TRABAJO FIN DE CARRERA

TRABAJO FIN DE CARRERATRABAJO FIN DE CARRERA

““CONTROL BIOLÓGICO DE CONTROL BIOLÓGICO DE Fusarium Fusarium

oxysporumoxysporum f. sp. f. sp. melonismelonis RAZA 1.2 CON RAZA 1.2 CON

ANTAGONISTAS”.ANTAGONISTAS”.

ALUMNA: ALUMNA: RAQUEL SOBRINO RUBIO.RAQUEL SOBRINO RUBIO.

DIRECTORES DEL PROYECTO:DIRECTORES DEL PROYECTO:

- Mª LUISA SORIANO MARTÍN- Mª LUISA SORIANO MARTÍN- ANDRÉS PORRAS PIEDRA- ANDRÉS PORRAS PIEDRA

FECHA DE PRESENTACIÓN: FECHA DE PRESENTACIÓN: MAYO 2005.MAYO 2005.

22

IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL CULTIVO DEL MELÓN

PRODUCCIÓNPRODUCCIÓN EN EN ESPAÑA DE 1 MILLÓN ESPAÑA DE 1 MILLÓN DE TONELADASDE TONELADAS

SUPERFICIE:SUPERFICIE:-75% CULTIVOS AL -75% CULTIVOS AL AIRE LIBREAIRE LIBRE-25% CULTIVOS -25% CULTIVOS PROTEGIDOSPROTEGIDOS

EN CLMEN CLM90% EN 90% EN CIUDAD REALCIUDAD REAL

33

INTRODUCCIÓN A LA FUSARIOSIS VASCULAR DEL MELÓN

condiciones de desarrollo ~20º C.

primeros trabajos sobre el estado sanitario

de los melonares de Levante y Murcia en

1976.

en 1985 se describe la micosis en cultivos

bajo plástico en Almería.

44

DIFICULTAD DE CONTROL DE LA FUSARIOSIS VASCULARFUSARIOSIS VASCULAR

enfermedad muy virulenta.

reducción de la producción hasta un

90% .

55

INTRODUCCIÓN AL CONTROL BIOLÓGICO

VENTAJASVENTAJAS

respetuoso con el medio respetuoso con el medio ambienteambiente

no existen problemas de no existen problemas de intoxicacionesintoxicaciones

no crea resistenciano crea resistencia

eliminación casi completa eliminación casi completa de la utilización de de la utilización de productos fitosanitariosproductos fitosanitarios

INCONVENIENTESINCONVENIENTES

ignorancia sobre su ignorancia sobre su utilizaciónutilización

falta de apoyo económicofalta de apoyo económico

falta de personal falta de personal especializadoespecializado

enemigos naturales enemigos naturales susceptibles a productos susceptibles a productos fitosanitariosfitosanitarios

66

INTRODUCCIÓN A LOS MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS

1. ocurre con frecuencia en la naturaleza.

2. interacción continua entre patógenos potenciales y sus antagonistas.

-equilibrio dinámico en la superficie del suelo-

3. microorganismos antagonistas:

- BACTERIAS: Bacillus y Pseudomonas

- HONGOS: Trichoderma y Micorrizas Arbusculares

77

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ANTAGONISTAS

Competencia:Competencia: debe existir “escasez” de un elemento. La debe existir “escasez” de un elemento. La competencia más común es por nutrientes, oxígeno o espacio.competencia más común es por nutrientes, oxígeno o espacio.

Interacción directa con el patógeno:Interacción directa con el patógeno:-Parasitismo: un microorganismo parasita a otro.-Parasitismo: un microorganismo parasita a otro.

- Predación: el antagonista se alimenta de materia orgánica - Predación: el antagonista se alimenta de materia orgánica entre la cual ocasionalmente se encuentra el patógeno.entre la cual ocasionalmente se encuentra el patógeno.

Antibiosis y lisis:Antibiosis y lisis: inhibición del crecimiento de un inhibición del crecimiento de un organismo por la acción de una sustancia producida por otro organismo por la acción de una sustancia producida por otro organismo.organismo.

88

OBJETIVOS

1. ESTUDIAR EL POSIBLE ANTAGONISMO FRENTE A 1. ESTUDIAR EL POSIBLE ANTAGONISMO FRENTE A FomFom

MEDIANTE ENFRENTAMIENTO DUAL MEDIANTE ENFRENTAMIENTO DUAL IN VITROIN VITRO

2. DETERMINAR LA EFICACIA DE LOS ORGANISMOS 2. DETERMINAR LA EFICACIA DE LOS ORGANISMOS

SELECCIONADOS EN EL SELECCIONADOS EN EL CONTROL BIOLÓGICOCONTROL BIOLÓGICO DE DE

FomFom RAZA 1.2 EN PLÁNTULAS DE MELÓNRAZA 1.2 EN PLÁNTULAS DE MELÓN

3. DETERMINAR LA EFICACIA DE LA COLONIZACIÓN DE 3. DETERMINAR LA EFICACIA DE LA COLONIZACIÓN DE

LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN CON LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN CON

MICORRIZAS VESÍCULO-ARBUSCULARESMICORRIZAS VESÍCULO-ARBUSCULARES EN EL EN EL

CONTROL BIOLÓGICO DE CONTROL BIOLÓGICO DE FomFom..

MATERIALES MATERIALES YY

MÉTODOS MÉTODOS

1010

ANTAGONISTAS UTILIZADOS EN EL CONTROL BIOLÓGICO

Trichoderma harzianum Trichoderma harzianum AspergillusAspergillus A5, A5, AspergillusAspergillus A8, A8, Aspergillus terreus, Aspergillus terreus,

Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceusAspergillus flavus, Aspergillus ochraceus Penicillum spPenicillum sp Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescensPseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilisBacillus subtilis

Fusarium oxysporumFusarium oxysporum no patogénicos no patogénicos Glomus mosseae, Glomus intraradices, Glomus Glomus mosseae, Glomus intraradices, Glomus

claroideumclaroideum

1111

MATERIAL VEGETAL Y PATÓGENO

SEMILLAS DE MELÓN DEL CULTIVAR SEMILLAS DE MELÓN DEL CULTIVAR AMARILLO CANARIOAMARILLO CANARIO F1 HÍBRIDO. F1 HÍBRIDO.

Fusarium oxysporumFusarium oxysporum f. sp. f. sp. melonismelonis RAZA 1.2 AISLADO CR 6801RAZA 1.2 AISLADO CR 6801

1212

PRODUCCIÓN DE INÓCULO DEL PATÓGENO

REPICADO DE REPICADO DE FomFom EN EN PDA.PDA.

- repicado del patógeno en - repicado del patógeno en placas de petri con PDA.placas de petri con PDA.

- estufa: 25- estufa: 252º C, 7 días.2º C, 7 días.

REPICADO DE REPICADO DE FomFom EN EN CPD.CPD.

-explante en matraz -explante en matraz erlenmeyer.erlenmeyer.

-agitador orbital (120 rpm), -agitador orbital (120 rpm), 25-27ºC, 16 horas luz, 6 25-27ºC, 16 horas luz, 6 días.días.

-filtrado del hongo.-filtrado del hongo.

-cuantificación de la -cuantificación de la densidad del inóculo.densidad del inóculo.

-ajuste de la concentración -ajuste de la concentración de inóculo.de inóculo.

1313

CULTIVO DUAL IN VITRO

CULTIVO DUALCULTIVO DUAL consiste en el enfrentamiento consiste en el enfrentamiento del patógeno y el antagonista en una placa de del patógeno y el antagonista en una placa de petri, analizando el crecimiento de ambos que se petri, analizando el crecimiento de ambos que se compara con el crecimiento individual de cada compara con el crecimiento individual de cada uno de ellos.uno de ellos.

SEPARACIÓNSEPARACIÓN::- 7 cm (HONGOS)- 7 cm (HONGOS)- 5 cm (BACTERIAS)- 5 cm (BACTERIAS)

ENSAYO:ENSAYO: 3 PLACAS DE PETRI, 4 REPETICIONES 3 PLACAS DE PETRI, 4 REPETICIONES TESTIGOS DE PATÓGENOTESTIGOS DE PATÓGENO

TESTIGOS DE ANTAGONISTATESTIGOS DE ANTAGONISTA

1414

CULTIVO DUAL DE Fom Raza 1.2 CULTIVO DUAL DE Fom Raza 1.2 CON CON Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum

pequeña cantidad del preparado de pequeña cantidad del preparado de T. T.

harzianumharzianum con pinzas esterilizadas en con pinzas esterilizadas en

una placa de petri con PDA. una placa de petri con PDA.

enfrentamiento de explantes de 5 mm de enfrentamiento de explantes de 5 mm de

diámetro de diámetro de FomFom y y T. harzianum.T. harzianum.

placa de petri en estufa (27ºC).placa de petri en estufa (27ºC).

mediciones del diámetro de las colonias mediciones del diámetro de las colonias

cada 48 horas.cada 48 horas.

1515

CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON AspergillusAspergillus A5, A5, AspergillusAspergillus A8 y A8 y

PenicillumPenicillum sp. sp.

repicado de los hongos de la placa original repicado de los hongos de la placa original en PDA.en PDA.

enfrentamiento de explantes de 5 mm de enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de diámetro de FomFom con con Aspergillus Aspergillus yy Penicillum.Penicillum.

placa de petri en estufa (27ºC).placa de petri en estufa (27ºC). mediciones del diámetro de las colonias mediciones del diámetro de las colonias

cada 48 horas.cada 48 horas.

1616

CULTIVO DUAL DE FomCULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 RAZA 1.2 CON CON Aspergillus terreus, A. flavus Aspergillus terreus, A. flavus yy A. A.

ochraceus.ochraceus.

recuperación de los hongos recuperación de los hongos liofilizados.liofilizados.

enfrentamiento de explantes de 5 enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de mm de diámetro de FomFom y y Aspergillus.Aspergillus.

placa de petri en estufa (27ºC).placa de petri en estufa (27ºC). mediciones del diámetro de las mediciones del diámetro de las

colonias cada 48 horas.colonias cada 48 horas.

1717

CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON Pseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescens y y

Pseudomonas putida.Pseudomonas putida.

1. recuperación de las bacterias liofilizadas.1. recuperación de las bacterias liofilizadas.

2. ensayo en: PDA y AGAR NUTRITIVO2. ensayo en: PDA y AGAR NUTRITIVO

3. enfrentamiento de explantes de 5 mm de 3. enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de diámetro de FomFom y y Pseudomonas Pseudomonas en Agar en Agar Nutritivo (separación de 5 cm).Nutritivo (separación de 5 cm).

4. placa de petri en estufa (27ºC)4. placa de petri en estufa (27ºC)

5. mediciones del diámetro de las colonias cada 5. mediciones del diámetro de las colonias cada 48 horas48 horas

1818

CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON CON Bacillus subtilis.Bacillus subtilis.

ENSAYO EN PDAENSAYO EN PDA

- ENFRENTAMIENTO DE - ENFRENTAMIENTO DE

EXPLANTES DE 5 mm DE EXPLANTES DE 5 mm DE

DIÁMETRO DE DIÁMETRO DE FomFom Y Y Bacillus Bacillus

subtilis subtilis EN PDA (SEPARACIÓN EN PDA (SEPARACIÓN

DE 5 CM).DE 5 CM).

- PLACA DE PETRI EN ESTUFA - PLACA DE PETRI EN ESTUFA

(27ºC)(27ºC)

- MEDICIONES DEL DIÁMETRO - MEDICIONES DEL DIÁMETRO

DE LAS COLONIAS CADA 48 DE LAS COLONIAS CADA 48

HORAS.HORAS.

ENSAYO CONTENIENDO EXUDADO DE ENSAYO CONTENIENDO EXUDADO DE

Bacillus subtilis.Bacillus subtilis.

- ENSAYO CON EXUDADOS DE ENSAYO CON EXUDADOS DE Bacillus Bacillus

subtilis.subtilis.

- 5 EXPLANTES DE 5 mm.- 5 EXPLANTES DE 5 mm.

- MATRAZ ERLENMEYER CON CPD.- MATRAZ ERLENMEYER CON CPD.

- AGITADOR ORBITAL (120 rpm, 7 DÍAS, - AGITADOR ORBITAL (120 rpm, 7 DÍAS,

TOTAL OSCURIDAD, TEMPERATURA TOTAL OSCURIDAD, TEMPERATURA

AMBIENTE).AMBIENTE).

- COMPROBACIÓN DEL CRECIMIENTO.COMPROBACIÓN DEL CRECIMIENTO.

- SE AÑADE AGAR.SE AÑADE AGAR.

- EXPLANTE DE EXPLANTE DE Fom.Fom.

- COMPROBACIÓN DEL DIÁMETRO DE LA COMPROBACIÓN DEL DIÁMETRO DE LA

COLONIA DE FOM CADA 48 HORAS.COLONIA DE FOM CADA 48 HORAS.

1919

CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON Fo NO PATOGÉNICOCON Fo NO PATOGÉNICO

repicado de los hongos de la placa original repicado de los hongos de la placa original en PDAen PDA

enfrentamiento de explantes de 5 mm de enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de diámetro de FomFom con con FoFo NO PATOGÉNICONO PATOGÉNICO..

placa de petri en estufa (27ºC)placa de petri en estufa (27ºC) mediciones del diámetro de las colonias mediciones del diámetro de las colonias

cada 48 horascada 48 horas

CONTROL BIOLÓGICO CONTROL BIOLÓGICO IN VIVOIN VIVO

2121

PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE Trichoderma Trichoderma harzianumharzianum

DETERMINACIÓN DE LA DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DE INÓCULO DEL DENSIDAD DE INÓCULO DEL

PREPARADO COMERCIALPREPARADO COMERCIAL

““MÉTODO DE LAS MÉTODO DE LAS DILUCIONES”DILUCIONES”

- PDA CON NYSTANINA AL 1%.PDA CON NYSTANINA AL 1%.- DILUCIÓN DEL PREPARADO DILUCIÓN DEL PREPARADO

COMERCIAL EN 9 ml DE AGUA.COMERCIAL EN 9 ml DE AGUA.- DILUCIONES EN 6 VIALES.DILUCIONES EN 6 VIALES.- PLACAS DE PETRI EN ESTUFA (27ºC)PLACAS DE PETRI EN ESTUFA (27ºC)- OBSERVACIÓN DE PLACAS CADA 12 OBSERVACIÓN DE PLACAS CADA 12

HORAS.HORAS.

2222

PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE AspergillusAspergillus A5 A5 repicado del hongo en PDA en placa de petri con repicado del hongo en PDA en placa de petri con

PDA (7 días,25-27ºC, oscuridad)PDA (7 días,25-27ºC, oscuridad)

repicado del hongo en CPDrepicado del hongo en CPD- 5 explantes de 5mm de diámetro en matraz de - 5 explantes de 5mm de diámetro en matraz de CPDCPD- agitador orbital 120 rpm en cámara de - agitador orbital 120 rpm en cámara de crecimiento (6 días, 25-27ºC, 16 horas de luz)crecimiento (6 días, 25-27ºC, 16 horas de luz)

filtrado del hongofiltrado del hongo

cuantificación de la densidad de inóculocuantificación de la densidad de inóculo

ajuste de la concentración de inóculoajuste de la concentración de inóculo

2323

GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE MELÓN

germinación en placas de petrigerminación en placas de petri- capa de vermiculita- capa de vermiculita- disco papel secante esterilizado- disco papel secante esterilizado- semillas- semillas- disco de papel secante esterilizado- disco de papel secante esterilizado

cámara de crecimiento (3 días, 25-27ºC, cámara de crecimiento (3 días, 25-27ºC, 16 horas luz)16 horas luz)

plantación en vasos de plástico plantación en vasos de plástico perforados en la base o bandejas de perforados en la base o bandejas de alvéolosalvéolos

Etiquetan y enumeran con el Etiquetan y enumeran con el antagonista utilizado.antagonista utilizado.

cámara de crecimiento (12 días)cámara de crecimiento (12 días)

2424

APLICACIÓN DE LOS ANTAGONISTAS APLICACIÓN DE LOS ANTAGONISTAS AL SUBSTRATOAL SUBSTRATO

CADA ENSAYO:CADA ENSAYO:

- 40 plántulas (4 repeticiones de 10 plántulas cada - 40 plántulas (4 repeticiones de 10 plántulas cada una)una)

- 10 plántulas testigos antagonistas - 10 plántulas testigos antagonistas (control +)(control +)

- 10 plántulas testigo con inóculo del patógeno- 10 plántulas testigo con inóculo del patógeno

(control -)(control -)

- 10 plántulas testigo sin tratar - 10 plántulas testigo sin tratar (control (control ))

SUBTRATO ESTÉRIL Y SUBTRATO NO ESTÉRILSUBTRATO ESTÉRIL Y SUBTRATO NO ESTÉRIL

2525

SUBSTRATOSUBSTRATO

El El substrato estérilsubstrato estéril se utiliza para observar el se utiliza para observar el comportamiento de los microorganismos comportamiento de los microorganismos antagonistas y Fom sin que se encuentre antagonistas y Fom sin que se encuentre sometido a la acción de otros microorganismos sometido a la acción de otros microorganismos que se puedan hallar en el substrato (bacterias, que se puedan hallar en el substrato (bacterias, hongos, etc.).hongos, etc.).

Los ensayos en Los ensayos en substrato no estérilsubstrato no estéril se realizan se realizan para observar el comportamiento de los para observar el comportamiento de los microorganismos antagonistas y Fom en las microorganismos antagonistas y Fom en las condiciones en las que se encontrarían las condiciones en las que se encontrarían las plántulas de melón en el invernadero.plántulas de melón en el invernadero.

2626

TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON Trichoderma harzianum

Ensayos:Ensayos:a) dosis 55 gr/kg de a) dosis 55 gr/kg de substratosubstratob) dosis 27.5 gr/kg de b) dosis 27.5 gr/kg de substratosubstrato

Mezclar de forma Mezclar de forma homogéneahomogénea

Vasos de plástico Vasos de plástico perforadosperforados

Bandejas de alvéolosBandejas de alvéolos Semilla germinada de Semilla germinada de

melónmelón Cámara de crecimientoCámara de crecimiento

2727

TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON Aspergillus A5

Suspensión conídica Suspensión conídica concentración 10concentración 1077 conidias/mlconidias/ml

En 100 ml de En 100 ml de substrato se añaden substrato se añaden 10 ml de suspensión 10 ml de suspensión conídicaconídica

Mezcla homogéneaMezcla homogénea Semilla germinada de Semilla germinada de

melónmelón Cámara de Cámara de

crecimientocrecimiento

2828

TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON MICORRIZAS

En 150 ml de En 150 ml de substrato se añade substrato se añade una cucharilla de una cucharilla de café rasa del café rasa del preparado preparado micorrízicomicorrízico

Semilla de melón Semilla de melón germinadagerminada

Cámara de Cámara de crecimientocrecimiento

2929

INOCULACIÓN DE LAS PLÁNTULAS DE INOCULACIÓN DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN CON EL PATÓGENOMELÓN CON EL PATÓGENO

Suspensión de 5 x 10Suspensión de 5 x 1055 conidias/ml de conidias/ml de FomFom Raza 1.2 Raza 1.2

Se añaden 10 ml de suspensión a Se añaden 10 ml de suspensión a cada vaso que contiene las plántulas cada vaso que contiene las plántulas de melón.de melón.

Cámara de crecimientoCámara de crecimiento

3030

REAISLAMIENTO DEL REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDA.PATÓGENO EN PDA.

REAISLAMIENTO REAISLAMIENTO siembra en PDA de siembra en PDA de fragmentos de raíz, fragmentos de raíz, cuello y tallo cuello y tallo (desinfestados) para (desinfestados) para comprobar si el comprobar si el patógeno ha sido patógeno ha sido capaz de colonizar el capaz de colonizar el sistema vascular de sistema vascular de las plantas tratadas las plantas tratadas con antagonistas e con antagonistas e inoculadas con Fominoculadas con Fom

3131

CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON

MICORRIZAS ARBUSCULARES.MICORRIZAS ARBUSCULARES.

A los 30 días del tratamiento.A los 30 días del tratamiento. 3 plantas por ensayo3 plantas por ensayo Lavado de raícesLavado de raíces Fragmentos de 2-3 cmFragmentos de 2-3 cm Decoloración de raíces con KOH Decoloración de raíces con KOH

al 10%, temperatura ambienteal 10%, temperatura ambiente Lavado y acidificación con CLH Lavado y acidificación con CLH

0.1N durante 30 minutos.0.1N durante 30 minutos. Tinción con Azul Tripán (4 horas)Tinción con Azul Tripán (4 horas) Intervalos de 15 min, lavado con Intervalos de 15 min, lavado con

aguaagua Colocación de fragmentos en un Colocación de fragmentos en un

porta-objetos de forma paralelaporta-objetos de forma paralela

Con el microscopio se realizan observaciones verticales en el porta-objetos tomando como referencia una distancia constante de 0.2 mm, y se anotan en 100 intersecciones si están o no micorrizadas.

3232

EVALUACIÓN DE LA INCIDENCIA Y SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD

ESCALA DE SEVERIDADESCALA DE SEVERIDAD

00 0% PLANTA SANA 0% PLANTA SANA

11 0-10% SÍNTOMAS LEVES 0-10% SÍNTOMAS LEVES

22 10-50% SÍNTOMAS 10-50% SÍNTOMAS SEVEROS SEVEROS

33 50-75% SÍNTOMAS MUY 50-75% SÍNTOMAS MUY SEVEROS SEVEROS

44 >75% PLANTA MUERTA >75% PLANTA MUERTA

RESULTADOSRESULTADOS

3434

1. RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO 1. RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO DUAL DUAL IN VITROIN VITRO

Finalización del ensayo:Finalización del ensayo:

- Unión física entre las colonias de Unión física entre las colonias de antagonista y patógenoantagonista y patógeno

- Halo de separación constante Halo de separación constante durante varias medicionesdurante varias mediciones

3535

RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO DUAL DUAL IN VITROIN VITRO

Halo de inhibición entre el patógeno y Aspergillus A5

3636

DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DE DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DE INÓCULO DEL PREPARADO COMERCIAL INÓCULO DEL PREPARADO COMERCIAL

DE DE Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum

conteo a las 48 horas de conteo a las 48 horas de realizarse las dilucionesrealizarse las diluciones

- incontables- incontables

- placas dilución -6 - placas dilución -6 contablescontables

resultado total 16.6 x 10resultado total 16.6 x 1077 u.f.c en el paquete original u.f.c en el paquete original de de Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum

3737

RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Nº DE DÍAS DESPUÉS DE LA INOCULACIÓN

ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD

Trichoderma harzianum Testigo Fom

Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 55 g/kg substrato estéril.

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN

ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD


Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 55 g/Kg substrato no estéril.

3838


0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD


Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 55 g/kg substrato estéril

(transplante).

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD


Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/kg substrato estéril.

3939


0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Nº DE DÍAS DESPUES DE LA INOCULACIÓN

ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD

Trichoderma harzianum Tesigo Fom

Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/Kg substrato no estéril.

Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/Kg substrato estéril, transplante.

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Nº DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN

ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD


4040


0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD

Aspergillus A-5 Testigo Fom

Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Aspergillus A-5.

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD

Glomus mosseae Testigo Fom

Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Glomus mosseae.

4141


0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD

Glomus intraradices Testigo Fom

Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como

antagonista Glomus intraradices

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


ÍND

ICE

DE

SE

VE

RID

AD

Glomus claroideum Testigo Fom

Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como

antagonista Glomus claroideum.

4242

RESULTADO DEL REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDA

En todas las pruebas de aislamiento se dio En todas las pruebas de aislamiento se dio positivopositivo en cuanto a infestación de las plantas por en cuanto a infestación de las plantas por Fusarium Fusarium oxysporumoxysporum f. sp. f. sp. Melonis.Melonis.

Reaislamiento del patógeno en PDA de plantas tratadas con Glomus intraradices

Reaislamiento del patógeno de planta tratada con Trichoderma harzianum utilizando la

dosis recomendada (substrato no estéril)

4343

REAISLAMIENTO DEL REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDAPATÓGENO EN PDA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

R C TB TM TA

55 gr/kg (SE) 55 gr/kg (SNE) 27,5 gr/kr (SE) 27,5 gr/kg (SNE)

Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes de plantas tratadas con distintas dosis de Trichoderma harzianum, en substrato estéril (SE) y no estéril (SNE), procedentes de explantes de raíz (R), cuello (C), tallo bajo (TB), tallo medio (TM) y tallo alto (TA).

4444

REAISLAMIENTO DEL REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDAPATÓGENO EN PDA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

R C TB TM TA

Glomus mosseae Glomus intraradices Glomus claroideum

Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes de plantas tratadas con Micorrizas Arbusculares, en sustrato estéril (SE), procedentes de explantes de raíz (R), cuello (C), tallo bajo (TB), tallo medio (TM) y tallo alto (TA).

4545

3.3. RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A.PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A.

Los porcentajes de raíz Los porcentajes de raíz micorrizada obtenidos micorrizada obtenidos son los siguientes:son los siguientes:

- - Glomus intraradicesGlomus intraradices: : 10’12 %10’12 %

- - Glomus mosseaeGlomus mosseae: 10’41 : 10’41 %%

- - Glomus claroideumGlomus claroideum: : 10’23 %10’23 %

Resultado del cálculo del porcentaje de micorrización de las raíces de las plántulas de melón tratadas con micorrizas.

0

5

10

15

20

PO

RC

EN

TA

JE D

E

MIC

OR

RIZ

AC

IÓN

Glomus mosseae Glomus intraradices Glomus claroideum

4646

RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS

PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A.PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A.

Observación de la micorriza por el microscopio, donde se aprecian vesículas dentro de la raíz.

4747

4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Comparativa de las diferentes Comparativa de las diferentes curvas de progreso de la curvas de progreso de la enfermedadenfermedad de los ensayos realizados de los ensayos realizados

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


ÍND

ICE

DE

S

EV

ER

IDA

D

Trichoderma harzianum 55 g/kg Substrato estéril

Trichoderma harzianum 55 g/kg Substrato no estéril

Trichoderma harzianum 55g/kg de substrato( transplante)

Trichoderma harzianum 27,5 g/kg Substrato estéril

Trichoderma harzianum 27,5g/kg de substrato no estéril

Trichoderma harzianum 27,5 g/kg Substrato estéril (transplante)

Aspergillus spp. Substrato estéril

Glomus mosseae Substrato estéril

Glomus intraradices Substrato estéril

Glomus Claroideum Substrato estéril

Testigos de Fusarium oxysporum f. sp. melonis ( substrato estéril)

4848

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

En los diferentes ensayos realizados, se ha En los diferentes ensayos realizados, se ha podido observar que las plántulas de melón podido observar que las plántulas de melón tratadas con tratadas con Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum (55 gr/kg (55 gr/kg substrato estéril) y substrato estéril) y Glomus claroideumGlomus claroideum, han , han conseguido retardar el proceso de infección del conseguido retardar el proceso de infección del patógeno Fom raza 1.2 en 8 días, siendo la media patógeno Fom raza 1.2 en 8 días, siendo la media de los demás ensayos de 5,8 días.de los demás ensayos de 5,8 días.

Se ha comprobado de igual forma que tras el Se ha comprobado de igual forma que tras el reaislamiento del patógeno en PDA en todos los reaislamiento del patógeno en PDA en todos los ensayos realizados, éste se ha desplazado de ensayos realizados, éste se ha desplazado de forma sistémica por toda la plántula produciendo forma sistémica por toda la plántula produciendo la muerte.la muerte.

4949

5. RESULTADO DEL ANÁLISIS 5. RESULTADO DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICOESTADÍSTICO

ANOVA Table: En los ensayos realizados ANOVA Table: En los ensayos realizados no hubo diferencias significativas entre las no hubo diferencias significativas entre las variables, con un 95% de nivel de variables, con un 95% de nivel de confianza.confianza.

MULTIPLE RANGE TESTS: En los ensayos MULTIPLE RANGE TESTS: En los ensayos realizados no hubo diferencias realizados no hubo diferencias significativas entre los pares de datos, con significativas entre los pares de datos, con un 95% de nivel de confianza.un 95% de nivel de confianza.

5050

CONCLUSIONES

Los microorganismos que han resultado demostrar Los microorganismos que han resultado demostrar su eficacia antagonista ante el patógeno su eficacia antagonista ante el patógeno Fusarium Fusarium oxysporumoxysporum f. sp. f. sp. melonismelonis raza 1.2 en el control raza 1.2 en el control biológico biológico in vitroin vitro tras realizarse los experimentos tras realizarse los experimentos han sido: han sido: Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum y y AspergillusAspergillus A-5. A-5.

En los ensayos realizados, se ha comprobado que la En los ensayos realizados, se ha comprobado que la inoculación con inoculación con Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum (empleando la dosis de 55 gr/kg como 27.5 gr/kg) (empleando la dosis de 55 gr/kg como 27.5 gr/kg) estimuló el crecimiento de las plántulas de melón.estimuló el crecimiento de las plántulas de melón.

5151

CONCLUSIONES Ningún hongo o bacteria que se ha utilizado en Ningún hongo o bacteria que se ha utilizado en

este proyecto ha dado como resultado un control este proyecto ha dado como resultado un control total de total de Fusarium oxysporumFusarium oxysporum f. sp. f. sp. melonismelonis, si , si bien se ha demostrado que los hongos bien se ha demostrado que los hongos Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum (dosis 55 gr/Kg de (dosis 55 gr/Kg de substrato estéril) y substrato estéril) y Glomus claroideumGlomus claroideum ha ha retardado la aparición de los síntomas del hongo retardado la aparición de los síntomas del hongo patógeno sobre las plántulas que se han tratado.patógeno sobre las plántulas que se han tratado.

Los porcentajes de micorrización de las raíces de Los porcentajes de micorrización de las raíces de las plántulas de melón tratadas con Micorrizas las plántulas de melón tratadas con Micorrizas Arbusculares (MA) han sido bajos, alrededor de Arbusculares (MA) han sido bajos, alrededor de un 10 %, debido a esto su eficacia como un 10 %, debido a esto su eficacia como microorganismo antagonista no ha sido efectivomicroorganismo antagonista no ha sido efectivo

FINAL FINAL PRESENTACIÓNPRESENTACIÓN

TRABAJO FIN DE CARRERA

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