TUBERCULOSIS BOVINA.

EL AGENTEElías F. Rodríguez Ferri

Universidad de León

Antecedentes• La TB ‘la reina de las

enfermedades’ y ‘la enfermedad de los reyes’.

• Datos desde el neolítico(4.000 AC): una TB espinal en un esqueleto. También en Egipto (en momias, 3.700-1.000 AC)

• Los griegos la llamaron Tisis. Después ‘consunción, struma y scrófula’

• La ‘peste blanca’, referente de la época romántica. Alejandro Dumas: ‘La Dama de las Camelias’

Víctimas de la TB en la Historia de la Enfermedad

• L. Pasteur planteó la posible implicación de un agente infeccioso

• J.A. Villemin (1868) demostróexperimentalmente la transmisión inoculando pus de un nódulo tuberculoso a un conejo

• R. Koch (1843-1910)(24/3/1882) a la Sociedad de Fisiología de Berlín: ‘había observado y aislado el microorganismo que causaba la TB en el hombre y en el ganado bovino’

• Lehmann y Neumann (1896): Mycobacterium

• Smith (1896): bacilo bovino →M. tuberculosis tipo humano y tipo bovino

El laboratorio de Kochen Wollenstein, en 1872

Caracteres generales de las micobacterias

• Bacilos delgados, rectos o ligeramente curvados, a veces ramificados, solos o en pequeños grupos, G+, (aunque se tiñen muy mal)

• Ácido-Alcohol-Resistentes, tiñen bien por Ziehl-Neelsen: rojo sobre fondo azul

• Técnicas fluorescentes: Auramina o Auramina + Rodamina B

AAR: formación de complejos con el ác. micólico

• Inmóviles, no esporulados, ni capsulados, carecen de fimbrias, no forman conidias

• Aerobios• Patógenos y saprofitos• C-G 62-72%• Más de 50 especies. Los

agentes de la TB, lepra y paratuberculosis

• Especie tipo: Mycobacteriumtuberculosis

• Micobacterias atípicas, tuberculoides, ocasionalmente pueden causar enfermedad

CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS

*

*

*M. avium, M. avium subsp. paratuber-culosis, M. intracellulare, M. ulcerans

(crecimiento lento y no cromógenas)

(crecimiento lento y no cromógenas)

(MNT ó MOTT)

* M. bovis subsp. caprae

Estructuras

• Pared celular fina (20 nm)• La estructura de la pared celular

es inusual. Incluye 4 tipos de polímeros:– Peptidoglicano– Arabinogalactano– Ácidos micólicos– Lipoarabinomanano

• Además se incluyen lípidos de superficie(micósidos, sulfolípidos,etc.)

• Peptidoglicano: – Similar al de otras bacterias

(cadenas de polisacáridos -NAM + NAG- cruzadas con cortos puentes peptídicos)

– Unido al arabinogalactanopor un único puentediglicosil-fosforil que contiene ramnosa y n-acetilglucosamina.

: peptidoglicano

Puente de unión al arabinogalactano:diglicosil-fosforil con ramnosa y N-

acetilglucosamina

• Arabinogalactano:– Construido a partir de un núcleo de

galactosa con ramificaciones de arabinosa, ambas en forma furanosa(anillos de 5 átomos)

– Las micobacterias son las únicascontienen tanto galactofuranosacomo arabinofuranosa en la pared

– La galactofuranosa es muy rara en la naturaleza (→ escaso conocimiento de las rutas biosintéticas)

Puente de unión al peptidoglicano:diglicosil-fosforil con ramnosa y N-

acetilglucosamina

• Ácidos micólicos– El componente principal de la

envoltura (hasta 60% del peso seco de la pared)

– Hidrofóbicos, forman la cubierta lipídica

– β-hidroxiácidos ramificados. En posición α una cadena alifática de 60-590 át C con interés taxonómico.

– Uniones covalentes tipo éster a una arabinosa al final del arabinogalactano ramificado

– Factor de virulencia. • Probablemente previenen del

ataque por proteínas catiónicas, lisozima y radicales de oxígeno en la vesícula fagocítica

• Inhiben la absorción de nutrientes• Causan agregación bacteriana• Contribuyen al crecimiento lento

• Lipoarabinomanano(LAM)– Un glicolípido al final de

la envoltura aunque estáanclado profundamente en el peptidoglicano

– Estructura compleja– Un núcleo de manosas

unidas a múltiples cadenas laterales ramificadas de arabinofuranosil-manosay una unidad de fosfatidilinositol que puede ser utilizada como un puente de unión a otros elementos de la envoltura

LAM

Otros Lípidos de superficie

• Micósidos:– Cera D: Ácido micólico + arabinogalactano y éste a 4

NAG/NAM, a los que se unen 2 cadenas de tetrapéptidos. Una falsa cera. Propiedades adyuvantes (adyuvante completo de Freund)

– Factor Cordón: 6,6,dimicolil-trealosa (2 ácidos micólicos unidos a trealosa). Asociado a la virulencia(es leucotóxico: inhibe la succinato DH, provoca el hinchamiento de las mitocondrias y separa los ribosomas del RER).

• Fosfolípidos: cardiolipina, fosfatidiletanolaminay fosfatidilinositol manósidos. Implicados en la formación de granulomas

• Sulfolípidos: glicolípidos sulfatados (ácidos grasos + trealosa); ej., sulfolípido I. Asociados a la virulencia (actúan como fagolisosomas)

• SOD (superóxido dismutasa): neutraliza la capacidad oxidante de los iones superóxido

Otros caracteres• Citoplasma con cuerpos

granulares • Mesosomas en membrana,

ocasionalmente muy largos y estructura laminar

• Fisión binaria• Ciclo de vida complejo,

incluye fragmentación y formas cocoides; alargamiento y bacilos

• Formas defectivas sin pared mediante lisozima, micobacte-riofagos y cicloserina

El genoma• El complejo Mtb posee un G+C del

65% y el genoma tiene un tamaño de 2,5-2,8 x 10/9 D

• Entre todas las especies existe alta homología DNA-DNA

• Algunas secuencias se utilizan como diana para su identificación previa amplificación: – Específicas del complejo Mtb: gen del

Ag MPB70, MPB64, del 38 kDa, secuencias IS6110, 986 ó 987, 1081, regiones espaciadoras (mtp40).

– Específicas del género Mycobacterium: Ag 85 kDa, dnaJ, ARNr 16S.

• Las IS6110, 986 ó 987, son virtualmente idénticas y han sido ampliamente utilizadas como marcador genéticopara el estudio de Mtb, debido a su variabilidad en el número de copias y a su capacidad para desplazarse dentro del genoma

• La mayoría de las cepas de Mtb poseen de 6-20 copiasde este elemento

• Las cepas de M.bovis de bovino, BCG y Mtb asiáticas solo llevan una copia de IS6110 y por lo general en un mismo lugar del genoma (en un locus de 1,9 kb), lo que limita su uso;

• Las cepas de cabras y de animales salvajes y las de Mtb, llevan múltiples copias → sugiere que varios reservorios animales pueden tener diferentes tipos de Mtb

• El complejo Mtb contiene, también, 5-6 copias de IS1081 y los diferentes patrones dependen solamente del tamaño de uno de los fragmentos

• Análisis mediante RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism) necesita de al menos 3 enzimas y electroforesis de elevada resoluciónpara apreciar las diferencias entre cepas

RFLP del DNA de Mb de 7 aislados bovinos hibridados con la sonda IS6110 (a). Gutierrez et al., 1995. J. Clin. Microbiol. 33: 11, 2953-56

Otros elementos repetitivos asociados con los polimorfismos

en el complejo Mtb

• MPTR (Major Polymorphic TandemRepeat), DR (Direct Repeat) y PGRS(Polymorphic GC Rich Repeat).

• Estos elementos han sido utilizados como sondas en Mtb y Mb

Polimorfismos en la región de repeticiones directas (DR) o Espoligotipificación (Spacer

Oligonucleotide Typing)

• Los DR son regiones de 36 pb separadas por espaciadores de DNA de 35 a 41 pb.

• Son exclusivos del complejo Mtb• Son polimórficos en tamaño y composición• Los DRs más la secuencia espaciadora única

se denomina DVR (Direct Variable Repeat)• Cuando se comparan regiones DR de varios

aislados se observa que el orden de los espaciadores es aproximadamente el mismo, pero se presentan recombinaciones homólogas entre DRs próximos o distantes, delecciones, duplicaciones e insercionesasociadas a la transposición de la IS6110 que se relacionan con la evolución

Delecciones genómicas (DRs y N-DR).Pérdida de regiones genómicas en aisladosdel complejo M. tuberculosis

• El polimorfismo en varios aislados comprende la ausencia o presencia de uno o más DVRs

• Permite la tipificación: Espoligotipificación(Spacer Oligonucleotide Typing): Kamerbeeket al. 1997. J. Clin. Microbiol. 35:907-914

• Detecta la presencia o ausencia de espaciado-res de secuencia conocida en un aislado

• El método: análisis de secuencias de amplificación generadas por PCR en la regiónDR.

– El primer contrasentido está marcado con biotina: todas las cadenas sintetizadas están marcadas

– Mediante hibridación del producto PCR marcado con una membrana a la que se han unido los 37 oligos derivados de los espaciadores en Mtb y los 6 de Mb BCG, se detectan los espaciadores individuales

• Se puede calcular las relaciones filogenéticasentre las cepas y puede aplicarse directamente a muestras clínicas Dendograma que muestra las interrelaciones entre 41 espoli-

gotipos identificados a partir de 224 aislados de Mb en Sudamé-rica y los 4 espoligotipos encontrados simultáneamente entreaislados de Sudamérica y España

Zumárraga et al., 1999. J. Clin. Microbiol. 37 (2): 296-303

Aranaz et al., 1996. J.Clin. Microbiol.,34(11):2734-2740

Dendograma que muestra las interrelaciones de 24 espoligotipos representativos identificados apartir de 182 aislados de Mb procedentes de bovinos, ciervos, jabalíes, gatos y ovejas. Spb y spcson los dos clusters identificados en los principales aislados de bovino y caprino

ANTÍGENOS EN LASMICOBACTERIAS

Las micobacterias comparten la mayoría de los antígenos

AntígenosEspecíficos de TB

MicobacteriasAtípicas

BCG

Antígenos• Grupo I: comunes al género e incluso a

Nocardia y Corynebacterium (incluyen proteínas, glicolípidos y polisacáridos de la pared)

• Grupo II: comunes a las especies de crecimiento lento; inducen ri de base celular y están presentes en los PPD (reacciones cruzadas entre Ma y Mb)

• Grupo III: comunes a todas las de crecimiento rápido

• Grupo IV: especie-específicos, por lo general proteínas. Contribuyen a la hipersensibilidad (daño tisular)

Antígenos del complejo Mtb

Ag 71 kDa (proteína de la fami-lia hsp70)

Ag 65 kDa (inmunodominante)Ag 60 kDa (en las PPD)Ag 39 kDa ó Ag 5 (GP especí-

fico Mtb y Mb)Ag 38 kDa o Ag b ó Ag Pab (lipo-

proteína, específica Mtb y Mb)Ag 32 kDa, P32 ó Ag 85 A (esti-

mulador de la ri de base celular)Ag 30 kDa, MPB 59, Ag 85B,..Ag 85 C (unión a fibronectina)Ag 29,8 kDa (solo en Mb)Ag 24 kDa o MPB 64Ag22 kDa o MPB70, MPB80 ó P2Ag 19 kDaAg 14 kDaAg 12 kDa

Cultivo. Procesado de muestras• Complejo M. tuberculosis:

crecimiento lento (> 3 semanas)• Transporte en una solución de

borato sódico (a tª ambienteconserva y puede utilizarse para el almacenamiento): – a 23ºC se ha recuperado despues de

17 semanas– a 4ºC después de 25 semanas

• Necesaria descontaminación de las muestras clínicas (evitar bacterias y hongos de crecimiento rápido)

• Conveniencia de concentración

Heces, orina, esputos, jugo gás-trico, escobillones y gasas, ma-

terial de necropsia, etc

Descontaminación:-NaOH 4% (15-30’ en agitación, a 37ºC). Neu-tralización (sulfúrico o ClH)

-Cloruro de hexadecilpiridinio(10ml a 10ml de homoge-neizado) 30 ‘ en agitacióny 30’ a 4.000 rpm. Siembradel pellet con hisopo

-preliminar con hipoclorito al1:1000, 4-6h; principal conNaOH al 2-4%, 10-30’ y neu-tralizar con ClH 2N. Centri-fugar para concentrar y sem-brar del pellet

Medios de cultivo• Condiciones de

crecimiento:– Aerobios

estrictos (algunas cepas microaerófilas: identificación)

– 28-37ºC– pH: 6-6,5– Tiempo: 30-60 d

pellet

Lowenstein (1930) y Jensen (1955):huevo completo, asparragina, glice-rol y sales minerales. M. bovis

Stonebrink (1957): piruvato sustituye a glicerol. M. bovis. B-83 tiene menos verde malaquita. Recupera más y másrápido

Coletsos: asparragina, piruvato,Glutamato Na, glicerol, verde deMalaquita y huevo. M. bovis

Herrold (1931): glicerol, peptona y yemaDe huevo. M. paratuberculosis

Crecimiento lento: tiempo dereplicación: 20 horas

Colonias en Lowenstein-Jensen

Coletsos

Cultivos líquidos• Precisan incorporar un

detergente (ej.Tween 80) para neutralizar la naturaleza hidrofóbica de los lípidos de superficie. En caso contrario se produce agregación y flotación: forman una película semejante a la que forman los hongos (Myco).

• En medios líquidos M. tuberculosis y M. bovis virulentas forman cordones al microscopio

Identificación tradicional• Velocidad de crecimiento,

producción de pigmentos, morfología de las colonias y pruebas bioquímicas:

– producción de niacina, reducción de los nitratos, hidrólisis del Tween 80, crecimiento en presencia de hidracida del ácido 2 tiofenocarboxílico (TCH), relaciones con el oxígeno, susceptibilidad a la pirazinamida, actividad arilsulfatasa y ureasa

• Inconvenientes: – lentitud (puede hasta 3 m), – precisa de suficiente

crecimiento– precisa de reactivos

peligrosos (bromuro de cianógeno, para la niacina)

Especie Biovar TCH N03 O2PZA

M. tuberculosis Humana clásicaHumana asiática

RS

++

AerAer

SS

M. africanum III

SS

-+

MicMic

SS

M. bovis ClásicaBCG

SS

--

MicAer

RR

Alternativas RÁPIDAS al cultivo e identificación

• Aislamiento– Bactec 460: método

radiométrico (15 d)– Bactec 9000:

método fluorimetrico(15,6 d)

– Septi-Check: medio bifásico (23 d)

• Identificación:– HPLC: cultivo + horas– BACTEC-NAP: 3.5 d– Biología Molecular:

• Sondas marcadas: sondas Accuprobe(cultivo + 1h)

• PCR: múltiples sistemas en función de la secuencia diana y primers utilizados

Caracteres de interés epidemiológico

• Muy sensible al Calor:– 70ºC 5’ en leche (una referencia)

• Resistente a los ácidos, álcalis y muchosdesinfectantes químicos (utilidad en la descontaminación de muestras)

– Puede eliminarse mediante una solución débil de lejía en agua (1:9)

– Fenol al 2% o formol al 3% 3 h son muy eficaces. – Fenol al 5% muy eficaz con/sin materia orgánica– Glutaraldehido al 2%, muy eficaz– Etanol al 80% (10 ‘ o menos): desinfección de piel y

materiales de uso clínico. Con materia orgánica se reduce– Acetona y tintura de yodo: rápidamente– Oxido de etileno: moderadamente eficaz– Derivados de amonio cuaternario, clorhexidina y

yodóforos: relativa o totalmente ineficaces– Yoduros de amonio cuaternario: muy eficaces

• M. tuberculosis y M. bovis no se multiplican en el medio ambiente perosobreviven varios meses en el suelo o estiércol bovino– Resistentes a la desecación. Si se protegen

de la luz solar sobreviven semanas o meses

– Se destruyen rápido por la luz solar o radiaciones UV (4-10 veces más sensiblesque E.coli)

– Duffield et al (1985) en suelos inoculados: M. bovis sobrevivió 4 s en suelos húmedosy heces, 80% de sombra y oscuridad

– En UK se ha demostrado la prevalencia en el ambiente de muchas explotacionesendémicas de TB (PCR y RT-PCR) (Courtenay et al., 2005)

– M. bovis BCG permanece viable en suelomás de 15 meses. Niveles significativos de DNA y RNA (PCR y RT-PCR) permanecenen el campo, lo que indica la presencia de células viables como un reservorioambiental de la infección, que poseeriesgo para el ganado (Young et al., 2005)

*Mtb y Mb poseen 190 proteínas reguladoras derutas metabólicas la mayoría de las cuales están conservadas en ambas especies, mientras que Mapposee 235*Map sobrevive más tiempo que el resto fuera del hospe- dador como consecuencia de la posibilidad de expansionar su amplio repertorio de genes reguladores (Whittington et al., 2004, 2005).

• Reservorios silvestres (OIE):– En UK e Irlanda, el tejón, corzo,

gamo y ciervo– En España: gamos, ciervos, jabalíes y

lince– En USA: venados de cola blanca,

coyote, zorro rojo, mapache, oso negro y lince rojo

– En Canadá: bisonte y ciervo– En Uganda: búfalos– En Sudáfrica: kudúes, zambos, leones,

leopardos y onzas– En Zambia: lichís rojos– En Hawai: suidos salvajes

Factores de virulencia de Mtb• El trabajo con Mtb es difícil en los

estudios de virulencia: lentocrecimiento y escasoconocimiento de su genética

• En los últimos años gran avance: secuenciado el genoma de Mtb (2 cepas), Mb, Ml y Map (Reddy Marriet al., 2006), así comoparcialmente el de otras 14 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi)

• La clave de su conocimiento estáen la entrada y supervivenciadentro de los macrófagos– En relación con la entrada: sobre

la superficie de los macrófagos se sitúan los receptores CR3 y CR4que unen Mtb

– No se conoce nada de losligandos de Mtb

Mtb Macrófago

CR3

CR4?

En conjunto, estos compuestosprevienen la destrucción porlisosomas o macrófagos

Factores de virulencia-Componentes de la pared celular: Ag85 (fbpA,B,C1 y C2:transferencia de micolatos, unión a fibronectina),LAM, mmpL(prot. transmembrana:1-13)-Factores de internalización: operones mce (1,2,3,y 4: entra-da en células de mamífero): diferencias de expresión-Factores de supervivencia: lipF, plcABC, hierro-Factores de persistencia: icl, lueD (auxotrofos)-Factores de resistencia al hospedador: narG, katG, sodC-Activadores transcripcionales: sigAF (resistencia drogas),mprAB

Mycobacterias• Factores de virulencia (Mtb)

– Factor Cordon: – glicolípido (trealosa6’,6’ dimicolato) que es responsabledel crecimiento serpenteante (en forma de cordón o filamento) de Mtben el que los bacilos crecen en forma cerrada y ordenada

• Es tóxico para los leucocitos, antiquimotáctico, interfiere con la función mitocondrial en los ratonesy juega un papel importante en el desarrollo de las lesionesgranulomatosas

– Capacidad de adquisición de hierro: requerido para la superviven-cia en el interior de los fagocitos

– Sulfolípidos: previenen la fusiónfagosoma-lisosoma y hacen que losbacilos no estén expuestos a lasenzimas lisosómicas (importante en la supervivencia intracelular)

• Dos factores adicionales se responsabilizan de la persistencia en los macrófagos (Flynn y Chan, 2003): – 1) prevención del

reconocimiento de los macrófagos infectados por las células T CD4+ por inhibición del procesado y presentación a cargo del MHC II: debido a la producción de IL-6 por los macrófagos infectados

– 2) evadiendo la acción del NO y de los intermediarios nitrogenados reactivos(RNIs): debido a la producción de IL-10 y TGF-βpor los macrófagos infectados

IL-6, IL-10,TGF-β

Secuencia de la infección con Mycobacterium bovis

Los bacilos son inhalados como gotitas.

En los pulmones son fagocitados por los macrófagos alveolarese inducen una respuesta proinflamatoria localizada que conduce al reclutamiento de mononucleares desde los vasos próximos

Estas células construyen un granuloma o tubérculo formado por un centrode macrófagos infectados rodeado de células gigantes y más macrófagoscon una cubierta de linfocitos (fase de contención).

Rotura de la fase de contención y liberación debacilos viables: fase de contagio