TRANSFORMACIÓN

Fred Griffith 1928, estudió Fred Griffith 1928, estudió Fred Griffith 1928, estudió Fred Griffith 1928, estudió Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae

Conclusión: Las células R

“absorbieron” “algo” de las células S

“principio transformante”

El Principio transformanteEl Principio transformanteEl Principio transformanteEl Principio transformante es DNAes DNAes DNAes DNA

TRANSFORMACIÓNTRANSFORMACIÓNTRANSFORMACIÓNTRANSFORMACIÓNCAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA

INTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENOINTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENOINTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENOINTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENO

Puede ser Puede ser

NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso)

ARTIFICIAL (INDUCIDA)

TRANSFORMACIÓN

¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias Grandes maquinarias Grandes maquinarias Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformaciónproteícas intervienen en el proceso de transformaciónproteícas intervienen en el proceso de transformaciónproteícas intervienen en el proceso de transformación

Algunas hipótesis que no son excluyentes…..Algunas hipótesis que no son excluyentes…..Algunas hipótesis que no son excluyentes…..Algunas hipótesis que no son excluyentes…..

I. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener

resistencia a antibióticos)

II. Para la reparación de DNA

III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono,

nitrógeno y fósforo

SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN TRANSFORMACIÓN TRANSFORMACIÓN TRANSFORMACIÓN vs vs vs vs CONJUGACIÓNCONJUGACIÓNCONJUGACIÓNCONJUGACIÓN

¿existe DNA libre en ¿existe DNA libre en ¿existe DNA libre en ¿existe DNA libre en todos los ambientes, es todos los ambientes, es todos los ambientes, es todos los ambientes, es

estable?estable?estable?estable?

TRANSFORMACIÓN NATURALTRANSFORMACIÓN NATURALTRANSFORMACIÓN NATURALTRANSFORMACIÓN NATURAL, , , , las bacterias más estudiadas sonlas bacterias más estudiadas sonlas bacterias más estudiadas sonlas bacterias más estudiadas son

GRAM +GRAM +GRAM +GRAM +

Streptococcus pneumoniae

Bacillus subtilis

GRAM GRAM GRAM GRAM ----

Neisseria gonorrhoeae

Haemophilus influenzae

El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS

ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente

ETAPA 2: Procesamiento del DNAUnión

Importe

Recombinación

El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS

Etapa 1: Desarrollo de un estado competente

¿Qué es una célula competente?Estado fisiológico inducible

Factores que inducen el estado de competencia en la Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural:

Limitación en los nutrientes

Mitomicina C

Alta densidad celular

Temperatura, pH

La transcripción de

los genes com se

inducen durante el

estado de

competencia

Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C

La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia

TRANSFORMACIÓN ARTIFICIALTRANSFORMACIÓN ARTIFICIALTRANSFORMACIÓN ARTIFICIALTRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL

El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli

Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generación de organismos transgénicos

TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULARDE LA BIOLOGÍA MOLECULARDE LA BIOLOGÍA MOLECULARDE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

VECORES GENÉTICOS:VECORES GENÉTICOS:VECORES GENÉTICOS:VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,

PLÁSMIDOSPLÁSMIDOSPLÁSMIDOSPLÁSMIDOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A

KANAMICINA

Medio LB + KANAMICINAMedio LB + KANAMICINAMedio LB + KANAMICINAMedio LB + KANAMICINAEscherichia coli

En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado ¿cómo se induce el estado ¿cómo se induce el estado ¿cómo se induce el estado competente de una bacteria?competente de una bacteria?competente de una bacteria?competente de una bacteria?

1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico2. Electroporación2. Electroporación2. Electroporación2. Electroporación

Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de E. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coli

3 mL medio

E. coli

A= 0.6 A= 0.6 A= 0.6 A= 0.6 –––– 0.8 a 600 nm0.8 a 600 nm0.8 a 600 nm0.8 a 600 nm

3 mL medio Luria

Incubar toda la noche a 37°C

5000 r.p.m. 5 min

3 mL NaCl3 mL NaCl3 mL NaCl3 mL NaCl

Resuspender

5 mL CaCl5 mL CaCl5 mL CaCl5 mL CaCl2222

Resuspender

Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de E. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coli

5 min 4444°CCCC

Incubar 20 min2500 r.p.m 7 min

CÉLULAS COMPETENTES

Plásmido 1 hr 42°C 70 s

Inmediatamente en hielo

LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICOLA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICOLA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICOLA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO

1 mL medio SOC

Incubar a 37°C con

agitación por 45 min

Esquema generalEsquema generalEsquema generalEsquema general

A nivel molecular

Electroporación

Utilizaremos el plásmido pET-TEM

Sitio múltiple de Sitio múltiple de Sitio múltiple de Sitio múltiple de restricciónrestricciónrestricciónrestricciónGen que confiere Gen que confiere Gen que confiere Gen que confiere

resistencia a kanamicina: resistencia a kanamicina: resistencia a kanamicina: resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasakanamicina fosfotransferasakanamicina fosfotransferasakanamicina fosfotransferasa

Origen de Origen de Origen de Origen de replicaciónreplicaciónreplicaciónreplicación

Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos.generalmente codificadas por plásmidos.generalmente codificadas por plásmidos.generalmente codificadas por plásmidos.

La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: 1.Adenilación de grupos hidroxilo. 2.Fosforilación de grupos hidroxilo. 3.Acetilación de grupos amino.

ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO:

Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina, Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina.

Gentamicina acetiltransferasa Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina.

Kanamicina acetiltransferasa Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas, Tobramicina, Gentamicinas,

Sisomicina.

Neomicina, Kanamicina Kanamicina Kanamicina Kanamicina fosfotransferasafosfotransferasafosfotransferasafosfotransferasa

Gentamicina A, Neomicina, KanamicinaKanamicinaKanamicinaKanamicina

Células transformantes

Células no

transformantes

Medio Luiria + KANAMICINA

ESQUEMA GENERALESQUEMA GENERALESQUEMA GENERALESQUEMA GENERAL

SESIÓN I:SESIÓN I:SESIÓN I:SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico

SESIÓN 2SESIÓN 2SESIÓN 2SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalina

SESIÓN 3:SESIÓN 3:SESIÓN 3:SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio

Lisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalina