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FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
TRABAJO FIN DE GRADO
Biocatálisis en disolventes verdes: La mejor
estrategia para la producción de fármacos en
disolventes sostenibles
Autor: Iván González Barrios
Tutor: María José Hernáiz Gómez-Dégano
Convocatoria: Julio
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Resumen:
La síntesis química con frecuencia involucra múltiples etapas de protección y
desprotección, así como el uso de reactivos y disolventes nocivos y peligrosos en
condiciones severas que tienen un impacto perjudicial sobre el ambiente y la salud
humana. Como consecuencia de ello, surge la necesidad de encontrar nuevos métodos
más sostenibles. La química verde ofrece las herramientas adecuadas para desarrollar
estos procesos, tanto a nivel de investigación, como a escala industrial. El empleo de
biocatalizadores para llevar a cabo la síntesis de fármacos ofrece una alternativa más
sostenible para obtener estos compuestos, ya que las reacciones catalizadas por enzimas
pueden llevarse a cabo bajo condiciones suaves de presión y temperatura en presencia
de disolventes sostenibles (agua, biodisolventes, líquidos iónicos o fluidos supercríticos)
y con una elevada eficiencia en la incorporación de los componentes de reacción en el
producto final (eficiencia atómica). Como ejemplo de sínesis de fármacos en
condiciones sostenibles a escala industrial he seleccionado la síntesis de la sitagliptina y
del diltiazem ya que son usados disolventes menos cotaminantes que los tradicionales.
Introducción y antecedentes
Biocatálisis como herramienta en la síntesis de fármacos:
La biocatálisis se define como la utilización de células o enzimas para catalizar
biotransformaciones que conducen a la obtención de compuestos de interés, que
satisfacen las necesidades humanas.[1] En etapas incipientes, la biocatálisis se
fundamentaba en el empleo de células enteras, como puede constatarse en la resolución
racémica del ácido tartárico descrita por Pasteur. Sin embargo, el hallazgo de algunas
enzimas que pueden desempeñar transformaciones en medios orgánicos, como las
hidrolasas, es lo que ha supuesto un verdadero cambio de paradigma, pues ha permitido
la transformación de sustratos insolubles en agua y llevar a cabo síntesis de compuestos
como amidas, ésteres, etc, imposibles de darse en medios acuosos.[2]
La biocatálisis es de gran utilidad en la síntesis de fármacos, existiendo un interés
creciente en la implementación de procesos biotecnológicos basados en la utilización de
biocatalizadores (enzimas o células), lo cual puede confirmarse por el gran número de
ejemplos industriales en los que se emplean los mismos.[3]
La generalización de la utilización de biocatalizadores a nivel industrial comporta una
serie de ventajas:
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1) Al tratarse de catalizadores eficientes se necesita una menor cantidad de los mismos
para llevar a cabo las reacciones, siendo procesos altamente competitivos en términos
económicos.[2]
2) Permiten trabajar en condiciones de temperatura y presión ambiente con excelente
economía atómica, evitándose de esta manera reacciones no deseadas como la
isomerización, epimerización, racemización, etc.[4]
3) Se mejora la quimio- regio y estereoselectividad en condiciones suaves de reacción
evitándose así establecer estrategias sintéticas basadas en procesos de protección y
desprotección.[1]
4) Reducción del uso de combustibles fósiles y de metales pesados lo que implica, por
tanto, una disminución de la contaminación ambiental y del calentamiento global.[5]
5) Es posible desempeñar reacciones sobre grupos no activados, lo cual no sería factible
químicamente.
6) Las enzimas son biodegradables y además presentan la posibilidad de ser
inmovilizados permitiendo su reutilización en diferentes ciclos.[6]
Por otro lado, la utilización de enzimas no está exenta de ciertos inconvenientes:
1) Su elevado coste.
2) Fácil desactivación en condiciones diferentes a las naturales.
3) Posibilidad de ser inhibidas por los sustratos o el producto de reacción.
4) Necesidad de cofactores para ejercer su acción en algunas ocasiones, como por
ejemplo en oxidorreductasas.[6]
Como biocatalizadores pueden emplearse células enteras o enzimas aisladas y su
elección depende de factores como el tipo de reacción, la escala a la que se realizará el
proceso o la necesidad de utilizar cofactores. El empleo de células tiene un coste menor
pues se produce un reciclaje de cofactores y no es necesario añadirlos. Sin embargo,
pueden darse reacciones secundarias a consecuencia del metabolismo celular, la
tolerancia hacia los disolventes orgánicos es reducida y se trabaja con elevados
volúmenes, lo cual es complejo. Estos problemas pueden solventarse con el manejo de
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enzimas aisladas. A pesar de que el coste de estas últimas es elevado, si aplicamos
técnicas de inmovilización, pueden reutilizarse durante varios ciclos catalíticos.[2]
Entre las principales clases de enzimas empleadas en la síntesis de fármacos pueden
citarse las oxidorreductasas y las hidrolasas:
Las oxidorreductasas catalizan reacciones redox. Su uso es extremadamente interesante
en la hidroxilación selectiva de enlaces C-H no activados, así como otras reacciones de
reducción de cetonas para obtener alcoholes quirales. Estas reacciones son difíciles de
llevar a cabo mediante métodos químicos convencionales. Es necesaria la presencia de
cofactores redox como el NADP, FAD, etc para la donación de los equivalentes
químicos de oxidación y reducción.[2] Estos son costosos, aunque la aparición de
cofactores sintéticos, cuyas propiedades pueden modularse para aumentar su
estabilidad, reactividad y coste, así como la posibilidad de acoplar sistemas de reciclaje
del cofactor, como el empleo de un segundo enzima y un sustrato para este o bien
emplear un segundo sustrato para la regeneración del cofactor que es convertido por el
mismo enzima que cataliza nuestra reacción de interés (El sustrato de la regeneración
tiene que ser barato y el producto derivado fácilmente eliminable) permiten una mayor
amortización de los biocatalizadores. Un método novedoso de reciclaje del cofactor es
aquel en el que el producto deseado se forma mediante la reacción de regeneración del
cofactor[7].
Las hidrolasas son los biocatalizadores más empleados, de hecho se estima que un 80%
de todas las enzimas usadas en procesos industriales pertenecen a esta clase. Esto está
justificado por la ausencia de necesidad de cofactores, que son caros; la buena
disponibilidad comercial a precios asequibles; la capacidad de reconocimiento
específica de sustratos, a veces muy alejados de la estructura de sus sustratos naturales
(promiscuidad catalítica); posibilidad de utilización en disolventes no acuosos, lo que
permite llevar la biocatálisis en el sentido de la esterificación en lugar de la hidrólisis.[8]
En este grupo destacan las lipasas, que son serín hidrolasas, desempeñando una función
esencial en la nutrición del ser humano y otros animales superiores que consiste en la
hidrólis de triacilglicéridos. Es interesante su cinética en la que cuando el sustrato se
encuentra disuelto en un estado monomérico, apenas son activas, si bien una vez se
supera la Cs formándose una segunda fase lipofílica se vislumbra un brusco incremento
en la actividad. Esto se conoce como activación interfacial. La cinética se explica a
nivel molecular por la existencia de una hélice α en algunas lipasas que cubre el acceso
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al sitio activo cuando el enzima se encuentra en un sistema monofásico acuoso. Por el
contrario, se reorganiza su estructura y la hélice α, al formarse una segunda fase
lipídica, se desplaza y el enzima se situa en la interfase acuoso/lipídica, mostrando
actividad catalítica. Por esta razón las lipasas, a diferencia de otras hidrolasas, presentan
una afinidad inherente por medios apolares y son extremadamente útiles en química
orgánica para la resolución de mezclas racémicas.[6,9]
El desarrollo experimentado por la biocatálisis ha sido plausible gracias al desarrollo de
las técnicas de la biología molecular, que permitieron la obtención a gran escala de
enzimas y microorganismos modificados genéticamente, así como su adaptación a las
exigentes condiciones industriales.[2] Las estrategias para la búsqueda de nuevos
catalizadores o la mejora de los existentes se catalogan en tres grandes grupos:
Screening de organismos naturales para la búsqueda de enzimas y metagenómica:
Uno de los métodos tradicionales para la búsqueda de nuevas enzimas radica en el
aislamiento de microorganismos a partir de muestras ambientales o bien de colecciones
tipo. La limitación que presenta esta técnica consiste en que sólo una pequeña
proporción de microorganismos tomados en una muestra ambiental pueden desarrollarse
en condiciones de laboratorio bien porque se desconocen las condiciones para su
adecuado cultivo, presentan tasas de crecimiento lento o requieren de la simbiosis para
su desarrollo. Esto reduce la diversidad de organismos existente en el ambiente natural,
perdiéndose muchas posibilidades de investigación.[10] Estos inconvenientes se superan
mediante la metagenómica.[11] (11 fig1).
Figura 1: Metagenómica
En esta técnica se extrae el DNA genómico completo directamente desde las muestras
ambientales y se procede a secuenciarlo, fragmentarlo y clonarlo para obtener
genotecas. A posteriori, se realiza una búsqueda de genes que codifiquen enzimas con la
actividad deseada. Finalmente, se va a clonar el gen en un microorganismo para que sea
sobreexpresado y se obtenga el enzima deseado en grandes cantidades.[12]
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Mutagénesis y evolución dirigida: Ambas técnicas permiten mejorar las propiedades
de un biocatalizador tales como la estabilidad, las condiciones óptimas de reacción, etc.
(11 fig2) La primera de ellas, el diseño racional o mutagénesis, se fundamenta en la
modificación de residuos concretos de la
estructura del enzima y estudiar cómo afecta a la
actividad. Para esta estrategia se necesita conocer
la estructura del enzima o saber utilizar
herramientas informáticas de cálculo y simulación
para determinar el tipo de modificaciones a
realizar. La evolución dirigida emula el proceso
de adaptación de las especies descrito en la
hipótesis evolutiva Darwiniana; primero, es
necesario identificar el gen que codifica el enzima, clonación del mismo y desarrollo de
un sistema de expresión adecuado (E. coli, B. subtilis,etc) al que se van a aplicar
procesos mutagénicos aleatorios y así se obtiene un conjunto de variantes representada
en una librería de genes mutantes. Posteriormente, se lleva a cabo la expresión de la
librería de genes mutantes y se someten a un proceso de análisis de los clones mediante
selección de alto rendimiento para obtener candidatos mejorados. A continuación, se
les aplicarán procesos de mutación y así sucesivamente hasta producir enzimas con las
propiedades catalíticas deseadas. La ventaja de la evolución dirigida sobre la
mutagénesis dirigida radica en que no se requiere un conocimiento previo detallado de
la estructura del enzima.[2,12]
Diseño de novo, enzimas a la carta: Se lleva a cabo mediante el concurso de
programas informáticos como Rosetta u ORBIT. Una vez definido un mecanismo
catalítico para una reacción dada y caracterizado el estado de transición en fase gaseosa,
se diseña un centro activo idealizado en el que los grupos funcionales, que mimetizan el
papel que ciertos residuos tendrían en un entorno enzimático, se disponen de forma que
se maximiza la estabilización del estado de transición. Finalmente, se diseñan posibles
esqueletos proteicos que alojen a ese centro activo y las enzimas obtenidas se optimizan,
Figura 2: Técnicas de ingeniería proteica.
Figura 3: Diseño de enzimas a la carta.
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sustituyendo aminoácidos mediante métodos combinatorios in silico que mejoren la
unión en el estado de transición.[11] (11 fig3).
Las enzimas presentan dos grandes problemas como son su limitada estabilidad y la
dificultad que entraña su separación del medio de reacción una vez finalizada ésta,
impidiendo su reutilización y contaminando el producto. Estos inconvenientes han sido
superados mediante la inmovilización, mejorando a su vez la rentabilidad económica de
muchos procesos industriales, al permitir el trabajo en continuo y por la posibilidad de
reutilizarlas.[2] La inmovilización restringe la difusión y la accesibilidad de los sustratos
al centro activo y la salida del producto, lo cual implica una pérdida en la actividad.
Asimismo, se puede producir una alteración de la estructura con respecto a su estado
nativo lo que puede afectar a la selectividad o incluso conducir a la inactivación del
enzima.
Figura 4: Métodos de inmovilización mediante retención física e inmovilización química.
Los métodos de inmobilización son clasificados en dos grandes grupos (7 fig4): 1) la
retención física y 2) la inmovilización química. En la primera no se forman enlaces
covalentes mientras que en la segunda sí que ocurre.[13]
1) Adsorción: La unión al soporte tiene lugar en este caso mediante interacciones
iónicas, puentes de hidrógeno, etc. Los principales factores a controlar son el pH del
medio que influye en la carga de la proteína y del soporte y limitar la fuerza iónica del
medio, ya que los iones se unen más intensamente al soporte que a la proteína. Es un
método sencillo y barato que permite retener altas actividades catalíticas, pero la unión
al soporte es débil perdiéndose enzima en operaciones de lavado, siendo necesario
optimizar las condiciones que controlan la adsorción.
Atrapamiento: Consiste en la contención del enzima en una matriz polimérica que se
genera de forma simultánea a la inmovilización por un cambio de temperatura, en el
caso de geles o por la adición de un reactivo, en el caso de polímeros. También se puede
llevar a cabo el atrapamiento en membranas de fibra hueca, como veremos más
Retención física Inmovilización química
Adsorción Atrapamiento o encapsulación Unión covalente Entrecruzamiento
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adelante. Es un método sencillo en el que no se modifica el enzima, pero que requiere
un control exhaustivo de las condiciones para la formación de la matriz, comprobándose
que no se alteran los grupos reactivos del enzima.
2) Inmoviliazción por unión covalente: Constituye la técnica más utilizada y de la que
mayor información se dispone. El soporte empleado debe mostrar resistencia mecánica
a las condiciones en que se opera y ser fácilmente separable del medio líquido. La unión
covalente procede mediante un ataque nucleofílico de determinados aminoácidos de la
superficie externa del enzima, a través de residuos no esenciales para la actividad, y
grupos químicos reactivos de un soporte funcionalizado. Debido a la estrecha unión
entre enzima y soporte, que permite estabilizar la estructura terciaria, la proteína
adquiere una alta estabilidad térmica. Asimismo, permite trabajar en reactores en
continuo al no perderse por elución el biocatalizador y la carga del enzima en el soporte
permanece constante. Es necesario tener en cuenta que este proceso al no permitir a las
moléculas de enzima tener movimiento libre, conduce a una pérdida de la actividad. Al
mismo tiempo, la estructura del centro activo puede verse alterada y es recomendable
llevar a cabo la inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el centro
activo.
Entrecruzamiento: Esta técnica combina la unión covalente con el atrapamiento. Se
emplean reactivos bifuncionales que permiten la unión entre moléculas de enzima. Se
seleccionan como entrecruzadores diisocianatos, dialdehídos, siendo el más empleado el
glutaraldehído, entre otros, que reaccionan con las lisinas de la superficie del enzima
formándose bases de Schiff. Para evitar las pérdidas de actividad por impedimentos en
la difusión, se realiza el coreticulado en
presencia de una proteína sin actividad y
rica en residuos de lisina, como la albúmina.
Una técnica en boga es la cristalización de
enzimas para posteriormente acometer el
reticulado con glutaraldehído (CLECs). Una
gran ventaja de este método es que no
requiere soporte alguno.
No existe una técnica universal de
inmovilización aplicable para todas las
enzimas y para la elección de la técnica más apropiada se contemplan criterios como las
Figura 5: Proporción de procesos en los que se emplea la
biocatálisis en cada sector.
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condiciones de reacción, el tipo de reactor a utilizar, la naturaleza del sustrato,
etc.[2,6,13,14]
Existen infinidad de ejemplos a nivel de laboratorio donde se emplean biocatalizadores
para la obtención de compuestos de interés para la industria farmacéutica, química y
otras (3 fig5). El problema radica en el escalado posterior para su implementación a
nivel industrial. En este sentido, los ejemplos más numerosos a pequeña escala se
concentran en el sector farmacéutico.[3]
Biocatálisis y química verde:
El término química verde (QV) fue acuñado en la década de los noventa y se define
como "el diseño de procesos y productos químicos que reduce o elimina la generación
de sustancias peligrosas". Esta disciplina surge por la demanda por parte de la sociedad
de instaurar procesos químicos sostenibles con el medio ambiente y benignos para la
salud.[15] Se circunscriben en ella doce principios (16 Fig6).
La sostenibilidad de los procesos se cuantifica por medio de parámetros como el factor
E, permitiendo además, la comparación entre ellos. Se define como la relación entre la
masa de residuos por kilogramo de producto deseado. Valores elevados implican mayor
generación de residuos y peor impacto ambiental. Lo deseable es obtener un valor 0 o
cercano a este. En su cálculo contempla como residuo todo aquello que no es producto,
incluso la energía requerida, aunque generalmente se desdeña el agua, ya que por un
lado no ocasiona un impacto ambiental y es barata, y por otro, su inclusión conduciría a
valores excesivamente altos y complicaría las comparaciones.[17] El factor E es más
elevado para el sector farmacéutico que para la industria química como consecuencia de
Figura 6: Principios de la química verde.
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un amplio uso de reactivos estequiométricos, cuyo precio es prohibitivo en el sector
químico y por otro lado, por la mayor complejidad molecular de los fármacos que lleva
aparejada la necesidad de más etapas sintéticas.[18]
Si estudiamos los residuos generados en un proceso, los disolventes constituyen el
mayor porentaje de los mismos y contribuyen al aumento del factor E; esto junto con los
aspectos relacionados con la salud han hecho que se encuentren bajo un estricto control.
La FDA y la industria han desarrollado guías para una selección de los disolventes más
sostenibles y una clasificación de los mismos (18 Tabla1) en función de su riesgo para
la salud y el medio ambiente, recomendando la sustitución de los indeseables.
Tabla 1: Guía de selección de disolventes de Pfizer.
Objetivos:
Exponer la relevancia de la biocatálisis y la química sostenible en el panorama
actual introducciendo al lector en ambas disciplinas. Se revisarán los
biocatalizadores más empleados, estrategias para la optimización de su actividad
y ténicas de inmovilización.
Desarrollo de los disolventes sostenibles utilizados con más frecuencia junto con
ejemplos a nivel de laboratorio que ilustran sus características ventajosas.
Descripción de reacciones sintéticas a gran escala para la obtención de fármacos
con interés terapéutico en las que se emplean biocatalizadores y disolventes
menos contaminantes y seguros.
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Metodología:
Para el desarrollo de este proyecto se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica
consultando en diversas bases de datos secundarias como son Pubmed®, Science direct®
y Embase®.
Resultados y discusión:
Disolventes sostenibles:
El medio de reacción influe notablemente en la estructura del enzima. Estas proteínas
poseen aminoácidos hidrófilos más expuestos hacia el exterior como -OH, -NH3+, etc,
mientras que los restos hidrofóbicos se
encuentran hacia el interior de su propia
estructura. La estructura y estabilidad de esta,
va a depender del orden de unión de los
aminoácidos en la cadena, así como de las
distintas interacciones covalentes (enlace
peptídico) y no covalentes (electrostáticas,
puente de hidrógeno, etc) entre los grupos
funcionales de las cadenas laterales y entre
éstos y las moléculas de agua del medio (6 fig7). Parte del agua se encontrará unida al
enzima en forma de monocapa, otra parte se disuelve en el disolvente y una tercera en el
soporte, polímeros, etc. Las variaciones en el medio pueden modificar estas
interacciones y alterar la estructura nativa del enzima y por tanto su actividad.[6]
En la búsqueda de una optimización de las biotrasformaciones, además de modificar las
propiedades de los biocatalizadores, se pueden diseñar las condiciones adecuadas para
que un enzima catalice con máxima actividad y estabilidad una reacción en cualquier
medio. Esto se conoce como ingeniería del medio de reacción.[2]
Las enzimas alcanzan una estabilidad óptima en agua, pero no todos los sustratos son
solubles en ésta. De ahí radica el interés en en disolventes orgánicos, cuyo uso
proporciona numerosas ventajas en la biocatálisis como son el incremento de la
solubilidad de sustratos no polares, posibilidad para la reversión del equilibrio hacia la
hidrólisis, se evitan las reacciones secundarias debidas a la presencia de agua, se
posibilita la modificación de la especificidad de sustrato y la enantioselectividad, y se
Figura 7: Representación del agua estructural en la
lipasa B de C. albicans.
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dificulta la contaminación microbiológica. Tampoco es necesario la inmovilización de
las enzimas ya que pueden recuperarse por filtración.[19,20]
Bajo la denominación de medios no convencionales se agrupa a los disolventes
orgánicos miscibles o inmiscibles con el agua lo que depende del valor de log P. En
función de la cantidad de agua en el medio y la naturaleza del disolvente orgánico, las
reacciones se pueden llevar a cabo en tres sistemas:[2]
Sistema monofásico: Conformado por un cosolvente orgánico miscible con el
agua para mejorar la solubilidad de compuestos relativamente insolubles en esta. Se
reducen las limitaciones en la transferencia de masa conduciendo a velocidades de
reacción más elevadas para sustratos hidrofóbicos. Concentraciones del cosolvante
superiores a cierto umbral redundan en la desnaturalización del enzima ya que compiten
con la monocapa de agua fuertemente unida en la formación de puentes de hidrógeno.
Este tipo de reacciones son altamente útiles en síntesis de ésteres y péptidos al favorecer
el equilibrio hacia la síntesis sobre la hidrólisis. Normalmente se emplean a una
concentración 10-50 % (v/v). Los disolventes más utilizados so alcoholes de cadena
corta (etanol, metanol) o disolventes polares como la acetona, dioxano,
dimetilformamida, etc.[19]
Sistemas bifásicos: Constan de una fase acuosa que contiene el enzima disuelta
y otra donde reside el disolvente inmiscible con el agua, formándose entre ambas una
interfase donde se sitúa el enzima rodeada de una concentración limitada de compuestos
orgánicos, con lo que se evita la
inhibición enzimática. Los sustratos se
reparten en ambas fases en función del
coeficiente de reparto, llevándose a cabo
la biotransformación en el medio acuoso.
Las ventajas residen en que el producto
se recupera fácilmente en la fase orgánica
y al ser el sistema bifásico se facilita la
eliminación del producto de la superficie
del enzima y por tanto, que se complete la reacción con rapidez. La agitación es esencial
para mejorar la transferencia de masa y la velocidad, pero puede conducir a la
desnaturalización del enzima al aumentar el contacto con el disolvente orgánico.[2,19] Un
ejemplo elegante de este tipo de sistemas lo constituyen los reactores de membrana (21
fig8). En una estructura cilíndrica hueca discurre un flujo de agua en el que se disuelve
Figura 8: Sistemas de membrana para síntesis
enzimática
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un reactivo, el cual atravesará una capa impermeable para el producto y alcanzará una
matriz multicapa, donde se encuentra atrapada físicamente el enzima, generándose un
producto impermeable a la membrana inicial que difundirá hacia la fase orgánica que
recorre el exterior de la estructura. El movimiento de los sustratos y produtos se explica
por el mantenimiento de una presión positiva.[21]
Disolvente orgánico puro: Las enzimas en su forma nativa son insolubles en
disolventes orgánicos y para solubilizarlas es necesario llevar a cabo modificaciones
como la adición de polímeros hidrofóbicos. El contenido de agua en el medio es
relevante, pues de ello depende que el biocatalizador retenga una buena actividad. La
actividad de agua debe de corresponderse con un valor inferior a 1. Los disolventes
hidrofóbicos posibilitan mayores actividades que los hidrofílicos.[19] Una correcta
agitación, al igual que en el caso de los sitemas bifásicos, permite que el intercambio de
los sustratos y el producto se produzca con una mayor celeridad y por tanto se
incremente la velocidad de la biotransformación.[1]
Los disolventes comunmente empleados son altamente volátiles, lo que resulta en
contaminación ambiental y un riesgo de toxicidad laboral para los trabajadores
expuestos. Esto puede ser solventado con los disolventes neotéricos, es decir, aquellos
nuevos, recientes, modernos, según la definición registrada en la RAE para este
término.[2]
Profundizaremos en los más utilizados en biocatálisis: fluidos supercríticos, líquidos
iónicos y biodisolventes.
Fluidos supercríticos (FSC): Se tratan de aquellos sometidos a una presión y
una temperatura superior al punto crítico, aquel en el que no se observa una clara
diferenciación entre el estado líquido y el sólido, mostrando una densidad comparable a
la de un líquido y una viscosidad semejante a la de los gases.[2] Propiedades como la
transferencia de masa y la polaridad son muy sensibles a las variaciones de presión, por
lo que los FSC son interesantes para la extracción de principios activos mediante
despresurización controlada. Al reducir la presión por debajo del punto crítico, el FSC
pierde sus propiedades y precipitan los productos.[1] Los cambios en propiedades como
la constante dieléctrica promovidos por la variación de presión durante el proceso,
pueden efectar asimismo a la actividad del enzima.[23] El elevado coste de los equipos es
un escollo para la aplicación industrial a gran escala. El SCF más empleado es el CO2,
ya que es barato, inerte, no inflamable, presenta baja temperatura y presión críticas y es
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fácilmente eliminable tras la reacción. Una posible reacción secundaria es la formación
de ácido carbónico por reacción con el agua del medio, lo que conduciría a una
disminución de pH y desactivación del enzima; se puede prevenir con bicarbonato
sódico.[1] En este disolvente se han descrito reacciones hidrolíticas catalizadas por
lipasas, glicosidasas y proteasas.[2] Palocci y col. han descrito como el empleo de CO2sc
puede modular la regioselectividad en la acilación del 6-O-tritil-β-D-glucopiranósido
usando la lipasa de C. rugosa (24 fig9). En presencia de este disolvente la reacción era
dirigida claramente a la formación del derivado acilado en la posición 3 que constituía
un 90% del producto final mejorando el rendimiento y la regioselectividad con respecto
a otros disolventes. Modificando la presión y temperatura también se modificaba el
rendimiento y la regioselectividad.[24]
Figura 9: Acilación catalizada por CRL en CO2sc
Líquidos iónicos (LI): Son sustancias líquidas a temperatura ambiente y que están
formadas por un catión y un anión, siendo normalmente el catión de naturaleza
heterocíclica (piridina, imidazol).[5] La estructura del anión y del catión (5 fig10)
modulan sus propiedades fisicoquímicas como densidad, viscosidad, etc. Entre sus
desventajas podemos citar que son ecotóxicos para organismos como algas, peces y
plantas, lo cual puede reducirse seleccionando cuidadosamente los cationes (ej. colina,
amino ácidos, etc) y disminuyendo las etapas sintéticas, obteniéndose los LI de tercera
generación.[1,25] Las fortalezas son la alta
estabilidad térmica y química, la escasa
volatilidad, bajo punto de fusión y su capacidad
para ser reutilizados. Los LIs se encuentran en
auge a nivel industrial al ser buenos sustitutos de
los disolventes orgánicos volátiles ya que no
causan desactivación y aumentan la selectividad
enzimática y se evitan los perjuicios ambientales
de la volatilidad.[26] Algunos de ellos (28 fig11) se han empleado en la síntesis de los
disacáridos Gal-β-(1-3)-GlcNac o Gal-β-(1-3)-GlcNac mediante la β-galactosidasa de B.
circullans ATCC 31382 con rendimientos del 99% manteniéndose una total
Figura 10: Iones comunes que forman parate de
los LIs
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regioselectividad y sin hidrólisis destacable, lo cual supone una mejora considerable con
respecto a la utilización de buffers acuosos y otros disolventes.[27]
Figura 11: Reacciones de transglicosilación por β-Gal-3 en LIs
Biodisolventes: Proceden de materias primas renovables aprovechándose un potencial
residuo para la obtención de un disolvente. Comparten ciertas características con los
disolventes orgánicos como la inflamabilidad, pero ventajas como una buena
biodegradabilidad, baja toxicidad y su producción sostenible, les confiere una elevada
competitividad. Ejemplos son el ácido láctico, los derivados de glicerol, el 2-MeTHF.
Su aplicación ha posibilitado rendimientos cuantiosos y estupenda regioselectividad en
la síntesis de disacáridos, como Gal-β(1-3)-GlcNAc, al igual que los LIs.[1,2]
Ejemplos de biocatálisis para la obtención de fármacos:
Sitagliptina:
Codexis y Merck han logrado desarrollar la biotransformación de la prositagliptina por
aminación directa en (R)-sitagliptina (Januvia®) con un rendimiento de hasta el 92% de
la forma enantioméricamente pura (2 fig 12), ejemplo en el que se integran varias de las
técnicas comentadas durante el trabajo. Se superan así las limitaciones de los métodos
químicos como las hidrogenaciones catalíticas con catalizadores de rodio o la reacción
de inversión de Mitsonobu.[28] Esta molécula actúa como un inhibidor de la dipeptidil
peptidasa 4 que degrada la incretina GLP-1, la cual estimula la secreción de insulina por
los islotes de Langerhans, suprime el glucagón posprandial, interviene en el control de
la saciedad en cerebro y enlentece la evacuación gástrica; acciones todas ellas que
revierten en un descenso de la glucemia, lo que explica su indicación en diabetes de tipo
II.[29]
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Figura 12: Biotransformación en la síntesis del antidiabético Januvia.
Las transaminasas son altamente selectivas para su sustrato y no aceptan sustituyentes
mayores a un grupo metilo en la posición adyacente a la cetona. Con la asistencia de
modelado computacional y una
variedad de metodologías de
ingeniería proteica, se sugirió que el
centro activo de la transaminasa
ATA-117 estaba constituido por un
bolsillo grande (L) y otro
pequeño (S) con las
limitaciones para los sustratos citadas (31 fig 13A), por lo que no uniría la
prositagliptina (31 fig13B). La aplicación de evolución dirigida, tras sucesivas rondas,
permitió obtener un enzima con bolsillos adecuados al sustrato que incluía 27
mutaciones, 10 de ellas en el centro activo, y mostraba una actividad 75 veces mayor
que la nativa (31 fig13E). A pesar de ello, era necesario optimizar las condiciones de
reacción para la aplicación industrial. La solubilidad de la prositagliptina era reducida
(<1g/L), siendo necesario un cosolvente para favorecerla. Se obtuvieron buenos
resultados con metanol (catalogado dentro de los preferidos por Pfizer) y DMSO. Como
el incremento de la temperatura aumenta la solubilidad, las condiciones óptimas de
trabajo son 40ºC empleando DMSO con alto punto de ebullición, lo que permite
aumentar la solubilidad de sustrato hasta 200 g/L. Un exceso del sustrato isopropilamina
permite desplazar el equilibrio de reacción hacia la formación del producto, lo cual
también puede obtenerse mediante la eliminación del producto acetona.[30]
Diltiazem:
Los fármacos bloqueantes de los canales de calcio constituyen un grupo diverso desde
el punto de vista químico y farmacológico. Esta benzotiazepina se une a los canales de
Ca2+ tipo L en corazón y vasos cuya indicación es el tratamiento de la hipertensión y el
control del dolor en el tórax (angina). Los efectos originados son la relajación de los
vasos sanguíneos facilitando el bombeo del corazón y el aumento de suministro de
sangre y oxígeno al corazón, así como un efecto antiarrítmico.[29] El diltiazem presenta
Figura 13: Modelos que reflejan el centro activo de transaminasa. Naranja,
bolsillo grande; turquesa, bolsillo pequeño; verde, residuos catalíticos.
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dos carbonos asimétricos, siendo
uno de los enantiómeros, el
eutómero, el que ejerce la acción
farmacológica. La resolución óptica
se desarrolla en la síntesis química
sobre un compuesto de alto peso
molecular, lo que lleva aparejado la
formación de grandes cantidades de
residuos. Las compañías DSM-
andeno y Tanabe Pharmaceutical (31
fig14) han comercializado una lipasa
que permite la resolución del éster metílico correspondiente del ácido (+)-(2S,3R)-trans-
3-(4-metoxifenil)-glicídico (MPGM), un sintón quiral muy importante en la síntesis del
fármaco, reduciéndose de esta manera el número de etapas sintéticas.[31]
La lipasa empleada por DSM-andeno procede de Rhizomucor miehei, mientras que
Tanabe la obtiene de Serratia marcescens. Sin embargo, el proceso es similar en ambos
casos, siendo el objetivo la hidrólisis del racémico Rac-50 para limpiar el enantiómero
deseado (2S,3R)-50 del ácido producto de la hidrólisis enzimática (2R,3S)-51, el cual se
descompone espontáneamente a un aldehido.
En el proceso descrito por Tanabe (32 fig 15), en un reactor de membrana se combinan
las operaciones de hidrólisis, separación y cristalización del Rac-50. Se emplea un
sistema bifásico agua-tolueno en el que en el tolueno del medio, disolvente catalogado
como utilizable de acuerdo con Pfizer, se disuelve el sustrato racémico y este es dirigido
hacia un biorreactor de membrana. La composición del mismo es poliacrilonitrilo y en
él se encuentra inmovilizado el enzima. La lipasa cataliza la hidrólisis del enantiómero
no deseado originando el ácido (2R,3S)-51, que discurre a través de la membrana hasta
la fase acuosa que atraviesa el hueco interno del sistema, gracias al gradiente de
presiones existente. Disuelto en ella se encuentra bisulfito, que va a reaccionar a su vez
con el aldehido formado por la decarboxilación espontánea del ácido, impidiéndose de
esta manera la desactivación de la lipasa El enantiómero deseado permanece en la fase
tolueno y cristaliza. El rendimiento del proceso fue de un 43% con el 100% de pureza
enatiomérica.[32]
Figura 14: A la derecha ruta química tradcional, a la
izquierda biotransformación de MPGM.
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Figura 15: Sistema de membrana empleado por Tanabe
Conclusiones:
La biocatálisis y la química verde constituyen un pilar fundamental en la
química a nivel de laboratorio, al llevar aparajadas una serie de ventajas de
carácter medio ambiental, económico y metodológico, y en el futuro también lo
serán a escala industral.
Los disolventes neotéricos superan las inconvenienrtes de los disolventes
orgánicos tradicionales ya que disminuyen la contaminación ambiental y la
toxicidad laboral. Asimismo, han posibilitado la obtención de mejores
rendimientos y modificaciones de la regioselectividad en algunas
biotransformaciones.
A nivel industrial se aplican varias de las técnicas analizadas durante el trabajo,
lo que ha permitido una optimización en cuanto a número de etapas, recursos y
rendimientos, mostrando la relevancia de la biocatális en la actualidad y en el
futuro.
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