trabajo MS

Análisis por cromatografía y técnicas afines.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS).

Ventajas:

1. Se requiere poquísima cantidad de compuesto y a la vez, puede obtenerse mucha información sobre el mismo.

2. En su fundamento no se ve implicado ningún fenómeno de absorción y/o emisión de radiación.

3. Lo que suele usar, por ejemplo, es un haz de electrones de alta energía, el cual produce fragmentaciones de las moléculas.

4. La masa de los distintos fragmentos y su abundancia relativa nos provee de información de gran importancia para la elucidación de la correspondiente estructura molecular.

Desventajas:

1. El inconveniente principal es su carácter destructivo. Es una técnica basada en la rotura de las moléculas para generar fragmentos, por lo que se destruye la muestra, haciendo imposible su recuperación.

IONES METAESTABLES.

Para que un ión puede observarse mediante esta técnica debe tener una existencia que dure al menos el tiempo que tarda en recorrer el analizador. Según esto podemos hacer la siguiente clasificación:

Iones estables, duran aprox. 10 µs. Iones inestables, duran aprox. Menos de 1 µs. No saldrá de la cámara

de ionización. Iones metaestables, con un tiempo de vida media comprendido entre

10 y 1 µs. Se descompondrán a lo largo del trayecto, por lo que llegarán al colector/detector con una masa distinta a la de partida.

Supongamos que de la cámara de ionización sale un ión A+ y descompone durante el trayecto dando un nuevo ión E+ y perdiendo una molécula neutra N (o un radical sin carga):

A+ -> E+ + N

Pues bien, se demuestra: m* = mE2/mA, siendo m* la masa aparente

del ión que aparece; mE, la masa del nuevo ión E+ y mA, la masa del ión original A+.

Características a destacar de los iones metaestables:

Suelen generar picos anchos (no agudos como los observados en los espectros normales).

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Su masa aparente es menor que la de los dos iones que dan lugar a su aparición, menor que mE y que mA.

La aparición de uno de estos picos en el espectro de masas indica de manera inequívoca la presencia de un proceso de fragmentación entre los dos iones implicados.

REGLAS GENERALES DE LA FRAGMENTACIÓN DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS.

Las fragmentaciones responden a alguna de las cuatro reglas siguientes (con independencia del tipo de rotura homo o heteronuclear):

1ª REGLA: “Los enlaces C-C se rompen preferentemente por los puntos de ramificación”. La carga positiva quedará sobre el carbocatión más estable, siendo la estabilidad de estos: Terciario > Secundario > Primario > Metilo.

2ª REGLA: “Los enlaces dobles o sistemas de dobles enlaces (entre ellos los aromáticos) favorecen la escisión de los enlaces arílicos y bencílicos”. La carga positiva quedará normalmente formando un carbocatión arílico o bencílico. En este ultimo caso debemos hacer notar que no es un catión bencilo lo que se forma sino que este sufre un reagrupamiento dando lugar a la formación del ión tropílio (C7H7

+) que es más estable que aquel al ser aromático.

Caso especial: los cicloalquenos sufren la fragmentación simultánea de ambos enlaces (reacción de retro Diels-Alder). Esto es debido a que tienen dos enlaces en posición alílica.

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3ª REGLA: “Los heteroátomos, como donadores de electrones, favorecen la fragmentación de los enlaces del átomo de Carbono que soporta al heteroátomo”. Debemos considerar dos casos:

o Heteroátomo unido al carbono mediante enlace simple.Podrían romperse bien el enlace C-X o bien el enlace C-C-X, quedando la carga sobre el fragmento que la estabilice mejor. Si el enlace que se escinde es el del carbono con el heteroátomo la carga queda preferentemente sobre el átomo de carbono.

Aquí tenemos un ejemplo de las dos posibilidades (ruptura del enlace C-X y del enlace C-C-X):

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o Heteroátomo unido al carbono mediante enlace doble.Si se trata de un grupo carbonilo (C=O), el ión más estable suele ser el ión acilo (RCO+).

4º REGLA: “Los dobles enlaces y los heteroátomos favorecen, como aceptores de Hidrógeno, la transposición de un hidrógeno a través de un estado cíclico de transición de seis miembros”. Conocido como transposición específica de hidrógeno o transposición de McLafferty”.

Características de dicha transposición:1. Suele ponerse en evidencia por la formación de iones de masa par a

partir de iones moleculares pares.2. Para que se produzca debe haber un átomo de H en una posición

espacial adecuada con respecto al doble enlace aceptor de dicho H.

EM – IE DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS.

Veremos las fragmentaciones más usuales de las diversas funciones orgánicas:

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Hidrocarburos saturados:

1. Aparece pico molecular (a veces con intensidad baja).2. Espectro con conjunto de picos separados en 14 unidades de masa.3. Picos más intensos: los de C3 (m/e = 43) y los de C4 (m/e = 57).4. Si hay ramificaciones, estas serán los puntos de rotura, aumentando

la intensidad de los iones secundarios frutos de dichas roturas.

5. Los hidrocarburos saturados alicíclicos suelen presentar un pico molecular intenso. Suelen ser espectros complejos en los que

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predominan las pérdidas de etileno (M-28) y la pérdida de la cadena lateral (en caso de existir).

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Hidrocarburos insaturados:

1. Aparece pico molecular, aparentemente formado por pérdida de un electrón π.

2. Picos más representativos: debidos a cationes alílicos formados por la 2ª regla de las fragmentaciones.

3. A tener en cuenta la posibilidad de transposiciones, reagrupaciones y transposición de McLafferty.

4. En los cíclicos suele observarse la formación de los iones correspondientes a la Retro-Diels-Alder.

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Hidrocarburos aromáticos:

1. Aparece intenso pico de ión molecular. 2. Si son ramificados, alquilbencenos, la rotura más típica corresponde a la

formación del ión tropilio (C7H7, m/e 91).3. Si hay cadena lo suficientemente larga se generan picos por la

transposición McLafferty.

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Haluros:

1. F y I monoisotópicos.2. Cl: dos picos correspondientes al ión molecular de masas M y M+2.

Este último con 1/3 de intensidad con respecto al de M.3. Br: dos picos correspondientes al ión molecular de masas M y M+2.

Este último con aproximadamente igual intensidad que el M.4. Fragmento más abundante: corresponde a la rotura del enlace C-X

dando lugar a C+ (3ª Regla de la fragmentación simple). 5. Frecuente pérdida de HCl y formación del alqueno. 6. Aparición de iones bromonio cíclicos cuando se puede formar anillo

de 5 miembros.

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Alcoholes:

1. Alcoholes primarios y secundarios: débil pico de ión molecular.2. Alcoholes terciarios: no presenta este pico.3. Fragmentaciones más frecuentes:

Deshidratación (M-18). Rotura de un enlace del C que tiene el grupo –OH, que da

iones tipo: R2C+--OH estabilizados por resonancia con el O.4. Alcoholes bencílicos: dan intenso pico de ión molecular, pudiendo dar

el M-1 (hidroxitropilio) y/o el M-18 por efecto orto.

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Fenoles:

1. Aparece intenso pico de ión molecular.2. Pico característico a M-28 (pérdida de CO).

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Éteres:

1. Picos parecidos a los de los alcoholes. 2. Fragmentaciones más frecuentes:

Rotura del enlace C-O quedando la carga sobre el radical alquílico (salvo en el caso de los aromáticos en que dicha carga suele quedar tanto sobre el anillo aromático como sobre el fenóxido).

Rotura del enlace C-COH, dando lugar a iones del tipo: R2C+--OR estabilizados por resonancia por el O.

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Aldehídos:

1. Alifáticos: pico débil de ión molecular.2. Dan rotura del enlace en alfa respecto al grupo C=O: picos M-1 y 29

(CHO).3. Si poseen H en gamma pueden dar transposición de McLafferty.

4. Aromáticos: presentan pico de ión molecular intenso.5. Picos intensos M-1, que suele dar la pérdida de CO para producir

iones fenílicos

Cetonas:

1. Aparece pico de ión molecular intenso. 2. Fragmentación análoga a la de aldehídos: se forma el ión acilo

(RCO) por pérdida del resto alquílico más voluminoso.3. Pico base a m/e = 43 (CH3CO).

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3-fenil-2-propenal



4. Si poseen H en gamma pueden dar transposición de McLafferty.

5. Aromáticas: presentan como pico base el del ión benzoilo, m/e = 105.

Ácidos:

1. Presentan un pico a m/e = 45, que se corresponde con COOH.2. Si poseen H en gamma pueden dar transposición de McLafferty, así

en los alifáticos el pico base es el de m/e = 60 (CH2=C(OH)2).

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3. Aromáticos: pico M – 17 muy intenso, correspondiente al ión acilo. (Para estudiarlos por masas se usan sus ésteres metílicos).

Ésteres:

1. Ésteres metílicos: dan como iones fundamentales el ión acilo (RCO) y el carboximetilo (OCOCH3, m/e 59).

2. Ésteres de cadena larga: dan el producto de Transposición de McLafferty (m/e 74: CH3COH=CH2). Los de etilo y superiores suelen dar el ión R-COOH debido a la Transposición de McLafferty.

3. Ésteres provenientes de ácidos aromáticos: dan iones acilo (ArCO) al perder el radical alcoxilo y transposiciones de McLafferty.

4. Ésteres bencílicos: dan un pico a M – 42 por pérdida de cetena (CH2=C=O).

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Aminas:

1. Alifáticas: no presentan pico de ión molecular.2. Pico más intenso: debido a pérdida de un grupo alquilo en beta

respecto al N ((R2C=N+R'2), que en aminas primarias corresponde a m/e 30 (CH2=N+H2).

3. Aromáticas: dan pico de ión molecular intenso acompañado de un moderado M-1.

Amidas:

1. Suele observarse el pico molecular. 2. Amidas primarias: se identifican por un pico a m/e 44 (NH2=C=O).

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3. Suelen dar transposición de McLafferty.

Nitrilos:

1. Pico base: debido a una transposición de McLafferty y corresponde al ión CH2=C=NH (m/e 41).

Compuestos nitrados:

1. Suelen dar pérdidas de 30 (NO) y 46 (NO2).

Compuestos de azufre:

1. Tioles y sulfuros: análogos a alcoholes y éteres, presentando picos de ión molecular más intenso que aquellos.

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2. Disulfuros: presentan pérdidas de olefinas, dando picos a m/e = 66 que se corresponde a HSSH.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ABUNDANCIA DE IONES.

En un espectro de masas los principales picos de iones fragmento deben corresponder a los productos iónicos más estables formados por los mecanismos de reacción más favorables.

Los mecanismos más favorables vienen determinados por varias fuerzas: Las reacciones que generan productos más estables tanto neutros como

iónicos. Si hay algún heteroátomo (O, S, N), los iones se estabilizan con frecuencia por formación de un “nuevo enlace” con el heteroátomo.

Las reactividades del ión serán análogas a las reacciones conocidas.

También influirán los factores estéricos. Los productos iónicos más abundantes serán los más estables. Por lo que veremos los factores estructurales que los estabilizan:

1. Compartición de electrones con un grupo vecino:

2. Efectos de resonancia:

3. El efecto inductivo: (+I) de los grupos alquilo (hiperconjugación) y (-I) según la serie: Cl > Br, O, S > I >> N

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4. La polarizabilidad de los enlaces retransmite a lo largo de los mismos.

PROPIEDADES DEL IÓN MOLECULAR.

Al llegar una molécula a la cámara de ionización y ser bombardeada con una corriente de electrones sufre la denominada ionización, esto es, la pérdida de un electrón para generar un ión-radical:

El primer electrón que se pierde es el que tiene un menor potencial de ionización; así se obtienen unas estructuras como las que siguen:

Veamos un ejemplo concreto:

Características principales del ión molecular:A. Debe ser el ión con mayor masa de los que aparecen en el espectro. B. Debe contener todos los elementos presentes en sus fragmentos. C. Debe corresponder al ión con el potencial de ionización más bajo. D. Su relación m/e debe ser par cuando no posee N o posee un número

par de el; por la misma razón debe ser impar cuando posee un número impar de átomos de N.

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E. Las diferencias de masa entre dicho ión molecular y los fragmentos que aparecen en el espectro deben ser químicamente lógicas.

F. Su abundancia relativa depende en gran medida de la naturaleza química del producto, así existe una serie que relaciona, de una manera cualitativa y aproximada, la intensidad de dicho ión con el grupo principal presente en la molécula y de mayor a menor sería:Compuestos aromáticos > olefinas conjugadas > compuestos alicíclicos > sulfuros > hidrocarburos lineales > mercaptanos > cetonas > aminas > esteres > éteres > ácidos carboxílicos > hidrocarburos ramificados > alcoholes.

G. Sirve para hallar la fórmula molecular del compuesto.H. Gracias a los espectros de masas de alta resolución (HR-EM) se

puede distinguir entre fórmulas de igual masa, ya que los elementos tienen un peso atómico que permite distinguir entre ellas. En la siguiente tabla se muestran algunas diferencias de masas de combinaciones atómicas para el pico de masa 43.

Combinación atómica

Masa exacta

CHNO 43.0058

C2H3O 43.0184

CH3N2 43.0269

C2H5N 43.0421

C3H7 43.0547

Estas diferencias de masa existen por las propias masas exactas de los elementos debidas a sus distribuciones isotópicas. Esto se recoge en la siguiente tabla:

Elemento Peso Atómico

Isótopos Abundancia relativa (%)

Masa atómica

Hidrógeno 1.00794 1H 2H

100 0.015

1.00783 2.01410

Carbono 12.01115 12C 13C

100 1.12

12.00000 13.00336

Nitrógeno 14.0067 14N 15N

100 0.366

14.0031 15.0001

Oxígeno 15.9994 16O

17O

18O

100

0.037

0.240

15.9949

16.9991

17.9992

Flúor 18.9984 19F 100 18.9984

Silicio 28.0855 28Si 100 27.9769

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29Si

30Si

5.110

3.38.5

28.97.65

29.9738

Fósforo 30.9738 31P 100 30.9738

Azufre 32.066 32S

33S

34S

36S

100

0.789

4.438

0.018

31.9721

32.9715

33.9669

35.9677

Cloro 35.4527 35Cl 37Cl

100 32.399

34.9689 36.9659

Bromo 79.9094 79Br 81Br

100 97.940

78.9183 80.9163

Yodo 126.9045 127I 100 126.9045

FRAGMENTACIONES Y TRANSPOSICIONES DEL IÓN MOLECULAR.

Hay principalmente tres tipos de fragmentaciones del ión molecular en función del número de enlaces que se rompen:

- Rotura de un enlace simple (σ): Producen siempre un catión y un radical, se conoce como fragmentación simple:

- Rotura simultánea de dos enlaces simples: produce normalmente la eliminación de moléculas neutras. En este tipo se engloban también las transposiciones o reagrupamientos a través de estados cíclicos como la retro Diels-Alder y la transposición de McLafferty:

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- Transposiciones más complejas las cuales implican transferencias de radicales hidrógeno y eliminaciones entre átomos no vecinales.

Dependiendo del tipo de rotura del enlace la fragmentación simple puede ser homolítica o heterolítica, siendo en ambos casos el resultado de la misma la formación de un radical (que no es detectado en el espectro de masas) y un catión:

Como característica de dicha fragmentación simple hay que destacar que si el ión molecular no contiene N (su masa es par) los fragmentos tienen masa impar. A su vez los cationes formados en esta fragmentación pueden sufrir nuevas fragmentaciones por dos vías: Vía homolítica: darían lugar a radicales e iones radicales. Vía heterolítica: producirían moléculas neutras y otro catión.

Un caso algo especial es el de las moléculas cíclicas, ya que al romperse un enlace del anillo lo que se obtiene es un nuevo ión radical homólogo del ión molecular, pero ahora lineal.

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Luego estos iones radicales sufren nuevas fragmentaciones y/o transposiciones generando cationes de masa par o impar respectivamente:

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Aquí exponemos una tabla de masas de los fragmentos más frecuentes que salen en los espectros de masas (debemos tener presente que dichos fragmentos son característicos de iones pero también de pérdidas del ión molecular):

MASA DEL IÓN ASIGNACIÓN

29 Etilo (C2H5), formilo (CHO)

30 Nitroso (NO)

31 Metoxilo (CH3O), hidroximetilo (CH2OH)

39 Ciclopropenilo (C3H3)

41 Alilo (CH2CH=CH2)

43 Propilo (C3H7), acetilo (CH3CO)

45 Carboxilo (COOH)

46 Nitro (NO2)

55 Butenilo (C4H7)

56 C4H8

57 t-Butilo (C4H9), Propanoilo (CH3CH2CO)

60 Ácido acético

65 Ciclopentadienilo (C5H5)

77 Fenilo (C6H5)

91 Bencilo (tropillo, Ph-CH2)

92 Metilenpiridina (azatropilio, C5H5N-CH2)

105 Benzoilo (Ph-CO)

127 Yodo

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INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA EN EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS.

Sólidos razonablemente puros: la muestra se sitúa sobre la punta de una barra, la cual se introduce dentro del espectrómetro a través de un sistema de vacío. En ese momento la muestra es evaporada o sublimada hasta fase gaseosa, usualmente mediante aplicación de calor.

Gases y líquidos: se introducen haciendo uso de sistemas de entrada con control de flujo, denominados sondas directas (direct probes), estos dispositivos transfieren la muestra desde el exterior a través de un sistema de vacío hacia la fuente de ionización que esta a alta presión (ver ilustraciones de la página siguiente). Estas sondas pueden ser diseñadas para soportar muestras para ser ionizadas por distintos métodos. Una vez que la muestra está en fase gaseosa es ionizada y frecuentemente esto se acompaña de fragmentación para proceder al análisis de masas. En algunas técnicas especializadas, la volatilización y la ionización de la muestra ocurren simultáneamente.

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Para obtener el espectro de masas de un compuesto simple de una mezcla, los componentes individuales deben ser separados antes del análisis de espectrometría de masas. La separación de los compuestos es necesaria para tener certeza de la identificación, ya que dos o más compuestos presentes en la muestra pueden crear espectros que se solapen o mezclen ya que los iones generan fragmentos simples que dificultarían el análisis de los datos obtenidos.Desde que en la década de los 60 se acopló la cromatografía de gases (GC) a la espectrometría de masas, esta conexión permite separar compuestos ya en fase gaseosa para su entrada al espectrómetro al entrar las diferentes fracciones en diferentes tiempos en forma continua permite un análisis secuencial de las muestras. Recientemente, equipos de cromatografía de líquidos (LC), cromatografía de fluidos supercríticos, HPLC y electroforesis capilar, utilizados para separar compuestos, se pueden acoplar a espectrómetros de masas para análisis de muestras complejas.

Expuestos los aspectos más relevantes de la introducción de la muestra mediante una visión general, ahora se hará de manera pormenorizada, ya que la metodología de trabajo variará en función del tipo de ionización a la cuál se vaya a someter dicha muestra.

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SONDAS DIRECTAS (DIRECT

PROBES).



PARA IMPACTO ELECTRÓNICO (EI) E IONIZACIÓN QUÍMICA (CI):

o Desde un reservorio caliente, para gases puros o líquidos volátiles.

o Sonda de inserción directa para sólidos o Cromatografía de gases (GC) para mezclas de sustancias

volátiles que llega directamente a la fuente iónica atravesando una interfaz caliente que evitará condensaciones e integrará al cromatógrafo y al espectrómetro.

o Interfase de haz de partículas (Particle Beam Interface) para compuestos semivolátiles que son susceptibles de ser analizados por EI y CI.

PARA BOMBARDEO CON ÁTOMOS RÁPIDOS (FAB):

o La muestra puede ser disuelta directamente dentro de la matriz o aplicada disuelta en un disolvente miscible. La sonda se inserta dentro del espectrómetro.

o Existe una versión “dinámica” de FAB, que consiste en un FAB de flujo continuo. Aquí, la muestra, en matriz, es introducida desde fuera del instrumento y es bombeada hasta el target (nombre que se da al lugar exacto donde se produce el bombardeo) vía un largo tubo de sílice fundida (similar a los de GC pero sin relleno).

PARA LA IONIZACIÓN POR DESORCIÓN LÁSER ASISTIDA POR LA MATRIZ (MALDI):

o La muestra es disuelta en una matriz, se le deposita en forma de gota en una tarjeta donde se deja cristalizar y luego la tarjeta es introducida en el instrumento.

PARA LA IONIZACIÓN POR ELECTROESPRAY (ESY):

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o Las muestras puras que se disuelven en fase móvil pueden inyectarse directamente mediante una inyección en “loop”. Esto se conoce como análisis en infusión directa.

o Cuando hay un acoplamiento con técnicas cromatográficas como CZE, CEC o particularmente HPLC el procedimiento es más complicado.

ALGUNAS APLICACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

Método basado en la abundancia isotópica:

La inmensa mayoría de los elementos son multisotópicos. Como consecuencia de este hecho un compuesto molecular introducido en un espectrómetro de masas genera una mezcla isotópica característica cuyas proporciones pueden ser calculadas.

Por ejemplo, para hallar las intensidades de los picos M+1 y M+2 de los compuestos que no posean más que los elementos C, H, N, O, F, P, se utilizan las expresiones matemáticas:

A partir de las intensidades respectivas de los picos de masas (en masas nominales) que constituyen la mezcla isotópica del ion padre (molecular), es posible, utilizando software informático específico, hallar la fórmula bruta de la mezcla isotópica que se aproxime más a los valores experimentales.

Método basado en espectros de alta resolución (HR-MS):

La determinación de la masa precisa de un ion por aplicación de la técnica de "analogía de picos" puede conducir directamente y de un modo fiable a la fórmula bruta buscada. Toda ambigüedad se elimina, puesto que conocemos los elementos presentes y la masa con cuatro o cinco decimales. Cuando no se disponía de los actuales medios informáticos, se buscaba con ayuda de tablas la fórmula bruta a la cuál la masa se aproximaba más a la dada por el

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nN0,36nC1,1%1)(M

nO0,21,12/200x1)(nCnC%2)(M



instrumento. Actualmente, los equipos proponen la fórmula bruta más apropiada en función de la masa encontrada. El algoritmo de búsqueda tiene en cuenta los elementos supuestamente presentes para delimitar los cálculos

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