TRABAJO PRACTICO n 4 - unp.edu.arTRABAJO PRACTICO N° 4: ANTIMICROBIANOS MÉTODOS DE DIFUSIÓN Y...
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2017
TRABAJO PRACTICO N° 4: ANTIMICROBIANOS
MÉTODOS DE DIFUSIÓN Y MÉTODOS DE DILUCIÓN – CÁLCULO DE CIM Y CBM
Objetivos
- Que el estudiante conozca las distintas técnicas de difusión y dilución que permiten establecer el perfil de sensibilidad antimicrobiana de los
- Que el estudiante pueda calcular e interpretar la CIM y CBM
En la actualidad la utilización indiscriminada de antibióticos ha producido un aumento en la
resistencia de las bacterias. Es importante que el médico suministre el antibiótico cuando es
necesario y el correspondiente para eliminar al microorganismo . Para esto se utilizan pruebas
para conocer que antibiótico es efectivo para el microorganismo causal el cual se manifestará
SENSIBLE.
Materiales:
§ Cultivo Puro de un microorganismo
§ Placa con medio de Müeller-Hinton
§ Pinzas metálicas
§ Discos de antibióticos
Fig. N°1: foto extraída pág. sites.google.com
Fig. N° 2: Antibiograma es donde se observan las zonas de inhibición del desarrollo de la bacteria por parte del
antibiótico probado. tTomada de la página: www.brizuela-lab.com.ar
Figura N ° 3: Medición de los halos de inhibición. Tomado de http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com.ar/
Existen dos tipos de pruebas que miden este aspecto, uno es la “técnica de difusión en agar” en
donde se prueban diferentes antibióticos que están impregnados en discos de papel y se miden los
halos de inhibición del desarrollo bacteriano, (fig 2 y 3), y la otra técnica es “determinar para
conocer la concentración inhibitoria mínima” = CIM ó sea cual es la menor concentración del
antibiótico capaz de inhibir el desarrollo bacteriano y “la concentración bactericida mínima” =
CBM que es la menor concentración que elimina el 99.99 % de los microorganismos
Fig 4. Realiación de CIM y CBM.
IMPORTANTE !!!!
Para el tratamiento de las infecciones sistémicas la dosis del antibiótico en suero debe ser 3 a 5 veces el valor de la CIM Otra metodología para poder establecer el valor CIM para el microorganismo causal de un foco
infeccioso es “E-Test o épsilon test” el procedimiento consiste en inocular hisopando la
suspensión 0,5 MacFarland de la bacteria en 3 direcciones sobre un medio para antibiograma
(Müller Hinton) sobre el mismo se aplicará una tira de papel que contiene un gradiente de
concentración del antibiótico , se dejará incubar a 35-37 ° por 24 hs para posteriormente observar la
formación de una elipse de inhibición de crecimiento que corta por su extremo a la tira en una
determinada concentración que es el valor CIM
A) Preparación suspensión del microrganismo
B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.
2 ml Sol ATB
Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo
Seleccionar 4 - 5 colonias
Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF
en SF estéril.
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Descartar
Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración
C) Siembra
Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)
Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal
Control de crecimiento +. Sin ATB
Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.
D) Determinación de la CIM y la CBM
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
A) Preparación suspensión del microrganismo
B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.
2 ml Sol ATB
Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo
Seleccionar 4 - 5 colonias
Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF
en SF estéril.
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Descartar
Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración
C) Siembra
Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)
Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal
Control de crecimiento +. Sin ATB
Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.
D) Determinación de la CIM y la CBM
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo
Seleccionar 4 - 5 colonias
Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF
en SF estéril.
2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml
Descartar
Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración
C) Siembra
Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)
Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal
Control de crecimiento +. Sin ATB
Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.
D) Determinación de la CIM y la CBM
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
A) Preparación suspensión del microrganismo
B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.
2 ml Sol ATB
Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo
Seleccionar 4 - 5 colonias
Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF
en SF estéril.
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Descartar
Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración
C) Siembra
Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)
Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal
Control de crecimiento +. Sin ATB
Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.
D) Determinación de la CIM y la CBM
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
A) Preparación suspensión del microrganismo
B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.
2 ml Sol ATB
Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo
Seleccionar 4 - 5 colonias
Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF
en SF estéril.
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Descartar
Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración
C) Siembra
Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)
Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal
Control de crecimiento +. Sin ATB
Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.
D) Determinación de la CIM y la CBM
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo
Seleccionar 4 - 5 colonias
Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF
en SF estéril.
2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml
Descartar
Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración
C) Siembra
Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)
Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal
Control de crecimiento +. Sin ATB
Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.
D) Determinación de la CIM y la CBM
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
CIM
CBM
Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal
Tuboscondiferentesconcentraciones deantibiótico
Secolocalamismacantidaddemicroorganismo
Fig 5. Valor de corte del Mic . Tomado de : http://www.biomerieux-diagnostics.com/etest
LO QUE DEBEMOS INTERPRETAR CON VALORES CIM Y CBM
ANTIFÚNGICOS:
Son los fármacos utilizados específicamente para tratamiento de infecciones por hongos y levaduras
(Fig 6), la terapéutica con los mismos ha sufrido una modificación en las últimas décadas,
dejándose de lado a los que pueden presentar mayor toxicidad o dificultades en su uso. Además se
fueron presentando resistencias.
Puede solicitar un mycograma de manera in vitro para estudio de las sensibilidades
Su clasificación puede ser en base al espectro, potencia, modo de acción.
Algunos antimicóticos son sistémicos o locales , su administración puede ser oral, tópica o
parenteral
CBM/CIM
MENOROIGUALA2 BACTERICIDA
MAYORA2 BACTERIOSTÁTICO
Fig 6. Sitio de acción de los antifúngicos. Tomado de http://www.medwave.cl/link.cgi/Medwave/PuestaDia/Cursos/3548
Por lo que resulta importante tener un conocimiento de las distintas sensibilidades a los diferentes
antimicóticos para optimizar el tratamiento antifúngico, para lo cual se pueden realizar 2
metodologías :
- DILUCIÓN EN CALDO
- DIFUSIÓN EN AGAR
DILUCIÓN EN CALDO:
Se coloca en tubos con un medio de cultivo adecuado ( caldo) para crecimiento de microorganismo
(hongo o levadura) se evalúa en diluciones decrecientes del antimicótico a ensayar. Así se
establecerá la CIM ( concentración inhibitoria mínima)
Se puede, también, evaluar en una microescala, es decir haciendo diluciones del antimicótico en
pocillos.
DIFUSIÓN EN AGAR:
Se inocula en un medio de cultivo sólido “agar” adecuado para el crecimiento de hongos o
levaduras y se depositan discos de papel impregnados del antifúngico a ensayar con una
concentración conocida. Después de incubar se observará una zona de inhibición del crecimiento
(halo) el tamaño del cual nos determinará si el hongo es sensible, intermedio o resistente para ese
antimicótico
El CLSI estandarizó el método de difusión en disco
La adición de azúcar al medio Müeller Hinton (para evaluación de sensibilidad) favorece el
crecimiento de las levaduras y aumenta la definición de los halos de inhibición. Fig 7.
Fig 7. Colocación de los discos en la placa de Müller Hinton.
TIPOS DE ANTIMICÓTICOS
Clasificación de los antifúngicos por su estructura:
Polienos Nistatina, natamicina, amfotericina B
Azoles Imidazol: micomazol, clotrimazol
Triazoles: fluconazol, itraconazol, ketoconazol
Triazoles de segunda generación: voriconazol, ravuconazol, posaconazol
Alilaminas Terbinafina, naftifina
Lipopéptidos Papulacandinas
Triterpenos glicosilados
Equinocandinas: caspofungina, anidulofungina, micafungina
Pirimidinas fluoradas Flucitosina
Otros Yoduro de potasio, ciclopirox, tolnaftato, griseofulvin
Tanto para los antibióticos como para los antimicóticos los resultados de las lecturas de halos de
inhibición las se evalúan extrapolándolos en unas tablas estandarizadas por CLSI donde se
interpretan valores cortes por debajo de los cuales los microorganismos son RESISTENTES, rango
de sensibilidad intermedia y valores cortes por encima de los cuales se los cataloga de SENSIBLES.
Además, se pueden colocar los discos siguiendo determinadas estrategias de ubicación para poner
de manifiesto las resistencias (efecto de sinergia, achatamientos, manifestación de mecanismos de
inducción).
En caso de necesitarse se puede complementar con el valor CIM.