Trabajo Fin de Grado v2dspace.umh.es/bitstream/11000/4168/1/TFG Pérez García... · 2017-10-25 ·...

Autora:ClaudiaPérezGarcía

Tutoracadémico:FelipeHornosAdán

Co-Tutor:RocíoEsquembreTomé

DepartamentodeAgroquímicayMedioAmbiente

ÁreadeQuímicaFísica

InstitutodeBiologíaMolecularyCelular(IBMC)

GradoenBiotecnología

FacultaddeCienciasExperimentales

Curso2016/2017

TRABAJOFINDEGRADO

USODEPOLÍMEROSNEUTROSPARAREDUCIRELFENÓMENODEOPSONIZACIÓNSOBRENANOPARTÍCULASMAGNÉTICASRECUBIERTASCONUNPOLIELECTROLITOANIÓNICO

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ÍNDICE

RESUMEN..................................................................................................................................3

PALABRASCLAVE.......................................................................................................................3

1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................41.1 Nanopartículasdemagnetita.................................................................................................61.2 Recubrimientodenanopartículasmagnéticasconpolielectrolitosaniónicos.......................81.3 Polímerosneutroscomotratamientodenanopartículasdemagnetitarecubiertasconpolielectrolito(NP-PAA)......................................................................................................................91.4 IsotermadeLangmuir..........................................................................................................111.5 Lisozimacomoproteínamodelo..........................................................................................13

2. ANTECEDENTESYOBJETIVOS..........................................................................................15

3. MATERIALESYMÉTODOS................................................................................................173.1 Síntesisdemagnetita...........................................................................................................173.2 Cuantificacióndelasnanopartículasdemagnetitaobtenidas............................................173.3 Recubrimientodenanopartículasdemagnetitaconácidopoliacrílico...............................173.4 CuantificacióndelasNP-PAApormétodoscolorimétricos.................................................183.5 AdsorcióndelisozimaalasNP-PAA.....................................................................................203.6 TratamientodelasNP-PAAconPEGdediferentespesosmoleculares,PVPyPVA............203.7 Medicióndeltamañoycargadelasnanopartículasobtenidas...........................................213.8 InfluenciadelacantidaddepolímeroneutrosobrelasNP-PAAtratadasconPEG400......21

4. RESULTADOS...................................................................................................................214.1 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAA.................................224.2 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares...........................................................................................................234.3 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVP..264.4 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVA....26

5. DISCUSIÓN.......................................................................................................................275.1 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares............295.2 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconotrospolímerosneutros:PVPyPVA..............30

6. CONCLUSIONESYPROYECCIÓNFUTURA........................................................................30

7.BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................33

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RESUMENElusodenanopartículasmagnéticashaidocreciendodeformadesmesuradadurantelasúltimas

décadasdebidoalagranaplicabilidadquepresentan.Podemosdestacarsuusodentrodelcampode

la biomedicina, donde ya han sido usadas como agentes de contraste en imagen por resonancia

magnética. Aunque aún en desarrollo, se pretenden utilizar como sistemas transportadores de

biomoléculas,sinembargo,estaspartículasalseradministradaspodríansereliminadasdelorganismo

porelsistemainmune(opsonización).

Enestetrabajosehanobtenidonanopartículasdemagnetitarecubiertasconunpolielectrolito

aniónico y se ha caracterizado su capacidad máxima para adsorber Lisozima. Con el fin de

reducir/evitar la opsonización, proponemos el tratamiento de las nanopartículas con distintos

polímerosneutros,comopolietilienglicol(PEG)dedistintopesomolecular(400,4000y35000g/mol),

polivinilalcohol(PVA)ypolivinilpirrolidona(PVP).

Losresultadospareceríanindicarquedelospolímerosutilizados,tantoelPEG400comoelPVA

aumentan la capacidad de adsorción de la nanopartícula (un 28 % y un 144 % respectivamente)

favoreciendo laopsonización,elPEG4000noafectaríaatal fenómeno,yquesolamenteelPEGde

35000ylaPVPloreduciríanun26%.

ABSTRACT

Useofmagneticnanoparticleshasshownasignificantincreaseduringthelastdecadesduetotheir

numerousapplications.Inparticular,inthebiomedicalfield,wheretheyhavebeenusedasmagnetic

resonanceimagingcontrastagents.Theirapplicationasdrugdeliverysystemsisnowindevelopment,

butoneofthemainproblemsencounteredistheireliminationbytheimmunesystem(opsonization).

Inthiswork,wehaveobtainedmagneticnanoparticlescoatedbyananionicpolyelectrolyteand

havecharacterizedtheiradsorptioncapacitytowardsheneggwhitelysozyme,usedasamodelcationic

protein.Asaworkinghypothesis,wehavestudiedifseveralneutralpolymerscouldcompetewiththe

protein for the charged surfaceof thenanoparticle as ameans to decrease the adsorption to the

nanoparticlesofsomeoftheproteinspresentinthebiologicalmediathatinitiatestheopsonization

process.Inparticular,wehavestudiedtheeffectofpolyethyleneglycol(PEG)ofdifferentmolecular

weights(400,4000y35000g/mol),polyvinylalcohol(PVA)andpolyvinylpirrolidone(PVP).

TheresultssuggestthatPEG400andPVAincreasethenanoparticleadsorptioncapacity(28%and

144%,respectively)promotingopsonizationwhilePEG4000hasanegligibleeffectandPEG35000and

PVPreducetheproteinadsorptioncapacitybya26%.

Palabrasclave:NP-PAA,PEG,PVP,PVA,capacidaddeadsorciónmáxima,opsonización.

Keywords:NP-PAA,PEG,PVP,PVA,maximumadsorptioncapacity,opsonization.

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1. INTRODUCCIÓNDurante las últimas décadas, el desarrollo y la caracterización de nanopartículas

magnéticashanidocreciendodesmesuradamente.Graciasasuspropiedadesfísicoquímicas

y a su magnetismo, pueden ser empleadas en numerosos ámbitos: como sistemas de

refrigeración magnética, en sistemas de almacenamiento de datos, tratando aspectos

medioambientalesodentrodelcampode labiomedicina(Tongetal.,2015;Laurentetal.,

2008).Concretamente,esdegraninteréssuaplicabilidadbiomédica,yaquedemuestranser

ungranavanceencienciaconunfuturomuyprometedor.Asípues,puedenser,entreotros,

interesantes agentes de contraste en imagen por resonancia magnética, eficientes

marcadorescelularesobuenossistemasdeliberacióncontroladadefármacos(Guptaetal.,

2005).Esdeespecial importancia suempleocomovehiculizadorasde fármacoscomouna

potencialalternativa frentealusode fármacosconvencionales, sobre todo, losempleados

en el cáncer. Los agentes quimioterapéuticos y antitumorales habituales son liberados al

torrente sanguíneo y se caracterizanpor nopresentar especificidadpor el tejido tumoral.

Como consecuencia, las células y los tejidos sanos también se ven afectadosdando como

resultadounaaltatoxicidadyseverosefectossecundarios(Bekaroğluetal.,2017).Conelfin

depaliar esteproblema, el fármacoantitumoral puede ser adsorbidoa la superficiede la

nanopartículamagnética,lacualsedirigebajolaaccióndeuncampomagnéticoexternoal

tejidoespecíficodondeactuarádichofármacoevitandolosindeseadosefectossecundarios.

Sin embargo, el principal problemaasociadoa este sistemade liberación controladaes el

fenómenodeopsonización.

Este fenómeno se describe comoelmecanismopor el cual el sistema inmune elimina

agentesextrañosdelorganismotalescomopatógenosopartículasexógenas.Sebasaenel

recubrimientodelagenteextrañoporunasproteínasséricasdenominadasopsoninas.Existe

unaampliavariedadynaturalezadentrodeestetipodeproteínas,pudiendoenglobardesde

componentesfundamentalesdelsistemainmunológico,comolasinmunoglobulinasyciertos

elementosdelsistemadelcomplemento,hastaproteínasséricascomunes,comoelcolágeno

tipoI,laproteínaCreactivaolafibronectina.

Elprocesodeopsonización(Fig.1)comienzaconlaunióndelaopsoninaalelementoque

sedeseaeliminar.Estauniónestámediadanormalmenteporreceptoresyligandosespecíficos

ydalugaraunafuerteseñalizaciónqueactivaalascélulasfagocíticas,lascualesdestruyenel

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material exógenomediante fagocitosis. En el caso de las nanopartículas, se ha visto que,

generalmenteno son fagocitadasporel sistema inmune sinoque son secuestradasen los

sistemasfagocíticosmononucleares(MNP)(Owensetal.,2006).

Como consecuencia de la opsonización, el sistema inmune tratará de eliminar las

nanopartículasmagnéticasmediantediversosmecanismosqueincluyenlaadsorcióndelas

proteínasplasmáticasporlasuperficiedelananopartículayposteriordesorcióndelaproteína

farmacológicaasícomoelreclutamientodelascélulasfagocíticasycomponentesdelsistema

inmune que median el reconocimiento, digestión y eliminación de compuestos extraños

dentrodeltorrentesanguíneo.

Unposibleabordajeparapoderemplearlasnanopartículasmagnéticascomosistemasde

liberacióncontroladadefármacosypoderdirigirlashacialostejidosdianadelfármacoessu

recubrimientoconpolímerosneutroscongruposhidroxilossemejantesalaguatalescomoel

polietilenglicol(PEG),lapolivinilpirrolidona(PVP)oelpolivinilalcohol(PVA).Deestemodo,el

sistema inmune no detectaría las nanopartículas como agentes exógenos que han de

eliminarseyseevitaría,deformarelativamenteeficaz,elfenómenodeopsonización(Grefet

al.,1995).

Figura 1. Esquema del proceso de opsonización en el torrente sanguíneo ante la presencia denanopartículasmagnéticassinrecubrirporpolímerosneutros(A)yrecubiertasconPEG(B).(A)Unióndelasopsoninasalananopartícula(2).Activacióndemacrófagos(3).Acumulacióndelasnanopartículasenelhígadoparadetoxificar(4).(B)LapresenciadelPEGreducelaunióndelasopsoninas(2)yelsecuestroenelhígado(3).(Jokerstetal.,2011)

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1.1 Nanopartículasdemagnetita.

Losóxidosdehierrosoncompuestoscomunesenlanaturalezayfácilmenteobteniblesen

el laboratorio pormétodos fisicoquímicos. Sus principales formas son:magnetita (Fe3O4),

maghemita(γ-Fe3O4)yhematita(α-Fe3O4)(Tejaetal.,2009).

Lamagnetita,compuestodeinterésenestetrabajo,esunmineraldehierrodecoloración

negra perteneciente al grupo de las espinelas. Este mineral se encuentra en un amplio

escenarioenlanaturaleza,siendomáscomúnenrocasígneas,metamórficasysedimentarias.

Laestructuradelamagnetita(Fig.2)fueunadelasprimerasestructurasmineralesenser

definidamediantedifracciónderayosXen1915(Bragg.,1915;Nishikawa.,1915)Estetipode

mineralpresentaunaestructuratípicacorrespondientealasespinelasinversas.Sebasaenla

disposicióndelosionesdeoxígeno(32O2-)formandounaredcúbicacentradaenlascaras

(FCC).EncuantoalosionesFe,éstosseposicionanenfuncióndesuestadodeoxidación.Los

ionesFe2+selocalizanenloshuecosoctaédricosmientrasquelosionesFe3+seencuentranen

lostetraédricos.

Laprincipalpropiedadyaplicabilidaddelamagnetitaessufuertemagnetismodebidoa

queesconsideradoelóxidometálicodetransiciónconmayormagnetismo.Estapropiedad

viene ocasionada como consecuencia del alineamiento de los momentos magnéticos de

diversos elementos. En función de estos momentos magnéticos, existen diversos

comportamientos: ferromagnético, ferrimagnéticoyantiferromagnético (Tejaetal., 2009).

Concretamente, lamagnetita es considerada comoun compuesto ferromagnético ya que,

Figura2.Estructuradelamagnetita(Okubeetal.,2014).

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todossusmomentosmagnéticosseencuentranalineadossinnecesidaddelaaplicacióndeun

campomagnético externo. Esta propiedad, junto con su alta biocompatibilidad y su baja

toxicidad, favorece el desarrollo y caracterización de nanopartículas compuestas de este

elemento(Leslie-Pelecky.,1996).

Centrandosuaplicabilidadalaliberacióncontroladadefármacos,esdevitalimportancia

conocerquécomportamientopresentanaunpHfisiológico.Dadoquesupuntoisoeléctrico

(pI) es cercano a 6.5 (Fig.3), se puede concluir que se encontrarán en su forma neutra,

careciendodecualquier tipodecarga.Comoconsecuencia, tiendena formaragregaciones

dando como resultadopartículasdeundiámetroaparentemayoral de lasnanopartículas

individualesdispersas.

Figura3.RepresentacióndelpotencialZdelamagnetitafrentealpH.Comosepuedeobservar,elpuntoisoeléctricoescercanoa6.5.(Halperetal.,1971)

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1.2 Recubrimientodenanopartículasmagnéticasconpolielectrolitosaniónicos.

Unaposiblesoluciónplanteadapornumerososautoresparaestabilizarcoloidalmentela

nanopartículademagnetitaes recubrirla conunpolielectrolito (PE) (Tombáczetal.,2006;

Mendenhall et al., 1996), el cual puede definirse como un polímero que contiene grupos

ionizablesloscualespuedenestartotaloparcialmentedisociadosendisoluciónpresentando

una elevada carga superficial, lo que nos permitirá unir fármacos con carga neta opuesta

medianteinteracciónelectrostática.

Parallevaracaboesterecubrimientohemosutilizadoelácidopoliacrílico(PAA)(Fig.4),un

polímero formado por homopolímeros de ácido acrílico entrecruzados con un alil éter

pentaeritrol. A pH fisiológico, los grupos carboxilatos que presenta pierden los protones

adquieriendo carga negativa. La principal ventaja de este polielectrolito, es la capacidad

quelantededichosgruposcarboxilatoporlosionesFequehayenlasuperficiedelapartícula,

loquesumadoalainteracciónelectrostáticalarecubrirádeformaeficaz,almismotiempo

queevitasucorrosión(Hajdúetal.,2012).

A partir de este sistema propuesto de nanopartícula-PE como sistema de liberación

controlada intentaremos reducir el fenómeno de opsonización tratándolo con polímeros

neutros.

Figura4.Estructuradelácidopoliacrílico(PAA).ObtenidadeSigmaAldrich.

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1.3 Polímerosneutroscomotratamientodenanopartículasdemagnetitarecubiertasconpolielectrolito(NP-PAA).

Dadas las características fisicoquímicas que presentan este tipo de compuestos y los

estudiosquesehanrealizadosobresusefectossobrelosfluidosbiológicos,lospolímerosson

unapieza fundamentaleneldesarrolloy caracterizaciónde lasnanopartículasmagnéticas

comotransportadorasdefármacos.Laampliavariedaddematerialescandidatosarecubrir

nanopartículasmagnéticacreceenparaleloaldesarrollodenuevoscompuestospoliméricos.

Losempleadosparallevaracaboelobjetivodeestetrabajofueronlosiguientes:

1.3.1 PEG

El PEG (Fig. 5-2) es un polímero helicoidal constituido por repeticiones de unidades

formadasporóxidodeetileno(Li,Jetal.,2003).

LasíntesisdelPEGseproduceporunainteracciónentreelóxidodeetilenoconelagua,

etilenglicoluoligómerosdeetilenglicolpudiendosercatalizadaporbasesoácidos.

Elpolietilenglicolpresentaunagranversatilidadypuedeunirse,de formacovalente,a

otrasmoléculascomoproteínasfarmacéuticasporunmecanismoconocidocomoPEGilación

(Fig.5-3).Graciasaestemecanismoesposiblelamodulacióndelasolubilidaddelaproteína

unidaasícomolainterferenciaeneltamañofinaldelananopartícula(Illésetal.,2015).

Lagranimportanciaquepresentaestepolímerocomorecubrimientodenanopartículas

resideensubiocompatibilidadysolubilidadenagua(Barreraetal.,2008;Yangetal.,2014).

EstosaspectossonmuyimportantesdebidoaquesehaobservadoquelaPEGilacióndelas

nanopartículas magnéticas desnudas reduce el fenómeno de opsonización y, por tanto,

aumentaeltiempodecirculaciónensangre(Grefetal.,1995).

Figura5.EstructuraquímicadelmonómerodelPEG(1)asícomodelpolímeroneutro(2).RepresentacióndeunananopartículamagnéticarecubiertaporPEGoPEGilada(3).(Jokerstetal.,2011)

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1.3.2 PVA

ElPVA(Fig.6)esunpolímerohidrofílicoquefuesintetizadoporprimeravezporHermann

yHaehnelen1924mediantelasaponificacióndelpolivinilésterenunasolucióndeNaOH.Sin

embargo, el PVA comercial es producidomediante una hidrólisis del polivinil acetato. Sus

propiedadesestructuralesdependendelamasamoleculardelpolímeroyelgradodehidrólisis

alquesehasometido(Muppalanenietal.,2013).Esteúltimoaspectoesmuyimportanteya

queestárelacionadoconlasolubilidad.Sepuedeafirmarqueloscompuestosconmayores

gradosdehidrólisis son aquellosquepresentanmenor solubilidaden agua (Hassanet al.,

2000).

Estepolímeroseempleaundiferentesáreasbiotecnológicasybiomédicasdebidoasus

propiedadesfisicoquímicas,sufácilprocesadoysubajatoxicidad(Chiellinietal.,2003).

1.3.3 PVP

La PVP (Fig.7) es un polímero que presenta una conformación de “random coil” en

solucionesacuosas.EstáconstituidoporlapolimerizacióndelaN-vinilpirrolidona,lacualda

lugarapolímeroscondiferentespesosmolecularesenfuncióndelascondicionesasícomo

copolímerosy“entrecruzamientos”(cross-linked)dePVP.

Figura6.EstructuradelPVA.ObtenidadeSigmaAldrich.

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LasíntesisdelaPVPcomienzaapartirdelacetilenoyelformaldehídoque,porunaserie

dereaccionesquímicas,dalugaralaN-vinilpirrolidona.Paraobtenerlapolivinilpirrolidona,

esteúltimocompuesto sepolimerizaendiversascondiciones.Porunaparte, la síntesis se

puede realizar en agua, tomando el peróxido de hidrógeno como compuesto iniciador.

Paralelamente, se puede realizar la polimerización en solventes orgánicos siendo, en este

caso,elradicaldelsolventeeliniciadordelareacción.

Lapresenciadegruposhidrofóbicosasícomodehidrofílicospermitequeestepolímero

sea capaz de ser soluble tanto en agua como en solventes orgánicos. Además, la alta

higroscopiaquepresentaensolucionesacuosas,conviertenlaPVPenunpolímeroadecuado

paraserempleadocomorecubrimiento.Sinembargo,hayquerecalcarqueelpesomolecular

deestepolímerojuegaunpapelimportanteensuaplicabilidadbiomédicayaque,segúnel

tamañoquepresente,tendrámayorsusceptibilidaddeserexcretadoporelorganismo(Haaf

etal.,1985).

1.4 IsotermadeLangmuir.

Para caracterizar la capacidad de adsorción de estos sistemas vehiculizadores nos

basaremosenlaisotermadeLangmuir(Langmuir,1916),elcualindicaelgradodeadsorción

delasmoléculasqueseencuentrandispersasentreunafaselíquida/gaseosayunafasesólida

cuandosealcanzaelequilibrio.

La isoterma teórica de Langmuir (Fig.8) es un ejemplo de unmodelo de isoterma de

adsorciónenmonocapa.Estemodelodefiendequelafasesólidaproporcionaunaseriede

posiciones para la adsorción, donde, únicamente se adsorberá una molécula, la cual no

interaccionaráconlasmoléculasdeposicionesvecinas.Paradefinirconmayorexactitudeste

Figura7.EstructuradelaPVP.ObtenidadeSigmaAldrich.

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tipodeadsorción,elmodeloincluyeeltérminodegradoofactorderecubrimiento,θ.Este

factorindicalafraccióndelossitiosdeadsorciónaloscuálessehaunidounamoléculadel

soluto.

LaisotermadeLangmuirsepuededefinirmediantelasiguienteecuación:

θ = 𝑞

𝑄𝑚𝑎𝑥 =𝐾 · [𝑃]

1 + 𝐾 · [𝑃]; 𝐾 =𝑘𝑎𝑑𝑠𝑘𝑑

siendoqelrecubrimientoparaunascondicionesdadas,Qmáxelrecubrimientomáximo,K,la

constantedeequilibrioyP,laconcentracióndeproteínaenelequilibrio.

Sisetrabajaencondicionessaturantesdeproteína(Ec.1.1),siendolaconcentraciónde

ésta superior a la constante de disociación, el recubrimiento obtenido será el grado de

recubrimientomáximo.Deestemodo,setrabajaenlapartefinaldelaisotermaysehallael

valorconmayorfacilidad.Lapendientedelaecuacióndelarectaresultantederepresentarla

concentracióndeproteínafrentealaconcentracióndenanopartículaseráelrecubrimiento

máximooQmáx(Ec.1).

Figura8.IsotermadeLangmuir.

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𝑞 =𝑄𝑚𝑎𝑥 · 𝑘𝑎𝑑 · [𝑃]𝑘𝑑 + 𝑘𝑎𝑑 · [𝑃] → 𝑆𝑖𝑘𝑑 <<< 𝑃 → 𝑞 = 𝑄𝑚𝑎𝑥(𝐸𝑐. 1)

q = 𝑚𝑃𝑟𝑜𝑡𝑎𝑑𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑑𝑎

𝑚𝑁𝑃𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙= 𝑄𝑚𝑎𝑥

1.5 Lisozimacomoproteínamodelo.

Parallevaracabolosdiferentesensayosdeadsorciónseempleacomoproteínamodelo

lalisozima(Lzm)(Fig.9).Estaproteína,tambiénconocidacomomuramidasa,esunaenzima

glucosidasadescubiertaporAlexanderFlemingen1922(Fleming,1922)cuandoobservóque

lassecrecionesnasalespodíanmatardiversasbacterias.Estaenzimaseencuentraentodo

tipo de fluidos corporales como las secreciones lacrimales, saliva, lechematerna o suero

sanguíneo.

Suprincipal funciónradicaencatalizar lahidrólisisdeenlaceglucosídicoß1-4entreel

ácidoN-acetilmurámicoylaN-acetilglucosaminaenelpeptidoglicano,componenteprincipal

delasparedesbacterianas.Además,apartedehidrolizarenlaces,escapazderealizarotras

funcionescooperandoconelsistemainmunológicoconelfindeeliminarmicroorganismos

patógenos del organismo. De este modo, actúa conjuntamente con anticuerpos (igA

secretadas) y los factores del sistema del complemento para lisar bacterias como E.coli.

Figura9.Representaciónencartoondelalisozima.ObtenidadeProteinDataBank.(Código:5TK0)

14

También,juegaunpapelimportanteenlafagocitosis,durantelacualesliberadadelascélulas

granulocíticas(McClellandetal.,1975).

GraciasalosestudiosdePierreJollès(Jollèsetal.,1969),hoyseconocequelalisozima

presenta129residuosaminoacídicosqueformanunacadenapolipeptídicaentrecruzadapor

cuatropuentesdisulfuro intramoleculares.Elempaquetamientode la lasproteínasesvital

para definir y comprender su actividad. De estemodo, la conformación de la lisozima se

caracterizaporlapresenciadeestructurassecundariascomoalfahélicesyláminasbetacon

residuostantohidrofílicoscomohidrofóbicos.Esdeinterésresaltarelsitioactivodelaenzima,

caracterizadoporserunaespeciedegrietadondeelsustratoseuney,posteriormente,es

hidrolizado.

Lalisozimaesunaenzimaqueporsuestructura,estabilidadyempaquetamientoesdelas

másempleadasyestudiadaseninvestigaciónbioquímica.Aunqueéstaseencuentraentodos

losanimales,esdereconocerlaimportanciadelalisozimadehuevoblancodegallina,como

modelodenumerososestudios(Swaminathanetal.,2011).

En este trabajo, la cuantificación pormétodos espectrofotométricos de la lisozima se

realizamidiendosuespectrodesde400a240nm(Fig.10).Laabsorciónde luzUVdeesta

proteínaesgraciasalapresenciadeaminoácidosaromáticosensuestructura,talescomoel

triptófano (Trp), la tirosina (Tyr), ademásdepuentesdisulfuro. Concretamente la lisozima

presenta 6 Trp, 3 Tyr y 4 puentes disulfuro, donde todos contribuyen a su máximo de

absorcióna280nm(ε=2.653(mg/mL)-1cm-1).

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2. ANTECEDENTESYOBJETIVOS.

Losprimerosestudiosquedestacanlaimportanciadelasnanopartículasmagnéticascomo

transportadorasdefármacosseremontanaladécadadelos70(Senyetal.,1978;Widderet

al.,1978).Elprimerartículoquedemuestrasuusocomosistemas liberadoresde fármacos

tienesuorigenen1983,cuandoWideretal(Widderetal.,1983)probaronlaeficaciadelas

nanopartículastransportandodoxorubicinadirectamenteaunsarcomaderata.

Existennumerososartículosquedestacanlaimportanciadelabúsquedadeunasolución

alproblemadeopsonizacióndenanopartículasmagnéticas.Estosestudiospreviossecentran

enelrecubrimientodenanopartículasdemagnetitadesnudas(Owensetal.,2006).

En cuanto al PEG, son numerosos los estudios que resaltan su idoneidad como

recubrimientodadasubiocompatibilidadysucapacidaddegenerarunasuperficiehidrofílica

y,portanto,conmayorvidamediaeneltorrentesanguíneo(Moghimietal.,2001;Zhanget

al.,2002;Harrisetal.,2003).

Sin embargo, estudios más centrados en la caracterización de las nanopartículas

recubiertas de PEG buscan como objetivo el recubrimiento óptimo.Un caso es el trabajo

realizadoporIllésetal(Illésetal.,2015)enelqueseconcluyequeloscopolímerosdePEGcon

ungrannúmerodegruposfuncionalesCOOHsonlosrecubrimientosidóneos.Además,otros

aspectosestudiadossonsuabsorciónytoxicidadinvivo.Pisciottietal(Pisciottietal.,2014)

determinanque lasnanopartículasrecubiertasconPEGaumentabanconsiderablemente la

absorción en las células tumorales donde se deseaba actuar. Además, paralelamente,

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

240 260 280 300 320 340 360 380 400

Absorbancia

normaliza

da

Longitud deonda(nm)

Figura10.Espectrodeabsorcióndelalisozimaenunrangode240a400nm.

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realizaronestudiosdecitotoxicidad,demostrandoqueestoscompuestospresentabanbaja

toxicidad.

EncuantoalrecubrimientodelasnanopartículasconPVA,diversosautoresafirmanque

estetipoderecubrimientopermiteunaestabilidadcoloidalyuncomportamientomagnético

óptimo(Qiuetal.,2000).Sinembargo,estudiosmásrecientes(Nadeemetal.,2016)afirman

queunaumentoenlaconcentracióndePVAdisminuyeelmagnetismodelasnanopartículas.

Encuantoaotraspropiedades,elPVAdisminuyeeltamañodelasnanopartículasy,asuvez,

evitalaaglomeración.

LaPVP,porsuparte,tambiénmuestraevidenciasdeserunrecubrimientoprometedor

dentrodelcampodelabiomedicina.Huangetal(Huangetal.,2010)estudiaronelefectodel

tamañodelasnanopartículasrecubiertasenlaabsorcióncelularyllegaronalaconclusiónde

queeltamañodeéstasesdeterminante.Además,tambiénsehanrealizadoexperimentoscon

nanoparticulas recubiertas con PEG y PVP conjuntamente (Tu et al., 2013). Este tipo de

recubrimientoresultaenunabuenaestabilidadcoloidal.

OBJETIVOGENERAL:

Elobjetivodeestetrabajoeslabúsquedadepolímerosneutrosparaeltratamientode

nanopartículasdemagnetitarecubiertasconpolielectrolitosconelfindeevitaroreducirel

fenómenodeopsonización.

OBJETIVOSESPECÍFICOS:

- Síntesisdenanopartículasdemagnetita.

- Estabilizacióndelasnanopartículasdemagnetitamedianteelrecubrimientoconun

polielectrolitoaniónicoyposteriorcaracterización(tamañoycarga).

- DeterminacióndelacapacidaddeadsorcióndeLzmsobrenanopartículas-PE.

- Tratamiento de las nanopartículas-PE con diferentes polímeros neutros y posterior

caracterización(tamañoycarga).

- DeterminacióndelacapacidaddeadsorcióndeLzmsobrenanopartículas-PEtratadas

conpolímerosneutros.

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3. MATERIALESYMÉTODOS

3.1 Síntesisdemagnetita.

La síntesis de la magnetita se da por una reacción conocida como reacción de

coprecipitación(Massart,1981).

𝐹𝑒FG 𝑎𝑐 + 2𝐹𝑒IG 𝑎𝑐 + 8𝑂𝐻M(𝑎𝑐) → 𝐹𝑒I𝑂N 𝑠 + 4𝐻F𝑂 𝑙

Paraobtenerlasnanopartículasdemagnetitaporelmétododecoprecipitación,sedebe

partirdeunasolucióndeácidoclorhídrico(HCl)0,4MmezcladaconFe3+yFe2+enunratio

2:1,respectivamente.Estasoluciónsemantieneenagitaciónyseecha,gotaagota,sobreuna

solución básica de hidróxido de sodio (NaOH) 0,5 M preparada previamente. Una vez

finalizadalasíntesis,semantienelasoluciónenagitaciónduranteunahora.Elresultadofinal

esunasolucióndecoloraciónnegracompuestaporóxidoferrosoférrico(Fe3O4)omagnetita.

Cabe destacar que un posible problema asociado a la síntesis de la magnetita es la

oxidacióndelhierro,lacualdesencadenaríaproblemasdepureza.Porestemotivo,conelfin

de evitar dicha oxidación, todo el proceso de coprecipitación se da en una atmósfera de

nitrógeno,elcualdesplazatodoeloxígenopresenteyaunatemperaturade40°C.

Tras la síntesis de lamagnetita, las nanopartículas deben seguir un proceso de varios

lavadosconaguadesgasificada.Porúltimo,paramantenerlasenunasolucióndispersa, se

realizaunúltimolavadoconetanol.

3.2 Cuantificacióndelasnanopartículasdemagnetitaobtenidas.

Conelfindeconocerlaconcentracióndemagnetitaobtenidaenlasíntesis,serealizauna

cuantificaciónmediante residuo seco. Para ello, se añaden 2ml de las nanopartículas de

magnetitaobtenidasatrestubospesadospreviamenteysedejansecarenuntermobloque.

Unavezsetieneelresiduoseco,sepesaysecalculalaconcentracióndemagnetitaenfunción

delaalícuotaquesehaañadidoinicialmente.

3.3 Recubrimientodenanopartículasdemagnetitaconácidopoliacrílico.

Para recubrir las nanopartículas demagnetita, se preparan 1000ml de PAA de 15000

g/mola2,7mg/mlajustadopreviamenteapH9,0ysemantieneenagitación.Paralelamente,

seañadendesdeunabureta100mla4mg/mldenanopartículasdemagnetitaajustadasapH

11 y sonicadas previamente durante treinta minutos en intervalos de diez segundos de

sonicación y veinte segundos sin sonicación (para evitar un calentamiento excesivo de la

18

disoluciónempleandounbañodehielo),sobre ladisolucióndePAAysedejaenagitación

todalanoche.

Unavezrecubiertas,sebajaelpHa3,0yasíseconsiguequelasnanopartículasrecubiertas

conPAA(NP-PAA)decanten.Ladecantaciónseproduceporque,aestepHpordebajodelpka

delPAA(4,35),losgruposcarboxilatoseprotonany,portanto,sepierdecarga,loqueconlleva

aunapérdidadeestabilidadcoloidal.Unavezdecantadas,lasNP-PAApuedensersometidas

aunaseriedelavadoshastaque,finalmente,sesubeelpHa7,0.Enestascondiciones,lasNP-

PAA volverán a ser sometidas a procesos de sonicación para individualizarlas y poder

cuantificarlas.

3.4 CuantificacióndelasNP-PAApormétodoscolorimétricos.

ExistendiversosmétodosparacuantificarlapresenciadeFey,portanto,demagnetitaen

unamuestra.Concretamente,mediantecolorimetría,empleandoreactivosqueinteraccionen

conelhierroyformencomplejoscoloreados,sepuedehallar,deunaformacuantitativa,el

contenidoenhierrodelassolucionesdeseadas.

Eltiocianatodepotasio(KSCN)esuncompuestoquímicoquesecaracterizaporreaccionar

con diferentes elementos dando lugar a compuestos caracterizados por su coloración.

Concretamente, con los compuestos dehierro, el ion SCN- interacciona conel ion Fe3+. El

resultadodeestainteracciónesuncomplejodecoloraciónrojiza(Fe(SCN)2+),elcualsepuede

medirmediantetécnicasespectrofotométricasaunalongituddeondade474nm.Deeste

modo,sehalladeformaprecisaycuantitativalacantidaddehierropresenteenunamuestra

a estudio. Son numerosos los estudios que emplean este tipo de cuantificación dada su

precisiónyfacilidad(Niedzielskietal.,2014).

Lareacciónmencionadaentreelcompuestodehierroyeliondeltiocianatoeslasiguiente:

𝐹𝑒IG 𝑎𝑐 + 𝑆𝐶𝑁M 𝑎𝑐 → 𝐹𝑒 𝑆𝐶𝑁 FG(𝑎𝑐)

Unproblemaadicionalquepuedesurgiralahoradecuantificarlapresenciademagnetita

endiferentesmuestraseslaproblemáticaasociadaasucarácterdivalenteytrivalente.Yaque

lamagnetitaestáformadatantoporionesdehierroFe2+comoFe3+,lacuantificaciónconKSCN

podría ser imprecisa. Por este motivo, se requiere de un agente oxidante con el fin de

desplazar todo el hierro divalente de lamagnetita a hierro trivalente. Son numerosos los

agentesoxidantesempleadosenlaliteraturaparalacuantificacióndelhierropero,losmás

19

empleados son el peróxido de hidrógeno y el permanganato, siendo el primero el más

adecuado(Martinsetal.,2005).

2𝐹𝑒FG + 𝐻F𝑂F + 2𝐻G → 2𝐹𝑒IG + 2𝐻F𝑂

Este método de cuantificación es el empleado para hallar la concentración de las

nanopartículasrecubiertasconPAA.Paraello,sedisuelvenlasnanopartículasdemagnetita

recubiertasconPAAenunasoluciónconácidoclorhídrico(HCl6M),agua(H2O)yperóxidode

hidrógeno al 0,75% (H2O2). Seguidamente, se realizan una serie de diluciones, las cuales

contienenvolúmenescrecientesdeFe3+enHCl2M.

Ladeterminacióndelaconcentracióndenanopartículaserealizamediantelamedidade

laabsorbanciaaunalongituddeondade474nmdelasmuestraspreparadasjuntoconun

volumenfijodeKSCN2M,elcualseañadejustoantesdemedir.

Acontinuación,apartirdelaleydeLambert-Beer,conociendoelcoeficientedeextinción

delcomplejo,expresadoenfuncióndeconcentracióndeFe3+enmg/ml(Fig.11)(ε=218,51

(mg/ml)-1·cm-1)sehallalaconcentracióndelasmuestrasmedidasenelespectrofotómetro.

Unavezconocidas lasconcentracionesdehierrodelasmuestrasmedidas,secalcula la

concentracióndemagnetitamedianterelacióndesusmasasmolares.

Figura11.DeterminacióndelcoeficientedeextincióndelcomplejoFe·(SCN)2+enmedioácidoaunalongituddeondade474nm.

y=218,51xR²=0,999

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006

Absorbancia(@474nm)

[Fe3+](mg/mL)

20

3.5 AdsorcióndelisozimaalasNP-PAA.

ConelfindeconocercómosecomportanlasNP-PAAobtenidascomovehiculizadorasde

fármacos,seprocedearealizarunestudiotomandocomoreferencialaproteínalisozima.

ParaobservarelcomportamientodelasNP-PAAjuntoconlalisozimay,porúltimo,hallar

lacapacidaddeadsorciónmáxima, sepreparanunaseriede tubosconunaconcentración

crecientedenanopartícula(desde0hasta0,055mg/ml)yunaconcentraciónfijadeproteína

(0,3mg/ml).Además,lostubossemantienenaunpHde7,0debidoalaadicióndelbuffer

Hepes(10mMapH7,0).

Trasdejarlostubostodalanocheenagitaciónenunanoria,seseparanlasNP-PAAconun

imán y se cuantifica la lisozimaque queda en el sobrenadantemediante lamedida de su

espectro y cogiendo el valor de absorbancia a 280 nm. De este modo, mediante la

aproximacióndelaisotermadeLangmuir,sepuedehallarlacapacidadmáximadeadsorción

delaproteína(Qmáx),lacualsirvecomoreferenciaalahoraderealizarlosestudiosconlos

polímeros.

3.6 TratamientodelasNP-PAAconPEGdediferentespesosmoleculares,PVPyPVA.

UnavezrealizadoslosestudiosdeadsorcióndelasNP-PAAjuntoconlaproteínamodelo,

seprocedeacaracterizarlasNP-PAAquehansidotratadascondiferentespolímerosneutros

candidatosaevitarelfenómenodeopsonización.

Para ello, se preparan una serie de tubos en las que la concentración de NP-PAA y

polímeroescrecienteyconuna relaciónenmasa1:10, respectivamente (desde0a0,055

mg/mldenanopartícula).Porsuparte,laconcentracióndelisozimasemantieneconstanteen

0,5mg/mldurantetodoelexperimento.Además,graciasalaadicióndelbufferHepes(10mM

pH7.0),lostubosseencuentranencondicionesfisiológicas.

Para la realización del experimento, primeramente, se añaden todos los volúmenes

requeridosaexcepcióndelalisozima.Unavezpreparadoslostubossemantienendurante

unahoraenlanoriaparafavorecerlainteracciónentrelasNP-PAAyelpolímero.Pasadala

hora,seañadeelvolumenfaltantedelisozimaysemantienendurantetodalanocheenla

noriapara,finalmente,separarlostubosenelimánymedirelespectrodelalisozimapresente

enelsobrenadante,esdecir,lacantidaddeproteínanoadsorbidaporlasnanopartículas.

21

3.7 Medicióndeltamañoycargadelasnanopartículasobtenidas.

EltamañodelasNP-PAAsedeterminómediantedispersióndeluzdinámica(DLS,Dynamic

Light Scattering) en el instrumento Brookhaven Mod 90 Plus (New York, EE.UU.). Este

instrumento mide el diámetro hidrodinámico de las partículas esféricas a partir de la

dispersióndeluzyteniendoencuentalavelocidadalaquesedifundensegúnelmovimiento

browniano,movimientoaleatoriodelaspartículasdebidoalsolventeenelqueseencuentran.

Concretamente, para medir el tamaño de las partículas se requiere el coeficiente de

difusióntraslacional,halladoapartirdelaecuacióndeStokes-Einstein:

𝑑 𝐻 = 𝑘𝑇

3 · 𝜋 · η · D

dondedeseldiámetrohidrodinámico,Delcoeficientededifusióntranslacional,klaconstante

deBoltzmann,Tlatemperaturaabsolutayη,laviscosidad(DLStechnicalnote).

Conelmismoinstrumentotambiénsehallalacargadelasuperficiedelasnanopartículas,

apartirdelpotencialZ,elcualesunamedidadelamagnituddelarepulsiónoatracciónentre

partículas. La magnitud del potencial Z informa sobre la estabilidad del sistema coloidal.

Partículasensuspensiónconungranvalor (negativoopositivo)depotencialZ tenderána

repelersemientrasquepartículasconvaloresbajosdepotencialZacabaránagregando.

ExistendiversosfactoresqueafectanalpotencialZcomoeselpH,laconductividadyla

concentracióndeloscomponentesaestudio(DLStechnicalnote).

TantolamedidadeltamañocomodelacargaporDLSrequierequelasmuestrasestén

diluidas,locualesunadesventajadelatécnica(BhattacharjeeS.,2016).

3.8 InfluenciadelacantidaddepolímeroneutrosobrelasNP-PAAtratadasconPEG400.

Elexperimentopartedelapreparacióndeunstockconconcentracionesde0,1mg/mly

100mMdeNaClconstantesmientrasquesevaríalaconcentracióndelPEG400(desde0hasta

1 mg/ml). A continuación, se disponen los tubos preparados en el imán y se mide el

sobrenadantecadacincominutosaunalongituddeondade440nm.

4. RESULTADOS

Tras emplear el método de coprecipitación para sintetizar magnetita, se obtiene una

concentraciónde14,86mg/mldeterminadamedianteresiduoseco.Estamagnetita,comose

22

ha comentado, apH cercanosa supI (6,5)noesestable coloidalmente y tiendea formar

agregadosporloquelacaracterizaciónporDLSnoesposible.LapresenciadelPAAdotade

cargaalasnanopartículasy,deestemodo,semantienenestablescoloidalmente,obteniendo

unaconcentraciónparanuestrostockde5,5mg/mldeterminadamediantelaformacióndel

complejoFe(SCN)2+.LaposteriorcaracterizaciónmedianteDLSindicaqueapH7presentan

untamañode92,3±0,9nmyunacargade-17,0±1,9mV,confirmandoqueelrecubrimiento

hasidoeficazdadoeltamañoquepresentanylacarga(apH7lasnanopartículassinrecubrir

poseenuntamañomicrométricodebidoalaagregación).

4.1 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAA.

Medianteelempleode laaproximaciónde la isotermadeLangmuiren lascondiciones

descritasenmaterialesymétodosesposibledeterminarlacapacidadmáximadeadsorción

de la lisozima. En la Fig.12 se representa la concentración de lisozima que queda en el

sobrenadantetrashaberdecantadomagnéticamentelasnanopartículasmedianteuncampo

magnéticoexternofrentealaconcentracióndenanopartículaquehabíainicialmenteenel

medio. A medida que aumenta la concentración de nanopartícula, la concentración de

lisozima disminuye en el sobrenadante, obteniendo una recta cuya pendiente podemos

relacionarconlacapacidadmáximadeadsorción.

ElvalordeQmáxobtenidoparalasNP-PAAdeesde2,10mgdelisozima/mgdenanopartícula.

ObtenidalacapacidadmáximadeadsorcióndeLzmporpartedelasNP-PAA,tratamoslas

nanopartículascondistintospolímerosneutros,ydeterminamossucapacidaddeadsorción.

y= -2,10x+0,30R²=0,970

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Liso

zima](m

g/ml)

[NPs](mg/ml)

Figura12.Determinaciónde lacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAA.

23

A partir de estemomento, en todas las gráficas siguientes donde se estudia la capacidad

máxima de adsorción se representa la concentración de lisozima que queda en el

sobrenadantetrashaberdecantadomagnéticamentelasnanopartículasmedianteuncampo

magnético externo frente a la concentración de nanopartícula (NP-PAA tratadas con el

polímeroneutroqueseindica)quehabíainicialmenteenelmedio.

4.2 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares.

ConelusodePEGdediferentespesosmolecularessepretendeestudiarsiseproducen

cambios, tanto positivos como negativos en cuanto a su capacidad para disminuir la

opsonización,ydehaberlossiexisteunacorrelaciónconlavariacióndesupesomolecular.

- PEG400g/mol

UnaveztratadaslasNP-PAAconPEGde400obtenemosuntamañode94,1±1,9nmy

unacargade-21,9±1,6mVmediantemedidasdeDLSyPZ.

Tras hacer el ensayo con estas partículas obtenemos que la capacidad máxima de

adsorciónesde2,68mg/ml(Fig.13).

ParaconocersiunaumentodeconcentracióndePEG400conllevaunaagregacióny,por

tanto,unefectoenlaestabilidadcoloidal,serealizaunexperimentoconcantidadescrecientes

deéste,enpresenciade100mMdeNaCl,condicionesenlascualeslasNPtiendenaagregar

debidoalapantallamientodelascargasquepresenta(Fig.14).Enestagráficaserepresentala

densidadópticadelsobrenadantetrashaberincubadolasnanopartículasenlascondiciones

y=-2,68x+0,50R²=0,940

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Liso

zima](m

g/ml)

[NPs](mg/ml)

Figura13.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPEGde400g/mol.

24

anteriormente indicadas (materiales ymétodos) y ser sometidas a una fuerzamagnética

externa,frentealtiempo.

Tras una hora de incubación, se observa que la cantidad de PEG no afecta

significativamente a la estabilidad coloidal de las nanopartículas, recuperando

aproximadamenteel80%delasnanopartículasiniciales.

- PEG4000g/mol

UnaveztratadaslasNP-PAAconPEGde4000obtenemosuntamañode95,5±0,5nmy

unacargade-22,6±1,1mVmediantemedidasdeDLSyPZ.



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60 70

Abs(@440nm

)

Tiempo(min)

NP-PAA

NP-PEG400:0,55mg/ml

NP-PEG400:1mg/ml

Figura 14. Variación de la estabilidad coloidal de las NP-PAA tratadas con PEG 400mediantemedidadedispersiónópticaa440nmfrentealtiempo.

25

- PEG35000g/mol

UnaveztratadaslasNP-PAAconPEGde35000obtenemosuntamañode98,5±0,2nm,y

unacargade-17,9±0,2mV.



y=-2,27x+0,50R²=0,980

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Liso

zima](m

g/ml)

[NPs](mg/ml)

y= -1,56x+0,50R²=0,840

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Liso

zima](m

g/ml)

[NPs](mg/ml)

Figura15.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPEGde4000g/mol.

Figura16.Determinaciónde lacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPEGde35000g/mol.

26

4.3 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVP.

TrastratarlasNP-PAAconPVPobtenemosuntamañode100,7±1,1nm,yunacargade-

12,1±1,2mVmediantemedidasdeDLSyPZ.



4.4 DeterminacióndelaQmáxdelalisozimaadsorbidasobrelasNP-PAAtratadasconPVA.

TrastratarlasNP-PAAconPVAobtenemosuntamañode101,7±0,5nm,yunacargade-

18,8±1,3mVmediantemedidasdeDLSyPZ.



y= -1,55x+0,50R²=0,800

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Liso

zima](m

g/ml)

[NPs](mg/ml)

Figura17.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPVP.

27

5. DISCUSIÓN

Lasíntesisdenanopartículasdemagnetitamedianteelmétododecoprecipitaciónesun

buenmétodopara suobtenciónyaqueel comportamientoquepresentanesel esperado

(magnetismo,bajaestabilidadapHfisiológico…).

TrasrecubrirlasnanopartículasdemagnetitaconunpolielectrolitoaniónicocomoelPAA,

lasnanopartículasaumentansuestabilidadcoloidal(vertamañoycargaenTabla1),siendo

unbuencandidatoparaestabilizarlas,yaqueademásdepresentaraltadensidaddecarga,sus

gruposcarboxilatoseunendeformamuyefectivaalasuperficiedelananopartículadadosu

capacidadquelantehacialosmetales,enestecasohaciaelhierro.

UnavezcaracterizadaslasNP-PAAdeterminamoslacapacidaddeadsorciónquetienen

cuandoenelmedioenelqueseencuentranhaypresenteunaproteína,comoeslalisozima,

la cual a pH 7 posee carga neta positiva. Debido a la alta densidad de carga que el

polielectrolitoexponehaciaelmedio,esperamosquelacapacidaddeadsorciónseaelevada,

yaqueelnúmerodecontactosconrespectoalapartículadesnuda(inestable)haaumentado.

Trasrealizarelestudiodesucapacidaddeadsorciónmediantelaaproximacióndelaisoterma

deLangmuir,obtenemosunacapacidaddeadsorciónde2,10mgLzm/mgNP-PAA,loquenos

indicaquelaNP-PAAescapazdeadsorbereldobledesumasa.

Sintetizarunasnanopartículasconaltacapacidaddeadsorción,puedesercontradictorio

paraelobjetivoqueplanteamos,yaquesilacapacidaddeadsorcióneselevada,elfenómeno

deopsonización se verá favorecido, pero a su vez, permitiría administrar una cantidadde

y= -5,13x+0,50R²=0,900

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Liso

zima](m

g/ml)

[NPs](mg/ml)

Figura18.Determinacióndelacapacidadmáximadeadsorciónde lasNPrecubiertasconPAAtratadasconPVA.

28

nanopartículamásreducidatransportandolamismacantidaddefármaco,siempreycuando

hayamossidocapacesdereducirdichofenómeno.

Paraintentarreducirlohacemosusodepolímerosneutros,deloscualesalgunosdeellos

yahansidoutilizadospararecubrirNPdemagnetita“desnudas”ysehavistoquereducenla

opsonización(Owensetal.,2006).

Los polímeros elegidos para tratar nuestras partículas recubiertas de PAA e intentar

reducirlaopsonizaciónhansido;polietilenglicol(PEG)dedistintopesomolecular(400,4000y

35000g/mol),polivinilalcohol(PVA),ypolivinilpirrolidona(PVP).Lacaracterizaciónobtenida

medianteDLSdelasdiferentesNP-PAAtratadascondiferentespolímerosneutrosrevelanlos

siguientesresultados(Tabla1).

Muestra Tamaño(nm) PotencialZ(mV)

NP-PAA(Control) 92,3±0,9 -17,0±1,9

NP-PEG400 94,1±1,9 -21,9±1,6

NP-PEG4000 95,5±0,5 -22,6±1,1

NP-PEG35000 98,5±0,20 -17,9±0,9

NP-PVP 100,7±1,1 -12,1±1,2

NP-PVA 101,7±0,5 -18,8±1,3

Una posible consecuencia del recubrimiento de las nanopartículas magnéticas con

polímeroseslaalteracióndeltamañoysuscaracterísticas(pérdidadelacapacidadmagnética,

aumentodelcomportamientocoloidal,agregación…).Sinembargo,comosepuedeobservar,

eltamañodelasNP-PAAtratadasconlosdiferentespolímerosneutrossemantienecercano

alos90-100nm,pudiendoatribuirestadiferenciadetamañoalposible“recubrimiento”de

lasNP-PAAporpartedelospolímerosneutros.Sinembargo,lacargadelasNP-PAAtratadas,

no parece tener una tendencia, siendo todas negativas, lo que parecería indicar que si el

polímeroneutroestá “recubriendo” lapartícula lopodríahacerde forma localizada sobre

distintospuntosdelasuperficie,perodejandoexpuestaslamayoríadesuscargasnegativas.

Tabla1.ComparativadetamañosycargadeNP-PAAyNP-PAAtratadascondistintospolímerosneutros.

29

TomandocomoreferenciaelvalordeQmáxparalasNP-PAA(2,10mgLzm/mgNP-PAA),y

tratandoestasNP-PAAconpolímerosneutrosveremossicambialacapacidaddeadsorción

sobrelaproteínaindicandoportantosielpolímeroeseficazparadisminuirelfenómenode

opsonización,osiporelcontrarioloaumenta.

5.1 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconPEGdediferentespesosmoleculares.

Encuantoa sucomportamientoenpresenciadeconcentracionesaltasdePEG400, se

puede observar que la estabilidad de la nanopartícula es prácticamente la misma que el

control(NP-PAA).Portanto,a100mMdeNaCl,lasNP-PAAtratadascondistintascantidades

dePEG400mantienensuestabilidadcoloidal.

ParadiscutirsobrelacapacidaddeadsorcióndecadaNP-PAAtratadasconestepolímero

recogemoslasQmáxenunatabla(Tabla2).

Muestra Qmáx(mgLzm/mgNP-PAA)

NP-PAA(Control) 2,10

NP-PEG400 2,68

NP-PEG4000 2,27

NP-PEG35000 1,56

LosresultadosobtenidosindicaríanqueelPEGde400g/molpareceríaaumentarun28%

lacapacidaddeadsorciónde lananopartícula,con locualnoseríaelmejorpolímeropara

tratarlasuperficie,yevitarlaopsonización.Amedidaqueaumentamoselpesomoleculardel

PEG vemos que la capacidad de adsorción con respecto al de menor peso molecular

disminuye,siendoprácticamentelamismaquelasNP-PAAsintratarcuandousamoselPEG

de4000,peroalrededordeun26%menorconelusodePEGde35000.Estopodríadebersea

que a medida que aumenta el número de monómeros de polímero la NP-PAA podría

encontrarse más “solvatada” por estos, haciendo disminuir su capacidad de adsorber la

lisozima.

LosresultadosobtenidostrasrealizarlacaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconPEG

dediferentespesosmolecularespareceríanindicarqueelpolímeroquemayorefectotendría

Tabla2.ComparativadelacapacidaddeadsorcióndeLzmparaNP-PAAyNP-PAAtratadasconPEGdedistintopesomolecular.

30

sobrelainhibicióndelaopsonizaciónseríaelPEGde35000g/mol.Estodeberíaestudiarse

másafondoutilizandocantidadesmayoresdePEGparaconfirmarsisupresenciaevitacasi,

oporcompleto,laadsorcióndelaLzm.

5.2 CaracterizacióndelasNP-PAAtratadasconotrospolímerosneutros:PVPyPVA.

EmpleandootrospolímerosneutroscomolaPVPoelPVA,losresultadosindicanquela

presenciadeestospolímerosafectadeformadiferentealaQmáx(Tabla3).

Muestra Qmáx(mgLzm/mgNP-PAA)

NP-PAA(Control) 2,10

NP-PVP 1,55

NP-PVA 5,13

Encuantoa los resultadosobtenidoscon laPVP, seobtienenvalores semejantesa los

obtenidosconelPEGdemayorpesomolecular.Estosresultadosindicaríanqueestetipode

polímero,inhibiríaelfenómenodeopsonizaciónalrededordeun26%,porloqueseríaotro

candidatoparahacerunestudiomásexhaustivoempleandocantidadesmayoresdepolímero

yversilareduccióndelacapacidaddeadsorciónescasitotaloprácticamentetotal.

Por otro lado los resultados obtenidos con el recubrimiento con PVA indican que la

capacidad de adsorción aumenta un 144% con respecto a laNP-PAA, por lo que sería un

polímeroinadecuadoparaelobjetivoquesehaplanteadoenestetrabajo.Porotrolado,se

abriríalaposibilidaddeutilizarlasNP-PAAtratadasparaotrasaplicacionesdondeserequiera

deunamayorcapacidaddeadsorción.

6. CONCLUSIONESYPROYECCIÓNFUTURA

CONCLUSIONES:

Lasíntesisdenanopartículasdemagnetitamedianteelmétododecoprecipitaciónysu

posteriorrecubrimientoconPAAenlascondicionesanteriormentedescritas,resultaseruna

buena estrategia para obtener nanopartículas con una elevada estabilidad coloidal y un

diámetrodealrededorde100nm.

Tabla3.ComparativadelacapacidaddeadsorcióndeLzmparaNP-PAAyNP-PAAtratadasconPVPyPVA.

31

LasNP-PAAdemuestran tenerunaelevada capacidaddeadsorción, siendocapacesde

adsorberalrededorde2gdelisozimaporgramodemagnetita.

LasNP-PAAtratadascondistintospolímerosneutros(PEG,PVA,PVP)noparecenafectar

aldiámetrohidrodinámicoycargadelananopartículay,comoconsecuencia,presentanuna

estabilidadcoloidalsimilaralaqueescaracterísticadelasnanopartículasnotratadas.

La presencia en la disolución de polímeros neutros como el PEG 400 o el PVA parece

aumentar lacapacidaddeadsorciónde lasnanopartículasrecubiertasconPAA,por loque

tienenunefectocontrarioalbuscado(inhibiciónparcialdelaadsorciónproteica)aumentando

portantoelfenómenodeopsonización.

Porsuparte,lapresenciadePEG4000parecetenerunefectoneutroenloqueserefiere

alacapacidaddeadsorcióndelasnanopartículasrecubiertas,NP-PAA.

Porúltimo,tantoelPEG35000comoelPVPdemuestrantenerunciertoefectoinhibitorio

delaadsorcióndelisozimaalasnanopartículasrecubiertas,reduciendoalrededordeun26%

la cantidad de proteína adsorbida por lo que ambos polímeros neutros podrían ser dos

candidatosparareducirelfenómenodeopsonización.

PROYECCIÓNFUTURA:

Traslarealizaciónyconclusióndeestetrabajo,surgeunabanicodeposiblesproyecciones

futurasaabordar.

- EncontramosresultadospositivostantoconlaPVPcomoconPEGde35000cuando

trabajamos en relaciones 1:10 en masa de NP-PAA:polímero neutro. Podríamos

plantearsistemasenelque larelacióndepolímero/nanopartícula fuesemayora la

estudiadaenestetrabajo,paraconfirmarquesepuedereduciraúnmáslacapacidad

deadsorcióndelananopartículatratada.

- Dado que con el PEG se han obtenido resultados positivos, la búsqueda y

caracterizacióndelPEGdepesomolecularóptimopodríaserunfuturoabordajepara

nuevosestudios.Eneste trabajo sehaestudiadoelPEGde trespesosmoleculares

diferentes (400, 4000 y 35000 g/mol, respectivamente) obteniendo resultados con

sutiles diferencias, siendo el PEG 35000 el recubrimiento con el que se obtienen

resultadosmásprometedores.Portanto,estudiosmáscentradosenestetipodePEG

podríanserclavesalahoradeobtenerunrecubrimientoóptimodeNP-PAAconfines

32

biomédicos.También,tomandocomobaselaidoneidaddelPEG,sepodríanrealizar

estudios con copolímeros de PEG como los polisorbatos, los poloxámeros o las

poloxaminas.

- Otra posibilidad que surge tras la finalización de este trabajo es la realización de

estudios similares empleando otro tipo de polímeros neutros como agentes de

recubrimiento encontrados en la literatura tales como el ficol, la poliacrilamida o

diversospolisacáridos.UnejemploquedareflejadoenlareviewrealizadaporColeet

al(Coleetal.,2011)(Fig.19).

- Otra propuesta interesante es lamodificación de la superficie de la nanopartícula

empleandootrotipodeestrategia.LosestudiosrealizadosporVeisehetal(Veisehet

al.,2010)recopilanlasprincipalesestrategiasparamodificarlasuperficiedelasNP-

PAA incluyendo la conjugación directa o mediada por un “linker” así como la

modificación de la superficiemediante interacciones físicas como las hidrofóbicas,

electrostáticas o de afinidad por ligando. Por tanto, siguiendo elmismo protocolo

realizadoenestetrabajooempleandootratécnicaparamodificarlasnanopartículas,

se pueden ampliar los resultados y las posibilidades de obtener un recubrimiento

acordealobjetivoplanteado.

Figura 19. Posibles recubrimientos poliméricos de nanopartículas magnéticas.(Coleetal.,2011)

33

Es de destacar la posible futura aplicabilidad de las NP-PAA tratadas con PVA, ya que

podríasermuyútilparaaplicacionesdondelacapacidaddeadsorcióndeproteína,partiendo

delamismaNP-PAAfuesenmayores.

Por último, los resultados obtenidos en la realización de este trabajo refuerzan la

necesidadderealizarestudiosposterioresconelfindeobtenerresultadostotalmenteacordes

alobjetivopreviamenteplanteado.

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