Una visión práctica del tipaje Rh(D) en pacientes...
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Una visión práctica del tipaje Rh(D)
en pacientes, donantes y gestantes
Prof. Dr. Carlos Cotorruelo
Laboratorio de Inmunohematología
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
Universidad Nacional de Rosario
IDICER - CONICET
++++
+++
++
+
+/-
-
D Variante
TCI+
Reactividad del antígeno D con anti-D
D+ con alo anti-D
D Variante
D Variante
Variación cuantitativa
del Ag D
D Débil
Variación cualitativa
(cuantitativa) del Ag D
D Parcial D Débil D Parcial
D Débil D Parcial
D Débil D Parcial
D Parcial
D Débil
¿se sensibilizan al antígeno D?
D Variante
Variación cuantitativa
del Ag D
D Débil
Variación cualitativa
(cuantitativa) del Ag D
D Parcial D Débil D Parcial
D Débil D Parcial
D Débil D Parcial
D Parcial
D Débil
Variación cuantitativa del Ag D Variación cualitativa
(cuantitativa) del Ag D
.
. .
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EpD1 EpD6/7
EpD3 EpD4
EpD5 EpD8
EpD9
EpD2
Proteína RhD Ag D = conjunto de Epitopes D
D Débil D Parcial
D Positivo
. .
EpD3
EpD9
. EpD4 . .
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EpD1 EpD6/7
EpD3 EpD4
EpD5 EpD8
EpD9
EpD2
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D Negativo D Parcial
D Positivo D Débil
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anti-D policlonal
D Negativo D Parcial
D Positivo D Débil
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EpD6/7
anti-D policlonal
D Negativo D Parcial
D Positivo D Débil
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Sin respuesta inmune
anti-D policlonal
D Negativo D Parcial
D Positivo D Débil
EpD 1-9 Anticuerpo Monoclonal
EpD1 LHM 169/81, LHM 70/45, LHM 174/102, BRAD-7
EpD2 P3x249, BS227, LOR12-E2, LORE
EpD3 H41, LHM 76/55, P3x290, LHM 76/59, LOR11-2D9, LOR29-F7
EpD4 LOR17-6C7, ESD1
EpD5 P3x241, P3x35, BS229, BS231, CLAS1-126, C205-29, AUB-2F7/FISS
EpD6/7
LOR17-8D3, P3AF6, MS201, P3x61, RUM-1, TH-28, LOR28-21D3, F5s, D89/47, LDM1, LHM 169/80,
HM16, HM10, LDM3, LHM 50/2b, 175-2; BS226; BS232; LHM57/17; BS221; BS228, H2D5D2F5, BRAD3,
17010C9, D10, NOI, BIRMA-D56, D90/7, L87.1G7, SAL20-12D5, BIRMA-DG3, SAL17-4E8, BTSN4, D-
90-17, B9A4B2, NaTH28-3C11, HM-92, HG/92, RAB.B15, HIRO-2, D90/12
EpD8 P3x21211F1, LHM 76/58, LHM 59/19, HIMA-36
EpD9 BIRMA-D6, P3G6, HIRO-4, HIRO-7, HIRO-8, LHM 77/64, MS26, ESD1M, P3x21223B10
EpD1
EpD6/7
EpD4
EpD9
EpD3
Ingeniería Genética
anti-D monoclonales
EpD II III IVa IVb Va DBT VI VII DFR
EpD1 + + - - - - - + -
EpD2 + + - - + - - + -
EpD3 + + - - + - + + +
EpD4 - + + - + - + + +
EpD5 + + + + - - - + -
EpD6/7 + + + + + + - + -
EpD8 + + + + + + - - -
EpD9 - + - - + - + + +
D Parcial Epitopes D
.
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EpD1 EpD6/7
EpD3 EpD4
EpD5 EpD8
EpD9
EpD2
Detectan la variante DVI (DVI+)
No detectan la variante DVI (DVI-)
Donantes Pacientes - Embarazadas
DVI- y DVI+
D Negativo
D Positivo
D Variante
Reactivos
anti-D
Limitaciones
Diferenciar D Débil y D parcial
Identificar el fenotipo DEL
Detectar D parcial en individuos D+
D Variante
Donante
RN de madre D-
Paciente (receptor)
Embarazada
D positivo
D negativo
Expresiones débiles del Ag D
Discrepancias
Protección contra la aloinmunización anti-D
Recomendaciones
• Los profesionales implicados en el programa de profilaxis antenatal deben informar a la embarazada o a su médico tratante que es portadora de un grupo RhD negativo y, como tal, candidata al tratamiento con IgG anti-D de acuerdo con el calendario previsto.
• Si la aglutinación obtenida no se corresponde con la que habitualmente presentan las muestras RhD positivas, se recomienda catalogar la muestra de forma provisional como RhD negativa, hasta que un laboratorio de referencia determine definitivamente su carácter RhD positivo o RhD negativo.
Caracterización molecular del fenotipo D variante
La Biología Molecular permite resolver las limitaciones planteadas por la serología
RhD- E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
Organización genética del locus RH
RhD+ E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
gen RHD gen RHCE
E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
Locus RH
2 genes
cromosoma 1
en tándem
homólogos 92%
10 exones
Cajas Rhesus
enfrentados por sus extremos 3’
Proteína RhCE C/c y E/e . .
Proteína RhD Ag D
Epitopes D
.
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Proteína RhD
RhD+
Ag D RhD-
Variantes D
Más de 400 alelos descriptos para el gen RHD
Fenotipo D negativo
Fenotipo D variante
gen RHD E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
.
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EpD1 EpD6/7
EpD3 EpD4
EpD5 EpD8
EpD9
EpD2
Fenotipo D positivo
alelo D débil
alelo D parcial
alelo nulo
alelo DEL
alelo D parcial
Conjunto de alelos
Polimorfismo molecular
DELECIÓN GÉNICA: completa
SNPs: sustitución, deleción o inserción de uno o varios nucleótidos
CONVERSIÓN GÉNICA: transferencia de segmentos de ADN entre genes homólogos
Mecanismos
El conocimiento del evento genético responsable de cada
alelo permite su determinación por Biología Molecular
DUPLICACIONES: de varios nucleótidos o exones
Diferentes Alelos Cambio de AAs en la Proteína RhD Fenotipo D negativo
Fenotipo D variante
Fenotipo D positivo
otras
Algunas variantes D definidas por Biología Molecular
DII DHMi weak D type 1 weak D type 16
DIII DHMii weak D type 2 weak D type 17
DIV DHO weak D type 3 weak D type 18
DV DHQ weak D type 4 weak D type 19
DVI DHR weak D type 5 weak D type 20
DVII DUR weak D type 6 weak D type 21
DAR DMI weak D type 7 weak D type 22
DAR-E DNAK weak D type 8 weak D type 23
DAU DMH weak D type 9 weak D type 24
DBS DNB weak D type 10 weak D type 25
DCS DNS weak D type 11 weak D type 26
DBU DNT weak D type 12 weak D type 27
DB DNU weak D type 13 weak D type 28
DFR DOL weak D type 14 weak D type 29
DHAR DTO weak D type 15 weak D type 30
D débil tipo 1
D débil tipo 2
D débil tipo 3
ayuda a decidir la conducta transfusional u obstétrica Receptor
Gestante
Otros alelos RHD pueden ser susceptibles de aloinmunización
Evidencias clínicas
no son susceptibles de aloinmunización
Frecuencias de variantes D
70%
30% Otras
Poblacional: 0,8 %
D débil tipo 1
D débil tipo 2
D débil tipo 3
Estudio molecular del fenotipo D variante
Paciente embarazada cuyos GR reaccionan
débilmente con anti-D en medio salino. Con
la prueba de la antiglobulina indirecta se
observa una aglutinación de +++.
Paciente:
Determinación: Fenotipo Rh
Metodología: Hemaglutinación
Resultado: - expresión débil del antígeno D (fenotipo D variante)
- C(+), c(-), E(-), e(+)
Estudio molecular del fenotipo D variante
E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
D débil tipo 2
E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
D débil tipo 1
E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
D débil tipo 3
E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8
D débil tipo 4
Desarrollos “in house”
Equipos comerciales PCR alelo específica
D débil tipo 1
D débil tipo 2
D débil tipo 3
D débil tipo 4
. . . .
. . .
D débil tipo
1 2 3 4
Paciente:
Determinación: Fenotipo Rh
Metodología: Hemaglutinación
Resultado: - expresión débil del antígeno D (fenotipo D variante)
- C(+), c(-), E(-), e(+)
Determinación: Genotipificación RHD
Metodología: PCR alelo específica
Resultado: D débil tipo 1
Nota: no administrar inmunoprofilaxis anti-D (Transfusion 2015; 55:680-689).
Estudios de Biología Molecular Estudios serológicos
D variante
Genotipificación RHD
D débil tipo 1 D débil tipo 2 D débil tipo 3
Otros alelos RHD
No requiere inmunoprofilaxis Transfundir D positivo
Administrar inmunoprofilaxis Transfundir D negativo
Tipificación RhD
D Positivo D negativo
Protocolo para la tipificación RhD en pacientes y gestantes Sandler et al. Transfusion 2015; 55(3): 680-689.
D positivo
D débil tipo 1
D débil tipo 1
D débil
tipo 2
D débil tipo 2
D débil tipo 93
D débil tipo 2
DVI
D débil
tipo 2
D débil
tipo 4 DV
D débil
tipo 59
D débil
tipo 1
DVII
D débil
tipo 1
D débil
tipo 3
D débil
tipo 4
D débil tipo 93
D débil tipo 1
DVII
D débil
tipo 4
D débil
tipo 2
D Variante
Los estudios serológicos permiten identificar el fenotipo D variante
Los estudios moleculares son útiles para determinar la importancia clínica
de las variantes D
La caracterización molecular del fenotipo D variante permite implementar:
- una administración racional de la inmunoprofilaxis en las mujeres
embarazadas
- un uso adecuado de las unidades de sangre D negativas en los
Bancos de Sangre
Para recordar
muchas gracias