Toxinas Marinas: Química, Toxicidad, Casos y Detección, con especial referencia al caso Danés.

Arjen Gerssen 1,*, Irene E. Pol-Hofstad 2, Marnix Poelman 3, Patrick P.J. Mulder 1,

Hester J. van den Top 1 and Jacob de Boer 4

1 RIKILT, Institute of Food Safety, Wageningen UR, Akkermaalsbos 2, 6708 WB Wageningen,

The Netherlands; E-Mails: Patrick.Mulder@wur.nl (P.P.J.M.); Hester.vandentop@wur.nl (H.J.T.)

2 Microbiological Laboratory for Health Protection, National Institute for Public Health and the

Environment, A. van Leeuwenhoeklaan 9, 3720 BA Bilthoven, The Netherlands;

E-Mail: Irene.Pol@rivm.nl

3 IMARES, Wageningen UR, Korringaweg 5, 4401 NT Yerseke, The Netherlands;

E-Mail: Marnix.Poelman@wur.nl

4 Institute for Environmental Studies, VU University, De Boelelaan 1087, 1081 HV Amsterdam, The

Netherlands; E-Mail: jacob.de.boer@ivm.vu.nl

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: Arjen.Gerssen@wur.nl;

Tel.: +0031-317-480433; Fax: 0031-317-417717.

Abstract:

Varias especies de algas pueden producir toxinas marinas bajo ciertas circunstancias.

Luego, estas toxinas pueden acumularse en moluscos tales como mejillones, ostras y

vieiras. Cuando estas especies de moluscos contaminados se consumen pueden ocurrir

intoxicaciones severas. En este informe se van a discutir los diferentes tipos de síndromes

que pueden ocurrir posteriores al consumo de moluscos contaminados, las toxinas

correspondientes y la legislación relevante a estos casos. Las intoxicaciones que ocurren

alrededor de todo el mundo son las intoxicaciones amnésicas por moluscos (ASP sigla en

inglés), intoxicaciones paralizantes por moluscos (PSP), intoxicaciones diarreicas por

moluscos (DSP) e intoxicaciones azaspirácidas por moluscos (AZP). En Estados Unidos y

Nueva Zelanda, los casos se limitan a intoxicaciones neurológicas por moluscos (NSP),

mientras que las toxinas causantes de DSP y AZP ocurren mayormente en Europa. Los

últimos dos grupos de toxinas son liposolubles y por lo tanto pueden clasificarse como

toxinas marinas lipofílicas. Se entrega una visión general detallada de los métodos

analíticos oficiales utilizados en la Unión Europea (bioensayos en ratones o ratas) y el

desarrollo reciente de métodos alternativos para las toxinas marinas lipofílicas. Estos

métodos alternativos se basan en ensayos funcionales, ensayos bioquímicos y métodos

químicos. Desde la literatura se deja en claro que los métodos químicos ofrecen el mejor

potencial para reemplazar los tests en animales que aún son legislados en el mundo

entero. Finalmente, se entrega una visión sobre la situación de las toxinas marinas en

Holanda. El ensayo en ratas ha sido utilizado para monitorear las toxinas de intoxicación

diarreica (DSP) y de intoxicación azaspirácida (AZP) en Holanda desde 1970. Hoy en día, se

utiliza a menudo una combinación de métodos químicos y de bioensayo en ratas. En

Holanda, los eventos tóxicos son mayormente causados por toxinas diarreicas (DSP), que

se han encontrado en mariscos holandeses por primera vez en 1961 y que se han repetido

en intervalos irregulares y en variadas concentraciones. Desde este estudio queda claro

que se realiza un esfuerzo considerable por parte de varios grupos de investigación para el

cese gradual de los tests en animales que aún se utilizan en los programas oficiales de

rutina de monitoreo.

Palabras clave: Toxinas marinas lipofílicas; Toxinas diarreicas DSP; métodos alternativos

1. Introducción

De las 5000 especies conocidas de fitoplancton hasta la fecha, bajo ciertas

circunstancias alrededor de 300 de ellas tienen un alto porcentaje de proliferación,

dando como resultado nubes de algas de alta densidad llamadas floraciones. Las

circunstancias del desarrollo de la floración de algas aún no se comprenden por

completo, sin embargo, condiciones hidrográficas y climáticas específicas parecen

tener un rol en la formación de floraciones [1-3]. Las floraciones a veces son

beneficiosas para la acuicultura y la biología marina [4]. No obstante, de las 300

especies de fitoplancton mencionadas arriba, más de 40 especies pertenecientes a

las clases de dinoflagelados y diatomeas se conoce que producen ficotoxinas

(toxinas marinas) [5]. La abundancia de estas especies de fitoplancton tóxico

puede variar desde miles hasta unos pocos millones de células por litro. La gran

abundancia de floraciones de estas especies de fitoplancton tóxico se le llama

Floraciones de Algas nocivas (FAN/ HABs en inglés). Se ha sugerido que ciertas

especies de fitoplancton producen toxinas para competir por espacio con otras

especies de fitoplancton [6].

Las Ficotoxinas se pueden acumular en diversas especies marinas tales como

peces, cangrejos o bivalvos que se alimentan por filtración (moluscos) tales como

mejillones, ostras, vieiras y almejas. En moluscos, las toxinas se acumulan

principalmente en las glándulas digestivas sin causar efectos adversos en sí mismo.

No obstante, cuando los humanos consumen cantidades sustanciales de moluscos

contaminados esto puede causar una intoxicación severa del consumidor (Imagen

1). Alrededor del mundo, las toxinas producidas por algas (incluyendo las toxinas

de cyano de agua dulce) se les considera responsables de aproximadamente

60.000 intoxicaciones humanas por año [7]. Las toxinas de mariscos también

causan daño a la vida silvestre [8.9] y tienen un impacto económico negativo en

recreación, turismo y la industria marisquera. En Europa, una pérdida anual

estimada de 720 millones de euros (€) en la industria de recreación y turismo y 166

millones de euros en la industria marisquera se debe a los eventos de floración de

algas [10,11]. Para poder prevenir la intoxicación por toxinas de mariscos del

consumidor, se ha desarrollado una legislación y se han establecido programas de

monitoreo alrededor del mundo [12,13]. En este estudio se entrega una visión

general de los diferentes tipos de síndromes de envenenamiento, el alga

correspondiente y las toxinas. Además, se analizan algunos métodos alternativos

que han sido desarrollados para reemplazar los bioensayos animales que se están

utilizando para la detección de toxinas marinas lipofílicas.

Imagen 1. Floraciones de Algas Nocivas en la cadena alimenticia y las rutas de

exposición.

2. Síndromes de envenenamiento y sus toxinas correspondientes.

Basándose en las propiedades químicas de las toxinas marinas de mariscos, se

pueden dividir en dos clases diferentes: toxinas hidrofílicas y toxinas lipofílicas. Las

toxinas que se asocian con los síndromes de intoxicación amnésica por molusco

(ASP) e intoxicación paralizante por molusco (PSP) son hidrofílicas y tienen un peso

molecular (PM) bajo los 500 Da (Daltons). Las toxinas responsables de intoxicación

neurológica por molusco (NSP) , intoxicación diarreica por molusco (DSP) e

intoxicación azaspirácida por molusco (AZP) y otras toxinas tales como

pectenotoxinas , yesotoxinas e íminas cíclicas todas tienen como común

denominador una masa molecular superior a 600 Da ( hasta 2.000 Da). Estas

toxinas tienen fuerte propiedades lipofílicas. Por consiguiente, estas toxinas se les

llaman generalmente toxinas marinas lipofílicas.

2.1 Toxinas Hidrofílicas

2.1.1. Intoxicación amnésica por molusco (ASP)

La diatomea Pseudo- nitzschia pungens es una de las especies más importantes de

las de más de 10 productoras de ácido domoico (Imagen 2), que corresponde a la

toxina responsable de la intoxicación amnésica por molusco (ASP) (Tabla 1).

Además, un número de isómeros tóxicos de DA (ácido domoico) han sido descritos

en otras publicaciones [14]. La acción primaria del DA es en el hipocampo, el cual

está encargado de procesar la memoria y las funciones viscerales [15]. El DA es una

neurotoxina que se une con gran afinidad a los receptores de glutamato. Este

enlace lleva a abrir los canales de la membrana (permeable para el sodio). Esto, a

su vez, lleva a un influjo aumentado del sodio y a una despolarización de la

membrana. Los efectos adversos que se han informado son desórdenes

gastrointestinales, nauseas, vómitos, calambres abdominales y diarrea. Además

dolores de cabeza, mareos o vértigo y también puede ocurrir pérdida de la

memoria a corto plazo [16,17].

La intoxicación amnésica por molusco fue descrita por primera vez en 1987 en la

Isla Príncipe Eduardo, Canadá [18].Durante este episodio tóxico, tres personas

murieron y más de 100 fueron ingresados al hospital después de consumir Mejillón

común (Mytilus edulis) con altos niveles de DA [17]. La presencia de DA en

moluscos es un problema global. En los últimos años, se han descrito casos de

moluscos que contenían DA en los Estados Unidos, Canadá, Francia, Reino Unido

(UK), España, Irlanda y Portugal [18-23]. La Unión Europea (EU) ha establecido un

nivel permitido de 20mg de DA/kg de carne de molusco. En el año 2009, la

Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) publicó una opinión sobre DA

[24]. En esta opinión el panel recomendó que era seguro consumir moluscos que

contuvieran menos de 4,5 mg de DA/kg de carne de molusco para no exceder la

dosis aguda de referencia (Arfd). DG SANCO (responsable por la salud y la

protección al consumidor en la Unión Europea) discutirá la opinión de EFSA con los

diferentes estados miembros de la UE y esto resultará en una nueva legislación.

Imagen 2. Estructura química del ácido domoico (DA)

Tabla 1. Grupos de toxinas marinas y las algas responsables de cada toxina.

2.1.2. Intoxicación paralizante por molusco (PSP)

Los Dinoflagelados del género Alexandrium son los productores de las saxitoxinas

(Imagen 3), el grupo de toxinas responsables de la intoxicación paralizante por

molusco PSP (Tabla 1). Dentro del grupo de saxitoxinas se han detectado alrededor

de 30 análogos diferentes [45]. No todos los análogos exhiben la misma toxicidad y

hoy en día para los análogos más prominentes, se han establecido factores de

equivalencia tóxica (TEF) [46]. La Saxitoxina causa inhibición del canal iónico de

sodio lo que resulta en un potencial de acción reducido [47]. Los efectos adversos

de la intoxicación con saxitoxinas comienzan con un hormigueo o entumecimiento

alrededor de los labios. Estos efectos se expanden hasta el cuello y el rostro. En un

estado avanzado se pueden sentir punzadas en las yemas de los dedos, dolor de

cabeza, mareos, nauseas, vómitos y diarrea. Incluso se ha descrito ceguera

temporal [46,48]. Cuando se consumen altos niveles de saxitoxinas también se ven

afectados los nervios motores, lo que resulta en dificultades respiratorias y otros

efectos paralizantes en los músculos [49]. Finalmente, esto podría causar la muerte

[50].

Los primeras descripciones de intoxicación paralizante por molusco PSP se

remontan a 1920 en California Estados Unidos, donde al menos seis personas

murieron [51]. Hasta 1970, las toxinas de PSP solamente se detectaron en aguas

Europeas, Norteamericanas y Japonesas. Hoy en día, las saxitoxinas se han

encontrado en Chile, en Sudáfrica, en Australia así como en otros países [52,54]. En

la mayoría de los países se han establecido programas de monitoreo para proteger

a los consumidores. La Unión Europea ha establecido un nivel permitido de 800

mcg (μg) de saxitoxina 2-HCL equivalentes/kg de carne de molusco. Recientemente

(2009) la EFSA publicó una opinión sobre el grupo saxitoxina [46]. En esta opinión

se recomienda que un nivel seguro es tan reducido como 75 mcg de saxitoxina

2-HCL equivalentes/kg de carne de molusco para evitar exceder la dosis aguda

de referencia (ArfD) [46].

Imagen 3. Estructura Química de la saxitoxina (STX)

2.2. Toxinas Lipofílicas

2.2.1. Intoxicación neurológica por molusco (NSP)

La intoxicación neurológica por molusco (NSP) es causada por las brevetoxinas

(Imagen 4) Estas toxinas se producen por las especies de algas Karenia ssp (Tabla

1) [8,30]. Las Brevetoxinas causan la apertura de los canales iónicos de sodio,

permitiendo un influjo de sodio en las células y a un completo bloqueo de la

excitabilidad neuronal [55]. Los efectos adversos que se han observado son

diarrea, vómitos, calambres, una reducción rápida de la frecuencia respiratoria y

alteraciones de conducción cardíaca las que pueden llevar a un estado de coma y

finalmente a la muerte [30]. Además del consumo de moluscos contaminados con

brevetoxinas, la intoxicación puede ocurrir por la inhalación de aerosoles

producidos por las olas que rompen en la costa [56,57]. La inhalación de

aerosoles de brevetoxinas puede causar problemas respiratorios e irritación de los

ojos y la membrana nasal. Hasta ahora las intoxicaciones por NSP han estado

limitadas a las zonas de Estados Unidos (Golfo de México y Florida) y a Nueva

Zelanda [58,59]. Ya que estas toxinas no se han encontrado en Europa, no existe

legislación para estas toxinas y no se han establecido programas de monitoreo. En

los Estados Unidos, se ha establecido una legislación por medio del Food and drug

administration (FDA). El límite regulatorio actual es de 800 mcg de brevetoxina-2

(PbTx-2) equivalentes/kg de carne de molusco [60]. Al momento de escribir este

estudio, la EFSA no ha publicado una decisión sobre las toxinas del tipo NSP.

Imagen 4. La estructura química de la brevetoxina (PbTx-2)

2.2.2. Intoxicación diarreica por molusco (DSP)

El ácido ocadaico (imagen 5), la dinofisistoxina -1 (DTX1) y -2 (DTX2) así como

también las formas esterificadas de ácido ocadaico (OA), DTX1 y DTX2 son

producidas por el género Dinophysis (tabla 1) [35]. Las toxinas del grupo OA

inhiben la serina y las treoninas fosfatasas PP1 y PP2A [61]. Esta inhibición lleva a

la hiperfosforilación de proteínas involucradas en las uniones cito esqueléticas que

regulan la permeabilidad de la célula, lo que resulta en una pérdida de fluidos

celulares [62]. El consumo de moluscos contaminados con altos niveles de toxinas

del tipo OA pueden tener efectos adversos tales como desorden gastrointestinal,

diarrea, calambres abdominales, nauseas y vómitos [63]. Además, las toxinas de

OA y DTX1 han demostrado que desarrollan sustancias de tumores en tests con

animales [64].

La primera intoxicación humana documentada que fue causada por las toxinas

diarreicas DSP fue en Holanda en 1961 [65]. Hoy en día, altos niveles de toxinas del

grupo OA se informan repetidamente en moluscos o algas a lo largo de las costas

de Europa ( Reino Unido, Irlanda, Dinamarca, Suecia, Noruega, Francia, España,

Italia, Portugal, Holanda y Bélgica), Canadá, Sudamérica (Chile), Japón, Australia y

África ( Marruecos) [63.66.67]. Se han establecido los factores de equivalencia

tóxica (TEF) para OA, DTX1 y DTX2 (Tabla 2) [68,69]. Dentro de Europa, el nivel

permitido para la cantidad total de OA, DTXs y PTXs en moluscos se ha fijado en

160 mcg OA –equivalentes/kg de carne de molusco. En el año 2008, el panel de

EFSA concluyó en su decisión sobre OA y análogos que OA y DTXs no deben

exceder los 45 mcg de OA –equivalentes /kg de carne de molusco, para así no

exceder la dosis aguda de referencia (ArfD). Para los PTXs, la EFSA ha preparado

una decisión [70].

Imagen 5. Estructura química del ácido ocadaico (OA)

Las Pectenotoxinas (PTXs) (Imagen 6) son producidas por las mismas especies de

fitoplancton que las toxinas del grupo OA, el género Dinophysis [33].

Aproximadamente hasta la fecha se han descrito 15 tipos diferentes de PTXs

[71,72]. La Pectenotoxina-2 (PTX2), ácido pectenotoxina- 2 seco (PTX2sa) y ácido

7-epi-pectenotoxina-2-secoico (7-epi PTX2sa) son los análogos predominantes en

moluscos europeos [73]. La toxicidad después de una administración

intraperitoneal o por administración oral de PTXs en ratones es considerada para

ser comparable. Después de la inyección intraperitoneal de PTX2, se ha observado

daño hepático tales como la generación de vacuolas y deformación de hepatocitos

[74]. La administración oral de PTX2 resultó en cambios histopatológicos en el

hígado y el estómago de ratones pero no se observó diarrea [75]. Aún no se han

documentado intoxicaciones humanas por PTXs. Como se mencionó

anteriormente, las PTXs están recién siendo incluidas en la legislación europea en

el grupo de toxinas OA, pero EFSA ha sugerido recientemente que las PTXs

deberían clasificarse de manera individual. El panel de EFSA propuso un nivel

permitido de 120 mcg/kg de PTX2 equivalentes (tabla 2) [70].

Imagen 6: Estructura química de la pectenotoxina -2 (PTX2)

Las Yesotoxinas (YTXs) (imagen 7) se producen por dinoflagelados Proceratium

reticulatum y Lingulodinium polyedrum [39,76]. Hasta ahora solo se han

identificado hasta 90 análogos de YTX [77]. Las toxinas más abundantes

encontradas en moluscos son las YTX y los metabolitos 45-hidroxi-YTX, carboxi-YTX

y sus homologos- 1a correspondientes [78]. Algunos análogos de YTX solamente se

han encontrado en ciertas regiones tales como adriatoxinas en el mar Adriático

[79]. Cuando se inyecta intraperitoneal la toxicidad de YTX es relativamente alta,

con una dosis letal DL50 para ratones de 750 mcg/kg. Por el contrario, la

administración oral de altos niveles de YTX(7,5 y 10 mg/kg) solamente resultó en

alguna inflamación de las células del músculo del corazón de los ratones [80].

Hasta ahora, no se ha informado sobre intoxicaciones en humanos por consumo

de moluscos contaminados por YTX. Los niveles de YTXs que exceden el actual

nivel regulatorio de la Unión Europea (1mg/kg) se han encontrado ocasionalmente

en Italia, Noruega y Portugal [78, 81,82]. La EFSA ha sugerido que el consumidor

está protegido cuando el molusco no excede una concentración de 3,75 mg de

YTX-equivalentes/kg de carne de molusco [83]. La EFSA ha identificado las YTX,

1a-homo-YTX, 45-hidroxi-YTX y la 45-hidroxi-1a-homo-YTX como las Yesotoxinas

más importantes presentes en moluscos. Para estas toxinas se han establecido

factores de equivalencia tóxica (TEF) (Tabla 2) [83].

La intoxicación diarreica por molusco es causada por OA y sus análogos DTX. Las

YTXs y PTXs a menudo se incluyen en el grupo de las toxinas DSP, ya que a menudo

pueden ocurrir simultáneamente con el ácido OA y los análogos de DTX aunque no

causan diarrea. Por lo tanto, debería considerarse quitar a estas toxinas del grupo

DSP. En nuestra opinión, un mejor término para clasificar las toxinas

pertenecientes a estos grupos sería toxinas marinas lipofílicas.

Imagen 7. Estructura química de yesotoxina (YTX)

2.2.3. Intoxicación azaspirácida por molusco (AZP)

Por años, se pensaba que los azaspirácidos (imagen 8) eran producidos por la

especie Protoperidinium crassipes [85], aunque faltaba una correlación entre el

recuento de alto contenido de algas y los niveles de toxina [86]. Recientemente, se

ha descubierto que las toxinas azaspirácidas (AZAs) realmente son producidas por

un ínfimo dinoflagelado [40,86]. Este dinoflagelado, llamado Azadinium spinosum,

es más pequeño (12 a 16 mcg) que cualquiera de los otros dinoflagelados

productores de toxinas que se conocen hasta ahora. Hasta el momento se han

descrito 24 azaspirácidos (AZAs) diferentes, con azaspirácido-1 (AZA1), -2 (AZA2),

-3 (AZA3) como los tipos predominantes [87]. El mecanismo de acción aún no se

comprende del todo, pero experimentos in vitro de líneas celulares de mamíferos

mostraron alteraciones en la estructura citoesquelética y un efecto en el sistema E-

cadherina, el cual es responsable de la interacción entre células [88-90]. Esto

podría explicar los efectos tóxicos tales como desórdenes gastrointestinales,

diarrea y calambres abdominales que se observan durante la intoxicación por AZP

[85,91]. En 1995, la primera intoxicación debido a AZP se registró cuando al menos

ocho personas se enfermaron en Holanda después del consumo de mejillones

importados de Irlanda. El bioensayo en ratas, que normalmente se utiliza para

detectar toxinas del tipo OA, reveló la presencia de actividad diarreica tóxica,

donde el bioensayo en ratones careció de detecciones de estas toxinas. Desde

entonces, sucedieron varios brotes de AZP en Irlanda y hasta ahora las AZAs habían

sido detectadas en Irlanda, Reino Unido, Noruega, Francia, Portugal, África del

Norte (Marruecos), Sudamérica (Chile) y en los Estados Unidos [67,85,92-97]. De

acuerdo a la legislación actual de la Unión Europea, la cantidad total de AZAs no

deberían exceder los 160 mcg/kg de AZA1-equivalentes [98]. Recientemente, la

EFSA revisó toda la información de toxicidad disponible y sugirió que un nivel

seguro de toxinas AZA está por debajo de la dosis aguda de referencia (ARfD) de 30

mcg de AZA-1 equivalentes/kg de carne de molusco [84]. Además, la EFSA sugirió

factores de equivalencia tóxica (TEFs) para las tres AZAs más importantes (Tabla 2)

[84].

Imagen 8. Estructura química de azaspirácido- 1 (AZA1).

2.2.4. Espirolidas y Gimnodiminas ( Iminas cíclicas)

Las Espirolidadas (SPXs) (Imagen 9) y las gimnodiminas son toxinas que pertenecen

al grupo de las iminas cíclicas. Las SPXs se producen por la especie Alexandrium

ostenfeldii (Tabla 1) [41,99]. Aproximadamente, se han encontrado de 10 a 15 SPxs

diferentes (incluyendo ésteres) tanto en algas o en moluscos [100-102].

El mecanismo de acción aún no se comprende por completo, pero la inyección

intraperitonal de extractos de molusco que contienen SPxs o gimnodiminas está

causando la muerte de los tests animales en cosa de minutos [103]. Por esta razón,

estas toxinas han sido clasificadas como toxinas de rápida acción. Aún no se han

informado casos de intoxicación de humanos con iminas cíclicas. Sin embargo, se

han encontrado SPXs en algas y moluscos de Noruega, Canadá, Dinamarca, España

y Chile [95,100,104], mientras que las gimnodiminas hasta el momento solo han

sido detectadas en algas y moluscos de Nueva Zelanda [44]. Actualmente, no

existe legislación en la Unión Europea para las iminas cíclicas. Actualmente, este

grupo de toxinas está siendo analizado por la EFSA, quiénes publicarán su decisión

en el 2010.

Imagen 9: Estructura química de la 13- desmetil espirolida C (SPX1).

3. Métodos de análisis.

Para la determinación de toxinas marinas se han descrito varios métodos

biológicos ( in-vivo e in-vitro), métodos bioquímicos y métodos químicos en la

bibliografía. No obstante, por largo tiempo no estuvieron disponibles los métodos

químicos para las toxinas marinas lipofílicas. En este párrafo, se entregará un

esquema sobre los métodos oficiales indicados en la legislación europea y los

métodos alternativos desarrollados en los últimos años.

Durante la última década se ha visto un fuerte incremento en ensayos conjuntos

sobre toxinas marinas lipofílicas (Imagen 10). En general, el desarrollo del método

y la validación del método para las toxinas marinas lipofílicas estuvieron

obstaculizados por muchos años, debido a la ausencia de patrones (certificados) y

materiales de referencia (certificados). Como se muestra en las imágenes 4 a 9 las

estructuras químicas de las toxinas son complejas y por consiguiente, es muy difícil

y costoso sintetizarlas [105]. Por lo tanto, los patrones necesitan ser aislados del

molusco contaminado o bien de las algas contaminadas [106,107].En los últimos

años, se han realizado esfuerzos considerables para expandir el número de toxinas

disponibles. En el año 2005, solo estaban disponibles pequeñas cantidades de

patrones de referencia fiables de las toxinas OA y de PTX2. En el 2007, estuvieron

disponibles las toxinas YTX, AZA1 y SPX1. Desde entonces, de todos los grupos

importantes de toxinas marinas lipofílicas al menos un patrón certificado está

disponible (OA, PTX2, YTX, AZA1 y SPX1). Se espera que otros patrones de

referencia importantes tales como DTX1, DTX2, AZA2 y AZA3 estén disponibles en

el transcurso del 2010.

Imagen 10. Número de publicaciones revisadas por pares sobre toxinas marinas

lipofílicas en la última década.

3.1. Métodos oficiales actuales descritos en la legislación y sus limitaciones.

La legislación de la Unión Europea prescribe una prueba biológica para la

determinación de las toxinas OA, DTXs, YTXs, PTXs y AZAs en moluscos. Esta

prueba biológica puede ser un ratón (BER) o un bioensayo en ratas (BER). El

Bioensayo en ratones se realizó en Japón y el bioensayo en ratas en Holanda en los

años 70 [65,108]. Diversos laboratorios han ajustado el bioensayo en ratones el

cual ha resultado en diferentes protocolos [109,110]. En Europa, se ha descrito un

procedimiento detallado por el Laboratorio Comunitario de Referencia sobre

toxinas marinas (LCR-BM, Vigo, España) para estandarizar el protocolo para el

bioensayo en ratones [111]. Los extractos de moluscos son preparados con

extracción de acetona seguida de una extracción líquido-líquido con diclorometano

o dietil éter. Después de la evaporación, el extracto es reconstituido en 1% de

solución de polisorbato 20. Estos extractos son inyectados de manera

intraperitoneal dentro de tres ratones macho con un peso corporal de 20gr.

Preferentemente, el hepatopáncreas del molusco debería usarse, ya que la

mayoría de las toxinas tienden a concentrarse en ese lugar, solo en relación a las

AZAs puede haber una discusión si es que estas toxinas se difunden dentro de la

carne de molusco [91,112]. Si al menos dos de tres ratones mueren dentro de 24

horas después de la inyección, la muestra se considera positiva para toxinas

marinas lipofílicas [13]. Desafortunadamente, también bajos niveles de toxinas

SPXs pueden causar la muerte, incluso dentro de unos pocos minutos [103]. Esto

indica que los bioensayos en ratones carecen de especificidad. Un aspecto fuerte

del ensayo es que puede señalar la presencia de nuevas toxinas marinas

emergentes. El Bioensayo en ratas, un método oficial en la Unión Europea que

solamente se aplica en Holanda, se basa en el consumo de moluscos (véase

también la sección “Presencia de eventos tóxicos en Holanda”). Ratas hembras

privadas de alimento (por 24 hrs) son alimentadas con 10gr de hepatopáncreas de

molusco. Después de 16 hrs la consistencia (reblandecimiento) de las heces es

investigada. La diarrea severa coincide con los niveles de toxinas alrededor de la

legislación de la Unión Europea vigente (160 mcg/kg de toxinas OA equivalente o

160 mcg/kg de toxinas AZA1 – equivalentes) [68]. Una desventaja considerable del

bioensayo en ratas es que las toxinas YTXs y PTXs no son detectadas en el límite

regulador porque no inducen diarrea. Además, el analista necesita acumular

experiencia para hacer una interpretación precisa de los resultados de las pruebas

(textura de las heces). En forma más general, las limitaciones del bioensayo en

ratones y el bioensayo en ratas es la carencia de especificidad y sensibilidad,

carencia para dar posible un perfil de la toxina, y la producción frecuente de

resultados falsos positivos. Por estas razones, dentro de Europa, varios países

ahora usan una combinación de pruebas en animales y pruebas químicas (Tabla 3).

Además, el bioensayo en ratones en particular se está convirtiendo cada vez más

en algo inaceptable por razones éticas y esto provee un fuerte ímpetu para

eliminar gradualmente y reemplazar el bioensayo en ratones.

Tabla 3. Métodos utilizados para el control oficial de toxinas marinas lipofílicas.

Desde una perspectiva mundial, la regulación de toxinas marinas lipofílicas difiere

ampliamente. Estas diferencias están relacionadas a la presencia o ausencia de las

toxinas en regiones específicas y sobre la metodología utilizada. En los Estados

Unidos la FDA ha instalado solamente una legislación sobre las toxinas OA y DTX1,

mientras que no se han establecido aún rutinas de programas de monitoreo (Tabla

4) [60,114]. Las normas Canadienses solo mencionan niveles máximos para las

toxinas OA y DTX1 en glándulas digestivas (Tabla 4) [115]. En Japón, el nivel se ha

expresado en unidades de ratón (UR) lo cual es una forma común de expresar el

límite regulador cuando el bioensayo en ratones se aplica (Tabla 4) [114]. En

Australia y Nueva Zelanda , se ha establecido un límite regulatorio para las toxinas

OA y DTX1, DTX2 y DTX3 (Tabla 4) [116]. En Europa, la mayoría de los tipos de

toxinas marinas lipofílicas pueden encontrarse en moluscos y como resultado la

legislación de la Unión Europea contempla las toxinas OA, DTXs, PTXs, YTXs y AZAs

( Tabla 4).

Tabla 4. Niveles permitidos para toxinas marinas lipofílicas

3.2. Desarrollo de métodos alternativos

3.2.1. Ensayos In-vitro

Los ensayos funcionales actualmente están siendo desarrollados como alternativas

a los bioensayos. Los ensayos funcionales se basan en el modo toxicológico de

acción de un grupo de toxinas en un proceso biológico. Las ventajas de los ensayos

funcionales son su potencial para el rastreo de alto caudal, la detección de nuevas

toxinas, mientras que no es hay necesidad de aplicar valores de factor de

equivalencia tóxica. Aún pueden ocurrir falsos positivos o negativos debido a las

sustancias matrices presentes en el extracto o debido a activación metabólica. Es

extremadamente difícil desarrollar un ensayo funcional que comprenda todas las

toxinas lipofílicas en un solo ensayo. Hasta ahora, los ensayos funcionales se han

desarrollado para el grupo de toxinas OA, YTXs, PTXs y SPXs. Las toxinas del grupo

OA pueden determinarse por ensayos inhibidores de proteína fosfatasa 2A (PP2A)

utilizando detección fluorimétrica. Varios de estos ensayos se han publicado en los

últimos años [117-119]. En varios laboratorios se han obtenido buenas

correlaciones entre el bioensayo de ratones y el ensayo fluorimétrico de PP2A

[117,120]. Así mismo, se ha desarrollado un ensayo de citotoxicidad para el grupo

de toxinas OA y de PTXs basado en la despolimerización del filamento de actina en

una línea celular BE(2)-M17 de neuroblastoma [121]. Para las toxinas del grupo OA

y YTXs, se desarrolló un ensayo basado en la reducción de la adhesión célula-célula

en células MCF-7 y Caco-2 produciendo una acumulación de E-cadherina

[122,123]. También la toxina AZA1 mostró un efecto en la adhesión célula-célula y

el influjo E- caderina, pero estos resultados aún no han derivado en un formato

de ensayo funcional [88]. Desafortunadamente, en lo que respecta a las toxinas OA

y YTX la reproducibilidad del el ensayo era más bien pobre. Por lo tanto, el ensayo

debería hacerse más sólido previo a la rutina de aplicación. Recientemente, se ha

desarrollado un ensayo por inhibición de polarización de fluorescencia para

toxinas SPX. El ensayo utiliza membranas de receptor nicotínico de acetilcolina

enriquecido del Pez Raya eléctrico (Torpedo marmorata) y es capaz de analizar

mejillones contaminados con concentraciones de toxinas SPX en el rango de 70 a

700 mcg/kg [124]. De los ensayos funcionales desarrollados hasta ahora, los

resultados más prometedores se han obtenido con el ensayo PP2A para el grupo

de toxinas OA y con el ensayo de receptor nicotínico de acetilcolina para las

toxinas SPX. No obstante, aún falta una validación satisfactoria (individual e

interlaboratorio) de éstos métodos.

3.2.2. Métodos bioquímicos

En métodos inmunoquímicos se utilizan anticuerpos que muestran afinidad con

partes estructurales específicas de una toxina. A menudo también se pueden

detectar análogos de estas toxinas por medio de reactividad transversal, pero no

se ha ganado información sobre diferencias en toxicidad. Por lo tanto, métodos

tales como el ensayo por inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA) puede ser

solamente utilizado para examinar muestras de moluscos. Para algunos de los

grupos de toxinas marinas lipofílicas, se han desarrollado métodos

inmunoquímicos. Para el grupo de toxinas OA se ha transformado un ensayo ELISA

a un formato inmunocromatográfico de flujo lateral (LFI). La prueba de tiras

reactivas permite el análisis de las toxinas in situ sin la necesidad de utilizar

laboratorios [125]. En principio, esto podría habilitar a la industria de mariscos

para que lleven a cabo estas pruebas por sí mismos. Un estudio reciente sobre

estas pruebas de tiras reactivas demostró que un gran número relativo de

muestras (45%) fueron mal identificadas como positivas [126]. Se necesitan más

estudios para hacer que este formato LFI sea apropiado para propósitos de

monitoreo de rutina. Otros métodos bioquímicos que están actualmente bajo

desarrollo para el grupo de toxinas OA hacen uso de inmunosensores e inmuno-bio

sensores amperométricos utilizando la resonancia plasmónica de superficie

(RPS)[127,128]. Se ha desarrollado un ensayo ELISA sensible para YTX con una

buena correlación al método químico basado en cromatografía líquida y detección

de masa espectrométrica. Su rango de trabajo podría hacer que ELISA sea

apropiada para el monitoreo de rutina [129,130].La ventaja de este ensayo ELISA

para toxinas YTX es la reactividad transversal hacia varias de las toxinas análogas

de YTX [129], aunque no está claro si estos análogos son o no tóxicos. Otros

métodos bioquímicos prometedores para YTX son los biosensores basados en RPS,

un bioensayo de espejo resonante y polarización de fluorescencia [131-133].

Para las toxinas PTX, AZA y SPX no hay métodos bioquímicos disponibles aún. Los

resultados más prometedores se han obtenido con el ensayo ELISA para los grupos

de toxinas OA e YTX. Al ser prevista de una validación apropiada que se está

llevando a cabo, estos métodos bioquímicos de examinación pueden utilizarse

para análisis de elevados números de muestras de toxinas de moluscos.

3.2.3 Métodos químicos

En la década de 1980, los primeros métodos de detección química desarrollados

para las toxinas del grupo OA se basaron en cromatografía líquida (CL) pareada con

una detección fluorimétrica (CL- DFL). Como la mayoría de las toxinas marinas

lipofílicas carecen de cromóforas, se requirió de un paso de derivatización. Para

toxinas del grupo OA se ha utilizado 9-antrildiazometano (ADAM) [134] y para

toxinas PTX e YTX se ha utilizado

4-[2-(6.7dimetoxi-4-metil-3-oxo-3,4-dihidroquinoxalinil) etilo]-1,

2,4-triazolina-3,5-diona (DMEQ-TAD) como reactivos de derivatización [135,136].

Un importante desventaja de cromatografía líquida de detección de fluoración

(CL-DFL) es su selectividad limitada para las toxinas del grupo OA así como también

para las toxinas PTX e YTX. El paso de derivatización es un poco arduo y puede ser

crítico. No se han desarrollado métodos de CL-DFL para las toxinas AZA y SPX. Esto

probablemente se debe al hecho de que estas toxinas fueron descubiertas a

mediados de los años 90 cuando la Cromatorafía líquida con espectometría de

masas [CL-(EM)/EM] se volvió muy popular.

En los últimos años, se ha puesto mucho esfuerzo en el desarrollo de los métodos

de cromatografía líquida con espectometría de masas (CL-EM/EM) que están

dedicados a detectar clases específicas de toxinas marinas lipofílicas o a detectar

diferentes toxinas marinas lipofílicas como sea posible en un método de

multi-toxinas. Muchos de los métodos desarrollados para clases específicas de

toxinas marinas lipofílicas se enfocaron en la aclaración de la estructura o en el

descubrimiento de nuevas toxinas marinas lipofílicas. Por ejemplo, para el grupo

de toxinas OA las técnicas de CL-EM/EM han sido utilizadas para identificar nuevas

toxinas DTX [137-140]. Hasta ahora, alrededor de 40 toxinas diferentes

pertenecientes al grupo OA se han identificado utilizando el método CL-EM/EM

[140,141]. Varios métodos de CL-EM/EM se han desarrollado para detectar nuevas

toxinas (YTX y PTX) tanto en algas como en moluscos [71,77,142-145]. Además, el

método CL-SM/SM se ha utilizado para investigar la transformación de toxinas a

metabolitos. La conversión de toxinas YTX a 45-OH-YTX y 45-COOH-YTX y la

conversión de PTX2 a PTX2sa se ha estudiado por medio del método CL-EM/EM

[75, 78,146]. Otro método de CL-SM/SM se desarrolló para determinar hasta 24

tipos diferentes de toxinas AZA en un solo análisis [87]. Algunos métodos

dedicados se utilizaron para estudiar los procesos metabólicos que tienen lugar

cuando los mejillones contaminados con toxinas AZA se tratan con calor [147].

También, con la ayuda de los métodos CL-EM/EM , se han identificado nuevos

análogos de las toxinas SPX que se producen tanto en algas como en moluscos

[101,102].

La mayoría de los métodos descritos más arriba se utilizaron con propósitos de

estudio y no fueron pensados para programas de monitoreo. Hoy en día, varios

métodos CL-EM/EM están disponibles para determinar la mayoría o todas las

clases de toxinas pertenecientes a las toxinas marinas lipofílicas. Los primeros

métodos CL-EM/EM multi-toxinas para toxinas marinas lipofílicas se desarrollaron

en el año 2001 [148,149]. Desafortunadamente, uno de los métodos no incluye a

las toxinas YTX [148] mientras que el otro utilizó una muestra laboriosa en un

procedimiento de limpieza basado en una extracción líquido-líquido y en varios

procedimientos de fase de extracción sólida [149]. Por esta razón, estos métodos

no eran apropiados para programas de monitoreo de rutina. En el año 2005, se

desarrollaron dos nuevos métodos multi-toxinas, que incluían toxinas de todas las

clases reguladas de toxinas marinas lipofílicas en la Unión Europea [150,151]. Estos

métodos fueron validados internamente y se obtuvieron buenas características de

desempeño. Las desventajas fueron la exclusión de las espirólidas en uno de los

métodos [151] y unas cromatografías pobres para algunos de los componentes en

el otro método [150]. En el 2007, se llevó a cabo un método de cromatografía

líquida a una muy alta presión (CLMAP)-EM/ME. Con este método fue posible

analizar 21 toxinas marinas lipofílicas en solo 6,6 minutos [152]. Debería

mencionarse que la separación y la detección podrían solamente llevarse a cabo

por medio de la generación más nueva de equipos de métodos de CL y SM. Este

método (CLMAP)-EM/ME no ha sido validado aún. El método multi-toxina que se

ha llevado a cabo más recientemente fue publicado en el año 2009. Por una

elección diferente de condiciones de cromatografía, todos los problemas de

cromatografía se han resuelto y el método ha sido validado internamente [153].

Todas las toxinas marinas lipofílicas prominentes fueron incluidas en este método.

Actualmente, para este método se está preparando un estudio completamente

colaborativo de validación de acuerdo a guías internacionales.

4. Episodios de Eventos Tóxicos en Holanda (1960-2009)

En Holanda, hasta ahora solamente han sucedido episodios de DSP y los otros

síndromes tóxicos ( ASP y PSP) no han sido informados. Solo en el año 2002, una

muestra de molusco ha sido testeada positiva para ácido domoico (información no

publicada entregada por M. Poelman). Por consiguiente, esta mirada histórica solo

trata con el síndrome de DSP. Las primeras incidencias fuera de Holanda se

reportaron en Japón (1976 y 1977) [109].Los investigadores japoneses encontraron

Dinophysis fortii, el alga que producía esta toxina. Por lo tanto, la toxina se nombró

Dinofisistoxina y el síndrome de intoxicación se le llamó Intoxicación Diarreica por

molusco (DSP) [154]. En 1982, la estructura de la toxina causante, dinofisistoxina-1,

fue finalmente elucidada [155].

En Holanda, las primeras incidencias de envenenamiento asociado con el consumo

de mejillones se informó en Julio y Agosto de 1961 [65]. La gente que consumió

mejillones experimentó calambres abdominales, vómitos y diarrea severa. Al

mismo tiempo, en Scheldt del Este y en el mar Wadden se reportaron altas

concentraciones de dinoflagelados Proroentrum micans, P. triestinum, P. minimum

y Dinophysis acuminata. En los años siguientes, estas algas fueron aisladas del

tracto gastrointestinal (hepatopáncreas) de los mejillones. Siguiente a este

episodio, las intoxicaciones humanas volvieron a suceder en Holanda el año 1971

(mejillones de Scheldt del Este), 1976, 1979 (mejillones del mar de Wadden) y en

1981 ( mejillones de Scheldt del Este y del mar Wadden) [156-158]. En 1979, se

desarrolló un bioensayo en ratas para la detección de estas toxinas y para prevenir

la intoxicación humana [65] y este bioensayo en ratas se adoptó como el método

oficial de control para la detección de las toxinas causantes de diarrea en Holanda.

El programa de monitoreo para las toxinas de DSP en Holanda incluye un sistema

de alerta temprana y el análisis de pre-mercado de los moluscos en la presencia de

toxinas de ASP, PSP y DSP. El sistema de alera temprana monitorea las diferentes

algas potencialmente tóxicas en el agua marina. El bioensayo en ratas se utilizó

para testear si las especies P. micans y P. minimum eran las responsables de los

efectos adversos observados en 1961. Sin embargo, los mejillones contaminados

con cultivos de algas fueron dados a las ratas, pero no se observaron efectos

adversos [65]. Por consiguiente, permaneció en la duda si estas algas eran

responsables de la producción de toxinas. En 1981, se demostró que en Holanda,

el alga responsable de la producción de toxina en Scheldt del Este y en el mar

Wadden era la especie D. acuminata [159]. En 1986 y en 1987, las toxinas de DSP

fueron detectadas nuevamente en el mar Wadden, pero debido a un programa de

monitoreo establecido las áreas de moluscos estaban cerradas y no se reportaron

intoxicaciones humanas [160,161]. En octubre de 1989, un episodio menor de

toxicidad de DSP sucedió en el mar Wadden, y no se reportaron incidencias en

enfermedades humanas. El área de producción estuvo cerrada durante la

presencia de toxinas de DSP. En el año 2002, la especie D. acuminata causó la

presencia de toxinas DSP en mejillones del mar Wadden. Esto fue seguido por un

cierre del área de producción por varias semanas (información no publicada por M

Poelman). Por medio del método CL-SM, pudieron ser detectados bajos niveles de

toxinas en mejillones varias semanas antes que el bioensayo en ratas recogiera

niveles por sobre el límite regulatorio de la Unión Europea. En este caso, se

observó una intoxicación de pescadores locales, mientras que el bioensayo en

ratas detectó niveles de toxinas DSP después del cierre del área de pesca

(información no publicada por M. Poelman).

En el año 2005 y 2007, la presencia de D. acuminata en el mar Wadden detonó la

aplicación de un (tardío) programa de monitoreo utilizando el método CL-EM/EM.

Estos análisis mostraron la presencia de toxinas OA en mejillones a niveles muy por

debajo del límite regulatorio actual, en un rango desde 18 a 68 mcg de toxinas OA

equivalentes/kg por carne de molusco. La presencia de altos números de D.

acuminata propició el análisis de moluscos por medio del método CL-EM/EM de

nuevo en el año 2009. No se encontraron cantidades detectables de alguna toxina

DSP. Estos resultados y también aquellos obtenidos en ocasiones previas indican

que no hay una correlación clara entre las cuentas de algas potencialmente tóxicas

y los eventos tóxicos (Imagen 11). Respecto a la opinión de la EFSA hay algunas

concentraciones encontradas en el 2005 y 2007 que están por sobre la dosis aguda

de referencia de 45 mcg de toxinas OA equivalentes/kg de carne de molusco. Por

consiguiente, en caso de que la legislación cambie hacia el dictamen de la EFSA,

más muestras positivas se encontrarán en los Países Bajos. En general, en la última

década en los mariscos de las aguas holandesas sólo bajos niveles de equivalentes

de OA se han encontrado.

5. Conclusiones

Las floraciones de algas responsables de la producción de toxinas lipofílicas

ocurren muy a menudo dentro de aguas europeas. Finalmente, casi 50 años

después del primer evento de toxinas DSP en Holanda, los métodos químicos se

encuentran disponibles actualmente para la detección de todas las toxinas marinas

lipofílicas importantes en moluscos. Estos métodos pueden ayudar a decidir sobre

la clausura de áreas de cosecha de moluscos y para prevenir intoxicaciones. Debido

a cambios en el clima y el transporte de algas a través de aguas de lastre, futuras

floraciones y episodios tóxicos no se pueden descartar. Por lo tanto, debe

continuar el desarrollo de métodos y se deben mantener los programas de

monitoreo. Además, se está realizando un esfuerzo considerable por parte de

varios grupos de investigación europeos y de la Unión Europea por eliminar

gradualmente las pruebas en animales que aún se utilizan para los programas

oficiales de monitoreo de rutina.

AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer a Ir. H.P. van Egmond por las útiles sugerencias hechas en el

manuscrito.