UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE C.C. QUMICAS Departamento de Qumica Analtica

BIOSENSORES AMPEROMTRICOS COMPSITOS BASADOS EN PEROXIDASA. APLICACIN A LA DETERMINACIN DE ANALITOS DE INTERS EN ALIMENTOS MEDIANTE ELECTRODOS BIENZIMTICOS Y MULTIENZIMTICOSMEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR POR Nuria Pea Garca Bajo la direccin del Doctor: Jos Manuel Pingarrn Carrazn Madrid, 2003

ISBN: 84-669-1840-X

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

BIOSENSORES AMPEROMTRICOS COMPSITOS BASADOS EN PEROXIDASA. APLICACIN A LA DETERMINACIN DE ANALITOS DE INTERS EN ALIMENTOS MEDIANTE ELECTRODOS BIENZIMTICOS Y MULTIENZIMTICOS

NURIA PEA GARCA MADRID 2002

Indice

NDICE

I. OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO II. INTRODUCCIN II.1. Biosensores ................................................................................................................ II.2. Electrodos compsitos ................................................................................................ II.2.1. Matrices electrdicas de grafito-Tefln ......................................................... II.2.2. Matrices electrdicas de carbono vtreo reticulado ....................................... II.3. Biosensores electroqumicos compsitos ................................................................... II.4. Biosensores enzimticos en medios orgnicos y en medios organizados .................. II.5. Biosensores en el anlisis de alimentos ..................................................................... II.6. Bibliografa ................................................................................................................. III. ELECTRODOS COMPSITOS DE PEROXIDASA III.1. Objetivo ..................................................................................................................... III.2. Caractersticas generales de las peroxidasas............................................................. III.3. Antecedentes bibliogrficos ....................................................................................... III.4. Parte Experimental .................................................................................................... III.4.1. Instrumentacin ........................................................................................... III.4.1.1. Aparatos ........................................................................................ III.4.1.2. Electrodos y clulas de trabajo ...................................................... III.4.2. Reactivos ..................................................................................................... III.4.3. Procedimiento experimental ........................................................................ III.4.3.1. Preparacin de disoluciones ......................................................... III.4.3.1.1. Medios de trabajo ........................................................... III.4.3.1.2. Disoluciones patrn de los compuestos empleados como sustratos en las reacciones enzimticas................. III.4.3.2. Obtencin de los amperogramas en discontinuo ........................... III.4.3.3. Medidas por inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica ....... III.5. BIOSENSORES COMPSITOS DE GRAFITO-TEFLN-PEROXIDASA III.5.1. Introduccin ........................................................................................................... III.5.2. Preparacin de los biosensores ............................................................................. III.5.3. Optimizacin de variables experimentales .............................................................. III.5.3.1. Composicin de la matriz electrdica ....................................................... III.5.3.2. Influencia del pH sobre la intensidad de corriente en estado estacionario............................................................................................... III.5.3.3. Efecto del potencial aplicado sobre la intensidad de corriente en estado estacionario.......................................................................................... III.5.3.4. Disoluciones micelares :eleccin del tensoactivo y de su concentracin ........................................................................................... III.5.3.5. Emulsiones aceite-agua .......................................................................... III.5.3.5.1. Influencia del porcentaje de fase dispersa sobre la intensidad en estado estacionario............................................. III.5.3.5.2. Influencia del porcentaje de agente emulsificante .................... III.5.3.6. Medio acetonitrilo :disolucin reguladora acuosa ..................................... III.5.3.6.1. Influencia del contenido de fase acuosa sobre la intensidad en estado estacionario ............................................... III.5.3.6.2. Influencia del potencial aplicado ................................................. III.5.3.7. Emulsiones agua-aceite o micelas inversas ............................................. III.5.3.7.1.Influencia del potencial aplicado sobre la intensidad de corriente en estado estacionario ................................................. III.5.3.7.2. Eleccin del tensoactivo ............................................................. III.5.3.7.3. Inflluencia de la concentracin del tensoactivo ...........................

1 3 4 8 12 14 16 20 25 29

39 39 41 49 49 49 49 50 51 51 51 52 52 52

55 56 57 59 61 62 63 65 65 66 67 67 68 69 70 71 71I

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III.5.3.7.4. Influencia del porcentaje de fase acuosa dispersa ..................... III.5.4. Estabilidad de los biosensores en los diferentes medios de trabajo ....................... III.5.4.1.Repetibilidad de las medidas sin regeneracin de la superficie electrdica ............................................................................................... III.5.4.2. Repetibilidad de las medidas regenerando la superficie electrdica por pulido ............................................................................. III.5.4.3. Tiempo de utilizacin del electrodo enzimtico ...................................... III.5.4.4. Reproducibilidad en la fabricacin de los electrodos .............................. III.5.4.5. Efecto del tiempo de almacenamiento de la pastilla madre .................... III.5.5.Estudio cintico de la reaccin enzimtica ............................................................... III.5.5.1. Clculo de la Vmax y la Km ....................................................................... III.5.5.2. Velocidad de reaccin ............................................................................ III.5.6. Curvas de calibrado y caractersticas analticas ..................................................... III.5.7. Inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica ..................................................... III.5.7.1. Influencia del potencial aplicado sobre la seal amperomtrica ............. III.5.7.2. Optimizacin de los parmetros caractersticos de inyeccin en flujo .... III.5.7.2.1. Caudal ........................................................................................ III.5.7.2.2. Volumen de inyeccin ................................................................ III.5.7.3. Repetibilidad de las seales amperomtricas ........................................ III.5.7.4. Curvas de calibrado y caractersticas analticas ..................................... III.6. BIOSENSORES COMPSITOS DE CARBONO VTREO RETICULADO-RESINA EPOXI-PEROXIDASA III.6.1. Introduccin ........................................................................................................... III.6.2. Preparacin de los biosensores .............................................................................. III.6.3. Optimizacin de las variables experimentales ......................................................... III.6.3.1. Composicin de la matriz electrdica ..................................................... III.6.3.2. Influencia del pH sobre la intensidad de corriente en estado estacionario ........................................................................................... III.6.3.3. Efecto del potencial aplicado sobre la intensidad de corriente en estado estacionario ................................................................................ III.6.3.4. Disoluciones micelares : Eleccin del tensoactivo y de su concentracin.......................................................................................... III.6.3.5. Emulsiones aceite-agua ......................................................................... III.6.3.5.1. Influencia del porcentaje de fase dispersa ................................. III.6.3.5.2. Influencia del porcentaje de agente emulsificante ...................... III.6.3.6. Medio acetonitrilo :disolucin reguladora acuosa ................................... III.6.3.6.1. Influencia del contenido de fase acuosa ..................................... III.6.3.6.2. Influencia del potencial aplicado ................................................. III.6.4. Estabilidad de los biosensores en los distintos medios de trabajo .......................... III.6.4.1.Repetibilidad de las medidas sin regeneracin de la superficie electrdica ............................................................................................... III.6.4.2. Reproducibilidad de las medidas regenerando la superficie electrdica por pulido ............................................................................. III.6.4.3. Tiempo de vida til de un biosensor........................................................ III.6.4.4. Reproducibilidad de las seales amperomtricas obtenidas con diferentes electrodos ........................................................................ III.6.5. Clculo de las constantes cinticas de la reaccin ................................................. III.6.6. Curvas de calibrado y caractersticas analticas ...................................................... III.6.7. Electrodos compsitos de RVC-resina epoxi-HRP-ferroceno/ ferrocianuro como detectores amperomtricos en sistemas en flujo .......................................... III.6.7.1. Optimizacin del caudal ......................................................................... III.6.7.2. Repetibilidad de las seales amperomtricas mediante anlisis por inyeccin en flujo III.6.7.3. Curvas de calibrado y caractersticas analticas .......................................... III.7. COMPARACIN DE LOS ELECTRODOS COMPSITOS ENZIMTICOS DEII

72 73 73 75 76 78 79 80 80 85 88 92 92 93 93 95 96 97

103 104 106 106 111 111 112 113 113 114 114 115 116 118 118 120 121 123 124 128 131 131 132 134

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MATRICES GRAFITO-TEFLN Y RVC RESINA EPOXI .................................................. III.8. BIBLIOGRAFA ELECTRODOS COMPSITOS DE PEROXIDASA .........................

139 145

IV. ELECTRODOS BIENZIMTICOS IV.1. BIOSENSOR DE GLUCOSA IV.1.1. Objetivo .................................................................................................................. IV.1.2. Introduccin ............................................................................................................ IV.1.3. Antecedentes bibliogrficos .................................................................................... IV.1.4. Parte Experimental ................................................................................................. IV.1.4.1. Instrumentacin ....................................................................................... IV.1.4.1.1. Aparatos .................................................................................... IV.1.4.1.2. Electrodos y clulas de trabajo .................................................. IV.1.4.2. Reactivos ................................................................................................. IV.1.4.3. Procedimiento Experimental ..................................................................... IV.1.4.3.1. Preparacin de disoluciones ...................................................... IV.1.4.3.2. Preparacin del electrodo compsito bienzimtico de glucosa ...................................................................................... IV.1.4.3.3. Obtencin de los amperogramas en discontinuo........................ IV.1.4.3.4. Medidas por inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica.... IV.1.4.3.5. Determinacin de glucosa en mostos y vinos ............................ IV.1.4.3.5.1. Preparacin de las muestras ....................................... IV.1.4.3.5.2. Obtencin de las seales amperomtricas .................. IV.1.4.3.5.2.1. Amperogramas en discontinuo ...................... IV.1.4.3.5.2.2. Inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica .............................................. IV.1.5. ELECTRODO COMPSITO DE GRAFITO-TEFLN-GLUCOSA OXIDASAPEROXIDASA-FERROCENO ................................................................................ IV.1.5.1. Estabilidad del electrodo bienzimtico ...................................................... IV.1.5.2. Curva de calibrado y caractersticas analticas ......................................... IV.1.5.3. inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica utilizando como detector el electrodo de grafito-tefln-glucosa oxidasaperoxidasa-ferroceno ............................................................................... IV.1.5.3.1. Repetibilidad de las medidas sin regeneracin de la superficie electrdica ................................................................. IV.1.5.3.2. Caractersticas analticas ........................................................... IV.1.5.4. Determinacin de glucosa en muestras de mostos y vinos ...................... IV.1.5.4.1. Estudio de interferencias ........................................................... IV.1.5.4.2. Anlisis en discontinuo .............................................................. IV.1.5.4.3. Anlisis por inyeccin en flujo .................................................... IV.1.6. CONCLUSIONES ................................................................................................... IV.1.7. BIBLIOGRAFA. BIOSENSOR DE GLUCOSA .......................................................

153

158 158 161 169 169 169 169 169 170 170 170 171 171 171 171 172 172 172

174 174 177

178 178 179 180 180 182 183 184 185

IV.2. BIOSENSOR DE HIPOXANTINA IV.2.1. Objetivo .................................................................................................................. IV.2.2. Introduccin ............................................................................................................ IV.2.3. Antecedentes bibliogrficos .................................................................................... IV.2.4. Parte Experimental ................................................................................................. IV.2.4.1. Instrumentacin ....................................................................................... IV. 2.4.1.1. Aparatos ................................................................................... IV. 2.4.1.2. Electrodos y clulas de trabajo .................................................

192 192 193 199 199 199 199III

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IV. 2.4.2. Reactivos ................................................................................................ IV.2.4.3. Procedimiento Experimental .................................................................... IV.2.4.3.1. Preparacin de disoluciones ..................................................... IV.2.4.3.2. Preparacin del electrodo compsito bienzimtico de hipoxantina ............................................................................ IV.2.4.3.3. Obtencin de los amperogramas ............................................... IV.2.4.3.4. Determinacin de hipoxantina en tejido muscular de sardinas ..................................................................................... IV.2.4.3.4.1. Determinacin de hipoxantina en tejido muscular de sardinas por el mtodo de referencia........................ IV.2.5. ELECTRODOS BIENZIMTICOS DE GRAFITO-TEFLN-XANTINA OXIDASA-PEROXIDASA-FERROCENO PARA LA DETERMINACIN DE HIPOXANTINA... IV.2.5.1. Optimizacin del porcentaje de Tefln en la matriz electrdica ................ IV.2.5.2. Eleccin del sistema enzimtico y efecto del potencial aplicado..................................................................................................... IV.2.5.3. Efecto de la temperatura........................................................................... IV.2.5.4. Efecto del pH............................................................................................ IV.2.5.5. Estabilidad del electrodo compsito bienzimtico ..................................... IV.2.5.6. Curva de calibrado y caractersticas analticas ......................................... IV.2.5.7. Estudio de interferencias .......................................................................... IV.2.5.8. Determinacin de hipoxantina en tejido muscular de sardinas ................. IV.2.6. CONCLUSIONES ................................................................................................... IV.2.7. BIBLIOGRAFA. BIOSENSOR DE HIPOXANTINA..................................................

200 200 200 201 201 202 202

204 204 205 209 210 211 214 215 216 218 219

IV.3. BIOSENSOR DE COLESTEROL IV.3.1. Objetivo .................................................................................................................. IV.3.2.. Introduccin ........................................................................................................... IV.3.3. Antecedentes bibliogrficos .................................................................................... IV.3.4. Parte Experimental ................................................................................................. IV.3.4.1. Instrumentacin ....................................................................................... IV.3.4.1.1. Aparatos .................................................................................... IV.3.4.1.2. Electrodos y clula electroqumica ............................................. IV.3.4.2. Reactivos ................................................................................................. IV.3.4.3. Procedimiento Experimental ..................................................................... IV.3.4.3.1. Preparacin de disoluciones ...................................................... IV.3.4.3.2. Preparacin del electrodo compsito bienzimtico de colesterol................................................................................... IV.3.4.3.3. Obtencin de los amperogramas ............................................... IV.3.4.3.4. Determinacin de colesterol en mantequilla, manteca de cerdo y yema de huevo ........................................................................ IV.3.5. ELECTRODO COMPSITO DE GRAFITO-TEFLN-COLESTEROL OXIDASA PEROXIDASA-FERROCIANURO PARA LA DETERMINACIN DE COLESTEROL EN MICELAS INVERSAS ......................................................................................... IV.3.5.1. Optimizacin de variables experimentales ............................................... IV.3.5.1.a. Contenido de colesterol oxidasa en la matriz electrdica ........... IV.3.5.1.b. Influencia de la temperatura ...................................................... IV.3.4.1.c. Influencia del potencial aplicado ................................................ IV.3.5.2. Estabilidad del electrodo compsito bienzimtico.......................................... IV.3.5.3. Curva de calibrado y caractersticas analticas ............................................. IV.3.5.4. Determinacin de colesterol libre y total en muestras de alimentos .............. IV.3.5.4.1. Estudio de interferencias................................................................. IV.3.5.4.2. Determinacin de colesterol libre y total en mantequilla .................IV

224 224 227 231 231 231 231 231 232 232 233 233 233

237 237 237 237 238 240 244 245 245 247

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IV.3.5.4.3. Determinacin de colesterol libre y total en manteca de cerdo ....... IV.3.5.4.4. Determinacin de colesterol libre y total en yema de huevo ........... IV.3.6. CONCLUSIONES ................................................................................................... IV.3.7. BIBLIOGRAFA. BIOSENSOR DE COLESTEROL .................................................

250 252 255 256

IV.4. BIOSENSORES DE ALCOHOLES IV.4.1. Objetivo ................................................................................................................. IV.4.2. Introduccin ............................................................................................................ IV.4.3. Antecedentes bibliogrficos .................................................................................... IV.4.4. Parte Experimental ................................................................................................. IV.4.4.1. Instrumentacin ................................................................................... IV.4.4.1.1. Aparatos .................................................................................... IV.4.4.1.2. Electrodos y clulas de trabajo .................................................. IV.4.4.2. Reactivos ............................................................................................. IV.4.4.3. Procedimiento Experimental ................................................................ IV.4.4.3.1. Preparacin de disoluciones ...................................................... IV.4.4.3.2. Preparacin de los electrodos compsitos bienzimticos para alcoholes ................................................................................... IV.4.4.3.2.1. Electrodo de grafito-Tefln-AOD-HRP-ferroceno ........... IV.4.4.3.2.2. Electrodo de RVC-resina epoxi-AOD-HRP-ferroceno..... IV.4.4.3.3. Obtencin de los amperogramas en discontinuo........................ IV.4.4.3.4. Medidas por inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica.... IV.4.4.3.5. Obtencin de los cromatogramas en HPLC ............................... IV.4.4.3.6. Determinacin de alcoholes en bebidas...................................... IV.4.4.3.6.1. Preparacin de las muestras ......................................... IV.4.4.3.6.1.1. Determinacin de etanol en cervezas, vinos y aguardientes .......................................... IV.4.4.3.6.1.2.Determinacin de metanol en vinos y aguardientes ....................................................... IV.4.4.3.6.2. Obtencin de los amperogramas para la determinacin de alcoholes ................................................................... IV.4.4.3.6.2.1. Determinacin de etanol en cervezas................. IV.4.4.3.6.2.2. Determinacin de etanol en vinos y aguardientes ...................................................... IV.4.4.3.6.2.3. Determinacin de metanol en vinos y aguardientes ................................................... IV.4.4.3.6.2.4. Determinacin de etanol en bebidas alcohlicas por un mtodo de referencia............................... IV.4.5. ELECTRODO COMPSITO DE GRAFITO-TEFLN-ALCOHOL OXIDASAPEROXIDASA......................................................................................................... IV.4.5.1. Optimizacin de las variables experimentales ........................................ IV.4.5.1.1. Optimizacin de la composicin del electrodo compsito .......... IV.4.5.1.2. Influencia del pH ........................................................................ IV.4.5.1.3. Influencia del potencial aplicado sobre la intensidad de corriente en estado estacionario ................................................. IV.4.5.2. Estabilidad del electrodo bienzimtico ............................................... IV.4.5.3. Respuesta del biosensor bienzimtico para diferentes alcoholes ...... IV.4.5.3.1. Clculo de las constantes de velocidad de la reaccin enzimtica para diferentes alcoholes ..................................... IV.4.5.4. Curvas de calibrado y caractersticas analticas ..................................... IV.4.5.5. Anlisis por inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica ................. IV.4.5.5.1. Optimizacin del caudal ........................................................ IV.4.5.5.2. Repetibilidad de las seales amperomtricas .......................

260 260 264 269 269 269 269 270 271 271 271 271 272 272 273 273 273 273 273 274 274 274 275 275 275

278 278 278 279 279 281 284 285 290 293 293 294V

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IV.4.5.5.3. Curvas de calibrado y caractersticas analticas .................... IV.4.5.6. Estudio de interferencias ....................................................................... IV.4.5.7. Determinacin de etanol en cervezas .................................................... IV.4.5.8. HPLC con deteccin amperomtrica con el electrodo de grafito-Tefln-alcohol oxidasa-peroxidasa-ferroceno.................................... IV.4.5.8.1. Repetibilidad de las medidas ................................................. IV.4.5.8.2. Curvas de calibrado y caractersticas analticas .................... IV.4.5.8.3. Determinacin de metanol y etanol en bebidas alcohlicas ............................................................................. IV.4.5.8.3.1. Determinacin en vinos ............................................. IV.4.5.8.3.2. Determinacin en aguardientes ................................. IV.4.6. ELECTRODO BIENZIMTICO DE RVC-RESINA EPOXI-ALCOHOL OXIDASAPEROXIDASA-FERROCENO ................................................................................ IV.4.6.1. Optimizacin de las condiciones experimentales ................................... IV.4.6.1.1. Contenido de alcohol oxidasa en la matriz electrdica .......... IV.4.6.1.2. Influencia del pH .................................................................. IV.4.6.1.3. Influencia del potencial aplicado sobre la intensidad de corriente en estado estacionario ............................................ IV.4.6.2. Estabilidad del biosensor ....................................................................... IV.4.6.3. Curvas de calibrado y caractersticas analticas ..................................... IV.4.6.4. Inyeccin en flujo con deteccin amperomtrica .................................... IV.4.6.4.1. Optimizacin de las variables hidrodinmicas ....................... IV.4.6.4.2. Repetibilidad de las seales amperomtricas ....................... IV.4.6.4.3. Curvas de calibrado y caractersticas analticas .................... IV.4.6.5. Determinacin de etanol en cervezas .................................................... IV.4.7. CONCLUSIONES ................................................................................................... IV.4.8. BIBLIOGRAFA. BIOSENSORES DE ALCOHOLES .............................................. IV.5. BIBLIOGRAFA. ELECTRODOS BIENZIMTICOS .................................................

296 298 299 302 305 306 308 308 312

316 316 316 317 317 318 321 325 325 327 328 329 332 333 336

V. ELECTRODOS MULTIENZIMTICOS. MULTIDETECCIN CON BIOSENSORES V.I. Objetivo ...................................................................................................................... V.2. Introduccin ................................................................................................................ V.3. Antecedentes bibliogrficos ........................................................................................ V.4. Parte Experimental ..................................................................................................... V.4.1. Instrumentacin ......................................................................................... V.4.4.1. Aparatos ........................................................................................ V.4.4.2. Electrodos y clulas de trabajo ...................................................... V.4.2. Reactivos ................................................................................................... V.4.3. Procedimiento Experimental ...................................................................... V.4.3.1. Preparacin de disoluciones .......................................................... IV.4.3.2. Preparacin de los electrodos compsitos enzimticos................. V.4.3.2.1. Electrodo bienzimtico de grafito-Tefln-lactato oxidasaperoxidasa-ferroceno .......................................................... V.4.3.2.2. Electrodo trienzimtico de grafito-Tefln-glucosa oxidasa-alcohol oxidasa-peroxidasa-ferroceno................................ V.4.3.3. Obtencin de los amperogramas en discontinuo............................ V.4.3.4. Medidas por inyeccin en flujo........................................................ V.4.3.5. Obtencin de los cromatogramas en HPLC ................................... V.4.3.6. Anlisis de muestras reales ........................................................... V.4.3.6.1. Preparacin de las muestras ............................................. V.4.3.6.2. Obtencin de las seales amperomtricas ........................VI

341 341 342 346 346 346 346 347 348 348 348 348 349 349 350 350 350 350 351

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V.4.3.6.2.1. Determinacin de etanol y glucosa en vino de jerez ....................................................... V.4.3.6.2.2. Determinacin de cido lctico y glucosa en vino tinto ............................................................. V.4.3.6.3. Determinacin de los analitos en las muestras mediante mtodos de referencia ....................................... V.5. ELECTRODO TRIENZIMTICO DE GRAFITO-TEFLN-GLUCOSA OXIDASAALCOHOL OXIDASA-PEROXIDASA FERROCENO .................................................. V.5.1. Establilidad del electrodo trienzimtico ..................................................... V.5.2. Curvas de calibrado y caractersticas analticas ....................................... V.5.3. Deteccin amperomtrica en HPLC ......................................................... V.5.3.1. Efecto del caudal ........................................................................... V.5.3.2. Repetibilidad de las medidas ......................................................... V.5.3.3. Curvas de calibrado y caractersticas analticas ............................ V.5.4. Aplicacin al anlisis de muestras reales ................................................. V.5.4.1. Determinacin de metanol y glucosa en vinos. V.5.4.2. Determinacin de etanol y glucosa en vino de Jerez V.6. DETECCIN SIMULTNEA DE ANALITOS MEDIANTE EL EMPLEO DE ELECTRODOS COMPSITOS BIENZIMTICOS EN PARALELO ............................ V.6.1. Determinacin de glucosa y etanol en vino de jerez V.6.2. Determinacin de cido lctico y glucosa en vinos. V.7. CONCLUSIONES ....................................................................................................... V.8. BIBLIOGRAFA.ELECTRODOS MULTIENZIMTICOS/MULTIDETECCIN .............

351 351 352

353 353 354 355 355 356 357 360 360 362

366 366 368 371 372

VI. CONCLUSIONES

377

VII

Introduccin

I. OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO

El objetivo de este trabajo, enmarcado dentro de una de las lneas de investigacin del grupo de Electroanlisis del Departamento de Qumica Analtica de la Universidad Complutense de Madrid, es el diseo de matrices electrdicas compsitas en las que se pueden inmovilizar enzimas por simple atrapamiento fsico, dando as lugar a biosensores amperomtricos con caractersticas operacionales adecuadas para su aplicacin a la resolucin de problemas analticos reales. Dada la amplia gama de posibilidades prcticas que representa la peroxidasa, se ha escogido esta enzima como base para desarrollar biosensores que, mediante el acoplamiento de diversas reacciones enzimticas, puedan ser utilizados para la determinacin rpida y fiable de analitos de inters en la industria alimentaria.

Las matrices electrdicas compsitas que se pensaron utilizar en este trabajo son las constituidas por grafito y Tefln y por carbono vtreo reticulado (RVC) y resina epoxi. En ambos casos el diseo del biosensor implica la inmovilizacin de varias enzimas, usualmente dos, junto con un mediador adecuado para cada medio de trabajo utilizado, en todo el volmen de la matriz. Con este tipo de diseo se debe favorecer un ntimo contacto entre la/s enzima/s, el mediador y la fase conductora del electrodo compsito (grafito o carbono vtreo reticulado dependiendo del tipo de electrodo que se trate) y se conseguir, adems, un depsito tridimensional de elemento de reconocimiento biolgico de fcil regeneracin superficial y, en principio, compatible tanto con medios acuosos como predominantemente no acuosos.

Con objeto de alcanzar el objetivo planteado, el plan de trabajo efectuado fue el siguiente : 1. Diseo, desarrollo, optimizacin y evaluacin de las caractersticas operacionales de matrices electrdicas de en grafito-Tefln-peroxidasa-mediador medios acuosos y y RVC-resina no epoxi-

peroxidasa-mediador

predominantemente

acuosos.

Establecimiento de las diferentes variables cinticas de la reaccin enzimtica en los medios estudiados, y de las caractersticas analticas para la determinacin de perxido de hidrgeno y perxido de 2-butanona en discontinuo y del perxido de hidrgeno en anlisis por inyeccin en flujo. 2. Diseo, desarrollo, optimizacin y evaluacin de las caractersticas operacionales y analticas de biosensores bienzimticos compsitos para la determinacin de glucosa, hipoxantina, colesterol, metanol y etanol. Establecimiento de las metodologias necesarias para la determinacin de estos analitos en alimentos de diversas caractersticas. 3. Evaluacin de la posibilidad de utilizar biosensores compsitos de grafito-Tefln como detectores amperomtricos en HPLC y como sistemas para la multideteccin de analitos. Se pretende evaluar la posibilidad de coinmovilizar diferentes oxidasas con la peroxidasa en un3

Introduccin

mismo electrodo para la determinacin simultnea de varios analitos en una misma muestra llevando a cabo una separacin cromatogrfica, as como el acoplamiento de varios electrodos bienzimticos en clulas de deteccin dual.

II. INTRODUCCIN4

Introduccin

La investigacin en Ciencia y Tecnologa de los alimentos requiere la determinacin de la composicin y caractersticas de stos, ya que es la manera de determinar el valor nutritivo, caractersticas funcionales y aceptabilidad de un alimento. Adems, cualquier producto alimentario necesita un anlisis como parte de un programa de control de calidad a lo largo del proceso de fabricacin y una vez que el producto est en el mercado. Para todo ello, se requieren mtodos de anlisis rpidos, precisos, exactos, que sean validables y que precisen un tratamiento de muestra mnimo y lo ms sencillo posible (Nielsen Aspen Publishers, 1998). Estos requisitos los pueden cumplir los mtodos que emplean electrodos amperomtricos enzimticos, los cuales combinan la selectividad que aportan las enzimas con la sensibilidad de la deteccin amperomtrica. Las enzimas son catalizadores proteicos que poseen una gran selectividad y reactividad. El anlisis enzimtico consiste en la determinacin de analitos con la ayuda de enzimas o en la medida de la actividad enzimtica endgena. El hecho de que la catlisis enzimtica pueda proceder bajo condiciones suaves, permite la determinacin de especies relativamente inestables que no pueden determinarse por otros mtodos. Por otro lado, la selectividad de las reacciones enzimticas puede permitir a veces la medida de componentes en mezclas complejas sin necesidad de recurrir a tcnicas de separacin. Existen numerosas aplicaciones del anlisis enzimtico en Ciencia y Tecnologa de los alimentos ; en algunas ocasiones, la actividad enzimtica es una medida de gran utilidad para verificar si un proceso es adecuado, por ejemplo estudiando la estabilidad trmica de la enzima durante tratamientos a diferentes temperaturas. Otra aplicacin, que es la que se ha empleado a lo largo de los trabajos que se recogen esta Memoria, es la determinacin de constituyentes o subproductos de un alimento que son sustratos enzimticos. En este contexto, el empleo de biosensores enzimticos permite un ahorro de costes y de tiempo, ya que se pueden utilizar repetidamente. Por ltimo, dada la selectividad de las enzimas, la preparacin de las muestras que precede al anlisis es, por lo general, mnima, ya que usualmente comprende nicamente extraccin y eliminacin de slidos por filtracin o centrifugacin, y en muchos casos la simple dilucin de la muestra, lo que supone una gran ventaja a la hora de desarrollar mtodos de anlisis que tengan amplia aceptacin (Nielsen Aspen Publishers, 1998). Por todo ello, es evidente que la utilizacin de enzimas, y en especial de biosensores enzimticos, en el anlisis de alimentos proporciona una serie de ventajas frente a otras metodologas analticas que hacen que este tipo de investigaciones resulten de inters prioritario.

II.1. BIOSENSORES5

Introduccin

La IUPAC define un biosensor como un dispositivo capaz de proporcionar una informacin analtica especfica cuantitativa o semicuantitativa, utilizando un elemento de reconocimiento biolgico que est en contacto directo con un elemento transductor (Esquema 1).ANALITO BIOSENSOR RESPUESTA

Seal Receptor Transductor

Esquema 1. Esquema de un biosensor

El reconocimiento de molculas o grupos de molculas particulares constituye un proceso fundamental en el funcionamiento de los sistemas biolgicos. La naturaleza ha desarrollado un amplio conjunto de biomolculas o estructuras biomoleculares que muestran una gran selectividad en el reconocimiento de alguna propiedad particular de una determinada molcula de entre un conjunto o una mezcla de ellas. Este fenmeno de reconocimiento selectivo de especies obviamente puede ser aprovechado con fines analticos para el diseo y preparacin de sensores de dichas especies. El transductor, en el cual se encuentra inmovilizado o retenido el material biolgico, debe permitir la conversin de la interaccin del analito con el receptor en una respuesta elctrica, que luego es amplificada o procesada y que estar relacionada con la concentracin de ese analito. Dicho transductor, por tanto, determina la eficacia en el procesado de la seal del biosensor, mientras que su selectividad viene principalmente definida por la particularidad de la interaccin del componente biolgico con el analito. Idealmente, los dispositivos de este tipo deben responder continua y reversiblemente al analito de inters sin perturbar la muestra, eliminando as la necesidad de su pretratamiento e incluso de su recogida (Pingarrn y Batanero, 1999). La clasificacin de los biosensores puede realizarse desde dos puntos de vista diferentes. Una clasificacin ms general y lgica es aquella basada en la naturaleza del proceso biolgico. Pueden distinguirse dos grandes grupos (Pingarrn y Snchez Batanero, 1999) : a) Biosensores catalticos, cuyos receptores pueden ser enzimas, tejidos o

microorganismos. b) Biosensores de afinidad, entre los que se encuentran los inmunosensores y los basados en quimiorreceptores y los que utilizan cidos nucleicos. Una segunda clasificacin, es la que se basa en el fundamento del transductor. Atendiendo a este criterio, los biosensores pueden clasificarse en :6

Introduccin

a) Electroqumicos, que, a su vez se dividen en potenciomtricos, amperomtricos y conductimtricos. b) pticos, que pueden ser espectroscpicos de absorcin, fluorimtricos o

fosforimtricos y otros. c) Trmicos. d) De masa. Por lo que respecta a los biosensores catalticos, debe decirse que sin duda alguna los ms utilizados son los biosensores enzimticos, tanto que a veces el trmino genrico de biosensores catalticos se suele aplicar a estos dispositivos. En las reacciones enzimticas la molcula transformada se denomina sustrato y usualmente implica el empleo de otro reactivo llamado cofactor, para generar los correspondientes productos. Alguna o todas las especies mencionadas pueden ser detectadas por medios fisicoqumicos proporcionando seales que convenientemente tratadas, proporcionan la informacin requerida del analito en cuestin. La reaccin cataltica enzimtica es eficiente y adems extremadamente selectiva, por lo que se combinan dos factores, de reconocimiento particular y de amplificacin, necesarios para la mayora de las aplicaciones analticas de estos sensores.

Por otro lado, puede decirse que los dispositivos electroqumicos son los ms utilizados como transductores en el desarrollo de biosensores enzimticos. Esto es debido a que, en general, poseen una serie de ventajas como son : a) Las medidas electroqumicas pueden ser realizadas en volmenes pequeos, incluso del orden de nanolitros, con relativa facilidad, lo que es debido a la naturaleza interfacial de la medida electroqumica. Esto hace que tales dispositivos sean especialmente apropiados para la monitorizacin in vivo. b) La seal obtenida, obviamente, es elctrica, y por tanto es factible la transduccin directa de la velocidad de reaccin en la seal de lectura. c) Los lmites de deteccin que se obtienen, normalmente entre 10-9 y 10-6 mol l-1, son suficientes y adecuados para la deteccin de numerosos analitos de inters. d) La relativa simplicidad y el bajo coste de la instrumentacin electroqumica permiten una fcil disponibilidad de estos dispositivos. No obstante, los sensores electroqumicos tienen tambin dos importantes

inconvenientes. Como es conocido, las tcnicas electroanalticas poseen una baja selectividad en comparacin con otras tcnicas analticas, si bien este inconveniente se minimiza drsticamente al utilizar un sistema de reconocimiento biolgico que posea una alta selectividad para ciertos analitos. Por otro lado, es necesario utilizar un electrodo de referencia

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Introduccin

que mantenga constante el potencial durante el transcurso de la medida durante un largo perodo de tiempo. Sin duda alguna, en el contexto de los biosensores electroqumicos, los ms prometedores, sobre todo en trminos de sensibilidad, son los biosensores amperomtricos, los cuales monitorizan corrientes faradaicas resultantes de intercambios electrnicos entre el sistema biolgico y un electrodo mantenido a un potencial constante apropiado. De entre los biosensores amperomtricos, los ms utilizados son los electrodos enzimticos, que al inmovilizar en las cercanas del material electrdico las enzimas, combinan las ventajas de la selectividad enzimtica con la transduccin directa de la velocidad de reaccin en una corriente elctrica.

El buen funcionamiento de un biosensor depende en gran medida, de la inmovilizacin del sistema de reconocimiento biolgico sobre el transductor. El objetivo fundamental de la inmovilizacin es permitir un ntimo contacto entre la enzima y el transductor manteniendo inalterable en lo posible la estabilidad de dicho sistema de reconocimiento biolgico. Los mtodos de inmovilizacin comprenden mtodos fsicos, fundamentalmente por adsorcin o por atrapamiento, y mtodos qumicos, ya sea mediante unin covalente o por entrecruzamiento o crosslinking. Dentro de cada uno de estos mtodos existen numerosas variantes y adems, tambin es posible utilizar combinaciones de diferentes mtodos de inmovilizacin, pero no profundizaremos en ellos, ya que solo se pretende proporcionar una visin general. En el Esquema 2 se recogen los esquemas correspondientes a los principales mtodos de inmovilizacin y sus principios.

El segundo tipo de inmovilizacin, es decir, la inclusin de la enzima en la matriz del transductor, se usa principalmente para la fabricacin de electrodos enzimticos compsitos. As, el procedimiento ms sencillo consiste en preparar una mezcla de la enzima y grafito en polvo, que es el transductor, a la que se agrega un aglutinante. Se homogeneiza la mezcla para formar una pasta de carbono modificada y se coloca en un molde con un contacto elctrico. Con este procedimiento se obtienen biosensores con un depsito tridimensional de enzima, que permite mediante un simple pulido la renovacin de la superficie del biosensor. Adems, en dicha matriz se pueden incluir otras enzimas, el mediador, etc.

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Introduccin

a) Adsorcin: +:Simple, barato, reversible. -: No muy estable Soporte

+

Enzima

+ Enzima Monmeros Red polimrica

+: Barato, -: La enzima puede desnaturalizarse

+ b) Atrapamiento Gel Enzima Atrapamiento en gel +: Mtodo muy suave, -: Poros muy grandes para las enzimas

+ Grafito Enzima

+ Aglutinante Matriz compsita

+: Mtodo muy suave, depsito tridimensional de enzima -: La enzima pierde actividad con los dias y hay que pulir

c) Acoplamiento covalente: +: Enlace muy estable - : Txico Soporte

Activacin Enzima

Soporte activado

d) Entrecruzamiento: +: Sencillo, barato -: Txico, prdida de actividad Enzima

+Glutaraldehido

Esquema 2. Esquemas de inmovilizacin de una biomolcula por adsorcin (a), por atrapamiento (b), acoplamiento covalente (c) y entrecruzamiento (d)

II.2. ELECTRODOS COMPOSITOS9

Introduccin

Un material compsito es el resultado de la mezcla de dos o ms sustancias con caractersticas diferentes entre si que, aunque conservan cada uno de ellas su naturaleza original, dan al material compsito propiedades qumicas, mecnicas y fsicas distintas de las que muestran dichas sustancias por separado. Si el material compsito est formado por una fase conductora y otra aislante, la primera clasificacin de estos materiales se puede basar en la distribucin de las partculas conductoras y aislantes en el material (Cspedes et al., 1996). Cuando un polmero aislante acta como agente aglutinante, el material compsito se puede clasificar por la naturaleza del material conductor (platino, oro, carbn, etc.) y tambin por la distribucin de sus partculas, dependiendo de que las partculas conductoras estn dispersadas en la matriz del polmero, o de que estn agrupadas en zonas claramente definidas. La clasificacin de los materiales compsitos aceptada ms comnmente atiende a la distribucin de la fase conductora en la matriz polimrica, siendo la siguiente:

ELECTRODOS COMPSITOS ORDENADO ALEATORIO

ARRAYS

CONJUNTOS

SUPERFICIE

SENO

DISPERSOS

CONSOLIDADOS

PASTA

SOLIDO

IMPREGNADO

SEGREGADO

Mezclado con monmero

Mezclado con polmero

CONDUCTOR

AISLANTE

Esquema 3. Clasificacin de los electrodos compsitos

Puesto que, por definicin, un electrodo compsito consiste en al menos una fase conductora y al menos una fase aislante entremezcladas de alguna manera, la superficie del electrodo compsito en contacto con la disolucin consiste necesariamente en regiones de conductor separadas por regiones de aislante. La primera clasificacin est basada en si la disposicin del conductor y el aislante est altamente ordenada (un array) o es aleatoria (un conjunto). Los electrodos de array pueden clasificarse posteriormente dependiendo de si el conductor est confinado en la superficie de un aislante (o de un aislante en la superficie de un10

Introduccin

conductor) o el conductor ordenado penetra en el seno del material. La mayora de los electrodos de array utilizados en electroanlisis son superficiales y pueden encontrarse algunos ejemplos en la revisin de Tallman y Petersen (Tallman and Petersen, 1990). Estos arrays tienen geometras bien definidas pero, sin embargo, sus superficies a menudo no son planas y pueden ser tambin bastante delicadas de pulir, requirindose otra forma de regeneracin superficial. Por lo que se refiere a los electrodos compsitos de conjunto, estos se pueden clasificar dependiendo de la distribucin del conductor a travs de la matriz del compsito. Los materiales en los que las partculas del conductor estn distribuidas aleatoriamente por todo el aislante se denominan compsitos dispersos. Una partcula de conductor (o un agregado de partculas) tiene una probabilidad idntica de ocupar cualquier punto en la matriz. En contraposicin, los compsitos consolidados estn formados de tal manera que el conductor se extiende a travs del compsito de un modo reticulado, aleatorio, con regiones de aislante puro y de conductor puro que no estn entremezcladas. Los compsitos dispersos pueden fabricarse en forma de pasta o bien slidos. Dentro del primer grupo pueden incluirse los electrodos de pasta de carbono, que consisten en una mezcla ntima de polvo de carbono o grafito con una cantidad apropiada de lquido orgnico viscoso no conductor o un aglutinante que sea lquido a temperaturas mayores de 45 C. Los compsitos dispersos slidos pueden prepararse de dos formas. El mtodo ms comn (mezclado con monmeros) implica la dispersin uniforme de un conductor en un monmero que es subsiguientemente polimerizado (Tallman and Petersen, 1990). Alternativamente, el conductor puede dispersarse en un polmero o una cera fundidos o disueltos (mezclado con polmeros) y permitir que la mezcla se endurezca. Los compsitos consolidados se pueden fabricar tambin de dos maneras generales. Una implica la impregnacin de, o bien un conductor poroso con un aislante, o bien de un aislante poroso con un conductor, denominndose tales materiales compsitos impregnados. En este caso la consolidacin del conductor dentro del compsito (y por tanto en la superficie del electrodo) est predeterminada por la estructura porosa del conductor o del aislante. La segunda manera de formar electrodos consolidados implica la mezcla de un conductor en polvo con un polmero en polvo y el moldeado por compresin de la mezcla. Dentro de este grupo se sitan los electrodos compsitos de grafito y tefln, que se utilizarn en nuestros trabajos experimentales. Estos materiales se llaman compsitos segregados. Los compsitos consolidados en general y los compsitos segregados en particular, presentan frecuentemente ventajas en electroanlisis en comparacin con los compsitos dispersos. Los electrodos de array y los electrodos compsitos impregnados conducen a travs de regiones bastante continuas de conductor mayoritariamente puro y homogneo. Por otra parte, los electrodos compsitos segregados y los dispersos conducen a travs de regiones bastante discontinuas, altamente heterogneas, de conductor y aislante entremezclados, un proceso11

Introduccin

descrito a menudo por modelos de percolacin (Tallman and Petersen, 1990). Para tener una conductividad adecuada para su uso en electroanlisis, un material compsito segregado o disperso debe tener una fraccin de volumen de conductor (f) algo por encima de la composicin crtica o umbral de percolacin (fc). Esta composicin crtica es significativamente menor para compsitos segregados que para compsitos dispersos. Para ambos tipos de materiales la mayor fraccin de volumen utilizable de conductor est a menudo determinada por la estabilidad mecnica requerida para el material y vara fuertemente con la naturaleza del aislante y del conductor. La superficie de un electrodo compsito puede asemejarse a un conjunto de microelectrodos. Es ese aspecto el que da lugar a las mejoras en la relacin seal/ruido para muchos electrodos compsitos cuando se les compara con sus correspondientes fases conductoras puras. Un electrodo compsito es capaz de producir una corriente mayor por unidad de rea activa que la del correspondiente macroelectrodo conductor puro, tanto en disoluciones quiescentes como bajo condiciones hidrodinmicas. Puesto que el ruido y la corriente de fondo (por unidad de rea activa) deben ser similares para ambos tipos de electrodos, el electrodo compsito presumiblemente muestra la mayor relacin seal/ruido. A medida que el recubrimiento fraccional de la superficie geomtrica del compsito por el conductor aumenta, la relacin seal/ruido tiende a disminuir, aproximndose en el lmite a la del electrodo conductor puro. Es por esta razn por la que los compsitos consolidados, que poseen buena conductividad a un bajo valor de f, que muestren presumiblemente una relacin seal/ruido superior a la de los compsitos dispersos.

Algunos ejemplos de materiales aislantes utilizados para la fabricacin de electrodos compsitos son : aceite mineral, parafina, resina epoxi, silicona, poliuretano, poliestireno, metacrilato o tefln. Estos polmeros dan al biosensor una cierta estabilidad fsica, qumica o biolgica. Los materiales de carbon son fases conductoras ideales para compsitos usados como sensores amperomtricos. Estos materiales tienen una elevada inercia qumica y muestran un amplio intervalo de potenciales de trabajo. Tambin tienen una baja resistencia elctrica y una estructura cristalina responsable de corrientes residuales bajas (Cspedes et al., 1996). Una ventaja importantsima que proporciona un electrodo compsito son los buenos lmites de deteccin asociados a las altas relaciones seal/ruido que se consiguen. La corriente residual y el ruido de un macrosensor fabricado con una fase conductora pura dependen del rea, lo que significa que una disminucin del rea proporciona una disminucin del ruido. Esto podra implicar una disminucin de la sensibilidad tambin, pero si el rea del electrodo es muy pequea, como en los microelectrodos, el permetro de la superficie tiene un significado ms importante en el transporte de masa que en el rea. Ya que se establece una difusin no lineal, se genera una corriente en estado estacionario que aumenta la relacin seal/ruido y, por12

Introduccin

tanto, permite una mejor sensibilidad (Pieiro-Avila et al., 1998). Los electrodos compsitos pueden visualizarse como macroelectrodos formados por arrays o agrupaciones de microelectrodos. Estos microelectrodos estn formados por una fase no conductora, y conectados en paralelo, y la seal producida sera la suma de las corrientes individuales generadas por cada microelectrodo. El resultado es un sensor con una seal tan fuerte como un macroelectrodo, pero que presenta una seal/ruido de un microelectrodo, lo que conlleva una mejor respuesta electroqumica, lmites de deteccin bajos y tiempos de respuesta rpidos. Por otro lado, los electrodos compsitos pueden fabricarse con gran flexibilidad en cuanto al tamao y forma del material, permitiendo una fcil adaptacin a una gran variedad de configuraciones electrdicas. Finalmente, uno de los aspectos ms importantes de los electrodos compsitos es su versatilidad, ya que permiten incorporar especies que mejoren la selectividad y/o sensibilidad en el propio material electrdico, bien mediante modificacin qumica del conductor y/o aislante antes de la fabricacin del compsito, o bien mediante la incorporacin fsica de un modificador (qumico o bioqumico) dentro de la propia matriz del compsito. A diferencia de los electrodos modificados superficialmente, estos electrodos compsitos modificados pueden ser regenerados en su superficie sin prdida de modificador.

Muchas de las primeras aplicaciones de los electrodos compsitos se hicieron en voltamperometra de redisolucin andica. Anderson y Tallman (Anderson and Tallman, 1976) describieron un electrodo de pelcula fina de mercurio sobre un compsito de grafito/epoxi. Por otro lado, se describieron varias aplicaciones de electrodos compsitos en cromatografa lquida, Fenn y col. (Fenn et al., 1978) estudiaron la aplicacin de un electrodo de cera/grafito a la determinacin de catecolaminas en extractos de cerebro de ratn y en extracto de plasma. Armentrout y col. (Armentrout et al., 1979) emplearon un electrodo de polietileno/negro de carbono para la determinacin de compuestos fenlicos en agua de drenaje superficial. Ms recientemente, la investigacin con materiales compsitos ha encontrado una aplicacin importantsima en la fabricacin de bateras de litio recargables (Hjelm et al., 2001 ; Rom et al. 2001) y hay tambin trabajos publicados que emplean como fase aislante/aglutinante, polmeros impresos molecularmente (MIP) (Andrea et al., 2001). Existen tambin trabajos que, en lugar de utilizar nuevos materiales aislantes, desarrollan materiales compsitos electrdicos ensayando diferentes fases conductoras. Tal es el caso de matrices desarrolladas a partir de pasta de carbono vitrificado (Wang et al., 2001), o de mezclas de metales como niquel (Khoroshilov et al. 2000) o cobre (Khoroshilov et al. 2000b) con poliestireno. II.2.1. MATRICES ELECTRDICAS DE GRAFITO-TEFLN Como ya se ha comentado, los electrodos de grafito-Tefln pueden considerarse como materiales compsitos segregados que se construyen mezclando cantidades conocidas de ambos componentes en polvo, para posteriormente prensar mecnicamente la mezcla13

Introduccin

homogeneizada en forma de pastillas con las dimensiones requeridas. Normalmente, en un material compsito segregado, el dimetro medio de las partculas conductoras es pequeo en relacin con las dimensiones de las partculas de polmero. Despus del proceso de mezcla y de homogeneizacin las partculas conductoras ocupan los intersticios entre las partculas de polmero ms grandes. En estos electrodos compsitos de grafito y Tefln la fase conductora utilizada presenta, obviamente, una buena estabilidad electroqumica y tiene una alta disponibilidad y un bajo coste. Por lo que respecta a la fase aislante, las propiedades fsico-qumicas del material resultante dependen fundamentalmente del polmero escogido, principalmente por lo que se refiere a la resistencia mecnica, carcter hidrofbico y resistencia al hinchamiento en disolventes no acuosos. Este ltimo aspecto es especialmente interesante desde un punto de vista prctico, dado que la afinidad de la matriz polimrica por los disolventes orgnicos es la causa de la inestabilidad dimensional de algunos electrodos en medios no acuosos. El hinchamiento de la fase aislante origina un crecimiento de la superficie del electrodo y, por tanto, una mayor corriente de carga. Los electrodos compsitos basados en tefln, Kel-F, polietileno y polipropileno presentan una buena resistencia a algunos disolventes orgnicos Park y Shaw B.R., 1994). Sin embargo, por otra parte, los materiales compsitos de grafitopolietileno y grafito-polipropileno poseen escasa dureza, por lo que resultan difciles de manejar y pulir. Por consiguiente, entre los materiales aislantes mencionados anteriormente, el Tefln constituye una de las matrices polimricas ms atractivas para su utilizacin en medios no acuosos, puesto que es prcticamente inerte al hinchamiento y presenta buenas propiedades mecnicas.

En la Tabla I se recogen algunos antecedentes bibliogrficos en los que se emplean electrodos de grafito-Tefln con fines analticos. En 1975, Klatt y colaboradores (Klatt et al., 1975) evaluaron el comportamiento voltamperomtrico, mediante voltamperometra cclica, de electrodos de grafito y tefln de diferente composicin, comparando la resistencia mecnica de las pastillas, la conductividad del electrodo y la forma de los voltamperogramas obtenidos con ferrocianuro. Estos autores examinaron, asimismo, la reproducibilidad de la superficie electrdica y la reproducibilidad entre diferentes electrodos, concluyendo que presentan excelentes caractersticas para su empleo en estudios electroqumicos. Adems, demostraron su estabilidad fsica en medios hidroalcohlicos y fuertemente cidos.Tabla I. Electrodos compsitos basados en matrices de grafito-Tefln Composicin matriz Grafito-PTFE Tipo de deteccin Amperomtrica Modo de medida Discontinuo Analito Ferro/ferricianuro Referencia Klatt et al., 1975

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Introduccin

Grafito-PTFE

Amperomtrica

HPLC

Grafito-PTFE

Voltamperomtrica

Discontinuo

Grafito-PTFE

Amperomtrica

FIA

Grafito-PTFE

Amperomtrica

HPLC Discontinuo en acetonitrilo Discontinuo Discontinuo y flujo Discontinuo

Grafito-PTFEVoltamperometra Buckminsterfullereno cclica (C-60) Grafito-PTFE + Hg, Co Voltamperometra Cu electrodepositados cclica Comparacin pasta de Voltamperom.cclica C con Grafito-PTFE y amperometra Grafito-PTFE Potenciometra

Shah y Honingberg, 1983 Herbicidas thiram y Fernndez disulfiram et al., 1995a Herbicidas thiram y Fernndez disulfiram et al., 1995b Herbicidas thiram y Fernndez disulfiram et al., 1996 Perclorato de tetra-nKutner, butilamonio 1996 Evaluacin del recubrimiento Antioxidantes Tensioactivos catinicos Metionina Xu et al., 1997 Diego et al., 1998 Matesicpuac et al., 2000 Pedrero et al., 2001

Compuestos fenlicos

Grafito-PTFE y grafitoEPD modificados con Ru y RuO2

Amperometra

FIA

PTFE= Politetrafluoroetileno (Tefln) EPD= Etilenpropilendieno

Por otra parte, Shah y Honigberg (Shah y Honingberg, 1983) evaluaron el comportamiento de un electrodo de grafito-Tefln como detector en HPLC, demostrando su utilidad para la deteccin electroqumica de distintos compuestos fenlicos y discutiendo un aspecto prctico tan importante como es la pasivacin de la superficie del electrodo por dichos compuestos. Sin embargo, desde 1983 hasta los estudios realizados por nuestro Grupo de Investigacin (Fernndez et al., 1995a) en 1995, slo se public un trabajo ms con este tipo de matriz electrdica compsita.

II.2.2. MATRICES ELECTRDICAS DE CARBONO VTREO RETICULADO El carbono vtreo reticulado (RVC) es una forma relativamente impermeable del carbono, muy parecida al carbono vitrificado, que est formada por una estructura rgida tridimensional en forma de panal de abeja. Las principales ventajas de este material en el campo de la electroqumica son (Heineman y Kissinger, 1980) : superficie microscpica muy15

Introduccin

pequea comparada con la del grafito poroso convencional, matriz rgida, bajo precio comparado con el carbono vitrificado, fcilmente manejable, disponibilidad comercial de diferentes tamaos de retcula, y combinacin de las propiedades electroqumicas del carbono vitrificado no poroso con sus ventajas hidrodinmicas y estructurales. Todas estas caractersticas del RVC permiten pensar que este material debe suponer una alternativa muy interesante al carbono convencional para la construccin de matrices compsitas. Gracias a su estructura tridimensional, se consigue tener una interconexin de la fase conductora a lo largo de la matriz, que raramente se podra obtener con carbono convencional, con el que se necesitara mucha ms cantidad para que al mezclarlo con la fase aislante, existiera contacto. Esto supone que haya menos fase conductora por unidad de rea y, por tanto, una mayor relacin seal :ruido que se traducir en menores lmites de deteccin.

Las posibilidades de aplicacin del RVC en Qumica Analtica son muchas, habindose acoplado a equipos de ICP para preconcentrar electroqumicamente (Snook, 1985) o como electrodo pticamente transparente (Norvell y Mamantov, 1977 ; Sorrels y Dewald, 1990) como ejemplos diferentes de las aplicaciones propiamente electroanalticas.

Por lo que se refiere a las apliaciones electroqumicas, se ha aprovechado su gran rea superficial para electrosntesis (Szanto et al., 1998), y culombimetras (Torabi et al., 1999). Recientemente, se ha utilizado para la eliminacin de metales del agua (Lanza y Bertazzoli, 1999 ; Fisk y Boyle, 2000 ; Carreno et al., 1999) Tambin se ha empleado como electrodo para tcnicas voltamperomtricas de redisolucin (Armalis et al., 1999 ; Armalis y Kubiliene, 2001) y para la deposicin de pelculas de Hg (Blaedel y Wang, 1979 ; Berrettoni et al., 1986) y de otros metales l (Czerwinski et al. 1999 ; Dado et al., 1999). Adems, se ha modificado con polmeros como el polipirrol (Rodriguez et al., 2000). Aprovechando su estructura porosa, se ha empleado en multitud de aplicaciones en sistemas de flujo utilizando el RVC vaco para que la disolucin portadora pase a su travs (Widner ET AL., 1998 ; Zhu Y Curran, 1991), o como reactor, bien para eliminar interferencias (Yao et al., 1983) o con enzimas inmovilizadas acoplado a detectores trmicos (Xien et al., 1993). Tambin se ha llegado a emplear como fase estacionaria en cromatografa aprovechando su porosidad (Wang y Dewald, 1984) o utilizando partculas de RVC como relleno de columnas (Ge y Wallace, 1989 ; Ge y Wallace 1990). Finalmente mencionar que se ha empleado como electrodo compsito para la determinacin de analitos por diferentes tcnicas electroanalticas. En la Tabla II se recogen los artculos de electrodos compsitos de RVC encontrados en la Bibliografa.Tabla II. Electrodos compsitos basados en matrices de RVC Composicin matriz Tipo de deteccin Modo de medida Analito Referencia

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Introduccin

RVC-Resina epoxi RVC-Resina epoxi RVC-Resina epoxi

Voltamperometra cclica Voltamperometra de onda cuadrada Amperometra

Discontinuo Discontinuo HPLC

Ferrocianuro Ferroceno Epinefrina, dopamina, acetaminofeno y ferrocianuro potsico Respuesta de PANI en carbonato de propileno

Sleszynski, 1984 ODea, 1985 Wang y Freiha, 1984 Tsutsumi et al., 1997

RVC-Polianilina-acido p-estirenosulfnico

Amperometra

Discontinuo

Para desarrollar la matriz compsita de RVC que se utiliza en esta Memoria fue necesario escoger una fase aislante que se pudiera introducir sin problemas en la estructura tridimensional del carbono, y que proporcionara al electrodo la rigidez suficiente para que la disolucin de trabajo no se introdujera en la matriz electrdica. Se eligi una resina epoxi, que pertenece a una familia de polmeros ampliamente utilizados por sus excelentes propiedades qumicas, su buena adhesin a otros materiales, y sus caractersticas aislantes. Adems son muy fciles de preparar, baratos y se dispone de ellos comercialmente (Dekker M. 2 Ed.). En la tabla II de electrodos compsitos de RVC se recogen algunas publicaciones en las que se utilizan electrodos de RVC-Resina Epoxi.

II.3. BIOSENSORES ELECTROQUMICOS COMPSITOS El empleo de matrices electrdicas compsitas puede considerarse como una eficiente estrategia para disear biosensores electroqumicos robustos, siendo la versatilidad que ofrecen probablemente una de sus ms importantes caractersticas. As, es posible incorporar en el seno de la matriz electrdica diferentes especies, tales como biomolculas, cofactores, mediadores, capaces de mejorar la selectividad y/o sensibilidad. De esta forma, es posible17

Introduccin

fabricar depsitos tridimensionales de biocomponentes cuya superficie puede regenerarse muy fcilmente mediante un procedimiento tan simple como es un suave pulido. Adems, pueden esperarse rpidas respuestas hacia los correspondientes sustratos implicados debido a la ausencia de barreras difusivas en forma de membranas sobre la superficie del electrodo, as como a la cercana de las biomolculas (y de otros componentes) al material electrdico. Si bien el grupo utilizado ms ampliamente como bioelectrodos compsitos es sin duda alguna el de los electrodos de pasta de carbono (Byfield et al., 1994 ; Gorton, 1995 ; Kalcher, 1995), varios inconvenientes asociados con su falta de estabilidad prolongada, principalmente en condiciones en flujo, as como de capacidad de mecanizacin y compatibilidad con medios no acuosos, han conducido al empleo de matrices compsitas rgidas como las que se han utilizado en esta Memoria.

El primer trabajo de un biosensor enzimtico de pasta de carbono data de 1988 (Matuszewski y Trojanowicz, 1988), y en el se inclua la enzima glucosa oxidasa directamente en una fase orgnica constituida por un polvo de grafito y un aceite de silicona. Desde entonces, se han utilizado multitud de aglutinantes : aceite de parafina (Hale et al. 1990), aceite mineral (Wang, 1991), aceite de fenilmetilsilicona (Gorton et al., 1992), Nujol (Pandey et al., 1992), etc.

En la Tabla III se recogen algunos trabajos sobre biosensores basados en electrodos compsitos de pasta de carbono publicados en los ltimos aos.

Tal y como refleja la Tabla, dada la escasa estabilidad de este tipo de electrodos en otros medios, la mayora de los trabajos publicados basados en electrodos de pasta de carbono se llevan a cabo en medios acuosos en los que, por otra parte, hay que destacar los cortos tiempos de vida operacional. Adems de los inconvenientes mencionados, se ha recogido en varios artculos que la fabricacin de la pasta de carbono puede afectar enormemente las propiedades finales del electrodo (Gorton, 1995) y, teniendo en cuenta que la mayora de las pastas se fabrican a mano con un mortero, es adems bastante difcil reproducir el proceso de fabricacin.Tabla III. Biosensores electroqumicos compsitos de pasta de carbono

Enzima / Sustrato HRP / H2O2 y perxido de 2-butanona Peroxidasa (batata) / 18

Inmovilizacin Atrapamiento fsico

Deteccin / Composicin electrodo Amperomtrica PC modificada con lactilol Amperomtrica PC (grafito y parafina)

Medio y modo de medida Mezclas acetonitriloagua

Mediador, Tiempo de Eap vida -----

Muestra ---

Referencias Popescu et al. 1996

Atrapamiento fsico

Mezcla metanol E= -0.22V / tampn fosfato (vs

---

Cosmticos

Vieira et al., 2000

Introduccin

Hidroquinona Polifenol oxidasa / Flavanoles

con batata Amperomtrica Tejidos de plantas inclui- PC con platano, patata y manzana dos en la pasta. Atrapamiento fsico Atrapamiento Amperomtrica fsico PC con estabi-lizador operacional : fenilendiamina Acuoso Discontinuo

Ag/AgCl) -----

(crema) Cerveza Eggins et al. 1997

LOD, HRP / Lactato y H2O2

Acuoso FIA

D-FDH / Fructosa

Atrapamiento fsico

Amperomtrica PC modificado con polmero de Os Amperomtrica PC obtenida con hidrocarburos de cadena corta como aglutinantes lquidos Amperomtrica Dos electrodos de PC. Cada uno con una de las enzimas Amperomtrica PC con mediador de Os y NAD+ y cubierta con hidrogeles formados in situ. Amperomtrica PC con NADP y azul de toluidina O polimerizado. Pruebas con tricloruro de hexaminarutenio Voltamperomtrica PC con la raz productora de la enzima Amperomtrica PC con las enzimas

Acuoso Discontinuo FIA Acuoso FIA

Os +0.1V (vs Ag/AgCl) ---

Mejor estabilidad operacional con fenilendia mina ---

Spohn, et al. 1997

Alimentos

Paredes et al., 1997

Tirosinasa / Fenoles

Atrapamiento fsico

---

Agua de ro

Wang et al., 1997

PyrOD, AOD / Monosacridos y etanol Ph-A, Ph-Glu, GPDH / Fosfatos inorgnicos GluDH / L-glutamato

Atrapamiento fsico

Acuoso Cromatografa lquida Acuoso Discontinuo

-50 mV vs Ag/AgCl

Atrapamiento fsico

Os

16 horas de monitorizacin ---

Procesos de fermentacin ---

Liden et al., 1998

Fernndez et al., 1998

Atrapamiento fsico

Acuoso FIA

Polmero de azul de toluidina O

---

---

Pasco et al., 1999

Polifenol oxidasa / Epinefrina, dopamina HBH, Lacasa / NADPH

Atrapamiento fsico de raz de Dioscorea bulbifera Atrapamiento fsico

Acuoso Discontinuo

E= -0.14 V

Disolucin reguladora de fosfato pH 6.2 Acuoso y con tensoactivos. Discontinuo y flujo

E= - 50 mV vs Ag/AgCl ---

Mejor estabilidad que con enzima pura 7 horas

Productos farmacuticos

Caruso et al., 1999

Colinesterasa / Pesticidas

Inmovilizacin en membranas reemplazables

Adsorcin del pesticida a la membrana segn hidrofobicidades y medida con electrodo de PC y pH

---

Medidas Huang et al., 1999 de GPDH en sangre --Budnikiv et al., 1999

Tabla III. Biosensores electroqumicos compsitos de pasta de carbono (Continuacin)Enzima / Sustrato PyrOD(LP), PyrOD(PS), HRP / Piruvato Inmovilizacin Atrapamiento fsico Deteccin / Composicin electrodo Amperomtrica PC orgnica mo-dificada con tri-halosa o lactilol solos o con poli-Laminocidos catinicos. Con la PyrOD(PS) hay que Medio y modo de medida Acuoso FIA Mediador, Tiempo de Eap vida E= 0.0 V Estabilidad operaciona vs l aumenta Ag/AgCl coinmovilizando poliL-arginina y cubrienMuestra Medios de cultivo de clulas de mamferos Referencias Bergmann et al., 1999

19

Introduccin

incluir piro-fosfato de tiamina y Mg (II)

ADH / Etanol

Atrapamiento fsico Atrapamiento fsico

Tirosinasa / Fenoles

Amperomtrica PC modificada con un complejo de Re Amperomtrica PC con la enzima

Acuoso Discontinuo HPLC

do el electrodo con membrana de dialisis E= 0.0 V 8 das vs SCE almacenado a 4 C Tyr-CPE : Disminucin de E=-0.20V seal en CPE : 10 inyecE=+1.0 ciones : +1.2 V CPE : 65% Tyr-CPE : 5%

---

Tobalina et al., 1999 Rogers et al., 1999

Muestras acuosas de suelo contamin adas y extracto orgnico de suelo y fangos

PC : Pasta de carbono HRP : Peroxidasa LOD : Lactato oxidasa FIA : Anlisis por inyeccin en flujo D-FDH : D-Fructosa deshidrogenasa PyrOD : Piranosa oxidasa AOD : Alcohol oxidasa Ph-A : Fosforilasa A Ph-Glu : Fosfoglucomutasa GPDH : Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa

GluDH : Glutamato deshidrogenasa HBH : p-hidroxibenzoato hidroxilasa NADPH : cido de nicotinamida adenin dinucletido fosfrico PyrOD(LP) : Piruvato oxidasa de Lactobacillus plantarum PyrOD(PS) : Piruvato oxidasa de Pediococcus sp. NAD+ : Nicotinamida adenin dinucletico SCE : Electrodo de calomelanos saturado CPE : Electrodo de pasta de carbono

Ya hemos visto anteriormente que, dentro de los distintos materiales rgidos compsitos utilizados para la fabricacin de biosensores, la utilizacin de resina epoxi como material aglutinante proporciona caractersticas mecnicas y fsicas muy atractivas para la fabricacin de biosensores. En la Tabla IV, se resumen diversas publicaciones sobre biosensores enzimticos compsitos fabricados con resina epoxi.

Los trabajos sobre biosensores fabricados con resina epoxi son menos abundantes que los que utilizan pasta de carbono, pero dentro de ellos hay bastantes en los que se emplean medios orgnicos. Tal y como se observa en la Tabla IV, los tiempos de vida operacionales con biosensores compsitos de este tipo son ms largos que para los electrodos de pasta de carbono (ya se empieza a hablar de meses) aunque sea necesario pulir a menudo. En cuanto a las enzimas y aplicaciones con los que se suelen utilizar este tipo de matrices, difiere en poco del resto de matrices compsitas.

Tabla IV. Biosensores electroqumicos compsitos fabricados con resina epoxiEnzima / Sustrato AOD / Etanol Inmovilizacin Deteccin / Composicin electrodo Amperomtrica Grafito en polvo, resina epoxi y la enzima AOD Medio y modo de medida Acuoso (Fosfato 0.1 M y KCl 0.1 M, pH 7.0) Discontinuo Mediador, Eap E=1.1 V vs Ag/AgCl Tiempo de vida Enzima estable en la matriz biocompsita tres meses Muestras Referencias

Atrapamiento fsico

---

Morales et al., 1998

20

Introduccin

AChE BChE / Pesticidas organofosfo rados y car bamatos GOD / Glucosa

Partculas de slice aminado

GOD / Glucosa

Atrapamiento en membrana de polmero de poliuretano acrilado fotocurable Atrapamiento fsico

Amperomtrica Grafito en polvo, resina epoxi, TCNQ y las partculas con la enzima empleada en cada caso Amperomtrica Grafito con epoxi y membrana adherida a la superficie

Acuoso (Fosfato 0.1 M y KCl 0.1 M, pH 7.0) Discontinuo

TCNQ E=0.3 V vs Ag/AgCl

Uso prolongado si se pule de vez en cuando

---

Martorell, et al., 1997

Acuoso Discontinuo

---

1 mes Membrana estable hasta tres meses ---

---

Puig et al., 2001

Tirosinasa / Fenol y catecol

Atrapamiento fsico

BOX, HRP /Bilirrubina

Atrapamiento fsico

HRP / H2O2

Atrapamiento fsico Atrapamiento fsico

HRP / Perxido de lauroilo

HRP / Perxidos orgnicos

Atrapamiento fsico

HRP / H2O2

Atrapamiento fsico Atrapamiento fsico

ADH / Alcoholes

------Galan et al., Amperomtrica 1998 Grafito+resina La mezcla se emplea para imprimirla sobre fibra de vidrio E=-0.1 V vs ----Mareike et Acuoso Voltamperometra Ag/AgCl al., 1996 (Fosfato 0.1 M, cclica y pH 6.0) y amperomtrica acetonitrilo/fosGrafito+resina fato y metanol / epoxi. Prueban fosfato modificaciones con FIA metales Fe(CN)62--Wang y Acuoso Pulido Amperomtrica Ossoz, et al., (Fosfato 0.05 necesario Mezcla de E=-0.2 V vs 1990 M, pH 7.4+ tras cada grafito+resina Ag/AgCl ferrocianuro) medida comercial E=-0.025 V ----Santandreu Acuoso Amperomtrica vs Ag/AgCl et al., 1997 (Fosfato 0.05 Mezcla comercial M, pH 7.4) grafito+resina Voltamperometra Acetona, aceto Ferroceno ----Ramrez, et cclica al., 2001 nitrilo, etanol, Grafito-epoxi y cloroformo y comparan con tetrahidrosilicona, poliester y furano poliuretano --Aguas de Wang et al., o-fenilenAcuoso Amperomtrica bebida 1991 diamina (Fosfato 0.05 Grafito y resina E= -0.2 V M, pH 7.4) y epoxi vs Ag/AgCl mezclas ace(Comparacin con tonitrilo/ agua pasta de carbono) --5 meses de Bebidas Zulfikar et al., Acuoso Potenciomtrica y suero 1995 uso (Fosfato 0.05 Grafito y resina intermitente M, pH 7.0) FIA epoxi --Wang et al., E=+0.1 V vs Pulido diario Amperomtrica Acuoso 1992 Ag/AgCl Cada Mezcla de grafito+ (Fosfato 0.05 paulatina resina epoxi+NAD+ M, pH 7.4)

AOD : Alcohol oxidasa AChE : Acetilcolinesterasa BCE : Butirilcolinesterasa TCNQ : 7,7,8,8,-tetracianoquinodimetano

GOD : Glucosa oxidasa BOX : Bilirrubina oxidasa HRP : Peroxidasa ADH : Alcohol deshidrogenasa

En cada una de las introducciones de los captulos de esta Memoria, se recogen ms referencias de biosensores compsitos fabricados con distintas matrices electrdicas, que demuestran la aplicabilidad de los materiales compsitos en el diseo y construccin de biosensores.

21

Introduccin

III.4.

BIOSENSORES

ENZIMTICOS

EN

MEDIOS

ORGNICOS

Y

EN

MEDIOS

ORGANIZADOS Es un hecho bien conocido que la utilizacin analtica de las reacciones enzimticas ha estado hasta hace poco tiempo restringida a los medios acuosos. Sin embargo, a partir de los trabajos de Hall y col (Hall et al. 1988a ; Hall et al. 1988b) ha quedado claro que es posible desarrollar biosensores enzimticos en fase orgnica con prestaciones que incluso pueden mejorar las conseguidas en medio acuoso, tales como la posibilidad de monitorizacin de analitos en muestras hasta ese momento inaccesibles, sin necesidad de un exhaustivo tratamiento de muestra. Los disolventes orgnicos pueden producir grandes cambios en la actividad y especificidad de las enzimas, dado que estas propiedades dependen de diferentes interacciones no covalentes, como enlaces de hidrgeno, inicos o interacciones de Van der Waals. Es obvio que los disolventes orgnicos pueden perturbar estas interacciones y con ello producir cambios cinticos y termodinmicos en el comportamiento de las enzimas. Es por ello, por lo que muchos de los trabajos de investigacin llevados a cabo en este campo se han dedicado a estudiar el efecto del disolvente empleado sobre la eficiencia de la reaccin cataltica, as como sobre la estabilidad y especificidad de los biosensores desarrollados. Con objeto de correlacionar la actividad cataltica en diferentes disolventes, Laane, Boeren y Vos (Laane, et al., 1987) propusieron la utilizacin del parmetro log P, donde P es el coeficiente de reparto del disolvente en el sistema de dos fases octanol-agua. A medida que log P aumenta la hidrofobicidad del disolvente orgnico tambin aumenta. Se ha establecido que, en general, los disolventes con mayor hidrofobicidad permiten una mayor actividad enzimtica y una mejor termoestabilidad y estabilidad operacional que los disolventes menos hidrofbicos. As mismo, se ha establecido que es necesaria la presencia de una capa de agua que rodee la enzima para que pueda existir actividad cataltica. Esta cantidad de agua esencial se precisa para mantener la hidratacin que proporcione la flexibilidad y polaridad necesarias al microambiente que rodea la parte activa de la enzima. Se ha sugerido (Saini et al., 1991) que disolventes con log P medio acuoso disoluciones micelares > emulsiones aceite/agua. III.5.4.2. REPETIBILIDAD DE LAS MEDIDAS REGENERANDO LA SUPERFICIE

ELECTRDICA POR PULIDO. Como ya se ha comentado, una de las ventajas ms interesantes desde el punto de vista prctico que poseen los electrodos compsitos enzimticos es la posibilidad de obtener una nueva superficie electrdica y, por tanto, un nuevo biosensor por simple pulido de dicha superficie. Por ello, uno de los estudios que se deben realizar en la caracterizacin de este tipo de biosensores es la repetibilidad de las medidas amperomtricas despus de haber regenerado la superficie del electrodo. En este estudio se realizaron 3 medidas sucesivas de H2O2 5.0x10-5 mol l-1 despus de cada pulido. En la Tabla 4 se recogen los valores medios de intensidad obtenidos tras realizar cada uno de los pulidos. La repetibilidad de las seales amperomtricas cuando se regenera la superficie puede considerarse como un indicador de la uniformidad de la distribucin de la enzima en el seno de la matriz electrdica. A la vista de los valores de RSD obtenidos en cada uno de los medios estudiados, puede decirse que los electrodos de grafito-Tefln-HRP permiten una buena repetibilidad de las medidas amperomtricas tras ser sometidas al procedimiento de regeneracin de la superficie electrdica por pulido. Este comportamiento indica, por tanto, que la peroxidasa y el mediador estn uniformemente repartidos en todo el volumen de la matriz del biosensor.Tabla 4. Repetibilidad de las seales amperomtricas obtenidas con los electrodos compsitos enzimticos tras pulidos sucesivos de la superficie electrdica. [H2O2] = 5.0x10-5 mol l-1 ; Eap= 0.00 V. Medio acuoso : disolucin reguladora de fosfato 0.05 mol l-1, pH 7.4 ; disoluciones micelares : 0.1 % Triton X-100 en disolucin reguladora de fosfato 0.05 mol l-1 (pH 7.4) ; emulsiones aceite/agua : 2% AcOEt y 0.1 % Triton X-100 en disolucin reguladora de fosfato 0.05 mol l-1 (pH 7.4) ; medio acetonitrilo/agua : 90% CH3CN :10 % disolucin reguladora Tris 0.02 mol l-1 (pH 7.4) y micelas inversas : 4 % disolucin reguladora de fosfato 0.05 mol l-1 (pH 7.4) y AOT 0.1 mol l-1 en acetato de etilo (Eap= +0.10 V). Medidas Disolucin reguladora de fosfato Disolucin micelar Emulsiones aceite/agua Medio CH3CN/H2O Micelas inversas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.62 0.66

0.56 0.61 0.64 0.58 0.56 0.55 0.63 0.59 0.65 0.55

0.53 0.62 0.53 0.50 0.53 0.56 0.53 0.60 0.52 0.56

1.66 1.65 1.64 1.60 1.67 1.59 1.62 1.59 1.60 1.62

2.08 2.08 2.32 2.20 2.20 2.08 2.16 2.24 2.12 1.80

0.630.76 0.74 0.71 0.62 0.58 0.65 0.60

74

Electrodos de peroxidasa

i, A RSD, %

0.66 0.04 9.1

0.59 0.03 6.8

0.55 0.03 7.3

1.62 0.02 2.0

2.2 0.1 6.6

III.5.4.3. TIEMPO DE UTILIZACIN DEL ELECTRODO ENZIMTICO Desde el punto de vista de la utilizacin de los biosensores, estos pueden diferenciarse entre biosensores desechables o de un solo uso, y biosensores reutilizables, los cuales se desarrollan para llevar a cabo varias medidas con el mismo dispositivo. Los electrodos compsitos enzimticos pertenecen obviamente a este segundo grupo. Por ello, es importante saber cunto tiempo puede funcionar el biosensor proporcionando seales reproducibles, dado que un mayor tiempo de vida til permitir un ahorro de tiempo y de costes. Para establecer el tiempo de vida til del biosensor, se construy un grfico de control en el que se representaron los valores medios de tres medidas, efectuadas diariamente, correspondientes a disoluciones diferentes de perxido de hidrgeno 5.0x10-5 mol l-1. Una vez realizadas las medidas de control, el mismo electrodo se utiliz para los experimentos necesarios durante la jornada de trabajo y, al final de la misma, se almacen en seco a 4 C. Para determinar el valor central, y los lmites superior e inferior del grfico de control se tom como periodo base las medidas de las seales amperomtricas obtenidas en el estudio de repetibilidad sin regeneracin de la superficie electrdica. As, en el caso de las disoluciones acuosas de regulador fosfato, el valor central considerado es el valor medio del perodo base correspondiente (0.66 A, Tabla 3), y los lmites superior e inferior son x+3s (0.84 A) y x-3s (0.48 A) respectivamente. Cuando un valor medio de tres medidas realizadas en un mismo da est por debajo del lmite de control inferior, se procede al pulido de la superficie electrdica, recuperndose entonces la seal dentro de los lmites de control. En la figura 16 se muestran los resultados obtenidos durante un periodo de tiempo de 70 das.

1.0

i, A0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 20 40 Tiempo, das 60 80

75

Electrodos de peroxidasa

Figura 16. Grfico de control para la dependencia de la corriente en estado estacionario con el tiempo de un electrodo compsito de grafito-Tefln-HRP-ferroceno. Los puntos que se muestran son la media de tres medidas de H2O2 5.0x10-5 mol l-1 en regulador fosfato 0.05 mol l-1 de pH 7.4. Eap= 0.00 V. ( ) Sin pulir, ( ) despus de pulir.

Como puede observarse, la seal amperomtrica permanece prcticamente constante entre 3 y 5 das sin necesidad de regeneracin de la superficie electrdica. Tambin se aprecia como un perodo de almacenamiento del biosensor de 10 das no produce ninguna disminucin de su capacidad de respuesta, lo que indica que la actividad enzimtica no se ve afectada por dicho perodo de almacenamiento. Sin embargo, a partir de aproximadamente 60 das se

observa una disminucin progresiva de la respuesta que no pudo recuperarse por pulido de la superficie del electrodo. Este hecho puede atribuirse a dos causas. Una es que el pulido repetido del electrodo haga que el grosor de la pastilla llegue a ser demasiado fino; otra razn puede ser el cambio de temperatura que sufre diariamente el biosensor al pasar de la temperatura de almacenamiento (4 C) a la temperatura de trabajo y viceversa, lo que puede dar lugar a una prdida de la actividad enzimtica. Esta ltima causa parece ser la ms probable, ya que en el estudio de repetibilidad de las medidas tras regenerar la superficie del electrodo, el nmero de pulidos que se realiz sin prdida de seal analtica fue de diez, mientras que, como puede apreciarse en la Figura 15, tan solo se realizaron 7 pulidos tras ms de 60 das de trabajo. Este perodo de vida til del biosensor de aproximadamente 60 das es, como caba esperar, idntico al que se observa en los dems medios predominantemente acuosos.

Por lo que se refiere al electrodo de grafito-Tefln-HRP-ferrocianuro, utilizado en las micelas inversas, un estudio similar al comentado anteriormente permiti construir el grfico de control que se muestra en la Figura 17. Ahora, el valor central corresponde al valor medio del perodo base (2.25 A), y los lmites superior e inferior se toman de nuevo como x+3s y x-3s, respectivamente.

76

Electrodos de peroxidasa

4.0

i, A3.0

2.0

1.0

0.0 0 10 20 30 40

Tiempo, das

Figura 17. Grfico de control para la dependencia de la corriente en estado estacionario con el tiempo de un electrodo compsito de grafito-Tefln-HRP-ferrocianuro. Los puntos que se muestran son la media de tres medidas realizadas para H2O2 5.0x10-5 mol l-1 en micelas inversas formadas por un 4% de disolucin reguladora de fosfato 0.05 mol l-1 (pH 7.4) y 0.1 mol l-1 de AOT en acetato de etilo. Eap= + 0.1V. ( ) Sin pulir, ( ) despus de pulir.

Puede observarse como en este caso un mismo electrodo puede utilizarse regularmente durante aproximadamente 1 mes, debiendo regenerarse la superficie por pulido en ese perodo de tiempo 5 6 veces. El hecho de que el electrodo de grafito-Tefln-HRP-ferrocianuro presente un menor tiempo de vida til que el biosensor en medio acuoso, parece indicar que el medio de trabajo afecta en mayor medida ahora a la estabilidad de la enzima.

III.5.4.4. REPRODUCIBILIDAD EN LA FABRICACIN DE LOS ELECTRODOS Cuando la seal amperomtrica no puede recuperarse por pulido, es necesario sustituir el electrodo por uno nuevo. Por lo tanto, la reproducibilidad de las seales analticas obtenidas con diferentes electrodos, fabricados tanto a partir de la misma pastilla madre como a partir de diferentes pastillas, es un aspecto esencial a evaluar con objeto de asegurar la utilidad prctica de los biosensores desarrollados. En la Tabla 5 se muestran los valores de las medidas amperomtricas realizadas para una concentracin de H2O2 5.0x10-5 mol l-1 con diferentes electrodos, algunos de ellos construidos a partir de la misma pastilla y otros preparados a partir de pastillas distintas. En todos los casos se realizaron tres medidas en diferentes disoluciones con cada uno de los electrodos y los intervalos de confianza se han calculado a un nivel de significacin de 0.05Tabla 5. Reproducibilidad de las medidas obtenidas con diferentes electrodos compsitos de grafitoTefln-HRP-ferroceno (medio acuoso) y grafito-Tefln-HRP-Ferrocianuro (micelas inversas) fabricados a partir de la misma pastilla y de pastillas diferentes. Se llevaron a acabo tres medidas de la corriente en estado estacionario de H2O2 5.0x10-5 mol l-1 en disolucin reguladora de fosfato 0.05 mol l-1, pH 7.4 (Eap=0.0 V) y micelas inversas (4 % disolucin reguladora de fosfato 0.05 mol l-1 (pH 7.4) y AOT 0.1 mol l-1 en acetato de etilo) (Eap= +0.10 V), respectivamente. Medio Pastilla Electrodo i, A i, A RSD, %

77

Electrodos de peroxidasa

1

1 2

0.65 0.72 0.69 0.64 0.62 0.64 2.67 2.41 2.43 2.37 2.49 2.5 0.1 6.5 0.66 0.05 6.1

Disolucin reguladora de fosfato

2

1 2

3

1 2

1 Micelas inversas