Trabajar Con Proteinas-1
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TRABAJAR CON
PROTEÍNASTÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN
1º. ROTURA DE LAS CÉLULAS EXTRACTO CRUDO
2º.FRACCIONAMIENTO
3º. DIALISIS
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DIFERENCIAS EN LA CARGA,TAMAÑO Y AFINIDAD DE UNIÓN.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
EJEMPLO CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO
EXPLICACIÓN
FACTORES DE RESOLUCIÓN ( LONGITUD ,VELOCIDAD ,TIEMPO)
CONCLUSIÓN
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
(FILTRACIÓN GEL)
APROVECHA
MÉTODO
CONCLUSIÓN
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
APROVECHA
MÉTODO
HPLC BOMBAS DE ALTA PRESIÓN QUE ACELERAN EL PROCESO
MATERIALES DE MEJOR CALIDAD QUE SOPORTAN LA PRESIÓN
HPLC
ELECTROFORESIS
¿Para qué sirve?
Análisis de pureza
Determinación de la masa molecular de proteínas,
Verificación de la concentración de proteínas,
Detección de proteólisis e
Identificación de proteínas inmunoprecipitadas, para
Conocer el punto isoeléctrico,
El nº de cadenas polipeptídicas
Identificación y secuenciación de proteínas.
• Equipo necesario:
• Fuente de poder
• Cámara/cubeta: puede ser horizontal o vertical.
• 2 electrodos
Factores que influyen en la velocidad de migración:
Voltaje aplicado
La carga neta de la proteína
El tamaño y forma de la proteína
La porosidad del gel
Y la densidad, temperatura y fuerza iónica del medio
Preparación:
Tampón de carga:
Buffer
Gel
Fundamento de la técnica :Hacer pasar corriente por la celda Las biomoléculas empezaran a moverse El resultado son una serie de bandas
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELECTROFORESIS
• FUERZA IÓNICA DEL MEDIO Y CARGA NETA DE LA PROTEÍNA
• MASA MOLECULAR
• VOLTAJE
• POROSIDAD DEL GEL
• TIEMPO DE DURACIÓN
LECTURA DE RESULTADOS
Proteínas Colorantes orgánicos (rojo Ponceau y azul brillante de Coomassie)Ácidos nucléicos sustancias fluorescentes que aumentan la sensibilidad(Bromuro de etidio)
TÉCNICAS ESPECIALES
Isoelectroenfoque Electroforesis bidimensional Electroforesis de campo pulsante Electroforesis preparativa Inmunoelectroforesis Electroforesis capilar