, " L_".

perrneabi 1 izacron de rnenlbranas y otros ( 4 ) .

El CC14 tambien se une covalentemente a proteínas y lipidos

en la membrana microsomal. Frank y col. ( 5 ) encontraron

fosfolipidos de la membrana microsomal resistentes al catabulismo.

ost tu la ron que existe un entrecruzamiento entre los

fosfolipidos y una distribuci6n erronea de estos ~ ~ n t o con los .

fosfolfpidos nurrnales a otras membranas.

Otrcas autores (6) postulan que el CC14 actua solvatando las -

membranas celulares. Eerner y eol. ( 7 ) expusieron hepatocito5

aislados a dosis de CC14 que han dado evidencia bioquimica de d a h

por sulvolisis. Se observ6 hinchamiento y fusihn de

microvelloeidades de la superficie del hepatocito con formacidn de I

"vesiculas" a los 2 minutos de la exposici6n. Posteriormente I

1 " 2 , .. t . " II.._-_ j____.- .. .

""

erlc~~,-1trarcerl alteraciones morfoldgicas en e l r e t l c u l o enc~upldsmicu

y un poco despues en las; mi tocctndr i as. 2 irnerman y Maca ( 7 ) y

Pencil y c o l . (€3) fueron capaces de determinar una disntinucibn d e

enzimas e n c é l u l a s de carcinoma de laringe y c & l u l a s de corandn

despuds de exponerlas a CC14, e s t a s c é l u l a s d i f i c i l m e n t e

metabolizan e l t b x i c o .

Es probable que' l a cloromet ilacidn, saturacich, accwtamiento

de cadenas hidrocarbonadas y peroxidacibn de l o s f o s f o l i p i d o s

a l t e r a n l a f l u i d e z y e l empaquetamiento d e las cadenas

hidrocarbo.nadas en e1 irtterit>r de las membranas.

. ." - - .

FI 1 t erac iones ce 1 u 1 a r e s que produce

aguda

NECROSIS CELULRR

, E n e l dano hep&tico producido p

t d x i c o s , e x i s t e n c i e r t a s c a r a c t e r í s t i c a s c o ~ u r ~ e s . La bhsqueda d e

un mecanismo general de d a h c e l u l a

de varios investigador-es; sin embargo, e s t a t a r e a ha resultado

d i f i c i l . -

L a necrosis conJurttamente con la e s t e a t o s i s (acumulacidn de

grasa), son dos d e l o s p r i n c i p a l e s e f e c t o s que c a r a q t e r i z a n e l

dano celular hepático producido por la administra,ci¿n del ~ ~ 1 4 . I

c

t -%-*,

P a g 3

Var-ios invest igadcwes (9, 18, 1 1 ) apoyan la idea d e que l a

rlecrosis en e l higadu es producida por la accivn del ttlxico

i n t e r f i r i e n d o con la integridad estructural d e l a rnernbrana

plasmát i c a d e t a l forma q u e se p i e r d e l a barr-era de per-meabil idad

a l c a l c i o , l o q u e t r a e u n estado d e desequil ibrio en e l c u a l l a

entrada de c a l c i o .es rnayor que l a s a l i d a y l a concent:r-acibn de

c a l c i o en l a c e l u l a 5e ve dramaticamente alterada.

El ion c a l c i o es .biolbgicamente muy a c t i v o . Funciona c w m

mensa~ero intra'celular en e l acoplamiento est irnuls-respuesta; pero

cuando e5td en exeeso, dentro d e l a k é l u l a , es un pcoterlte ayerlte

tbxico. 'Basado en l o a n t e r i o r , la muerte t b x i c a d e l.as c é l u l a s

del higado pareceria depender- d e algc-trru de los s iguientes eventos:

~ . ~ ~- .

1 . Una i n t e r a c c i d n i n i c i a l con e l h e p a t o c i t o para producir-

una alteracicm bioquimica q u e produce: . .

2. Un daAo en l a membrana plasmática q u e provoca l a entr.ada

y acumulacidn de iones Ca y l iberaciijn dk ertzirnas intracelulares;

finalmente:

3. La aparicidn d e las manifestaciones rnorfolsgicas d e

necrosis.

Se ha observado que e l CC14 produce cambios marcados en l a

horneostais d e l c a l c i o e n l a s c e l u l a s h e p i t i c a s . E n t r e 6 y 12

h r s . d e s p u é s d e l a i n t o x i c a c i d n aguda con CC14, e l contenido

i n t r a c e l u l a r de c a l c i o se e l e v a dramaticamente alcanzando niveles

28 veces mayores que l o s normales (la, 1 1 ) . I

Tsokos-Khun y c o l . (12) encontraron una acumulacicfn I

decrernentada d e c a l c i o e n vesl 'culas del plasmarema en r a t a s 1 -. ' P.

, . . ylll "" - ~ .

.. -~ , t

i n t o x i c a d a s con C C 1 4 . S u a r e s u l t a d o s i n d i c a n q u e l a

p e r m e a b i l i d a d d e l p l a s m a l e m a esta i n c r e m e n t a d a a l c a l c i o y q u e

i s t e une men05 c a l c i o .

Varios i n v e s t i g a d o r e s ( 1 3 , 1 4 ) h a n e n c o n t r a d o q u e e l C C 1 4

i n h i b e l a bomba d e c a l c i o d e l r e t í c u l o e n d o p l $ s m i c o . E 5 t o p r o v o c a

l a s a l i d a d e calcio d e l ret iculo e n d o p l d s m i c c e q u e r e s u l t a e n l a

d e s t r u c c i d n d e l a h o m e o s t a s i s i n t r a c e l u l a r d e l c a l c i o .

ESTEf4TOSIS HEFFITICfi

E l C C 1 4 p r o v o c a a c u m u l a c i d n a n u r r n a l d e grasa e n l a s células

p a r e n q u i m a t u s a s . L e x ¡ 1 i p i d o s q u e se acunlulan sort

predomi nant ement e’ t r i g 1 i cer i d.os (TG

h a c i a el p l a s m a c o m o - c u m p l e ~ o s d e 1

l i p o p r o t e i n a s d e muy baJa d e n s i d a d (‘LMED) es e l p r i n c i p a l v e h i c u l p ’

d e t r a n s p o r - t e d e l o s T G ’ s .

E x i s t e n e v i d e n c i a s q u e i n d i c a n que e l CC1’4: y l a . e t i o n i n a

p r o d u c e n d i s m i n u c i 6 n e n el , n i v e l c i r c u l a n t e d e l i p o p r o t e i n a s ,

p r i n c i p a l m e n t e LMED, d e s e n c a d e n a n d o

h i g a d o . D e s d e el p u n t o d e v i s t a t e d r i c c t p u e d e r a z o n a r s e que una

d i s m i n u c i d n e n 1.a s e c r e c i d n d e 1 i p o p r o t e . í n a s p u e d e ser

c o n s e c u e n c i a d e :

- -

a. Un b l o q u e o e n la s i n t e s i s d e p r o t e i n a s .

b. Un defecto e n l a a g r e g a c i d n d e s u s c o n s t i t u y e n t e s debido a

un cambio e n s u e s s h r u c t u r a q u í m i c a y f ’ u n c i d n o u n a a l t e r a c i u n err

l a e s t r u c t u r a d e l RE. <

c. Un defecto en e l mecarrisrno d e l i b e r a c i j n de l a s micelas

". I

, i

P a y 7 '

1 i p o p r o t e l c a s en l a s c é l u l a t i h e p á t i c a s . ?

D i a n z i a n i (15) h a s u g e r i d o q u e este a g r e g a d o d e f e c t u o . ; o

p a d r f a d e b e r s e a c a m b i o s e s t r u c t u r a l e s p r o d u c i d o s p a r e l CC14, e l

cual p r o d u c e 1 i p o p e r o x i d a c i & n d e l a s m c + l & c u l a s a p o p r o t e í c a s

p r e x i s t e n t e s , o d e los l l p i d o n q u e c c m s t i t u y e r r l a s m o l & u l a s d e

las l i p o p r o t e í n a s ( p o r eJernplo d e s n a t u r a l i z a c i ~ r l d e l a s mol&ulas

p r q t e l c a s ) , con lo c u a l p i e r d e n s u f u n c i o n a l i d a d .

Q l t e r n a t i v a m e n t e , e l d a n o p e r o x i d a t i v o d e l a membrana d e l ,RE trae

cornu c o n s e c u e n c i a q u e el C C 1 4 i n d u z c a d e f e c t o s e n e l sistema d e

s e c r e c i b n d e l a s 1 i p o p r o t e i n a s (15).

t

ciclo d e e n s a m b l e - d e 5 e n s a m b l e d e l a t u b u l i n a , y l a i n t e r r u p c i d n d e

este c i c l o p u r l a a d m i n i s t r a c i & d e c o l c h i c i n a r e s u l t a en un

b l o q u e o d e l a s e c r e c i b n d e LMBD. E s t e - sistema m i ' c r o t u b u l a r p o d r i a

ser el b l a n c o d e l o s a g e n t e s h e p a t o t d x i c o s q u e p r o d u c e n

esteatosis, por u n a i n h i b . i c i 6 n d e la s e c r e c i d n d e l a s LMBD. L.

Q este r e s p e c t o , G a b r i e l (16) ha d e m o s t r a d o q u e los a l d e h i d o s

p r o d u c i d o s d u r a n t e e l p r o c e s o de 1 i p o p e r o x i d a c i Ó n i n d u c i d o por

CCL4, p u e d e p r n d u c i r a 1 t erac i ones f unc i ona 1 es en e 1 s i sterna

m i c r o t u b u l a r h e p a ' t ico. -

R l t e r a c i o n e s e n l a m e h b r a n a p l a s m á t i c a q u e p r o d u c e e l C C 1 4 .

la relacicm c~~lest .erul/fc~sful ipido. disminuye a expensas de una

reduccihn err l a r e l a c i 6 m c ~ ~ l e s t e r o l / p r o t e ~ r ~ a y e l e v a c i h d e la

relacidn fusfol $pido/pr-oteina. Se determind urr aurnento del 48% en

l a s e s f i n g o m i e l i n a s ; l a s f c r s f a t i d i l c o l i n a s y

fosfatidiletanulaminas disminuyeron en un 13 y 19% r*espectivamente

(26).

La a c t i v i d a d en las GTF1asas de Na-K, y Ca dismirruyerc~n

s i g n i f i c a t ivanlente e n membranas de ratas intoxicadas agudarnente

I

I

f .

Colchicirra

La colchic ina, es un alcaloide n a t u r a l que 5e o b t i e n e de l a

p l a n t a d e Colchicum autumnale . Una d e l a s p r i n c i p a l e s

caracteristicas d e l a ' c o l c h i c i n a e5 que i n h i b e la p o l i m e r i z a c i ~ ~ n I

d e m i c v o t u b u l o s "in v i t r o " e " i n v i v a " .

a t r i b u i d o s a c o l c h i c i n a :

a ) E s t a b i l i z a m e m b r a n a s lisosomales.

b) I n h i b e l a m c w i l i z a c i o n y l i b e r a c i d n e x t r a c e l u l a r d e

e n z i m a s de leucoeitos h u m a n o s d u r a n t e l a f a g o c i tosis.

c) I n h i b e l a l i b e r a c i d n d e h i s t a m i n a d e 1 ~ 1 s l e u c o c i t o s ,

d ) I n h i b e la l i b e r a c i h de k i n i n a d e l plasma " i n v i t r o "

e) I n h i t i e l a m o v i l i z a c i & n , a d h e r e r c i a y q u i m i o t a x i s de los

n e u t r b f i l o s

f) I n h i b e la c i t o t o x i c i d a d mediada pur n e u t r d f i l o s y

d e p e n d i e n t e d e a n t i c u e r p o s -

g) I n h i b e el recambio d e i n o s i t o l en lirtfclcitos

11 I FInt imicrotubular:

I ) I n t e r f i e r e con l a p o l i m e r i z a c i h de tubulina.

.:I) Inhibe e l movimiento transcelular de proteinas de

os sobre la mernbr ana plasmática d e l a c h l u l a :

k.1 Modifica el sistema de a d e n i l a t o c i c l a s a en e l higado

I ! Rumenta los niveles plasmáticus d e f o s f a t a s a a l c a l i n a

111.' Corrige la concentracidn elevada d e c o l e s t e r u l , que s e

ob5erva en l a s mernbranas plasrndt i c a s - . d e h d g a d ~ s dcwlde se i n d u Jo

c i r - t - c ~ ~ ~ s por medio del CC14. Corrige la's alteraeiones' err ia

actividad de l a aderrilatco c i c l a s a y HTPasas q u e s e observan deshe

l o s pr imerus d r'as de t r a t amientu con C C 1 4 para inducir cirrosls

i23!.

"

u.11 El pretratamaiento con colchicina antes d e la i n t o x i c a c i h

agucia con C C 1 4 protege d e l o s e f e c t o s tklxicus del CCl4. La

necrosis celular disminuye como se puede observar tanto

h i st u 1 cfg i cament e y b i oq u ím i earnent e p u r det ern1 i nac i 6n de enz imas

mavcadoras de dano hepático e n plasma (26).. Rdicionalemente l a

colch~cina reduce la acumulaci&n de grasa inducida por el C C 1 4 en

e l hígado, aumentando' l a l i b e r a c i d n de t r i g l i c e r i d o s por e l orgarto

y disminuyendo la incorporaci&n d e a'cido palmitico a los l ipidoe

hepdt iCOS ( 3 2 ) .

, # :

Paq 3

o) Ruwenta 115s n i v e l e s de g l u c ~ g e n o hepa't icu.

p ) Disminuye l a pro1 ina plasrndt i c a y e l lactatcr sarlguineo en

p a c i e n t e s c i r r d t i c o s alcohol i c o s

q) Disminuye la proteinuria en e l sindrorne n e f r d t i c o

VI E f e c t o s ant i f i b r o g é n i c o s

Se ha demostrado que l a c o l c h i c i n a tarnbién t iene efe.ctos

sobre e l metabolismo d e la colágena, que i n t e r f i e r e con e l

movimiento t r a n c e l u l a r de l a misrna y aumenta la produccidn d e

colagenasa in vitro (33 ,341 .

Mebendazcal

' El mebendazol: C r n e t i l - N - ( S - b e n z o i l - ~ - b e r ~ z i r ~ l i d a ~ c ~ i l ) 3

carbamatct 5e desarro114 para tratar infeccicmes por vermes

redondos, corno resultado d e ' la investigacian efectuada en Bélgica

por Erugmans y c o l . en 1971. Fue aprobado cctrncr antihelmint ico de

arnplicr espectro por l a Food and D r u g Rdministration en 1974, para

e l traatamiento de infecciones Únicas o mixtas pr-ovccadas por -

Rscaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichura

y uncinariasis.

Los experimentos realizados por V a n Den Eosche y c o l .

( 3 5 , 3 6 , 3 7 ) demostdaron que e l mebendazol induce l a d e s a p a r i c i i h

de los' microtúbulos citoplásmicos causando cambios deQen@rdtiVoS

erg l a s c k l u l a s d e a b s o ~ c i ! ? p d e l o s nemátodos. Fldemas, inhibe 'la t

Pag 4

captacidn d e glucosa. Esto se r e f l e J a en una disminucidn del

yluc6geno almacenado en el par&ito, resultandcl en una

disminucidn en l a formaci6n d e t r i f o s f a t o d e adenosina (OTFS),

También se observa un bloqueo del transporte de qra'nulos d e

secrecidn. Como consecuencia d e lo anterior ucurre u n a l i s i s d e l

citoplasma provocando la degerleracidn d e l a s c é l u l a s d e absorcidrl

y e n consecuencia la muerte del helminto.

Se ha reportado q u e en humanos, e l mebendazol es absosrbidu

en cantidades mfnimas q u e o s e i l a n e n t r e 5 y 18%. Se excreta

predominantemente par cvina y e l r e s t o se elimina en l a s heces; sin

modificarse. Lo5 n i v e l e s rdximos err plasma representan el @.S% de

la-&x&s-administyada v se alcanzan durante las pt-imet-as 2 a 4

h r s .

. .

En est ud i o s r e a l i zados en a s c a r i s 5e encorltr& a l cc~rnp~iest o en

e l estjfago y c d l u l a s i n t e s t i n a l e s d e l - p a r a s i t o unido a tubulina

(37). E l nlebendazol compite con c o l c h i c i n a en l a unidn a

microtúbulos. Este comportamiento fue confirmado tarnbien pcw H.

V a n d e r Bossche en 19138 ccm tubulina purificada d e Flscaris suun1 y

tubulina d e cerebra d e cerdo, indicando que e l rnebendasol y

colchicina compiten por u n mismo s i t i o d e u n i j r t o que son dos

sit ios estructuralmente cercanos en l a s subunidades protefcas de

los microtubulos. -

-

Estudios real izados e n e l laboratorio del Dr.Lino D i a r d e

Le& demostraron un e f e c t o d e proteccidn por parte d e l mebendazol

e n e l d e s a r r o l l o d e cirrclsis hepática producida por e l CC14.

Se obset-vd una diominucion en el contenido d e coldgevta

hepática e n grupos tratados corm mebemdazol y CC14: e? estad?.?,

L . -

.. . . " . , . . Y "

, b 1,

Fag 6

Ií

MQTERIQLES Y METODOS i

I

T r a t a m i e n t o a g u d o c o n C C 1 4 . I

Para este e s t u d i c ~ se usarq-1 ratas macho Wistar p e s a n d o e n t r e 288 y

25ldgm. Los a n i m a l e s t r a t a d o s r - e c i b i e r o n u n a d o s i s finita d e B.5 d e

C C 1 4 p o r 180grfl d e p e s o d e l a n i m a l d i s u e l t o s e n a c e i t e d e o l i v a

CZ:l v / v ) a t r a v é s d e un t Ú b o i n t r a g á s t r i c o ; los a n i m a l e s c o n t r o l

r e c i b i e r o n e l mismo v o l u m e n d e aceite d e o l i v a .

P r * e p a r a c i d n d e l a f r a c c i 4 n d e membranas s e r r l i p u r i f icadas d e

h e p a t c c i t o s d e r a t a . ~ - "" "

L a 5 m e m b r a n a s se s e p a r a r o n u s a r ~ d o u n a modi f i c a c i d r t a l m&tudo '

d e N e v i l l e , d e P o h 1 , B i r n b a u n e r .y R o d b e l l ( 3 4 ) .

E l p r o c e d i m i e n t o se r e a l i z a a t e r f i p e r a t u r a d e 8 a 4 ' C y

c o n s i s t e e n l o s i g u i e n t e :

5e s a c r i f i c a n l a s ratas y se le5 e x t i r p a r a p i d a m e n t e e l

h i g a d o . Se e l i m i n a e 5 t e J i d o c o n J u n t i v o y se coloca cada h i g a d o

en un v a s o d e ' p l & t i t a fria y se desrmnuza ccm t iJeras. Lor;

f r a g m e n t o s se p a s a n a u n h o m o g e n i z a d o r ( D o u n c e ) g r a n d e c o n &bolo

f l o J o , se a d i c i o n a r 1 25 m1 d e NaHC03 l rnM pH 7 . 8 y 5e h o m o g e n i z a n -

c o n 6 g o l p e s d e e'mbolo p o r cada h c g a d o . Se a y i t a n s u a v e m e n t e p o r

tres rninut.os y se f i l t r a p r i m e r o a t r - a v e k d e g a s a d o b l e y

p o s t e r i o r m e n t e a t r a v e ' s d e g a s a c u d d r u p l e . E l f i l t r a d o se

d i s t r i b u y e e n b o t e l l a s d e c e n t r i f u g a de 258ml y se c e n t r i f u g a a

25016 rpm d u r a n t e 38 m i n u t o s . Se d e s e c h a e l s o b r e n a d a n t e y e l

p r e c i p i t a d o se r e s u s p e n d e e n un v o l u m e n rngnimo d e medio. E l <

. . 111-

Una s o l u c i d ~ r ~ d e sacarosa se a ~ u s t a a una concerltracibn de

~jg+-Q). 5% (P/P) con l a ayuda d e un re fractdrnet t-13 n b b e . . En una

probeta se rnezcla un volumen d e homoQenezadct y 1. 76 v o l u ~ e r ~ e ~ i d e

sacarusa al 69%; e s t a rnezcla d e b e quedar a una concentracich

f i n a l d e sacarosa d e 44+-8.1%.

Con esta suspencidn se lienan 2/3 partes del vulurnen d e 105

t u b o 5 ; e l t e r c i o r e s t a n t e se l l e n a cuidadosamente con una scrlucidn

d e rjacarosa a J ustada previamente a una ccwcentracidn final de

Se c e n t r i f u g a a 1858069 durante 158 rninutos en u n rcltclt-

Postericwmente se recupera l a porci8n f 1otani.e que I

corresponde a l a s mrmbrnas sernipurificadas. Se adicisnarl i33 m1 de

NaHC03 lm y se resuspenden haciendolas pasar par a g u ~ a N o , 18 y

luego otra No. g@. 5e lavan con NaHCU3 lrnM para quitat- e l exceso

d e sdcarcsa. D.espues, se centrifugan a 2580 g durante 15 r t i i n .

Las rnenibranas sedimentadas se resuipenden en un vulurnen minirtio d e

sobrenadante y se transfieren allcuotas apropiadas a v i a l e s que se

a lolacenan a -B@C.

M e c J i c i d n d e l a a c t i v i d a d d e la .FITPasa d e Ca pclr el rl1e'tudt:l

c o l o r i m d t r i c o d e Rmes ( 3 5 ) .

E s t e m i t o d o m i d e c o l o r i m e t r i c a m e n t e l a c a n t i d a d d e

fosfato ( P i ) l i b e r a d o d e l FITP m e d i a n t e l a f o r m a c i & n d e un compleJc1

c o l o r i d o c o n mol i b d a t s d e amorlitzt e n p r e s e n c i a d e ascclrbato.

PI cont i r l u a c i d n 5e d e s c r i b e e l p r o t o c o l o e x p e r i m e n t a l .

La curva d e cal i b r a c i b d e P i se h i zo ut i 1 i z a n d o K2k1F04.

La d e t e r m i n a c i & n c u a n t i t a t i v a d e l a s pt-ccteírms c o n t e n i d a s en

l a s membranas se efect uo' p u r e l método d e Bradfl=lrd (36).

P r s t c i i m l o p a r a l a d e t e r m i n a c i h n d e l a a c t i v i d a d d e RTF'asa d e

c a f c i m - p V k t - 1 pn. L

En un t ubct d e ensaye se a n a d e n l o s react i v c t s d e acuerdo a l

s i g u i e n t e esquema:

React ivci C o r t t r o l E x p e r i ment a 1

C a C l Z 12.5 2:168p1 . m0p 1

I m i d a z o l 28mM ph 7 . 6 270p 1 rsap 1

M e m b r a n a s ( 6 8 - 1 8 0 m g p r o t ) C"idCI 1 ""e

. P r e i n c u b a r d u r a n t e lamin a 37 C

BTP 125mM 1qA1 1 @kt 1

I n c u b a r

a n a d e n 1 0 0 ~ 1

se t o p a n 28

asc&bico a l

d u r a n t e 3 8 m i n a 5 7 C -

P o s t er i ornlent e se

d e acidlo t r i c l o r o a c e t i c o ( T C R ) , a l 35%. Se a g i t a n (y

y se les a d i c i o n a 5 8 8 u ~ d e agua, E!a0Pl d e acid0

10%, 1.2 m1 d e molibdato d e a m o n i o ' tla.45X en HZS04 1 '. ~ 2.

. ~. " .. ._ " - . . ...

a b s o r b a n c i a a 820nm.

f u e o b s e r v a d a e l i m i n a n d o l a p r o t e í n a d e e n s a y o s c o n t r o l e s .

M e d i c i d n d e l a a c t i v i d a d d e l a n'TPasa d e Na-K

E l m e d i o e s t d n d a r p a r a l a a c t i v i d a d t o t a l d e UTPasa c u n t e n l ' a

e n 0.5 m l : N a C l 150mM, KC1 5mM, 2.5 mM d e MgCl , RTP, i2.5mM, CUI a

8 8 r 9 d e p r o t e i r l a d e membranas y 20 mM d e b u f f e r d e l i m i d a t u l . - E l

pH d e l a s o l u c i d n se adustd a 7.6 a 37'C, t e m p e r a t u r a d e t o d a l a

i n c u b a c i d n e n t i m d t i c a . La a c t i v i d a d d e la RTPasa i n d e p e r l d i e r l t e d e

f r í o . Se toma u n a a l i c u o t a d e 2@ p a r a d e t e r m i n a r el f u r i f a t o

1

I

RESULTGDOS

C a d e t e r m i n a d a e n rliernbranas plasmát icas de ratas; q u e reclbier'.ot-t

de Ca d i s n l i n c t y e cerca d e l 58% , permahece asi d u r a n t e 10'3

s i g u i e n t e s 6 d í a s y e m p i e z a a r e c u p e r a r s e a p a r t i r d e l séptimo d í a

a l c a n z a n d o , valores; n u r r i r a l e s e n el d í a 1 1 .

E f e c t o d e l p r e t r a t a m i e n t o con cctlchicina s o b r e l a a c t i v i d a d ue id

FITPasa d e C a

- De un lote d e ratas W ist ar rliacho de Z:BO-Z:S@g 5 e f&sat-urt 4

grupc85 d e 5 animales cada g r u p o y se a p l i c a n lo5 s i g u i e n t e s

c o n c u l c h i c i n a sobr'e l a a c t i v i d a d d e la FITPasa d e C a . Se o b t e t w &

q u e l o s p r e t r a t a m i e n t o s con 58 y 1 8 8 u g i d l ) a d e c c l l c h i c i r l a

p r o t e g i e r o n e n un 716% de l a d i s r n i n u c i . d n d e a c t i v i d a d d e l a ATFzasa

d e C a que p r o d u c e e l C C 1 4 ; m i e n t r a s 'el p r e t r a t a m i e n t o C Ü ~ l@mg

d i a r i o s n o p r e v i n o l a p é r d i d a d e a c t i v i d a d d e l a ertzirna.

Se a n a l i z a r o n l o s p a r á n l e t r o s c i r t g i t i c o s d e l a a c t i v i d a d de la

enzinia conlo una funcibn d e l a c u n c e n t r a c i d n d e s u s t r - a t c a y lo.;

r e s u l t a d o s o b t e n i d o s se p r e s e n t a n e n l a t a b l a 3. Se cabservc: que

los a n i m a l e s i n t o x i c a d o s cckn C C 1 4 p r e s e n t a n u n a d i s r ~ i i n u c i b n - e n e l -

a l . valcw nornlal y una Vmax d e l 68% rnertcw q u e 1 a nor-ma1 . Las

tnembranas d e a n i m a l e s p r - e t r a t a d o s c u r l c o l c h i c i h a c¡@Qug d i a r i ü s i

m o s t r - a r o n p a t - & e t r o s c i n e ' t icos c o m p q r a b l e s c o n los- d e l g r u p o

FlTPasa d e La.

. """"ury

CURM DE RECUPERhCIOW hTPasa de Ca DESPUES DE INTOXIC~CIOW COW CCL4

Fig. 1 C d a barra representa el promedio de 6 animales + -S D -

c

. ”

hCTIUIDCSD bTPasa DE ChLCIO DESPUES COLCHICINh +. C C 1 4

Y o

Fig.2. Cada barra representa el promedio de 6 animales + -SD

_. . .

c" 14 u 22.68+-1.5 "

(-. - >: L 18.30+-3.3

17.50+-2.0

- 51.68+-6.0

hCTIUIDhD hTPftSh DE ChLCIO DESPUES DE MEBENDflZOL + CC14

Y o L 88 P

8

Fig. 3. Cada barra corresponde a un animal y es el promedio de 4 determinaciones+ -SO

DISCUSlON

JE,:: r - e p o t - t a d a s p o r e l g r u p o d e M s u r e l l e y col . (23). tin este

t t ' a i t r l ~ o ell135 i n t e r p r e t a n l a a c t i v i d a d d e ' h i d r b l i s i ' s d e QTP en

p y e i - i e r c i a d e C a C l T 2. 5rnM como la a c t i v i d a d d e OTPasa d e Ca y l'a **

l c i i = . l - , t ; i f i c a r ~ como l a bomba d e Ca r e s p o n s a b l e d e p a r t i c i p a r err l a

a+

En e l p r e s e n t e e s t u d i o se m i d i o l a a c t i v i d a d d e l a RTPasa -

~ r ~ ~ 1 e p e r 1 d i e r r t . e d e sodio y p o t a c i o (FITPasa d e Mg) en un medía q u e

rr.carlt.enia 5 0 d i o 158mM, KC1 2.5rnM, M g C l 2 2.5mM en p r e r j e r c i a de

l a s c u a l e s l a a c t i v i d a d d e esta e n z i m a i g u a l a o e x c e d e a l a RTPasa

medir- l a a c t i v i d a d d e e s t a e n z i m a o q u e rnclestrarr una a c t l v a c i u n

ni uy ba J a.

E n e l p r e s e n t e e s t u d i o se d e r m s t - r o que e l C C 1 4 pruvoca l a

p e r d i d a d e a c t i v i d a d d e a GTFasa i n d e p e n d i e n t e d e Na-P, y qqe la

r s l c h i c i n a e5 c a p a z d e p r e v e r l i r este efecto t d x i c o d e l C C 1 4 .

C C 1 4 . E5tos c a m b i a s se p u e d e n e x p l i c a r p u r l o s cambios e n

t : o r f l p o s i c i o n d e l a rtlernbrana q u e h a n s i d o e r ~ c o r c t r a d o s ( 2 4 , 2 5 , 2 6 ) . -

Se h a e n c o n t r a d a q u e u n a gran v a r i e d a d . d e d r o g a s i431,

p r - o t e g e n en c o n t r a d e l a h e p a t o x i c i d a d d e l C C 1 4 . Una d r o g a q u e

r o v a . l e n t e a l i k i d o s y proteirlas u puede actuar e n l a s u l t iina5

b

l e t a p a s q u e l l e v a n a n e c r o s i s . . ,l.

CONCLUSIONES

2. El CC14 disminuye en un 30% la Km de esta enzima.

3. La colchicina previene los efectos tdxicos del CC14, en cuanto a la reducciljn actividad d e esta enzima. .

4. Em rnebendazol, a las dosis probadas no actuo protegiendo de la perdida de actividad de la enzima.

p r - o d ~ c e la a d t t ~ i n i s t r a c i ~ h d e l C C 1 4 aun rm e s t a bien aclarada. be sabe

.;e debert. a la induccidn de la degeneracidn peroxidativa de los l fpidus

,.elulares. En l a l i t e r a t u r a e x i s t e n r e p o r t e s donde se errcuntr-83 que i a

, . :olchicina protegla contra el darm hep4tico agudn y s e v 1 o que e l

~ ~ l e c a r ~ i ~ ~ ~ o protector 5e basa fundamentalmente en l a capac.idad para

/

ur-everlir la l ipoperoxidacidn y de actuar a n i v e l d e la rt1ernDrarta

~ , l a s r n ~ t i c a . Err e l labor-atur-io s e erlcontrd que, e l rneberldazul t e n i a un

,zbfectca de pr-oteccidn en e l d e s a r r o l l o de cirr-osis nepcitica producido

._ -

pretendid estudiar- los cambios de la a c t i v i d a d de la QTPasa de Na-k y

de l a QTPasa independiente de Na-K de las mernbr-ana del hepatocitcl de

vatas intoxicadas con C C 1 4 agudamente y . a n a l i z a r si la colchicirta y e l

r~nebendazol administradas previamente al CC14 era capaz d e pr-evenir

kales cambios; Se trabaJo' con ratas Wistar rnachct adultas d e

&2<@@-eS@grs. Se formaron l o s s i g u i e n t e s gr-upos: 1 . -Control, 2. - C C 1 4 ,

3.-colchicina l@pg/dia pot- 7 dias, 4 . - c o l c h i c i n a 58yg/clia por- '7 d i a s ,

5. -colchicina lB@pg/i3ia por 7 dias, 6. -rtlebendazol lulug diariosL7dias

Se s a c r i f icarctn los animales en per-iudc~s de Z+ hot-az despues del

C C 1 4 y se a i s l a r o n l a s membr-arms plasmdticas que se u t i l i z a r o n para

rnedir l a a c t i v i d a d de l a s RTPasas. Los resultados (demostrar-on que l a

""

RESUMEN

efecto d e p r o t e c c i o n e n e l desarrollct d e cirr-osi5 h e p a t i c a p r - o o u c l d o

p o r e l C C 1 4 y rm e x i s t e n r e p s r t e e d e que se haya usads cctrnca un posible \ -

h e p a t o p r o t e c t o r e n la i n t u x i c a c i o n a g u d a . En el p r e s e n t e ' trabaJo se

p r e t e n d i o e s t u d i a r l o s c a r n b i o s d e l a a c t i v i d a d d e l a FITPasa d e Na-k y

RTPasa i n d e p e n d i e n t e d e Na-H d e la5 membrana d e l h e p a t o c i t o d e ratas

i n t o x i c a d a s con C C 1 4 a g u d a m e n t e y a n a l i z a r si l a c u l c h i c i n a y e l

r n e b e n d a z o l a d m i n i s t r a d a s p r e v i a m e n t e a l C C 1 4 era c a p a s a z d e p r e v e n i r

3 . - c o l c h i c i n a l @ u g / d i a p o r 7 d i a s , 4. - c o l c h i c i n a S @ u g / d i a p o r 7 dias,

d. - c c l l c h i c i n a 1 8 8 u g / d i a p o r 7 d i a s , 6. - m e b e n d a z o l 1 8 u g d i a r i o s / 7 d i a s C:

Se s a c r i f i c a r o n l o s a n i m a l e s dn p e r i o d o s d e Z4 h o r a s c i e s p u e s d e l

C C 1 4 y se a i s l a r - o n l a s m e m b r a n a s p l a s m a t icas q u e se u t i 1 i zar-ort para

rnedir l a a c t i v i d a d rde las RTPasas. t o s res!?j,tados. d e r n u c t r a r o n q u e i d

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< I