Potencial inhibitorio de trimipramina y sus principales metabolitos en monoaminas humanas y transportadores

de cationes orgánicos.

Abstract

El antidepresivo trimipramina muestra un atípico perfil farmacológico y su mecanismo de acción es aun oscuro. El presente estudio investigó si la trimipramina y sus tres metabolitos interactúan con blancos de otros antidepresivos, los transportadores humanos de monoaminas para noradrenalina, serotonina y dopamina y con los transportadores de cationes humanos (hOCT1, hOCT2 y hOCT3) los cuales son expresados en el cerebro y son conocidos por estar involucrados en la receptación de monoaminas. Las células HEK293 heterólogas expresando los transportadores mencionados fueron utilizadas para determinar la inhibición de [3H]Methyl Phenyl pyridinium catión para la recaptación de trimipramina y sus principales metabolitos.En las concentraciones hasta de 30μM, todos los transportadores, excepto hOCT3, fueron inhibidas por todas las sustancias examinadas.Con un Intervalo de Confianza (IC50) valores entre 2 y 10μM, la trimipramina inhibió los transportadores de serotonina, noradrenalina, cationes orgánicos 1 y 2, mientras que claramente las concentraciones más altas fueron necesarias para una inhibición media máxima del transportador de dopamina. Desmetil-trimipramina demostró sobre las mismas potencias como trimipramina, mientras que 2-hidroxi-trimipramina era menos potente en los transportadores de noradrenalina, serotonina y de cationes orgánicos 1. Óxido-N-trimipramina inhibió preferencialmente el transportador de serotonina.La trimipramina ni sus metabolitos son altamente inhibidores de los transportadores de monoaminas examinados. Sin embargo, puesto que en un estado estacionario la suma de las concentraciones de los compuestos primarios y sus metabolitos activos son casi dos veces más alto que la concentración plasmática de trimipramina y es conocido que la acumulación en el cerebro (hasta diez veces), hasta la parcial inhibición por trimipramina y sus metabolitos de los transportadores de serotonina y noradrenalina (pero no de los transportadores orgánicos de cationes 3) puede contribuir hacia la acción antidepresiva de la trimipramina.

Objetivo del artículo

El presente estudio investigó si la trimipramina y sus tres metabolitos interactúan con blancos de otros antidepresivos, los transportadores humanos de monoaminas para noradrenalina, serotonina y dopamina y con los transportadores de cationes humanos (hOCT1, hOCT2 y hOCT3) los cuales son expresados en el cerebro y son conocidos por estar involucrados en la receptación de monoaminas.

Material y métodos.

Cultivo celular y transfección

Las células fueron creciendo como monocapas en 175cm2 de frascos de cultivo tisular modificado en Dulbecco modificado en un medio de águila (DMEM) /F12 de jamón suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS), conteniendo penicilina G (100U/ml) y estreptomicina (100ug/ml) en una atmósfera modificada con 5% de CO2 a 37°C.

Para las células de transfección transitoria fueron subcultivadas en 24 placas en DMEM/ F12 de jamón más 10% dializado de FCS hasta obtener una densidad celular de 40 - 60% al día siguiente. Transfección con la cadena de DNA de transportadores de noradrenalina, dopamina, serotonina, cationes orgánicos 1, 2 ó 3 (todos subclonados dentro la expresión del vector pcDNA3) fue realizada por lipofección usando el reactivo de transfección TransIT-293 como se describe anteriormente. Para cada 0.4 μg de cadena de DNA fue utilizada. Experimentos de receptación fueron realizados 48 hrs después de la transfección.

Las medidas de recaptación del catión metil-fenil-pyridinium fueron escencialmente como se describe anteriormente. En resumen, el medio de cultivo fue aspirado de las 24 placas 48 hrs. después de la transfección y las células fueron lavadas 2 veces con el buffer Krebs-Ringer HEPES (KRH) buffer (125mM NaCl, 4,8mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 5.6 mM d-glucosa y 25 mM HEPES, pH 7.4). Las células fueron pre-incubadas por 15 min con el buffer KRH. La solución pre-incubadora fue entonces aspirada y la recaptación del catión metil-fenil-pyridinium fue iniciada por la adición de 15nM catión metil-fenil-pyridinium conteniendo buffer KRH incluyendo la prueba de substancia en la presencia o ausencia de decynium-22 (D-22; para transportador de catión orgánico 1, 2 o 3) o cocaína (para transportador de noradrenalina, serotonina y dopamina). Después de la incubación de las células por 10 min. a 37°C, la recaptación fue terminada por el retiro del buffer de incubación y el rápido lavado de las células tres veces con el buffer KRH congelado. Las células de cada una fue solubilizado con 500 ul Triton X-100 (0.1% en 10mM Tris, pH 7.5). Para el lisato, 300ul fueron mezclados con 5 ml de un coctél de centelleo “Lumagel seguro” y la radioactividad fue cuantificada usando un LS 5000 TD contador de centelleo líquido. Una alícuota de 100 ul de lisato fue usada para la proteína de determinación de acuerdo al método de Lowry. La recaptación no específica del catión metil-fenil-pyridinium en la presencia de 30 nM D-22 (para transportadores de cationes orgánicos) o 50 uM de cocaina (para transportadores de monoaminas humanas) fue sustraída de la recaptación total.

Medicamentos

Los medicamentos usados en este estudio fueron la trimipramina, Desmetil trimipramina, 2-hidroxi-trimipramina y óxido de N-trimipramina. El catión metil-fenil-pyridinium yodado fue obtenido de Biotrend.

Cálculos y estadísticas

Una regresión analítica no lineal fue usada para el cálculo de los valores con un Intervalo de Confianza 50. El valor de la recaptación del metil-fenil-pyridinium de los tres transportadores de monoaminas y de los cationes orgánicos en el rango micromolar y siendo concentraciones no saturadas de catión metil-fenil-pyridinium fueron usados.

Resultados

En las primeras series de experimentos, se puedo mostrar que la recaptación del catión metil-fenil-pyridinium en las células HEK293 expresan cada transportador de monoaminas o transportadores de cationes orgánicos incrementan linealmente con el tiempo arriba de 10 min; unos 10 minutos de recaptación fueron usados en los siguientes experimentos de la determinación de los valores con un intervalo de confianza 50.

Las potencias inhibitorias (aparentemente afinidades) de trimipramina y tres de sus principales metabolitos (Desmetil-trimipramina, 2-hidroxi-trimipramina y óxido N-trimipramina) en los transportadores de monoaminas y los transportadores de cationes orgánicos fueron examinados determinando sus valores con un intervalo de confianza 50 por la inhibición de mediadores de los transportadores de monoaminas para la recaptación del catión metil-fenil-pyridinium. Todos los transportadores examinados fueron inhibidos por el incremento de concentraciones de las sustancias probadas con la excepción del transportador de cationes orgánicos 3 (hOCT3) el cual no mostró ninguna inhibición hasta una concentración de 30uM por ninguna de las sustancias.

Trimipramina mostró la más alta potencia en los transportadores de serotonina, cationes orgánicos y noradrenalina con valores de intervalos de confianza 50. En los transportadores de cationes orgánicos 2 (hOCT2) su potencia inhibitoria fue igual muy alta, mientras que en los transportadores de dopamina la trimipramina fue solo un débil inhibidor. La Desmetil-trimipramina exhibió valores similares en los transportadores de noradrenalina, cationes orgánicos 1 (hOCT1) y serotonina, donde su metabolito mostró menos efectos inhibitorios en el transportador de dopamina y cationes orgánicos 2 (hOCT2).

El metabolito de la trimipramina, 2-hidroxi-trimipramina inhibió los transportadores de noradrenalina, cationes orgánicos 1 y 2 (hOCT1, hOCT2) con casi la misma potencia. Una relativamente potencia baja inhibitoria de la 2-hidroxi-trimipramina fue encontrada en el transportador de dopamina y serotonina.

El metabolito óxido N-trimipramina mostró relativamente una potencia inhibitoria alta en los transportadores de serotonina mientras que efectos moderados fueron detectados en transportadores de cationes orgánicos 1 y 2 (hOCT1 hOCT2), dopamina y noradrenalina.

En resumen, la trimipramina y los metabolitos examinados mostraron una alta potencia inhibitoria en los transportadores de noradrenalina, serotonina y cationes orgánicos 1, una potencia moderada en transportadores de dopamina y cationes orgánicos 2 y en concentraciones de hasta 30uM ninguna inhibición de transportadores de cationes orgánicos 3.

Conclusiones

La trimipramina es un antidepresivo tricíclico con sedante, ansiolítico y efectos débiles anti-psicóticos. Su principal modo de acción como un antidepresivo no es claro y difiere de otros antidepresivos tricíclicos. Debido a que la trimipramina es extensamente metabolizada, esto es justificable para preguntar en el presente estudio si los metabolitos de la trimipramina pueden ser inhibidores de los transportadores de la recaptación neuronal para noradrenalina, serotonina o dopamina. Además, se examinó si la trimipramina y/o sus metabolitos pueden inhibir otras monoaminas transportando portadores expresados en el cerebro como transportadores orgánicos humanos para los cuales se ha demostrado la inhibición del hOCT3 ha sido mostrado para exhibir efectos antidepresivos.

La inhibición por trimipramina de los transportadores de serotonina, noradrenalina y dopamina por valores con intervalos de confianza 50. Así, la trimipramina es un inhibidor más potente de los transportadores de serotonina y noradrenalina. Los valores de los transportadores de noradrenalina y serotonina son similares a los encontrados en los sinaptosomas de los cerebros de rata.

Sin embargo, en estudios previos de enlaces con radio-ligandos, reportaron valores con un IC50 para trimipramina en los trasportadores de serotonina los cuales fueron por factor 15 y 55 más bajos que los del experimento. La inhibición por trimipramina de unión de radio ligando al transportador de dopamina fue claramente más bajo que en nuestro estudio. Estas discrepancias pueden por lo menos, se debe al hecho de que habían sido medidos interacciones con los enlaces del radio ligando en membranas aisladas. en el presente estudio, la trimipramina mostró el siguiente orden de potencia inhibitoria en los

transportadores de: serotonina > cationes orgánicos 1 > noradrenalina > cationes orgánicos 2 > dopamina > cationes orgánicos 3.

Por lo tanto, transportadores de serotonina y noradrenalina que son conocidos objetivos primarios de los antidepresivos son potentemente inhibidos, mientras que el hOCT3 fueron solo marginalmente inhibidos por la trimipramina hasta concentraciones de 30uM.

Comparado con la trimipramina, la Desmetil-trimipramina mostró potencias inhibitorias similares en los transportadores examinados con inhibición preferencial de los transportadores de noradrenalina, serotonina y cationes orgánicos 1, mientras que la 2-hidroxi-trimipramina fue menos potente en los transportadores de noradrenalina y cationes orgánicos 1. Sin inhibición por la 2-hidroxi-trimipramina de los transportadores de serotonina fue medida en una concentración arriba de 30uM aunque la trimipramina y sus otros metabolitos mostraron inhibición moderada del transportador de serotonina. Presentemente, nosotros no tenemos explicación para éste resultado. El óxido N-trimipramina mostró una inhibición preferencial del transportador de serotonina. La potencia inhibitoria de la trimipramina de los transportadores de noradrenalina y serotonina por Desmetil-trimipramina y de los de serotonina por el óxido N-trimipramina pudo eventualmente contribuir para el efecto antidepresivo de la trimipramina.

Un rol potencial de los transportadores de cationes orgánicos en los efectos antidepresivos de la trimipramina parece poco probable, debido a que ni la trimipramina o sus metabolitos son capaces de inhibir el OCT3. Entre los OCTs, el OCT3 es el que se expresa ampliamente en el cerebro. El OCT2 que también se expresa en el cerebro es inhibido en una media máxima a concentraciones por debajo de 10uM solamente por la trimipramina pero menos potente por sus metabolitos. Si el OCT2 puede jugar un (mínimo) papel en la acción antidepresiva de la trimipramina aún debe ser mostrada. Debido a que el OCT1 es escasamente expresado en el cerebro, su media máxima inhibitoria por concentraciones bajas micromolares de trimipramina y Desmetil-trimipramina probablemente no juega un papel en los efectos antidepresivos de la trimipramina.

Concierne el involucramiento de los transportadores neuronales de noradrenalina, dopamina y serotonina en la acción principal de la trimipramina y/o sus metabolitos, que nosotros pudimos excluir el transportador de dopamina desde un IC50 para la trimipramina y sus metabolitos que estaban por encima de 30uM. Mientras Desmetil-trimipramina era un poco más potente inhibidor del transportador de noradrenalina que del transportador de serotonina (como el óxido N-trimipramina). Esto indica que el transportador de serotonina podría constituir un blanco para los efectos antidepresivos de la trimipramina. Esto puede (en menor

grado) también puede ser cierto para el transportador de noradrenalina, puesto que fue inhibido la media máxima a concentraciones por debajo de 10uM por la trimipramina y su principal metabolito Desmetil-trimipramina. La inhibición de los transportadores de serotonina y noradrenalina, objetivos cuales fueron inhibidos por la trimipramina y su metabolito desmetilado con valores con IC50 por debajo de 10uM, puede jugar un rol en los efectos antidepresivos de la trimipramina depende de las concentraciones de esas sustancias pueden alcanzar en el cerebro dosis clínicos relevantes. En la periferia, las concentraciones plasmáticas de la trimipramina deben estar entre 0.5 y 1.2uM. Además, las concentraciones plasmáticas de la Desmetil-trimipramina representan cerca del 50% de los principales compuestos bajo condiciones estacionarias. Por lo tanto, la suma de las concentraciones plasmáticas de los compuestos activos, es decir de los principales compuestos es casi dos veces mayor que el de la trimipramina sola. Ya que se sabe que otros antidepresivos tricíclicos y sus metabolitos desmetilados farmacológicamente activos penetran la barrera hemato-encefalica y se acumula en el cerebro hasta 10 veces, hasta una parcial inhibición por trimipramina y Desmetil-trimipramina de los transportadores de serotonina y en menor grado también de los transportadores de noradrenalina puede ser esperado para contribuir en parte a la acción antidepresiva de la trimipramina.

Tomados juntos, se mostró que la trimipramina es un inhibidor de los transportadores de noradrenalina y serotonina, confirmando previos resultados en los transportadores de las ratas. El estudio por primera vez demuestra que esto también se sostiene para los metabolitos de la trimipramina; también se muestra (por primera vez) que el transportador de dopamina como los transportadores de cationes orgánicos son solo moderadamente inhibidos por la trimipramina y sus metabolitos. Así, la moderada inhibición de los transportadores de serotonina y noradrenalina por la trimipramina y sus metabolitos son actualmente solo conocidos las acciones las cuales pueden explicar o al menor pueden contribuir a los efectos antidepresivos de la trimipramina.

Ficha hemerográfica

Haenisch B., Hiemke C., Bönisch H. (2011). Inhibitory potencies of trimipramine and its main metabolites at human monoamine and organic cation transporters Psychopharmacology. 217 (2), 289-295 pp.