Unidad 8. núcleo y ciclo celular

Biología Celular y Molecular Núcleo y Ciclo Celular

Dra. Virginia H. Martínez

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El núcleo interfásico Una característica llamativa de la arquitectura nuclear es la existencia de compartimientos distintos estructurales y funcionales (Fig. 1). Las subestructuras nucleares caracterizadas incluyen la lámina nuclear, los nucléolos, los cuerpos de PML y de Cajal, y los puntos nucleares. También, se sabe que un número creciente de los componentes de la maquinaria que se requiere para la transcripción o su represión, pueden tener una distribución no homogénea en el nucleoplasma. A nivel del genoma así mismo, el material genético se dobla y empaqueta en el núcleo en estructuras altamente ordenadas que probablemente contribuyen a la regulación de la expresión génica. Una meta importante de los estudios en curso para entender la influencia potencial de la arquitectura nuclear en funciones nucleares, es identificar los principios que gobiernan la organización espacial del genoma. Un clásico el ejemplo de la organización dentro del núcleo es la distinción entre eucromatina descondensada, transcripcionalmente activa y condensada, heterocromatina generalmente inactiva. Ahora también se sabe que los cromosomas individuales ocupan posiciones distintas en el núcleo, designado territorios cromosómicos. Como resultado de diversos niveles de la compactación, diversos segmentos del cromosoma adoptan una organización y una topografía complejas dentro de su territorio cromosómico. Polarizando la distribución intranuclear de genes-ricos y de genes-pobres, los segmentos cromosómicos han demostrado ser un principio evolutivamente conservado de organización nuclear. Las regiones ricas en genes tienden a estar orientadas hacia el interior nuclear, mientras que las regiones pobres en genes, tienden a estar orientadas hacia la periferia. Aunque los cromosomas se organizan como territorios distintos en el núcleo de en interfase, la evidencia obtenida de varios modelos biológicos - usando técnicas de genética clásica a herramientas moleculares - ha demostrado que los cromosomas son estructuras dinámicas y estas regiones cromosómicas individuales se pueden ubicar nuevamente, con respecto a ambas estructuras nucleares y a otra regiones cromosómicas. También está aumentando la evidencia que la ubicación de nuevas regiones genómicas en espacio nuclear es importante para la regulación de la expresión génica. Los recientes avances tecnológicos permiten ahora identificar grandes lugares geométricos que obran recíprocamente a través del genoma, y los resultados iniciales han destacado la importancia potencial de tales interacciones para la apropiada regulación génica. Como será discutido más adelante, la posibilidad de que redes espaciales de lugares geométricos genómicos existan en el núcleo implica la existencia de un nivel previamente inexplorado de regulación del gen que coordina la expresión a través el genoma. Organización del núcleo celular de la célula de mamíferos. El núcleo se caracteriza por una distribución compartamentalizada de sus componentes funcionales. La envoltura nuclear contiene poros y una red de filamentos intermedios, la lámina nuclear. Las organizadas regiones nucleares, se agrupan y forman nucléolos, los cromosomas en territorios cromosómicos y en compartimentos intercromosómicos. La cromatina está organizada en distintos territorios cromosómicos. También otros componentes son los puntos nucleares, los cuerpos PML y los cuerpos de Cajal localizados en las lagunas intercromosómicas. La cromatina expande lóbulos en la intercromatina e interactúan entre los pliegues vecinos de los territorios cromosómicos y los subdominios cromosomales en la intercromatina. Organización del núcleo celular de la célula de mamíferos. El núcleo se caracteriza por una distribución compartamentalizada de sus componentes funcionales. La envoltura nuclear contiene poros y una red de filamentos intermedios, la lámina nuclear. Las organizadas regiones nucleares, se agrupan y forman nucléolos, los cromosomas en territorios cromosómicos y en compartimentos intercromosómicos.



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La cromatina está organizada en distintos territorios cromosómicos. Los puntos nucleares, cuerpos PML y los cuerpos de Cajal están localizados en las lagunas intercromosómicas. La cromatina expande lóbulos en la intercromatina e interactúa entre los pliegues vecinos de los territorios cromosómicos y los subdominios cromosomales en la intercromatina.

Puntos nucleares: Estructuras irregulares que contienen altas concentraciones de factores de corte y pequeñas partículas de ribonucleoproteínas. Cuerpos PML (promielocitos leukemia): Estructuras nucleares implicadas en la regulación transcripcional, la patogenia viral, supresión tumoral, apoptosis y reparación del ADN. Cuerpos de Cajal: Estructuras esféricas que están involucradas en el procesamiento del ARN nuclear. Proteínas marcadas que incluyen la proteína p 80 coilina y la proteína para la supervivencia de las neuronas motoras (SMN). Envoltura nuclear y Citoesqueleto de lamininas

• Tiene afinidad por ADN, cromatina e histonas • Responden a señales • Las señales remodelan la organización de las lamininas y exponen a la cromatina a las

proteínas reguladoras • Favorece la estructura nuclear, la segregación cromosómica y cumple roles en la

transcripción y la fase de elongación en la replicación del ADN • Determina la forma nuclear y controla la distribución de los poros nucleares



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Posición de los cromosomas en el núcleo interfásico El estudio de la expresión génica está cambiando rápidamente. Más que analizar en detalle los mecanismos involucrados en la regulación de genes individuales, el foco en la era genómica está en comprender globalmente el genoma dentro del contexto del núcleo entero. Se está proponiendo que la expresión de la regulación génica no puede llevarse a cabo exclusivamente por la información codificada en la secuencia lineal de ADN. Hay evidencias puntuales que la alta organización estructural de los cromosomas y la regulación epigenética a través de las modificaciones de la cromatina juegan importantes roles en la expresión de los genes, la arquitectura nuclear y la organización espacial del genoma son los factores principales en regulación de genes simples y en los programas de expresión de genes.

La unidad natural de subdivisión del genoma es el cromosoma, que puede observarse fácilmente en mitosis como unidades altamente condensadas, pero su naturaleza morfológica durante la interfase fue desconocida por muchos años. Recientes avances en microscopía, unidos a la secuenciación completa del genoma, permiten por primera vez localizar alguna parte del genoma



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en espacio y tiempo proveyendo las primeras señales del rol que gobierna la organización de los cromosomas durante la interfase. Se discute los modelos emergentes de posición de los cromosomas no azarosa y sus implicancias funcionales.

Territorios cromosómicos El material genético que compone un cromosoma no está distribuido desordenadamente en el núcleo interfásico, cada uno ocupa un lugar exclusivo y definido en el volumen nuclear y representa una unidad estructural definida como territorio cromosómico. Este término fue propuesto por Rabl y Boveri en los 80 y Cremer mediante técnicas de microradiación con láser y ultravioleta. El término territorios cromosómicos refleja la naturaleza física diferente de los cromosomas en el núcleo interfásico. Se visualizan actualmente con FISH y se establece la existencia de los cromosomas como territorios individuales. En los organismos superiores. El tamaño de los territorios cromosómicos está determinado por su contenido en ADN pero también puede estar afectado por otros factores como su estado transcripcional. Todavía su organización interna no está clara. En metafase los cromosomas presentan series de bandas, R y G, correspondientes a regiones de replicación del genoma. Durante la metafase estas regiones se mantienen y ocupan distintos dominios dentro del territorio cromosómico. Los dominios de replicación son de aproximadamente 1 Mb de tamaño y representan diferentes niveles de organización de los territorios cromosómicos, que se mantienen durante varios ciclos celulares. Se ha sugerido que la fibra de cromatina dentro de los territorios cromosómicos está en forma de loops de 30 a 150 Kb, formando rosetas de 1Mb.

Expresión génica y topología cromosómica Una cuestión crucial para entender la estructura y función de los territorios cromosómicos es donde están localizados los genes activos dentro de los territorios cromosómicos. Inicialmente la baja resolución de los estudios morfológicos indicaban que los territorios cromosómicos son más bien estructuras impermeables e implicaban que los genes activos se encontraban en la superficie del cromosoma accesibles a los factores regulatorios y a los componentes de la maquinaria de replicación. Estudios recientes indican que no es el caso. Mediciones de la movilidad de las proteínas en el núcleo de células vivas sugiere que la mayoría de las proteínas son altamente móviles in vivo y que no hay zonas de exclusión significativas. Así los territorios cromosómicos son permeables a las proteínas, los territorios se comportan como esponjas y contienen grandes superficies internas creadas por redes de canales interconectados. Estudios directos de localización espacial de muchos genes han mostrado que los genes pueden encontrarse en cualquier lugar del territorio cromosómico, independientemente de su actividad transcripcional. Hay genes como el de la distrofia muscular que están localizados en la periferia del territorio cromosómico, otros no exhiben localización preferente, otros si es importante su localización periférica para su expresión.

Posición no azarosa de los cromosomas. Se preguntan si ya que el material genético de cada cromosoma está limitado a un subvolúmen nuclear, los territorios están organizados al azar dentro del núcleo o siguen un patrón particular?. Rabl, 1885, propuso que la orientación centrómero telómero observada durante la anafase se mantenía durante el ciclo celular. Como consecuencia, en interfase los centrómeros y telómeros están en lados opuestos del núcleo. Esta polarización se conoce como configuración de Rabl común en plantas y drosofila. La configuración de Rabl asegura que la orientación de los cromosomas dentro del núcleo está preservada y probablemente ayuda al mantenimiento de la integridad de los cromosomas. Se ha sugerido que la especificidad del posicionamiento de los cromosomas tiene consecuencias funcionales por que facilitaría el alineamiento de los



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cromosomas homólogos durante la meiosis. Sin embargo el alineamiento de los cromosomas en la configuración de Rabl no parece tener implicancias en el control de la expresión génica. En mamíferos, la configuración Rabl es relativamente rara en interfase. Estudios recientes dan evidencias fuertes que el arreglo de los cromosomas en la distribución radial no es al azar. , esto fue observado en la distribución radial de cromosomas humanos, el cromosoma 19 con alta densidad de genes se posiciona más bien en posición interna del núcleo de linfocitos, mientras que el 18 que presenta una baja densidad se posiciona en la periferia nuclear. El posicionamiento no está relacionado a la densidad génica, la posición radial de estos cromosomas se ha conservado evolutivamente ya que se conserva en los monos del viejo mundo. Esta conservación evolutiva de la posición implica un rol funcional: La disposición radial de acuerdo a ala densidad génica y al tamaño también ha sido observada por ejemplo en los cromosomas largos se posicionan hacia la periferia y los pequeños hacia el interior. También estaría determinada por la posición relativa de cada uno de ellos, ocupando posiciones preferenciales. Los cromosomas pueden tener diferentes arreglos en diferentes organismos, tejidos y tipos celulares de acuerdo al rol que cumplan y presentan diferentes patrones de arreglo. Una dificultad es al análisis tridimensional del núcleo interfásico, el relativo gran número de cromosomas y la ausencia de puntos de referencia.

Establecimiento y mantenimiento de la posición de los cromosomas. La posición de los cromosomas es establecida en anafase, esto fue observado por Rabl. Sin embargo probablemente los cromosomas tengan más libertad de traslación cuando entran en G1, donde su posición puede ser restablecida o alterada, esto los hacen cuando salen de la mitosis. Durante G1, la cromatina se desespiraliza y las fibras de cromatina pueden se producen movimientos de difusión de sus partes que interactúan con las estructuras nucleares más estables como la envoltura nuclear y la matriz. Experiencias de fluorescencia en etapas posteriores de G1, S y G2, establecieron menor movilidad durante las mismas, una de las razones sería el gran volumen que toman los cromosomas en relación al volumen celular. Limitantes físicas evitan que los cromosomas puedan moverse y favorecen el mantenimiento de la posición de los cromosomas en el núcleo interfásico. El sustrato más obvio de anclaje de los cromosomas es la envoltura nuclear, observaciones en la levadura confirman que la envoltura se asocia con la cromatina y limita el movimiento de traslación. La cromatina puede interactuar directa o indirectamente con los componentes de lámina nuclear, con los filamentos intermedios de laminina nuclear, pueden unirse directamente al ADN o al corazón de histonas, anclando la cromatina a la lámina nuclear. La envoltura puede anclar la cromatina indirectamente a través de múltiples proteínas internas de la envoltura nuclear. En la levadura la cromatina está anclada por un segundo componente, los poros nucleares, la cromatina telomérica está anclada a los poros nucleares por la proteína MLP2 , que también actúa como mediador transcripcional de la represión.. No hay evidencia de anclaje a poros nucleares en mamíferos. Los movimientos de los cromosomas también están restringidos por proteína de unión de la matriz nuclear, las lamininas también están presentes en el interior y no solo restringidas a la lámina nuclear, e interactúen con la cromatina. Los cromosomas que contienen el organizador nucleolar, tienen restringidos sus movimientos por su asociación con el nucleolo, otras estructuras que restringen los movimientos son los factores splicing preARNm . Todos estos factores producen el mantenimiento de la posición de los cromosomas.

Implicancias funcionales del posicionamiento de los cromosomas Que significado funcional tiene inmovilización de los cromosomas en el núcleo y que su posición no ser al azar?. En el caso del nucleolo, aumenta la eficiencia de la expresión génica, creando zonas especializadas, producen ambientes específicos de expresión para los genes, genera dominios



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nucleares. La asociación de loci de genes con la heterocromatina son modos poderosos de silenciar genes.

Si la posición de los cromosomas fue importante funcionalmente para la regulación de la expresión génica, uno puede predecir que el arreglo de los cromosomas sufrió cambios durante la diferenciación y desarrollo de los organismos.

Por ejemplo se han observado interacciones intercromosomales inducidas por diferentes hormonas (señales): La transcripción aumenta en un punto nuclear específico. A. Después del tratamiento con la hormona 17β-estradiol (E2) se observa un nivel básico de expresión (roja) TFF1 (amarillo) y GREB1. A los 2 minutos se observa una asociación intercromosomal a través de interacciones actina/miosina (B y C). Resultado de estas interacciones es el aumento de la expresión génica (B y C). Queda por determinar si los genes que actúan recíprocamente reclutan pre-mRNA o empalman y se descomponen en factores puntos preexistentes (b) o si los genes se mueven a otros punto (c).



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Modelos de territorios cromosómicos. (a) En el modelo de dominio intercromosómico (ICD), hay un límite entre la superficie de un TC y el compartimiento que contiene la maquinaria de expresión del gen (focos de RNAPII en azul, que enriquece los puntos en color de rosa). Este modelo predice que todos los genes activos (círculos verdes) están situados en la superficie de TC. (b) En el modelo del compartimiento de la intercromatina (IC), la superficie de los TC se invagina de modo que la maquinaria de la expresión del gen puede penetrar mejor dentro del TC. Los lazos de la cromatina descondensada que contiene genes activos, pueden ubicarse hacia fuera en este compartimiento. (c) En el modelo del enrejado hay una mezcla extensa de las fibras de cromatina de la periferia de TC adyacentes. En (b) y (c), los diversos genes de los TC pueden co-localizarse en el núcleo junto con las maquinarias de transcripción (azules) o empalmar los puntos -factor-enriquecidos.

Translocaciones, efectos de proximidad y cáncer. Se han documentado más de 600 rearreglos cromosómicos en cánceres humanos. La posición no azarosa de los cromosomas tiene implicancias en la formación de translocaciones en los cromosomas. En dos cromosomas que sufren translocaciones recíprocas, cada uno de ellos puede contener terminaciones libres formadas por rupturas y producir intercambio,: La proximidad tiene efectos importantes en la determinación de patrones de translocación. Cromosomas próximos son más proclives a sufrir translocaciones que cromosomas que se hallan alejados. La especificidad cromosómica de las translocaciones tiene consistencia con diferentes tipos de cánceres.

Nucleólo

• Segundo compartimento nuclear

• Sitio de biogénesis de subunidades de ARN ribosomal (rRNA) y 40S y 60S En células somáticas animales y de plantas contiene centenares de r-genes activos, la mitad de la producción celular total de ARN. Sin embargo, la mayor parte de la evidencia indica que una



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fracción significativa, a menudo > el 50%, de r-genes sigue siendo transcripcionalmente silenciosa

• Lugar de regulación del ciclo celular • Lugar de diversos procesos bioquímicos: produce mucho de los complejos proteícos y de

nucleoproteínas de diversos tamaños, incluyendo partículas pre-ribosomales, ribonucleoproteínas (RNPs), ARNsARNsn, ARNt, SRP-RNA, telomerasas de ARN.

• Modelo tripartito, Centro fibrilar FCs); Componente fibrilar denso (DFC9 y componente granular (GC). (cromatina condensada perinucleolar, cromatina intranucleolar, intersticios del nucléolo, vacuolas o las cavidades)

Conclusiones Los cromosomas no se disponen en el núcleo al azar.

Se tienen patrones rudimentarios de organización, estos patrones están establecidos y mantenidos y tienen implicancias funcionales la posición de los cromosomas.

Se ha secuenciado el genoma pero no se conoce la organización espacial de los cromosomas in vivo.

Esto requiere de un mapa cromosómico del espacio tridimensional del núcleo en diferentes tiempos, como durante la diferenciación y el desarrollo.

Para correlacionar los cambios en los patrones cromosómicos con los cambios en la expresión génica, es importante determinar la relevancia de la posición cromosómica en el núcleo.



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Hay que establecer los patrones de posición bajo diferentes condiciones funcionales y de manipulación experimental y probar sus consecuencias funcionales.

Dilucidar si el posicionamiento cromosómico en interfase tiene un efecto significativo en nuestra comprensión de la expresión del genoma.

Mapear los cromosomas en el espacio y tiempo es esencial para comprender los procesos biológicos complejos durante los cambios en los programas de expresión génica que ocurren durante la diferenciación de las células madre y durante la reprogramación del núcleo en la clonación por transferencia nuclear.

En la diagnosis de enfermedades humanas.

Ciclo Celular

• Toda célula se origina de otra célula. Rudolf Virchow 1858

División celular • Medio de propagación • En organismos unicelulares, modo de reproducción • Organismos pluricelulares, origen del organismo multicelular • Mitosis: huevo-crecimiento-renovación – reparación • Meiosis: formación de gametos • Enlace entre progenitor y descendencia • Toda célula tiene un ciclo: Ciclo celular

Ciclo celular • Proceso donde la célula replica el ADN, transmisión de la información genética a la próxima

generación • Segrega cromosomas • Crece y duplica organelos

Sistema de control regulado por proteínas

• Dispositivo bioquímico que actúa cíclicamente • Es coordinado y retroalimentado • Es subordinado • Regulado por señales internas y del entorno • Presenta puntos de control y entradas de información • Controla cada etapa • Activan señales para continuar procesos de activación o retrasos • El proceso se ha descubierto estudiando levaduras, xenopus y el hombre • Función principal del CC es duplicar con exactitud el genoma, además de los organelos

celulares • Fase S y M separadas por dos G1 y G2, fases de descanso, algunas entran en G0

Participan dos familias de proteínas



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1. Kinasas dependientes de ciclina cdK • Actuan fosforilando proteínas seleccionadas sobre treonina y serina

2. Ciclinas

• Activadoras especializadas, que se unen a las cdK y controlan su capacidad de fosforilar a proteínas dianas.

Cuatro tipos de ciclinas • Ciclina G1/S, se unen a las cdK al final de G1 y determinan que la célula replique el ADN • Ciclina S: Ciclina S + cdK, actúa en S e inicia la replicación de ADN. • Ciclina Mitótica: Ciclina mitótica + cdK, actúa en G2 para entrar en Mitosis • Ciclina G, ayudan a dar paso al punto de inicio o de restricción del G1.

Periodo G1

• Inactivación de cdK +M • Crecimiento celular • Aparición de proteínas inhibidoras de cdK • Salida a G1, síntesis de ciclina G1, formación del complejo cdK + ciclina G1 • Actividad de cdK + ciclina G1, induce a la síntesis de ciclinas G1/S • Formación complejo cdK + ciclina G1/S, induce síntesis de ciclina S • Cromosoma: orígenes de replicación • Formación de complejos prereplicativos: proteínas reguladoras de la replicación: MCM

Periodo G1 –S

• Ciclina G1/S, se unen a las cdK al final de G1 a • diferentes proteínas reguladoras que activan los orígenes de replicación en cromosomas • Inicio de la replicación del ADN

Periodo S

• cdK+ciclina S • Replicación del ADN • Activación de orígenes de replicación de los cromosomas por activación de los complejos de

replicación

Periodo G2 • 2 juegos de genoma • Aumenta síntesis de Ciclina M • Formación complejo cdK + M • Actividación del complejo regulada por la proteína kinasa, wee 1 inhibe fosforilación de su

sitio activo; desfosforilación regulada por otra proteína cdc25 aumenta actividad

Periodo M • cdK + M • Condensación de los cromosomas, cohesinas, empaquetamiento de los cromosomas. • Fosforilación de laminina nuclear. • Vesiculización de la EN



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• Microtúbulos, huso mitótico • Vesiculización del Golgi • Metafase a anafase: Complejo promotor de la anafase (APC), proteólisis de las cohesinas, • Puntos de control cinetocoros Alineado de los cromosomas

En levaduras: una sola cdK se une a todas las ciclinas En mamíferos: Hay 4 cdK: dos cdK con ciclinas G1, otra con G1/S y S y la restante la ciclina M.

Acción de los complejos proteícos ciclina-cdK • Las ciclinas activan los cdK • La dirige hacia sus proteínas diana • El complejo fosforila un grupo diferente de proteínas sustrato • Produce diferentes efectos dependiendo de la accesibilidad de los productos • Participan además enzimas que degradan las ciclinas en diferentes fases del ciclo • Son tambien regulados por otras proteínas inhibidoras CKI, control en las fases G1 y S

Control del ciclo celular • Cada uno de los complejos cdK-ciclina, desncadena un acontecimiento • La replicación no solo debe ser exacta, minimizando mutaciones

Mitosis

• La finalización de la replicación deja dos juegos de genoma • En G2, aumenta la síntesis de Ciclina M y se forma el complejo cdK + M



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• La actividad del complejo es regulada por una proteína kinasa, wee 1 que inhibe la fosforilación de su sitio activo; la desfosforilación es regulada por otra proteína cdc25 que aumenta su actividad, control de la fase M

• Se activa por acción de proteínas reguladoras como cdc 25 Efectos del complejo cdK + M

• Provoca la condensación de los cromosomas, activando las cohesinas, lo que produce el empaquetamiento de los cromosomas.

• Desorganización de la envoltura nuclear por fosforilación de laminina nuclear, despolimerización, produce la vesiculización de la EN

• Organiza los microtúbulos para formar el huso mitótico, nucleación de los microtúbulos • Vesiculiza el Golgi, por acción de una proteína que se fosforila la Grasp 6S • El pasaje de metafase a anafase, provoca las cromátidas hermanas se separen, esto se

logra cuando se activa: • Complejo promotor de la anafase (APC), una enzima ubiquitina ligasa, produce la proteólisis

de las cohesinas, actuando sobre la separasa, por degradación de la segurasa que la inhibe, al final de la metafase.

• Al APC, lo activa Cdc 20 • Hay puntos de control en los cinetocoros, para el alineado de los cromosomas • La salida de mitosis implica la degradación del complejo cdK+M, por fosforilación provocada

por APC y cdc 20.

Proteínas de control de daño

• P53 y P21 Mecánica de la división celular



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Huso Mitótico • Produce la duplicación de los centriolos • Aparición del material pericentriolar (MPC) • Complejo de anillo de y tubulina • Organización y polimerización de los microtúbulos • Formación del aster • Microtúbulos astrales, polares y cinetocóricos • Alargamiento y separación del huso • Proteínas asociadas a microtúbulos MAP, estabilizan • Catastrosfinas, desetabilizan, cuando deben acortarse

Cromosomas

• Cromátides hermanas unidas por cohesinas • Condensinas, proteínas que superenrrollan la cromatina

Cinetocoro • Complejo proteíco trilaminar • Dineínas cinetocóricas • Microtúbulos • Capta los extremos + de los microtúbulos, asociando tubulina • Despolimeriza cuando se mueven los cromosomas en anafase

Proteínas motor

• Dineinas cinetocóricas • Dineínas citoplasmáticas

Citocinesis: anillo contractil, citoesqueleto de actina y miosina Fragmoplasto

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