1

TRADUCCION - Biosíntesis de Proteínas

- 1950s

Proteínas: arreglos de solo 20 aa en forma no azarosa

- Ribosomas: lugar de síntesis de proteínas

- 1960s polisomas, tRNAs

- 1961 Jacob y Monod

Teoría del mensajero

-1964s confirmación de mRNA intermediario informacional

2

mRNA

tRNA

Aminoacil-tRNA sintetasa

Ribosomas

Factores proteicos

Componentes principales sistema traducción

3

- Secuencia codificante

- 5' leader No traducible (5´UTR)

- 3' trailer No traducible (3´UTR)

- 5' cap and 3' poly (A) tail (eucariotas)

mRNA :

4

tRNA

Y T

TyC arm D arm

L-shaped

5

Aminoacil-tRNA sintetasas

• Une los aa al correcto tRNA

• 20 enzimas diferentes

• Requiere ATP

Reconocimiento del tRNA:

puntos de contacto entre tRNA ysitio activo de proteína (1–5 sitios,muchas veces incluye anticodon)

6

tRNA

Une un aa específico en la terminación 3´

tRNAs isoaceptores con anticodones diferentes unen el mismo aa(varios codones para un aa)

Hay varias especies de tRNA que pueden reaccionar con el mismocodon

El anticodon hace apareamiento de bases con un codon de mRNA (omas), la tercer base de codon con la primer base de anticodon puedeaparear con otras bases además del apareamiento tradicional(Wobbling)

7

60S subunit

40S subunit

Ribosomas

4 sitios de binding

mRNA-binding site

A site (aminoacyl)

P site (peptidyl)

E site (exit)

Procariotas :

subunidades 30s y 50s

8

Traducción

3 fases

•Iniciación

•Elongación

•Terminación

y Reciclado

9

INICIACION

Procariotas Eucariotas

Tienen en común

-Disociación de ribosomas en subunidades

-Formación complejo preiniciación en subunidad menor

-Unión de complejo preiniciación a mRNA

-Iniciación mediada por factores

-Tanscripción- traducción acopladas -Iniciación citoplasmática

Iniciación en mRNAs que se

están transcribiendo

-Reconocimiento de sitio de iniciación - Estrategias diferentes para por interacción mRNA-RNAr reconocimiento de sitio de (Secuencia Shine-Dalgarno) iniciación

5´-UAAGGAGGU-3´ Traducción Cap-dependiente

“scanning”

Traducción Cap-independiente (IREs)

-3 Factores de iniciación (IF1,IF2,IF3) - 13 factores diferentes

10

Mecanismos de iniciación

Iniciación cap dependiente y cap independiente

cap-dependiente (Kozak, M 1978)

- Reconocimiento m7G-cap en extremo 5´

- Unión de subunidad 40s

- scanning hasta AUG iniciador

*Leaky scanning

*Ribosoma Shunting

*Reiniciación

cap-independiente (1988-Picornavirus)

Unión directa de subunidad ribosomal 40s en sitio interno sobre mRNA denominado IRES

INICIACION

11

INICIACION cap dependiente

3 Pasos

1) Formación del complejo de preiniciación 43 S

Unión del iniciador tRNAiMet a la subunidad menor

2) Unión de complejo 43 S a mRNA

3) Localización codón de iniciación (scanning)

4) Unión de la subunidad mayor del ribosoma

Cada uno de los pasos de la iniciación de la traducción es facilitado

por por proteínas denominadas Factores de iniciación.

EUCARIOTAS

12

Iniciación

13

Iniciación

eIF4F eIF4E

eIF4G

eIF4A

14

15

Interacción entre factores y regulación de iniciación

Interacción entre cap y poli A

Sinergismo que estimula inicio de traducción-circularización de mRNA

16

Reconstitution of the eIF4E/GST-4G1f/Pab1p Complex(A) Reconstitution with Pab1p immobilized on poly(A)-Sepharose resin. Pab1p bound to poly(A)-Sepharose resin was incubated with the indicated GST-4G1f proteins and eIF4E. Bound proteins were eluted with buffer containing SDS, resolved by SDS–PAGE, and visualized by Western analysis with the appropriate antibodies.(B) Reconstitution with eIF4E immobilized on the cap-analog resin 7mGDP-agarose. eIF4E bound to the resin was incubated with the indicted GST-4G1f proteins and Pab1p/poly(A)125 complexes. Bound proteins were analyzed as in (A).

17

If the dsRNA is incubated with GST-4G1f-459, Pab1p, and eIF4E (D), most of thedsRNA is linear although some circles are observed (lower left corner). In thepresence of GST-4G1f, Pab1p, and eIF4E (E and F), much of the dsRNA is in acircular conformation with a protein complex positioned where the ends of the RNAmeet. Differences in the apparent width of the RNA result from variation in the tipand imaging force used to generate each image

18

Ribosome-recycling

19

CODON INICIACION

- AUG codon iniciación predominante en eucariotas y exclusivo en levaduras

AUG mas próximo a 5 ´es iniciación en mayoría de mRNAs

- Secuencia que rodea el AUG es critica :

Pu X X A U G Pu C C Pu C C A U G G

-3 +1 +4 -3 +1 +4

Presencia de estructura 2ª downstream AUG aumenta iniciación a partir de ese sitio

- Factores eIF1, eIF5 ,eIF2 importantes en reconocimiento de AUG

- Estructura secundaria del 5´leader mRNA (puede impedir unión y/o scanning de los ribosomas)

Scanning

20

Esquema del fundamento del método de toeprinting

Estrella: primer de oligonucleótidos marcado radiactivamente. Flecha entera: RNAm.Flecha punteada: extendido por la transcriptasa reversa.

21

22

INICIACION

Mecanismos no clásicos de Iniciación

-Leaky scanning :

AUG en contexto débil , carente de Pu en –3 y G en +4

2 proteínas diferentes == N-terminal

== secuencias enteras

-Reiniciación:

Comienza y termina la traducción a partir de un uORF. La subunidad 40s queda unida al mRNA se recarga de factores y comienza la traducción en el siguiente AUG.

23

Leaky scanning

AUG

CUG, GUG, UUG codones de iniciación raros

Codones = a AUG son usados como sitios iniciación suplementarios

CUG upstream es usado a veces, 1er AUG siempre

24

The autoradiograms show [35S]Met-labeled proteins synthesized in vitrofrom capped mRNAs that encodechloramphenicol acetyltransferase.(A) Initiation at AUG#1 generates anN-terminally extended protein,labeled preCAT. A suboptimal contextaround AUG#1 allows some ribosomesto scan past that site and initiateinstead at AUG#2. This leakyscanning produces a shorter protein,labeled CAT. (B) All mRNAs have asuboptimal context (U in position −3)around the first AUG codon and,except for the control in lane 1, amoderately stable base-pairedstructure between the first andsecond AUGs. The only variable is thedistance (n) between AUG#1 and thebase of the hairpin structure. Whenproperly positioned, the downstreambase-paired structure apparentlysuppresses leaky scanning (lane 4). Afull description of these constructsand the adjustments required for therabbit

D F

25

Reiniciación

AUGAUG

uORF

uORF: ORF presente en región 5´UTR

26

Factor de transcripción

C/EBP

27

cap-independiente

IRES

Internal ribosoma entry sites

IRES : Zonas con estructuras complejas (5´UTRs)Poca similitud en cuanto a secuencia y tamaño. Suactividad depende de integridad estructural.

Se definen funcionalmente

Inicialmente se descubrieron en Virus

3-5% mRNAs celulares se traducen por mecanismo cap-independiente

IRES presentes en 5´UTR

28

29

30

GCMV IRES

31

RNA secondary structure model of the FGF-2, 5´-ATR

32

Ensayo plásmido bicistrónico

33

FIG. 2. The BCL-2 5-UTR functions as an IRES in vitro. The DNA constructsdepicted (panel A) were transcribed in vitro in the presence of the m7G cap analog, then

translated in nucleased RRL, and resolved via SDS-PAGE and autoradiography.

34

Regulación de iniciación de traducción

Niveles de regulación:

1) Estructura de mRNA:

- Accesibilidad de cap- uORFs y ORF dentro de secuencia codificante- Contexto de AUG- Estructura secundaria de mRNA

2) Actividad y Fosforilación de factores de iniciación

3) Interacciones Proteína-RNA

4) Interacciones RNA-mRNA

35

Regulación de unión de subunidad 40S al mRNA

a) Proteínas 4E-BPs:

NO Fosforiladas ………..interacción con eIF4E .................. Traducción

Fosforiladas………… no interacción con eIF4E…………. Traducción

PI3-K, Akt y FRAP/mTOR (quinasas involucradas en fosforilación)

b) Disponibilidad de eIF4E y fosforilación

eIF4E poco abundante y limitante.

Fosforilación en Ser209 ...................................... Traducción

Fosforilación de eIF4E en Ser 209 inhibe unión a cap si ocurre previo a interacción cap-eIF4E y estimula si ocurre después de interacción cap-eIF4E. MNK1 (quinasa)

Actividad y Fosforilación de factores de iniciación

36

c) eIF4G: Clivaje y disponibilidadEn apotosis o infecciones virales por proteasas .............. Traducción

b) eIF2 fosforilación

eIF2-P (Ser51) Mayor afinidad por GDP ……………………. Traducción

37

38

Proteínas 4E-BPs

39

eIF4E fosforilación

40

FIG. 1. Shutoff of host protein synthesis and cleavage of eIF4GI and eIF4GII upon poliovirus infection. (A) Pattern of protein synthesis. HeLa cells were mock-infected or infected with poliovirus (100 pfu per cell), and labeled for 30 min with [35S]methionine at the indicated times after infection, and equal amounts of cytoplasmic protein extracts (5 mg) were subjected to SDSy15% PAGE. The arrows indicate viral capsid proteins.(B and C) Analysis of eIF4GI and eIF4GII cleavage. Proteins (40 mg) of samples as in A were resolved by SDSy6% PAGE, transferred to nitrocellulose paper, and incubated with a polyclonal antibody against the N-terminal fragment of eIF4GI (B) or eIF4GII (C)

eIF4G: Clivaje y disponibilidad

41

Regulación traduccional durante el estrés celular

Disponibilidad del

complejo ternario

eIF2-P (Ser51)

Mayor afinidad por GDP

Inhibe traducción

general

42

43

[aa] GCN2 kinasa eIF2a P GCN4

traducción general

Regulación de traducción de GCN4

GCN4 : activador transcripcional (biosíntesis de aa) en levaduras

44

45Reiniciación

46

Interacciones Proteína-RNA

Regulación expresión genes involucrados en metabolismo de hierro

(ALA, TfR, mitocondril aconitase;etc)

Proteínas (IRP) que se unen a IRE: iron responsive elements (hairpin) en 5´o 3´UTR

Evita degradación

Inhibe interacción 4G-3F

Inhibe interacción 4G-3F

47

ELONGACION

aa-tRNA:EF1A:GTP

EF1A:GDPEF1B

EF2:GTP

EF2:GDP

eEF1A y eEF1B

Fosfoproteínas

(CK2 yPKC)

eEF2

Fosfoproteína

(eEF2 quinasa

Inhibe actividad)

48

TERMINACION

AAAAAAAAAAA Poli(A)

eIF4G

PABPRF3RF1

5`-cap

Complejo de

iniciaciónmRNA

Complejo de

terminación

RF1

RF3-GTP

RF3-GDP RF1

La estructura de RF1 se asemeja a la del tRNA

49

50

Silenciamiento génico

post-transcripcional por

siRNA o miRNA