TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adiciónde tipo S-michael sobre una deshidroalanina quiral

Ismael Compañón Pérez

MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA

Tutores: Alberto Avenoza Aznar y Jesús Héctor Busto SanciriánFacultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Curso 2011-2012

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012

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Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adición de tipo S-michael sobre unadeshidroalanina quiral, trabajo fin de estudios

de Ismael Compañón Pérez, dirigido por Alberto Avenoza Aznar y Jesús Héctor BustoSancirián (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los

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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA Grupo de Síntesis Química de La Rioja U.A. – C.S.I.C.

SÍNTESIS DE CISTEÍNAS GLICOSILADAS MEDIANTE ADICIÓN DE TIPO S-MICHAEL SOBRE UNA DESHIDROALANINA QUIRAL

Trabajo de investigación. Proyecto fin de Máster.

Ismael Compañón Pérez

Junio 2012

ALBERTO AVENOZA AZNAR, Catedrático de Química Orgánica del Departamento de Química de la Universidad de La Rioja y JESÚS HÉCTOR BUSTO SANCIRIÁN, Profesor Titular de Universidad del Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.

HACEN CONSTAR:

Que la memoria " Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adición de tipo S-Michael sobre una deshidroalanina quiral." ha sido realizada por el Licenciado ISMAEL COMPAÑÓN PÉREZ en el Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 30 créditos ECTS correspondientes al período de investigación del Trabajo fin de Máster.

Logroño, Junio 2012

Fdo.: Alberto Avenoza Aznar Fdo.: Jesús Héctor Busto Sancirián

A mis padres, por su comprensión y apoyo en todo momento A mi hermana, por su cariño y paciencia.

A mi familia y amigos, por estar ahí.

Han pasado ya más de dos años desde que formo parte de este grupo y a lo largo de este periodo ha habido buenos y mejores momentos y por ello antes de entrar en el contenido de esta memoria, me gustaría agradecer el apoyo prestado a todos aquellos que me han acompañado:

A Alberto y Héctor, mis directores, a los cuales les estaré

eternamente agradecido por haber permitido formar parte de este grupo; a Pere, Marimar y Paco, muchas gracias por todo cuánto me habéis enseñado durante la carrera y por haber estado ahí en todos los momentos en los que he dudado; a Fer, mi primer “jefe” durante las tuteladas, gracias por haberme inculcado el espíritu trabajador que tienes en el laboratorio; a Javi, que aunque no he compartido mucho tiempo contigo, no me puedo olvidar de esos bailes las noches de fiesta; a Charlie, “jefe” no hay palabras para agradecer el apoyo incondicional que me has prestado todo este año, no sé qué hubiera sido de mi sin tu ayuda; a Eva, siempre dispuesta a gastar de su tiempo para dárselo a los demás; a Lara, al principio en el laboratorio y más tarde en el despacho, una indispensable compañera; a Nuria, qué sería del laboratorio sin sus devaneos de cabeza a la hora de pedir material; a Víctor S., que nos anima a todos con su buen humor; a Víctor R., indispensable en el laboratorio por su organización y también en el despacho por su paciencia; a Iván, por muchísimas cosas pero sobre todo por enseñarme a manejar el carro, cuanto tiempo he ganado gracias a ello; a Mada, siempre dispuesto a pasárselo bien; a Claudio y Laura, mis compañeros de master y grupo, por aguantarme en general.

No me olvido de mis vecinos fotoquímicos, Anselmo, Alegría, Héctor y Marina con los que también he compartido muy buenos momentos.

Y por supuesto que tampoco me olvido de mi amigo y compañero

Justo, han sido muchos años dando guerra con nuestras discusiones sobre química, dentro y fuera de la universidad, y espero que sean muchos más.

Por último, pero no menos importante, agradecer al resto de gente de los otras áreas por todos los momentos compartidos durante este tiempo.

También me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la ayuda económica aportada para la realización de este trabajo:

Ministerio de Educación y Ciencia, por la aportación económica al proyecto CTQ2009-13814/BQU.

Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y tecnológico idóneo para el desarrollo de este trabajo.

ÍNDICE

Abreviaturas I

1. Introducción 1

2. Antecedentes y objetivos 11

3. Discusión de resultados 21

4. Conclusiones 29

5. Experimental 33

6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 45

Abreviaturas

desplazamiento químico 1H RMN resonancia magnética nuclear de protón

13C RMN resonancia magnética nuçclear de carbono-13

Ac acetilo Ac2O anhídrido acético AcOEt acetato de etilo Boc terc-butoxicarbonilo Boc2O dicarbonato de di-terc-butilo tBu terc-butilo BuOH butanol c concentración (g/100 mL) Cbz benciloxicarbonilo COSY COrrelated SpectroscopY d doblete DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida dd doblete de dobletes DIEA diisopropiletilamina Et etilo EtOH etanol Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo Fmoc·OSu succinimida de N-(9-Fluorenilmetoxicarbonilo) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence J constante de acoplamiento m multiplete Me metilo MeOH metanol MeONa metóxido de sodio mmol milimol NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY R sustituyente alquilo o arilo Rdt rendimiento RMN resonancia magnética nuclear

s singlete, ázucar (del inglés, sugar) SPPS solid-phase peptide synthesis t triplete, tiempo TBTU tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N´,N´-

tetrametiluronio TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano TMS trimetilsililo, tetrametilsilano

1.- Introducción

3 Introducción

1-I��������I��

Las modificaciones post-traduccionales de proteínas son cambios químicos ocurridos tras la síntesis proteica. Las modificaciones post-traduccionales más comunes en la naturaleza son llevadas a cabo con diversos fines como la incorporación de grupos hidrófobos para su anclaje en la membrana celular, adición de cofactores para la mejora de la actividad enzimática1, glicosilaciones para el reconocimiento celular, etc.

Además de las modificaciones post-traduccionales ocurridas de manera

natural2a-b se pueden incluir las utilizadas por los científicos como la incorporación de sondas fluorescentes o radioactivas, que permiten el seguimiento de la proteína en tiempo real. El logro de la modificación selectiva está a menudo lleno de dificultades, un único residuo debe reaccionar con preferencia entre cientos de cadenas laterales, por lo que es necesario el uso de una síntesis química muy selectiva. (Figura 1.1)

�i�ur� 1.1. Modificaciones post-traduccionales

1 Qi, D.; Tann, C.-M.; Haring, D.; Distefano, M. D. Chem. Rev. ���1, 101, 3081–3111. 2 (a) de Graaf, A. J.; Kooijman, M.; Hennink,W. E.; Mastrobattista, E. Bioconjugate Chem. ����, 20, 1281–1295. (d) Ohta, A.; Yamagishi, Y.; Suga, H. Curr. Opin. Chem. Biol. ����, 12, 159–167. (c) Johnson, J. A.; Lu, Y. Y.; Van Deventer, J. A.; Tirrell, D. A. Curr. Opin. Chem. Biol. ��1�, 14, 774–780. (b) Xie, J.; Schultz, P. G. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. ����, 7, 775–782.

4 Introducción

De los aminoácidos naturales, la cisteína es uno de los más convenientes a la hora de ralizar estas modificaciones debido a su alta nucleofília, siendo un objetivo clásico para la reacción selectiva con electrófilos3. Es fácil de introducir en un sitio de interés mediante mutagénesis y su abundancia natural relativamente baja permite la preparación de mutaciones selectivas de cisteína.

Además de las modificaciones post-traduccionalaes basadas en la química de los aminoácidos naturales como la cisteína existen otras estrategias de marcado basadas en la incorporación de aminoácidos no naturales y su posterior modificación bio-ortogonal4.

Como se ha mencionado anteriormente la cisteína es un aminoácido

fácilmente modificable gracias a su elevada nucleofilia3. En primer lugar se describió el uso de la cisteína como un precursor de puentes disulfuro, pudiéndose generar estos puentes de manera selectiva. Además se han utilizado rutas no clásicas de modificación de la cisteína, como la conversión de los puentes disulfuro a tioéteres y la conversión de la cisteína a deshidroalanina para la incorporación de nuclelófilos azufrados y formar también tioéteres de interés.

En este sentido la generación de glicoproteínas mediante la

formación de puentes disulfuro es crítica a la hora de generar modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Trivialmente la mezcla de una proteína que contiene un residuo de cisteína junto con un tiol genera mezclas de puentes disulfuro tras la oxidación con aire. Bajo estas condiciones pueden aparecer productos no deseados. Sin embargo reactivos como el metanotiosulfonato (MTS)5, 6, feniltiosulfonato (PTS),7 o el sulfuro de fenilselenio (SeS)8 reaccionan rápida y específicamente con la cisteína 3 Chalker, J.M.; Bernardes, G. J. L.; Lin, Y. A.; Davis, B. G. Chem. Asian J. ����, 4, 630–640. 4 Slotten, E. M.; Bertozzi, C.R. Acc. Chem. Res. ��11, 44, 666–676. 5 Davis, B. G.; Lloyd, R. C.; Jones, J. B. J. Org. Chem. 1���, 63, 9614–9615. 6 Davis, B. G.; Maughan, M. A. T.; Green, M. P.; Ullman, A.; Jones, J. B. Tetrahedron Asymmetry ����, 11, 245–262. 7 Gamblin, D. P.; Garnier, P.; Ward, S. J.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G. Org. Biomol. Chem. ����, 1, 3642–3644. 8 Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. Angew. Chem. Int. Ed. ����, 43, 828–833.

5 Introducción

para formar puentes disulfuro casi de manera instantánea y por ello es fácil llevar a cabo la generación de productos de control cinético sin necesidad de utilizar grandes excesos de reactivos. (Figura 1.2)

�i�ur� 1.�. Modificación post-traduccional por formación de puentes

disulfuro.

Esta química ha sido utilizada por ejemplo para la generación de dendriglicoproteinas9 capaces de neutralizar patógenos tras su adhesión,10 también se ha empleado para la glicosilación de proteínas con sacáridos complejos (heptasacáridos) e incluso se han podido generar puentes trisulfuro.11

La facilidad y la utilidad de la formación de puentes disulfuro inspiró

un método para la tionación directa de alcoholes utilizando el reactivo de Lawesson, que ha permitido la incorporación de carbohidratos más complejos. (Figura 1.3)

9 Davis, B. G. Chem. Commun. ���1, 351– 352. 10 Rendle, P. M.; Seger, A.; Rodrigues, J.; Oldham, N. J.; Bott, R. R.; Jones, J. B.; Cowan, M. M.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. ����, 126, 4750–4751. 11 Bernardes, G. J. L.; Marston, J. P.; Batsanov, A. S.; Howard, J. A. K.; Davis, B. G. Chem. Commun. ����, 3145–3147.

6 Introducción

�i�ur� 1.�. Utilización del reactivo de Lawesson.

Aunque hay muchos métodos para la síntesis de tioglicósidos, la

mayoría de ellos requieren en gran medida métodos de protección de grupos.12 Como gran ventaja, la conversión de azúcares reductores a tioglicoles mediante la utilización del reactivo de Lawesson no requiere la intervención de estos grupos protectores13 y permite la utilización directa de azúcares aislados de fuentes naturales y su posterior unión a la proteína.12

Como hemos visto los puentes disulfuro pueden llegar a ser lábiles

bajo condiciones reductoras. Cuando la modificación anclada es crítica para la función específica de la proteína, se hace esencial un enlace estable. Mediante el uso de fosfinas ricas en electrones como la HMPT se puede aprovechar esa labilidad del puente disulfuro para generar el correspondiente tioéter,13 con aumento de la estabilidad química y resistencia enzimática.14 (Figura 1.4)

12 Pachamuthu, K.; Schmidt, R. R. Chem. Rev. ����, 106, 160–187. 13 Bernardes, G. J. L.; Gamblin, D. P.; Davis, B. G. Angew. Chem. Int. Ed. ����, 45, 4007–4011. 14 (a) Galonic D. P.; van der Donk, W.A.; Gin, D. Y. Chem. –Eur. J., ����, 9, 5997–6006. (b) Zhu, X,; Pachamuthu, K.; Schmidt, R.R. J. Org. Chem., ����, 68, 5641. (c) Pachamuthu, K.; Schmidt, R.R. Chem. Rev., ����, 106, 160–187. (d) Comegna, D.; De Riccardis, F. Org. Lett. ����, 11, 3898–3901.

7 Introducción

�i�ur� 1.�. Formación de un tioéter.

El mecanismo parece implicar al correspondiente derivado de deshidroalanina, que se genera mediante el ataque de la fosfina sobre el azufre de la cisteína y la posterior eliminación del ión tiofosfonio genera la aparición del derivado de deshidroalanina. La adición del tiol liberado sobre la deshidroalanina15 generada proporciona el tioéter. (Figura 1.5)

�i�ur� 1.�. Generación y desaparición de deshidroalanina.

Viendo los estudios mecanísticos de la formación de tioéteres

mediante el procedimiento anteriormente mencionado surgió la idea de la utilización de deshidroalanina para la obtención de estos derivados. Con el fin de llevar a cabo este propósito se desarrolló un método para la obtención de deshidroalanina a partir de cisteína.

El tratamiento con O-mesitilsulfonilhidroxilamina (MSH) consiguió

que la cisteína eliminara rápidamente para generar deshidroalanina.15 La

15 Bernardes, G. J. L.; Grayson, E. J.; Thompson, S.; Chalker, J. M.; Errey, J. C.; El Oualid, F.; Claridge, T. D. W.; Davis, B. G. Angew. Chem. Int. Ed. ����, 47, 2244–2247.

8 Introducción

posterior adición de tioglicoles generó la aparición de los derivados deseados. (Figura 1.6)

�i�ur� 1.�. Generación de tioéteres a partir de deshidroalanina.

Como se puede observar el uso de deshidroalanina como sustrato proporciona una vía muy útil para generar un amplio rango de modificaciones post-traduccionales.16 Sin embargo, esta metodología no proporciona control sobre el nuevo centro estereogénico creado, proporcionando mezclas diasteroméricas.

Por otro lado, la resistencia antibiótica es un problema importante en

la sociedad actual. Esta resistencia aparece de manera natural debida a mutaciones surgidas al azar. En aquellas bacterias en las que surja una mutación que les permita sobrevivir se reproducirán, trasmitiendo de esta manera la información genética necesaria para producir esa resistencia.

El abuso de los antibióticos en la sociedad actual es sin duda una de las causas más influyentes en esta resistencia antibiótica, pues impone una nueva presión evolutiva en organismos que tienen un tiempo de vida generacional muy corto (unos 20 minutos) y una tasa de mutación de 1 en 10 millones. Esto quiere decir que en apenas unos pocos años estas

16 Bernardes, G. J. L.; Chalker, J. M.; Errey, J. C.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. ����, 130, 5052–5053.

9 Introducción

mutaciones pueden hacer que la bacteria codifique la síntesis de proteínas que le ayuden a soportar estos antibióticos.

La manera que tenemos de combatir este problema es el desarrollo de antibióticos de nueva generación. Una de las familias de antibióticos que se está estudiando en la actualidad son las bactericinas. Se trata de antibióticos de naturaleza peptídica eficaces contra bacterias Gram positivas.

En este contexto, el acoplamiento de residuos deshidrogenados, como la deshidroalanina, a cisteínas da como resultado la formación de las denominadas lantioninas, las cuáles son aminoácidos con un puente tioéter.17 Las lantioninas son conocidas principalmente por su presencia en antibióticos que contienen estas estructuras y se denominan lantibióticos. Los lantibióticos pertenecen a la clase I de bacteriocinas y son antibióticos peptídicos de aproximadamente 20-40 residuos, activos fundamentalmente frente a bacterias Gram positivas.

Nuestro grupo de investigación tiene experiencia en la síntesis de

lantionina (Lan), a través de nuevos sintones quirales de deshidroalanina y en la síntesis de derivados como la metilnorlantionina (MeLan) mediante la apertura selectiva de sulfamidatos cuaternarios18.

En el último año, de forma independiente, dos grupos han mostrado la S-glicosilación en péptidos bacterianos que actúan como bacteriocinas19. Estos descubrimientos sugieren que la S-glicosilación se encuentra de manera natural y además está mucho más extendida de lo que se pensaba.

17 Moll, G.N.; Kuipers, A.; Rink, R. Antonie Leeuwenhoek ��1�, 97, 319–333. 18 (a) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Peregrina, J. M. Org. Lett. ����, 8, 2855–2858. (b) Aydillo, C.; Avenoza, A.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. Org. Lett. ��1�, 14, 334–337. 19 (a) Oman, T. J.; Boettcher, J. M; Wang, H.; Okalibe, X. N.; van der Donk, W. A. Nat. Chem. Biol. ��11, 7, 78–80. (b) Wang, H.; van der Donk, W. A. J. Am. Chem. Soc. ��11, 133, 16394–16397. (c) Katayama, H.; Asahina, Y.; Hojo, H. J. Pept. Sci. ��11, 17, 818–821. (d) Stepper, J.; Shastri, S.; Loo, T. S.; Preston, J. C.; Novak, P.; Man, P.; Moore, C. H.; Havlicek, V.; Patchett, M. L.; Norris, G. E. FEBS Lett. ��11, 585, 645–650. (e) Venugopal, H.; Edwards, P. J. B.; Schwalbe, M.; Claridge, J. K.; Libich, D. S.; Stepper, J.; Loo, T.; Patchett. M. L.; Norris, G. E.; Pascal, S. M. Biochemistry ��11, 50, 2748–2755.

10 Introducción

Por un lado el Profesor van der Donk y colaboradores han presentado el descubrimiento de la S-glicosilación en un péptido antimicrobiano producido por el Bacillus subtilis 168 y llamado sublancina19a-c. Dicha glicosilación está localizada en el residuo Cys22 y el carbohidrato es la β-glucosa. La S-glicosilación es requerida, según muestran los bioensayos, para la actividad antimicrobiana del péptido y esta actividad, se mantiene con el cambio de otras hexosas por la glucosa. Todas estas características, sugieren que la glicosilación en Cys22 puede constituir una inusual clase de auto-resistencia. (Figura 1.7)

�i�ur� 1.�. Fragmento de la secuencia de sublancina con la glucosa unida

a la cisteína.

En un segundo estudio, el Profesor Norris y colaboradores encontraron que el glicopéptido gliocina F tiene un carbohidrato, la β-N-acetilglucosamina (β-GlcNAc) unido a un residuo de Cys43.19d-e También en este caso la glicosilación de la cisteína contribuye al aumento de actividad antimicrobiana aunque parece no ser imprescindible. (Figura 1.8)

�i�ur� 1.�. Fragmento de la secuencia de gliocina F con una β-N-

acetilglucosamina unida a la cisteína.

�.-�nt�c�d�nt�� � ����ti�o�

13 Antecedentes y Objetivos

Una de las opciones propuestas para la síntesis de péptidos glicosilados es la estrategia denominada “Fmoc-strategy solid phase peptide synthesis” (Fmoc -SPPS). Esta estrategia de síntesis peptídica requiere la utilización como “building blocks” de aminoácidos glicosilados cuyo grupo amino está protegido por el grupo Fmoc. En este apartado veremos los métodos más comunes para la obtención de tio-glicoaminoácidos con algún ejemplo seleccionado para cada uno. S-���ui��ción d�� tio� �no��rico

Una de las metodologías más comunes consiste en una alquilación de tiocarbohidratos empleando como electrófilos derivados halogenados de aminoácidos convenientemente protegidos.1

Asi utilizando β-bromoalaninas y γ-bromoalaninas en presencia de del tiol, hidrogenosulfato de tetra-n-butilamonio y NaHCO3 con acetato de etilo como disolvente se obtienen los correspondientes tioglicopéptidos con buenos rendimientos y sin producir racemización2. (Figura 2.1)

�i�ur��.1

1 Monsigny, M. L. P.; Vaculik, D. D. M. Carbohydr. Res. 1���, 59, 589–593. 2 Zhu, X.; Schmidt, R. R. Tetrahedron Lett. ����, 44, 6603–6067.

14 Antecedentes y Objetivos

Wong y colaboradores3 modificaron esta metodología generando el tiolato in situ y adicionando el derivado de bromoalanina posteriormente sin generar la β-eliminación de ésta. (Figura 2.2)

�i�ur� �.� Halcomb4,5 y colaboradores describen otra estrategia para la alquilación utilizando sulfamidatos cíclicos como electrófilos. Consiste en la pregeneración de sulfamidatos cíclicos, los cuales reaccionan con el 1-tioazucar, que tras posterior hidrólisis ácida proporcionan el glicosilaminoácido con excelentes rendimientos. (Figura 2.3)

3 Thayer, D. A.; Yu, H. N.; Galan, M. C.; Wong, C.-H. Angew. Chem., Int. Ed. ����, 44, 4596–4599. 4 Cohen, S. B.; Halcomb, R. L. J. Am. Chem. Soc. ����, 124, 2534–2543. 5 Cohen, S. B.; Halcomb, R. L. Org. Lett. ���1, 3, 405–407.

15 Antecedentes y Objetivos

�i�ur� �.�

Esta estrategia también se ha desarrollado para la síntesis en fase sólida uniendo el sulfamidato del aminoácido a una resina de poliestireno modificada y así elevando el rendimiento de la reacción. Este método está limitado a monosacáridos debido a que la etapa de escisión de la resina se realiza con un ácido fuerte lo que conlleva la ruptura de los enlaces O-glicosídicos de los polisacáridos. ���cción d� � ic���� �ntr� d�ri��do� d� d���idro���nin� �uir���� � �-�uc��ó�i�o�

Otra de las metodologías más empleadas consiste en emplear como electrófilos derivadodos de deshidroalanina generados in-situ efectuando reacciones tio-Michael sobre ellos. Sin embargo, muchos de estos ejemplos carecen de control sobre el nuevo centro estereogénico creado.6 (Figura 2.4)

�i�ur� �.�

6 Pachamuthu, K.; Schmidt, R. R. Chem. Rev. ����, 106, 160–187

16 Antecedentes y Objetivos

En este contexto, recientemente en nuestro grupo de investigación se ha desarrollado un método para la obtención de alquil derivados de cisteína mediante el empleo de la reacción de Michael sobre derivados quirales de deshidroalanina7 como el compuesto 1. Esta es una manera muy efectiva de obtención de estos derivados debido a la elevada diasteroselectividad que presenta esta reacción.

En primer lugar se había probado esta reacción con S-alquil derivados a 0 ºC y DBU viéndose la aparición de los dos diasteromeros posibles.

Debido a ello se llevó a cabo la reacción disminuyendo la

temperatura hasta los -78 ºC con el motivo de imponer condiciones cinéticas. De esta manera solo se apreció por RMN la aparición de uno de los dos diasterómeros posibles. (Figura 2.5)

�i�ur� �.�

7 Aydillo, C.; Avenoza, A.; Busto, J.H.; Jimenez-Osés, G.; Peregrina, J.M.; Zurbano, M.M. Org. Lett. ��1�, 14, 334–337.

17 Antecedentes y Objetivos

Además del ataque con los tioles mostrados anteriormente, también se consiguió realizar esta adición empleando 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosa.8 La configuración del nuevo centro estereogenico se determinó por comparación con trabajos anteriores. (Figura 2.6)

�i�ur� �.�

�-.�����I���

En el siguiente trabajo se pretenden escalar las reacciones de adición de Michael de tioglucósidos al derivado de deshidroalanina 1 para la obtención del tiogliciominoacido �, debido a que en trabajos anteriores se han llevado a cabo en muy pequeñas cantidades.

8 Tesis de Carlos Aydillo Miguel ��11

18 Antecedentes y Objetivos

Puesto que únicamente se ha descrito con anterioridad la adición de la 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosa a este tipo de derivados, uno de los objetivos es también el de llevar a cabo esta reacción con los glucósidos 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-galactopiranosa, N-Cbz-3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucosamina y 4-O-β-Tetra-O-acetil-D-galactopiranosil-Tri-O-acetil-D-glucupiranosa-1’’-β-tio).

Por último se procederá a la derivatización del producto de adición

de la 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosa con el fin de conseguir el tioglicopéptido modelo con los extremos amida para posteriores estudios conformacionales. Ademas la obtención del “building block”, convenientemente protegido, para su incorporación en la síntesis en fase sólida, permitirá su inclusión en diferentes cadenas glicopeptídicas

�.- �i�cu�ión d� r��u�t�do�

21 Discusión de resultados

�.1 ��nt��i� d�� �roducto d� ��rtid� La síntesis del derivado de deshidroalanina 1 se llevó a cabo siguiendo la metodología que ya se había empleado anteriormente en nuestro grupo de investigación. A partir de (S)-serina comercial se obtiene (S)-N-Boc-serinato de metilo, al que se adicionó 2,2,3,3-tetrametoxibutano en presencia de ácido p-toluensulfónico como catalizador a reflujo de tolueno.1 De esta forma se obtiene el N,O-acetalbiciclico con buen rendimiento. A partir de él se pudo obtener el deshidroalinato quiral 1, con excelente rendimiento, por tratamiento con la base KHDMS. (Figura 3.1).

�i�ur� �.1 �.� ���ccion�� d� tio-� ic���� �o�r� �� d�ri��do d� d���idro���nin�

Una vez que se llevó a cabo la síntesis del precursor 1 se pasó a ensayar la reacción de adición conjugada con diferentes tioglicósidos. Teniendo en cuenta la experiencia de nuestro grupo, las condiciones iniciales elegidas fueron emplear atmósfera de argón a -78 ºC y THF como disolvente, con el fin de poder mantener un control cinético de la reacción y asi obtener un exceso diasteromérico elevado.

De esta forma se repitió la adición conjugada de la tetra-O-acetil-1-

tio-β-D-glucosa sobre el deshidroalinato, anteriormente descrita en nuestro grupo de investigación. Dicha reacción se había realizado partiendo de 32 mg del compuesto 1 en presencia de DBU obteniendo un 86% de rendimiento del producto de tio-Michael. El proceso transcurre con 1 Aydillo, C., Jiménez- Oses, G., Busto, J. H., Peregrina, J. M., Zurbano, M. M., Avenoza, A. Chem. Eur. J. ����, 13, 4840–4848

22 Discusión de resultados

excelente diasteroselectividad, detectando un solo diasterómero en el que el nuevo centro quiral generado posee la configuración (S)2. Así para un primer objetivo de este trabajo nos propusimos optimizar esta reacción empleando una mayor cantidad del producto de partida. De esta forma y empleando 200 mg del deshidroalinato 1 se pudo obtener 312 mg (63%) del producto de ataque tio-Michael. El exceso diasteromérico se conserva observándose un único producto por 1H RMN, (Figura 3.2). El rendimiento disminuye pero la escala utilizada permite obtener la cantidad necesaria de compuesto para realizar las posteriores transformaciones.

�i�ur� �.� Animados por los excelentes resultados obtenidos tras la reacción

anteriormente descrita, se planteó realizar esta adición conjugada con diferentes tio-β-glucósidos, con el fin de ver si se mantenía el elevado exceso diasteromérico además de tener acceso a nuevos glicoconjugados. Así se probó la reacción de Michael con la tetra-O-acetil-1-tio-β-D-galactosa. (Figura 3.3)

Con una cantidad del compuesto 1 de (200 mg) se emplearon las mismas condiciones utilizadas anteriormente, para el compuesto �. En este caso el rendimiento obtenido fue del 82% y al igual que en el caso anterior se comprobó la elevada diastereoselectividad de esta reacción al no observarse el otro diasterómero por 1H RMN.

2 Tesis de Carlos Aydillo Miguel ��11

�i�ur� �.�

23 Discusión de resultados

El siguiente objetivo fue llevar a cabo la adición de un aminoglucósido, en concreto la N-Cbz-tri-O-acetil-1-β-tio-D-glucosamina previamente sintetizada.3 (Figura 3.4)

�i�ur� �.�

En ese caso el rendimiento obtenido fue del 56%, algo menor que en

los casos anteriores, sin embargo el exceso diasteromérico siguió siendo muy elevado al no observarse ningún otro isómero por 1H RMN. Posiblemente, la desprotonación del grupo amida haga disminuir la eficacia catalítica de la DBU.

Por último se planteó la adición de un glucósido de mayor tamaño, la

S-(2,3,4,6-tera-O-acetil-β-D-glgalactopiranosil-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetil-β-

D-glucopiranosa). (Figura 3.5)

�i�ur� �.�

Empleando las mismas condiciones y partiendo de 200 mg del

compuesto 1, el rendimiento obtenido en este caso fue del 78% y una vez más fue éste el único diasterómero detectado con la técnica de 1H RMN. (Figura 3.6)

3 Tesis de Gonzalo Jiménez Osés ����

24 Discusión de resultados

�i�ur� �.� �.� ��nt��i� d� �� di��id� �od��o

A la hora de estudiar las conformaciones espaciales que adoptan los aminoácidos glicosilados en disolución acuosa lo correcto es acercarnos lo más posible a la situación real. En la naturaleza los aminoácidos se unen entre sí para formar péptidos, esta unión se realiza a través de los conocidos enlaces peptídicos de tipo amida, tanto por el extremo del grupo carboxilo como por el extremo del grupo amino.

Con el fin de emular esta situación, una aproximación acertada es la

de derivatizar nuestro aminoácido, generando una metilamida en el extremo carboxilo y acetilando el grupo amino. Con ese propósito se planteó la formación de la diamida de la cisteína glucosilada. (Figura 3.7)

25 Discusión de resultados

�i�ur� �.�

Así lo primero fue obtener el aminoácido desprotegido, algo que ya

se había conseguido con anterioridad en nuestro grupo de investigación pero en pequeña escala. La desprotección se llevó a cabo mediante hidrólisis ácida con HCl (6 N) a 60 ºC en agua durante 8 horas. (Figura 3.8)

�i�ur� �.�

El rendimiento para la obtención del clorhidrato � tras la etapa de

desprotección fue elevado, en concreto del 95%. La etapa de purificación consistió en lavar el crudo disuelto en agua con acetato de etilo. No se observó epimerización del aminoácido y el valor del poder óptico rotatorio coincide con el descrito previamente por nuestro grupo de investigación y que confirma la configuración (S) del nuevo centro estereogénico creado.

Lo siguiente fue proteger el grupo amino con el grupo Fmoc, para

ello se hizo reaccionar el producto � con Fmoc-OSu en medio básico y una mezcla de CH3CN/H2O (2:1) como disolvente durante 72 horas (Figura 3.9). El compuesto se utilizó en la siguiente reacción sin mayor purificación.

�i�ur� �.�

26 Discusión de resultados

Con el objetivo de obtener el éster terc-butílico del compuesto �, se disolvió éste en diclorometano y se añadió a una mezcla de DCC, tBuOH, y CuCl que previamente se había dejado con agitación a temperatura ambiente en atmosfera de argón durante 5 días. Esta mezcla se dejó 4 horas con agitación bajo atmosfera de argón, se filtró en una placa porosa y se evaporó el filtrado obteniéndose un crudo que contenía el producto de esterificación.

Debido a la difícil purificación de este intermedio, se siguió adelante

con el crudo, suponiendo el rendimiento teórico del 100%. Con el fin de proteger los grupos hidroxilo del tioglicósido en forma de acetatos se añadió el crudo anterior a una mezcla Ac2O/Py (1:2) reaccionando con agitación durante 2 horas y dando como resultado el producto � previa eliminación del disolvente. (Figura 3.10)

�i�ur� �.1�

De esta forma hemos accedido al tio-glicoaminoácido

ortogonalmente protegido y preparado para su incorporación en síntesis peptídica, tanto en disolución como en fase sólida. Con el glicoaminoácido ortogonalmente protegido se procedió a la formación de las amidas.

27 Discusión de resultados

El crudo anterior se disolvió en CH2Cl2 y se añadió TFA dejando la mezcla con agitación durante 1 h. Se evaporó el disolvente a vacío obteniendo un sólido amarillento correspondiente a la desprotección del éster terc-butílico. En un matraz se disolvió el crudo anterior junto con TBTU y tamiz molecular adicionando DIEA. Pasados 5 minutos con agitación se añadió NH2Me·HCl y se dejó reaccionar durante 8 h. El producto se purificó parcialmente por columna cromatográfica en gel de sílice obteniéndose el compuesto 1� como un sólido blanco. (Figura 3.11)

�i�ur� �.11

El producto anterior se disolvió en CH3CN y se añadió piperidina manteniendo la agitación durante 2.5 horas para desproteger el grupo amino. El crudo obtenido se trató con Ac2O/Py (1:2) consiguiendo acetilar fácilmente la amina recientemente desprotegida. Con el fin de desproteger los grupos hidroxilo de la glucosa, se disolvió el producto anterior en MeOH y se añadió MeONa/MeOH (0.5 M). Por último se utilizó la resina de intercambio iónico Dowex-H+ para neutralizar la base anteriormente añadida sin generar sales en el medio. El crudo anterior se purificó por columna cromatrográfica en gel de sílice obteniéndose el producto �. (Figura 3.12)

28 Discusión de resultados

Figura 3.12

�.� �����u�i����

31 Conclusiones

Se ha conseguido escalar las reacción de adición conjugada de Michael de 1-β-tioglucosa al derivado de deshidroalanina 1 obteniéndose 327 mg del compuesto 2.

Se ha llevado a cabo con éxito la síntesis de tres productos de adición conjugada de Michael sobre ese mismo derivado 1� observándose en todos los casos un solo diastereoisómero confirmando la alta selectividad del proceso.

32 Conclusiones

Se ha conseguido la obtención del derivado glucosilado de cisteína �

en cantidad suficiente (475 mg) para obtener la diamida correspondiente �, que será objeto de posteriores estudios conformacionales.

�.� �ar�� ����ri����a�

35 Parte experimental

Los espectros de RMN 1H y 13C se realizaron en un espectrómetro

Bruker Avance-400, los desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados CD3Cl, con TMS como referencia interna, y D2O.

Los análisis de espectrometría de masas por ionización electrospray

(ESI-MS) se realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode, ionización ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.

La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel

(Polichrom SI F254) sobre soporte de poliéster o aluminio y para su visualización se utilizó luz ultravioleta y revelador de ácido fosfomolíbdico en etanol.

La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-

0.06 mm (230-400 mesh). Todas las reacciones se llevaron a cabo empleando disolventes

secos. Dichos disolventes se purificaron y secaron utilizando técnicas estándar.

36 Parte experimental

� ����� g���ra� �� a�i�i�� ����uga�a 1�� �� �i���� ���r� el α,β�����i�r�a�i����i�� �uira�

El α,β-deshidroaminoácido (1 eq.) es introducido en un schlenk disuelto en THF seco (~ 10 mg de α,β-deshidroaminoácido/mL de THF) bajo atmósfera de argón. La disolución es enfriada a –78 ºC y agitada. El correspondiente tiol (1.2 eq.) es introducido en el schlenk. Seguidamente se adiciona DBU (1.1 eq.) lentamente. La reacción es seguida mediante cromatografía de capa fina y cuando se ve la desaparición de todo el α,β-deshidroaminoácido, se para con disolución saturada de NH4Cl (el mismo volumen que de THF). La mezcla se calienta hasta temperatura ambiente mientras se agita vigorosamente. El crudo se diluye en éter dietílico y la fase acuosa se extrae con más éter (3x20 ml). Las fases orgánicas se juntan, se lavan con disolución saturada de NaCl y se secan con Na2SO4 anhidro. El disolvente es evaporado y el crudo purificado por columna cromatográfica en gel de sílice para dar el correspondiente producto de adición de Michael.

37 Parte experimental

�S��3�����ra�O�a���i����g�u���ira���a�1’’�β��i���2�((4’S,5’R��4’��i�r��i�5’������i�4’,5’��i���i��2’������a���i�i��3’�i����r��a��a�� �� ���i�� �2�

A través del método general de adición

de Michael, partiendo de 1 (200 mg, 0.82 mmol), 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosa (327 mg, 0.90 mmol) y DBU (136 μL, 0.89 mmol) y después de 2 horas de reacción se obtuvo el compuesto 2. El crudo fue

purificado por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt, 1:1) para dar 2, como un sólido blanco (312 mg, �3� ).

= – 34.5 (c 1.03, CHCl3) HRMS ESI+ (m/z) = 632.1626 [M+Na+]; calculado C24H35NO15SNa+ = 632.1620 1H NMR (400 MHz, CDCl3) (ppm) 1.40 (s, 3H; CH3), 1.57 (s, 3H; CH3), 1.99 (s, 3H; Ac), 2.02 (s, 3H; Ac), 2.04 (s, 3H; Ac), 2.04 (s, 3H; Ac), 3.31 (dd, J = 5.3, 14.3 Hz, 1H; CHCH2), 3.43 (s, 3H; OCH3), 3.49 – 3.62 (m, 1H; CHCH2), 3.76 (s, 3H; CO2CH3), 3.70 – 3.78 (m, 1H; CHGlc), 4.08 – 4.19 (m, 2H; CH2Glc), 4.19 – 4.29 (m, 1H; CHCH2), 4.64 (d, J = 10.1 Hz, 1H; CHGlc), 4.95 – 5.09 (m, 2H; CHGlc), 5.21 (t, J = 9.3 Hz, 1H; CHGlc) 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (ppm) 15.6 (CH3), 19.8 (CH3), 20.5, 20.5, 20.6, 20.6 (Ac), 30.7 (CHCH2), 50.8 (OCH3), 52.9 (CO2CH3), 55.8 (CHCH2), 62.0 (CH2Glc), 68.0, 70.0, 73.4, 76.2, 84.9 (CHGlc), 90.0 (CNCH3OH), 108.4 (CCH3OCH3), 154.5 (NCO2), 169.3, 169.4, 169.4, 170.0 (Ac), 170.4 (CO2CH3)

38 Parte experimental

�S��3�����ra�O�a���i����ga�a����ira���a�1’’�β��i���2�((4’S,5’R��4’��i�r��i�5’������i�4’,5’��i���i��2’������a���i�i��3’�i����r��a��a�� �� ���i�� �3�

A través del método general de adición

de Michael, partiendo de 1 (200 mg, 0.82 mmol), 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-galactopiranosa

(327 mg, 0.82 mmol) y DBU (136 μL, 0.89 mmol) y después de 2 horas de reacción se obtuvo el compuesto 3. El crudo fue purificado

por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt, 1:1) para dar 3, como un solido blanco (406 mg, �2� ). P.F. = 64.2 - 66.2 ºC

= – 24.6 (c 1.00, CHCl3) HRMS ESI+ (m/z) = 632.1606 [M+Na+]; calculado C24H35NO15SNa+ = 632.1620 1H NMR (400 MHz, CDCl3) (ppm) 1.43 (s, 3H; CH3), 1.59 (s, 3H; CH3), 1.99 (s, 3H; Ac), 2.04 (s, 3H; Ac), 2.07 (s, 3H; Ac), 2.18 (s, 3H; Ac), 3.36 (dd, J = 5.0, 14.8 Hz, 1H; CHCH2), 3.44 (s, 3H; OCH3), 3.53 – 3.59 (m, 1H; CHCH2), 3.71 (s, 1H; OH), 3.77 (s, 3H; CO2CH3), 3.98 (t, J = 6.31 Hz, 1H; H5-Gal), 4.07 – 4.17 (m, 2H; H6-Gal), 4.21 – 4.25 (m, 1H; CHCH2), 4.59 (d, J = 9.9 Hz, 1H; H4-Gal), 5.03 – 5.06 (m, 1H; H2-Gal), 5.24 (t, J = 9.9 Hz, 1H; H3-Gal), 5.43 (d, J =3.2 Hz, 1H; H1-Gal) 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (ppm) 15.6 (CH3), 19.9 (CH3), 20.6, 20.7, 20.7, 20.8 (Ac), 30.3 (CHCH2), 50.9 (OCH3), 53.0 (CO2CH3), 56.0 (CHCH2), 61.9 (C6-

Gal), 67.1(C3-Gal), 67.3(C1-Gal), 71.7(C2-Gal), 75.2(C5-Gal), 85.0 (C4-Gal), 90.2 (CNCH3OH), 108.6 (CCH3OCH3), 154.6 (NCO2), 169.5, 169.7, 170.1, 170.4 (Ac), 170.4 (CO2CH3)

39 Parte experimental

�S��3��N�����i���i�ar���i��3������ri�O�a���i����g�u���a�i�a�1’’�β��i���2�((4’S,5’R��4’��i�r��i�5’������i�4’,5’��i���i��2’������a���i�i��3’�i����r��a��a�� �� ���i�� ���

A través del método general de adición de Michael, partiendo de 1 (22 mg, 0.09 mmol),

N-Cbz-3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucosamina (45 mg, 0.1 mmol) y DBU (15 μL, 0.1 mmol) y después de 2 horas de reacción se obtuvo el compuesto �. El crudo fue purificado

por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt, 1:1) para dar �, como un sólido blanco (36 mg, 0.05 mmol, ��� ). P.F. = 68.4 - 70.4 ºC

= – 27.4 (c 1.00, CHCl3) HRMS ESI+ (m/z) = 723.2037 [M+Na+]; calculado C30H40N2O15SNa+ = 723.2042 1H NMR (400 MHz, CDCl3) (ppm) 1.40 (s, 3H; CH3), 1.59 (s, 3H; CH3), 1.93 (s, 3H; Ac), 2.02 (s, 3H; Ac), 2.06 (s, 3H; Ac), 3.31 (dd, J = 4.5, 14.9 Hz, 1H; CHCH2), 3.44 (s, 3H; OCH3), 3.63 – 3.72 (m, 3H; CHCH2; CH5-Glc; CH4-Glc), 3.76 (s, 3H; CO2CH3), 4.10 – 4.23 (m, 2H; H6-Glc), 4.28 (d, J = 6.1 Hz, 1H; CHCH2), 4.84 (d, J = 10.00 Hz, 1H; H1-Glc), 4.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H; NHCbz) 5.01 – 5.13 (m, 3H; CH2-Glc; OCH2Ph), 5.20 (d, J = 9.2 Hz, 1H; CH3-Glc), 7.29 – 7.43 (m, 5H; OCH2Ph) 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (ppm) 15.7 (CH3), 19.9 (CH3), 20.6, 20.7, 20.7 (Ac), 30.8 (CHCH2), 51.0 (OCH3), 53.1 (CO2CH3), 55.6 (CHCH2), 56.0 (C4-Glc), 62.3 (C6-Glc), (68.5C2-Glc), 73.2(C3-Glc), 76.3(C5-Glc), 86.0 (C1-Glc), 90.3 (CNCH3OH), 108.6 (CCH3OCH3), 128.2, 128.4, 128.7 (Ph), 154.8 (NCO2), 155.9 (NCO2Bn), 169.6, 169.6, 170.7 (Ac), 170.8 (CO2CH3)

40 Parte experimental

�S��3������β����ra�O�a���i����ga�a����ira���i���ri���a���i����g�u���ira���a�1’’�β��i���2�((4’S,5’R��4’��i�r��i�5’������i�4’,5’��i���i��2’������a���i�i��3’�i����r��a��a�� �� ���i�� ���

A través del método general de

adición de Michael, partiendo de 1 (200 mg, 0.82 mmol), 4-O-β-Tetra-O-

acetil-D-galactopiranosil-tri-O-acetil-D-glucupiranosa-1’’-β-tio, (52 mg, 0.82 mmol) y DBU (136 μL, 0.897

mmol) y después de 2 horas de reacción se obtuvo el compuesto �. El crudo fue purificado por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt, 1:1) para dar �, como un sólido blanco (566 mg, 0.64 mmol, ��� ). P.F. = 97.3 – 99.3. ºC

= – 21.0 (c 1.00, CHCl3) HRMS ESI+ (m/z) = 920.2470 [M+Na+]; calculado C36H51NO23SNa+ = 920.2465 1H NMR (400 MHz, CDCl3) (ppm) 1.39 (s, 3H; CH3), 1.57 (s, 3H; CH3), 1.96 (s, 3H; Ac), 2.03 (s, 3H; Ac), 2.04(s, 3H; Ac), 2.05 (s, 3H; Ac), 2.07 (s, 3H; Ac), 2.08 (s, 3H; Ac), 2.15 (s, 3H; Ac), 3.27 (dd, J = 4.2, 14.9 Hz, 1H; CHCH2), 3.44 (s, 3H; OCH3), 3.57(s, 1H; OH), 3.61 – 3.68 (m, 2H; CHCH2; H5-Glc), 3.75 – 3.79 (m, 4H; CO2CH3; H4-Glc), 3.87 (dd, J = 6.4, 7.2 Hz, 1H; H5-Gal), 4.01(dd, J = 5.9, 12.1 Hz, 1H; H6-Glc), 4.09 – 4.14 (m, 2H; H6-Gal), 4.20 (dd, J = 4.2, 10.7 Hz, 1H; CHCH2), 4.46 (d, J = 7.9 Hz, 1H; H1-Gal), 4.56 (dd, J = 1.7, 12.0 Hz, 1H; H6-Glc), 4.61 (d, J = 10.0 Hz, 1H; H1-Glc), 4.91 – 4.97 (m, 2H; H2-Glc; H3-Gal), 5.10 (dd, J = 7.9, 10.4 Hz, 1H; H2-Gal), 5.20 (t, J = 9.1 Hz, 1H; H3-Glc), 5.34 (d, J = 2.6 Hz, 1H; H4-Gal)

41 Parte experimental

13C NMR (100 MHz, CDCl3) (ppm) 15.6 (CH3), 19.8 (CH3), 20.5, 20.7, 20.7, 20.7, 20.7, 20.7, 20.8 (Ac), 30.6 (CHCH2), 50.9 (OCH3), 53.0 (CO2CH3), 55.9 (CHCH2), 60.9 (C6-Gal), 62.1 (C6-Glc), 66.7 (C4-Gal), 69.1 (C2-Gal), 70.3 (C5-Gal), 70.8(C3-Gal), 71.0 (C2-Glc), 73.4 ( C3-Glc), 75.9 ( C4-Glc), 77.2 ( C5-Glc), 84.8 (C1-Glc), 90.1 (CNCH3OH), 101.1 (C1-Gal), 108.5 (CCH3OCH3), 154.5 (NCO2), 169.1, 169.4, 169.7, 169.7, 170.1, 170.2, 170.3 (Ac), 170.4 (CO2CH3) (S)������u���ira���i������i�����a ���

El compuesto 2 (934 mg, 1.57 mmol) se introdujo en un matraz con HCl 6 N (30 mL). La mezcla se agitó durante una noche a 60 ºC. El disolvente se eliminó a vacío, el residuo fue disuelto en agua (20 mL) y se lavó con AcOEt (20 mL). La fase acuosa

se evaporó para dar el compuesto � en forma de clorhidrato (475 mg, ���).

= + 43.0 (c 0.56, H2O) HRMS ESI+ (m/z) = 284.0799 [M+]; calculado C9H18NO7S+ = 284.0798

1H NMR (400 MHz, D2O) (ppm) 3.21 – 3.41 (m, 6H; CHCH2; H3-Glc; H2-

Glc; H4-Glc; H5-Glc), 3.62 (dd, J = 6.3, 12.3 Hz, 1H; H6-Glc), 3.84 (dd, J = 3.2, 12.3 Hz, 1H; H6-Glc), 4.34 (dd, J = 4.0, 6.6 Hz, 1H; CHCH2), 4.53 (d, J = 9.8 Hz, 1H; C1-Glc) 13C NMR (100 MHz, D2O) (ppm) 31.1 (CHCH2), 53.0 (CHCH2), 60.9 (C6-

Glc), 69.4 (C4-Glc), 72.0 (C2-Glc), 76.9 (C3-Glc), 79.9 (C5-Glc), 85.8 (C1-Glc), 170.3 (CO2H)

42 Parte experimental

�����Cys(����u���ira���i������ � ���

El compuesto � (475 mg, 1.49 mmol) se

introdujo en un matraz junto con NaHCO3 (430 mg, 5.23 mmol) y se disolvió en 30 ml CH3CN/H2O (2:1). Se añadió Fmoc-OSu (867 mg, 2.56 mmol) y se agitó la mezcla durante 72

h. El CH3CN se eliminó a vacío, y la disolución acuosa se lavó con Et2O. Se acidificó la fase acuosa y se extrajo con CHCl3/ iPrOH (3:1) (3 x 20 ml). La fase orgánica se evaporó a vacío obteniéndose el compuesto � como un aceite amarillento.

El crudo obtenido se disolvió en 10 ml de CH2Cl2 y se añadió a una

mezcla de DCC (1.139 g, 5.47 mmol), tBuOH (0.66 ml, 7.00 mmol), y CuCl (16 mg, 0.17 mmol) que previamente se había dejado con agitación a temperatura ambiente en atmosfera de argón durante 5 días. La mezcla resultante se dejó con agitación durante 4 h a temperatura ambiente y posteriormente se filtró en una placa porosa. El filtrado se evaporó a vacío y el crudo resultante se añadió a un mezcla de Ac2O/Py (1:2, 10 ml) dejándose con agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Se evaporó la mezcla a vacío obteniéndose un aceite amarillo.

43 Parte experimental

El crudo anterior se disolvió en 2 ml de CH2Cl2 y se añadieron 2 ml

de TFA dejándose con agitación durante 1 h. Se evaporó el disolvente a vacío obteniendo un sólido amarillento. En un matraz se mezcló el crudo anterior junto con TBTU (62 mg, 0.19 mmol) y tamiz molecular, se disolvió posteriormente con 20 ml de CH3CN y se adicionó DIEA (115 mg, 0.89 mmol). Pasados 5 minutos con agitación se añadió NH2MeHCl (20 mg, 0.30 mmol) y se dejó reaccionar durante 8 h. Se filtró en placa cerámica y se evaporó el disolvente a vacío. Se purificó parcialmente el producto por columna cromatográfica en gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 20:1) obteniéndose el compuesto 1� como un sólido blanco.

El producto anterior se disolvió en 10 ml de CH3CN, se añadió

piperidina (2.25 ml, 0.56 mmol) y se dejó con agitación durante 2.5 h. Se evaporó el disolvente a vacío obteniéndose un sólido blanco que fue tratado con Ac2O/Py (1:2) (6 ml) a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se evaporó a vacío obteniéndose un aceite amarillo. El crudo anterior se disolvió en 3 ml de MeOH y se añadieron 3 ml MeONa/MeOH (0.5 M) dejándose con agitación durante 1 h. Se añadió Dowex previamente lavado con metanol y se filtró en una placa porosa. Se evaporó el disolvente a vacío y el crudo se purificó mediante columna cromatográfica en gel de sílice (NH3/EtOH/BuOH/CHCl3, 4:5:4:2) obteniéndose el compuesto � como un sólido blanco. HRMS ESI+ (m/z) = 360.1025 [M+]; calculado C9H18NO7S+ = 361.1040

44 Parte experimental

1H NMR (400 MHz, D2O) (ppm) 2.08 (s, 3H; Ac), 2.76 (s, 3H; CONHCH3), 3.06 – 3.19 (m, 2 H; CHCH2), 3.33 (dd, J = 8.2, 17.4 Hz, 1H; H2-Glc), 3.39 – 3.44 (m, 1 H; H4-Glc), 3.48 – 3.52 (m, 2 H; H3-Glc; H5-Glc), 3.72 (dd, J = 5.8, 12.5 Hz, 1H; H6-Glc), 3.91 (d, J = 12.7 Hz, 1H; H6-Glc), 4.55 (dd, J = 8.1, 5.5 Hz, 1H; CHCH2), 4.60 (d, J = 9.9 Hz, 1H; H1-Glc) 1H NMR (400 MHz, H2O/D2O 9:1 Región de amidas) (ppm) 8.09 (d, J = 4.4 Hz, 1H; NHAc) , 8.40 (d, J = 7.1 Hz, 1H; CONHCH3) 13C NMR (100 MHz, D2O) (ppm) 21.8 (COCH3), 25.9 (CONHCH3), 31.8 (CHCH2), 54.2 (CHCH2), 60.9 (C6-Glc), 69.4 (C4-Glc), 72.2 (C2-Glc), 77.1 (C5-

Glc), 79.9 (C3-Glc), 86.0(C1-Glc), 172.6 (COCH3), 174.5 (CONHMe)

������ ������r�� �� �� �

47 ANEXO: Espectros de RMN

A continuación se presentan los espectros de RMN mono y bidimensionales de los productos sintetizados en esta memoria.

Los espectros de RMN de 1H, 13C, COSY y HSQC fueron tratados y

representados con el programa MestreNova (6.1) a partir de los archivos fid y ser obtenidos del espectrómetro Bruker Avance-400.

48 ANEXO: Espectros de RMN

1H RMN 400 MHz en CDCl3

13C RMN 100 MHz en CDCl3

49 ANEXO: Espectros de RMN

COSY en CDCl3

HSQC en CDCl3

50 ANEXO: Espectros de RMN

1H RMN 400 MHz en CDCl3

13C RMN 100 MHz en CDCl3

51 ANEXO: Espectros de RMN

COSY en CDCl3

HSQC en CDCl3

52 ANEXO: Espectros de RMN

1H RMN 400 MHz en CDCl3

13C RMN 100 MHz en CDCl3

53 ANEXO: Espectros de RMN

COSY en CDCl3

HSQC en CDCl3

54 ANEXO: Espectros de RMN

1H RMN 400 MHz en CDCl3

13C RMN 100 MHz en CDCl3

55 ANEXO: Espectros de RMN

COSY en CDCl3

HSQC en CDCl3

56 ANEXO: Espectros de RMN

1H RMN 400 MHz en D2O

13C RMN 100 MHz en D2O

57 ANEXO: Espectros de RMN

COSY en D2O

HSQC en D2O

58 ANEXO: Espectros de RMN

1H RMN 400 MHz en D2O

1H RMN 400 MHz en H2O/D2O (9:1)

59 ANEXO: Espectros de RMN

13C RMN 100 MHz en H2O/D2O (9:1)

COSY en D2O

60 ANEXO: Espectros de RMN

HSQC en D2O