Transformasi Genetik dan Karakterisasi

Tanaman Produk Rekayasa Genetika

Oleh:

Wahyu Indra Duwi Fanata1,2

1PS Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Jember

2Divisi Biologi Molekul dan Bioteknologi, Center for Development of Advanced Science and Technology

(CDAST) Universitas jember

I. Transformasi Genetik

II. Karakterisasi Tanaman Transgenik

Pokok Bahasan

I. Transformasi Genetik

II. Karakterisasi Tanaman Transgenik

Rekayasa Genetika Pada Tanaman

Syarat terjadinya transformasi genetik

– DNA harus masuk dalam sel

– DNA harus terintegrasi dalam

genom

– DNA harus terekspresi

Masuknya gen asing ke dalam sel:

– Agrobacterium sebagai

perantara

– Transfer gen secara langsung

Transfer Gen dimediasi oleh Agrobacterium

T-DNA

auxA auxB cyt ocsLB RB

• LB, RB: left dan right borders

• auxA, auxB: mengkode enzim yang memproduksi auxin

• Cyt: mengkode enzim yang memproduksi cytokinin

• Ocs: mengkode octopine synthase, memproduksi octopine

✓ Meningkatnya produksi hormon tesebut akan menstimulasi pembelahan sel

✓ Menghasilkan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol

Modifikasi T-DNA

Prosedur Transformasi Genetik

Prosedur Transformasi Genetik

Tran and Sanan-Mishra, Biotechnology Reports, 7:143-149

Transfer Gen Secara dengan Metode “Particle Bombardment”

• Prinsip dasar dari metode ini adalah memasukkan

partikel logam (emas atau tusngten) yang telah

diseliputi oleh T-DNA dengan menembus dinding

sel menuju nukelus.

• Eksplan yang sudah “ditembak” kemudian

ditumbuhkan menjadi tanaman baru melalui teknik

kultur jaringan

• Lebih efisien dan lebih sederhana

• Namun sel rentan rusak dan peralatan yang

digunakan sangat mahal

Konfirmasi Keberadaan transgen dalam genom

Apriasti et.al., Molecular Biology Reports, 45:2749-2758

I. Transformasi Genetik

II. Karakterisasi Tanaman Transgenik

Pemilihan Tanaman Transgen dengan

Insersi Tunggal T-DNA

• Tanaman dengan dua/lebih insersi mempunyai kemungkinan yang lebih tinggi

untuk terjadi fenomena gene silencing

• Tanaman dengan insersi tunggal mempunyai tingkat ekspresi gen yang lebih

stabil dan seragam

• Pemilihan tanaman transgenik dengan inserti tunggal T-DNA sangat penting

untuk dilaksanakan

• Jumlah insersi umumnya dianalisa dengan menggunakan metode Southern

Blot atau dengan cara menghitung rasio segregasi pada tanaman T1

Southern Blot

• Analisa Southern Blot menggunakan bahan radioaktif (α

32P) untuk tanaman padi non transgenik (WT) dan

transgenik heterosigot (Het) dan homosigot (Ho) untuk

mengetahui jumlah T-DNA yang ada dalam genom.

• Satu pita DNA yang terdeteksi pada masing-masing jenis

tanaman transgenik menunjukkan bahwa masing-masing

padi transgenik mengandung satu T-DNA.

Fanata et. al., The Plant Journal, 73:966-979

Apriasti et.al., Molecular Biology Reports, 45:2749-2758

Southern Blot (non radiokatif)

Rasio Segregasi

• Tanaman generasi T0 masih mengandung T-DNA di

salah satu kromosom (heterosigot)

• Apabila tanaman T0 menyerbuk sendiri, maka sifat

keturunannya akan bersegregasi menurut hukum

mendel

• Tanaman T0 dengan satu insersi T-DNA dengan sifat

resisten antibiotik akan menghasilkan keturunan (T1)

dengan rasio ketahan 3:1 (resisten : sensitif)

Chi et.al., Plant Physiology, 148: 808-817

Analisa Tingkat Ekspresi Gen dan Translasi Protein

Analisa tingkat ekspresi target gen

umumnya menggunakan teknik PCR

dangan menggunakan cDNA sebagai

template

Analisa tingkat translasi target protein

umumnya menggunakan teknik

western blot menggunakan antibody

spesifik yang hanya berinteraksi

dengan target proteinApriasti et.al., Molecular Biology Reports, 45:2749-2758

Penggunaan Gen Reporter Sebagai

Indikator Ekspresi Gen

Toki et.al., The Plant Journal, 47:969-9768

Gen yang menyandi Green Flurescent Protein (GFP) seringkali digunakan sebagai penanda aktivitas

gen pada tingkatan translasi

Analisa Fenotipa tanaman TransgenikTanaman Trx-m RNAiTanaman Overekspresi gen hrf1

Zhang et.al., Journal of Experimental Botany, 62:4229-42238 Chi et.al., Plant Physiology, 148: 808-817

1. Transformasi genetik dapat menggunakan metode agrobacterium atau

metode partikel bombardment

2. Teknik kultur jaringan yang efisien berperan penting dalam

keberhasilan tarnsformasi genetik

3. Konfirmasi kebenaran tanaman transgenik dilakukan dengan

menggunakan metode PCR dan southern blot

4. Galur tanaman transgenik yang dipilih untuk pengjian lanjutan

sebaiknya mengandung satu insersi T-DNA

Kesimpulan