UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO INSTITUTO ...

FACULTAD DE MEDICINA

EFECTO DEL PÉPTIDO TAT(49-57) SOBRE LA

BIODISTRIBUCIÓN Y DOSIMETRÍA DE

RADIOFÁRMACOS ANÁLOGOS DE LA

BOMBESINA

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN FÍSICA MÉDICA

P R E S E N T A

CLARA LETICIA SANTOS CUEVAS

TOLUCA, MÉXICO JUNIO 2011

Directoras de Tesis: Dra. Guillermina Ferro Flores Dra. Eva Leticia Rojas Calderón

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

INSTITUTO NACIONAL DE

INVESTIGACIONES NUCLEARES

ININ

AGRADECIMIENTOS y RECONOCIMIENTOS

El presente trabajo se realizó en el Departamento de Materiales Radiactivos del

Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, bajo la dirección y tutoría de la Dra.

Guillermina Ferro Flores, con el apoyo financiero de CONACyT (Proyecto: CONACYT-

SALUD-69051-Mexico) y de la Agencia Internacional de Energía Atómica (Contrato

No. 14539/RO).

A la Dra. Guillermina Ferro Flores del Departamento de Materiales Radiactivos del

Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por todo su apoyo en la realización de

este proyecto.

A la co-dirección de la Dra. Eva Leticia Rojas Calderón de la Gerencia de Ciencias

Ambientales del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por las asesorías en

el tema de la simulación por el método Monte Carlo

Al comité doctoral, Dras. Consuelo Arteaga de Murphy y Martha Pedraza López, del

Departamento de Radiofarmacia del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición

Salvador Zubirán por las facilidades prestadas para la realización de este trabajo.

A la Dra. Rocío García Becerra y al Lic. David Ordaz Rosado del Departamento de

Biología de la Reproducción del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición

Salvador Zubirán por su ayuda y aportaciones en el área biológica.

A la Dra. Flor de M. Ramírez de la Cruz del Departamento de Química del Instituto

Nacional de Investigaciones Nucleares por su colaboración en el diseño de los

radiofármacos desarrollados en esta tesis.

A los miembros del jurado Drs. Guillermina Ferro Flores, Consuelo Arteaga de Murphy,

Rocío García Becerra, Jeanette Rodríguez Cortés, Fernando Ureña Núñez, Eugenio

Torres García y Miguel Angel Camacho López por sus valiosas aportaciones

Al Posgrado en Ciencias con Especialidad en Física Médica de la Facultad de

Medicina de la Universidad Autónoma del Estado de México.

ÍNDICE Resumen i

Abstract iii

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1

1.1. Introducción 2

1.2. Objetivo General 4

1.3. Objetivos Específicos 5

1.4. Referencias 6

CAPÍTULO 2: MARCO TEÓRICO 9

2.1. Péptidos específicos para imagen de cáncer in vivo 10

2.1.1. Análogos de la somatostatina 11

2.1.2. Análogos del péptido liberador de la gastrina 12

2.1.3. Péptidos ligantes de colecistoquinina (CCK) y receptores de gastrina

21

2.1.4. Péptidos ligantes de la integrina αvβ3: Marcadores de angiogénesis tumoral

21

2.1.5. Péptidos ligantes para receptores de neurotensina 22

2.1.6. Péptidos de internalización Tat 23

2.2. Sistemas multifuncionales con péptidos para la imagen óptica

24

2.2.1. Fluorocromos de infrarrojo cercano 24

2.2.2. Quantum Dots

26

2.2.3. Nanopartículas de oro

28

2.3. Sistemas multifuncionales con nanopartículas de óxido de hierro conjugadas a péptidos para imagen por resonancia magnética

29

2.4. Péptidos para imagen molecular con técnicas multimodales 31

2.5. Radioterapia de blancos moleculares

32

2.5.1. Proceso Auger 36

2.5.2. Efecto Auger en la terapia de blancos moleculares 38

2.5.3. Rango de las partículas y proximidad al ADN 40

2.5.4. Muerte celular inducida por radiación 43

2.5.5. El papel de la apoptosis en la radioterapia dirigida 45

2.5.6. La necrosis en la radioterapia dirigida 46

2.5.7. La catástrofe mitótica inducida por radiación 46

2.5.8. Cuantificación del efecto Auger 47

2.6. Metodología de cálculo de dosis absorbida de radiación 48

2.6.1. Sistema MIRD para cálculo de dosis interna 50

2.6.2. Modelos radiofarmacocinéticos 51

2.6.2.1.

Modelos Empíricos 51

2.6.2.2.

Modelos Analíticos 52

2.6.2.3.

Modelos Compartimentales 53

2.7 Dosimetría celular 54

2.7.1. Esquema MIRD celular 55

2.8. Simulación Monte Carlo 56

2.8.1. Códigos de simulación del transporte de radiación 57

2.8.2. Código de simulación Monte Carlo PENELOPE 58

2.8.2.1. Geometría del sistema 60

2.8.2.2. Definición de materiales 61

8.2.2.3. Descripción del programa principal 61

2.9. Microdosimetría 64

2.11 Referencias 66

CAPÍTULO 3: MARCO METODOLÓGICO 78

3.1. Obtención de los radioconjugados [99mTc]EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN), [99mTc]N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) y [188Re]N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (188Re-Tat-BN)

79

3.1.1. Síntesis de HYNIC-Lys3-BN 79

3.1.2. Síntesis de N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN 79

3.1.3. Modelado Molecular 80

3.1.4 Procedimiento de radiomarcado de HYNIC-Lys3-BN con 99mTc

80

3.1.5. Procedimiento de radiomarcado de N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN con 99mTc.

81

3.1.6. Procedimiento de radiomarcado de N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN con 188Re

81

3.1.7. Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN

82

3.1.8. Estabilidad en suero humano 84

3.1.9 Desafío a la cisteina 84

3.2. Pruebas in vitro 84

3.2.1. Líneas celulares 84

3.2.2. Prueba de internalización y unión no específica 85

3.2.3. Internalización nuclear de 99mTc-Tat-BN 85

3.2.4. Modelo Biocinético 86

3.2.5. Análisis estadístico 87

3.2.6. Localización in vitro de Tat-BN internalizado en células de cáncer por inmunocitoquímica

87

3.2.7. Efecto del 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular

88

3.3. Pruebas in vivo 89

3.3.1. Estudios de biodistribución 89

3.3.2. Inducción de tumores en ratones atímicos 89

3.3.3. Imágenes 90

3.4. Dosimetría subcelular 90

3.5. Referencias 94

CAPÍTULO 4: RESULTADOS 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-BN 95

4.1. Diseño y preparación 96

4.1.1. HYNIC-Lys3-BN

96

4.1.2. N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN

97

4.2. Modelaje Molecular: Diseño de (Acm)2-S2N2-Tat-Lys3-BN, Tc(O)S2N2-Tat-Lys3-BN por cálulos semiempíricos

98

4.3. Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN)

101

4.4. Estabilidad en suero de 99mTc-Tat-BN 102

4.5 Desafío a la cisteina 102

4.6. Pruebas in vitro

103

4.6.1. Captación in vitro de 99mTc-Tat-BN

103

4.6.2. Internalización celular de 99mTc-Tat-BN

104

4.6.3. Biodistribución subcelular de 99mTc-Tat-BN

106

4.6.4. Modelos biocinéticos subcelulares de 99mTc-Tat-BN

108

4.6.5. Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de cáncer por inmunocitoquímica

110


114

4.7. Pruebas in vivo

116

4.7.1. Estudios de Biodistribución in vivo de 99mTc-Tat-BN

116

4.7.2. Imágenes de ratónes atímicos con tumores inducidos PC3

117

4.8. Dosis absorbida celular de 99mTc-Tat-BN

119

4.8.1. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3

120

4.8.2. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7

121

4.8.3. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB231

123

4.8.4. Resumen de dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer

124

4.9. Discusión y conclusiones 126

4.10. Referencias 133

CAPÍTULO 5. RESULTADOS 188Re-N2S2-Tat(49-57)-BN 136

5.1. Diseño y preparación

137

5.2. Modelaje Molecular: Diseño de Re(O) 2S2N2-Tat-Lys3-BN por cálculos semiempíricos

138

5.3. Evaluación de la pureza radioquímica de 188Re-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (188Re-Tat-BN)

140

5.4. Estabilidad en suero humano de 188Re-Tat-BN 143

5.5 Desafío a la cisteina 144

5.6. Pruebas in vitro 144

5.6.1. Captación in vitro de 188Re-Tat-BN 144

5.6.2. Internalización celular de 188Re-Tat-BN 145

5.6.3. Biodistribución subcelular de 188Re-Tat-BN 147

5.6.4. Modelos biocinéticos subcelulares de 188Re-Tat-BN 149

5.7. Pruebas in vivo 151

5.7.1. Estudios de Biodistribución in vivo de 188Re-Tat-BN 151

5.8. Dosis absorbida celular de 188Re-Tat-BN 153

5.8.1. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3 154

5.8.2. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7 156

5.8.3. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231

157

5.8.4. Resumen de dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células de cáncer

158

5.9. Discusión y conclusiones 160

5.10. Referencias 166

CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES GENERALES Y TRABAJO A FUTURO

169

6.1 Conclusiones generales 170

6.2 Relevancia y trabajo a futuro 173

ANEXOS 175

1. Santos-Cuevas CL , Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Ramírez Fde M, Luna-Gutiérrez MA, Pedraza-López M, García-Becerra R, Ordaz-Rosado D. Design, preparation, in vitro and in vivo evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-bombesin: a target-specific hybrid radiopharmaceutical. Int J Pharm. 2009 Jun 22;375(1-2):75-83. 2. Ferro-Flores G, Ramírez Fde M, Meléndez-Alafort L, Santos-Cuevas CL. Peptides for in vivo target-specific cancer imaging. Mini Rev Med Chem. 2010 Jan;10(1):87-97. 3. Santos-Cuevas CL , Ferro-Flores G, Rojas-Calderón EL, García-Becerra R, Ordaz-Rosado D, Arteaga de Murphy C, Pedraza-López M. 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-bombesin internalized in nuclei of prostate and breast cancer cells: kinetics, dosimetry and effect on cellular proliferation. Nucl Med Commun. 2011 Apr;32(4):303-13. 4. Registro de patente: Clara Leticia Santos-Cuevas , Guillermina Ferro-Flores, Flor de María Ramírez de la Cruz 99mTc-Tat-Bombesina como un nuevo radiofármaco para la detección temprana de cáncer de mama. MX/a/2010/003829 Registrada.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Ilustración esquemática de las múltiples modalidades para la detección específica por imagen de cáncer de mama in vivo con péptidos conjugados a quantum dots, nanopartículas metálicas, fluorocromos de infrarrojo cercano o radionúclidos.

11

Figura 2 Estructura calculada por MM3 del complejo Tc-(EDDA)-HYNIC-BN (E= 105 Kcal/mol).

19

Figura 3 Estructura química de los quelantes más comunes utilizados para acoplar análogos de la BN a varios radionúclidos.

20

Figura 4 Representación esquemática de la longitud de trayectoria de la radiación α, β y Auger, en un medio celular y subcelular (escala arbitraria). El mayor depósito de energía de un electrón Auger ocurre muy cerca de unos pocos nm, mientras que la de la radiación α y β, ocurre en trayectorias de 40-80 µm y 0.1-10 mm respectivamente.

33

Figura 5 Transiciones radiativas y no radiativas en procesos orbitales internos atómicos. No existen transiciones CK en los orbitales K.

36

Figura 6 Representación esquemática de la relación entre la distancia del sitio de decaimiento y la energía depositada en el ADN. Se puede observar que si se mueve el sitio de irradiación del núcleo a la superficie celular, la energía depositada al ADN se reduce significativamente.

42

Figura 7 Catástrofe mitótica producida por irradiación. Las células control normalmente contienen un único núcleo redondo (izquierda). Célula irradiada con múltiples núcleos (punta de flecha) y micronúcleo (flecha) (derecha).

47

Figura 8 Estructura de la molécula HYNIC-Lys3-BN. 96

Figura 9 Estructura de la molécula N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.

97

Figura 10 (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido Tc(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio de quelación del Tc(O): [Tc(O)N2S2].

100

Figura 11 (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma-UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 99mTc-Tat-BN 2 h posteriores al radiomarcado.

101

Figura 12 Radiocromatogramas HPLC en fase reversa de 99mTc-Tat-BN recién marcado y 24 horas posteriores a la preparación (a temperatura ambiente).

102

Figura 13 HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea punteada corresponde al radiocromatograma de 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN después de incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h.

103

Figura 14 Internalización dependiente del tiempo de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).

105

Figura 15 Biocinética del 99mTc-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).

107

Figura 16 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas.

111

Figura 17 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MCF7. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas.

112

Figura 18 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MDA-MB231. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas.

113

Figura 19 Efecto del Tat-BN y 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular: la proliferación se correlaciona directamente con la concentración de ADN (ng/mL).

115

Figura 20 Captación de (A) 99mTc-Tat-BN y (B) en tumores inducidos de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 en ratones atímicos 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos.

118


137

Figura 22 (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido Re(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio de quelación del Re(O): [Re(O)N2S2].

139

Figura 23 Influencia de la concentración del péptido sobre la pureza radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, [ácido ascórbico] = 4.35 mg/mL, 18°C).

141

Figura 24 Influencia de la concentración de ácido ascórbico sobre la pureza radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, 18°C).

141

Figura 25 (A) HPLC de exclusion molecular, se representa el cromatrograma-UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 188Re-Tat-BN 2 h posteriores al radiomarcado.

142

Figura 26 HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea punteada corresponde al radiocromatograma de 188Re-Tat-BN después de incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h.

143

Figura 27 Internalización dependiente del tiempo de 188Re-Tat-BN en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).

146

Figura 28 Biocinética del 188Re-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA- MB231 (C).

148

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Incidencia y distribución de GRPr en carcinomas de mama primarios.

15

Tabla 2 Propiedades de la radiación emitida de algunos radionúclidos terapéuticos.

34

Tabla 3 Ejemplos de emisores de electrones Auger. 38

Tabla 4 Requisitos principales para radioterapia dirigida que utiliza emisores de electrones Auger.

39

Tabla 5 Características de las rutas de muerte celular. 44

Tabla 6 Diseño factorial experimental utilizado para el marcado de Tat-BN con 188Re.

82

Tabla 7 Gradiente de concentración de la fase móvil.

83

Tabla 8 Geometría y volumen de citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231.

91

Tabla 9 Composición elemental de una célula humana, utilizada para generar el archivo de material de la simulación por el método Monte Carlo.

91

Tabla 10 Espectro de radiación promedio del 99mTc utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo.

92

Tabla 11 Espectro de radiación promedio del 188Re utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo.

93

Tabla 12 Distancias de enlace de los complejos calculados Tc(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y Conflex.

99

Tabla 13 Captación celular de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN en diferentes líneas de cáncer (% del total de actividad ± Desviación estándar (DS)).

104

Tabla 14 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer PC3.

108

Tabla 15 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MCF7.

109

Tabla 16 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.

109

Tabla 17 Biodistribución del 99mTc-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).

116

Tabla 18 Biodistribución de 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN en ratones atímicos con tumores inducidos PC3, 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos (n=3).

117

Tabla 19 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3. 120

Tabla 20 Dosis absorbida de electrones de CI y Auger del 99mTc en citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.

120

Tabla 21 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

121

Tabla 22 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7.

121

Tabla 23 Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.

122

Tabla 24 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

122

Tabla 25 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB23.

123

Tabla 26 Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.

123

Tabla 27 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

124

Tabla 28 Dosis absorbida (Gy/Bq) de 99mTc-Tat-BN en núcleo y citoplasma de células de cáncer.

124

Tabla 29 Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de electrones CI y Auger de 99mTc.

125

Tabla 30 Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de electrones CI y Auger de 99mTc en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231.

125

Tabla 31 Distancias de enlace del los complejos calculado Re(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y CONFLEX.

138

Tabla 32 Captación celular de 188Re-Tat-BN en las líneas celulares de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231 (% del total de actividad ± DS).

145

Tabla 33 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer PC3.

149

Tabla 34 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MCF7.

150

Tabla 35 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.

150

Tabla 36 Biodistribución de 188Re-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).

152

Tabla 37 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3. 154

Tabla 38 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188Re en citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.

154

Tabla 39 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

155

Tabla 40 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7.

155

Tabla 41 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188Re en citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.

156

Tabla 42 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

156

Tabla 43 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231.

157

Tabla 44 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188Re en citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.

157

Tabla 45 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

158

Tabla 46 Dosis absorbida (Gy/Bq) de 188Re-Tat-BN en núcleo y citoplasma de células de cáncer.

158

Tabla 47 Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de radiación β, electrones CI y Auger de 188Re.

159

Tabla 48 Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de radiación β, electrones CI y Auger de 188Re en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231.

159

Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina

1

Capítulo 1

Introducción y Objetivos


2

1. 1. Introducción Las técnicas de obtención de imágenes moleculares, directa o indirectamente,

monitorean y registran la distribución espacio-temporal de procesos

moleculares o celulares para aplicaciones bioquímicas, biológicas, diagnósticas

o terapéuticas. En el caso de la medicina nuclear, el blanco molecular debe

unirse a una sustancia radiomarcada (radiofármaco) de forma altamente

específica. Las moléculas bioactivas radiomarcadas que se unen a receptores

específicos pueden ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, péptidos,

análogos de DNA y oligonucleótidos antisentido (antisense), entre otros [1].

En los últimos años se ha demostrado la utilidad diagnóstica de los péptidos

radiomarcados para la detección específica de diversas neoplasias, para ello

se utilizan herramientas desarrolladas por la biología molecular pero con

métodos aplicables in vivo [2-4].

El grupo de neuropéptidos llamados bombesinas (BN) comprende un gran

número de péptidos originalmente aislados de la piel de batracios y estimulan

las contracciones del músculo liso y regulan la temperatura. Posteriormente se

encontró que además están ampliamente distribuidos en células neurales y

endócrinas humanas [5,6].

Las principales BNs de origen mamífero son dos: el péptido liberador de la

gastrina (GRP) y la neuromedina B (NMB). Los receptores del péptido liberador

de la gastrina (GRPr) se encuentran distribuidos en muchos órganos pero se

sobre-expresan en la membrana de las células malignas, especialmente las de

cáncer de mama y de próstata y en las células de cáncer metastásicas a

ganglios linfáticos axilares y pélvicos [7,8].

La BN se unen específicamente al GRPr y este enlace es el fundamento para

marcar la BN con radionúclidos emisores de radiación gamma o positrones (Ej. 99mTc, 111In, 18F) para la obtención in vivo de imágenes de los GRPr por

técnicas de medicina nuclear molecular [6-9]. Es importante mencionar que


3

después de la interacción receptor-ligante (GRPr-BN) en la membrana celular,

una parte del complejo es internalizado al citoplasma celular [10].

En el ámbito de la química de radiofármacos existe, el interés por desarrollar

análogos de la BN marcados con 188Re. El 188Re es un radionúclido emisor de

radiación gamma, útil en la obtención de imágenes gammagráficas, pero

también es emisor de radiación β. Una biomolécula dirigida a un receptor

específico de una célula de cáncer marcada con un radionúclido emisor de

partículas β, tiene el potencial para ser utilizada en la radioterapia de blancos

moleculares [11,12-14].

Idealmente un radiofármaco debería depurarse rápidamente de la sangre,

acumularse en el sitio blanco y la radiactividad no unida a los sitios receptores

eliminarse rápidamente por vía renal, tanto por razones dosimétricas como

para mejorar el contraste de la imagen. La excreción hepatobiliar produce dosis

absorbida de radiación innecesaria al paciente y aumenta la radiación de fondo

que interfiere con la calidad de las imágenes.

Los análogos de la BN marcados con 188Re y la mayoría de los derivados

radiomarcados con 111In y 99mTc hasta ahora reportados, presentan como vía

principal de eliminación la excreción hepatobiliar, lo que hasta cierto punto ha

limitado su aplicación en la práctica clínica [8,15-29, 12-14].

Evidentemente la diferencia en la lipofilia de los diferentes complejos está

fuertemente influenciada por el compuesto o compuestos químicos que se

utilicen en la esfera de coordinación del radiometal. Recientemente se reportó

la preparación y evaluación preclínica del conjugado [99mTc]EDDA/HYNIC-Lys3-

BN (99mTc-BN) como un radiofármaco con rápida depuración renal y específico

para detectar a partir de una imagen gammagráfica, la expresión y

sobreexpresión de proteínas GRPr [6]. El diagnóstico y tratamiento de

enfermedades por nuevos mecanismos que involucren el transporte eficiente

de fármacos a blancos moleculares específicos intracelulares es de grán

interés en el ámbito médico-farmacéutico.


4

El dominio básico de la proteína Tat del VIH-1, es decir el Tat (49-57), es un

péptido que penetra o atraviesa fácilmente la membrana celular por lo que,

conjugado a diferentes fármacos, proteínas, péptidos y nanopartículas, actúa

como un “caballo de Troya” al incrementar de forma significativa la

internalización celular de los diferentes fármacos o biomoléculas [36-45]. Por lo

tanto, un nuevo conjugado del tipo [99mTc]N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN

(99mTc-Tat-BN) podría incrementar de manera significativa la internalización del

radiofármaco y con ello el contraste de las lesiones cancerosas en las

imágenes y mejoraría la sensibilidad y especificidad de los estudios

diagnósticos. Si se considera que la internalización se incrementará, las

emisiones de electrones Auger del 99mTc, podrían jugar un papel fundamental

en la energía depositada dentro de la célula (dosis de radiación absorbida) con

un posible efecto sinérgico en la terapia del cáncer si se activan por ejemplo

rutas apoptóticas. Por otro lado, si la biocinética y la especificidad de la Lys3-

BN unida al Tat(49-57) es favorable, un conjugado del tipo [188Re]N2S2-Tat(49-

57)-Lys3-BN (188Re-Tat-BN) podría ser potencialmente útil en radioterapia de

blancos moleculares.

1.2. Objetivo General

Preparar, caracterizar y comparar la cinética y dosimetría celular in vitro e

in vivo de los radiofármacos de 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN como agentes de

diagnóstico para la detección temprana y específica de cáncer de próstata y de

mama por técnicas de imagenología en medicina nuclear molecular. Asimismo

evaluar el potencial del radiofármaco 188Re-Tat-BN como un posible agente

para radioterapia de blancos moleculares.


5

1.3. Objetivos específicos

1. Obtener los radiofármacos 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN con

purezas radioquímicas mayores al 90 %.

2. Evaluar la estabilidad en suero humano y la unión a proteínas séricas

mediante cromatografía líquida de alta eficiencia de los complejos 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN.

3. Evaluar la captación específica in vitro de 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN en células de cáncer de las líneas PC3 (próstata humano),

MCF7 (mama humano) y MDA-MB231 (mama humano).

4. Evaluar la cinética de internalización in vitro de 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN en células tumorales PC3, MCF7 y MDA-MB231.

5. Estimar y comparar la dosimetría de los radiofármacos 99mTc-BN

y 99mTc-Tat-BN por el método Monte Carlo empleando el código

PENELOPE 2008 en células tumorales PC3, MCF7 y MDA-MB231 a partir

de los datos cinéticos experimentales.

6. Estimar la dosimetría del radiofármaco 188Re-Tat-BN en células de cáncer

por el método Monte Carlo (código PENELOPE 2008) a fin de calcular por

simulación el potencial terapéutico de un conjugado de Lys3-BN

radiomarcado con un emisor β.

7. Evaluar la biodistribución en ratones sanos BALB/c de los complejos 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN.

8. Evaluar la biocinética de los complejos 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN en ratones

atímicos con tumores inducidos con células PC3.


6

1.4. Referencias [1] Thakur M and Lentle BC. Report of a summit on molecular imaging. Radiology

236: 753-755 (2005). [2] Van Den Bossche B and Van de Wiele C. Receptor imaging in oncology by

means of nuclear medicine: Current status. J Clin Oncol 22: 3593-3607 (2004). [3] Kwekkeboom DJ, Mueller-Brand J, Paganelli G, Anthony LB, Pauwels S, Kvols

LK, O'dorisio TM, Valkema R, Bodei L, Chinol M, Maecke HR, Krenning EP. Overview of results of peptide receptor radionuclide therapy with 3 radiolabeled somatostatin analogs. J Nucl Med 46: 62S-66S (2005).

[4] Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Melendez-Alafort L. Third generation radiopharmaceuticals for imaging and targeted therapy. Current Pharm Anal 2: 339-352 (2006).

[5] Varvarigou A, Scopinaro F, Leondiadis L, Corleto V, Schillaci O, De Vincentis G. Synthesis, chemical, radiochemical and radiobiological evaluation of a new 99mTc-labelled bombesin-like peptide. Cancer Biother Radiopharm 17: 317-326 (2002).

[6] Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Rodríguez-Cortés J, Pedraza-López M, Ramírez-Iglesias MT. Preparation and Evaluation of 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-Bombesin for Imaging of GRP Receptor-Positive Tumours. Nucl Med Commun 27: 371-376 (2006).

[7] Gugger M and Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in non-neoplastic and neoplastic human breast. Am J Pathol 155:2067-2076 (1999).

[8] Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou AD, Laurenti C, Iori F, Remediani S, Chiarini S, Stella S. 99mTc-bombesin detects prostate cancer and invasion of pelvic lymph nodes. Eur J Nucl Med Mol Imaging 30:1378-1382 ( 2003).

[9] Lin KS, Luu A, Baidoo KE, Hashemzadeh-Gargari H, Chen MK, Brenneman K, Pili R, Pomper M, Carducci MA, Wagner HN. A new high affinity technetium-99m-bombesin analogue with low abdominal accumulation. Bioconjug Chem 16:43-50 (2005).

[10] Reubi JC. Peptide receptors as molecular targets for cancer diagnosis and therapy. Endocrine Reviews 24:389–427 (2003).

[11] Ferro-Flores G. and Arteaga de Murphy Consuelo, Pharmacokinetics and Dosimetry of 188Re-based Targeted Radiotherapeutics, Advanced Drug Delivery Reviews, in press, (2007).

[12] Smith CJ, Sieckman GL, Owen NK, Hayes DL, Mazuru DG, Volkert WA, Hoffman TJ. Radiochemical investigations of [188Re(H2O)(CO)3-diaminopropionic acid-SSS-bombesin(7-14)NH2]: syntheses, radiolabeling and in vitro/in vivo GRP receptor targeting studies. Anticancer Res 23:63-70 (2003).

[13] Moustapha ME, Ehrhardt GJ, Smith CJ, Szajek LP, EckelmanWC, Jurisson SS. Preparation of cyclotron-produced 186Re and comparison with reactor-produced 186Re and generator-produced 188Re for the labeling of bombesin Nucl Med Biol 33:81-89 (2006).

[14] Garcia-Garayoa E, Rüegg D, Bläuenstein P, Zwimpfer M, Khan IU, Maes V, Blanc A, Beck-Sickinger AG, Tourwé DA, Schubiger PA. Chemical and biological characterization of new Re(CO)3/[

99mTc](CO)3 bombesin analogues. Nucl Med Biol 34:17-28 (2007).

[15] Soluri A, Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou A, Scafe R, Massa R, Schillaci O, Spanu A, David V. 99mTc [LEU13]bombesin and a new gamma camera, the imaging probe, are able to guide mammotome breast biopsy. Anticancer Res 23:2139-2142 (2003).

[16] Reubi JC, Wenger S, Schmuckli-Maurer J, Schaer JC, Gugger M. Bombesin receptor subtypes in human cancers: detection with the universal radioligand


7

(125)I-[D-Tyr(6), beta-Ala(11), Phe(13), Nle(14)] bombesin(6-14). Clin Cancer Res 8:1139-1146 (2002).

[17] Hoffman TJ, Gali H, Smith CJ, Sieckman GL, Hayes DL, Owen NK, Volkert WA. Novel series of 111In-labeled bombesin analogs as potential radiopharmaceuticals for specific targeting of gastrin-releasing peptide receptors expressed on human prostate cancer cells. J Nucl Med 44:823-831 (2003).

[18] La Bella R, Garcia-Garayoa E, Langer M, Blauenstein P, Beck-Sickinger AG, Schubiger A. In vitro and in vivo evaluation of a 99mTc(1)-labeled bombesin analogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positive tumors. Nucl Med Biol 29:553-560 (2002).

[19] Scopinaro F, Varvarigou A, Ussof W. Breast cancer takes up 99mTc bombesin: A preliminary report. Tumori 88: S25-S28 (2002).

[20] De Vincentis G, Scopinaro F, Varvarigou A. Phase I trial of technetium [Leu13] bombesin as cancer seeking agent: Possible scintigraphic guide for surgery. Tumori 88:S28-S30 (2002).

[21] Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou AD. Use of bombesin in humans. J Clin Oncology 23:3170-3171 (2005).

[22] Alves S, Correia JD, Santos I, Veerendra B, Sieckman GL, Hoffman TJ, Rold TL, Figueroa SD, Retzloff L, McCrate J, Prasanphanich A, Smith CJ. Pyrazolyl conjugates of bombesin: a new tridentate ligand framework for the stabilization of fac-[M(CO)3]+ moiety. Nucl Med Biol 33:625-634 (2006).

[23] Kunstler JU, Veerendra B, Figueroa SD, Sieckman GL, Rold TL, Hoffman TJ, Smith CJ, Pietzsch HJ. Organometallic (99m)Tc(III) '4 + 1' Bombesin(7-14) Conjugates: Synthesis, Radiolabeling, and in Vitro/in Vivo Studies. Bioconjug Chem. [Epub ahead of print] (2007).

[24] Faintuch BL, Santos RLSR, Souza ALF, Hoffman J, Greeley M, Smith CJ. 99mTc-Hynic-bombesin (7-14)NH2: Radiochemical evaluation with coligands EDDA (EDDA=ethylenediamine-N,N`-diaetic acid), tricine and nicotinic acid. Synt React Inorg Met-Org Nano-Met Chem 16:438-442 (2005).

[25] Smith CJ, Volkert WA, Hoffman TJ. Radiolabeled peptide conjugates for targeting of the bombesin receptor superfamily subtypes. Nucl Med Biol 32:733-740 (2005).

[26] Zhang X, Cai W, Cao F, Schreibmann E, Wu Y, Wu JC, Xing L, Chen X. 18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostate cancer. J Nucl Med 47:492-501 (2006).

[27] Wickline S. A., Neubauer A. M., Winter P. M., Caruthers S. D., and Lanza G. M., Molecular Imaging and Therapy of Atherosclerosis With Targeted Nanoparticles, Magn. Reson. Imaging 25:667–680 (2007).

[28] Sharma P., Brown S., Walter G., Santra S., Moudgil B., Nanoparticles for bioimaging, Advances in Colloid and Interface Science 123–126:471–485 (2006)

[29] Liu Y., Shipton M. K., Ryan J., Kaufman E. D., Franzen S., and Feldheim D. L., Synthesis, Stability, and Cellular Internalization of Gold Nanoparticles Containing Mixed Peptide-Poly(ethylene glycol) Monolayers, Anal. Chem., 79: 2221-2229 (2007).

[30] O’Neal, D. P.; Hirsch, L. R.; Halas, N. J.; Payne, J. D.; West, J. L. , Photo-thermal tumor ablation in mice using near infrared-absorbing nanoparticles, Cancer Letters, 209(2) :171-176 (2004).

[31] Lewin, M.; Carlesso, N.; Tung, C. H.; Tang, X. W.; Cory, D.; Scadden, D. T.; Weissleder, R., Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells, Nature Biotechnology, 18, 410-414 (2000).

[32] Tkachenko A. G., Xie H., Coleman D., Glomm W., Ryan J., Anderson M. F., Franzen S., and Feldheim D. L., Multifunctional Gold Nanoparticle-Peptide


8

Complexes for Nuclear Targeting, Journal of American chemical society, 125: 4700-4701(2003).

[33] Hogemann D., Ntziachristos V., Josephson L., and Weissleder R., High Throughput Magnetic Resonance Imaging for Evaluating Targeted Nanoparticle Probes, Bioconjugate Chem., 13:116-121(2002).

[34] Paciotti GF,Myer L,Weinreich D, Goia D, Pavel N, McLaughlin RE, Tamarkin L. Colloidal Gold: A Novel Nanoparticle Vector for Tumor Directed Drug Delivery, Drug Delivery,11(3):169-183 (2004).

[35] Gu F. X., Karnik R., Wang A. Z., Alexis F., Levy-Nissenbaum E., Hong S., Langer R. S., and Farokhzad O. C., Targeted nanopartículas for cancer therapy, Nanotoday, ,2(3):14-21 (2007).

[36] Dietz GP and Bähr M. Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach. Mol Cell Neurosci 27:85-131(2004).

[37] Deshayes S, Morris MC, Divita G, Heitz F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci 16:1839-1849 (2005).

[38] Deshayes S, Morris MC, Divita G, Heitz F. Interactions of primary amphipathic cell penetrating peptides with model membranes: consequences on the mechanisms of intracellular delivery of therapeutics. Curr Pharm Des 11:3629-3638 (2005)

[39] Wadia JS, Dowdy SF. Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by Tat-mediated transduction in the treatment of cancer. Adv Drug Deliv Rev 57:579-596 (2005).

[40] Koch AM, Reynolds F, Kircher MF, Merkle HP, Weissleder R, Josephson L. Uptake and metabolism of a dual fluorochrome Tat-nanoparticle in HeLa cells, Bioconjugate Chem 14:115-1121 (2003).

[41] Jain M, Venkatraman G, Batra SK. Cell-penetrating peptides and antibodies: a new direction for optimizing Radioimmunotherapy. Eur J Nucl Med Mol Imaging 34:973-977 (2007)

[42] Chen L, Harrison SD. Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracellular targets. Biochem Soc Trans 35:821-825 (2007).

[43] Youngblood DS, Hatlevig SA, Hassinger JN, Iversen PL, Moulton HM. Stability of cell-penetrating peptide-morpholino oligomer conjugates in human serum and in cells. Bioconjug Chem 18:50-60 (2007).

[44] Hu M, Chen P, Wang J, Scollard DA, Vallis KA, Reilly RM. 123I-labeled HIV-1 Tat peptide radioimmunoconjugates are imported into the nucleus of human breast cancer cells and functionally interact in vitro and in vivo with the cyclin-dependent kinase inhibitor, p21(WAF-1/Cip-1). Eur J Nucl Med Mol Imaging 34:368-377 (2007).

[45] Zhang YM, Tung CH, He J, Liu N, Yanachkov I, Liu G, Rusckowski M, Vanderheyden JL. Construction of a novel chimera consisting of a chelator-containing Tat peptide conjugated to a morpholino antisense oligomer for technetium-99m labeling and accelerating cellular kinetics. Nucl Med Biol 33:263-269 (2006).


9

Capítulo 2

Marco Teórico


10

2.1. Péptidos específicos para imagen de cáncer in vivo

Los análogos de péptidos reguladores representan una clase de moléculas

desarrolladas para marcar específicamente células de cáncer. Estos péptidos

controlan y modulan la función de casi todos los órganos vitales y procesos

metabólicos, incluyendo neuropéptidos que están en el cerebro, péptidos de

hormonas intestinales, así como péptidos presentes en el sistema vascular

(péptidos vasoactivos) y sistema endócrino [1].

Los receptores de péptidos reguladores, son proteínas que se sobreexpresan

en numerosas células de cáncer humano. Estos receptores se han utilizado

cómo blancos moleculares para péptidos radiomarcados con el fin de localizar

tumores. Los resultados clínicos alcanzados durante la última década con

imágenes de tumores neuroendócrinos que sobreexpresan somatostatina han

sido útiles en el estudio de otros péptidos para detectar cáncer asociado con

receptores de péptidos, como el péptido liberador de la gastrina (GRPr),

colecistoquinina, ligantes de péptidos para receptores de integrina o

neurotensina. La mejora en los análogos de péptidos permite obtener imágenes

clínicas específicas y terapia para diferentes tipos de tumores, incluyendo,

mama, próstata, pulmón, intestino, páncreas y tumores cerebrales [2, 3, 4]. La

imagen molecular comprende el monitoreo no invasivo de procesos funcionales

y espaciotemporales a nivel molecular y celular en humanos y otros sistemas

vivos. Las técnicas de imagen, tales como la resonancia magnética (RMI), la

tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), la tomografía

por emisión de positrones (PET), y la imagen por fluorescencia óptica (OI) se

han utilizado para monitorear dichos procesos (figura 1).


11

Figura 1. Ilustración esquemática de las múltiples modalidades para la

detección específica por imagen de cáncer de mama in vivo con péptidos

conjugados a quantum dots, nanopartículas metálicas, fluorocromos de

infrarrojo cercano o radionúclidos.

2.1.1. Análogos de la somatostatina

La somatostatina es un péptido cíclico compuesto de 14 aminoácidos y juega

un papel importante en la secreción de hormonas, como la del crecimiento,

insulina y glucagón. Los cinco subtipos de receptores que se han encontrado

reconocen a la somatostatina. El octreótido (OC) se desarrolló como un

análogo de la somatostatina para la supresión de hipersecreción y para

controlar los síntomas de enfermedades de origen neuroendócrino. El OC

contiene 8 aminoácidos que retienen un enlace interno entre el disulfuro que

restringe la geometría de los cuatro aminoácidos de reconocimiento biológico y

es estable contra la degradación enzimática in vivo. Los adenomas pituitarios y


12

varios tumores de origen neuroendócrino sobreexpresan receptores de

somatostatina como los carcinomas de páncreas, feocromocitomas, carcinoma

medular de tiroides, paragangliomas, gastrinoma, neuroblastoma, meningioma

y cáncer de pulmón de células pequeñas. En la imagenología de cáncer

basada en somatostatina, un análogo de la somatosatina se une a un agente

quelante bifuncional que puede enlazar a un elemento radiactivo como el 111In y 99mTc para SPECT o 18F y 68Ga para PET. Actualmente el Tyr3-OC (TOC) es

utilizado en la práctica clínica como un complejo estable para detección de

tumores neuroendócrinos por técnicas de medicina nuclear molecular [5-9]. El

radiofármaco 99mTc-Depreotido desarrollado como un análogo del OC en 1996

por Pearson y cols [10] ha sido aprobado recientemente para su uso en

humanos en EUA y Europa por sus buenos resultados en el diagnóstico de

ganglios pulmonares [11,12].

2.1.2. Análogos del péptido liberador de la gastrin a

El péptido bombesina (BN, 14 aminoácidos) pertenece a un grupo grande de

neuropéptidos con muchas funciones biológicas. El equivalente en el humano

es el péptido liberador de la gastrina (GRP, 27 aminoácidos) y los GRPr están

sobreexpresados en la membrana celular de varios tumores malignos. El GRP

difiere de la BN en sólo 10 residuos carboxi-terminales y esto explica la

actividad biológica similar de los dos péptidos. La unión específica que

presenta la BN a los GRPr es la base para marcar a la BN con radionúclidos

tales como el 68Ga, 64Cu, 18F y 99mTc para imagen nuclear [15-22]. El subtipo 2

del receptor de la BN está sobreexpresado en varios tumores humanos como el

de mama, próstata, y pulmón de células pequeñas y cáncer de páncreas [21-

23]. Aproximadamente 30 diferentes péptidos radiomarcados (agonistas o

antagonistas) se han desarrollado en los últimos años [1, 24, 25].

La función principal de las hormonas peptídicas GRP y BN es liberar a la

gastrina secretada a la sangre por el tracto gástrico. Otras funciones del GRP y

BN son: actuar sobre tejidos periféricos y sistema nervioso central, estimular la

liberación de hormonas gastrointestinales, aumentar las concentraciones de


13

gastrina plasmática, polipétido pancreático, glucagon, insulina, péptido gástrico-

inhibidor y mantener los ciclos circadianos [26-28].

La BN tiene la siguiente secuencia de 14 aminoácidos: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-

Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-CONH2. Los últimos 7 de la porción del

carbono terminal representan la porción biológicamente activa [26].

Los 4 tipos de receptores de BN que se han identificado son: el GRPr,

frecuentemente expresado en tumores malignos, el receptor de la neuromedina

B (NMBr) y los receptores BB3 (BB3r) y el BB4 (BB4r), estos dos últimos con

afinidad mayor para la BN que para el GRP. El GRPr y el NMBr determinan la

acción de los péptidos semejantes a la BN en los mamíferos. Sin embargo,

solamente se había estudiado la farmacología del GRPr debido a la falta de un

ligante apropiado. Recientemente se ha informado que la BN marcada con 125I,

la 125I-[D Tyr6-beta-Ala11-Phe13-Nle14]-BN(6-14) se une con gran afinidad a

todos los receptores mencionados y es utilizada para estudios farmacológicos

[29].

El agonista GRP/BN es introducido al interior de la célula una vez que se ha

unido a sus receptores de membrana. Estos receptores son reciclados o

degradados mientras que el GRP/BN permanece en el espacio perinuclear. Por

lo tanto, la BN conjugada a la 2-pirrolino-doxorubicina, se ha reportado como

un agente citotóxico para quimioterapia dirigida que, inyectada a ratones

desnudos con tumores de próstata humana inducidos, produce resultados

satisfactorios en el tratamiento de este cáncer [30]. Asimismo, la BN

radiomarcada permanecerá en el tejido blanco por largos períodos dando como

resultado una acumulación de la radiactividad en tejidos ricos en GRPr

positivos (GRPr+), sin daño significativo a las células y tejidos circundantes.

De acuerdo con Reubi y cols se encontraron GRPr con alta densidad en:

1) Carcinomas prostáticos invasivos (30/30) y en casos de lesiones

proliferativas intraepiteliales prostáticas (26/26), mayormente en neoplasias


14

intraepiteliales prostáticas [31]. Metástasis óseas provenientes de cánceres

prostáticos andrógeno-independientes (4/7). Contrariamente, los GRPr,

ausentes en tejido prostático normal, fueron identificados en sólo algunas

próstatas hiperplásicas, y localizados en muy poca densidad en tejido glandular

y localmente en tejido estromal [31].

2) Células de mama epiteliales neoplásicas en dos tercios de los

carcinomas ductales invasivos y carcinomas ductales in situ [32].

Las metástasis de los ganglios linfáticos provenientes de carcinomas primarios

que expresaban el GRPr fueron todos positivos, mientras que el tejido

linforeticular adyacente fue negativo y sin embargo estos receptores estuvieron

presentes en ductos y lóbulos provenientes de muestras de tejido no

neoplásico, la hiperexpresión del GRPr en carcinomas mamarios, sugiere que

estos tumores pueden servir como blanco para análogos del GRP y BN [32].

La tabla 1 resume la incidencia y distribución de los GRPr en carcinomas de

mama primario en un estudio realizado por Gugger y Reubi [33].

Reubi y cols [34] analizaron los subtipos de los GRPr en 161 tumores

cancerosos humanos por medio de una BN marcada con 125I (125I-[D-Tyr6,beta-

Ala11,Phe13Nle14]BN(6-14)) que identifica los 4 subtipos de receptores.

Encontraron que 12/12 tumores de próstata, 41/57 tumores de mama y 5/5

gastrinomas expresaban predominantemente el GRPr; en cuanto a carcinoides:

11/24 intestinal, 1/26 bronquial y 1/1 carcinoide del timo presentaban NMBr;

9/26 carcinoides bronquiales y 4/9 tumores de cáncer pulmonar de células

pequeñas expresaban de preferencia, BB3r y de ellos 3/9 también expresaban

GRPr. Igualmente 6/16 carcinomas renales expresaban GRPr y 4 de ellos

también expresaban BB3r. Finalmente 2/10 sarcomas de Ewing expresaban

solamente BB3r. Con este primer estudio por medio de técnicas de unión

específica para detectar diferentes receptores expresados en tumores Reubi y

cols concluyen que estos tumores pueden ser diagnosticados y tratados con

análogos de la BN radiomarcados [34].


15

Tabla 1. Incidencia y distribución del GRPr en carcinomas de mama primarios

[33].

GRPr

Tipos Histopatológicos n Incidencia Distribución en el tejido

Carcinomas Invasivos

� IDC

� ILC

� Carcinoma Tubular

� Carcinoma Mucinoide

o Subtotal

46

4

1

1

52

29/46

1/4

1/1

1/1

32/52

Heterogéneo 16/29

Heterogéneo

Homogéneo

Heterogéneo

Heterogéneo 18/32

Carcinomas in situ

� DCIS

o Solo

o Concomitante con

IDC

� LCIS concomitante

con ILC

o Subtotal

4

13

2

19

2/4

9/13

1/2

12/19

Heterogéneo 2/2

Heterogéneo 6/9

Homogéneo

Heterogéneo 8/12

Total de neoplasias

estudiadas 71

44/71

(62%)

Heterogéneo 26/44

(59%)

El ligante convencional 125I-[Tyr4]BN muestra resultados similares que con la

BN no marcada, en cuanto a afinidad y al número de receptores a los que se

une. Al sustituir el 125I por radionúclidos emisores de radiaciones gamma y β

positivas y negativas (99mTc, 111In, 64Cu, 131I, 188Re, 177Lu, 149Pr, 153Sm) se

obtienen radiofármacos específicos análogos de BN utilizados en medicina

nuclear para el diagnóstico y/o terapia de tumores GRPr+ [13,15,17,19,20,34-

44].

El GRPr se encuentra involucrado en el crecimiento fetal de los pulmones [27] y

en el desarrollo de enfermedades pulmonares [45]. Las células de distintos

carcinomas de vías respiratorias producen y secretan GRP, además de


16

expresar receptores con alta afinidad para péptidos análogos de la BN [46].

Persinger y cols encontraron que el gen del GRPr se localiza en el cromosoma

X y que en las vías respiratorias humanas se expresa de manera abundante,

siendo ésta más predominante en personas fumadoras. Sus resultados

sugieren que el gen del GRPr está expresado más frecuentemente en mujeres

que en hombres y que la expresión de éste gen se activa más temprano en

mujeres como respuesta a la exposición al tabaco. La presencia de dos copias

que expresan el gen GRPr en mujeres puede ser un factor que incrementa su

susceptibilidad a la inducción de cáncer por tabaco [47].

Otro estudio hecho por Fleischman y cols demuestran que el tejido uterino

normal expresa al GRPr en el miometrio, glándulas secretoras endometriales y

vasos sanguíneos endometriales [48].

Halmos y cols demostraron que existe una relación directa y significativa (p <

0.005) entre los GRPr y los niveles de los receptores esteroideos [49,21].

Kahan y cols encontraron que una terapia con antagonistas de la BN, redujo el

tamaño de carcinomas mamarios inoculados en ratones atímicos [50].

Se han preparado diversos análogos de la BN radiomarcada para ser utilizados

como radiofármacos en medicina nuclear con la finalidad de detectar tumores

malignos y para estadificar cánceres mamarios y de próstata, así como para

identificar ganglios linfáticos afectados [3], como: 99mTc-diaminedithiol-[Lys3]BN (99mTc-DADT-[Lys3]BN) [51], 99mTc(I)-2-

picolylamine-N,N-diacetic acid-5-aminovaleric acid-BN (99mTc(I)-PADA-AVA-

BN), 99mTc-Cys-6-amino-n-hexanoic acid-BN [52,14,40], 99mTc(CO)3-pyrazolyl-

BN(7-14)NH2, [53], 99mTc-HYNIC-β-Ala-BN(7-14)NH2 y 99mTc-HYNIC-5-AVA-

BN(7-14)NH2, [41].

Muchos de los análogos de la BN marcados con 99mTc tienden a acumularse en

el hígado e intestino como resultado de su alta lipofilia y eliminación

hepatobiliar. La alta acumulación de radioactividad puede interferir durante la

detección de cánceres GRPr+ y sus metástasis en áreas abdominales [3].


17

El análogo de la BN, Demobesin-1 que contiene un quelante –N4- para su

unión estable con el 99mTc ha sido reportado como selectivo para el GRPr y

presenta eliminación mínima hepatobiliar [54].

Recientemente se han reportado nuevos agonistas de la BN como el 99mTc-

Demobesin-3, 4 y 5 y se demostró durante los estudios in vivo una captación e

internalización rápida a células tumorales PC3. La 99mTc-Demobesin-3 y 4 se

excretaron principalmente por vía renal [43].

Lin y cols reportaron otro análogo de la BN radiomarcado, [DTPA, Lys3(99mTc-

Pm-DADT), Tyr4]BN, que tiene poca eliminación hepatobiliar. Los estudios in

vivo con este radiofármaco mostraron gran afinidad a las células de cáncer

PC3. Los estudios de biodistribución en ratones normales mostraron muy baja

acumulación de radioactividad en el hígado e intestinos. Asimismo la captación

en el páncreas fue significativa ya que es un órgano que expresa GRPr [44].

El análogo de la BN radiomarcado, [111In-DTPA-Pro1, Tyr4]BN, demostró en

estudios preclínicos de medicina nuclear que se capta en tumores GRPr+.

Además de mostrar una gran afinidad y rápida internalización in vitro e in vivo

en células con GRPr [55].

El radiofármaco, RP527 marcado con 99mTc se ha estudiado en humanos y

mostró una captación específica en tumores de mama (4/6) y carcinomas de

próstata (1/4). En todos los casos se observó una alta eliminación hepatobiliar

[56-57].

El [188Re(NS3)(L-X-BBN(7-14))] mostró afinidad por el GRPr en el rango

nanomolar como se demostró por pruebas in vitro de unión competitiva al

utilizar células humanas de cáncer de próstata PC3. Las pruebas de

internalización y externalización in vitro indicaron que aproximadamente el 65%

del conjugado [99mTc(NS3)(L2-betaAla-BBN(7-14))] estaba unido en la

superficie o internalizado en las células PC3. Las pruebas de biodistribución de


18

[99mTc(NS3)(L-betaAla-BBN(7-14))] en ratones normales mostraron mínima

acumulación en páncreas normal (tejido que expresa al GRPr con alta

densidad en modelos murinos) y eliminación tanto hepatobiliar como renal [58].

Estudios con diferentes análogos de BN radiomarcada en más de 50 pacientes

con cáncer de mama, colorectal y de próstata, se pudo detectar invasión

tumoral en ganglios linfáticos pélvicos y captación en lecho prostático [38]. En

un estudio de 15 pacientes con lesiones mamográficas y a quienes se les

realizó biopsia y/o cirugía, el radiofármaco 99mTc-Leu13-BN diagnosticó

correctamente 12 de 15 cánceres de mama, mientras que 3 estudios

gammagráficos fueron negativos y correspondieron a 3 lesiones benignas.

Asimismo Scopirano y cols diagnosticaron 8 de 8 cánceres primarios de

próstata y detectaron correctamente invasión tumoral en ganglios linfáticos

pélvicos en 3 pacientes no detectados por tomografía computarizada y

resonancia magnética con el radiofármaco análogo de la BN, 99mTc[Leu13] BN

que además presentó eliminación hepatobiliar y renal [38].

Ferro-Flores y cols conjugaron al quelante bifuncional HYNIC (ácido 6-

hidrazinopiridina-3- carboxílico) y al coligante EDDA (ácido etilendimino-N,N –

diacético) a la BN para preparar 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-BN. La utilización

de HYNIC le dio al radiofármaco propiedades menos lipofílicas y

consecuentemente baja eliminación hepatobiliar y principalemente excreción

renal [18]. La estructura del radiofármaco, calculada por mecánica molecular y

por cálculos mecánico-cuánticos, se representa en la figura 2. Además García

Garayoa y cols recientemente mostraron que la introducción de un espaciador

hidrofílico entre la secuencia peptídica y el complejo de unión al 99mTc puede

reducir la alta lipofilicidad y mejorar la relación tumor-tejido no blanco [59].


19

Figura 2. Estructura calculada por MM3 del complejo Tc-(EDDA)-HYNIC-BN

(E= 105 Kcal/mol)

Después del diagnóstico, estadificación y localización del tumor se han utilizado

análogos de péptidos marcados con 111I como sustitutos para determinar la

biodistribución y dosimetría de radiofármacos terapéuticos marcados con

radiometales tales como 90Y. El DTPA (ácido dietilen triamino pentaacético) y

DOTA (ácido 1, 4, 7,10-tetraazaciclododecano-N, N’,N’, N’’-tetraacético) se han

utilizado como sistemas quelantes acoplados a análogos de la BN para terapia

[60]. Los radiofármacos como el [111In-DTPA-Pro,Tyr4]BN [61, 62], se han

reportado con alta afinidad a tumores GRPr+, rápida depuración de tejidos no

blanco y sangre vía renal. La sustitución del quelante DTPA por DOTA en el

mismo conjugado mostró efectos favorables en la afinidad por los GRPr [62].

Recientemente M. de Jong y cols sintetizaron un nuevo análogo de la BN

acoplado a DTPA, [111In-DTPA-ACMpip5,Tha6,βAla11,Tha13,Nle14]BN(5-14)

(Cmp 3), con limitada estabilidad en suero humano, pero alta captación in vivo

en tumores GRPr+ en estudios con animales [63].

Muchos de los estudios con nuevos análogos de la BN se enfocan en el

sistema quelante-DOTA por sus opciones multipropósito como SPECT, PET y

radioterapia con péptidos radiomarcados (PRRT) [64-71]. Por ejemplo, el

DOTA-PESIN (DOTA-PEG4-BN(7-14)) demostró ser un compuesto muy

prometedor. A pesar de tener afinidad moderada por los GRPr, presentó buena


20

captación in vivo en estudios animales [65]. La eliminación del compuesto fue

vía renal, con rápida depuración de tejidos negativos a GRPr, pero muy alta

acumulación en riñones, que no pudo ser reducida a través de la co-inyección

de lisina (figura 3).

Otro análogo de la BN utilizado como quelante al DOTA es el 177Lu-AMBA [71].

Este radiofármaco mostró alta captación en tumores GRPr+ en estudios

animales y con una razón tumor-fondo favorable. El tratamiento del tumor in

vivo con éste compuesto resultó en una sobrevida prolongada del ratón y

disminuyó la tasa de crecimiento del tumor comparado con los ratones control.

También se excretó via renal, con alta acumulación en los riñones a pesar de la

co-inyección de lisina, debido probablemente a la falta de lisinas en la

secuencia peptídica.

Figura 3. Estructura química de los quelantes más comunes utilizados para

acoplar análogos de la BN a varios radionúclidos [73].


21

La aplicación de péptidos análogos de la BN radiomarcados en pacientes aún

está muy limitado [56, 72, 73]. Sin embargo los desarrollos recientes en la

síntesis de nuevos análogos de la BN están promoviendo su utilización en

estudios clínicos.

2.1.3. Péptidos ligantes de colecistoquinina (CCK) y receptores de

gastrina

La colecistoquinina (CCK) y la gastrina actúan como neurotransmisores en el

sistema nervioso central, como reguladores de varias funciones en el tracto

gastrointestinal y como estimuladores de los factores de crecimiento en varios

tumores, como el cáncer de colon y el cáncer gástrico. Estructuralmente están

relacionados ya que ambos tienen los mismos cinco aminoácidos carbono-

terminal (-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2), que es el sitio activo para la unión con el

receptor de colecistoquinina-2 (CCK-2r). El CCK-2r se ha identificado en la

membrana celular de carcinomas medulares de tiroides (92%) mientras que se

encuentra ausente en cáncer de tiroides diferenciado. Específicamente la

minigastrina marcada con 99mTc ha mostrado una alta afinidad in vivo por los

CCK-2r [2, 74, 75]. Aproximadamente 13 diferentes péptidos marcados con 99mTc o 111In se han reportado recientemente como radiofármacos dirigidos a

los CCKr [22].

2.1.4. Péptidos ligantes de la integrina αvβ3: Marcadores de angiogénesis

tumoral

La angiogénesis representa la formación de nuevos capilares por crecimiento

celular a partir de microvasos ya existentes [76]. Las integrinas son receptores

de adhesión celular capaces de convertir la unión de ligantes extracelulares en

la activación de procesos intracelulares (señalización de fuera hacia adentro)

así como de emplear procesos intracelulares para activar respuestas celulares

(señalización de adentro hacia fuera). La integrina α(v)β(3) está involucrada en

la angiogénesis tumoral y producción de metástasis. La unión específica a


22

integrinas αvβ3 de péptidos que contienen residuos de Arg-Gly-Asp (RGD) se

han empleado para radiomarcar péptidos RGD útiles como agentes de imagen

específicos para tumores.

Varios péptidos que contienen RGD se han sintetizado y se ha encontrado que

restringiendo la movilidad del RGD en un pentapéptido cíclico, se incrementa la

afinidad in vitro. Estos datos sugieren que el sitio de unión en el receptor αvβ3

es limitado.

El monómero c-RGDyV (ciclo-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Val) se marcó primero en

1999 por Haubner y cols con 125I [77]. Este compuesto relativamente lipofílico

tuvo una rápida depuración tumoral y excreción hepatobiliar. La alta

acumulación de actividad en el hígado e intestino limitó su aplicación. La

glicosilación del péptido RGD disminuyó la lipofilicidad y consecuentemente la

captación hepática [78]. El mismo glicopéptido se marcó entonces con 18F [79-

80].

Los ligantes de péptidos para receptores αvβ3 marcados con 99mTc, 18F o 68Ga

son el c-RGDyK y el c-RGDfK (ciclo-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) en ambas formas,

como monómeros o como dímeros [81-87]. En estos péptidos la cadena lateral

de la lisina provee funcionalidad a la amina primaria para acoplarse con

agentes quelantes bifuncionales. Para mejorar la especificidad de los sistemas

multiméricos RGD se han diseñado más de 30 derivados de RGD marcados

con 18F, 64Cu, 68Ga o 99mTc [24, 88-90]. Es importante mencionar que los

péptidos RGD no pertenecen a la familia de péptidos reguladores, pero son

importantes porque pueden marcar vasos neoangiogénicos a través de los

receptores de integrinas.

2.1.5. Péptidos ligantes para receptores de neurote nsina

La neurotensina (NT) es un péptido lineal de 14 aminoácidos que se encuentra

en altas concentraciones en el íleon e hipotálamo, e induce varios efectos

fisiológicos tales como hipotensión, analgesia, contracción gástrica e


23

incremento en la permeabilidad vascular. Los receptores de neurotensina están

expresados en el cáncer de próstata y cáncer de páncreas [2,91]. El

neuropéptido-Y análogo marcado con 99mTc (NPY) también es útil en la

detección de sarcomas [92,93].

2.1.6. Péptidos de internalización Tat

El diagnóstico y tratamiento de enfermedades por métodos novedosos se

incrementaría con un transporte eficiente del fármaco al núcleo de las células.

Los péptidos de internalización (PPs) son fármacos utilizados en la imagen

molecular y están basados en dos péptidos, el VIH Tat (Tat; Arg-Lys-Lys-Arg-

Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) y el péptido homeodominio antennapedia (Ant; Arg-Gln-

Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys) [94]. El péptido

derivado VIH Tat es un péptido pequeño básico llamado “caballo de Troya”

porque se ha utilizado para transportar una gran variedad de moléculas al

interior de las células, como, nanopartículas, proteínas, péptidos y ácidos

nucleicos. El dominio de transducción o región que le da las propiedades de

internalización parece estar confinado en una pequeña secuencia de

aminoácidos básica Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg y es conocido como

Tat(49-57) [94-97]. Los radiofármacos híbridos, como por ejemplo el 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN han demostrado que aumenta la captación en

células de cáncer y consecuentemente el contraste en la imagen de tumores de

cáncer de mama [98]. Los péptidos Tat no pertenecen a la familia de péptidos

reguladores.

Las secuencias de localización nuclear (NLS) se han utilizado para llevar al

núcleo de células de cáncer a algunos anticuerpos como el anticuerpo

monoclonal anti–CD33 HuM195, modificado con una secuencia NLS y marcado

con 111In (emisor de electrones Auger). El 111In-NLSHuM195 se probó en

células de leucemia mieloide y mostró internalización nuclear del radiofármaco

donde los electrones Auger emitidos fueron letales [99]. Otro anticuerpo

monoclonal utilizado con NLS y emisores Auger fue el traztusumab marcado

con 111In sobre células de cáncer de mama HER2/neu+ y células de cáncer de


24

mama resistentes a traztusumab. Costantini y cols demostraron el potencial

citotóxico de este agente terapéutico contra dichas células [97,100].

2.2. Sistemas multifuncionales con péptidos para la imagen óptica

La imagen nuclear está limitada por varios factores tales como el tiempo

necesario en la adquisición de datos, el costo del equipo, la exposición a la

radiactividad, la necesidad de contar con personal altamente capacitado [101].

La imagen óptica de fluoróforos alojados en tejido no sano, en tiempo real, no

radiactiva tiene alta resolución [102]. Dentro de todas las técnicas de imagen

óptica investigadas, es de particular interés la imagen basada en fluorescencia

infrarroja (NIR, longitud de onda de 700-1000nm) por ser no invasiva in vivo,

por su absorción y dispersión relativamente bajas en tejido y por su mínima

autofluorescencia de luz NIR [103]. Esto es debido a la hemoglobina (principal

absorbedor de luz infrarroja), agua y lípidos (principales absorbedores de luz

infrarroja) que tienen los coeficientes de absorción más bajos en la región de

infrarrojo cercano [104,105]. Por lo tanto áreas de tejido más profundas son

accesibles para desplegarse en una imagen tomográfica de señales ópticas

(FMT) [106-113] e imagen de reflectancia por fluorescencia (FRI) [114-116].

Estas aplicaciones para imagen molecular in vivo emplean longitudes de onda

de infrarrojo cercano. Los métodos de imagen por fluorescencia generalmente

son superiores en términos de sensibilidad y facilidad en su empleo [104]. Sin

embargo, la imagen por fluorescencia de infrarrrojo cercano en animales

pequeños no puede ser extrapolada directamente a una imagen in vivo en

pacientes debido a su limitada profundidad de penetración de la señal óptica (<

7 mm por imagen de resonancia por fluorescencia y < 20 cm por tomografía

molecular por fluorescencia) [104].

2.2.1. Fluorocromos de infrarrojo cercano

Los colorantes fluorescentes orgánicos son los fluorocromos más utilizados.

Los colorantes como el isotiocianato de fluoresceina (FITC) y el éster

diacetatosuccinimidil de carboxifluoresceina (CFSE) se han utilizado para


25

varias aplicaciones biológicas como el marcado de anticuerpos con

fluorescencia y moléculas que se usan para marcar células u organelos [117].

Sin embargo, pierden rápido su fluorescencia por la exposición a la luz y por lo

tanto, no son útiles para observaciones de bioimagen por periodos largos de

tiempo. La mayoría de los colorantes orgánicos tienen un espectro de emisión

relativamente estrecho. La longitud de onda de emisión/excitación está

comúnmente afectada por los cambios en el ambiente químico local (por

ejemplo, el pH, la interacción de iones, etc.).

La intensidad de la fluorescencia de algunos colorantes como la cianina cambia

de acuerdo con la reacción específica con óxido nítrico, que es una molécula

involucrada en la regulación de mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos

[118].

En el caso específico de péptidos, el compuesto marcado con fluorescencia de

infrarrojo cercano, RGD con afinidad a receptores de integrinas, internalización

celular y otras características se están estudiando para mejorar la sensibilidad

y especificidad para detectar tumores con angiogénesis. La combinación de la

interacción específica del péptido RGD / integrina con la detección por

fluorescencia de infrarrojo cercano puede ser aplicada en la imagen no invasiva

de la expresión de integrinas y monitorear la eficacia de tratamientos anti-

integrinas.

Chen y cols [119] mostraron que el conjugado Cy5.5-RGD tiene afinidad por la

integrina αvβ3 (IC(50) = 58.1± 5.6 nmol/L). Otros resultados demostraron que el

Cy5.5- conjugado al péptido RGD monómero, dímero o tetrámero son

adecuados para la imagen de la expresión de integrinas [120].

También se ha logrado observar la expresión de αvβ3 en un modelo de tumor

cerebral ortotópico con un sistema de imagen óptica 3D (IVIS 200) después de

la administración del monómero Cy5.5-RGD [121].


26

Las imágenes de fluorescencia del pentapéptico cíclico RGD marcado con

Cy5.5 [122], adquiridas vía un dispositivo de detección intensificador acoplado

a una carga, concluyen que los análisis farmacocinéticos in vivo basados en la

imagen óptica dinámica pueden ser potencialmente útiles en la medicina

molecular.

Wu y cols [123] marcaron RGD monómero, dímero y tetrámero con Cy7. El

tetrámero Cy7-RGD fue el que mostró mayor afinidad por la integrina, mayor

acumulación de actividad en el tumor y el mejor contraste tumor-tejido no

blanco.

Waldeck y cols [124] reportaron que el Cy5.5-RGD combinado con métodos de

imagen óptica de infrarrojo cercano, permite una imagen específica de la

expresión de integrinas αvβ3 en macrófagos adquiridos de lesiones vasculares

y pude servir para estimar la actividad inflamatoria a partir de la unión de

macrófagos en lesiones ateroescleróticas.

En 2007 Ma y cols desarrollaron el fármaco fluorescente Alexa Fluor 680-G-G-

G-BN(7-14)NH2 y demostraron la habilidad de este nuevo conjugado de marcar

específicamente células de cáncer de mama de la línea T47D en ratones por

imágenes de fluorescencia [125].

2.2.2. Quantum Dots

Los quantum dots (QDs) o nanocristales son nanopartículas semiconductoras

fluorescentes (2-10 nm) con muchas propiedades ópticas únicas como, mostrar

fluorescencia brillante, son resistentes a la fotodecoloración y presentan un

ancho de banda de emisión estrecha [126-129]. Su longitud de onda de

emisión de fluorescencia puede ir de 400 nm a 2000 nm al cambiar tanto el

tamaño de partícula como la composición química, a temperatura ambiente.

Las partículas están hechas generalmente de cientos a miles de átomos (~200-

10,000 átomos) de elementos del grupo II y VI (por ejemplo CdSe y CdTe) o

elementos de los grupos III y V (por ejemplo InP y InAs) [130]. Como el cadmio


27

es potencialmente tóxico, Gao y cols [131] desarrollaron una clase de

conjugados con QDs que contienen un copolímero para protección in vivo y

múltiples moléculas PEG para mejorar la biocompatibilidad y circulación

(figura 1). Los QDs que son solubles en agua se pueden unir a péptidos

utilizando protocolos de bioconjugación estándar, como el acoplamiento de

maleimida-activada-QDs a grupos tiol [132]. Los QDs también pueden actuar

como sensores para detectar la presencia de biomoléculas con diseños que

incorporan donadores o receptores de energía. Por ejemplo, los QDs pueden

adaptarse para detectar la presencia del azúcar maltosa, al conjugar la proteína

que se une a la maltosa a la superficie del nanocristal [133].

Recientemente Cai y Chen reportaron un procedimiento detallado para la

preparación de QDs-RGD con PEG comercial [67]. Shah y cols [134] utilizaron

QDs-RGD para marcar células madre mesenquimatosas durante la replicación

y diferenciación en células osteogénicas, condrogénicas y adipogéncias. Young

y Rozengurt [135] demostraron que los conjugados de QDs-BN pueden marcar

receptores acoplados a proteína G en ratones, sugiriendo que la tecnología de

QDs puede ser adaptada para monitorear in vivo la unión del ligante a su

receptor.

Los QDs conjugados al péptido VIH Tat se unen rápido a las células y se

internalizan vía endocitosis. Ruan y cols utilizaron un sistema modelo de QDs-

Tat para examinar la captación celular y el transporte intracelular de

nanoparticulas en células vivas [136]. Dowdy y cols obtuvieron imágenes

dinámicas de fluorescencia y reporaron que el fármaco QDs-Tat se internalizó

por macropinositosis [137]. El QDs-Tat se unió a la superficie interna de

vesículas y quedó atrapado en organelos intracelulares. Un descubrimiento

importante es que los QDs unidos a las vesículas son transportados

activamente a lo largo de las trayectorias de los microtubos a una región

perinuclear asimétrica llamada centro de organización microtubular [138].

Además, se encontró que los QDs-Tat se unen fuertemente a membranas

celulares. Este resultado no solo brinda nuevos conocimientos del mecanismo

mediante el cual el péptido Tat transporta moléculas al interior de la célula, sino


28

que también, es un importante desarrollo de moléculas dirigidas conjugadas a

nanopartículas para marcar organelos intracelulares y adquisición de

imágenes.

2.2.3. Nanopartículas de oro

Las nanopartículas de oro (AuNPs) son inertes y no tóxicas debido a que el

Au(0) es captado por células humanas pero no causa citotoxicidad aguda [137].

Otra ventaja es que son de fácil síntesis [139]. Hay dos propiedades de las

nanopartículas que son muy relevantes: la resistencia a la oxidación y un

plasmón de resonancia visible [140]. El plasmón de resonancia para

nanoesferas de oro ordinarias se encuentra en 520 nm, en la mitad del

espectro visible, pero puede desplazarase hacia el rojo a la región de infrarrojo

cercano de 800 a 1200 nm y se han unido a moléculas biológicas para lograr

que interaccionen con un blanco biológico especifico. La conjugación de

moléculas a una AuNP se realiza por medio de una reacción espontánea de un

tiol (Cys) o una amina primaria con la superficie de la AuNP. Los tioles son las

moléculas estabilizadoras más importantes para las AuNPs de cualquier

tamaño. El uso de tioles conlleva a la formación de un enlace fuerte Au-S

[139,141]. La fluorescencia de las AuNPs se presenta desde el plasmón de

resonancia de superficie y se puede aumentar, apagar o disminuir según el

tamaño de la AuNP, la naturaleza de la capa unida a la AuNP, así como el

medio que rodea a la AuNp. Idealmente, la eficiencia de la energía transferida

de la AuNP a la capa orgánica solo depende de la extensión de la

superposición de la banda de emisión de la capa y de la banda de resonancia

del plasmón de superficie de la nanopartícula, que puede ser trasladada en una

transferencia de energía de resonancia de fluorescencia [142]. La emisión de

fluorescencia es muy importante en un estudio de AuNP conjugadas a péptidos

debido a que en general los péptidos contienen residuos aromáticos que

transfieren su energía a la AuNP de la siguiente manera: del nivel de

fluorescencia (péptido) al nivel de fosforescencia (péptido) y al nivel de

resonancia del plasmón de superficie (AuNP). La luz absorbida reemitida por lo

general está en el rango del infrarrojo cercano. Si la emisión de fluorescencia


29

de infrarrojo cercano no se apaga o se enmascara por la luminiscencia de

fondo, en particular en tejidos.

Surujpaul y cols [142] prepararon un sistema multifuncional de nanoparticulas

de oro conjugadas al péptido TOC y fue caracterizado por TEM, espectroscopia

UV-Vis, infraroja y de fluorescencia. Los espectros de emisión de fluorescencia

de AuNP y AuNP-TOC se obtuvieron ambos en solución y en tejido tumoral

AR42J de ratones. Los analisis de fluorescencia en tejido revelaron el

reconocimiento del conjugado AuNP-TOC por un tumor neuroendocrino. Los

resultados abren la posibilidad de utilizar AuNP-TOC en bioimagen.

De La Fuente y cols prepararon AuNPs conjugadas a la secuencia de

aminoácidos del péptido Tat para transportar NPs al núcleo de la célula [143] y

AuNP-RGD para posibles aplicaciones foto terapéuticas [144].

2.3. Sistemas multifuncionales con nanopartículas d e óxido de hierro

conjugadas a péptidos para imagen por resonancia ma gnética

Las NPs producen efectos multivalentes debido a las interacciones simultáneas

múltiples entre la superficie de la nanopartícula y la superficie de la célula

mientras que las señales en la imagen nuclear son el resultado de las

propiedades biológicas de péptidos únicos radiomarcados.

La técnica de imagen por resonancia magnética MRI es una modalidad no

invasiva capaz de brindar imágenes anatómicas de alta resolución.

Básicamente esta técnica utiliza el contraste del tejido que es generado a partir

de señales de resonancia magnética nuclear (NRM) recibidas de los núcleos de

hidrogeno localizados en diferentes ambientes fisiológicos de sistemas vivos.

La modalidad de MRI se puede extender a través del uso de NPs magnéticas

que mejoren la diferenciación entre tejido maligno y tejido sano. Las NPs de

óxido de hierro tienen propiedades magnéticas y se han estudiado para

aplicaciones biomédicas por su excelente biocompatibilidad y fácil síntesis [145

a 151]. El requerimiento principal de la MRI es la captación eficiente de NPs


30

magnéticas en las células y cuando una célula esta suficientemente cargada

con material magnético la MRI puede ser utilizada para seguimiento de la

célula.

Recientemente se conjugaron NPs de óxido de hierro superparamagnéticas

cubiertas de dextrán (CLIO) marcadas con Cy5.5 a aminoacidos carbono-13

terminal BN, mostrando que la BN-CLIO (Cy5.5) tiene la habilidad para marcar

y visualizar tumores en un modelo de adenocarcinoma ductal pancreático por

MRI [152].

Montet y cols [118] prepararon cRGD-CLIO (Cy5.5)-NPs y evaluaron la

expresión celular de integrinas en carcinoma de mama humano, la

farmacocinetica y la vasculariación tumoral. Los resultados indicaron que las

RGD-NPs magnetofluorescentes se dirigieron a las células tumorales que

expresaban integrinas in vivo y fueron detectadas por imagen de reflectancia

de fluorescencia, tomografía molecular de fluorescencia e imagen por

resonancia magnética. Estas imágenes permitieron analizar la naturaleza de la

vascularización del tumor, la vida media en sangre de las NPs (180 min) y la

depuración sanguínea (lenta).

La modificación de la superficie de agentes de contraste superparamagneticos

unidos al péptido Tat es una técnica efectiva para marcar magnéticamente el

interior de las células [153]. Las NPs de óxido de hierro superparamagneticas

ultrapequeñas (USPIO) se conjugaron al péptido Tat para marcar células T

CD4+. La captación en las células se determinó con espectrometría de plasma

acoplada por inducción de emisión óptica para medir el contenido de hierro. En

las células se detectó hierro cuando se utilizó USPIO-Tat-NPs. Además, se

demostró que las células T CD4+ retuvieron su función proliferativa y

regulatoria in vitro y no se observaron diferencias en su comportamiento

transmigratorio. El conjugado mostró potencial como agente de contraste para

MRI. Otro estudio en el mismo campo mostró la viabilidad de utilizar MRI para

monitorear células T in vivo con CLIO-Tat-NPs. Los cambios en la intensidad


31

de la imagen del bazo causados por el compuesto se midieron por MRI [154,

155].

2.4. Péptidos para imagen molecular con técnicas mu ltimodales

La imagen molecular representa el futuro de la imagen diagnóstica, ha

evolucionado desde la imagen anatómica funcional, así como los avances en

genética, biología molecular y celular, química y física. Diferentes técnicas de

imagen son, en general, complementarias más que competitivas. Agentes de

imagen dirigidos con doble marcaje permiten la validación cruzada y

comparación directa, por ejemplo, entre la imagen nuclear y la imagen óptica

de fluorescencia o MRI y fluorescencia, o imagen trimodal nuclear-MRI-

fluorescencia.

Por ejemplo, el SPECT y el PET brindan información funcional pero insuficiente

información anatómica. La tomografía computarizada (CT) es una técnica de

imagen tomográfica que utiliza una fuente de rayos x externa para producir

datos anatómicos tridimensionales. Los sistemas SPECT-CT y PET-CT

actualmente se utilizan en la práctica clínica, combinan una cámara gamma y

un sistema de transmisión de Rx integrado, montado en el mismo gantry

[156,157]. La ventaja de estos sistemas es la habilidad de adquirir una imagen

anatómica con CT y una imagen funcional con SPECT o PET secuencialmente.

La modalidad dual PET-NIR con péptidos fluorescentes ha sido reportada

recientemente por CAI y cols [158]. La imagen PET-NIRF se ha utilizado para

medir tejido fluorescente y la inmunofluorescencia se realizó con células

tumorales de bioglastoma humano U87MG implantados en ratones para

cuantificar la captación tumoral y en órganos principales de 64Cu-DOTA-QD-

RGD. Se obtuvo una excelente correlación lineal entre las mediciones de la

imagen PET in vivo y aquellas mediciones realizadas con la imagen NIRF ex

vivo y el tejido fluorescente homogeneizado [158]. Los autores concluyeron que

este fármaco con función dual redujo significativamente la toxicidad y supera la


32

limitante de penetración en tejido de la imagen óptica, requisito para la imagen

dirigida cuantitativa en tejido profundo [158].

La imagen tomográfica molecular fluorescente (FMT) puede monitorear la

función molecular en animales vivos con fármacos dirigidos fluorescentes

específicos. Sin embargo, los métodos de imagen macroscópicos tales como el

FMT generalmente muestran pocos detalles anatómicos. Para superar esto

McCann y cols [159] reportaron una técnica de imagen cuantitativa, estructural

y funcional al combinar FMT y MRI. Los autores demostraron que la imagen

FMT-MRI puede producir imágenes multimodales tridimensionales de cerebros

de ratones vivos indispensables para monitorear la morfología tumoral y la

actividad de las proteasas. La imagen tumoral FMT/MRI combinada brinda un

parámetro diagnóstico in vivo, que refleja los cambios histológicos en los

tumores y es alterado significativamente por la quimioterapia sistémica. La

imagen FMT/MRI combinada con fármacos dirigidos moleculares fluorescentes

puede ser útil para el desarrollo de fármacos para tumores cerebrales y otras

aplicaciones de imágenes neurológicas y somáticas [159].

La síntesis y caracterización in vivo de 18F-CLIO fue reportada por Devarag y

cols [160]. Estas NPs pueden detectar de manera muy precisa los ganglios

linfáticos. Las imágenes PET/MRI in vivo pueden identificar claramente

ganglios linfáticos pequeños (1mm) junto con información anatómica precisa.

La fluorescencia de infrarrojo cercano tiene el potencial de proporcionar

imágenes rápidas a bajo costo y no radioactivas de cáncer de mama. Bhushan

y cols [161] desarrollaron un sistema de detección de microcalcificaciones en

cáncer de mama utilizando la modalidad dual SPECT/fluorescencia/NIR.

2.5 Radioterapia de blancos moleculares

Los radionúclidos que emiten partículas β de alta energía, son útiles para el

tratamiento de tumores voluminosos y en este caso, el rango corto de las

partículas puede compensar la pobre penetración de la molécula en una masa

tumoral que posiblemente muestre heterogeneidad en la expresión del receptor


33

blanco. Por otro lado las partículas β de alta energía no son eficientes para

destruir células individuales de cáncer o micrometástasis, debido a que la

mayor energía asociada al decaimiento radiactivo se deposita fuera de la célula

maligna. Tomando en cuenta lo anterior los emisores de partículas β de baja

energía con mayor interés para su uso en radioterapia de blancos moleculares

son el 177Lu, 161Tb, 67Cu, entre otros. [162, 163,164].

Debido al rango de penetración en el tejido de la radiación β, se produce un

efecto cruzado, que alcanza una mayor proporción de células tumorales a

pesar de la distribución heterogénea del radiofármaco (figura 4). Otra ventaja

de la terapia con radiación β es la disponibilidad de varios radionúclidos que

emiten radiación con energías baja media y alta (tabla 2). Estas energías tienen

rangos de penetración en tejido desde 0.1 hasta 10 mm [165].

Figura 4. Representación esquemática de la longitud de trayectoria de la

radiación α, β y Auger, en un medio celular y subcelular (escala arbitraria). El

mayor depósito de energía de un electrón Auger ocurre muy cerca de unos

pocos nm, mientras que la de la radiación α y β, ocurre en trayectorias de

40-80 µm y 0.1-10 mm respectivamente [165].


34

Tabla 2. Propiedades de la radiación emitida de algunos radionúclidos

terapéuticos [165].

Radiación β- α Electrones

Auger

Energía Baja Media Alta Muy alta Muy baja

Ejemplos 169Er 131I 90Y 211At 125I

177Lu 186Re 188Re 213Bi 123I

67Cu 153Sm 32P 212Bi 111In

199Au 111Ag 89Sr 149Tb 55Fe

33P 64Cu 67Ga

Rango promedio

en tejido (mm) 0.1-0.3 0.3-1 1-5 0.03-0.08 <0.001

Característica LET bajo y fuego cruzado LET alto LET alto

Adecuado para

tratamiento de: Masas tumorales

Células

individuales y

agrupadas

Células

individuales y

agrupadas

LET = Transferencia Lineal de Energía (keV/µm)

Los electrones Auger que se emiten durante la captura electrónica o

decaimiento por transición isomérica, también se consideran partículas

adecuadas para la inactivación de células malignas. Estas partículas, debido a

su alto rendimiento por decaimiento, son en extremo radiotóxicas si en sus

trayectorias chocan con el ADN. Entonces, existe una alta probabilidad de que

induzcan rompimiento de varias dobles hebras e inactivación de las células

[165-167]. El mayor reto de utilizar electrones Auger para terapia es su rango

corto que los hace eficientes solo si el decaimiento radiactivo ocurre muy cerca

del ADN. Por esta razón un agente terapéutico con emisiones Auger debe de

internalizarse a la célula maligna, llegar al núcleo e idealmente incorporarse al

ADN.

Varios radionúclidos utilizados en medicina nuclear decaen por captura

electrónica y/o conversión interna (201Tl, 123I, 111In, 67Ga, 99mTc, etc.) como


35

consecuencia de la vacante generada en los orbitales atómicos internos por

estos tipos de decaimineto se emiten varios electrones Auger. Muchos de estos

electrones tienen energías muy bajas (∼ 20-500eV) con rangos en el orden de

las dimensiones subcelulares en tejido. Por lo tanto, el depósito de alta energía

muy localizada ocurre alrededor del sitio de decaimiento. El radionúclido que

más se ha utilizado para investigar los efectos de los electrones Auger es el 125I, el cual emite varios electrones de baja energía. [168].

El efecto Auger es causado por una vacante en la capa electrónica interna,

preferentemente en el orbital K, que perturba la estabilidad de la energía del

átomo. Cuando se recupera el balance de energía, un gran número de

electrones de baja energía y rayos x característicos se emiten de diferentes

capas electrónicas del átomo.

El término “electrones Auger” es un nombre conceptual para diferentes

transiciones (Auger, Coster-Kronig y super Coster-Kronig). Generalmente se

puede decir que las transiciones Auger ocurren entre los orbitales (L→K, M→L

etc). Debido a que cada orbital con más de dos electrones se puede dividir en

diferentes niveles de energía (la estructura fina), las transiciones entre los

electrones del mismo orbital también pueden ocurrir (transiciones Coster-

Kronig). La energía del electrón emitido es igual a la diferencia de energía entre

los orbitales involucrados. Por lo tanto, un gran número de combinaciones se

traducirá en un espectro de energía del electrón Auger compuesto de varios

electrones monoenergéticos de intensidad variable.

Los decaimientos por captura electrónica o conversión interna son las

principales fuentes de electrones Auger. Experimentalmente es importante

distinguir entre lo que puede ser un incremento normal en la dosis celular y el

efecto biológico Auger. Las energías electrónicas cercanas al potencial de

ionización (< 30 ev) tendrán un efecto limitado y los electrones con energías

mayores a 5 keV con un rango aproximado de 1 µm no contribuirán al efecto

local. La mayoría de los electrones Auger tendrán energías de


36

aproximadamente 20 keV, que es una energía ideal para ser totalmente

depositada dentro del tamaño de una célula [169].

2.5.1. Proceso Auger

Cuando los radionúclidos decaen por captura electrónica o conversión interna,

se crea una vacante en las órbitas atómicas internas del átomo residual.

Posteriormente el átomo excitado experimenta una serie de transiciones hasta

que alcanza el estado basal. Estas transiciones son de dos tipos: procesos

radiativos y no radiativos. Las transiciones radiativas, las cuales predominan

por vacantes en el orbital K, resultan en la emisión de rayos x característicos

(figura 5). Hay varias transiciones no radiativas, las más comunes son de los

tipos Auger, Coster-Kronig (CK) y super Coster-Kronig (super CK) (figura 5).

Cada una resulta en la expulsión de un electrón orbital. Estos procesos son

altamente probables cuando la vacante esta situada más allá del orbital L. En la

transición Auger, la vacante inicial en el orbital principal menor se llena con un

electrón proveniente del orbital principal superior y otro electrón es expulsado

del orbital principal superior. Mientras que en la transición CK, la vacante

originada en el orbital principal es llenada con un electrón del mismo orbital

principal y el electrón expulsado será del orbital principal superior. Finalmente,

en el caso de la transición super CK la vacante y los dos electrones están todos

en el mismo orbital principal [168].

Figura 5. Transiciones radiativas y no radiativas en procesos orbitales internos

atómicos. No existen transiciones CK en los orbitales K.


37

Las transiciones radiativas mueven la vacante al orbital principal superior sin

cambio en el número de vacantes, mientras que las no radiativas incrementan

el número de vacantes por uno. Por lo tanto, como las vacantes más internas

se filtran hacia el orbital de valencia, se desarrolla un fenómeno de cascada

que corresponde a la multiplicación de la vacante y la emisión de numerosos

electrones de baja energía, conocidos como electrones Auger. Generalmente

varios electrones Auger son emitidos para cada vacante del orbital interior

primario. Muchos de estos tienen muy bajas energías (menos de unos cientos

de eV), con valores intermedios de transferencia lineal de energía (LET) (10-25

keV/µm) y rangos extremadamente cortos (varios nm) en tejido biológico. Dado

que la cascada se completa dentro de ∼10-15 s, la región de las inmediaciones

del átomo es colmada de electrones Auger y como consecuencia se obtienen

densidades de energía local muy altas [168].

Varios radionúclidos emiten radiación Auger pero los de mayor interés para

tratamiento son el 125I, 123I y 201Tl (tabla 3). El 55Fe emite una gran cantidad de

radiación en forma de electrones Auger, pero no califica para la terapia en

humanos ya que tiene una vida media de 2.7 años. Para el 99mTc la energía de

radiación Auger liberada por decaimiento es menor del 1%, mientras que para

el 125I, 123I y 201Tl es de 3.7% a 19.9% [165].

De acuerdo con la AAPM (American Association of Physicists in Medicine) el 99mTc emite un promedio de 4 electrones Auger y 1.1 electrones CI por

decaimiento. Los electrones emitidos presentan energías de alrededor de 0.9

keV y 15.4 keV por decaimiento, respectivamente, con un cálculo de energía

total por decaimiento de 142.6 keV (incluyendo las contribuciones del rayo

gamma). El porcentaje total de energía Auger por decaimiento es 0.6 % y de CI

es 10.8 % [168].


38

Tabla 3. Ejemplos de emisores de electrones Auger [165].

Electrones Energía

(keV) % de energía*** Radionúclido

Auger/dec CI/dec Auger/dec* CI/dec* Total/dec** Auger/dec CI/dec

T1/2

55Fe 5.1 0 4.2 0 5.8 71.9 0 27a

67Ga 4.7 0.3 6.3 28.1 201.6 3.1 13.9 78h

99mTc 4.0 1.1 0.9 15.4 142.6 0.6 10.8 6h

111In 14.7 0.2 6.8 25.9 419.2 1.6 6.2 67h

123I 14.9 0.2 7.4 20.2 200.4 3.7 10.1 13h

125I 24.9 0.9 12.2 7.2 61.4 19.9 11.8 59.4d

201Tl 36.9 1.1 15.3 30.2 138.5 11.0 21.8 73h

dec = decaimiento, *AAPM TG6, **incluidas las contribuciones de rayos x y rayos gamma ***energía

Auger o CI en % del total de energía/ decaimiento.

2.5.2. Efecto Auger en la terapia de blancos molecu lares

La radioterapia dirigida que utiliza electrones Auger presenta múltiples ventajas

y retos. Durante la última década, el 99mTc ha sido utilizado como un agente en

imagen diagnóstica y recientemente se ha analizado su potencial como agente

terapéutico. Las propiedades físicas de 99mTc junto con su gran disponibilidad a

través de un generador in situ pueden representar un nuevo e importante

campo en la radioterapia dirigida.

Los tres requisitos principales para una radioterapia dirigida efectiva que utiliza

emisores de electrones Auger, se muestran en la tabla 4.


39

Tabla 4. Requisitos principales para radioterapia dirigida que utiliza emisores

de electrones Auger [165].

REQUISITO DESCRIPCIÓN

Selectividad y especificidad. La alta especificidad y selectividad

evitará la toxicidad de los tejidos sanos

alrededor del tumor.

Irradiaciones internas consecutivas La habilidad de desarrollar múltiples

ciclos de tratamiento en el tiempo. A

diferencia de la quimioterapia, la

radioterapia usualmente no provoca una

respuesta inmune.

Reducir la heterogeneidad en la

captación tumoral.

Que el blanco de la radiación se una a la

mayoría de las células de cáncer vivas.

El efecto del fuego cruzado de la

radiación β puede tener ventajas en

tumores grandes, pero no en pequeños.

Una vez localizado cerca del núcleo de las células, la efectividad terapéutica de

los emisores de electrones Auger ocurre principalmente debido a la extensiva

fragmentación del ADN que es difícil de reparar. Esto se puede explicar

basándose en el rango de los electrones Auger (que es de orden de nm) y en la

densidad de ionización de estos electrones [170]. De hecho, de acuerdo con

Buchegger y cols, la dosis absorbida local dentro del tejido tumoral después de

la irradiación con 125I es 22000 veces mayor que con una fuente externa de

70 Gy, utilizada en radioterapia externa. A pesar de estas ventajas la terapia

dirigida con electrones Auger muestra algunas limitaciones y retos,

especialmente al considerar terapia de tumores sólidos como a) Tiempos

largos de retención del trazador en el flujo sanguíneo, que conllevan a una

dosis absorbida más alta en la médula ósea (uno de los tejidos más

radiosensibles); b) Baja penetración en ciertas áreas tumorales que resulta en

dosis absorbidas no uniformes [169].


40

Debido a que los electrones Auger tienen un rango corto, presentan toxicidad

baja a la medula ósea en comparación con partículas β y α.

De acuerdo con Sofou, la principal restricción en la radioterapia dirigida es la

limitación de la toxicidad de la dosis absorbida en el tejido, que es el resultado

de la acumulación significativa de los portadores del radionúclido en órganos

vitales no blanco. Esto resulta en niveles de toxicidad que prohiben la

administración de dosis altas para alcanzar dosis absorbidas letales en el sitio

tumoral [171]. Algunas posible soluciones incluyen a) Marcado directo en un

solo paso con biomoléculas que resulten en una mejor biodistribución;

b) Estrategias para detener la angiogénesis sin afectar tejido sano;

c) Normalización de la vasculatura tumoral para permitir mayor penetración y

reducir la captación heterogénea en el tumor.

2.5.3. Rango de las partículas y proximidad al ADN

El rango de las partículas y la proximidad al ADN son dos características vitales

cuando el objetivo es la radioterapia dirigida. Las partículas β emitidas por el 90Y presentan un rango promedio de 215 células, mientras que las del 131I

irradian 40 células y el 211As (emisor de partículas α) irradia solo 3 [172]. Los

electrones Auger permiten que la radioterapia dirigida sea más eficiente con

daño mínimo a tejido sano debido a su corto rango, por lo que la radiotoxicidad

de los electrones Auger (cerca del 90%) se crea por mecanismos indirectos,

especialmente el denominado efecto bystander.

El efecto bystander es un fenómeno que ocurre cuando las células con daño

radiobiológico inducen muerte celular en células no irradiadas a través de la

liberación de citosinas y radicales libres [169]. Boyd demostró que el 123I indujo

la liberación de citotoxicinas bystander, lo cual sugiere el posible uso de 123I-

MIBG (metaiodobenzilguanidina) para el tratamiento de pacientes con tumores

neurales. [173]. Chen mostró la ausencia de citotoxicidad en tejidos sanos

próximos cuando utilizó el complejo regulador del poro nuclear para transportar


41

una proteína del citoplasma al núcleo. Este complejo poro nuclear permitió la

penetración de moléculas con diámetro menor de 40 a 60 kDa por difusión

pasiva, y para moléculas con dimensiones mayores requirió transporte activo

[99]. Los efectos tóxicos de emisores de electrones de baja energía se han

asociado no solo con la unión covalente entre el radioisótopo y el ADN celular,

sino también con la toxicidad proveniente de las moléculas unidas al emisor de

electrones Auger. Estudios recientes han mostrado que algunas moléculas son

capaces de penetrar al núcleo celular y no necesitan unirse covalentemente al

ADN para inducir radiotoxicidad [169]. Buchegger utilizó nucleótidos

radiomarcados y enfrentó algunas limitaciones, incluyendo la incorporación al

ADN durante la fase S del ciclo celular [165]. Esto puede significar que no solo

el rango y la proximidad al ADN son factores clave en la radioterapia dirigida,

también influye la fase del ciclo celular. La incubación con tiempos

suficientemente largos para cubrir de 2 a 3 ciclos celulares se utilizaron para

estudios in vitro y la administración del fármaco para sincronizar todas las

células a la misma fase del ciclo [165].

Los estudios en tejidos y células han mostrado que una vez que el emisor de

electrones Auger está en el citoplasma se observan efectos similares a

aquellos inducidos por radiaciones de LET bajo. Cuando se introducen cerca

del ADN, las curvas de sobrevivencia serán similares a aquellas obtenidas con

partículas α de LET alto [174]. De acuerdo con Boswell y cols, la tasa de dosis

absorbida en la célula cuando se irradia con 99mTc, 123I, 111In, 67Ga y 201Tl es de

94, 21, 18, 74 y 76 veces mayor, respectivamente, cuando la irradiación ocurre

en el núcleo, que cuando ocurre en la membrana celular (figura 6) [175].


42

Figura 6. Representación esquemática de la relación entre la distancia del sitio

de decaimiento y la energía depositada en el ADN. Se puede observar que si

se mueve el sitio de irradiación del núcleo a la superficie celular, la energía

depositada al ADN se reduce significativamente.

De acuerdo con Buchegger el depósito de energía de electrones de emisores

Auger ocurre en esferas de 1 a 2 nm de diámetro y una vez incorporados al

ADN, la energía depositada en la doble hebra puede ser igual o mayor de

1 MGy.

Los electrones emitidos CI (aún cuando decaigan en el citoplasma celular)

pueden alcanzar el núcleo y por lo tanto el ADN. Sin embargo, estos electrones

presentan una eficacia radiobiológica (RBE) similar a la de partículas β y

rayos x. Estos electrones depositan de 106 – 109 cGy en un volumen de

algunos nm3 alrededor del sitio de decaimiento. Por otro lado, los electrones

emitidos por captura electrónica presentan LET alto y por lo tanto mayores

valores de eficacia radiobiológica [169].

La AAPM propuso valores de RBE cercanos a 10 para efectos determinísticos

de electrones Auger y 20 para efectos estocásticos. Estos valores solo aplican

para electrones Auger obtenidos por captura electrónica, debido a que aquellos


43

adquiridos por conversión interna se clasifican como radiación de LET bajo y

por lo tanto presentan un factor de peso de 1 [165].

2.5.4. Muerte celular inducida por radiación

La radiación ionizante utilizada en la terapia contra el cáncer deposita su

energía en el ADN del núcleo celular, produce rupturas simples y dobles en las

hebras del ADN, que si no es capaz de repararse produce la muerte celular.

Además, la radiación induce daño en la membrana celular, que puede activar

rutas de muerte celular.

En los últimos años, se ha hecho evidente que tomar en cuenta sólo la

inducción de apoptosis y necrosis como efecto radioterapéutico de los agentes

anticancerígenos, es insuficiente. Por lo tanto, se han considerado también, la

catástrofe mitótica y la autofagia basados en los criterios morfológicos, debido

a la falta de equivalencia entre las alteraciones estructurales y las

características bioquímicas de la muerte celular. Además se ha incluido en esta

clasificación la senescencia (vejez celular), que es un tipo de muerte celular

proliferativa que puede ser inducida por radiación (tabla 5) [176].

Efecto del P

éptido Tat(49-57) sobre la B

iocinética y Dosim

etría de Radiofárm

acos Análogos de la B

ombesina

44

Tabla 5. C

aracterísticas de las rutas de muerte celular.

Apoptosis Necrosis Catástrofe mit ótica Autofagia Senescencia

Reducción del volumen celular y nuclear

Hinchazón citoplasmática y de organelos celulares

Formación de una “Célula Gigante”

Vacuolización masiva del citoplasma (formación de autofagosomas)

Aplastamiento, incremento del tamaño celular

Invaginación, mantenimiento de la integridad de la membrana

Pérdida de la integridad de la membrana

Separación fallida de los cromosomas durante la mitosis

Los hidrolasas lisosomales digieren el contenido celular y lo reciclan para uso interno

Acumulación de heterocromatina foci

Condensación de la cromatina, fragmentación nuclear, fragmentación del ADN cromosomal

Degradación aleatoria del ADN

Micronucleación, multinucleación

Granularidad Incremento de la actividad de la β-galactocidasa

Sin respuesta inmune Respuestas inmunes Ejecutada vía apoptosis retardada o necrosis retardada

Métodos de detección: Annexina marcada Ensayos de fragmentación del ADN Ensayos de la activación de caspasa

Métodos de detección: Permeabilidad temprana a colorantes vitales Microscopía eletrónica

Métodos de detección: Visualización de células multinucleares y células con micronúcleos

Métodos de detección: Localización de LC3

Métodos de detección: Senectud asociada a la actividad de β-galactocidasa


45

2.5.5. El papel de la apoptosis en la radioterapia dirigida

La respuesta tumoral a la radiación de partículas depende de múltiples factores

que incluyen la dosis absorbida, la tasa de dosis, la penetración tumoral del

radiofármaco, la localización intracelular del radionúclido y la radiosensibilidad

del tumor.

Los daños al ADN estimulan diferentes rutas celulares, como el arresto del ciclo

celular para reparar los daños (de la fase G1 a la fase S y de la Fase G2 a la

mitosis) o con lleva a la muerte celular programada, conocida como apoptosis.

La apoptosis es un mecanismo de muerte celular asociado con un proceso

inflamatorio nulo o mínimo que ocurre durante la embriogénesis y cuando

algunos agentes adversos arriesgan el futuro celular. Todas las rutas

apoptóticas muestran transducción de señales proteínicas. En el caso de los

daños inducidos por radiación, el gen P53 tiene un papel crucial. Además se

sabe que las células linfoides son más susceptibles de entrar en apoptosis,

mientras que las células epiteliales (que también sufren arresto celular),

generalmente mueren debido a la reproducción fallida después de una o varias

divisiones celulares. La eficacia de la radiación para inducir muerte celular

depende también de la tasa de dosis y de la densidad de ionización [169].

Los procesos apoptóticos se pueden observar en diferentes tumores,

especialmente dentro de áreas hipóxicas cerca de zonas necróticas. Las

proteasas cisteina-acido aspártico (conocidas como caspasas) se activan

durante la apoptosis, son responsables de la perturbación del citoesqueleto

celular, el aglutinamiento de la cromatina, la ruptura del ADN intranucleosomal,

y finalmente la desintegración celular en pequeños remanentes de membrana,

que serán removidos por macrófagos [170].

Urashima y cols estudiaron la apoptosis radioinducida y observaron que el

proceso apoptótico provocado por la radiación gamma después de una

exposición a 125I parece activar la caspasa 3 sin correlación con la

radiosensibilidad de la célula, sin embargo una vez que el 125I se incorpora al


46

ADN, la apoptosis parece ser dependiente de la dosis y se correlaciona con la

radiosensibilidad celular vía la caspasa 3. Este estudio señala algunas

diferencias entre la irradiación que utiliza rayos gamma y electrones Auger.

Además demostró que dependiendo del lugar del sitio donde ocurra el depósito

de energía se, pueden activar diferentes rutas apoptóticas [177].

2.5.6. La necrosis en la radioterapia dirigida

La necrosis es considerada generalmente como la muerte celular accidental, no

regulada [178]. Cuando la necrosis es inducida, se produce rápidamente la

permeabilización de la membrana plasmática, lo que conduce a la salida del

contenido celular y la inducción de la inflamación. Además, la necrosis carece

de marcadores bioquímicos específicos y sólo puede detectarse mediante

microscopía electrónica. La necrosis es usualmente definida como un tipo de

muerte celular que implica la ruptura de la membrana plasmática, sin las

características de la apoptosis (picnosis, contracción de la célula y la formación

de cuerpos apoptóticos) y sin riesgos de vacuolización autofágica [179]. Las

principales características de la necrosis incluyen el aumento en el volumen

celular (oncosis), que finalmente culmina en la ruptura de la membrana

plasmática y el desmantelamiento desorganizado de organelos hinchados. La

necrosis inducida por radiación se puede subdividir en necrosis temprana y

necrosis tardía. La necrosis temprana es una muerte celular ultra-rápida, que

es inducida dosis altas de irradiación es decir, más de 100 Gy [180]. La

necrosis tardía es una muerte celular lenta y uno de los mecanismos por los

cuales se ejecuta la catástrofe mitótica [181].

2.5.7. La catástrofe mitótica inducida por radiació n

La catástrofe mitótica es la muerte célular que ocurre dentro de la mitosis o

como resultado de la mitosis aberrante [179]. La mitosis anormal tiene

diferentes rutas que inducen cambios que incluyen a la anafase, rezago del

material cromosomal y mitosis multipolares (figura 7) [182, 183]. Además no se

produce la separación cromosomal correcta ni división celular, lo que conlleva a


47

la formación de células gigantes con morfología nuclear aberrante, con

múltiples núcleos o varios micronúcleos [184, 185, 186, 187, 188]. La división

de estas células puede formar colonias abortivas, que viven varias horas o días

pero eventualmente mueren por necrosis o apoptosis retardada.

Figura 7. Catástrofe mitótica producida por irradiación. Las células control

normalmente contienen un único núcleo redondo (izquierda). Célula irradiada

con múltiples núcleos (punta de flecha) y micronúcleo (flecha) (derecha) [184].

Las células después de irradiarlas entran prematuramente en mitosis, con ADN

dañado que induce aberraciones cromosomales que culminan en la catástrofe

mitótica. Esto aplica para radiaciones de diferentes densidades de ionización y

tasas de dosis.

2.5.8. Cuantificación del efecto Auger

En la radioterapia es común utilizar dosis absorbida como el parámetro

relacionado con los efectos biológicos y los resultados terapéuticos. El uso de

diferentes características de la radiación es tratado con el concepto de

efectividad biológica relativa (RBE = RELATIVE BIOLOGICAL

EFFECTIVENESS), donde el efecto biológico de la radiación a prueba se

compara con aquella radiación de LET bajo. Los electrones individuales son

principalmente radiación de LET bajo (energía < 10 keV/µm). Solo una


48

pequeña fracción de los electrones Auger tendrá LET entre 10 y 30 keV/µm y

poco incremento de RBE. El efecto biológico Auger se explica entonces como

el efecto colectivo de varios electrones de LET bajo que darán una producción

más efectiva de varios rompimientos de doble hebra del ADN y por lo tanto el

valor de RBE será comparado con el de la radiación de LET alto (como los

emisores α).

Un problema al utilizar dosis absorbida junto con el efecto Auger es que nos

limitamos a confiar en los cálculos tanto de la fuente (rendimiento de electrones

Auger de baja energía) y en cómo la energía es absorbida, debido a que es

casi imposible medir estos parámetros en condiciones fisiológicas. El potencial

de ionización de la molécula de ADN y la habilidad de los electrones Auger de

ocasionar rompimientos de la doble hebra varía dependiendo de las

condiciones químicas y fisiológicas [189].

2.6. Metodología de cálculo de dosis absorbida de r adiación

En dosimetría interna la cantidad principal de interés es la dosis absorbida y la

dosis equivalente. La dosis absorbida (D) está definida como D=dЄ/dm, donde

dЄ es la energía promedio impartida por la radiación ionizante a la materia de

masa dm. La unidad de D es el Gray (Gy).

La dosis equivalente (H) es la dosis absorbida multiplicada por un factor de

calidad (Q), y es la estimación de la efectividad de diferentes tipos de radiación

de causar efectos biológicos: H = DQ. Debido a que el factor de calidad es

adimensional, las unidades de esta cantidad son las mismas que la D, sin

embargo la unidad especial es el Sievert (Sv) [190].

Entonces la ecuación general para la dosis absorbida en un órgano es:

mEnAkDi

iii

==== ∑∑∑∑ φφφφ~ ec 2.1


49

Donde:

D Es la dosis absorbida (Gy)

A~

Es la dosis acumulada (MBq·s)

n Es el número de radiaciones con energía E emitida por transición nuclear

E Es la energía de emisión (MeV)

Φ Es la fracción de energía absorbida en el blanco

m Es la masa de la región del blanco (Kg)

k Es la constante de proporcionalidad (kg/MBq·s MeV)

La aplicación terapéutica de los radionúclidos, especialmente los emisores de

partículas α en medicina nuclear y la utilización reciente de haces de protones y

haces de partículas cargadas en radioterapia ha destacado la necesidad de un

formalismo dosimétrico bien definido y acompañado por cantidades con nombres

especiales correspondientes, aplicable a efectos determinísticos. Se han

propuesto varias soluciones, por ejemplo la NCRPM (National Council on

Radiation Protection and Measurements) y la ICRP (International Commission on

Radiological Protection) han propuesto la unidad Gray- Equivalente (Gy-Eq) para

referirse a la dosis absorbida ponderada por la efectividad radiobiológica [191,

192]. En 2007 la ICRP propuso el uso Gy como la unidad de dosis absorbida

ponderada por efectividad radiobiológica para efectos biológicos determinísticos.

En el campo de la terapia de haces de protones, el término “dosis equivalente”

se ha utilizado con la unidad Gy-Eq o Cobalto-Gray-Equivalente (CGE)

[193,194].

En el contexto de la terapia de haces iónicos, un grupo de trabajo en conjunto

con la IAEA (International Atomic Energy Agency) y la ICRU (International

Commission on Radiation Units and Measurements), propusieron un formalismo

para resolver la cuestión de las cantidades y unidades usadas para predecir

efectos determinísticos de la radiación ionizante. Este grupo introdujo la cantidad

de dosis isoefectiva (DIsoE), que fue definida como el producto de las dosis

absorbida (D) y un factor de ponderación isoefectivo (wIsoE). Este factor de peso

se definió para considerar todos los factores que pueden influir en los efectos

determinísticos clínicos asociados con una dosis absorbida dada. En la terapia


50

con radionúclidos se podría incluir este factor pero no estaría limitado al tipo de

radiación, la tasa de dosis y la distribución espacial de la dosis absorbida [195].

La condición de irradiación de referencia para determinar wIsoE fue definida para

fotones que depositan 2 Gy en el tejido por fracción y 5 fracciones por semana.

Se recomendó que la dosis isoefectiva se expresara en Gy [195].

A pesar de que wIsoE es similar en su concepto a la efectividad radiobiológica,

este difiere en que la radiación de referencia está bien definida y

tradicionalmente ha sido utilizada en la terapia con medicina nuclear como el

estándar para predecir consecuencias biológicas probables de una dosis

absorbida particular. De la misma manera, el comité MIRD (Medical Internal

Radiation Dose) recomienda que el formalismo de dosis isoefectiva se adopte

para su uso en medicina nuclear terapéutica. No obstante, el comité MIRD

recomienda que para corresponder con el formalismo establecido para efectos

estocásticos, la dosis isoefectiva sea expresada en una nueva unidad especial

conocida como el barendsen (Bd).

Se recomendó la utilización de este nombre en reconocimiento a las

contribuciones hechas por Gerrit W. Barendsen a la radiobiología de radiación

de LET alto [195].

2.6.1. Sistema MIRD para cálculo de dosis interna

La ecuación para la dosis absorbida en el sistema MIRD es aparentemente

simple: SAD~==== [190]. En este esquema la radiación ionizante deposita energía

en un blanco, pero es independiente del tiempo. Los volúmenes blanco son

modelos anatómicos de órganos humanos y cuerpo entero. La D se define

como el producto de los factores dependientes del tiempo (biocinéticos) por

aquellos factores independientes del tiempo (físicos).

SAD~==== ec 2.2

mEnkSi

iii

==== ∑∑∑∑ φφφφ ec 2.3


51

Los factores biocinéticos corresponden a la actividad acumulada Ã y los

factores físicos son el tipo y energía de la emisión, masa del blanco, fracción de

la energía depositada en el blanco por la partícula emitida, geometría de la

fuente y del blanco, distribución de la fuente etc. (S).

Existen una variedad de métodos conocidos como modelos

radiofarmacocinéticos que describen el comportamiento del vector que acarrea

a la fuente radiactiva dentro de un organismo, mediante los cuales se puede

conocer la actividad acumulada.

2.6.2. Modelos radiofarmacocinéticos

Un modelo radiofarmacocinético, es la descripción matemática de la

distribución biológica de algún radiofármaco en función del tiempo, desde su

introducción al cuerpo hasta su eliminación biológica o física [196]. Se dividen

en tres tipos:

1. Empíricos o de integración directa

2. Analíticos o análisis de regresión por “mínimos cuadrados”

3. Compartimentales o modelo compartimental

2.6.2.1. Modelos empíricos

Al utilizar la metodología de los radiotrazadores, puede obtenerse una serie de

medidas de concentración del radionúclido en los diferentes tejidos y graficarlas

en función del tiempo post-administración. Las curvas resultantes de actividad-

tiempo pueden ser caracterizadas como un modelo farmacocinético empírico,

puesto que es una descripción matemática de la distribución del radionúclido

incorporado cuya información derivó de la medición directa [197].

El área bajo la curva actividad vs tiempo puede ser evaluada por métodos de

integración numérica simples y obtener la actividad acumulada (~A ), parámetro

biocinético necesario para el cálculo de la dosis absorbida. Sin embargo, la


52

precisión de tal integración es completamente dependiente del adecuado

cálculo de la fracción (o porcentaje) de actividades acumuladas en los órganos

fuente y en las muestras de excreta. Es importante tomar suficientes muestras

de la distribución y la retención del radiofármaco durante el transcurso del

estudio.

El sistema MIRD fue desarrollado principalmente para su uso en la estimación

de dosis de radiación recibida por pacientes cuando se les administra un

radiofármaco.

2.6.2.2. Modelos analíticos

Para superar la limitante de los métodos empíricos, en cuanto a extrapolar

razonablemente un dato más allá del último tiempo de lectura, los datos

biológicos obtenidos pueden ajustarse a una función analítica, también

conocida como “función de distribución”. En el modelo analítico queda implícito

que la curva de actividad vs tiempo puede ser ajustada a una función

dependiente del tiempo antes de la primera medición y después de la última

medición. Los procesos biológicos siguen una cinética de primer orden, por lo

que las curvas de actividad vs tiempo pueden ajustarse a una suma de

exponenciales, así: [197]

(((( )))) t

j

jhh

jheAtq )(

)(

λλλλ∑∑∑∑==== ec 2.4

Donde:

qh(t) = es la función de distribución de la región fuente rh, que es la actividad

corregida por decaimiento radiactivo (Bq) en la región fuente rh al tiempo t post-

administración del radiofármaco; Ah(j) es la actividad (Bq) para el j-ésimo

componente exponencial en la región fuente rh al tiempo t=0; y λh(j) es la

constante de eliminación efectiva (h-1) del j-ésimo componente exponencial de

la curva actividad vs tiempo en la región fuente, que es la fracción de la

actividad eliminada por unidad de tiempo para el j-ésimo componente

exponencial de la curva actividad vs tiempo.


53

Los datos de actividad vs tiempo al ser graficados en papel semilogarítmico (la

actividad se grafica en la escala logarítmica de las ordenadas y el tiempo en la

escala aritmética de las abscisas), producen un segmento lineal para cada

componente de la función de distribución qh(t) y el número de componentes

exponenciales corresponde al número de segmentos lineales identificables, de

esta forma, se puede obtener, por arreglo de mínimos cuadrados, la función

correspondiente [197].

Si se incorpora la función de distribución en la expresión de actividad

acumulada, esta puede escribirse como:

∫∞

=∞0

)(),0(~

dttqeA h

tλ ec 2.5

Evaluando la integral resultante para el modelo biexponencial antes propuesto:

)2(

)2(

)1(

)1(~

h

h

h

h AAA

λλλλλλλλ++++==== ec 2.6

Y en términos generales:

∑∑∑∑====∞∞∞∞j jh

jhAA

)(

)(),0(

~

λλλλ ec 2.7

2.6.2.3. Modelos compartimentales

En este modelo el sistema biológico es tratado como compartimentos

interconectados como un ensamble de unidades físicas y químicas idénticas.

Cada ensamble corresponde a la entidad anatómica identificable (ej. un órgano

como el hígado), la entidad fisiológica identificable (ej. sistema retículo

endotelial) o la entidad física identificable (ej. agua del espacio extracelular).

Sin embargo, referirse a la entidad identificable o un compartimento discreto es

únicamente conceptual. El modelo compartimental está caracterizado por el

número de compartimentos y por las probabilidades de transición, o

velocidades de intercambio, entre los compartimentos, lo cual puede ser

representado matemáticamente como el grupo de ecuaciones diferenciales

ordinarias acopladas [197, 198].


54

2.7. Dosimetría celular

La biodistribución y las medidas cinéticas de radiofármacos en pacientes son

difíciles de lograr. Una dosimetría de alta calidad de radiofármacos emisores de

rayos gamma o positrones sigue siendo muy difícil de desarrollar en un entorno

clínico estándar. Para dosimetría de radiación Auger, es esencial el

conocimiento del porcentaje de células que están marcadas en los tejidos

individuales. Además la irradiación Auger más importante ocurriría solo para

emisores asociados al ADN. En contraste con las células marcadas, las células

no blanco estarían mínimamente o no irradiadas por los decaimientos de

electrones Auger [165].

Dado que la actividad acumulada en un órgano es conocida como la dosis

promedio de radiación absorbida nuclear, se puede calcular, si se estima el

porcentaje de radiación Auger asociado al ADN. Los valores S para dichas

situaciones ya se conocen [199]. Para la estimación del riesgo de efectos

estocásticos a largo plazo, un factor de calidad (wR) de 20 se puede aplicar

para radiación Auger asociada al núcleo celular. Esto puede generar el

estimado del riesgo de la dosis de radiación para un paciente expuesto a un

procedimiento diagnóstico de medicina nuclear con emisores de electrones

Auger [91].

Para los cálculos de lo efectos citotóxicos determinísticos de la radiación

Auger, el conocimiento de la dosis de radiación absorbida nuclear promedio en

un órgano es insuficiente. Es esencial tener el estimado del porcentaje de

células que son marcadas con radiacióm y conocer las tasa de captación del

radiofármaco dentro de estas células. Asimismo, la consideración de los

efectos de los emisores de radiación Auger con tiempos de vida media largo,

tal como el 125I, las células con captación insuficiente pueden evitar

citotoxicidad por la división celular [200]. La división celular produce dilución de

los decaimientos de radiación Auger en múltiples células hijas. Igualmente si se

considera la sobrevivencia clonal, la probabilidad de sobrevivencia de al menos


55

una de varias células hijas será mayor que aquella de una sola célula madre

expuesta al mismo número de decaimientos Auger. El manejo dosimétrico

preciso de la división celular durante la radiación Auger de larga duración es

por lo tanto muy compleja. Esta requiere la atención al retraso de la división

celular provocado por la irradiación continua que causa rompimientos de la

doble hebra en el ADN. Estos rompimientos inducen señales de detención del

ciclo en diferentes puntos control que permiten la reparación.

Los efectos biológicos de la radiación Auger han sido medidos con 125I o 123I-IdUrd. La vida media de 123I permite que la mayoría de su emisión de

radiación Auger ocurra en un día, mientras que la duplicación celular de

tumores ocurre frecuentemente de uno a varios días. En contraste, debido a la

vida media larga del 125I (60 días), la liberación de energía ocurrirá durante

varios días o semanas siempre que el radiofármaco permanezca asociado al

ADN. Para el 125I-IdUrd se calculó que con 120 decaimientos de radiación

Auger que ocurrieron cercanos al ADN se logró esterilizar una célula [201].

Este cálculo está basado en el conocimiento del tiempo que tarda una división

celular normal y el tiempo de división bajo condiciones de irradiación Auger.

2.7.1. Esquema MIRD celular

El formalismo matemático mediante el cual se calcula la dosis absorbida en

una célula es el mismo que se emplea en dosimetría interna (descrito arriba)

entonces:

)(~

hkh rrSAD ←⋅= ec. 2.8

Donde Ã es la actividad acumulada y S es la dosis absorbida en la región

blanco rk por unidad de actividad acumulada en la región fuente rh. Los valores

S usados en el cálculo se encuentran en el MIRD celular y existen para

diferentes dimensiones celulares que contienen distribuciones de radiactividad

en el núcleo, citoplasma o membrana [202].


56

2.8. Simulación Monte Carlo

El método Monte Carlo es una forma genérica de nombrar procedimientos

matemáticos o métodos numéricos cuya característica común es la utilización

de números generados aleatoriamente y el muestreo de distribuciones de

probabilidad. Se hace uso de variables aleatorias definidas en un espacio

dimensional finito y se calcula su valor esperado [203]. La principal limitación

del método Monte Carlo es la obtención de suficiente precisión en los

resultados. Entre más precisión se requiere, más eventos o muestreos deben

hacerse y eso, en problemas complejos, lleva a utilizar mucho tiempo de

cómputo. Existen opciones para reducir esos tiempos, como los métodos de

reducción de varianza, la utilización de modelos simplificados o la subdivisión

del problema en partes menos complejas.

La simulación Monte Carlo del transporte de radiación se basa en que la

trayectoria de una partícula es vista como una secuencia aleatoria de

desplazamientos libres que terminan con un evento de interacción donde la

partícula cambia su dirección de movimiento, pierde energía y puede generar

partículas secundarias. Todo ello se realiza al aplicar las leyes de la física,

sobre las funciones de probabilidad determinadas por las secciones eficaces

adecuadas, dependiendo del medio, la energía de la partícula y la disposición

geométrica del sistema [204,205].

Los códigos de simulación Monte Carlo desarrollados para el transporte de

radiación, contienen modelos de interacción para definir las funciones de

distribución de probabilidad para las distintas variables aleatorias que

intervienen en cada proceso y permiten obtener valores promedio de

observables de interés como pueden ser la posición de las partículas después

de cada interacción, el momento y las pérdidas de energía de las partículas

primarias o las secundarias generadas en algunas interacciones [206].


57

2.8.1. Códigos de simulación del transporte de radi ación

Entre los códigos o programas de simulación Monte Carlo para el transporte de

partículas en medios materiales están: EGS4, EGSnrc, PENELOPE, NOREC,

MCNP y GEANT.

El MCNP fue desarrollado en Los Alamos, E.U. para simular solo neutrones; sin

embargo, actualmente puede utilizarse para simular hasta 36 tipos de

partículas en intervalos de energías de unos keV hasta el orden de cientos de

MeV en materiales muy diversos [207].

El GEANT fue elaborado en el CERN (European Organization for Nuclear

Research) para aplicaciones con altas energías y se puede utilizar para simular

haces de diferentes tipos de partículas (muones, piones, neutrinos, etc.), desde

energías de unos cuantos cientos de eV hasta cientos de TeV para algunas

partículas.

El NOREC es específico para aplicaciones de microdosimetría, pero su manejo

es difícil y está limitado a simular en agua fotones y electrones.

Con PENELOPE se pueden simular cascadas de fotones, electrones y

positrones en casi cualquier medio material sólido, líquido o gaseoso, en

geometrías que pueden definirse con superficies cuádricas, es decir

determinadas por una ecuación de segundo grado. Este código originalmente

fue desarrollado para simular electrones, lo cual se puede hacer evento por

evento, si son de baja energía [208].

Una vez seleccionado el sistema a simular, se hace un modelo geométrico y se

genera un archivo (o tarjetas de entrada), en el lenguaje o formato del código;

se definen los materiales que rellenan los volúmenes definidos y se generan los

archivos de dichos materiales de acuerdo al formato requerido. Básicamente

para cada material se introducen los elementos químicos que lo forman, el

porcentaje en peso atómico de cada elemento y su densidad. Se establecen las


58

condiciones iniciales de las fuentes como son la energía, posición, tipo de

partícula, número de partículas y se declaran las energías de corte o absorción.

Finalmente se estipula el grado de detalle con que debe efectuarse la

simulación y dependiendo del código, se establecen los proceso de interacción

necesarios e incluso alguna teoría física específica para la simulación.

2.8.2. Código de simulación Monte Carlo PENELOPE

PENELOPE (acrónimo del ingles PENetretion and Energy LOss of Positrons

and Electrons y fotones en la actualidad) es un código Monte Carlo de

propósito general capaz de simular cascadas de fotones y electrones en el

rango de unos pocos cientos de eV hasta 1 GeV en casi cualquier medio

material amorfo cuya composición química sea conocida. PENELOPE destaca

frente a otros códigos por su descripción del transporte de interfaces materiales

y el transporte de partículas de baja energía [209].

PENELOPE es un paquete de subrutinas, controladas por un programa

principal que controla la evolución de las historias de las partículas y acumula

en contadores las magnitudes de interés en cada aplicación concreta. Estas

subrutinas están escritas en el lenguaje de programación FORTRAN77 y son

distribuidas por la Agencia de Energía Nuclear de la Organización para la

Cooperación y el Desarrollo Económico (Nuclear Energy Agency, NEA-OECD).

Sus autores son Francesc Salvat y José M. Fernández-Varea de la Facultad de

Física de la Universidad de Barcelona y Josep Sempau del Instituto de

Técnicas Energéticas de la Universidad Politécnica de Cataluña [209].

La simulación de electrones y positrones con PENELOPE incluye los siguientes

tipos de interacciones:

• Dispersión elástica fuerte (θ > θc).

• Dispersión inelástica fuerte (θ > θc).

• Emisión por Bremsstrahlung (radiación de frenado).

• Interacción Delta.

• Interacción artificial débil (θ < θc).

• Ionización de capas internas.


59

• Aniquilación (sólo para positrones).

• Interacciones auxiliares (mecanismos adicionales de interacción que pueden

ser definidos por el usuario, por ejemplo, interacciones fotonucleares).

La simulación de fotones incluye los siguientes tipos de interacciones:

• Dispersión elástica (Rayleigh).

• Dispersión inelástica.

• Efecto fotoeléctrico.

• Producción de pares.

• Interacción Delta.

• Interacciones auxiliares.

Cada interacción puede dar lugar a partículas secundarias, las cuales serán

simuladas posteriormente. Por ejemplo, la aniquilación de un positrón dará

lugar a dos fotones gamma y el efecto fotoeléctrico dará lugar a un electrón

libre. Para poder emplear PENELOPE se debe construir un programa principal,

el cual se encargará de ir llamar de manera adecuada a las subrutinas de

PENELOPE, e irá almacenando la información sobre las trayectorias de las

partículas simuladas. Este programa principal debe dar a PENELOPE unos

ficheros de entrada con información sobre la geometría del sistema y de los

materiales a utilizar. También debe de proporcionar a las subrutinas de

PENELOPE los parámetros necesarios para su funcionamiento, como son: tipo

de partícula a simular, posición y dirección de la misma. Mediante el uso

adecuado de estas herramientas de simulación, el usuario puede crear el

entorno de simulación que le permita realizar los estudios deseados. En este

trabajo se ha empleado como programa principal el penmain, que viene

incluido con PENELOPE, ligeramente modificado para poder calcular la

atenuación y la energía depositada por haces de electrones de bajas energías

tras atravesar un determinado espesor del material estudiado (membrana,

citoplasma y núcleo celular). PENELOPE incluye la subrutina para la

generación de series de números aleatorios que está basada en el algoritmo

que se debe a L’Ecuyer [210] y produce números reales de 32 bits

uniformemente distribuidos en un intervalo abierto entre cero y uno. Su periodo


60

es del orden de 1018 s, lo que es infinito para efectos prácticos en simulaciones.

[209].

Los ficheros fuente necesarios para realizar la simulación con PENELOPE son

los siguientes [209]:

• Penmain.f: Es el programa principal, que se encarga de llamar a todas las

subrutinas de PENELOPE y almacena la información sobre las trayectorias de

las partículas simuladas.

• PENELOPE.f: Es el paquete básico de subrutinas que se necesita para la

simulación de cascadas de fotones, electrones o positrones en cualquier

medio.

• Pengeom.f: Paquete de subrutinas que realiza el seguimiento de las

partículas a través de la geometría definida.

• Penvared.f: Paquete de subrutinas encargado de reducir las incertidumbres

estadísticas.

• Timer.f: Subrutina que permite controlar el tiempo de ejecución del programa.

• Pengenerator.f: Subrutina encargada de generar el fichero de geometría en el

formato adecuado para que lo pueda leer PENELOPE.

2.8.2.1. Geometría del sistema

La geometría del sistema que se desea simular debe ser definida en un formato

adecuado para que lo lea PENELOPE.

El sistema quedará definido por cuerpos formados cada uno de un solo

material, cada uno de estos se forma mediante superficies que quedan

definidas mediante cuadricas; es decir, cada una de ellas debe venir dada por

la siguiente ecuación:

0),,( 0

222 =++++= AIzIzIyIxIzyxF zzzyyxx ec 2.9

Por lo tanto, para definir una determinada superficie con PENELOPE se

necesita dar valores de 1, -1 o 0 a los coeficientes Ixx, Iyy, Izz, Iz y A.I0, así como


61

decidir el tamaño que tendrán las superficies en las tres direcciones del espacio

y siempre que sea necesario incluir un valor que traslade respecto al origen a la

superficie definida.

PENELOPE tiene una sencilla aplicación que permite visualizar las superficies

llamada “gview3d.exe”. Esta permite comprobar que el archivo de la geometría

está escrito de forma correcta y que corresponde al modelo que deseamos

simular [209].

2.8.2.2. Definición de materiales

Toda la información de los materiales involucrados en la simulación debe de

estar recopilada en un archivo que el usuario debe construir siguiendo normas

concretas. Se incluyen tablas de propiedades físicas y de secciones eficaces.

El archivo de materiales se crea mediante la aplicación llamada “material.exe”,

tras ejecutarla se introducen los datos sobre el material como su composición

química y densidad. Asimismo, PENELOPE dispone de una lista de 280

materiales para los cuales sólo se introduce su referencia y se obtiene el

archivo de materiales directamente. Cuando se trata de materiales

compuestos, la aplicación aproxima la sección eficaz a la suma de las

secciones eficaces de cada elemento al ponderar su proporción en la molécula.

De la misma manera que el archivo de geometría debe seguir las reglas de

sintaxis, todos los materiales deben ir concatenados en el registro de los

materiales. [209]

De esta manera PENELOPE les asocia un número que es el que se debe de

utilizar en el archivo de geometría, identificándose así de que material está

compuesto cada cuerpo.

2.8.2.3. Descripción del programa principal

Como se indicó anteriormente, el programa principal que se va a emplear en

este trabajo es el programa penmain, ligeramente modificado para poder


62

calcular la atenuación y la energía depositada por haces de electrones al

atravesar un determinado espesor del material estudiado.

El cuerpo de nuestro programa principal y PENELOPE están conectados

mediante una serie de variables globales que deben estar completamente

definidas. PENELOPE va a buscar en el programa principal los valores de

todas estas variables antes de empezar la simulación. Estas son [209]:

• KPAR: Tipo de partículas que se está simulando (1 – electrón, 2 – fotón, 3 –

positrón)

• E: Energía en eV que posee la partícula en ese momento.

• X, Y, Z: Coordenadas espaciales (en cm).

• U, V, W: Cosenos directores que marcaran la dirección de las partículas.

• WGHT: Peso útil cuando se usan las técnicas de reducción de varianza.

• IBODY: Cuerpo en el que se encuentra la partícula

• MAT: Material en el que se encuentra la partícula.

• ILB (5): Vector de 5 componentes que describe el origen de las partículas

secundarias.

También se debe incluir en el programa principal una serie de valores

relacionados con el transporte de radiación que influirán directamente en la

precisión y rapidez de la simulación.

• DSMAX (M): Proporciona la distancia máxima entre dos eventos duros. El

parámetro M define esta distancia para cada material.

• EABS (KPAR, M): Valor de la energía para la cual podemos considerar que la

partícula se absorbe localmente. PENELOPE distingue entre colisiones duras y

blandas. Las colisiones duras son aquellas cuya pérdida de energía está por

encima de un cierto valor mientras que las blandas son las que se encuentran

por debajo. En el programa principal también se especifican estos límites para

cada material mediante las siguientes variables:

• C1 (M): Indica el recorrido libre medio entre eventos elásticos duros para cada

material.

• C2 (M): Determina la fracción máxima de energía que se puede perder entre

dos colisiones duras consecutivas.

• Wcc (M): Energía de corte en eV para colisiones inelásticas.


63

• Wcr (M): Energía de corte para emisión de Bremsstrahlung.

Como ya se ha comentado anteriormente, el programa principal se apoya en

una serie de funciones y subrutinas de PENELOPE, que son las siguientes:

• PEINIT: Subrutina que lee los archivos de los diferentes materiales y

secciones eficaces que serán empleadas.

• GEOMIN: Lee el archivo de geometría.

• TIME0 y TIMER: Usados para poner el contador de tiempo a 0 y para ponerlo

en marcha.

• LOCATE: Determina el cuerpo que contiene el punto con las coordenadas (X,

Y, Z). Los valores de salida son:

- IBODY: Cuerpo en el que se mueve la partícula

- MAT: Material en dicho cuerpo

• CLEANS: Inicializa la lista de partículas secundarias. Debe de ser llamada

antes de comenzar la simulación de cada partícula primaria.

• START: Pone en marcha la simulación de una partícula.

• JUMP: Calcula el recorrido libre desde el punto de salida hasta la posición del

siguiente evento de interacción y la probabilidad de ocurrir de los distintos tipos

de interacciones. El valor de salida es:

- DS: Recorrido libre de la partícula.

• STEP: Esta subrutina parte de las coordenadas y dirección iniciales y

haciendo uso de la distancia recorrida calcula las coordenadas finales.

Además, devuelve el cuerpo y el material en que se encuentra finalmente la

partícula.

• KNOCK: Simulación de los eventos de interacción. Los parámetros de salida

son:

- DE: Energía depositada por la partícula en el material

- ICOL: Tipo de interacción sufrida por la partícula

- (U, V, W): Nueva dirección de la partícula

• SECPAR: Devuelve las condiciones iniciales de la siguiente partícula

secundaria y la elimina de la lista de partículas secundarias. El valor de salida

es:

- LEFT: Número de partículas secundarias restantes en la lista en el

momento que se llama a la subrutina.


64

2.9. Microdosimetría

En microdosimetría [211, 212] la cantidad estocástica análoga a la D en un

volumen V se define como la energía específica (z),

mVz

ερε == ec 2.10

Donde ρ es la densidad del material que está contenido en V.

El valor promedio de la dosis absorbida D en V que es igual a z que es el valor

promedio de la distribución de probabilidad )(zf en V. Si hacemos incidir un

electrón en un volumen infinitamente pequeño este prácticamente atravesaría

ese volumen sin depositar energía. Por lo general V es una esfera y por

consiguiente es necesario conocer su radio. Para grandes dosis absorbidas la

forma de )(zf es una campana alrededor del valor promedio de V. Suponiendo

que V es suficientemente pequeño de tal forma que la dosis absorbida sea

constante independientemente del tipo de radiación, entonces,

zDm 0lim

→= ec 2.11

A partir de )(zf se puede conocer D pero no es posible el proceso inverso por

lo que se tienen que definir cantidades microdosimétricas específicas.

Otra cantidad microdosimétrica muy útil es la energía lineal definida como:

ly 1ε

= ec 2.12

Donde 1ε es la energía impartida en un solo evento y l es el diámetro promedio

de un volumen. En el caso donde V es una esfera,

3

2dl = ec 2.13

La frecuencia de evento ( *Φ ) es el número promedio de eventos en un sitio

(de región esférica) por unidad de dosis absorbida. Es decir, *Φ , es el


65

recíproco de otra cantidad llamada energía absorbida específica promedio

( .Fz ). Y la función de proximidad )(xt la cual se refiere a la distribución de

distancias entre dos puntos donde se depositó energía en la materia irradiada.

En cuanto a los aspectos espaciales de la microdosimetría, z está sujeta a tres

diferentes tipos de fluctuaciones;

- Variación en el número de eventos en el sitio

- Variación en el número de colisiones que ocurren en esos eventos

- Variaciones en la energía localmente depositada en colisiones

individuales

Estas variaciones aumentan conforme el tamaño de volumen blanco se reduce,

ya que si el volumen es demasiado pequeño se incrementa la probabilidad de

que no ocurra ningún evento en ese sitio tan pequeño [212].


66

2.10. Referencias

[1] Reubi, J.C.; Waser, B. Concomitant expression of several peptide receptors in neuroendocrine tumours: molecular basis for in vivo multireceptor tumour targeting. Eur. J. Nucl. Med., , 30, 781-93. (2003)

[2] Reubi, J.C.; Maecke, H.R. Peptide-based probes for cancer imaging. J. Nucl. Med., 49, 1735-38. (2008)

[3] Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Melendez-Alafort, L.Third generation radiopharmaceuticals for imaging and targeted therapy. Curr. Pharm. Anal., 2, 339-52. (2006)

[4] de Visser, M.; Verwijnen, S.M.; de Jong, M. Update: improvement strategies for peptide receptor scintigraphy and radionuclide therapy. Cancer Biother. Radiopharm., 23, 137-57. (2008).

[5] Decristoforo, C.; Meléndez-Alafort, L.; Sosabowski, J.K.; Mather, S.J. 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-Octreotide for imaging somatostatinreceptor-positive tumors: preclinical evaluation and comparison with 111In-octreotide. J. Nucl. Med., 41, 1114-19. (2000)

[6] Plachcinska, A.; Mikolajczak, R.; Maecke, H.R.; Mlodkowska, E.; Kunert-Radek, J.; Michalski, A.; Rzeszutek, K.; Kozak, J.; Kusmierek, J. Clinical usefulness of 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC scintigraphy in oncological diagnostics: a preliminary communication. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 30, 1402-06. (2003)

[7] Plachcinska, A.; Mikolajczak, R.; Maecke, H.R.; Michalski, A.; Rzeszutek, K.; Kozak, J.; Kusmierek, J. 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC scintigraphy in the differential diagnosis of solitary pulmonary nodules. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 31, 1005-10. (2004)

[8] Gonzalez-Vazquez, A.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Gutierrez-Garcia, Z. Biokinetics and dosimetry in patients of 99mTc-EDDA/HYNIC-Tyr3-octreotide prepared from lyophilized kits. Appl. Radiat. Isot., 64, 792-97. (2006)

[9] Czepczynski, R.; Parisella, M.G.; Kosowicz, J.; Mikolajczak, R.; Ziemnicka, K.; Gryczynska, M.; Sowinski, J.; Signore, A. Somatostatin receptor scintigraphy using 99mTc-EDDA/HYNICTOC in patients with medullary thyroid carcinoma. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 34, 1635-45. (2007)

[10] Pearson, D.A.; Lister-James, J.; McBride, W.J.; Wilson, D.; Martel, L.J.; Civitello, E.R.; Taylor, J.E.; Moyer, B.R.; Dean, R.T. Somatostatin receptor-binding peptides labelled with technetium-99m: chemistry and initial biological studies. J. Med. Chem., 39, 1361-71. (1996)

[11] Blum, J.; Handmaker, H.; Lister-James, J.; Rinne, N. A multicenter trial with a somatostatin analogue 99mTc-depreotide in the evaluation of solitary pulmonary nodules. Chest, 117, 1232-38. (2000)

[12] Plachcinska, A.; Mikoajczak, R.; Kozak, J.; Rzeszutek, K.; Kumierek, J. Comparative analysis of 99mTc-depreotide and 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC thorax scintigrams acquired for the purpose of differential diagnosis of solitary pulmonary nodules. Nucl. Med.Rev., 9, 24-9. (2006)

[13] La Bella, R.; Garcia-Garayoa, E.; Langer, M.; Bläuenstein, P.; Beck-Sickinger, A.G.; Schubiger, P.A. In vitro and in vivo evaluation of a 99mTc(I)-labeled bombesin analogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positive tumors. Nucl. Med. Biol., 29, 553-60. (2002)

[14] Scopinaro, F.; Varvarigou, A.D.; Ussof, W.; De Vicentis, G.; Sourlingas, T.G.; Evangelatos, G.P. Technetium labeled bombesin like peptide: preliminary report on breast cancer uptake in patients. Cancer Biother. Radiopharm., 17, 327-35. (2002)


67

[15] Scopinaro, F.; De Vicentis, G.; Varvarigou, A.D.; Laurenti, C.; Iori, F.; Remediani, S. 99mTc-bombesin detects prostate cancer and invasion of pelvic lymph nodes. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 30, 1378-82. (2003)

[16] Chen, X.; Park, R.; Hou, Y.; Tohme, M.; Shahinian, A.H.; Bading, J.R. microPET and autoradiographic imaging of GRP receptor expression with 64Cu-DOTA-[Lys3]bombesin in human prostate adenocarcinoma xenografts. J. Nucl. Med. 45, 1390-97. (2004)

[17] Alves, S.; Correia, J.D.; Santos, I.; Veerendra, B.; Sieckman, G.L.; Hoffman, T.J.; Rold, T.L.; Figueroa, S.D.; Retzloff, L.; McCrate, J.; Prasanphanich, A.; Smith, C.J. Pyrazolyl conjugates of bombesin: a new tridentate ligand framework for the stabilization of fac-[M(CO)3]+ moiety. Nucl. Med. Biol., 33, 625-34. (2006)

[18] Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Rodriguez-Cortes, J. Pedraza-Lopez, M.; Ramirez-Iglesias, MT. Preparation and evaluation of 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin for imaging gastrin-releasing peptide receptor-positive tumours. Nucl. Med. Commun., 27, 371-76. (2006)

[19] Zhang, X; Cai, W.; Cao, F.; Schreibmann, E.; Wu, Y.; Wu, J.C.; Xing, L.; Chen, X. 18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostate cancer. J. Nucl. Med., 47, 492-501. (2006)

[20] Kunstler, J.U.; Veerendra, B.; Figueroa, S.D.; Sieckman, G.L.; Rold, T.L.; Hoffman, T.J.; Smith, C.J.; Pietzsch, H.J. Organometallic (99m)Tc(III) ‘4 + 1’ bombesin(7–14) conjugates: synthesis, radiolabeling, and in vitro/in vivo studies. Bioconjug. Chem., 18, 1651-716. (2007)

[21] de Visser, M.; van Weerden, W.M.; de Ridder, C-M. Androgen dependent expression of the gastrin-releasing peptide receptor in human prostate tumor xenografts. J. Nucl. Med., 48, 88-93. (2007)

[22] Santos-Cuevas, C.L.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Pichardo-Romero, P. Targeted imaging of gastrin-releasing peptide receptors with 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin: biokinetics and dosimetry in women. Nucl. Med. Commun., 29, 741-47. (2008)

[23] Van de Wiele, C.; Phonteyne, P.; Pauwels, P. Gastrin-releasing peptide receptor imaging in human breast carcinoma versus immunohistochemistry. J. Nucl. Med., 49, 260-64. (2008)

[24] Scottelius, M.; Wester, H.-J. Molecular imaging targeting peptide receptors. Methods, 48, 161-77. (2009)

[25] Schroeder, R.P.J.; van Weerden, W.M.; Bangma, C.; Krenning, E.P.; de Jong, M. Peptide receptor imaging of prostate cancer with radiolabelled bombesin analogues. Methods, 48, 200-4. (2009)

[26] Arteaga de Murphy C, Ferro-Flores G. Bombesina y bombesinas radiomarcadas: estado actual. ALASBIMN J, 30:1-7. (2005)

[27] Bunnett N. Gastrin-releasing peptide. Gut peptides: Biochemistry and physiology. Ed. JH Walsh and GJ Dockray, New York, (1994)

[28] Walsh JH. Gastrointestinal hormones and peptides, Physiology of the gastrointestinal tract, 3rd Ed, Ed L.R. Jhonson, Raven Press, New York, (1981)

[29] Pradhan TK, Katsuno T, Taylor JE, Kim SH, Ryan RR, Mantey SA, et al. Identification of a unique ligand which has high affinity for all four bombesin receptor subtypes. Eur J Pharmacol, 343:275-287. (1998)

[30] Stangelberger A, Schally AV, Letsch M, Szepeshazi K, Nagy A, Halmos G, et al. Targeted chemotherapy with cytotoxic bombesin analogue AN-215 inhibits growth of experimental human prostate cancers. Int J Cancer, resumen electrónico anterior a la publicación. (2005)

[31] Markwalder R, Reubi JC, GRP receptors in the human prostate: relation to neoplastic transformatio. Cancer Res, 59:1152-1159 (1999)

[32] Gugger M, Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in the human breast. Am J Pathol, 155:2067-2076, (1999)


68

[33] Ell PJ, Gambhir S Nuclear Medicine in Clinical Diagnosis and Treatment. Elsevier Health Sciences, Edinburgh, UK (ISBN: 9780443073120). (2004)

[34] Reubi JC, Wenger S, Schmuckli-Maurer J, Schaer JC, Gugger M. Bombesin receptor subtypes in human cancers: detection with the universal radioligand (125)I-[D-TYR(6), beta-ALA(11), PHE(13), NLE(14)] bombesin(6-14). Clin Cancer Res, 8:1139-1146. (2002)

[35] Soluri A, Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou A, Scafe R, Massa R, Schillaci O, Spanu A, David V. 99mTc [LEU13]bombesin and a new gamma camera, the imaging probe, are able to guide mammotome breast biopsy. Anticancer Res 23:2139-2142 (2003).

[36] Hoffman TJ, Gali H, Smith CJ, Sieckman GL, Hayes DL, Owen NK, Volkert WA. Novel series of 111In-labeled bombesin analogs as potential radiopharmaceuticals for specific targeting of gastrin-releasing peptide receptors expressed on human prostate cancer cells. J Nucl Med 44:823-831 (2003).

[37] Varvarigou A, Scopinaro F, Leondiadis L, Corleto V, Schillaci O, De Vincentis G. Synthesis, chemical, radiochemical and radiobiological evaluation of a new 99mTc-labelled bombesin-like peptide. Cancer Biother Radiopharm 17: 317-326 (2002).

[38] Scopinaro F, Varvarigou A, Ussof W. Breast cancer takes up 99mTc bombesin: A preliminary report. Tumori 88: S25-S28 (2002).

[39] De Vincentis G, Scopinaro F, Varvarigou A. Phase I trial of technetium [Leu13] bombesin as cancer seeking agent: Possible scintigraphic guide for surgery. Tumori 88:S28-S30 (2002).

[40] Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou AD. Use of bombesin in humans. J Clin Oncology 23:3170-3171 (2005).

[41] Faintuch BL, Santos RLSR, Souza ALF, Hoffman J, Greeley M, Smith CJ. 99mTc-Hynic-bombesin (7-14)NH2: Radiochemical evaluation with coligands EDDA (EDDA=ethylenediamine-N,N`-diaetic acid), tricine and nicotinic acid. Synt React Inorg Met-Org Nano-Met Chem 16:438-442 (2005).

[42] Smith CJ, Volkert WA, Hoffman TJ. Radiolabeled peptide conjugates for targeting of the bombesin receptor superfamily subtypes. Nucl Med Biol 32:733-740 (2005).

[43] Nock BA, Nikolopoulou A, Galanis A, Cordopatis P, Waser B, Reubi JC, Maina T. Potent bombesin-like peptides for GRP-receptor targeting of tumors with 99mTc: a preclinical study. J Med Chem 48:100-110 (2005) .

[44] Lin KS, Luu A, Baidoo KE, Hashemzadeh-Gargari H, Chen MK, Brenneman K, Pili R, Pomper M, Carducci MA, Wagner HN. A new high affinity technetium-99m-bombesin analogue with low abdominal accumulation. Bioconjug Chem 16:43-50 (2005).

[45] Sunday ME; Kaplan LM, Motoyama E, CHin WW, Spindel ER. Gastrin –releasing peptide (mammalian bombesin) gene expresión in health and disease. Lab Invest. 59:5-24. (1988)

[46] Cuttitta F, Carney DN, Mulshine J, Moody TE, Fedorko J, Fischler A, Minna JD. Bombesin-like peptides can function as autocrine growth factors in human small-cell lung cancer. Nature, 316:823-826. (1985)

[47] Persinger SS, Bourdeau H, Gubish C, Tirpak D, Gaither A, Luketich J, Siegfried J. Sex-specific expression of gastrin-releasing peptide receptor: relationship to smoking history and risk of lung cancer. J of the Nat Cancer Inst, 92:18-23. (2000)

[48] Fleischman A, Waser B, Jan-Olaf G, Reubi JC. Gastrin releasing peptide receptors in normal and neoplastic human uterus: involvement of multiple tissue compartments. Endocrinol Metab, 90:4722-4729. (2005)

[49] Halmos G, Wittliff J, Schally A. Characterization of bombesin/gastrin-releasing peptide receptors in human breast cancer and their relationship to steroid receptor expression. Cancer Res, 55:280-287. (1995)


69

[50] Kahán Z, Sun B, Schally A, Arencibia J, Cai R, Groot K, Halmos G, Inhibition of growth of MDA-MB-468 estrogen-independent human breast carcinoma by bombesin/gastrin-releasing peptide antagonists RC-3095 and RC-3940-II. Cancer, 88:1384 1392. (2000)

[51] Baidoo KE, Lin KS, Zhan Y, Finley P, Scheffel U, Wagner HN. Design, synthesis, and initial evaluation of high-affinity technetium bombesin analogues. Bioconjug Chem, 9:218-223. (1998)

[52] Varvarigou AD, Scopinaro F, Leondiadis L, Corleto V, Schillaci O, De Vicentis G. Gastrin-releasing peptide (GRP) analogues for cancer imaging. Cancer Biother Radiopharm, 17:317-323. (2002)

[53] Alves S, Paulo A, Correia JDG, Gano L, Smith CJ, Santos I. Pyrazolyl derivatives as bifunctional chelators for labeling tumor-seeking peptides with the fac-[M(CO)[3]][+] moiety (M = [9][9][m]Tc, Re) : Synthesis, characterization, and biological behavior. Bioconjug Chem, 16:438-442. (2005)

[54] Nock B, Nikolopoulou A, Ciotellis E, Loudos G, Maintas D, Reubi JC, Maina T. [99mTc]Demobesin 1, a novel potent bombesin analogue for GRP receptor-targeted tumour imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 30:247-250 (2003)

[55] de Visser M, Bernard HF, Erion JL, Schmidt MA, Srinivasan A, Waser B, Reubi JC, Krenning EP, M de Jong. Novel 111 In-labelled bombesin analogues for molecular imaging of prostate tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 34:1228-1238.(2006)

[56] Van de Wiele C, Dumont F, Vanden Broecke R, et al. Technetium-99m RP527, a GRP analogue for visualisation of GRP receptor-expressing malignancies: a feasibility study. Eur J Nucl Med, 27:1694-1699. (2000)

[57] Van De Wiele C, Dumont F, Dierckx RA, Peers SH, Thomback JR, Slegers G, Thierens H. Biodistribution and dosimetry of (99m)Tc-RP527, a gastrin-releasing peptide (GRP) agonist for the visualization of GRP receptor-expressing malignancies. J Nucl Med, 42:1722-1727. (2001)

[58] Gu F. X., Karnik R., Wang A. Z., Alexis F., Levy-Nissenbaum E., Hong S., Langer R. S., and Farokhzad O. C., Targeted nanopartículas for cancer therapy, Nanotoday, 2(3):14-21 (2007)

[59] Garcia Garayoa, E., Ruegg, D., Blauenstein, P., et al.: Chemical and biological characterization of new Re(CO)(3)/[(99 m)Tc](CO)(3) bombesin analogues. Nucl Med Biol 34, 17–28 (2007)

[60] Reubi, J. C., Macke, H. R. and Krenning, E. P.: Candidates for peptide receptor radiotherapy today and in the future. J Nucl Med 46 (Suppl 1), 67S–75S (2005)

[61] Breeman, W. A., Hofland, L. J., de Jong, M., et al.: Evaluation of radiolabelled bombesin analogues for receptor-targeted scintigraphy and radiotherapy. Int J Cancer 81, 658–665 (1999)

[62] Breeman, W. A., de Jong, M., Erion, J. L., et al.: Preclinical comparison of (111)In-labeled DTPA- or DOTA-bombesin analogs for receptor-targeted scintigraphy and radionuclide therapy. J Nucl Med 43, 1650–1656 (2002)

[63] de Visser, M., Bernard, H. F., Erion, J. L., et al.: Novel (111)In-labelled bombesin analogues for molecular imaging of prostate tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 34(8):1228-38 (2007)

[64] Zhang, H., Chen, J., Waldherr, C., et al.: Synthesis and evaluation of bombesin derivatives on the basis of pan-bombesin peptides labeled with indium-111, lutetium-177, and yttrium-90 for targeting bombesin receptor-expressing tumors. Cancer Res 64, 6707–6715 (2004)

[65] Zhang, H., Schuhmacher, J., Waser, B., et al.: DOTA-PESIN, a DOTA-conjugated bombesin derivative designed for the imaging and targeted radionuclide treatment of bombesin receptorpositive tumours. Eur J Nucl Med 34, 1198–1208 (2007)


70

[66] Yang, Y. S., Zhang, X., Xiong, Z., et al.: Comparative in vitro and in vivo evaluation of two 64Cu-labeled bombesin analogs in a mouse model of human prostate adenocarcinoma. Nucl Med Biol 33, 371–380 (2006)

[67] Smith, C. J., Gali, H., Sieckman, G. L., et al.: Radiochemical investigations of (177)Lu-DOTA-8-Aoc-BBN[7-14]NH(2): an in vitro/in vivo assessment of the targeting ability of this new radiopharmaceutical for PC-3 human prostate cancer cells. Nucl Med Biol 30, 101–109 (2003)

[68] Rogers, B. E., Bigott, H. M., McCarthy, D. W., et al.: MicroPET imaging of a gastrin-releasing peptide receptor-positive tumor in a mouse model of human prostate cancer using a 64Culabeled bombesin analogue. Bioconjug Chem 14, 756–763 (2003)

[69] Johnson, C. V., Shelton, T., Smith, C. J., et al.: Evaluation of combined (177)Lu-DOTA-8-AOC-BBN (7-14)NH(2) GRP receptor-targeted radiotherapy and chemotherapy in PC-3 human prostate tumor cell xenografted SCID mice. Cancer Biother Radiopharm 21, 155–166 (2006)

[70] Biddlecombe, G. B., Rogers, B. E., Visser, M. D., et al.: Molecular imaging of gastrin-releasing peptide receptor-positive tumors in mice using (64)Cu- and (86)Y-DOTA-(Pro(1),Tyr(4) )-Bombesin(1-14). Bioconjug Chem 18, 724–730 (2007)

[71] Lantry, L. E., Cappelletti, E., Maddalena, M. E., et al.: 177Lu-AMBA: Synthesis and characterization of a selective 177Lu-labeled GRP-R agonist for systemic radiotherapy of prostate cancer. J Nucl Med 47, 1144–1152 (2006)

[72] Van de Wiele, C., Dumont, F., van Belle, S., et al.: Is there a role for agonist gastrin-releasing peptide receptor radioligands in tumour imaging? Nucl Med Commun 22, 5–15 (2001)

[73] Baum, R., Prasad, V., Mutloka, N., et al.: Molecular imaging of bombesin receptors in various tumors by Ga-68 AMBA PET/CT: first results. J Nucl Med 48, 79P (2007)

[74] von Guggenberg, E.; Behe, M.; Behr, T.M.; Saurer, M.; Seppi, T.; Decristoforo, C. 99mTc-labeling and in vitro and in vivo evaluation of HYNIC- and (Nalpha-His)acetic acid-modified [D-Glu1]-minigastrin. Bioconjug. Chem., 15, 864-71. (2007)

[75] Nock, B.A.; Maina, T.; Behe, M.; Nikolopoulou, A.; Gotthardt, M.; Schmitt, J.S.; Behr, T.M.; Macke, H.R. CCK-2/Gastrin receptor–targeted tumor imaging with 99mTc-labeled minigastrin analogs. J. Nucl. Med., 46, 1727-36. (2005)

[76] Bhattacharya, R.; Mukherjee, P. Biological properties of “naked” metal nanoparticles. Adv. Drug Deliv. Rev., 60, 1289-306. (2008)

[77] Haubner, R.; Wester, H.J.; Reuning, U. Radiolabelled αvβ3 integrin antagonists: a new class of tracers for tumor targeting. J. Nucl. Med., 40, 1061-71. (1999)

[78] Haubner, R.; Wester, H.J.; Burkhart, F. Glycosylated RGDcontaining peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. J. Nucl. Med., 42, 326-36. (2001)

[79] Haubner. R.; Kuhnast, B.; Mang, C. [18F]Galacto-RGD: synthesis, radiolabeling, metabolic stability, and radiation dose estimates. Bioconjug. Chem., 15, 61-9. (2004)

[80] Haubner, R.; Wester, H.J.; Weber, W.A. Non-invasive imaging of � v� 3 integrin expression using 18F-labelled RGD-containing glycopeptide and positron emission tomography. Cancer Res., 61, 1781-5. (2001)

[81] Morrison, M.S.; Ricketts, S.A.; Barnett, J.; Cuthbertson, A.; Tessier, J.; Wedge, S.R. Use of a Novel Arg-Gly-Asp Radioligand, 18F-AH111585, to determine changes in tumor vascularity after antitumor therapy. J. Nucl. Med., 50, 116-22. (2009)

[82] Yoshimoto, M.; Ogawa, K.; Washiyama, K.; Shikano, N.; Mori, H.; Amano, R.; Kawai, K. αvβ3 integrin-targeting radionuclide therapy and imaging with monomeric RGD peptide. Int. J. Cancer, 123, 709-715. (2008)


71

[83] Jeong, J.M.; Hong, M.K.; Chang, Y.S.; Lee, Y.S.; Kim, Y.J.; Cheon, G.J.; Lee, D.S.; Chung, J.K.; Lee, M.C. Preparation of a promising angiogenesis PET imaging agent: 68Galabeled c(RGDyK)–isothiocyanatobenzyl-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid and feasibility studies in mice. J. Nucl. Med., 49, 830-36. (2008)

[84] Li, Z.B.; Chen, K.; Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin � v� 3 expression. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 35, 1100-08. (2008)

[85] Kenny, L.M.; Coombes, R.C.; Oulie, I.; Contractor, K.B.; Miller, M.; Spinks, T.J.; McParland, B.; Cohen, P.S.; Hui, A.M.; Palmieri, C.; Osman, S.; Glaser, M.; Turton, D.; Al-Nahhas, A.; Aboagye, E.O. Phase I Trial of the positron-emitting arg-gly-asp (RGD) peptide radioligand 18F-AH111585 in breast cancer patients. J. Nucl. Med., 49, 879-86. (2008)

[86] Liu, Z.; Yan, Y.; Chin, F.T.; Wang, F.; Chen, X. Dual integrin and gastrin-releasing peptide receptor targeted tumor imaging using 18Flabeled PEGylated RGD-bombesin heterodimer 18F-FB-PEG3-Glu-RGD-BBN. J. Med. Chem., 52, 425-32. (2009)

[87] Liu, Z.; Niu, G.; Wang, F.; Chen, X. (68)Ga-labeled NOTA-RGDBBN peptide for dual integrin and GRPR-targeted tumor imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 36, 1483-94. (2009)

[88] Haubner, R.; Decristoforo, C. Radiolabelled RGD peptides and peptidomimetics for tumour targeting. Front. Biosci., 14, 872-86.(2009)

[89] Mitrasinovic, P.M. Advances in αvβ3 integrin-targeting cancer therapy and imaging with radiolabeled RGD peptides. Curr. Radiopharm., 2, 214-19. (2009)

[90] Zaccaro, L.; Del Gatto, A.; Pedone, C.; Saviano, M. Peptides for tumour therapy and diagnosis: Current status and future directions. Curr. Med. Chem., 16, 780-95. (2009)

[91] Buchegger, F.; Bonvin, F.; Kosinski, M.; Schaffland, A.O.; Prior, J.; Reubi, J.C.; Blauenstein, P.; Tourwe, P.; García-Garayoa, E.; Bischof A. Radiolabelled neurotensin analog, 99mTc-NT-XI, evaluated in ductal pancreatic adenocarcinoma patients. J. Nucl. Med., 44, 1649-54. (2003)

[92] Korner, M.; Waser, B.; Reubi, J.C. High expression of neuropeptide Y1 receptors in Ewing sarcoma tumors. Clin. Canc. Res., 14, 5043-49. (2008)

[93] Zwanziger, D.; Khan, I.U.; Neundorf, I. Novel chemically modified analogues of neuropeptide Y for tumor targeting. Bioconjug. Chem., 19, 1430-38. (2008)

[94] Kersemans, V.; Kersemans, K.; Cornelissen, B. Cell penetrating peptides for in vivo molecular imaging applications. Curr. Pharm. Des., 14, 2415-27. (2008)

[95] Deshayes, S.; Morris, M.C.; Divita, G.; Heitz, F. Interactions of primary amphipathic cell penetrating peptides with model membranes: consequences on the mechanisms of intracellular delivery of therapeutics. Curr. Pharm. Des., 11, 3629-38. (2005)

[96] Cornelissen, B.; McLarty, K.; Kersemans, V.; Scollard, D.; Reilly, R. Properties of [111In]-labeled HIV-1 tat peptide radioimmunoconjugates in tumor-bearing mice following intravenous or intratumoral injection. Nucl. Med. Biol., 35, 101-10. (2008)

[97] Costantini, D.L.; Hu, M.; Reilly, R. Peptide motifs for insertion of radiolabeled biomolecules into cells and routing to the nucleus for cancer imaging or radiotherapeutic applications. Cancer Biother. Radiopharm., 23, 3-23. (2008)

[98] Santos-Cuevas, C.L.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.A.; Ramírez, F. de M.; Luna-Gutiérrez, M.A.; Pedraza-López, M.; García-Becerra, R.; Ordaz-Rosado, D. Design, preparation, in vitro and in vivo evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-bombesin: a target-specific hybrid radiopharmaceutical. Int. J. Pharm., 375, 75-83. (2009)

[99] Chen P, Wang J, Hope K, Jin L, Dick J, Cameron R, Brandwein J, Minden M, Reilly RM., Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and


72

enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells., J Nucl Med. May;47(5):827-36. (2006)

[100] Costantini DL, Chan C, Cai Z, Vallis KA, Reilly RM., (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer., J Nucl Med., 48(8):1357-68. (2007)

[101] Weissleder, R.; Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology, 219, 316-33. (2001)

[102] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur. Radiol., 13, 195-208. (2003)

[103] Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 626-34. [54] Sharma, P.; Brown, S.; Walte, G.; Santra, S.; Moudgil, B. Nanoparticles for bioimaging. Adv. Colloid Interface Sci., 123, 471-85. (2006)

[104] Sharma, P.; Brown, S.; Walte, G.; Santra, S.; Moudgil, B. Nanoparticles for bioimaging. Adv. Colloid Interface Sci., 123, 471-85. (2006)

[105] Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat. Biotechnol., 19, 316-7.(2001)

[106] Ntziachristos, V.; Schellenberger, E.A.; Ripoll, J.; Yessayan, D.; Graves, E.; Bogdanov, A. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V–Cy5.5 conjugate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, 12294-99. (2004)

[107] Graves, E.E.; Culver, J.P.; Ripoll, J.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Singular-value analysis and optimization of experimental parameters in fluorescence molecular tomography. J. Opt. Soc. Am. A., 21, 231-41. (2004)

[108] Graves, E.E.; Yessayan, D.; Turner, G.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J. Biomed. Opt., 10, 44019 (doi:10.1117/1.1993427). (2005)

[109] Graves, E.E.; Ripoll, J.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. submillimeter resolution fluorescence molecular imaging system for small animal imaging. Med. Phys., 30, 901-11. (2003)

[110] Graves, E.E.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr. Mol. Med., 4, 419-30. (2004)

[111] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Tung, C.; Weissleder, R. Imaging cathepsin B up-regulation in HT-1080 tumor models using fluorescence-mediated molecular tomography (FMT). Acad. Radiol., 9, S323-25. (2002)

[112] Ntziachristos, V.; Weissleder, R. Charge-coupled-device based scanner for tomography of fluorescent near-infrared probes in turbid media. Med. Phys, 29, 803-9. (2002)

[113] Gao, M.; Lewis, G.; Turner, G.M.; Soubret, A.; Ntziachristos, V. Effects of background fluorescence in fluorescence molecular tomography. Appl. Opt., 44, 5468-74. (2005)

[114] Gremlich, H.U.; Martinez, V.; Kneuer, R.; Kinzy, W.; Weber, E.; Pfannkuche, H.J. Non-invasive assessment of gastric emptying by near-infrared fluorescence reflectance imaging in mice: pharmacological validation with tegaserod, cisapride, and clonidine. Mol. Imaging, 3, 303-11.(2004)

[115] Tung, C.H.; Quinti, L.; Jaffer, F.A.; Weissleder, R. A branched fluorescent peptide probe for imaging of activated platelets. Mol. Pharm., 2, 92-5. (2005)

[116] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Graves, E.E.; Ripoll, J.; Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol. Imaging, 1, 82-88. (2002)

[117] Lyons, A.B.; Parish, C.R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods, 171, 131-7. (1994)


73

[118] Kojima, H. Development of near-infrared fluorescent probes for in vivo imaging. Yakugaku Zasshi, 128, 1653-63. (2008)

[119] Chen, X.; Conti, P.S.; Moats, R.A. In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin αvβ3 in brain tumor xenografts. Cancer Res., 64, 8009-14. (2004)

[120] Cheng, Z.; Wu, Y.; Xiong, Z.; Gambhir, S.S.; Chen, X. Nearinfrared fluorescent RGD peptides for optical imaging of integrin αvβ3 expression in living mice. Bioconjug. Chem., 16, 1433-41. (2005)

[121] Hsu, A.R.; Hou, L.C.; Veeravagu, A.; Greve, J.M.; Vogel, H.; Tse, V.; Chen, X. In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin αvβ3 in an orthotopic glioblastoma model. Mol. Imaging Biol., 8, 315. (2006)

[122] Wang, W.; Ke, S.; Wu, Q.; Charnsangavej, C.; Gurfinkel, M.; Gelovani, J.G.; Abbruzzese, J.L.; Sevick-Muraca, E.M.; Li, C. Near-infrared optical imaging of integrin αvβ3 in human tumor xenografts. Mol. Imaging, 3, 343-51. (2004)

[123] Wu, Y.; Cai, W.; Chen, X. Near-infrared fluorescence imaging of tumor integrin αvβ3 expression with Cy7-labeled RGD multimers. Mol. Imaging Biol., 8, 226-36. (2006)

[124] Waldeck, J.; Häger, F.; Höltke, C.; Lanckohr, C.; Wallbrunn, A.; Torsello, G.; Heindel, W.; Theilmeier, G.; Schäfers, M.; Bremer, C.Fluorescence reflectance imaging of macrophage-rich atherosclerotic plaques using an αvβ3 integrin–targeted fluorochrome. J. Nucl. Med., 9, 1845-51.(2008)

[125] Ma. L.; Yu, P.; Veerendra, B.; Rold, T.L.; Retzloff, L.; Prasanphanich, A.; Sieckman, G.; Hoffman, T.J.; Volkert, W.A.; Smith, C.J. In vitro and in vivo evaluation of alexa fluor 680-Bombesin[7-14]NH2 peptide conjugate, a high-affinity fluorescent probe with high selectivity for the gastrin-releasing peptide receptor. Mol. Imaging, 6, 171-80. (2007)

[126] Chan, W.C.W.; Maxwell, D.J.; Gao, X.H.; Bailey, R.E.; Han, M.Y.; Nie, S.M. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol., 13, 40-46.(2002)

[127] Han, M.Y.; Gao, X.H.; Su, J.Z.; Nie, S.M. Quantum dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nat. Biotechnol., 19, 631-35. (2001)

[128] Gao, X.H.; Nie, S.M. Doping mesoporous materials with multicolor quantum. J. Phys. Chem. B, 107, 11575-78. (2003)

[129] Gao, X.H.; Nie, S.M. Quantum dot-encoded mesoporous beads with high brightness and uniformity: rapid readout using flow cytometry. Anal. Chem., 76, 2406-10. (2004)

[130] Gao, X.H.; Yang, L.; Petros, J.A.; Marshall, F.M.; Simons, J.W.; Nie1, S. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Curr. Opin. Biotechnol., 16, 63-72. (2005)

[131] Gao, X.H.; Cui, Y.Y.; Levenson, R.M.; Chung, L.W.K.; Nie, S.M.In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol., 22, 969-76. (2004)

[132] Smith, A.; Duan, H.; Mohs, A.M.; Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv. Drug Deliv. Rev., 60, 1226-40. (2008)

[133] Medintz, I.L.; Clapp, A.R.; Mattoussi, H.; Goldman, E.R.; Fisher, B.; Mauro, J.M. Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors. Nat. Mater., 2, 630-8. (2003)

[134] Shah, B.S.; Clark, P.A.; Moioli, E.K.; Stroscio, M.A.; Mao, J.J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett., 7, 3071-79. (2007)

[135] Young, S.H.; Rozengurt, E. Qdot nanocrystal conjugated to bombesin or ANG II label the cognate G protein-coupled receptor in living cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 290, C728-32. (2006)

[136] Ruan, G.; Agrawal, A.; Marcus, A.I.; Nie, S.M. Imaging and tracking of Tat peptide-conjugated quantum dots in living cells: new insights into nanoparticle


74

uptake, intracellular transport, and vesicle shedding. J. Am. Chem. Soc., 129, 14759-66. (2007)

[137] Wadia, J.S.; Dowdy, S.F. Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by Tat-mediated transduction in the treatment of cancer. Adv. Drug Deliv. Rev., 57, 579-96. (2005)

[138] Gonczy, P.; Pichler, S.; Kirkham, M.; Hyman, A.A. Cytoplasmic dynein is required for distinct aspects of Mtoc positioning, including centrosome separation, in the one cell stage caenorhabditis elegans embryo. J. Cell Biol., 147, 135-50. (1999)

[139] Brust, M.; Fink, J.; Bethell, D.; Schiffrin, D.J.; Kiely, C. Synthesis and reactions of functionalised gold nanoparticles. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 16, 1655-56. (1995)

[140] Pissuwan, D.; Valenzuela, S.M.; Cortie, M.B. Therapeutic possibilities of plasmonically heated gold nanoparticles. Trends Biothecnol., 24, 62-67. (2006)

[141] Chompoosor, A.; Han, G.; Rotello, V.R. Charge dependence of ligand release and monolayer stability of gold nanoparticles by biogenic thiols. Bioconjug. Chem., 19, 1342-5. (2007)

[142] Surujpaul, P.P.; Gutierrez-Wing, C.; Ocampo-Garcia, B.; Ramirez, F. de M.; Arteaga de Murphy, C.; Pedraza-Lopez, M.; Camacho-Lopez, M.A.; Ferro-Flores, G. Gold nanoparticles conjugated to [Tyr3]octreotide peptide. Biophys. Chem., 138, 83-90. (2008)

[143] De la Fuente, J.M.; Berry, C.C. Tat Peptide as an efficient molecule to translocate gold nanoparticles into the cell nucleus. Bioconjug. Chem., 16, 1176-80. (2005)

[144] De la Fuente, J.M.; Berry, C.C.; Riehle, M.O.; Curtis, S.G. NPs targeting at cells. Langmuir, 22, 3286-93. (2006)

[145] Sun, S.H.; Zeng, H.; Robinson, D.B.; Raoux, S.; Rice, P.M.; Wang, S.X.; Li, G.X. Monodisperse MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) Nanoparticles. J. Am. Chem. Soc., 126, 273-9. (2004)

[146] Lee, J.H.; Huh, Y.M.; Jun, Y.W.; Seo, J.W.; Jang, J.T.; Song, H.T.; Kim, S.; Cho, E.J.; Yoon, H.G.; Suh, J.S.; Cheon, J. Artificially engineered magnetic nanoparticles for ultra-sensitive molecular imaging. Nat. Med., 13, 95-99. (2007)

[147] Xu, C.J.; Sun, S.H. Monodisperse magnetic nanoparticles for biomedical applications. Polym. Int., 56, 821-26. (2007)

[148] Baldi, G.; Bonacchi, D.; Franchini, M.C.; Gentili, D.; Lorenzi, G.; Ricci, A.; Ravagli, C. Synthesis and coating of cobalt ferrite nanoparticles: a first step toward the obtainment of new magnetic nanocarriers. Langmuir, 23, 4026-8. (2007)

[149] Peng, S.; Wang, C.; Xie, J.; Sun, S. Synthesis and stabilization of monodisperse Fe nanoparticles. J. Am. Chem. Soc., 128, 10676-77. (2006)

[150] Qiang, Y.; Antony, J.; Sharma, A.; Nutting, J.; Sikes, D.; Meyer, D. Iron/iron oxide core-shell nanoclusters for biomedical applications. J. Nanopart. Res., 8, 489-96. (2006,)

[151] Sun, S.H. Recent advances in chemical synthesis, self-assembly, and applications of FePt nanoparticles. Adv. Mater., 18, 393-403. (2006)

[152] Montet, X.; Weissleder, R.; Josephson, L. Imaging pancreatic cancer with a peptide-nanoparticle conjugate targeted to normal pancreas. Bioconjug. Chem., 17, 905-11. (2006)

[153] Zhao, M.; Kircher, M.F.; Josephson, L.; Weissleder, R. Differential Conjugation of Tat Peptide to Superparamagnetic Nanoparticles and Its Effect on Cellular Uptake. Bioconjug. Chem., 13, 840-4. (2002)

[154] Josephson, L.; Tung, C.H.; Moore, A.; Weissleder, R. Highefficiency intracellular magnetic labelling with novel superparamagnetic–Tat peptide conjugates. Bioconjug. Chem., 10, 186-91. (1999)


75

[155] Dodd, C.H., Hsu, H.C.; Chu, W.J. Normal T cell response and in vivo magnetic resonance imaging of T cells loaded with HIV transactivator-peptide-derived superparamagnetic NPs. J. Immunol. Methods, 256, 89-105. (2001)

[156] O´Connor, M.K.; Kemp, B.J. Single-photon emission computed tomography/ computed tomography: basic instrumentation and innovations. Semin. Nucl. Med., 36, 258-66. (2006)

[157] Delbeke, D.; Coleman, R.E.; Guiberteau, M.J.; Brown, M.L.; Royal, H.D.; Siegel, B.A. Procedure guideline for SPECT/CT Imaging. J. Nucl. Med., 47, 1227-34. (2006)

[158] Cai, W.; Chen, K.; Li, Z.B.; Gambhir, S.S.; Chen, X. Dual-Function Probe for PET and Near-Infrared Fluorescence Imaging of Tumor Vasculature. J. Nucl. Med., 48, 1862-70. (2007)

[159] McCann, C.M.; Waterman, P.; Figueiredo, J.L.; Aikawa, E.; Weissleder, R.; Chen, J.W. Combined magnetic resonance and fluorescence imaging of the living mouse brain reveals glioma response to chemotherapy. Neuroimage, 45, 360-9. (2009)

[160] Devaraj, N.K.; Keliher, E.J.; Thurber, G.M.; Nahrendorf, M.; Weissleder, R. F Labeled nanoparticles for in vivo PET-CT imaging. Bioconjug. Chem., 20, 397-401. (2009)

[161] Bhushan, K.R.; Misra, P.; Liu, F.; Mathur, S.; Lenkinski, R.E.; Frangioni, J.V. Detection of breast cancer microcalcifications using a dual-modality SPECT/NIR fluorescent probe. J. Am. Chem. Soc., 130, 17648-49. (2008,)

[162] Srivastava S, Dadachova E Recent advances in radionuclide therapy. Semin Nucl Med 31:330–341 (2001)

[163] Milenic DE, Brady ED, Brechbiel MW Antibody-targeted radiation cancer therapy. Nat Rev Drug Discov 3:488–499 (2004)

[164] Zweit J Radionuclides and carrier molecules for therapy. Phys Med Biol 41:1905–1914] (1996)

[165] Buchegger F, Perillo-Adamer F, Dupertuis YM, Delaloye AB. Auger radiation targeted into DNA: a therapy perspective., Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33(11):1352-63. (2006)

[166] O’Donoghue JA, Wheldon TE Targeted radiotherapy using Auger electron emitters. Phys Med Biol 41:1973–1792 (1996)

[167] Adelstein SJ, Kassis AI, Bodei L, Mariani G Radiotoxicity of iodine-125 and other auger-electron-emitting radionuclides: background to therapy. Cancer Biother Radiopharm 18:301–316 (2003)

[168] Howell RW. Radiation spectra for Auger-electron emitting radionuclides: report No. 2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No. 6., Med Phys. 19(6):1371-83 (1992)

[169] Tavares AA, Tavares JM. (99m)Tc Auger electrons for targeted tumour therapy: a review., Int J Radiat Biol.;86(4):261-70 (2010)

[170] Britz-Cunningham S, Adelstein S. Molecular Targeting with Radionuclides: State of the Science. Journal of Nuclear Medicine 44:1945-1961. (2003)

[171] Sofou S.. Radionuclide carriers for targeting of cancer. International Journal of Nanomedicine 3:181-199. (2008)

[172] Unak P. Targeted Tumor Radiotherapy. Brazilian Archives of Biology and Technology 45:97-110. (2002)

[173] Boyd M, Ross S, Dorrens J, Fullerton N, Tan K, Zalutsky M, Mairs R. Radiation-Induced Biologic Bystander Effect Elicited In Vitro by Targeted Radiopharmaceuticals Labeled with α-, β-, and Auger Electron-Emitting Radionuclides. Journal of Nuclear Medicine 47:1007-1015. (2006)

[174] Sastry K.. Biological Effects of the Auger Emiter Iodine-125: A Review. Report No.1 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No.6. Medical Physics 19:1361-1370. (1992)


76

[175] Boswell C, Brechbiel M. Auger Electrons: Lethal, Low Energy, and Coming Soon to a Tumor Cell Nucleus Near You. Journal of Nuclear Medicine 46:1946-1947. (2005)

[176] Eriksson D, Riklund K, Johansson L, and Stigbrand T, Radiation Induced Cell Deaths, Targeted Radionuclide Tumor Therapy Biological Aspects, Ed. Springer ISBN 978-1-4020-8695-3 (2008)

[177] Urashima T, Nagasawa H, Wang K, Adelstein S, Little J, Kassis A. Induction of Apoptosis in Human Tumor Cells After Exposure to Auger Electrons: Comparation with Gamma-Ray Exposure. Nuclear Medicine and Biology 33:1055-1063. (2006)

[178] Kroemer G, Dallaporta B, Resche-Rigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annual Review of Physiology, 60:619–42. (1998)

[179] Galluzzi L, Maiuri MC, Vitale I, Zischka H, Castedo M, Zitvogel L, Kroemer G. Cell death modalities: classification and pathophysiological implications. Cell Death and Differentiation; 14(7):1237–43. (2007)

[180] Akagi Y, Ito K, Sawada S. Radiation-induced apoptosis and necrosis in Molt-4 cells: a study of dose-effect relationships and their modification. International Journal of Radiation Biology; 64(1):47–56. (1993)

[181] Roninson IB, Broude EV, Chang BD. If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Drug Resistance Updates; 4(5):303–13. (2001)

[182] Harms-Ringdahl M, Nicotera P, Radford IR. Radiation induced apoptosis. Mutation Research; 366(2):171–9. (1996)

[183] Gisselsson D. Mitotic instability in cancer: is there method in the madness? Cell Cycle (Georgetown, TX); 4(8):1007–10. (2005)

[184] Eriksson D, Lofroth PO, Johansson L, Riklund KA, Stigbrand T. Cell cycle disturbances and mitotic catastrophes in HeLa Hep2 cells following 2.5 to 10 Gy of ionizing radiation. Clinical Cancer Research; 13(18 Pt 2):5501s–8s. (2007)

[185] Eriksson D, Joniani HM, Sheikholvaezin A, Lofroth PO, Johansson L, Riklund Ahlstrom K, Stigbrand T. Combined low dose radio- and radioimmunotherapy of experimental HeLa Hep2 tumours. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging; 30(6):895–906. (2003)

[186] Roninson IB, Broude EV, Chang BD. If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Drug Resistance Updates; 4(5):303–13. (2001)

[187] Castedo M, Kroemer G. [Mitotic catastrophe: a special case of apoptosis]. Journal de la Societe de biologie; 198(2):97–103. (2004)

[188] Erenpreisa J, Kalejs M, Lanzini F, et al. Segregation of genomes in polyploid tumour cells following mitotic catastrophe. Cell Biology International; 29(12):1005–11. (2005)

[189] Lundqvist H, Stenerlöw Bo, and Gedda L, The Auger Effect in Molecular Targeting Therapy, Targeted Radionuclide Tumor Therapy Biological Aspects, Ed. Springer ISBN 978-1-4020-8695-3 (2008)

[190] [69] Stabin MG, Sparks RB, Crowe E. OLINDA/EXM: the second-generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine. J Nucl Med 46:1023-1027 (2005)

[191] International Commission on Radiological Protection. ICRP Publication 92: Relative Biological Effectiveness (RBE), Quality Factor (Q), and Radiation Weighting Factor (WR). Stockholm, Sweden: International Commission on Radiological Protection; (2003)

[192] National Council on Radiation Protection and Measurements. Radiation Protection Guidance for Activities in Low-Earth Orbit. Bethesda, MD: National Council on Radiation Protection and Measurements;. Report Number 132. (2000)


77

[193] Fitzek MM, Thornton AF, Rabinov JD, et al. Accelerated fractionated proton/photon irradiation to 90 cobalt gray equivalent for glioblastoma multiforme: results of a phase II prospective trial. J Neurosurg.;91:251–260. (1999)

[194] Trofimov A, Nguyen PL, Coen JJ, et al. Radiotherapy treatment of early-stage prostate cancer with IMRT and protons: a treatment planning comparison. Int J Radiat Oncol Biol Phys.;69:444–453. (2007)

[195] Sgouros G, Howell RW, Bolch WE, Fisher DR., MIRD commentary: proposed name for a dosimetry unit applicable to deterministic biological effects--the barendsen (Bd)., J Nucl Med.; 50(3):485-7. (2009)

[196] Strand SE, Znzonico P, Jonson TK. Pharmacokinetic modeling. Med Phys, (20):515-527. (1993)

[197] Makoid Michael, Vucherich Philip, Basic Pharmacokinetics,. http://kiwi.creighton.edu/pkinbook/. (1996-1999)

[198] Gu F. X., Karnik R., Wang A. Z., Alexis F., Levy-Nissenbaum E., Hong S., Langer R. S., and Farokhzad O. C., Targeted nanopartículas for cancer therapy, Nanotoday, 2(3):14-21 (2007)

[199] Goddu SM, Howell RW, Rao DV. Calculation of equivalent dose for Auger electron emitting radionuclides distributed in human organs. Acta Oncol;35:909–916 (1996)

[200] O’Donoghue J, Wheldon T. Targeted radiotherapy using Auger electrons emitters. Physics in Medicine and Biology 41:1973-1992. (1996)

[201] Kassis AI, Fayad F, Kinsey BM, Sastry KS, Taube RA, Adelstein SJ. Radiotoxicity of 125I in mammalian cells. Radiat Res;111:305–318 (1987)

[202] Goddu S M, Howell R W, Bouchet L G, Bolch W E, Rao D V., MIRD Cellular S Values, Society of Nuclear Medicine

[203] Carrasco R, Fernández de Córdoba, García Raffi L. Sanchís J. Métodos de Simulación Monte Carlo y sus aplicaciones, Valencia España, Universidad Politécnica de Valencia, (2000)

[204] Morin R L., Monte Carlo Simulation in the Radiological Sciences. United Kingdom CRC Press, (1988)

[205] Reuven R. Simulation and the Monte Carlo Method. New York USA, John Wiley and Sons (1981)

[206] Rojas Calderón E L. Aplicaciones de la simulación Monte Carlo en dosimetría y problemas de física médica, Contribuciones del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares al Avance de la Ciencia y la Tecnología en México Ed Conmemorativa (2010)

[207] Denise B. Pelowitz, editor. MCNPXTM Users Manual La-CP-05-0369, Versión 2.5.0. Los Alamos USA, (2005)

[208] Salvat F., Fernández Varea, Sempau J. PENELOPE a code system for Monte Carlo simulation of electron and poton transport. Workshop Proceedings, Issy-les.Molineaux, France, (2001)

[209] Sempau J, Fern.ndez-Varea J M, Acosta E and Salvat F 2003 Experimental benchmarks of the Monte Carlo ode PENELOPE, Nucl. Inst. Meth. In Phy. Res. B 207 107-23, (2003)

[210] P. L'Ecuyer, Efficient and portable combined random number generators. In: ACM, (New York: ACM) pp742-51, (1988)

[211] Rossi H, Zaider M, Microdosimetry and its applications, Springer (1996) [212] Microdosimetry, ICRU Report 36 (1983)


78

Capítulo 3

Marco Metodológico


79

3.1. Obtención de los radiofármacos [ 99mTc]EDDA/HYNIC-Lys 3-BN

(99mTc-BN), [ 99mTc]N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN (99mTc-Tat-BN) y

[188Re]N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN (188Re-Tat-BN)

3.1.1. Síntesis de HYNIC-Lys 3-BN

El ácido hidrazinonicotínico (HYNIC) se conjugó, en medio acuoso y a pH 9.0,

al grupo ε-amino del residuo de Lys3 en la región N-terminal de la BN utilizando

como precursor al succinimidil-N-Boc-HYNIC. Alternativamente se utilizó la

reacción en medio no acuoso con dimetilformamida (DMF) utilizando el

precursor N-Boc-HYNIC y como activador del grupo carbonilo al

hexafluorofosfato O-(7-azabenzotriazolil)-1,1,3,3 tetrametiluronium (HATU). El

proceso de purificación se realizó mediante cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) y extracción en fase sólida (SepPack cartridge C-18) [27]. El

péptido HYNIC-BN (Pyr-Gln-Lys (HYNIC)-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-

His-Leu-Met-NH2, peso molecular: 1726.9 g/mol) fue sintetizado por PiChem

(Graz, Austria) con una pureza > 98 % analizada por HPLC en fase reversa y

espectrometría de masas.

3.1.2 Síntesis de N 2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN

El péptido Tat(49-57) se conjugó a la secuencia de amino ácidos Gly-

Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm)-NH2 para producir un péptido del tipo Tat(49-57)-

espaciador-N2S2 (El N2S2 es el sitio de quelación del péptido para unirse al 99mTc). Por otro lado, la Lys3-BN se conjugó al reactivo maleimidopropil (MPA)

y el sitio Lys-MPA se utilizó como posición de unión para formar un tioéter con

la Cys del péptido Tat(49-57)-espaciador-N2S2. Los análisis por HPLC,

espectrometría de masas y análisis de aminoácidos se realizaron. En esta

parte del proyecto se contó con el apoyo de una compañía farmacéutica

(Bachem, CA, USA). Se obtuvo un certificado que indica que tiene una pureza

química >90% y un peso molecular de 3779.5 g/mol, pero la propuesta y el

diseño de la estructura del péptido híbrido es de este grupo de trabajo.


80

3.1.3. Modelado Molecular

La estructura de la molécula del péptido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN se construyó

tomando en cuenta la valencia, el tipo de unión, carga e hibridación. Las

energías mínimas (cálculos utilizando campos de fuerza de Mecánica

Molecular 3, MM3 aumentados) y el confórmero con menor energía (formalismo

CONFLEX) asociado a la geometría óptima de esta estructura se calcularon

utilizando el programa de cómputo para Windows® CAChe Pro 5.02 y/o 5.04

(Fujitsu Ltd., 2000-2001). De la aplicación secuencial de los métodos MM3

aumentado/CONFLEX se obtuvieron los confórmeros más estables para las

estructuras de los complejos N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN, Tc(O)N2S2-Tat(49-57)-

Lys3-BN y Re(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.

3.1.4. Procedimiento de radiomarcado de HYNIC-Lys 3-BN con 99mTc

La formulación liofilizada [1] se preparó disolviendo 1 mg de HYNIC-Lys3-BN en

1 ml de etanol al 10%, y se agregó a una solución de EDDA (ác.

etiléndiaminodiacético)-tricina-manitol. El cloruro estanoso (1.6 ml) se adicionó

bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se esterilizó por filtración en

membrana (Millipore, 0.22 µm) y se colocó 1 ml en 80 viales preesterilizados y

se liofilizaron por 24 h. A los estuches se les hicieron pruebas de esterilidad y

apirogenicidad. El procedimiento de radiomarcado se realizó adicionando 1 mL

de buffer de fosfatos 0.2 M y pH 7 a la formulación liofilizada e inmediatamente

740-1110 MBq (1 mL) de pertecneciato de sodio, obtenido de un generador

GETEC de 99Mo/99mTc (ININ, México). La solución se dejó reaccionar en un

baño seco a 92°C por 15 min. Todos los reactivos f ueron adquiridos en Sigma-

Aldrich Chemical Co. y utilizados como se recibieron.


81

3.1.5 Procedimiento de radiomarcado de N 2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN con 99mTc

La desprotección de los grupos acetamidometil (Acm) y el proceso de

radiomarcado del N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN, se realizaron en un solo paso por

reducción del pertecneciato de sodio con cloruro estanoso en presencia de

acetato de amonio y tartrato de sodio a temperatura ambiente. Fue necesario

tener un pH de 9.5 para desacetilar las cadenas laterales Cys14(Acm) y

Cys16(Acm) del péptido Tat(49-57)-espaciador-N2S2 que es necesario para la

unión del tecnecio [2-4].

El N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (1 mg) se disolvió en 200 µl de agua inyectable

(Pisa®, México), se agregaron 10 µL de esta solución a 25 µL de 99mTc-pertecneciato de sodio (185 MBq), se adicionaron 7 µL de una mezcla de

desprotección (50 mg/mL de tartrato de sodio en 0.1 M NH4OH/NH4CH3COOH,

pH 9.5) y 3 µL de solución reductora (0.5 mg de SnCL2/mL en 0.05 M HCl), la

mezcla final se incubó por 20 min a temperatura ambiente. El 99mTc-pertecneciato de sodio se obtuvo de un generador GETEC 99Mo/99mTc

(ININ-México). El resto de los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich

Chemical Co. y se utilizaron tal como se recibieron.

3.1.6. Procedimiento de radiomarcado de N 2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN con 188Re

El 188Re es ligeramente más rico en electrones respecto al 99mTc, por ello el

potencial de oxidación es mayor y tiende a ser inestable con diferentes agentes

quelantes. Sin embargo, complejos del tipo [Re=O]N2S2 son altamente estables

cuando se conjugan a diversas biomoléculas. La desprotección de los grupos

Acm y el proceso de radiomarcado del N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN, se realizó en

un solo paso por reducción del pertecneciato de sodio con cloruro estanoso a

pH ácido (2-4) y en presencia de tartrato de sodio [5,6].


82

El 188Re-perrenato de sodio se obtuvo de un generador de 188W/188Re

(Polatom). Los demás reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co.

y se utilizaron como fueron recibidos.

El N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (1 mg) se disolvió en 200 µL de agua inyectable

(Pisa®, Mexico). El ácido ascórbico (2 o 0 mg, utilizado como antioxidante) se

disolvió junto con el tartrato de sodio (816 mg) en 5 ml de solución de cloruro

estanoso (SnCl2 en 0.06 M HCl).

La solución de 188Re-perrenato de sodio (100 µL, 40 MBq) se ajustó a pH de 1,

se agregó a la solución del péptido junto con 300 µL de la solución de cloruro

estanoso-tartrato de sodio. El pH de la mezcla de reacción se midió y se dejó

reaccionar por 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 ó 24 h a temperatura ambiente ó 92°C. El

diseño factorial del experimento se muestra en la tabla 6 [5,6].

Tabla 6. Diseño factorial experimental utilizado para el marcado de Tat-BN con

188Re*.

Clase Niveles Valores

[Tat-BN] (mg/mL) 3 0.12, 0.29, 0.54

[Ácido ascórbico] (mg/mL) 2 0, 4.35

Temperatura (°C) 2 18, 92

Tiempo de incubación (h) 7 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 24

* Variable dependiente: pureza radioquímica.

3.1.7. Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN

Los análisis de pureza radioquímica se realizaron por cromatografía

instantánea de capa fina en gel de sílica (ITLC-SG, Gelman Sciences),

extracción en fase sólida (cartuchos Sep-Pack C-18) y por HPLC de fase

reversa.


83

Los análisis de ITLC-SG se efectuaron utilizando dos diferentes fases moviles:

2-butanona para determinar la cantidad de 99mTcO4- libre (Rf = 1, Rf = relación

de frentes o factor de retención y es la distancia recorrida por el soluto entre la

distancia recorrida por el solvente) y citrato de sodio 0.1 M con pH 5 para

establecer el porcentaje de 99mTc-tartrato y 99mTcO4- (Rf = 1). El valor de Rf del

péptido radiomarcado en cada sistema fue de 0.0.

Los cartuchos Sep-Pak se preacondicionaron con 5 mL de etanol seguidos de

5 mL de HCl 1 mM de aire. Una alícuota de 0.1 mL del péptido radiomarcado

se cargó en el cartucho previamente acondicionado, seguido de 5 mL de HCl

1 mM para eluir el 99mTcO4- libre y el 99mTc-tartrato. El péptido radiomarcado se

eluyó con 3 mL de etanol:solución salina (1:1 v/v) mientras que el 99mTc

reducido y el coloide formado quedaron en el cartucho.

Los análisis por HPLC se llevaron a cabo con el sistema Waters® usando el

software Millenium® con dos detectores, el de radiactividad y el de UV

arreglados en línea y la columna YMC ODS-AQ S5 (5 µm, 4.6 mm x 250 mm).

El gradiente se corrió a la tasa de flujo de 1 mL/min con las condiciones

siguientes: ácido trifluoroacético (TFA) 1% en agua (fase A) y TFA 1 % en

acetonitrilo (fase B). El gradiente utilizado se muestra en la tabla 7.

Tabla 7. Gradiente de concentración de la fase móvil

Tiempo

(min)

Flujo

(mL/min)

%

Fase A

%

Fase B

0 0 0 0

1 – 3 1 100 0

3 – 20 1 50 50

20 – 23 1 30 70

23 – 30 1 100 0


84

En este sistema los tiempos de retención para 99mTcO4- libre, 99mTc-Tat-BN y

188Re-Tat-BN fueron 3-4 min y 10-11 min (para ambos radiofármacos)

respectivamente.

3.1.8. Estabilidad en suero humano

Para estimar la estabilidad en suero humano de 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN

se utilizó el análisis por HPLC de exclusión molecular y el de ITLC-SG. Una

solución de 50 µL de péptido radiomarcado (0.5 µL/50 µg) se incubó a 37°C

con 1 mL de suero humano fresco. La estabilidad radioquímica se determinó a

partir de muestras para análisis de 10 µL tomadas a diferentes tiempos desde

20 min hasta 24 h. Un cambio en el perfil de radiactividad del HPLC hacia

pesos moleculares altos indica unión a proteínas, mientras que picos de bajo

peso molecular muestra catabolitos marcados o unión a cisteina del suero.

3.1.9. Desafío a la cisteina

La estabilidad de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN se probó a

través de su unión a la cisteina. Una solución fresca de cisteina se preparó

(10 mg/mL en PBS 0.1 M, pH 7.0) y se diluyó para tener diferentes

concentraciones. Posteriormente, 10 µL de cada solución se mezcló con 90 µL

del péptido radiomarcado (20 µM). Las relaciones molares de cisteina:péptido

fueron 5:1, 50:1 y 500:1. Los tubos de prueba se incubaron a 37°C por 1 h y se

analizó la pureza radioquímica por ITLC-SG.

3.2. Pruebas in vitro 3.2.1. Líneas celulares

Células de cancer de próstata PC3 y células de carcinoma mamario MCF7 y

MDA-MB231 se obtuvieron originalmente de ATCC (USA). Las células se

cultivaron a 37°C, con atmósfera de CO 2 al 5 % y humedad de 100 % en medio

RPMI (medio “Roswell Park Memorial Institute”) suplementado con 10% de

suero bovino fetal y antibióticos (estreptomicina, 100 µg/mL).


85

3.2.2. Prueba de internalización y unión no específ ica

Las células PC3, MCF7 o MDA-MB231 suministradas en medio fresco se

diluyeron para tener 1x106 células/tubo y se incubaron con aproximadamente

200,000 cpm de 99mTc-BN (péptido total 0.3 nmol), 99mTc-Tat-BN ó 188Re-Tat-BN (BN total 0.3 nmol) por triplicado a 37°C durante 0.083, 2, 4, 6 y

24 h. Los tubos de ensayo se centrifugaron (3 min, 500 g), se lavaron dos

veces con buffer de fosfato salino (PBS), y se determinó la actividad en el

botón celular en un detector de centelleo tipo pozo. La radiactividad en el botón

celular representó tanto el péptido externalizado (unido a la superficie celular)

como el péptido internalizado. Se tomó una alícuota con la actividad inicial que

significó el 100% y entonces se calculó la actividad captada en las células.

La actividad del péptido externalizado se removió con 1 mL de solución de

ácido acético 0.2 M/NaCl 0.5 M que se utilizó para resuspender el botón. Los

tubos de ensayo se centrifugaron, lavaron con PBS, volvieron a centrifugar y la

actividad en el botón se consideró como la internalización.

El botón celular se resuspendió con NaOH 1 M para lisar las células, se

centrifugó y lavó con PBS. La actividad del sobrenadante constituyó la

captación en el citoplasma. La unión no específica se determinó en paralelo

pero en presencia de Lys3-BN 10 µM (Bachem USA) para bloquear a los GRPr

en la membrana celular.

3.2.3. Internalización nuclear de 99mTc-Tat-BN

La distribución de 99mTc-Tat-BN en citoplasma y núcleo se estudió en las

células PC3, MCF7 y MDA-MB231. Las células se incubaron con el

radiofármaco durante 0.5, 1, 2, 4, 6 o 24 h, posteriormente, se separó el

citoplasma y el núcleo usando un estuche de extracción nuclear (Chemicon

International Inc., CA, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las

células se lavaron con 1 mL de ácido acético 0.2 M/NaCl 0.5 M. Los tubos de

ensaye se centrifugaron (250 x g), se lavaron con PBS, se volvieron a


86

centrifugar y la actividad del botón se midió en un detector de centelleo de tipo

pozo (contador gamma) y se consideró como el 100 % de la actividad

internalizada. El botón celular se resuspendió con la solución de lisis

citoplasmático. Para obtener la suspensión de células lisadas, la suspensión de

células se aspiró y se expulsó utilizando una jeringa con una aguja de calibre

27 y se centrifugó a 8000 x g durante 20 min a 4°C. El sobrenadante que

contenía la porción citosólica de las células lisadas se midió en un contador

gamma. El botón con la fracción nuclear del lisado de células se resuspendió

en la solución de extracción nuclear y después de lisar los núcleos la

suspensión se centrifugó a 1600 x g durante 5 min a 4°C. el extracto nuclear

fue el sobrenadante y en el botón permanecieron las membranas. La

radiactividad en la fracción con el extracto nuclear y el botón se midieron en un

contador gamma y se calcularon los porcentajes de actividad en cada

compartimento subcelular a diferentes tiempos.

3.2.4. Modelo Biocinético

Los porcentajes de actividad obtenidos a diferentes tiempos de los

radiofármacos en la membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer

se usaron para elaborar las curvas de actividad-tiempo de 99mTc. La biocinética

subcelular de 188Re-Tat-BN se calculó a partir del comportamiento biológico de 99mTc-Tat-BN (q(t) vs t), considerando el tiempo de vida media físico del 188Re

(e-λt , donde λ= ln2/17h). Los datos de la cinética de los radiofármacos se

ajustaron a una función exponencial utilizando el código OLINDA/EXM [7]. Al

integrar sobre el tiempo la actividad, como el número de desintegraciones por

unidad de tiempo, se obtiene el número total de desintegraciones (N = Bq·s) en

la membrana, citoplasma o núcleo expresado por unidad de actividad inicial

internalizada en las células de cáncer (ec 3.1).

∫∫∫∫−−−−====

tt dtteAN

00 )(λλλλ ec 3.1.


87

3.2.5. Análisis estadístico

Las diferencias entre los datos de los experimentos in vitro se evaluaron por la

prueba de t de Student. Dicha prueba se refiere al análisis estadístico de la

comparación de dos medias, es decir, se comparan dos grupos (normalmente

dos tratamientos) con relación a una variable de eficacia cuantitativa.

3.2.6. Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de

cáncer por inmunocitoquímica

Las células de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231 (1x105/pozo) se cultivaron a

37°C, una atmósfera de CO 2 al 5 % y humedad al 100 % en medio RPMI

suplementado con suero bovino fetal y antibióticos (estreptomicina 100 µg/mL)

en portaobjetos de vidrio tipo pozo. Las células se incubaron con 5 mL de Tat-

BN diluido en 1 mL de medio RPMI por 1 h.

Posterior al tratamiento las células fueron enjuagadas con PBS frío, se fijaron

con formaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 25% y se

lavaron con PBS. Después de incubarlas a temperatura ambiente durante

30 min con BSA (albúmina de suero bovino) al 1% en PBS, las células se

incubaron por 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo primario VIH Tat

(1:500) (Abcam Inc., UK) y luego con el anticuerpo secundario (1:700)

conjugado con fluoróforos (Anticuerpo secundario de oveja IgG – H&L (FITC);

Abcam Inc., UK). Después del marcado con los anticuerpos primario y

secundario, las células se enjuagaron con PBS previo al montaje en los

portaobjetos (ProLong Gold; Molecular Probes). Los controles negativos

incluyeron células sin tratamiento con Tat-BN y/o sin anticuerpo primario.

Las imágenes del Tat-BN internalizado en las tres líneas de células de cáncer

marcadas por inmunofluorescencia se realizaron en un microscopio confocal

Zeiss LSM510 META, con un objetivo 40x/0.75Ph2 Plan-Neofluar, y un filtro BP

500-530 IR y una longitud de onda 488 nm, 20 %.


88


El efecto antiproliferativo del 99mTc-Tat-BN en las células de cáncer PC3, MCF7

o MDA-MB231 se evaluó utilizando un estuche de ensayos de proliferación

celular CyQuant® (Molecular Probes, Invitrogen). El estuche utiliza un colorante

verde fluorescente patentado que muestra un aumento en la fluorescencia

cuando se une a los ácidos nucleares celulares. Una curva estándar de

referencia se creó para convertir los valores de fluorescencia a cantidad de

ADN utilizando un ADN bacteriófago-λ y siguiendo el protocolo del fabricante.

Aproximadamente 1x103 células de las líneas PC3, MCF7 o MDA-MB231 se

sembraron por pozo en microplacas de cultivo de 96 pozos. Las células se

cultivaron por 24 h y el medio de crecimiento se remplazó por medio fresco

conteniendo dos concentraciones diferentes de los fármacos Tat-BN (1.3 y 2

µM) o 99mTc-Tat-BN (14 MBq/nmol, 1.3 µM (3.6 MBq) y 2.0 µM (5.5 MBq))

(n=6). Para los controles positivos y negativos se utilizaron células incubadas

con medio sin estímulo (células sin tratamiento como control negativo) o con

astemizol 2.5 µM como agente antiproliferativo (control positivo) (n=6) [8]. Las

células se cultivaron durante 6 días a 37°C y el me dio se remplazó al día 3

utilizando una segunda dosis de estímulo de Tat-BN (1.3 y 2.0 µM) o 99mTc-Tat-

BN (7 MBq/nmol, 1.3 µM (1.8 MBq) y 2 µM (2.8 MBq). En el día 6, las células

fueron congeladas durante 30 min (-70°C), descongel adas y lisadas al agregar

la solución de CyQuant® con el marcador verde fluorescente. La fluorescencia

se midió directamente a una excitación/emisión máxima de 480/520 nm. La

absorbancia de los pozos se midió en un lector de microplacas (Bio-Tek,

Sinergy HT). Finalmente, las absorbancias de los pozos se correlacionaron con

las concentraciones de ADN (ng/mL) utilizando la curva estándar.


89

3.3. Pruebas in vivo

3.3.1. Estudios de Biodistribución

Los estudios de biodistribución y captación tumoral en ratones se realizaron de

acuerdo con las reglas y regulaciones de la Norma Oficial Mexicana

062-ZOO-1999.

Ratones sanos BALB/c de 6 semanas de edad se utilizaron para los estudios

de biodistribución. En la vena de la cola se les inyectó 1.11 MBq (30 µCi) en

0.04 mL de 99mTc-Tat-BN. Los ratones (n=3) se sacrificaron a las 0.25, 0.5, 2, 4,

y 24 h posteriores a la inyección. Muestras de corazón, pulmón, hígado, bazo,

páncreas, riñones, intestinos, músculo, hueso y sangre se tomaron, colocaron

en tubos de plástico previamente pesados. La actividad se determinó en un

detector centelleador tipo pozo (Canberra) junto con 6 alícuotas de 0.5 mL del

estándar diluido que representó el 100% de la actividad inyectada. El promedio

de las actividades se utilizó para obtener el porcentaje de actividad inyectada

por gramo de tejido (%AI/g).

3.3.2. Inducción de tumores en ratones atímicos

Los ratones atímicos machos (20-22 g) que se utilizaron se mantuvieron en

jaulas estériles con camas de aserrín, temperatura y humedad constante y

periodos de luz/obscuridad 12/12 h. Se les proporcionó a los ratones acceso ad

libitum a alimentos y agua (standard PMI 5001 feed).

Los tumores de próstata se indujeron en la parte trasera superior de 4 ratones

atímicos de 6-7 semanas de edad vía una inyección subcutánea de células

PC3 (1x106) suspendidas en 0.2 mL de PBS. Los sitios de inyección se

observaron a intervalos regulares para verificar la formación y progresión

tumoral.


90

3.3.3. Imágenes Los ratones atímicos con tumores implantados se sacrificaron 2 h posteriores a

la administración en la vena de la cola de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN o 99mTc-BN (3 MBq en 0.04 mL). Las imágenes se tomaron con una gamma

cámara utilizando un colimador tipo pinhole. Finalmente, se llevó a cabo la

disección completa de los órganos para determinar el porcentaje de actividad

inyectada por gramo de tejido (%AI/g) como se describe anteriormente.

3.4. Dosimetría subcelular

La dosis absorbida de radiación depositada en el núcleo de las células PC3,

MCF7 y MDA-MB231 de 99mTc-Tat-BN o 188Re-Tat-BN se estimó por el método

Monte Carlo utilizando el programa Penmain del código PENELOPE 2008. La

geometría y tamaño de las células y núcleo se construyó a partir de las

imágenes de inmunofluorescencia (n=50) y las dimensiones promedio se

determinaron utilizando el Software Zeiss LSM Image Examiner (Carl Zeiss

AG). Los volúmenes de los compartimentos subcelulares se calcularon (tabla 8)

y la composición elemental de la membrana, citoplasma y núcleo se obtuvo de

la literatura (tabla 9) [9,10].


91

Tabla 8. Geometría y volumen del citoplasma y núcleo de las células PC3,

MCF7 y MDA-MB231.

Volumen ( µm3) Línea celular

Citoplasma Núcleo Geometría

PC3 (Longitud promedio 80 x 33 µm, profundidad 20 µm: núcleo 23 x

17 µm)*

23048 3568

MCF7 (Longitud promedio 56 x 22 x 49 µm, profundidad 14 µm:

núcleo 16 x 11 µm)*

10239 1112

MDA-MB231 (Longitud promedio 66 x 32 µm, profundidad 17 µm: núcleo 18 x

14 µm)*

16114 1770

*Zeiss LSM Image Examiner Software (Carl Zeiss AG)

Tabla 9. Composición elemental de una célula humana, utilizada para generar

el archivo de material de la simulación por el método Monte Carlo [9,10].

Elementos H C N O P S Otros (Porcentaje en peso)

Núcleo

celular 10.6 9.0 3.2 74.2 2.6 0.4 ---------------

Citoplasma

y

Membrana

10.0 18.0 3.0 65.0 1.0 0.25

Ca(1.5), k(0.35), Na(0.15),

Mg(0.05), Cu, Zn, Se, Mo, F,

Cl, I, Mn, Co, Fe (todos 0.70)

Li, Sr, Al, Si, Pb, V, As, Br

(todos 0.001)


92

La simulación de la fuente se realizó utilizando todas las emisiones de

electrones de CI y Auger (incluidos los Coster-Kroning y Super-Coster-Kroning)

del espectro de 99mTc reportado por la AAPM (tabla 10) [11]. La fuente de 188Re

se simuló utilizando las emisiones β con mayor probabilidad de ocurrencia,

electrones CI de más alta probabilidad de emisión y los electrones Auger del

espectro reportado por el Laboratorio Nacional Henri Bequerel de Francia

(tabla 11) [12].

Tabla 10. Espectro de radiación promedio del 99mTc utilizado como fuente en la

simulación por el método Monte Carlo.

Emisión Energía promedio

(MeV) Yield/decaimiento

IC 1 M,N… 1.82E-03 9.91E-01

IC 2 K 1.19E-01 8.43E-02

IC 2 L 1.37E-01 1.36E-02

IC 2 M;N… 1.40E-01 2.50E-03

IC 3 K 1.22E-01 5.90E-03

IC 3 L 1.40E-01 2.50E-03

Auger KLL 1.53E-02 1.26E-02

Auger KLX 1.78E-02 4.70E-03

CK LLX 4.29E-05 1.93E-02

Auger LMM 2.05E-03 8.68E-02

Auger LMX 2.32E-03 1.37E-02

Auger LXY 2.66E-03 1.20E-03

CK MMX 1.16E-04 7.47E-01

Auger MXY 2.26E-04 1.10E+00

CK NNX 3.34E-05 1.98E+00


93

Tabla 11. Espectro de radiación promedio del 188Re utilizado como fuente en la

simulación por el método Monte Carlo.

Emisión Energía promedio

(MeV) Yield/decamiento

β 204.30E-03 4.4E-03

β 345.33E-03 6.30E-03

β 527.78E-03 1.65E-02

β 728.88E-03 2.56E-01

β 795.41E-03 7.11E-01

Auger L 6.88E-03 6.95E-02

Auger K 57.107E-03 2.10E-03

CE K 81.17E-03 4.88E-02

CE L 143.10E-03 5.70E-02

CE M 152.50E-03 1.44E-02

La energía depositada (MeV) por desintegración por gramo del núcleo celular

se convirtió a Gy (J/Kg)/desintegración (Bq·s) y la D en el núcleo producida por 99mTc-Tat-BN o 188Re-Tat-BN se calculó multiplicando los Gy/Bq·s por el

número total de desintegraciones (N) que ocurrieron en el núcleo por unidad de

radiactividad (Bq) internalizada, basado en los resultados de la biocinética

experimental. Las contribuciones a la D en el núcleo provenientes de la

captación de los radiofármacos en la membrana y citoplasma también se

calcularon para obtener la D total al núcleo por cada Bq internalizado en las

células de cáncer PC3, MCF7 o MDA-MB231 (Gy/Bq). Los porcentajes de

absorción de cada emisión (espectro, electrones Auger y CI) en cada región

subcelular se calcularon de la siguiente manera:

100*odecaimient por emitida Energía

célula la en absorbida Energía% ====Absorción ec 3.2.


94

100*célula la en absorbida Energíasubcelular región la en absorbida Energía

% ====ónSubabsorci ec 3.3.

3.5. Referencias

[1] Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Rodriguez-Cortes, J., Pedraza-Lopez, M.,

Ramirez-Iglesias, M.T., Preparation and evaluation of 99mTc- EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin for imaging of GRP receptor-positive tumours. Nucl. Med. Commun. 27, 371–376 2006.

[2] Bogdanov, A., Tung, C.-H., Bredow, S.,Weissleder, DNA binding chelates for nonviral gene delivery imaging. Gene Ther. 8, 515–522 R., 2001.

[3] Zhang, X., Cai,W., Cao, F., Schreibmann, E.,Wu, Y.,Wu, J.C., Xing, L., Chen, X., 18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostate cancer. J. Nucl. Med. 47, 492–501. 2006.

[4] Zhang, Y.-M., Tung, C.H., He, J., Liu, N., Yanachkov, I., Liu, G., Rusckowski, M., Vanderheyden, J.L., Construction of a novel chimera consisting of achelator-containing Tat peptide conjugated to amorpholino antisense oligomerfor technetium-99m labeling and accelerating cellular kinetics. Nucl. Med. Biol.33, 263–269. 2006.

[5] L.Meléndez Alanfort, G. Ferro Flores, C. Arteaga de Murphy, M. Pedraza-López, M.A. González Zavala, J.I. Tendilla, L. García Salinas Labeling peptides with rhenium-188., Int. J. Pharm. 1999.

[6] Ferro-Flores G, Torres-Garcia E, Garcia-Pedroza L, Arteaga de Murphy C, Pedraza-Lopez M, Garnica-Garza H. An efficient, reproducible and fast preparation of 188Re-anti-CD20 for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma. Nucl Med Commun 26:793-799 2005.

[7] Stabin MG, Sparks RB, Crowe E. OLINDA/EXM: The second-generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine. J Nucl Med.; 46:1023-7, 2005.

[8] Garcia-Ferreiro RE, Kerschensteiner D, Major F, Monje F, Stumer W, Pardo LA. Mechanism of block of hEag1 K+ channels by imipramine and astemizole. J Gen Physiol.;124:301-17, 2004.

[9] ICRU 44, 1989. Tissue substitutes in radiation dosimetry and measurement. ICRU Report 44- International Commission on Radiation Units and Measurements. , Rodwell V.

[10] Organic Chemistry: The Elemental Basis of Life. John Wiley & Sons Inc. USA, 1979.

[11] Howell R. Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report 2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No. 6. Med Phys. 19:1371-83. 1992.

[12] Decay Data Evaluation Project www.nucleide.org/DDEP_WG/DDEPdata.htm BNM-CEA/LNHB-Table de Radionucléides-CEA ISBN 2 7272 0200 8 188 75 Re, LBNL /E. Browne 2002.


95

Capítulo 4

RESULTADOS

99mTc-N2S2-Tat(49-57)-BN


96

4.1 Diseño y preparación 4.1.1 HYNIC-Lys 3-BN En la figura 8 se observa el diseño de la molécula, con el sitio de

reconocimiento biológico de la BN y la zona de quelación con el 99mTc a través

del quelante bifuncional HYNIC.

Figura 8. Estructura de la molécula HYNIC-Lys3-BN.


97

4.1.2 N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN En la figura 9 se observa el diseño del N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN. Por un lado

tiene la secuencia de aminoácidos de la Lys3-BN, que contiene el sitio de

reconocimiento específico para su unión con los GRPr, por otro lado, tiene al

péptido Tat(49-57) que le permite a la molécula internalizarse al citoplasma y

llegar hasta el núcleo celular y finalmente el sitio de quelación con el 99mTc.

Figura 9. Estructura de la molécula N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.


98

4.2 Modelaje Molecular: Diseño de (Acm) 2S2N2-Tat-Lys 3-BN, Tc(O)S 2N2-

Tat-Lys 3-BN por cálulos semiempíricos

Un buen modelaje molecular genera estructuras que son similares a aquellas

que se obtienen experimentalmente. Sin embargo, este parecido puede verse

afectado por el tamaño, la carga y la movilidad de las moléculas, por ejemplo,

péptidos grandes y cargados. Teniendo en cuenta estas características, el

péptido híbrido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (figura 10) se diseñó con cálculos

semiempíricos para estudiar la posibilidad de su formación. Las energías

mínimas de la estructura y confórmero más estables fueron 271 y 233 kcal/mol,

respectivamente. El complejo oxo-Tc que se formó con el péptido híbrido se

modeló considerando dos factores de este tipo de sitio quelante:

a) Los dos tioles terminales S2(Acm)2 se pueden ionizar si se remueve el

acetamindometil de los grupos protectores [13, 14].

b) Los grupos amina pueden fácilmente disminuir la pérdida de protones [14].

Entonces se espera que el sitio de quelación forme un complejo coordinado

[N2S2]4- alrededor del núcleo de [Tc(O)]3

+, formando de esta manera un

complejo con carga negativa cinco-coordinado. Con base en esto se calculó la

molécula del complejo peptídico [TcO(N2S2)]-1-Tat(49-57)-Lys3-BN (figura 10)

utilizando el confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido. La

energía mínima de la estructura optimizada fue 300 kcal/mol y la del

confórmero más estable igual a 262 kcal/mol. En la tabla 12 se dan algunos

parámetros geométricos de este complejo.


99

Tabla 12. Distancias de enlace de los complejos calculados Tc(O)-N2S2-Tat-

Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y Conflex.

Compuesto Geometría Distancias de

enlace (Å)

Radio del enlace

Tc-N1: 2.314

RN = 1.003

Tc-N2: 2.308 RS = 1.003

Pirámide cuadrada

distorcionada

Tc-S1: 2.618 TcN2/TcO =1.04

Tc-S2: 2.611 TcS1/TcO = 1.19

Tc=O: 2.210

[99mTc(O)-(N2S2)]-1-Tat-Lys3-BN


100

Figura 10. (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N2S2-

Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más

estable de la molécula del péptido híbrido Tc(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN

modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio

de quelación del Tc(O): [Tc(O)N2S2].


101

4.3 Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN

(99mTc-Tat-BN)

Los resultados de la pureza radioquímica de 99mTc-Tat-BN obtenidos por ITLC,

Sep-Pak y HPLC (figura 11) mostraron una pureza radioquímica promedio de

92 ± 2 % (n>30) y permaneció estable hasta las 24 h sin purificación posterior

al radiomarcado (figura 12). La actividad específica promedio fue de

14 MBq/nmol.

Figura 11. (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma-

UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 99mTc-Tat-BN 2 h

posteriores al radiomarcado.


102

Figura 12. Radiocromatogramas HPLC en fase reversa de 99mTc-Tat-BN recién

marcado y 24 horas posteriores a la preparación (a temperatura ambiente).

4.4 Estabilidad en suero humano de 99mTc-Tat-BN

La pureza radioquímica del 99mTc-Tat-BN después de la incubación en suero

humano por 1 h fue > 90%, después de 3 y 24 h disminuyó a 82 % y 65 %

respectivamente. La unión a proteínas fue 36.4 ± 2.7 a las 2 h sin trasquelación

del 99mTc a la cisteina (figura 13).

4.5 Desafío a la cisteina

Después de incubar el radiofármaco con cisteina a 37°C con relaciones

molares 5:1, 50:1 y 500:1 de cisteina:péptido, los análisis por ITLC mostraron

que la radiactividad disociada de 99mTc-Tat-BN, 7, 16 y 41% respectivamente

indicando una estabilidad radiofarmacéutica adecuada.


103

Figura 13. HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el

cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea

punteada corresponde al radiocromatograma de 99mTc-Tat-BN después de

incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h .

4.6 Pruebas in vitro

4.6.1 Captación in vitro de 99mTc-Tat-BN

Los resultados de la prueba in vitro mostraron captación en las tres líneas

celulares, PC3, MCF7 y MDA-MB231, cuya especificidad se comprobó al inhibir

la captación con la incubación previa con BN fría (tabla 13). En general la unión

en las células bloqueadas fue menor al 3% del total de actividad para 99mTc-BN

y menor al 9% para el 99mTc-Tat-BN en todos los tiempos. Esto comprueba la

especificidad in vitro de ambos radiofármacos por los GRPr que se localizan en

la membrana de las tres líneas celulares, debido a que ambos compuestos

tienen BN.


104

Sin embargo, se observa una mayor captación del radiofármaco 99mTc-Tat-BN,

ya que es un híbrido que contiene BN, que se une específicamente a los GRPr

de la membrana, pero además, aumenta la captación e internalización debido

al péptido Tat que tiene la capacidad de internalizar la molécula al citoplasma

celular e incluso llegar hasta el núcleo.

Tabla 13. Captación celular de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN en diferentes líneas de

cáncer (% del total de actividad ± Desviación estándar (DS)).

PC3 MCF7 MDA-MB231 Tiempo

(h) Tat-BN Hynic-BN Tat-BN Hynic-BN Tat-BN Hynic-BN

0.083 22.01 ± 2.08 10.29 ± 1.47 19.27 ± 3.55 7.83 ± 0.71 24.33 ± 2.82 5.91 ± 0.26

1 21.43 ± 2.91 8.59 ± 0.59 17.43 ± 1.13 6.79 ± 0.45 19.43 ± 1.3 5.48 ± 0.21

2 24.88 ± 2.12 12.85 ± 0.90 18.27 ± 2.14 8.97 ± 0.92 15.98 ± 1.07 5.06 ± 0.57

4 28.10 ± 3.86 17.62 ± 1.86 13.15 ± 1.27 7.48 ± 0.30 14.40 ± 1.79 4.16 ± 0.39

6 25.43 ± 1.79 9.63 ± 0.47 12.65 ± 0.94 7.98 ± 0.22 13.60 ± 0.96 4.19 ± 0.52

24 23.91 ± 1.53 8.21 ± 0.64 12.30 ± 1.16 2.32 ± 0. 49 14.24 ± 0.34 3.43 ± 0.27

4.6.2 Internalización celular de 99mTc-Tat-BN

El aumento en la internalización del radiofármaco 99mTc-Tat-BN, comparado

con el 99mTc-BN, se muestra en las gráficas de internalización de las tres líneas

celulares (figura 14). El máximo de internalización en las células PC3 (figura 14

(A)) y MCF7 (figura 14 (B)) se alcanza entre las 2 y 4 horas de incubación, pero

en las células MDA-MB231 (figura 14 (C)) tiene un comportamiento distinto ya

que disminuye la internalización celular al paso del tiempo y muestra un

máximo de internalización en los primeros minutos de incubación. Estos

resultados comprueban que éste péptido híbrido, tiene la capacidad de

penetrar la membrana celular.


105

Figura 14. Internalización dependiente del tiempo de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN

en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).


106

4.6.3 Biodistribución subcelular de 99mTc-Tat-BN

Los porcentajes de actividad internalizada de 99mTc-Tat-BN en cada

compartimento subcelular a diferentes tiempos, se observan en la figura 15

para células PC3, MCF7 y MDA-MB231.

La mayor captación del radiofármaco se produce en el núcleo de las tres líneas

celulares, seguido por el citoplasma y finalmente la membrana. Estos

resultados comprueban que además de la especificidad del radiofármaco

(debido a la BN) hacia las células que sobre expresan el GRPr (PC3, MCF7 y

MDA-MB231), las características que le da el péptido Tat al radiofármaco

híbrido, evidencian la internalización del 99mTc-Tat-BN al citoplasma. Asimismo,

la NLS con la que cuenta el mismo péptido permite que la molécula se mueva

hasta el núcleo a través de los poros perinucleares [12]. Algunas diferencias en

la captación e internalización pueden deberse al origen clonal de las células, al

número de pases que hayan tenido al momento de la realización del

experimento, así como a la diferencia en el número de receptores que expresa

cada línea celular.


107

Figura 15. Biocinética del 99mTc-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo de

células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).


108

4.6.4 Modelos biocinéticos subcelulares de 99mTc-Tat-BN

En la tablas 14, 15 y 16 se muestran los modelos biocinéticos del 99mTc-Tat-BN

en membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer PC3, MCF7 y

MDA-MB231 respectivamente. Así como el número total de desintegraciones

(N = Bq·s) por cada Bq de 99mTc captado en la célula, que ocurrieron en cada

compartimento subcelular a tiempo infinito al integrar sobre el tiempo, cada

modelo biocinético.

Tabla 14. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer PC3.

Región celular

Modelo Biocinético A(t) [Bq]

(N) Número total de

desintegraciones [Bq·s]

Membrana 956.0

31.163.84.41)(2

0427.085.0847.0

====

++++++++==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

3229

Citoplasma 998.0

4.274.315.45)(2

295.0137.0579.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

8766

Núcleo 994.0

9.634.548.91)(2

321.0123.0628.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

17826


109

Tabla 15. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MCF7.

Región celular




Membrana 987.0

74.202.48.63)(2

0747.0075.01.1

====

++++++++==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

5338

Citoplasma 998.0

4.5965.860)(2

285.00871.0508.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

6826

Núcleo 990.0

7.819.45103)(2

327.0103.0630.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

19151

Tabla 16. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.

Región celular




Membrana 1

4.1983.68.19)(2

277.00948.031.2

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

4810

Citoplasma 976.0

35.57.2582.1)(2

0848.00847.0353.0

====

++++++++==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

13380

Núcleo 1

3.128.41188)(2

0784.0183.083.6

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

12880


110

Como se observa en las tablas anteriores la mayoría de los modelos

biocinéticos muestran que el mayor número de desintegraciones del 99mTc

ocurren en el núcleo de las tres líneas celulares de cáncer.

El mayor número de desintegraciones que ocurren en el citoplasma de las

células MDA-MB231 con respecto a las del citoplasma de las células MCF7

(tablas 15 y 16) puede estar asociado con una mayor actividad lisosomal en las

MDA-MB231, porque el proceso de internalización del complejo BN/GRPr

involucra atrapamiento por parte de los lisosomas [15].

4.6.5 Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de

cáncer por inmunocitoquímica

Las imágenes obtenidas por microscopía confocal de las células PC3, MCF7 y

MDA-MB231 se observan en las figuras 16, 17 y 18. Estas imágenes

demuestran que el Tat-BN se internalizó en el núcleo de las tres líneas

celulares de cáncer utilizadas en este estudio. En las imágenes control (A) (sin

Tat-BN), el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia se internalizó al

citoplasma, pero no al núcleo. Cuando las células fueron estimuladas con el

péptido Tat-BN e incubadas con el anticuerpo primario Anti-Tat y el anticuerpo

secundario marcado con fluorescencia, se observó la fluorescencia en el

núcleo (B) demostrando la internalización nuclear del Tat-BN.


111

Figura 16. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen

control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con

fluorescencia B) Células incubadas con Tat-BN, anti-Tat y anticuerpo

secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase,

E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las

células, como indican las flechas.


112

Figura 17. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MCF7. A) Imagen







113

Figura 18. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen







114

4.6.6 Efecto del 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular

El efecto del 99mTc-Tat-BN en la proliferación celular a diferentes

concentraciones (5.4 o 8.1 MBq) se estudió en células de cáncer (figura 19).

Como se muestra en la figura 19, el 99mTc-Tat-BN (5.4 MBq) inhibió

significativamente la proliferación de células MDA-MB231 (35.80 %), MCF7

(45.71 %) y PC3 (52.98 %) con respecto a las células no tratadas (p < 0.05).

Sin embargo, en presencia de 1.3 y 2.0 µM de Tat-BN se observó incremento

en la proliferación celular debido a la actividad mitogénica del Tat [16] y esta

puede ser la razón por la cual aparentemente 8.1 MBq (2.0 µM de Tat) de 99mTc

no es más efectivo que 5.4 MBq (1.3 µM de Tat) para reducir la concentración

de ADN. No obstante, se puede deducir que en el caso del radiofármaco 99mTc-

Tat-BN el efecto antiproliferativo del 99mTc (por electrones CI y Auger)

prevalece sobre el efecto mitogénico del Tat (figura 19).

La actividad mitogénica del Tat puede explicar también la baja concentración

de ADN que se obtiene con astemizol (inhibidor del proceso de proliferación

celular) comparado con el del 99mTc-Tat-BN en las células PC3 y MDA-MB231.

Sin embargo, la proliferación en células MCF7 fue similar con 99mTc-Tat-BN que

con el tratamiento con astemizol. Estos datos se correlacionan bien con los

resultados de la biocinética (Tablas 14, 15 y 16) del radiofármaco.


115

Figura 19. Efecto del Tat-BN y 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular: la

proliferación se correlaciona directamente con la concentración de ADN

(ng/mL).


116

4.7 Pruebas in vivo

4.7.1 Estudios de Biodistribución in vivo de 99mTc-Tat-BN

La biodistribución del 99mTc-Tat-BN se muestra en la tabla 17. Se observa

excreción renal predominantemente pero también se presenta eliminación

hepatobiliar. Los pulmones presentaron captación del radiofármaco debido a

que los GRPr están expresados de manera natural en dicho órgano [17]. Sin

embargo, el páncreas mostró mayor captación que otros órganos no excretores

como el bazo, músculo, e incluso pulmones debido a la presencia de los GRPr,

indicando que la BN actúa como el sitio de reconocimiento biológico específico.

Tabla 17. Biodistribución del 99mTc-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a

diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).

% AI/g (promedio ± DS) Órgano

0.25 h 0.5 h 2 h 4 h 24 h

Sangre

Corazón

Pulmones

Hígado

Bazo

Páncreas

Riñones

Intestino

Músculo

Hueso

7.81±2.62

2.43±0.78

2.68±0.94

4.91±1.57

1.28±0.40

2.89±1.01

16.87±4.85

3.70±1.49

1.47±0.26

2.44±0.79

6.02±2.59

1.62±0.63

2.26±0.44

3.97±1.70

0.80±0.30

2.65±0.77

22.99±8.57

11.30±7.71

1.28±0.70

1.74±0.60

1.12±0.17

0.33±0.07

0.60±0.08

2.03±0.04

0.35±0.05

1.87±0.11

29.02±2.78

2.06±0.33

0.58±0.23

0.42±0.05

1.00±0.03

0.32±0.03

0.56±0.04

2.11±0.32

0.55±0.17

1.43±0.24

27.72±2.18

2.05±0.98

0.43±0.14

0.78±0.26

0.07±0.02

0.09±0.10

0.09±0.03

0.52±0.17

0.23±0.07

0.21±0.04

8.45±0.81

0.17±0.08

0.03±0.02

0.19±0.17


117

4.7.2 Imágenes de ratónes atímicos con tumores indu cidos PC3

La tabla 18 muestra la biodistribución en ratones atímicos con tumores

inducidos de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Las razones

tumor/sangre, tumor/músculo y páncreas/sangre para el 99mTc-BN fueron de

4.4, 7 y 8.2 respectivamente y 3.2, 8 y 1.4 para el 99mTc-Tat-BN

respectivamente. Las imágenes in vivo muestran captación en el tumor. La

disección completa de los órganos remarcó la captación del 99mTc-Tat-BN

(figura 20 (A)) y 99mTc-BN (figura 20 (B)) en el tumor de células PC3. La razón

tumor/músculo obtenida a partir de las cuentas por pixel de la imagen

correspondientes a 99mTc-BN fue de 7 y de 8.5 para 99mTc-Tat-BN,

demostrando que diferencia entre los dos radiofármacos utilizados no es

estadísticamente significativa.

Tabla 18. Biodistribución de 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN en ratones atímicos con

tumores inducidos PC3, 2 h posteriores a la administración de los

radiofármacos (n=3).

% AI/g (Promedio ± DS) Órgano

99mTc-BN 99mTc-Tat-BN

Sangre 0.40±0.03 1.22±0.16

Corazón 0.25±0.02 0.43±0.08

Pulmón 0.50±0.04 0.54±0.07

Hígado 0.85±0.04 2.14±0.05

Bazo 0.40±0.05 0.42±0.04

Páncreas 3.29±0.21 1.69±0.12

Riñones 23.5±1.21 28.12±2.18

Intestino 0.85±0.13 1.96±0.23

Músculo 0.25±0.03 0.48±0.05

Tumor 1.75±0.11 3.84±0.25


118

Figura 20. Captación de (A) 99mTc-Tat-BN y (B) 99mTc-BN en tumores inducidos

de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 en ratones atímicos 2 h

posteriores a la administración de los radiofármacos (la disección de los

órganos remarcó la captación en los tumores).


119

4.8 Dosis absorbida celular de 99mTc-Tat-BN

Al estimar la dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN, utilizando el método Monte

Carlo, con el código PENELOPE 2008, se pudo obtener la dosis absorbida en

cada compartimento subcelular por cada desintegración del radionúclido

(Gy/Bq·s), y al multiplicarlo por el número total de desintegraciones (Bq·s) se

obtuvieron los Gy/Bq la dosis absorbida en el núcleo y citoplasma celular

normalizado por cada unidad de actividad captada en la célula (Bq) (Tablas 19,

22 y 25 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231 respectivamente).

También se obtuvieron las contribuciones de cada emisión (electrones Auger y

CI) a la dosis absorbida total en cada compartimento subcelular (Tablas 20, 23

y 26 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231 respectivamente).

Del mismo modo a partir de la energía total emitida de cada tipo de emisión

(electrones Auger o CI), así como de la energía total emitida del espectro

completo utilizado (electrones Auger y CI) y de la porción de energía absorbida

en el núcleo y citoplasma de las células simuladas, se calculó el porcentaje de

absorción y subabsorción en la célula, de las ecuaciones 3.2 y 3.3 (Tablas 21,

24 y 27 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231 respectivamente).


120

4.8.1 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3

Tabla 19. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3.

Posición

de la

fuente

Blanco Dosis Absorbida

(Gy/Bq ·s)

Dosis Absorbida

(Gy/Bq)

Núcleo 2.25E-06 ± 2.25E-08 4.02E-02 ± 4.00E-04

Citoplasma 2.21E-05 ± 4.90E-08 1.94E-01 ± 4.30E-04

Membrana

Citoplasma

1.44E-06 ± 2.36E-08 4.65E-03 ± 7.63E-05

Total 2.58E-05 ± 9.51E-08 Total 2.39E-01 ± 9.06E-04

Núcleo 1.39E-04 ± 2.90E-07 2.47E+00 ± 5.17E-03

Citoplasma 2.43E-06 ± 5.99E-08 2.13E-02 ± 5.25E-04

Membrana

Núcleo

1.13E-06 ± 4.12E-08 3.64E-03 ± 1.33E-04

Total 1.42E-04 ± 3.91E-07 Total 2.50E+00 ± 5.83E-03

Tabla 20. Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y

núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida

de radiación.

Blanco Tipo de

emisión

Dosis Absorbida

(Gy/Bq ·s)

% de

contribución

CI 1.92E-05 ± 3.15E-08 74.47 Citoplasma

Auger 6.41E-06 ± 3.70E-08 24.83

CI 1.01E-04 ± 8.88E-08 70.82 Núcleo

Auger 4.04E-05 ± 2.06E-07 28.40


121

Tabla 21. Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del

espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en

células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

Espectro Electrones CI Electrones Auger

Blanco

subcelular

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 1.99 9.19 2.06 12.21 0.00 0.00

Núcleo 18.97 87.54 14.10 83.40 99.83 100.00

Membrana 0.71 3.27 0.74 4.39 0.00 0.00

Total 21.67 16.91 99.83

4.8.2 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7

Tabla 22. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7.

Posición

de la

fuente


(Gy/Bq ·s)

Dosis Absorbida

(Gy/Bq)

Núcleo 4.09E-06 ± 4.26E-08 7.84E-02 ± 8.15E-04

Citoplasma 4.80E-05 ± 1.01E-07 3.27E-01 ± 6.90E-04

Membrana

Citoplasma

4.71E-06 ± 5.72E-08 2.51E-02 ± 3.05E-04

Total 5.68E-05 ± 2.01E-07 Total 4.31E-01 ± 1.81E-03

Núcleo 4.25E-04 ± 8.82E-07 8.13E+00 ± 1.69E-02

Citoplasma 6.55E-06 ± 1.64E-07 4.47E-02 ± 1.12E-03

Membrana

Núcleo

2.92E-06 ± 1.04E-07 1.56E-02 ± 5.56E-04

Total 4.34E-04 ± 1.15E-06 Total 8.19E+00 ± 1.86E-02


122


núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida

de radiación.

Blanco Tipo de

emisión

Dosis Absorbida

(Gy/Bq ·s)

% de

contribución

CI 4.16E-05 ± 5.80E-08 73.29 Citoplasma

Auger 1.50E-05 ± 1.01E-07 26.41

CI 3.03E-04 ± 2.05E-07 69.83 Núcleo

Auger 1.29E-04 ± 6.83E-07 29.83



células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.


Blanco

subcelular

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 1.61 7.86 1.66 10.54 0.62 0.62

Núcleo 18.10 88.52 13.29 84.50 99.26 99.38

Membrana 0.74 3.63 0.78 4.96 0.00 0.00

Total 20.44 15.73 99.87


123

4.8.3 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB231

Tabla 25. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB231.

Posición

de la

fuente


(Gy/Bq ·s)

Dosis Absorbida

(Gy/Bq)

Núcleo 3.04E-06 ± 3.04E-08 3.91E-02 ± 3.92E-04

Citoplasma 3.14E-05 ± 6.93E-08 4.20E-01 ± 9.27E-04

Membrana

Citoplasma

2.01E-06 ± 3.21E-08 9.66E-03 ± 1.54E-04

Total 3.64E-05 ± 1.32E-07 Total 4.69E-01 ± 1.47E-03

Núcleo 2.71E-04 ± 5.69E-07 3.49E+00 ± 7.33E-03

Citoplasma 3.31E-06 ± 9.46E-08 4.44E-02 ± 1.27E-03

Membrana

Núcleo

1.34E-06 ± 6.08E-08 6.43E-03 ± 2.92E-04

Total 2.76E-04 ± 7.25E-07 Total 3.54E+00 ± 8.89E-03


núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total

absorbida de radiación.

Blanco Tipo de

emisión

Dosis Absorbida

(Gy/Bq ·s)

% de

contribución

CI 2.69E-05 ± 4.14E-08 73.91 Citoplasma

Auger 9.29E-06 ± 5.63E-08 25.48

CI 1.93E-04 ± 1.33E-07 70.15 Núcleo

Auger 8.13E-05 ± 4.14E-07 29.48


124



células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.


Blanco

subcelular

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 1.88 8.95 1.99 12.21 0.09 0.09

Núcleo 18.40 87.86 13.59 83.36 99.75 99.91

Membrana 0.67 3.18 0.72 4.43 0.00 0.00

Total 20.94 16.30 99.83

4.8.4 Resumen de dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer

Tabla 28. Dosis absorbida (Gy/Bq) de 99mTc-Tat-BN en núcleo y citoplasma de

células de cáncer.

Dosis Absorbida (Gy/Bq) Línea Celular

Citoplasma Núcleo

PC3 0.2389 ± 0.0009 2.4973 ± 0.0058

MCF7 0.4309 ± 0.0018 8.1918 ± 0.0185

MDA 0.4688 ± 0.0014 3.5437 ± 0.0088


125

Tabla 29. Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en

citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de electrones CI

y Auger de 99mTc.

Blanco Tipo de

emisión

% de contribución a la

Dosis Absorbida

CI 73.89 ± 0.40 Citoplasma

Auger 25.57 ± 0.56

CI 70.27 ± 0.37 Núcleo

Auger 29.24 ± 0.56

Tabla 30. Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de

electrones CI y Auger de 99mTc en citoplasma y núcleo de las células PC3,

MCF7 y MDA-MB231.

Espectro Electrones CI Electrones Auger Blanco

subcelular %

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 1.82 ± 0.15 8.67 ± 0.54 1.90 ± 0.16 11.66 ± 0.74 0. 23 ± 0.25 0.23 ± 0.25

Núcleo 18.49 ± 0.32 87.97 ± 0.36 13.66 ± 0.29 83.75 ± 0.50 99.61 ± 0.24 99.76 ± 0.26

Membrana 0.71 ± 0.03 3.36 ± 0.18 0.75 ± 0.02 4.59 ± 0.24 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

Total 21.02 ± 0.43 16.31 ± 0.39 99.85 ± 0.02

Podemos observar que las dosis absorbidas en el núcleo se calcularon como la

suma de las contribuciones de la dosis producida por la actividad de la

membrana al núcleo (N←M), más la dosis del citoplasma al núcleo (N←C),

más la del núcleo al núcleo (N←N). Por ejemplo en las células MCF7, la

contribución a la dosis absorbida en el núcleo de la actividad en la membrana

fue de 0.0155 ± 0.0005 Gy/Bq, la dosis absorbida del citoplasma al núcleo fue

de 0.0447 ± 0.0011 Gy/Bq y la dosis absorbida de núcleo a núcleo fue de


126

8.1315 ± 0.0168 Gy/Bq, entonces la dosis absorbida total en el núcleo de las

células MCF7 fue de 8.1918 ± 0.0185 Gy por unidad de actividad unida a la

célula (1Bq).

Es importante mencionar que en general una dosis aguda de 2 Gy puede matar

al 50% de una muestra de células in vitro, pero es necesaria una dosis aguda

de 100 Gy para matar a todas las células. Los electrones CI del 99mTc

depositan 13.66 ± 0.29 % del total de energía que emiten por desintegración

dentro de las dimensiones del núcleo celular. No obstante, en todos los casos

el promedio de la contribución a la dosis absorbida en el núcleo celular de los

electrones CI fue de 70.26 ± 0.36% y de los electrones Auger fue de 29.23 ±

0.55%, debido a la baja energía y rendimiento de emisión por decaimiento de

los electrones Auger. Estos resultados quieren decir que, por ejemplo en las

células PC3 (total de dosis absorbida al núcleo = 2.49 Gy/Bq), la dosis

absorbida al núcleo por contribución Auger fue de 0.73 Gy/Bq, mientras que por

contribución de electrones CI fue de 1.75 Gy/Bq. A pesar de que la mayor

contribución a la dosis absorbida al núcleo de las células fue de los electrones

CI, los electrones Auger son los que tienen mayor probabilidad de causar daño

al ADN.

4.9 Discusión y Conclusiones Las energías mínimas calculadas para el péptido híbrido Tat-BN son

adecuadas para esta estructura molecular, debido a su tamaño, la complejidad

y la carga del péptido, se imponen repulsiones estéricas y electrostáticas contra

su estabilización a bajas energías mínimas. Sin embargo, la comparación de su

energía mínima (271 kcal/mol) con aquellas estructuras calculadas por otros

autores de péptidos como el UBI(29-41) [18], Tat-Scr [19], 90 y 72-90 kcal/mol,

respectivamente, sugieren que el péptido híbrido tiene que ser estable.

Además, la conformación adquirida por la molécula del péptido no interfiere con

el sitio de reconocimiento específico de la BN. Estos resultados apoyan la

propuesta de que la preparación del péptido híbrido es viable y mantiene su

especificidad.


127

La estructura peptídica de [TcO(N2S2)]-1-Tat(49-57)-Lys3-BN adquirió en el sitio

de quelación una geometría piramidal cuadrada con el grupo oxo en la posición

apical de la pirámide y el Tc cerca del plano formado por los donadores N2S2

como se muestra en la figura 10. Esta geometría se ha observado por

difracción de rayos x en otros complejos neutrales cinco-coordinados de Tc(O)

o compuestos cargados como los complejos cinco-coordinados Tc(O)N2S2

cargados negativamente [13,14]. La energía mínima de estos complejos no

difiere significativamente del complejo híbrido antes de la coordinación a

[Tc(O)]3+.

En general el radiofármaco 99mTc-Tat-BN no mostró las mejores características

radioquímicas como el 99mTc-BN previamente reportado [1], debido a que el

radiofármaco híbrido (con el péptido Tat(49-57)) mostró menor pureza

radioquímica (>95% para 99mTc-BN) y menor estabilidad en cisteina y suero

humano. Estos resultados se explican debido a que el quelante bifuncional

HYNIC junto con los coligantes han demostrado ser altamente estables para el

marcado de péptidos [20,21]. Sin embargo, la región de unión al Tc que consta

de Gly-Gly-Cys-NH2 o Cys-Gly-Cys-NH2 péptido (para formar un ligante –N2S2-

o -N3S-) se ha utilizado exitosamente para preparar complejos estables con el

Tc=O3+, sin producir alteraciones en la bioactividad de la molécula de acuerdo

con los resultados obtenidos en este trabajo [22-24].

El 99mTc-Tat-BN se une a proteínas plasmáticas en aproximadamente 20% más

que el 99mTc-BN. Estos resultados indican que a pesar de que ambos

radiofármacos contienen BN y están marcados con 99mTc, las cargas positivas

del Tat debido a las argininas y lisinas que contiene en su secuencia de

aminoácidos, tiende a interactuar de modo más rápido y fuerte con las

proteínas, además de que el Tat no está dirigido a un receptor específico [11,

12]. Esta propiedad catiónica es necesaria para penetrar la membrana celular y

localizar al núcleo [25], pero estas características pueden tener efectos en la

tasa de depuración sanguínea por la unión a proteínas plasmáticas así como al

aumento en la interacción e internalización en células y tejido sano (por


128

ejemplo, células plasmáticas, bazo e hígado). Aunque la captación en células

de cáncer fue significativamente mayor para 99mTc-Tat-BN que con 99mTc-BN, la

mayor actividad en sangre del primero, no produce incremento significativo en

el contraste de la imagen tumoral en ratones (figura 20).

La captación máxima de ambos radiofármacos en células de cáncer se

presentó a los mismos tiempos, en PC3 a las 4 h (99mTc-Tat-BN, 17.62±1.86%; 99mTc-BN, 28.1±2.86%), en MCF7 a las 2 h (99mTc-BN, 8.97±0.92%; 99mTc-Tat-BN, 18.27±2.14%) y en MDA-MB231 a los 5 min (99mTc-BN,

5.91±0.26%; 99mTc-Tat-BN, 24.33±2.82%) con diferencias sólo atribuibles a la

expresión de GRPr. Es importante mencionar que a pesar de que ambas líneas

celulares, MCF7 y MDA-MB231, son derivadas de cáncer de mama, las

primeras son estrógeno dependientes y las segundas estrógeno

independientes y se ha reportado que la expresión de GRPr es dependiente de

la expresión de receptores de estrógenos en etapas tempranas del cáncer de

mama [26].

La eliminación de los radiofármacos en los tiempos posteriores se debe al

hecho de que el proceso de internalización del complejo BN/GRPr involucra su

captura final por los lisosomas al unirse, donde en el caso de los péptidos son

rápidamente degradados. Debido a la degradación inmediata de los lisosomas,

no se espera que haya acumulación de la radiactividad en las células [15].

En medicina nuclear los receptores proteínicos celulares se consideran blancos

moleculares. En general, la internalización celular fue por medio de un receptor

específico con el 99mTc-BN y en el caso del 99mTc-Tat-BN el 9% del total de

actividad fue no específica como se demostró en los resultados de los

experimentos de células con los GRPr bloqueados debido a la NLS del Tat [12].

Los estudios de biodistribución mostraron una depuración sanguínea lenta del 99mTc-Tat-BN, se observó lo contrario en órganos no blanco, sin embargo, la

captación máxima se presentó en riñones indicando que la excreción fue

principalmente renal.


129

Estos resultados coinciden con la biodistribución del 99mTc-BN donde la

eliminación fue principalmente renal y la captación en órganos no blanco fue

baja con depuración sanguínea más rápida. Aunque ambos radiofármacos

mostraron buena localización del tumor de células PC3 en ratones atímicos. No

obstante el 99mTc-Tat-BN mostró ligera mejora en la razón tumor/músculo de

8.5 comparada con 7 para el 99mTc-BN.

La captación alta de 99mTc-Tat-BN en riñones y órganos no blanco muestra la

necesidad de utilizar un mejor método para reducir la radiactividad de fondo

que se puede lograr con la co-administración de una infusión de aminoácidos

lisina-arginina como se ha reportado previamente para otros péptidos

radiomarcados [27].

Cálculos de dosis absorbida a nivel subcelular utilizando el método Monte Carlo

han sido reportados previamente, sin embargo se han utilizado modelos de

células esféricas con radios de 1 a 10 µm [28, 29]. Las geometrías y tamaños

de las células utilizadas en este estudio son bastantes diferentes de las esferas

ideales (tabla 8, figuras 16, 17 y 18) y estos parámetros son factores críticos al

evaluar la fracción de energía absorbida de los electrones sobre las

dimensiones nucleares. El hecho de considerar los datos radiofarmacocinéticos

subcelulares, obtenidos experimentalmente en este trabajo, también es un

factor crítico para mejorar la exactitud en los cálculos de dosis absorbida

celular. Aunque se espera que las dimensiones de las células de cáncer in vivo

sean un poco más pequeñas que las muestras in vitro, la cinética de

intenalización nuclear debe ser la misma.

Los electrones Auger de baja energía han sido considerados como las

partículas más adecuadas para la inactivación de células individuales malignas.

Sin embargo, en el caso del 99mTc, los electrones de conversión interna

emitidos con el más alto rendimiento por decaimiento (99.9 – 88 %) y la menor

energía (por ejemplo 1.82 keV) depositan, en promedio, 13.66 % de su energía

sobre las dimensiones del núcleo celular (elipsoides de 23 x 17 µm a 16 x 11


130

µm) y fueron los principales contribuyentes a la dosis absorbida nuclear

(70-26 %). Por lo tanto, estas partículas (electrones CI) pueden ser

extremadamente radiotóxicos si fueran capaces de ponerse en contacto con el

ADN.

Lundqvist y cols [30] han demostrado que es importante distinguir entre lo que

puede ser un incremento normal en la dosis celular y el efecto biológico Auger.

Las energías de los electrones cercanas al potencial de ionización (< 30 eV)

solo tendrán un efecto biológico insignificante y los electrones con energías

menores a 5 keV no contribuirán al efecto local. Por ejemplo un electrón Auger

con energía de aproximadamente 20 keV es ideal para que deposite toda su

energía dentro de las dimensiones de una célula humana, pero estará lejos del

ADN y no tendrá impacto en el ADN local que usualmente está asociado al

efecto biológico Auger, lo cual ocurre dentro de nanómetros cúbicos.

Recientemente Tavares y Tavares [31] calcularon que los electrones CKMMX

(todas las transiciones Coster Kronig-CK y super CK del orbital M) del 99mTc y

los electrones Auger MXY (todas las transiciones Auger del orbital M) si están

cercanos al ADN tienen un potencial terapéutico comparable al de las

partículas α del 211At (LET alto).

Los resultados presentados aquí demostraron que el 99mTc-Tat-BN se

internalizó en células de cáncer con reconocimiento específico por GRPr. En

general, los análisis inmunohistoquímicos mostraron incremento en la

abundancia del Tat-BN en el núcleo, evento que se asoció con la inhibición de

la proliferación celular como resultado de los electrones Auger y CI de baja

energía del 99mTc-Tat-BN dentro del núcleo.

El efecto biológico de los electrones Auger y CI de baja energía no es la única

propiedad terapéutica posible del 99mTc-Tat-BN porque la dosis absorbida de

radiación puede también causar daño a membranas y organelos de tal manera

que se inicie la señalización de rutas apoptóticas dentro de las células [32, 33].


131

El ligante CD95 es un miembro de la familia de citosinas relacionadas con el

factor de necrosis tumoral y se ha encontrado tanto en forma soluble como

unido a la membrana. Varios estudios han demostrado que la activación del

receptor de la muerte celular y de su receptor, induce apoptosis. Freisen y cols

[33] reportaron que después de la irradiación de células de leucemia, se

detectó una sobre regulación del ligante CD95 y de su receptor, junto con la

consecuente activación de las caspasas. Además, el daño mitocondrial debido

a la irradiación, resulta en la perturbación del potencial de membrana

mitocondrial, liberación del citocromo c y activación de la caspasa 9. También

se ha demostrado que la incorporación de 125I (24.9 electrones

Auger/decaimiento) en el ADN induce apoptosis vía la caspasa 3 [34]. El efecto

bystander de la radiación igualmente juega un papel importante en la

radioterapia de blancos moleculares con electrones Auger [35].

Es notable mencionar que la prueba de proliferación utilizando ADN provee un

indicador más exacto del número relativo de células, pero puede reflejar tanto

el arresto del ciclo celular como la apoptosis; por lo tanto, la evaluación del

efecto pro-apoptótico del 99mTc-Tat-BN y del Tat-BN deben ser tomados en

cuenta y requieren más investigación.

Los péptidos con NLS se han utilizado exitosamente para transportar diferentes

moléculas al núcleo celular [36-39]. Se ha demostrado que la conjugación de

un NLS a 111In-HuM195 (anti-CD33) y a 111In-trastuzumab (anti-HER2)

incrementa considerablemente la captación nuclear en células de cáncer de

mama y de leucemia, aumentando así su toxicidad [36,37]. Es posible que en

todos estos radiofármacos híbridos, las cargas positivas del Tat(49-57) o de

cualquier péptido con NLS, una interacción electrostática con el ADN cargado

negativamente, produce toxicidad celular a partir de un efecto biológico Auger y

no solo por el simple incremento en la dosis absorbida macroscópica.

Es importante mencionar que una de las ventajas de utilizar 99mTc (T1/2= 6h)

con respecto al 111In (T1/2= 67h) es su vida media corta; el 99mTc es capaz de

producir un mayor número de desintegraciones en unas pocas horas y alcanzar

dosis absorbidas más altas por unidad de tiempo.


132

El radiofármaco híbrido 99mTc-Tat-BN puede ser utilizado en radioterapia de

blancos moleculares como parte de un esquema de terapia combinada. La

resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células de cáncer es el desarrollo

simultáneo de resistencia a varios agentes anti-cancerígenos; un mecanismo

de acción MDR es el aumento en el flujo de agentes quimioterapéuticos por

transporte de proteínas. La expresión de la proteína de resistencia en el cáncer

de mama media este flujo de salida del fármaco como MDR [40]. Los análogos

de la BN citotóxicos en combinación con otros péptidos han sido utilizados

exitosamente para inhibir la proliferación de células de cáncer con MDR [40-

42]. Como un ejemplo de terapia combinada, Constantini y cols [43]

demostraron que el 111In-NLS-Trastuzumab puede matar células de cáncer de

mama resistentes al trastuzumab a través de la emisión de electrones Auger en

combinación con methotrexate para radiosensibilización de las células.

Por lo tanto, se puede concluir que el 99mTc-Tat-BN se ha desarrollado como un

radiofármaco híbrido compuesto de un péptido de internalización y con la

capacidad de reconocimiento específico (Tat conjugado a la BN), al producir

una molécula radiomarcada estable capaz de atravesar la barrera lipofílica de

la membrana plasmática, con alta internalización a células de cáncer GRPr+.

Por lo tanto este híbrido puede ser útil para la obtención de imágenes de

cáncer de próstata y mama. La presencia del Tat(49-57) transportó

eficientemente al radiofármaco al núcleo de células PC3 y células de cáncer de

mama MCF7 y MDA-MB231, donde el rango de nanómetros a micrómetros de

los electrones Auger y de conversión interna reducen significativamente la

proliferación celular depositando dosis absorbidas de 0.142 mGy/Bq·s a

0.434 mGy/Bq·s. El radiofármaco puede ser utilizado como un agente

terapéutico en cáncer de mama y próstata como parte de un esquema de

terapia combinada.


133

4.10 Referencias

[1] Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Rodriguez-Cortes, J., Pedraza-Lopez, M., Ramirez-Iglesias, M.T., Preparation and evaluation of 99mTc- EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin for imaging of GRP receptor-positive tumours. Nucl. Med. Commun. 27, 371–376 2006

[2] Santos-Cuevas, C.L., Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Pichardo-Romero, P., Targeted imaging of GRP receptors with 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin: biokinetics and dosimetry in women. Nucl. Med. Commun. 29,741–747 2008

[3] Sharkey RM, Goldenberg DM. Novel radioimmunopharmaceuticals for cancer imaging and therapy. Curr Opin Investig Drugs; 9:1302-16 2008.

[4] Buchegger F, Perillo-Adamer F, Dupertuis YM, Bischof A. Auger radiation targeted into DNA: a therapy perspective. Eur J Nucl Med Mol Imaging; 33:1352-63. 2006.

[5] Howell R. Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report 2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No.6. Med Phys; 19:1371-83 1992

[6] Reubi JC, Waser B. Concomitant expression of several peptide receptors in neuroendocrine tumours: molecular basis for in vivo multireceptor tumour targeting. Eur J Nucl Med; 30:781-93. 2003

[7] Baidoo KE, Lin KS, Zhan Y, Finley P, Scheffel U, Wagner HN. Design, synthesis, and initial evaluation of high-affinity technetium bombesin analogues. Bioconjugate Chem; 9:218-25. 1998

[8] Garcia-Garayo E, Ruegg D, Blauenstein P, Zwimpfer M, Khan IU, Maes V, Blanc A, Beck-Sickinger AG, Tourwe DA, Schubiger PA Chemical and biological characterization of new Re(CO)3/[99mTc](CO)3 bombesin analogues. Nucl Med Biol; 34:17-28. 2007

[9] Koumarianou E, Mikołajczak R, Pawlak D, Zikos X, Bouziotis P, Garnuszek P, Karczmarczyk U, Maurin M, Archimandritis SC. Comparative study on DOTA-derivatized bombesin analog labelled with 90Y and 177Lu: in vitro and in vivo evaluation. Nucl Med Biol; 36:591-603. 2009

[10] Linder KE, Metcalfe E, Arunachalam T, Chen J, Eaton SM, Feng W, Fan H, Raju N, Cagnolini A, Lantry LE, Nunn AD, Swenson RE. In vitro and in vivo metabolism of Lu-AMBA, a GRP-receptor binding compound, and the synthesis and characterization of it s metabolites. Bioconjugate Chem; 20:1171-8 2009.

[11] Cornelissen B, McLarty K, Kersemans V, Scollard D, Reilly R. Properties of [111In]-labelled HIV-1 Tat peptide radioimmunoconjugates in tumor-bearing mice following intravenous or intratumoral injection. Nucl Med Biol; 35:101-10. 2008

[12] Costantini DL, Hu M, Reilly R. Peptide motifs for insertion of radiolabeled biomolecules into cells and routing to the nucleus for cancer imaging or radiotherapeutic applications. Cancer Biother Radiopharm; 23:3-23 2008.

[13] Canney, D.J., Billings, J., Francesconi, L.C., Guo, Y.-Z., Haggerty, B.S., Rheingold, A.L., Kung, H.F.,. Dicarboxylate diamide dimercaptide (N2S2) technetium-99m complexes: synthesis and biological evaluation as potential renal radiopharmaceuticals. J. Med. Chem. 36, 1032–1040. 1993

[14] Bandoli G., Dolmella, A., Porchia, M., Refosco, F., Tisato, F., 2001. Structural overview of technetium compounds (1993–1999). Coord. Chem. Rev. 214, 43–90; Bandoli y cols., 2001

[15] La Bella R, Garcia-Garayoa E, Langer M, Bläuenstein P, Beck-Sickinger AG, Schubiger PA. In vitro and in vivo evaluation of a 99mTc(I)-labelled


134

bombesin analogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positve tumors. Nucl Med Biol; 29:553-60 2002

[16] Bettaccini AA, Baj A, Accolla RS, Basolo F, Toniolo AQ. Proliferative activity of extracellular HIV-1 Tat protein in human epithelial cells: expression profile of pathogenetically relevant genes. BMC Microbiology; 5:20 doi:10.1186/1471-2180-5-20. 2005

[17] Shriver, S.P., Bourdeau, H.A., Gubish, C.T., Tirpak, D.L., Davis, A.L., Luketich, J.D., Siegfried, J.M.,. Sex-specific expression of gastrin-releasing peptide receptor: relationship to smoking history and risk of lung cancer. J. Natl. Cancer Inst. 92, 24–33. 2000.

[18] Melendez-Alafort, L., Ramirez, F., de, M., Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Pedraza-Lopez, M., Hnatowich, D.J.,. Lys and Arg in UBI: a specific site for a stable Tc-99m complex? Nucl. Med. Biol. 30, 605–615 2003

[19] Ferro-Flores, G., de Ramírez, F.M., Meléndez-Alafort, L.G., Arteaga de Murphy, C.,Pedraza-López, M.,. Molecular recognition and stability of 99mTc-UBI 29-41 based on experimental and semiempirical results. Appl. Radiat. Isot. 61,1261–1268. 2004

[20] Liu, S., Edwards, D.S99mTc-labelled small peptides as diagnostic radiopharmaceuticals.Chem. Rev. 99, 2235–2251. 1999.

[21] Decristoforo, C., Melendez-Alafort, L., Sosabowski, J.K., Mather, S.J., 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotide for imaging somatostatin-receptor-positive tumors:preclinical evaluation and comparison with 111In-octreotide. J. Nucl. Med. 41,1114–1119. 2000.

[22] Bogdanov, A, Tung, C., Bredow, s, Weissleder, R. DNA binding chelates for nonviral gene delivery imaging. Gene Ther. 8, 515–522. ., 2001

[23] Francesconi, L.C., Zheng, Y., Bartis, J., Blumenstein, M., Costello, C., De Rosch, M.A., Preparation and characterization of [99TcO] apcitide: a technetium labeled peptide. Inorg. Chem. 43, 2867–2875. 2004.

[24] Zhang, Y.-M., Tung, C.H., He, J., Liu, N., Yanachkov, I., Liu, G., Rusckowski, M.,Vanderheyden, J.L., Construction of a novel chimera consisting of a chelator-containing Tat peptide conjugated to amorpholino antisense oligomer for technetium-99m labeling and accelerating cellular kinetics. Nucl. Med. Biol. 33, 263–269 2006.

[25] Drin, G., Cottin, S., Blanc, E., Rees, A., emsamani, J., Studies on the internalization mechanism of cationic cell penetrating peptides. J. Biol. Chem. 278, 31192–31201 2003

[26] Halmos, G., Wittliff, J.L., Schally, A.V., Characterization of bombesin/gastrin releasing peptide receptors in human breast cancer and their relationship to steroid receptor expression. Cancer Res. 55, 280–287 1995

[27] Bodei, L., Cremonesi, M., Zoboli, S., Grana, C., Bartolomei, M., Rocca, P., Caracciolo, M., Macke, H.R., Chinol, M., Paganelli, G., Receptor-mediated radionuclid therapy with 90Y-DOTATOC in association with amino acid infusion: a phase 1 study. Eur. J. Nucl. Med. 30, 207–216. 2003

[28] Emfietzoglou D, Kostarelos K, Hadjidoukas P. Subcellular S-factors for low-energy electrons: A comparison of Monte Carlo simulations and continous-slowing-down calculations. Int J Rad Biol 84:1034-44. 2008.

[29] Torres GE, Carrillo CT. Specific energy from Auger and conversion electrons of 131I, 188Re-anti-CD20 to a lymphocyte's nucleus. Rad Eff Def Solids, doi:10.1080/10420150.2010.488692. 2010

[30] Lundqvist H, Stenerlöw B, Gedda L. The Auger effect in molecular targeting therapy. In Targeted radionuclide tumor therapy, 1st. ed.; Stigbrand T, Carlsson J, Adams GP, Eds. Springer: NewYork; 195-214. , 2008


135

[31] Tavares AAS, Tavares JMRS. Evaluating 99mTc Auger electrons for targeted tumor radiotherapy by computational methods. Med Phys; 37:3551-60, 2010.

[32] Rupnow BA, Knox SJ. The role of radiation-induced apoptosis as a determinant of tumor responses to radiation therapy. Apoptosis; 4:115-43. 1999

[33] Friesen C, Lubatschofski A, Kotzerke J, Buchmann I, Reske SN, Debatin KM. Betairradiation used for systemic radioimmunotherapy induces apoptosis and activates apoptosis pathways in leukaemia cells. Eur J Nucl Med Mol Imaging; 30:1251-61. 2003

[34] Urashima T, Nagasawa H, Wang K, Adelstein S, Little J, Kassis A. Induction of apoptosis in human tumor cells after exposure to Auger electrons: comparison with gamma-ray exposure. Nucl Med Biol; 33:1055-63. 2006

[35] Kassis A. Cancer Therapy with Auger Electrons: Are We Almost There?. J Nucl Med; 44:1479-81. 2003

[36] Chen P, Wang J, Hope K, Jin L, Dick J, Cameron R, Brandwein J, Minden M, Reilly RM. Nuclear localizing sequence promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the Anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labelled with 111In in human myeloid leukemia cells. J Nucl Med; 47:827-36. 2006

[37] Costantini DL, Chan C, Cai C, Vallis KA, Reilly RM. 111In-labelled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. J Nucl Med; 48:1357-68. 2007

[38] Ginj M, Hinni K, Tschumi S, Schulz S, Maecke HR Trifunctional somatostatin-based derivatives designed for targeted radiotherapy using Auger electron emitters. J Nucl Med; 46:2097-103. 2005

[39] Costantini DL, Bateman K, McLarty K, Vallis KA, Reilly RM. Trastuzumab-resistant breast cancer cells remain sensitive to the Auger electron-emitting radiotherapeutic agent 111In-NLS-trastuzumab and are radiosensitized by methotrexate. J Nucl Med; 49:1498-505. 2008

[40] Schally AV, Nagy A. Cancer chemotherapy based on targeting of cytotoxic peptide conjugates to their receptors on tumors. Eur J Endocrinol; 141:1-14. 1999

[41] Buchholz S, Keller G, Schally AV, Halmos G, Hohla F, Heinrich E, Koester F, Baker B, Engel JB. Therapy of ovarian cancers with targeted cytotoxic analogs of bombesin, somatostatin, and luteinizing hormone-releasing hormone and their combinations. Proc Natl Acad Sci USA; 103:10403-7. 2006

[42] Ziegler CG, Brown JW, Schally AV, Erler A, Gebauer L, Treszl A, Young L, Fishman LM, Engel JB, Willenberg HS, Petersenn S, Eisenhofer G, Ehrhart-Bornstein M, Bornstein SR. Expression of neuropeptide hormone receptors in human adrenal tumors and cell lines: antiproliferative effects of peptide analogues. Proc Natl Acad Sci USA; 106:15879-84. 2009

[43] Costantini DL, Bateman K, McLarty K, Vallis KA, Reilly RM. Trastuzumab-resistant breast cancer cells remain sensitive to the Auger electron-emitting radiotherapeutic agent 111In-NLS-trastuzumab and are radiosensitized by methotrexate. J Nucl Med; 49:1498- 505 2008


136

Capítulo 5

Resultados

188Re-N2S2-Tat(49-57)-BN


137

5.1 Diseño y preparación

El fármaco N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN se diseñó y preparó como se muestra en

la figura 21. Cuenta con la Lys3-BN que contiene el sitio de reconocimiento

específico para unirse con los GRPr, tiene al péptido Tat(49-57) para

internalizar a la molécula al citoplasma e incluso hasta el núcleo y tiene el sitio

de quelación con el 188Re.



138

5.2 Modelaje Molecular: Diseño de Re(O) 2S2N2-Tat-Lys 3-BN por cálculos

semiempíricos

El complejo oxo-renio que se formó con el péptido híbrido, se modeló

considerando dos factores de este tipo de sitio quelante:

a) Los dos tioles terminales S2(Acm)2 se pueden ionizar si se remueve el

acetamindometil de los grupos protectores [12,13].

b) Los grupos amina pueden fácilmente disminuir la pérdida de protones [13].

Se espera que el sitio de quelación forme un complejo coordinado [N2S2]4-

alrededor del núcleo de [Re(O)]3+, de esta manera se forma un complejo con

carga negativa cinco-coordinado. La molécula del complejo

[ReO(N2S2)]-1-Tat(49-57)-Lys3-BN se calculó (figura 22) con el confórmero más

estable de la molécula del péptido híbrido. La energía mínima de la estructura

optimizada fue de 300 kcal/mol y la del confórmero más estable igual a

262 kcal/mol. En la tabla 31 se dan algunos parámetros geométricos de este

complejo.

Tabla 31. Distancias de enlace de los complejos calculado

Re(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3

aumentado y CONFLEX.

Compuesto Geometría Distancias de

enlace (Å)

Radio del enlace

Re-N1: 2.314 RN = 1.003

Re-N2: 2.308 RS = 1.003

Pirámide cuadrada

distorcionada

Re-S1: 2.618 ReN2/ReO =1.04

Re-S2: 2.611 ReS1/ReO =1.19

[188Re(O)-(N2S2)]-1-Tat-Lys3-BN

Re=O: 2.210


139

Figura 22. (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido

N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más

estable de la molécula del péptido híbrido Re(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN


140

modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio

de quelación del Re(O): [Re(O)N2S2].

5.3 Evaluación de la pureza radioquímica de 188Re-N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN

(188Re-Tat-BN)

Las mejores condiciones para el marcado de Tat-BN con 188Re fueron con

50 µL de péptido (figura 23) ya que al incrementar la concentración de péptido

fue posible estabilizar el perrenato reducido que puede ser reoxidado

fácilmente a 188ReO4-. El factor que más afectó la pureza radioquímica fue el

pH=3, debido a que es necesario marcar en condiciones ácidas que permitan

una reacción redox Re7+/Re5+ reversible [14].

Al utilizar altas concentraciones de cloruro estanoso y grandes cantidades del

ligante débil (tartrato de sodio [tartrato] = 106 mg/mL) se estabiliza al ión

estanoso y al perrenato reducido en la solución. Los 2 mg de ácido ascórbico

sirvieron como antioxidante, porque ayudan al complejo a permanecer estable

hasta las 24 h (figura 24), como Zamora y cols reportaron para la preparación

de 188Re-RC-160 (un análogo de la somatostatina por el método de marcado

directo con tartrato estanoso) [15].

El mejor marcado del Tat-BN con 188Re se llevó a cabo a temperatura ambiente

ya que al calentarlo a 92°C la pureza radioquímica, una hora después de

agregarle el perrenato de sodio, disminuyó de 92% a 74%. A pesar de que

otros autores han marcado péptidos a 92°C y 100°C c on buenos resultados, el

proceso depende de cada molécula [16]. Con el sistema de HPLC y el detector

de radiactividad se obtienen el cromatograma y radiocromatograma asociado

con tiempos de retención de 3-4 min y 10-11 min para 188ReO4- libre y 188Re-

Tat-BN, respectivamente (figura 25). La actividad específica promedio fue de

0.60 MBq/nmol.


141

0 1 2 3 4 5 24

50

60

70

80

90

100

Pur

eza

radi

oquí

mic

a de

18

8 Re-

Tat

-BN

Tiempo de Reacción (h)

[Tat-Bn] = 0.12 mg/mL [Tat-Bn] = 0.29 mg/mL [Tat-Bn] = 0.54 mg/mL

Figura 23. Influencia de la concentración del péptido sobre la pureza

radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, [ácido

ascórbico] = 4.35 mg/mL, 18°C).

0 1 2 3 4 5 2420

30

40

50

60

70

80

90

100

Pur

eza

radi

oquí

mic

a de

18

8 Re-

Tat

-BN

Tiempo de reacción (h)

[Acido ascórbico] = 0 mg/mL [Acido ascórbico] = 4.35 mg/mL

Figura 24. Influencia de la concentración de ácido ascórbico sobre la pureza

radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, 18°C).


142

La pureza radioquímica del compuesto 188Re-Tat-BN fue de 95 ± 1% (n>30)

obtenida por ITLC, Sep-Pak y análisis por HPLC y se mantuvo estable hasta

las 24 h (figura 25).

Figura 25. (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma-

UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 188Re-Tat-BN 2 h

posteriores al radiomarcado.


143

5.4 Estabilidad en suero humano de 188Re-Tat-BN

La pureza radioquímica del 188Re-Tat-BN en suero humano después de 1 h de

incubación a 37°C fue de 95% y disminuyó a 91% y 74 % después de 2 y 24 h

respectivamente. La unión a proteínas fue de 41.2 ± 2.7% a las 2 h sin

trasquelación hacia la cisteina (figura 26).

Figura 26. HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el

cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea

punteada corresponde al radiocromatograma de 188Re-Tat-BN después de

incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h.


144

5.5 Desafío a la cisteina

Después de incubar el radiofármaco con cisteina a 37°C en relaciones molares

de 5:1, 50:1 y 500:1 de cisteina:péptido, los análisis por ITLC mostraron que la

radiactividad disociada de 188Re-Tat-BN fue 12, 19 y 40% respectivamente,

indicando una estabilidad radiofarmacéutica adecuada.

5.6 Pruebas in vitro

5.6.1 Captación in vitro de 188Re-Tat-BN

En la prueba de captación in vitro se muestran diferentes comportamientos en

las tres líneas celulares. En las células PC3 y MDA-MB231 la captación fue

incrementando con el tiempo, sin embargo, en las células MCF7 fue

disminuyendo. Se muestra un incremento del 40% en los tiempos de 2, 4 y 6

horas para las células MDA-MB231, que se debe al aumento en el número de

los GRPr, tal vez por el tratamiento que recibieron al momento de cultivarlas.

Sin embargo en las células MCF7, no se observa tanta captación ya que el

número de GRPr es menor que el de las PC3, que muestran una captación

máxima de 27.23% (tabla 32). La unión del radiofármaco fue específica para

GRPr, la captación inespecífica fue menor del 7% en todos los tiempos.


145

Tabla 32. Captación celular de 188Re-Tat-BN en las líneas celulares de cáncer

PC3, MCF7 y MDA-MB231 (% del total de actividad ± DS).

Tiempo (h) PC3 MCF7 MDA-MB231

0.083 20.39 ± 0.91 16.35 ± 1.03 18.33 ± 1.04

0.25 22.44 ± 2.57 12.80 ± 0.51 23.92 ± 0.40

0.5 23.51 ± 1.25 11.55 ± 0.89 24.50 ± 1.43

1 27.23 ± 0.26 10.40 ± 0.63 29.85 ± 1.35

2 27.22 ± 1.78 10.84 ± 0.52 40.18 ± 2.03

4 25.86 ± 0.38 10.05 ± 1.38 50.18 ± 2.13

6 24.16 ± 2.27 8.99 ± 0.43 50.55 ± 3.84

24 22.8 ± 3.52 7.47 ± 0.98 40.71 ± 1.23

5.6.2 Internalización celular de 188Re-Tat-BN

La internalización celular de 188Re-Tat-BN resultó ser muy similar en

comportamiento en las líneas celulares PC3 y MDA-MB231 (figura 27 (A) y (C))

ya que en ambas se incrementó con el tiempo, sin embargo, en las células

MCF7 (figura 27 (C)) se observa una gráfica más lineal, con un máximo a las

4 h y disminuyendo muy poco hasta las 24 h. La diferencia se observa en los

porcentajes de internalización del radiofármaco, ya que las MDA-MB231 y las

PC3 inician a las 0.83 h en 9.19 ± 0.25% y 9.44 ± 0.35% respectivamente, pero

a las 2 h las células MDA-MB231 llegan hasta un 25.46 ± 2.01%, llegando a las

6 h a 33.07 ± 3.93% y las PC3 alcanzan su máxima internalización a las 6 h

pero con 19.76 ± 1.44%.


146

Figura 27. Internalización dependiente del tiempo de 188Re-Tat-BN en células

de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).


147

La sobreexpresión de receptores de péptidos en tumores humanos es de gran

interés para la obtención de imagen y terapia de cáncer, lo cual se consigue

exitosamente con una máxima internalización y retención de la radiactividad

por las células tumorales. En este estudio se observa la internalización del

radiofármaco 188Re-Tat-BN en las tres líneas celulares. El radiofármaco

presentó un flujo de salida de actividad limitado en todas las líneas de células

tumorales durante el periodo de investigación (24h), presumiblemente debido a

que los GRPr participan en el atrapamiento del trazador en los lisosomas y la

consiguiente degradación por proteasas lisosomales [17-18].

5.6.3 Biodistribución subcelular de 188Re-Tat-BN

La biodistribución subcelular del 188Re-Tat-BN en células PC3, MCF7 y MDA-

MB231 se presenta en la figura 28, donde parecido a lo que sucede con el 99mTc-Tat-BN, el mayor porcentaje de captación del radiofármaco ocurre en el

núcleo de las tres líneas celulares. La diferencia que se presenta en la

internalización entre el 99mTc-Tat-BN y el 188Re-Tat-BN, puede deberse a la

acidez con que se lleva a cabo el marcado de Tat-BN con 188Re, lo que provoca

que la molécula se divida y existan dos marcados, uno de 188Re-Tat-BN que es

el que se internaliza y otro de 188Re-BN que permanece en la membrana

celular.

La internalización del radiofármaco híbrido marcado con 188Re es posible por el

número de aminoácidos básicos presentes en el péptido Tat que interacciona

con los grupos cargados de la bicapa fosfolipídica de la membrana celular,

indicando que el Tat permite que el compuesto llegue al citoplasma y una vez

ahí la NLS permite que se internalice hasta el núcleo celular [19].


148

Figura 28. Biocinética del 188Re-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en

células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).


149

5.6.4 Modelos biocinéticos subcelulares de 188Re-Tat-BN

En las tablas 33, 34 y 35 se muestran los modelos biocinéticos del 188Re-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer PC3,

MCF7 y MDA-MB231 respectivamente, así como el número total de

desintegraciones (Bq·s) de 188Re que ocurrieron en cada compartimento

subcelular

Tabla 33. Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer PC3.

Región celular Modelo Biocinético A(t) [Bq]



Membrana 958.0

563.004.21.50)(2

032.00321.0838.0

====

++++++++==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

5076

Citoplasma 999.0

507.206.57)(2

218.00392.0466.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

22824

Núcleo 997.0

727.488.94)(2

244.00401.0561.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

48240


150

Tabla 34. Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MCF7.




Membrana 987.0

11.356.58.63)(2

0365.00366.011.1

====

++++++++==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

10620

Citoplasma 998.0

408.173.50)(2

256.0039.051.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

18504

Núcleo 995.0

9.545.608.92)(2

341.00395.0655.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

55800

Tabla 35. Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.




Membrana 1

1.113.1620)(2

039.0278.005.2

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

11988

Citoplasma 997.0

8.168.3222)(2

0306.00886.0314.0

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

30564

Núcleo 1

5.367.188.80)(2

0397.0217.088.4

====

++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−

R

eeetA ttt

35604


151

Podemos observar que el mayor número de desintegraciones ocurren en el

núcleo celular. Estos resultados son teóricos debido a que no se obtuvieron

experimentalmente, sino a partir de los datos biocinéticos del 99mTc-Tat-BN,

considerando la vida media del 188Re y los modelos biocinéticos hasta 72 h, lo

que incrementa de manera significativa el número de desintegraciones en cada

compartimento subcelular.

Las diferencias en captación e internalización que se observan entre las tres

líneas celulares, tiene relación con el número de GRPr que se expresan en la

membrana celular, que a su vez se relaciona con la expresión de receptores

esteroideos de cada tipo celular, como se mencionó anteriormente, las células

PC3 son andrógeno independientes, las células MCF7 son células estrógeno

dependientes y las MDA-MB231 son estrógeno independientes.

5.7 Pruebas in vivo

5.7.1 Estudios de Biodistribución in vivo de 188Re-Tat-BN

La biodistribución de 188Re-Tat-BN en ratones sanos BALB/c se observa en la

tabla 36, se muestra una lenta depuración sanguínea, eliminación hepatobiliar,

pero principalmente renal. Además de presentar captación en órganos con

GRPr como pulmón y páncreas, indicando la especificidad de la BN su

receptor.


152

Tabla 36. Biodistribución de 188Re-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a

diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).

% ID/g (promedio ± DS) Tejido

0.25 h 0.5 h 2 h 4 h 24 h

Sangre 8.16 ± 2.35 8.86 ± 2.26 5.26 ± 0.81 3.50 ± 0.31 1.59 ± 1.00

Corazón 2.28 ± 0.63 3.01 ± 1.74 2.78 ± 1.12 1.55 ± 0.24 1.37 ± 0.58

Pulmón 2.64 ± 1.07 3.89 ± 1.14 3.55 ± 1.02 1.92 ± 0.41 1.97 ± 0.42

Hígado 8.31 ± 3.36 14.19 ± 4.14 11.41 ± 3.02 5.10 ± 0.85 3.09 ± 0.75

Baso 1.93 ± 0.77 5.14 ± 0.03 3.69 ± 1.51 1.34 ± 0.54 2.08 ± 0.87

Páncreas 2.38 ± 0.99 5.91 ± 1.24 2.82 ± 0.69 1.98 ± 0.34 1.32 ± 1.00

Riñón 15.17 ± 6.53 36.39 ± 6.61 18.60 ± 4.69 13.11 ± 1.69 5.12 ± 1 .00

Intestino 4.39 ± 1.59 12.64 ± 8.94 7.26 ± 2.60 3.32 ± 0.96 1.08 ± 0.73

Músculo 0.98 ± 0.43 3.47 ± 1.09 0.97 ± 0.05 1.07 ± 0.51 0.05 ± 0.05

Hueso 1.29 ± 0.76 10.40 ± 5.97 1.42 ± 0.24 3.35 ± 2.28 2.12 ± 2.83

A pesar de la especificidad de la BN por sus receptores, que se encuentran

expresados de manera natural en páncreas y pulmones, el péptido Tat, debido

a su naturaleza catiónica, que es necesaria en la interacción con la bicapa

fosfolipídica de la membrana celular para permitir la internalización del

Tat-fusión-péptido al citoplasma y la localización nuclear, esta misma

característica afecta la tasa de depuración sanguínea, ya que se une a las

proteínas plasmáticas y células en general sin importar su tipo.


153

5.8 Dosis absorbida celular de 188Re-Tat-BN

En las tablas 37, 40 y 43 están los resultados de la dosis absorbida en

citoplasma y núcleo en las células PC3, MCF7 y MDA-MB-231

respectivamente, por cada desintegración (Gy/Bq·s) del 188Re, al multiplicarlo

por el número total de desintegraciones (Bq·s) de obtuvieron las dosis

absorbidas en los compartimentos subcelulares normalizado por unidad de

actividad captada en las células (Gy/Bq).

En las tablas 38, 41 y 44 se muestran las contribuciones de cada emisión β,

electrones CI y Auger a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las

células PC3, MCF7 y MDA-MB231.

Los porcentajes de absorción y subabsorción en la célula (ecuaciones 3.2 y

3.3) obtenidos a partir de la energía total emitida en cada desintegración y de la

energía absorbida en el núcleo y citoplasma de cada tipo de emisión se

observa en las tablas 39, 42 y 45 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231

respectivamente.


154

5.8.1 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3

Tabla 37. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3.

Posición

de la

fuente


(Gy/Bq ·s)

Dosis Absorbida

(Gy/Bq)

Núcleo 1.42E-05 ± 2.37E-08 0.6833 ± 0.0011

Citoplasma 2.52E-05 ± 3.01E-08 0.5755 ± 0.0007

Membrana

Citoplasma

7.78E-06 ± 2.35E-08 0.0395 ± 0.0001

Total 4.72E-05 ± 7.73E-08 Total 1.2983 ± 0.0019

Núcleo 1.34E-04 ± 1.38E-07 6.4671 ± 0.0066

Citoplasma 1.46E-05 ± 6.90E-08 0.3343 ± 0.0016

Membrana

Núcleo

6.86E-06 ± 4.72E-08 0.0348 ± 0.0002

Total 1.56E-04 ± 2.54E-07 Total 6.8362 ± 0.0085

Tabla 38. Dosis absorbida de radiación β, electrones CI y Auger del 188Re en

citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total

absorbida de radiación.

Blanco Tipo de

emisión

Dosis Absorbida

(Gy/Bq ·s)

% de

contribución

β 3.53E-05 ± 6.38E-08 74.87

CI 8.21E-06 ± 1.10E-08 17.42 Citoplasma

Auger 3.64E-06 ± 2.51E-09 7.72

β 1.10E-04 ± 2.16E-07 70.51

CI 2.37E-05 ± 3.23E-08 15.21 Núcleo

Auger 2.22E-05 ± 5.84E-09 14.28


155


espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en

células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.

Radiación β Electrones CI Electrones Auger Blanco

subcelular %

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 0.22 38.32 2.89 40.28 2.50 2.92

Núcleo 0.27 48.32 3.22 44.91 82.13 95.89

Membrana 0.08 13.36 1.06 14.81 1.02 1.19

Total 0.56 7.18 85.65

5.8.2 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7

Tabla 40. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7.

Posición

de la

fuente


(Gy/Bq ·s)

Dosis Absorbida

(Gy/Bq)

Núcleo 2.63E-05 ± 4.45E-08 1.4687 ± 0.0025

Citoplasma 4.76E-05 ± 5.50E-08 0.8803 ± 0.0010

Membrana

Citoplasma

2.29E-05 ± 4.98E-08 0.2432 ± 0.0005

Total 9.68E-05 ± 1.49E-07 Total 2.5922 ± 0.0040

Núcleo 3.13E-04 ± 3.35E-07 17.4433 ± 0.0187

Citoplasma 3.67E-05 ± 1.79E-07 0.6797 ± 0.0033

Membrana

Núcleo

1.89E-05 ± 1.29E-07 0.2008 ± 0.0014

Total 3.68E-04 ± 6.42E-07 Total 18.3238 ± 0.0233


156


citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis

total absorbida de radiación.

Blanco Tipo de

emisión

Dosis Absorbida

(Gy/Bq ·s)

% de

contribución

β 7.26E-05 ± 1.26E-07 75.03

CI 1.61E-05 ± 1.89E-08 16.63 Citoplasma

Auger 8.07E-06 ± 4.09E-09 8.34

β 2.46E-04 ± 5.52E-07 66.90

CI 5.15E-05 ± 7.59E-08 13.97 Núcleo

Auger 7.04E-05 ± 1.48E-08 19.12



células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.


subcelular %

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 0.21 42.26 2.77 43.89 2.13 2.52

Núcleo 0.22 43.03 2.52 39.92 81.57 96.44

Membrana 0.07 14.72 1.02 16.19 0.88 1.04

Total 0.50 6.32 84.59


157

5.8.3 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231

Tabla 43. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231.

Posición

de la

fuente


(Gy/Bq ·s)

Dosis Absorbida

(Gy/Bq)

Núcleo 1.98E-05 ± 3.20E-08 0.7062 ± 0.0011

Citoplasma 3.42E-05 ± 3.90E-08 1.0439 ± 0.0012

Membrana

Citoplasma

1.04E-05 ± 3.18E-08 0.1252 ± 0.0004

Total 6.44E-05 ± 1.03E-07 Total 1.8753 ± 0.0027

Núcleo 2.23E-04 ± 2.36E-07 7.9454 ± 0.0084

Citoplasma 1.97E-05 ± 1.07E-07 0.6028 ± 0.0033

Membrana

Núcleo

8.06E-06 ± 6.68E-08 0.0966 ± 0.0008

Total 2.51E-04 ± 4.10E-07 Total 8.6448 ± 0.0125


citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la

dosis total absorbida de radiación.

Blanco Tipo de

emisión

Dosis Absorbida

(Gy/Bq ·s)

% de

contribución

β 4.82E-05 ± 8.51E-08 74.83

CI 1.10E-05 ± 1.43E-08 17.04 Citoplasma

Auger 5.24E-06 ± 3.19E-09 8.13

β 1.71E-04 ± 3.51E-07 67.97

CI 3.60E-05 ± 4.95E-08 14.36 Núcleo

Auger 4.44E-05 ± 9.23E-09 17.67


158



células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.


subcelular %

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 0.21 42.26 2.77 43.89 2.13 2.52

Núcleo 0.22 43.03 2.52 39.92 81.57 96.44

Membrana 0.07 14.72 1.02 16.19 0.88 1.04

Total 0.50 6.32 84.59

5.8.4 Resumen de dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células de cáncer

Tabla 46. Dosis absorbida (Gy/Bq) de 188Re-Tat-BN en núcleo y citoplasma de

células de cáncer.

Dosis Absorbida (Gy/Bq) Línea Celular

Citoplasma Núcleo

PC3 1.2983 ± 0.0019 6.8362 ± 0.0085

MCF7 2.5922 ± 0.0040 18.3238 ± 0.0233

MDA 1.8753 ± 0.0027 8.6448 ± 0.0125


159

Tabla 47. Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en

citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de radiación β,

electrones CI y Auger de 188Re.

Blanco Tipo de

emisión

% de contribución a

la Dosis Absorbida

β 74.91 ± 0.08

CI 17.03 ± 0.26 Citoplasma

Auger 8.06 ± 0.23

β 68.46 ± 1.36

CI 14.51 ± 0.46 Núcleo

Auger 17.03 ± 1.83

Tabla 48. Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de

radiación β, electrones CI y Auger de 188Re en citoplasma y núcleo de las

células PC3, MCF7 y MDA-MB231.


subcelular %

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

%

Absorción

%

Subabsorción

Citoplasma 0.20 ± 0.02 40.31 ± 1.33 2.65 ± 0.24 41.89 ± 1.33 2.12 ± 0.26 2.50 ± 0.30

Núcleo 0.22 ± 0.03 44.23 ± 2.73 2.63 ± 0.40 41.15 ± 2.51 81.67 ± 0.31 96.40 ± 0.34

Membrana 0.08 ± 0.00 15.46 ± 1.89 1.06 ± 0.03 16.96 ± 1.95 0.94 ± 0.06 1.10 ± 0.06

Total 0.50 ± 0.04 6.34 ± 0.56 84.72 ± 0.62

Como se describe en el capítulo anterior las dosis absorbidas totales tanto en

el núcleo y en el citoplasma de las tres líneas celulares proviene de la suma de

las contribuciones de las actividades en membrana, citoplasma y núcleo al

blanco subcelular.


160

Las dosis absorbidas por desintegración del 188Re son menores que las del 99mTc, debido a que las energías de la radiación β se emite en un espectro de

energías, por consiguiente, las emisiones de más baja energía son las que

contribuirían mayormente a la dosis subcelular, debido a su corto alcance. Sin

embargo, la probabilidad de emisión de β de baja energía es muy baja, no

obstante, son las que más contribuyen a la dosis absorbida tanto en el

citoplasma (74.91 ± 0.08 %), como en el núcleo (68.46 ± 1.36 %). Los

electrones CI contribuyen más que los electrones Auger a la dosis absorbida en

el citoplasma. Pero en el núcleo el efecto es inverso, es decir la mayor

contribución a la dosis absorbida en el núcleo de las células se debe a los

electrones Auger, cuya diferencia en el rango a nivel celular con respecto a los

electrones CI y radiación β, permite que depositen la mayoría de su energía

dentro de los límites de tamaño del núcleo celular.

5.9 Discusión y conclusiones

La simulación de la molécula a través de MM3 permite optimizar la geometría

molecular utilizando mecánica molecular clásica. El sistema encuentra la

geometría óptima por medio del movimiento sistemático de todos los átomos en

la muestra química hasta que la fuerza neta que actúa en cada átomo se

aproxima a cero. Conflex genera confórmeros de baja energía de una

molécula con cualquier forma. Los cálculos se realizaron con un metal sin ser

específicamente Tc o Re, así que la energía mínima calculada de 271 kcal/mol

apoyan la preparación del péptido híbrido y demuestra que la capacidad de

reconocimiento específico del péptido no se afecta por la formación del

complejo Re(O)N2S2. Sin embargo, la estabilidad del quelante mismo

[Re(O)(N2S2)]-1 puede afectarse aunque no significativamente.

Las diferencias observadas en la captación de 188Re-Tat-BN entre las líneas

celulares MDA-MB231 y MCF7, puede deberse a que a pesar de que ambas

son células de cáncer de mama, las primeras son estrógeno independientes y

las segundas son estrógeno dependientes y esta condición afecta la cantidad

de GRPr que se expresan en la membrana celular. En el caso específico de


161

estas dos líneas celulares, Halmos y cols, demostraron que ambas tienen

GRPr y ambas tienen sitios de unión de alta y baja afinidad, siendo incierta la

razón de esta característica. Sin embargo, hace la aclaración de que la

expresión de GRPr parece estar relacionada a su origen clonal [20]. Pero en

este estudio se demostró que los GRPr están presentes en ambas líneas

celulares, pero en concentraciones distintas ya que ambas captaron al

radiofármaco y cuando se bloquearon los GRPr, se observa el efecto debido

sólo al Tat, que fue menor del 7% de captación.

De acuerdo con Tetsu Yano y cols, la BN o el GRP pueden actuar como

factores de crecimiento a través de los receptores de BN o GRPr en algunos

cánceres de mama humanos. Además de reportar que la expresión de GRPr

puede disminuir o aumentar, de acuerdo al suero del medio que se utilice en

los cultivos celulares. Tetsu Yano y cols obtuvieron como resultado que las

células MCF7 no respondieron a la BN, aunque otros autores han reportado lo

contrario y las células MDA-MB231 mostraron una gran afinidad por la BN en

los sitios de unión del GRPr, mismo resultado publicado por Miyazaki M y cols

[21-23]. Estas diferencias entre varios reportes acerca de la presencia o no del

GRPr en las células de cáncer de mama MCF7 se pueden atribuir a la

diferencia del clon celular y las condiciones de cultivo utilizadas en los

experimentos.

Las células de cáncer de próstata humano PC3 andrógeno independientes

sobre expresan el GRPr, por lo que se observa alta captación del radiofármaco.

A pesar de que de Visser y cols reportaron que la alta densidad del GRPr sólo

se observaba en células de tumores PC3 de próstata andrógeno dependientes,

es decir, sólo en etapas tempranas del desarrollo del cáncer. Stangelberger y

Ferro Flores y cols reportaron que las células PC3 mostraban GRPr con alta

afinidad por la BN [24, 25].

Es importante mencionar que además de la unión específica e internalización

del radiofármaco 188Re-Tat-BN a los GRPr debido a las características del

péptido BN, el péptido Tat, aumenta la internalización celular debido a que su


162

secuencia de aminoácidos facilita el transporte intracelular directo de la

biomolécula a través de la barrera de la membrana plasmática de manera

independiente de los receptores. El Tat se internaliza al citoplasma celular sin

importar el tipo de célula y puede transducir eficientemente en casi el 100% de

las células, tanto in vitro, como in vivo sin toxicidad aparente. Esta

internalización del Tat-BN depende de la interacción entre las cargas negativas

de los fosfolípidos de la membrana celular y los aminoácidos cargados

positivamente (argininas y lisinas) de la secuencia del péptido Tat [26, 27].

Cornelissen y cols, reportaron que debido a la poca especificidad del Tat y el

efecto que esto tiene en la biodistribución de Tat-fusión-proteína o -péptido

radiomarcado, la dosis absorbida en el tejido sano como los riñones o el

hígado, disminuiría si se administrara el péptido híbrido intratumoralmente que

si se hiciera intravenosamente [28]. Del mismo modo se puede reducir la

captación y por lo tanto la dosis absorbida en tejido no blanco, a través de la

aplicación de la infusión de aminoácidos catiónicos, es decir, arginina-lisina,

antes y después de la aplicación de 188Re-Tat-BN ya que bloquea sitios de

captación del Tat, permitiendo actuar de manera predominante a la BN, como

Bodei y cols recomiendan [29].

Existen varios estudios realizados con éxito para el radiomarcado de BN con 188Re, así como pruebas in vitro e in vivo de éstos mismos radiofármacos,

como el [188Re(H2O)(CO)3-ácido diaminopropiónico-SSS-BN(7-14)NH2] probado

con células de cáncer de próstata PC3 [30], el [188Re-N3S-5-Ava-BBN(7-

14)NH2] que mostró alta especificidad por los GRPr pero eliminación renal y

hepatobiliar importante [31] y [M(L(2)-BBN)(L(1)-acr)(CO)(3)] que mostró

captación e internalización en células PC3 pero no internalización nuclear [32].

Sin embargo, las ventajas del 188Re-Tat-BN respecto a éstos radiofármacos,

son, en primer lugar, el péptido híbrido, que tiene especificidad molecular al

unirse por medio de la BN a los GRPr sobreexpresados en células de cáncer

de mama y próstata. Tiene también el Tat que le da la capacidad de aumentar

su internalización celular y le da la característica de localización nuclear y

además, el radiomarcado con 188Re que le permite ser utilizado como un


163

radiofármaco para diagnóstico por la emisión gamma de 150 keV y como

agente terapéutico por la emisión β, de electrones Auger y CI.

El 188Re es un radionúclido con excelentes propiedades físicas y químicas que

ha sido utilizado para marcar muchas moléculas terapéuticas, incluyendo

anticuerpos monoclonales y péptidos. La ventaja que tiene sobre otros

radionúclidos es su disponibilidad a través de un generador de 188W/188Re. Sin

embargo, el uso de 90Y o 177Lu para terapia es más común porque tienen una

química más simple que la del 188Re. No obstante, estudios clínicos y

preclínicos han demostrado que la terapia que utiliza 188Re tiene propiedades

dosimétricas y farmacocinéticas favorables [10]. Varias moléculas como

anticuerpos monoclonales, péptidos, fosfonatos, liposomas o coloides se han

marcado con 188Re con propiedades similares a las mostradas por el 188Re-Tat-BN.

Actualmente los radionúclidos más utilizados en la clínica para

radioinmunoterapia son el 188Re, 131I y el 90Y, mientras que el 177Lu y el 90Y son

usados en la radioterapia mediada por un receptor peptídico. Sin embargo, en

este trabajo el 188Re se utilizó para marcar un péptido híbrido, dirigido a un

receptor específico expresado en la membrana de células de cáncer de

próstata y mama y capaz de internalizar al radiofármaco hasta el núcleo; lo que

le brinda características adecuadas para el tratamiento molecular en medicina

nuclear.

Un radionúclido con vida media física larga depositará más energía por

decaimiento que uno con vida media corta, considerando que ambos tienen la

misma actividad inicial e igual biocinética en el tejido blanco. Además hay una

diferencia importante en la tasa de dosis dependiente del tiempo de ambos

radionúclidos. En general, por razones biológicas, las tasas de dosis más altas

entregadas en tiempos de tratamiento cortos son más efectivas. Por lo tanto,

un radionúclido con vida media más corta tendrá mayor efectividad biológica

que uno con energía de emisión similar pero con vida media más larga [10, 33].

En este contexto el 188Re tiene ventaja sobre el 177Lu y 131I durante el primer día


164

de tratamiento. Así mismo, el que éste radiofármaco se internalice hasta el

núcleo permite que además de aprovechar la emisión β por efecto del fuego

cruzado, aumente su efectividad radiobiológica por la acción de los electrones

Auger cercanos al ADN.

Uusijarvi y cols estimaron la tasa de dosis absorbida en tumores dividida entre

la tasa de dosis absorbida en el tejido normal (TND), para diferentes tamaños

de tumores en un modelo matemático del cuerpo humano. Los valores TND

medios y máximos (medio/max) para el 188Re, localizado en el núcleo o en el

citoplasma, fueron de 8/123, para 177Lu en el núcleo fue de 15/25 y en

citoplasma de 14/25, concluyendo que los valores TND para emisores β no se

afectan por una distribución subcelular del radionúclido pero sí para emisores

de electrones Auger como es el caso del 188Re [10, 33].

Otra de las ventajas del 188Re es que tiene una emisión gamma de 150 keV, lo

que permite obtener imágenes cuantitativas en una gammacámara para la

evaluación de estimaciones biocinéticas y dosimétricas.

Los tumores sólidos son resistentes a la apoptosis, sin embargo el mecanismo

por el cual la irradiación β induce la muerte celular es a través de la

sobrerregulación del ligante CD95 y su receptor, con la consecuente activación

de caspasas, además del daño resultante a las mitocondrias. [10] Por lo que el

radiofármaco 188Re-Tat-BN presenta ventajas tanto como emisor gamma para

diagnóstico, emisor β en la terapia de tumores sólidos y emisor Auger y CI en la

muerte celular por su cercanía al ADN.

El efecto bystander de la radiación también juega un papel importante en la

radioterapia, que resulta de los efectos de células irradiadas y no irradiadas.

Algunos estudios han propuesto la posible existencia de mediadores solubles

producidos por las células después de la irradiación, pueden afectar a células

no irradiadas [35].


165

A pesar de la baja emisión Auger y CI que presenta el 188Re, tienen una

importante aportación a la dosis absorbida nuclear, de 17 y 14.5%

respectivamente, mientras que en el citoplasma es de 8 y 17%

respectivamente. Sin embargo, la mayor aportación a la dosis absorbida ocurre

por la emisión β del radionúclido, ya que aunque se conocen las emisiones

máximas y promedio, este tipo de emisión ocurre en un espectro de energías,

por lo tanto las emisiones β de menor energía son las que depositan en su

mayoría o en su totalidad la energía dentro los limites nucleares y

citoplasmáticos. Contrariamente a lo que ocurre con el radiofármaco 99mTc-Tat-BN, el 188Re-Tat-BN tiene menor dosis absorbida por desintegración,

que al multiplicarla por el número total de desintegraciones tenemos mayor

dosis absorbida por unidad de actividad captada por la célula en el caso del

radiofármaco marcado con 188Re que con 99mTc, debido a la biocinética y las

diferencias en el tiempo de vida media física de los radiofármacos.

La contribución debida al efecto de fuego cruzado por las emisiones β del 188Re

a la dosis absorbida es de aproximadamente 30% si el radiofármaco se

encontrara en la superficie celular según los estudios realizados por Torres

García y cols. [36]

Entonces se puede concluir que en medicina nuclear molecular para terapia

mediada por un receptor peptídico, como en este caso el GRPr, muestra que

los estudios preclínicos farmacocinéticos del 188Re-Tat-BN son favorables

aunque no los mejores para un estudio clínico completo. Sin embargo el hecho

de que éste radionúclido emisor de electrones Auger y CI sea capaz de

internalizarse al núcleo y citoplasma de células de cáncer es un avance

importante para la terapia de radiación por medicina nuclear molecular.


166

5.10 Referencias

[1] Oyen W. J. G,, L. Bodei, F. Giammarile, H. R. Maecke, J. Tennvall, Targeted therapy in nuclear medicine—current status and future prospects., M. Luster1,7 & B. Brans, Journal: Annals of Oncology ISSN: 1572-610X, vol. 5 p. 149- 159. 2008.

[2] Amin I. Kassin and S. James Adelstein. Considerations in the Selection of Radionuclides for Cancer Therapy (pages) Handbook of radiohaprmaceuticals, John Wiley & Sons,Ltd Print ISBN: 9780471495604, Online ISBN: 9780470846384, DOI: 10.1002/04708463801:767–793 2005

[3] Dik J. Kwekkeboom; Jan Mueller-Brand; Giovanni Paganelli; Lowell B. Anthony; Overview of Results of Peptide Receptor Radionuclide Therapy with 3 Radiolabeled Somatostatin Analogs J Nucl Med; 46:62S–66S 2005

[4] Gugger M and Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in non-neoplastic and neoplastic human breast. Am J Pathol 155:2067-2076 1999

[5] Scopinaro F, De Vincentis G, Varvarigou AD, Laurenti C, Iori F, Remediani S, Chiarini S, Stella S. 99mTc-bombesin detects prostate cancer and invasion of pelvic lymph nodes. Eur J Nucl Med Mol Imaging 30:1378-1382, 2003

[6] Van de Wiele C, Phonteyne P, Pauwels P, et al. Gastrin-releasing peptide receptor imaging in human breast carcinoma versus immunohistochemistry. J Nucl Med.;49:260–264, 2008

[7] Lantry LE, Cappelletti E, Maddalena ME, et al. 177Lu-AMBA: synthesis and characterization of a selective 177Lu-labeled GRP receptor agonist for systemic radiotherapy of prostate cancer. J Nucl Med.;47:1144–1152. 2006

[8] Zhang H, Chen J, Waldherr C, et al. Synthesis and evaluation of bombesin derivatives on the basis of pan-bombesin peptides labeled with indium-111, lutetium-177, and yttrium-90 for targeting bombesin receptor-expressing tumors.Cancer Res.;64:6707–6715, 2004

[9] Cescato R, Maina T, Nock B, et al. Bombesin receptor antagonists may be preferable to agonists for tumor targeting. J Nucl Med.;49:318–326, 2008

[10] Ferro-Flores G and Arteaga de Murphy C, Pharmacokinetics and Dosimetry of 188Re-based Targeted Radiotherapeutics, Advanced Drug Delivery Reviews, 60, 12: 1389-1401, 2008

[11] Chang CH, Stabin MG, Chang YJ,, Cheng LC, Comparative Dosimetric Evaluation of Nanotargeted 188Re-(DXR)-Liposome for Internal Radiotherapy, Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, vol. 23, no. 6, pp. 749–758, 2008.

[12] Canney, D.J., Billings, J., Francesconi, L.C., Guo, Y.-Z., Haggerty, B.S., Rheingold, A.L., Kung, H.F.,. Dicarboxylate diamide dimercaptide (N2S2) technetium-99m complexes: synthesis and biological evaluation as potential renal radiopharmaceuticals. J. Med. Chem. 36, 1032–1040. 1993

[13] Bandoli G., Dolmella, A., Porchia, M., Refosco, F., Tisato, F., 2001. Structural overview of technetium compounds (1993–1999). Coord. Chem. Rev. 214, 43–90; Bandoli et al., 2001

[14] Ferro-Flores G, Torres-García E, García-Pedroza L, Arteaga de Murphy C, Pedraza-López M, Garnica-Garza H., An efficient, reproducible and fast preparation of 188Re-anti-CD20 for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma. Nucl Med Commun. Sep;26(9):793-9. 2005

[15] Zamora, P.O., Marek, M.J., Knapp, F.F., Preparation of 188Re-RC-160 somatostatin analog: a peptide for Local/regional radiotherapy. Appl.Radiat. Isot. 48, 305-309, 1997

[16] Meléndez-Alafort L, Ferro-Flores G.1; Arteaga-Murphy C.; Pedraza-Lopez .; Gonzalez-Zavala M.A.; Tendilla J.I.; Garca-Salinas L.; Internacional


167

Journal of Pharmaceutics, 1999, Labeling peptides with rhenium-188, 182;2: 165-172; 1999.

[17] Slice LW, Yee HF Jr, Walsh JH. Visualization of internalization and recycling of the gastrin releasing peptide receptor-green fluorescent protein chimera expressed in epithelial cells, Receptors Channels.;6(3):201-12. 1998

[18] Grady EF, Slice LW, Brant WO, Walsh JH, Payan DG, Bunnett NW Direct observation of endocytosis of gastrin releasing peptide and its receptor. J Biol Chem; 270(9):4603-11; 1995

[19] Jehangir S. Wadia, Steven F. Dowdy; Transmembrane delivery of proteína and peptide drugs by Tat-mediated transduction in the treatment of cancer; Advanced Drug Delivery Reviews 57: 579-596; 2005

[20] Halmos G, Wittliff JL, Schally AV. Characterization of bombesin/gastrin releasing peptide receptors in human breast cancer and their relationship to steroid receptor expression. Cancer Res; 55:280–287; 1995

[21] Tetsu Yano, Jacek Pinski, Kate Groot, and Andrew V. Schally. Stimulation by Bombesin and Inhibition by Bombesin/Gastrin-releasing Peptide Antagonis RC-3095 of Growth of Human Breast Cancer Lines. Cancer Research 52, 4545-4547, 1992

[22] Patel, K.V., and Schrey , M. P. Modulation of inositol lipid hydrolisis in human breast cancer cells by two classes of bombesin antagonist. J. Mo.l. Endocrinol., 6:71-78, 1991

[23] Miyazaki M, LamharziN, Schally AV, Halmos G, Szepeshazi K, Groot K, Cai RZ. Inhibition of growth of MDA-MB231 human breast cancer xenografts in nude mice by bombesin/gastrin releasing peptide (GRP) antagonists RC-3940-II and RC-3095. European Journal of Cancer, Volume 34, Issue 5, Pages 710-717, 1998

[24] Stangelberger A, Schally A, Varga J, Srandi M, Szepeshazi K, Armatis P, Halmos G, Inhibitory Effecto of Antagoniss of Bombesin and Growth Hormona-Releasing Hormona on Orthotopic and Intraosseous Growth and Invasiveness of PC3 Human Prostate Cancer in Nude Mice, Clinical Cancer Research, vol 11, 49-57, 2005

[25] Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Rodríguez-Cortés J, Pedraza-López M, Ramírez-Iglesias MT. Preparation and Evaluation of 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-Bombesin for Imaging of GRP Receptor-Positive Tumours. Nucl Med Commun 27: 371-376 2006.

[26] Jehangir S. Wadia, Steven F. Dowdy. Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by Tat-mediated transduction in the treatment of cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 57: 579-596. 2005

[27] Brooks H, Lebleu B, Vives E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Advanced Drug Delivery Reviews. 57: 559-577; 2005

[28] Cornelissen B, McLarty K, Kersemans V, Scollard D, Reilly R. Properties of [111In]-labelled HIV-1 Tat peptide radioimmunoconjugates in tumor-bearing mice following intravenous or intratumoral injection. Nucl Med Biol; 35:101-10. 2008

[29] Bodei, L., Cremonesi, M., Zoboli, S., Grana, C., Bartolomei, M., Rocca, P., Caracciolo, M., Macke, H.R., Chinol, M., Paganelli, G., Receptor-mediated radionuclid therapy with 90Y-DOTATOC in association with amino acid infusion: a phase 1 study. Eur. J. Nucl. Med. 30, 207–216. 2003

[30] Smith CJ, Sieckman GL, Owen NK, Hayes DL, Mazur DG, Volkert WA, Hoffman TJ, Radiochemical investigations of [188Re(H2O)(CO)3-diaminopropionic acid-SSS-bombesin(7-14)NH2]: syntheses, radiolabeling and in vitro/in vivo GRP receptor targeting studies, Anticancer Res.;23(1A):63-70. 2003


168

[31] Moustapha ME, Ehrhardt GJ, Smith CJ, Szajek LP, Eckelman WC, Jurisson SS Preparation of cyclotron-produced 186Re and comparison with reactor-produced 186Re and generator-produced 188Re for the labeling of bombesin; Nucl Med Biol.;33(1):81-9; 2006

[32] Agorastos N, Borsig L, Renard A, Antoni P, Viola G, Spingler B, Kurz P, Alberto R. Cell-specific and nuclear targeting with [M(CO)(3)](+) (M=(99m)Tc, Re)-based complexes conjugated to acridine orange and bombesin. Chemistry.;13(14):3842-52; 2007

[33] Kassis, J. Adelstein, Considerations in the selection of radionuclides for cancer therapy, in: M.J. Welch, C.S. Redvanly (Eds.), Handbook of Radiopharmaceuticals, Radiochemistry and Applications, Wiley & Sons, London, pp. 767–793. 2003.

[34] Uusijarvi, P. Bernhardt, T. Ericsson, E. Forssell-Aronsson, Dosimetric characterization of radionuclides for systemic tumor therapy: influence of particle range, photon emission, and subcellular distribution, Med. Phys. 33 3260–3269. 2006

[35] Hernandez, S.J. Knox, Radiobiology of radioimmunotherapy: targeting CD20 B-cell antigen in non-Hodgkin's lymphoma, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59 1274–1287. 2004

[36] Torres G, Garnica G, Ferro F, Monte Carlo Micordosimetry of 188Re and 131I- labeled anti-CD20., Phys. Med. Biol. 51:349-56 2006


169

Capítulo 6

Conclusiones generales y trabajo a futuro


170

6.1 Conclusiones Generales

Los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN se diseñaron a partir de

radioconjugados híbridos cuyas energías mínimas (~300kcal/mol) permiten

estructuras moleculares termodinámicamente estables. La conformación

adquirida por la molécula peptídica no interfiere con el sitio de reconocimiento

específico de la BN. Estos resultados apoyan la propuesta de que la

preparación de los radiofármacos es viable y mantienen su especificidad.

La región para quelar al 99mTc o 188Re consta de la secuencia de aminoácidos

Cys-Gly-Cys-NH2 (para formar el ligante -N2S2-) y se utilizó con éxito para

preparar complejos estables con dichos metales sin alterar la actividad

biológica de la molécula.

Los radiofármacos híbridos utilizados en este trabajo mostraron unión

significativa a células de cáncer PC3 (próstata), MCF7 (mama) y MDA-MB231

(mama) aunque con diferentes afinidades debido a las diferencias en la

expresión del GRPr que depende de la expresión de receptores esteroideos en

etapas tempranas del cáncer de próstata o mama. Las diferencias en captación

también pueden atribuirse al origen clonal de cada línea celular.

Los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN además de mostrar alta

especificidad por los GRPr de células de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231

debido al péptido BN, se internalizan al citoplasma celular a través de la barrera

de la membrana plasmática por efecto del péptido Tat. La secuencia de

aminoácidos de localización nuclear (NLS, Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-

Arg) con que cuenta el Tat transporta a la biomolécula hasta el núcleo celular a

través de los poros perinucleares, donde por efecto de las cargas negativas de

los grupos fosfato del ADN y las cargas positivas los aminoácidos lisina y

arginina del péptido Tat, se produce una interacción electrostática entre los

radiofármacos y el ADN. Los análisis inmunohistoquímicos mostraron

incremento en la abundancia del Tat-BN en el núcleo, este resultado se asoció

con la inhibición de la proliferación celular como consecuencia de los

electrones Auger y CI de baja energía del 99mTc-Tat-BN dentro del núcleo (PC3


171

(52.98%), MCF7 (45.71%) y MDA-MB231 (35.80%) con respecto a células no

expuestas).

Las cargas positivas del Tat (aminoácidos argininas y lisinas) interactúan más

fácilmente con las proteínas, ya que el péptido no está dirigido a un receptor

específico, por lo que los radiofármacos híbridos utilizados en este trabajo se

unen a proteínas plasmáticas aproximadamente 20% más que el radiofármaco

sin Tat. La propiedad catiónica del péptido Tat le permite penetrar la membrana

celular y localizar al núcleo, pero estas características afectan la tasa de

depuración sanguínea así como la unión e internalización de los radiofármacos

en células no blanco. Sin embargo, la captación en células de cáncer aumentó

significativamente para los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN

comparado con la captación de 99mTc-BN.

La mayor actividad en sangre que se observó en los estudios de biodistribución

en ratones para el 99mTc-Tat-BN comparado con el 99mTc-BN no afectó

significativamente el contraste de la imagen tumoral en ratones. El 99mTc-Tat-BN mostró una mayor captación y contraste en el tumor de células

PC3 inoculadas en ratones atímicos respecto al 99mTc-BN. Los estudios de

biodistribución mostraron que la máxima acumulación de actividad se presenta

en los riñones, indicando que la excreción biológica fue principalmente por vía

renal.

Los cálculos de dosis absorbida a nivel subcelular utilizando el método Monte

Carlo que se realizaron en este trabajo son originales. A diferencia de otros

cálculos reportados previamente, las geometrías y tamaños de las células

utilizadas en este estudio se diseñaron a partir de las imágenes microscópicas

reales de las mismas células que difieren significativamente de los modelos de

células esféricas. Estos parámetros son factores críticos al evaluar la fracción

de dosis absorbida de los electrones sobre las dimensiones nucleares. Los

datos radiofarmacocinéticos a nivel subcelular que se obtuvieron

experimentalmente y que se utilizaron para el cálculo de dosis absorbida en las


172

regiones del citoplasma y núcleo celular también fueron un factor crítico para

mejorar la exactitud en los cálculos de dosis absorbida.

Los electrones Auger de baja energía, emitidos por el 99mTc y el 188Re se

consideran como las partículas más adecuadas para la inactivación de células

de cáncer, sin embargo, los electrones CI emitidos por el 99mTc y la emisión β

de baja energía del espectro de 188Re fueron los principales contribuyentes a la

dosis absorbida en el núcleo celular. El 188Re-Tat-BN produce una menor dosis

absorbida por desintegración respecto al radiofármaco 99mTc-Tat-BN. Cuando

se multiplican los Gy/Bq·s por el número total de desintegraciones (Bq·s) se

obtiene mayor dosis absorbida normalizada por unidad de actividad (Bq)

captada en la célula para el caso del 188Re que con 99mTc debido a la

biocinética y a las diferencias en el tiempo de vida media física de los

radionúclidos.

El efecto biológico de los electrones Auger, CI y la radiación β de los

radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN no solo incluye el daño al ADN si

se encuentran en el núcleo celular, la dosis absorbida de radiación también

puede causar daño a membranas y organelos, de tal manera que se inicie la

señalización de rutas apoptóticas dentro de las células. La prueba de

proliferación celular refleja el arresto del ciclo celular, la apoptosis y otros

métodos de muerte celular por efecto de la energía depositada. Por lo tanto, es

necesario evaluar la ruta específica de muerte celular producida por estos

radiofármacos.

Los radiofármacos híbridos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN pueden ser utilizados

en el diagnóstico y la radioterapia de blancos moleculares como parte de un

esquema de terapia combinada, ya que cuentan con un sitio de reconocimiento

específico (BN) para células de cáncer de próstata PC3 y de mama MCF7 y

MDA-MB231, además de contar con un péptido de internalización (Tat) que le

permite a las moléculas radiomarcadas atravesar la barrera lipofílica de la

membrana plasmática. Por las características físicas de ambos radionúclidos 99mTc y 188Re, los radiofármacos desarrollados en este trabajo son útiles para la


173

obtención de imágenes de cáncer de próstata y mama y para producir muerte

celular, ya que depositan dosis absorbidas en el núcleo celular de

0.142 mGy/Bq·s a 0.434 mGy/Bq·s para el caso del 99mTc-Tat-BN y de

0.156 mGy/Bq·s a 0.368 mGy/Bq·s para el caso del 188Re-Tat-BN.

6.2 Relevancia y trabajo a futuro

La utilización de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN no se limita a

imágenes nucleares o a la radioterapia de blancos moleculares. Estos

radiofármacos podrían conjugarse a otras moléculas como los fluorocromos de

infrarrojo cercano o los nanocristales semiconductores (“quantum dots”) para

obtener imágenes moleculares ópticas de fluorescencia y para imágenes

nucleares como métodos complementarios que permitan validar el diagnóstico

de cáncer o monitoreo in vivo de la unión del ligante a su receptor. El péptido

híbrido Tat-BN o cada péptido por separado (Tat o BN) se podrían conjugar a

estos mismos sistemas para ser utilizados en la obtención de imágenes

dinámicas ópticas y observar la captación celular o el transporte intracelular de

nanopartículas en células vivas o el mecanismo de acción propio del péptido

Tat, BN o Tat-BN en las células.

El modo natural de interacción entre los GRPr y la BN involucra múltiples sitios

de unión, por tanto, la afinidad a GRPr de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN podría mejorarse utilizando sistemas multivalentes. Es decir, la

unión de decenas o centenas de moléculas de péptidos a la superficie de por

ejemplo, una nanopartícula de oro (AuNP) produciría un sistema multivalente

capaz de incrementar la unión de las AuNP-Tat-BN a sus receptores. Dado que

las AuNPs ocasionan destrucción celular térmica irreversible cuando son

irradiadas con un láser, los radiofármacos unidos a AuNPs preparados como

sistemas multivalentes permitirían, además de la obtención de imágenes

diagnósticas, la posibilidad de aplicarlos en terapias combinadas, es decir,

radioterapia por efecto de los electrones de baja energía Auger, CI ó radiación

β y termoterapia por efecto de las AuNPs.


174

La secuencia de aminoácidos Tat(49-57) internaliza eficazmente a los

radiofármacos al núcleo celular, pero también produce un efecto mitogénico. Se

propone utilizar otras NLS como por ejemplo, los aminoácidos Pro-Lys-Lys-Lys-

Arg-Lys-Val a fin de disminuir significativamente el efecto mitogénico e

incrementar de manera significativa la muerte celular.

Las modificaciones propuestas (secuencias de aminoácidos, unión a moléculas

ópticas y formación de sistemas multivalentes) como trabajo a futuro, podrían

mejorar las propiedades farmacocinéticas de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN para ser utilizados en pruebas clínicas que conduzcan a la

obtención de productos eficaces y seguros que puedan aplicarse de manera

cotidiana en el diagnóstico y terapia de cáncer de mama y próstata por técnicas

de Medicina Nuclear Molecular.


175

Anexos

Author's personal copy

C.L. Santos-Cuevas et al. / International Journal of Pharmaceutics 375 (2009) 75–83 83

Chen, L., Harrison, S.D., 2007. Cell-penetrating peptides in drug development:enabling intracellular targets. Biochem. Soc. Trans. 35, 821–825.

Cornelissen, B., McLarty, K., Kersemans, V., Scollard, D., Reilly, R., 2008. Propertiesof [111In]-labeled HIV-1 tat peptide radioimmunoconjugates in tumor-bearingmice following intravenous or intratumoral injection. Nucl. Med. Biol. 35,101–110.

Costantini, D.L., Hu, M., Reilly, R., 2008. Peptide motifs for insertion of radiolabeledbiomolecules into cells and routing to the nucleus for cancer imaging or radio-therapeutic applications. Cancer Biother. Radiopharm. 23, 3–23.

Decristoforo, C., Melendez-Alafort, L., Sosabowski, J.K., Mather, S.J., 2000. 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotide for imaging somatostatin-receptor-positive tumors:preclinical evaluation and comparison with 111In-octreotide. J. Nucl. Med. 41,1114–1119.

Deshayes, S., Morris, M.C., Divita, G., Heitz, F., 2005. Interactions of primary amphi-pathic cell penetrating peptides with model membranes: consequences onthe mechanisms of intracellular delivery of therapeutics. Curr. Pharm. Des. 11,3629–3638.

de Visser, M., Verwijnen, S.M., de Jong, M., 2008. Improvement strategies for peptidereceptor scintigraphy and radionuclide therapy. Cancer Biother. Radiopharm. 23,137–157.

Dietz, G.P., Bähr, M., 2004. Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojanhorse approach. Mol. Cell. Neurosci. 27, 85–131.

Drin, G., Cottin, S., Blanc, E., Rees, A., Temsamani, J., 2003. Studies on the inter-nalization mechanism of cationic cell penetrating peptides. J. Biol. Chem. 278,31192–31201.

Faintuch, B.L., Santos, R.L.S., Souza, A.L.F., Hoffman, J., Greeley, M., Smith, C.J., 2005.99mTc-Hynic-bombesin (7–14)NH2: radiochemical evaluation with coligandsEDDA (EDDA = ethylenediamine-N,N′-diacetic acid), tricine and nicotinic acid.Synth. React. Inorg. Met.-Org. Nano-Met. Chem. 16, 438–442.

Ferro-Flores, G., de Ramírez, F.M., Meléndez-Alafort, L.G., Arteaga de Murphy, C.,Pedraza-López, M., 2004. Molecular recognition and stability of 99mTc-UBI 29-41 based on experimental and semiempirical results. Appl. Radiat. Isot. 61,1261–1268.

Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Melendez-Alafort, L., 2006a. Third generationradiopharmaceuticals for imaging and targeted therapy. Curr. Pharm. Anal. 2,339–352.

Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Rodriguez-Cortes, J., Pedraza-Lopez,M., Ramirez-Iglesias, M.T., 2006b. Preparation and evaluation of 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin for imaging of GRP receptor-positive tumours.Nucl. Med. Commun. 27, 371–376.

Francesconi, L.C., Zheng, Y., Bartis, J., Blumenstein, M., Costello, C., De Rosch, M.A.,2004. Preparation and characterization of [99TcO] apcitide: a technetium labeledpeptide. Inorg. Chem. 43, 2867–2875.

Garcia-Garayoa, E., Ruegg, D., Blauenstein, P., Zwimpfer, M., Khan, I.U., Maes, V., Blanc,A., Beck-Sickinger, A.G., Tourwe, D.A., Schubiger, P.A., 2007. Chemical and biolog-ical characterization of new Re(CO)3/[99mTc](CO)3 bombesin analogues. Nucl.Med. Biol. 34, 17–28.

Halmos, G., Wittliff, J.L., Schally, A.V., 1995. Characterization of bombesin/gastrinreleasing peptide receptors in human breast cancer and their relationship tosteroid receptor expression. Cancer Res. 55, 280–287.

Hu, M., Chen, P., Wang, J., Scollard, D.A., Vallis, K.A., Reilly, R.M., 2007. 123I-labeledHIV-1 tat peptide radioimmuno conjugates are imported into the nucleus ofhuman breast cancer cells and functionally interact in vitro and in vivo withthe cyclin-dependent kinase inhibitor, p21(WAF-1/Cip-1). Eur. J. Nucl. Med. Mol.Imaging 34, 368–377.

Jain, M., Venkatraman, G., Batra, S.K., 2007. Cell-penetrating peptides and antibod-ies: a new direction for optimizing radioimmunotherapy. Eur. J. Nucl. Med. Mol.Imaging 34, 973–977.

Koch, A.M., Reynolds, F., Kircher, M.F., Merkle, H.P., Weissleder, R., Josephson, L., 2003.Uptake and metabolism of a dual fluorochrome Tat-nanoparticle in HeLa cells.Bioconjugate Chem. 14, 115–1121.

Kunstler, J.U., Veerendra, B., Figueroa, S.D., Sieckman, G.L., Rold, T.L., Hoff-man, T.J., Smith, C.J., Pietzsch, H.J., 2007. Organometallic (99m)Tc(III) ‘4 + 1’Bombesin(7–14) conjugates: synthesis, radiolabeling, and in vitro/in vivo stud-ies. Bioconjugate Chem. 18, 1651–1716.

La Bella, R., Garcia-Garayoa, E., Langer, M., Blauenstein, P., Beck-Sickinger, A.G., Schu-biger, A., 2002. In vitro and in vivo evaluation of a 99mTc(1)-labeled bombesinanalogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positive tumors. Nucl.Med. Biol. 29, 553–560.

Lin, K.S., Liu, A., Baidoo, K.E., Hashemzadeh-Gargari, H., Chen, M.K., Brenneman, K.,Pili, R., Pomper, M., Carducci, M.A., Wagner, H.N., 2005. A new high affinitytechnetium-99m-bombesin analogue with low abdominal accumulation. Bio-conjugate Chem. 16, 43–50.

Liu, S., Edwards, D.S., 1999. 99mTc-labelled small peptides as diagnostic radiophar-maceuticals. Chem. Rev. 99, 2235–2251.

Lui, V.W., Thomas, S.M., Zhang, Q., Wentzel, A.L., Siegfried, J.M., Li, J.Y., Grandis, J.R.,2003. Mitogenic effects of gastrin-releasing peptide in head and neck squamouscancer cells are mediated by activation of the epidermal growth factor receptor.Oncogene 22, 6183–6193.

Melendez-Alafort, L., Ramirez, F., de, M., Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C.,Pedraza-Lopez, M., Hnatowich, D.J., 2003. Lys and Arg in UBI: a specific site for astable Tc-99m complex? Nucl. Med. Biol. 30, 605–615.

Nock, B.A., Nikolopoulou, A., Galanis, A., Cordopatis, P., Waser, B., Reubi, J.C., Maina,T., 2005. Potent bombesin-like peptides for GRP-receptor targeting of tumorswith 99mTc: a preclinical study. J. Med. Chem. 48, 100–110.

Reubi, J.C., 2003. Peptide receptors as molecular targets for cancer diagnosis andtherapy. Endocrine Rev. 24, 389–427.

Santos-Cuevas, C.L., Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Pichardo-Romero,P., 2008. Targeted imaging of GRP receptors with 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin: biokinetics and dosimetry in women. Nucl. Med. Commun. 29,741–747.

Shriver, S.P., Bourdeau, H.A., Gubish, C.T., Tirpak, D.L., Davis, A.L., Luketich, J.D.,Siegfried, J.M., 2000. Sex-specific expression of gastrin-releasing peptide recep-tor: relationship to smoking history and risk of lung cancer. J. Natl. Cancer Inst.92, 24–33.

Smith, C.J., Sieckman, G.L., Owen, N.K., Hayes, D.L., Mazuru, D.G., Volkert,W.A., Hoffman, T.J., 2003. Radiochemical investigations of [188Re(H2O)(CO)3-diaminopropionic acid-SSS-bombesin(7–14)NH2]: synthesis, radiolabeling andin vitro/in vivo GRP receptor targeting studies. Anticancer Res. 23, 63–70.

Thakur, M., Lentle, B.C., 2005. Report of a summit on molecular imaging. Radiology236, 753–755.

Varvarigou, A., Scopinaro, F., Leondiadis, L., Corleto, V., Schillaci, O., de Vincentis,G., 2002. Synthesis, chemical, radiochemical and radiobiological evaluation ofa new 99mTc-labeled bombesin-like peptide. Cancer Biother. Radiopharm. 17,317–326.

Youngblood, D.S., Hatlevig, S.A., Hassinger, J.N., Iversen, P.L., Moulton, H.M., 2007.Stability of cell-penetrating peptide-morpholino oligomer conjugates in humanserum and in cells. Bioconjugate Chem. 18, 50–60.

Zhang, X., Cai, W., Cao, F., Schreibmann, E., Wu, Y., Wu, J.C., Xing, L., Chen, X., 2006a.18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostatecancer. J. Nucl. Med. 47, 492–501.

Zhang, Y.-M., Tung, C.H., He, J., Liu, N., Yanachkov, I., Liu, G., Rusckowski, M.,Vanderheyden, J.L., 2006b. Construction of a novel chimera consisting of achelator-containing Tat peptide conjugated to a morpholino antisense oligomerfor technetium-99m labeling and accelerating cellular kinetics. Nucl. Med. Biol.33, 263–269.


82 C.L. Santos-Cuevas et al. / International Journal of Pharmaceutics 375 (2009) 75–83

Fig. 7. Uptake of (A) 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and (B) 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) in tumor PC3 cells in athymic mouse 2 h after radiophar-maceutical administration (mice with dissection of internal viscera to highlight tumor uptake).

99mTc-Tat-BN binds to plasmatic proteins approximately 20%more than 99mTc-BN. These data indicate that in spite of the factthat both radiopharmaceuticals contain BN and are labeled with99mTc, the positive charges of Tat due to arginines and lysines con-tained in its amino acid sequence, tend to interact faster and in astrong way with proteins, besides that it is not targeted to a spe-cific receptor (Costantini et al., 2008; Cornelissen et al., 2008). Thiscationic property is necessary to penetrate the cell membrane andlocalize the nucleus (Drin et al., 2003), but these characteristicscan have an effect in blood elimination rate by binding to plasmaticproteins as well as increasing interaction and internalization in cellsand healthy tissue (e.g. plasmatic cells, spleen and liver). Althoughcancer cell uptake was significantly higher for 99mTc-Tat-BN withrespect to 99mTc-BN, the higher activity in blood for the first onedid not produce a very high increase in the contrast of tumor imagein mice (Fig. 7).

The maximum uptake of both radiopharmaceuticals was pre-sented at the same times in all cancer cells, in PC3 at 4 h (99mTc-BN,17.62 ± 1.86%; 99mTc-Tat-BN, 28.1 ± 2.86%), in MCF7 at 2 h (99mTc-BN, 8.97 ± 0.92%; 99mTc-Tat-BN, 18.27 ± 2.14%) and in MDA-MB231at 5 min (99mTc-BN, 5.91 ± 0.26%; 99mTc-Tat-BN, 24.33 ± 2.82%) withdifferences only attributed to GRP-r cell expression. In this point itis important to mention that although MCF7 and MDA-MB231 areboth breast cancer cell lines, the first one is estrogen-dependentand the latter is estrogen-independent, and it has been suggestedthat the GRP-r expression is estrogen-dependent in the early stagesof breast carcinoma (Halmos et al., 1995). The elimination of theradiopharmaceuticals in the following times is due to the fact thatthe internalization process of the ligand/GRP-r complex involveslysosomes final trapping upon binding, where, in the case of thepeptides, are quickly degraded. Due to this immediate lysosomedegradation, no radioactivity accumulation in cells was expected(La Bella et al., 2002).

Receptor proteins in cells are considered targets in molecularnuclear medicine. In general cell internalization was receptor spe-cific with 99mTc-BN and in the 99mTc-Tat-BN case 9% of total activitywas non-specific as demonstrated uptake results in GRP-r blockedcell experiments because of Tat nuclear localizing sequence (NLS)(Costantini et al., 2008).

In this work the nucleus of the cytoplasm was not separatedto quantify nuclear internalization. Nevertheless it was considerednecessary to carry out this test with the purpose of estimating cel-lular dosimetry because of 99mTc-auger electron emission.

Biodistribution studies showed a slow blood clearance for 99mTc-Tat-BN, the contrary was observed in non-target organs, however,maximum uptake was observed in kidneys indicating principal

renal excretion. These results coincide with 99mTc-BN biodistri-bution studies where excretion is mainly renal and uptake innon-target organs was lower with faster blood clearance. Neverthe-less both radiopharmaceuticals showed good tumor localization forPC3 cells in athymic mice. However 99mTc-Tat-BN showed a slightlybetter tumor/muscle ratio of 8.5 compared to 7 for 99mTc-BN.

High 99mTc-Tat-BN uptake in kidneys and in non-target organsshows the need for an improved method for reducing radioactivitybackground which could be done by the co-administration of a coldlysine–arginine infusion as previously reported for other peptide-radiopharmaceuticals (Bodei et al., 2003).

5. Conclusions

99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN has been developed as a hybridradiopharmaceutical composed of a penetrating peptide with spe-cific targeting moiety (Tat conjugated to BN) producing a stablelabeled molecule able to overcome the lypophilic cell membranebarrier with higher internalization in GRP-receptor positive cancercells with respect to 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN. Therefore, thishybrid is potentially useful in breast and prostate cancer imaging.

Acknowledgements

This study was supported by the CONACyT-SALUD-69051-Mexico and the International Atomic Energy Agency (Contract No.14539/RO).

References

Alves, S., Correia, J.D., Santos, I., Veerendra, B., Sieckman, G.L., Hoffman, T.J., Rold,T.L., Figueroa, S.D., Retzloff, L., McCrate, J., Prasanphanich, A., Smith, C.J., 2006.Pyrazolyl conjugates of bombesin: a new tridentate ligand framework for thestabilization of fac-[M(CO)3]+ moiety. Nucl. Med. Biol. 33, 625–634.

Baidoo, K.E., Lin, K.S., Zhan, Y., Finley, P., Scheffel, U., Wagner, H.N., 1998. Design, syn-thesis, and initial evaluation of high-affinity technetium bombesin analogues.Bioconjugate Chem. 9, 218–225.

Bandoli, G., Dolmella, A., Porchia, M., Refosco, F., Tisato, F., 2001. Structural overviewof technetium compounds (1993–1999). Coord. Chem. Rev. 214, 43–90.

Bodei, L., Cremonesi, M., Zoboli, S., Grana, C., Bartolomei, M., Rocca, P., Caracciolo,M., Macke, H.R., Chinol, M., Paganelli, G., 2003. Receptor-mediated radionuclidetherapy with 90Y-DOTATOC in association with amino acid infusion: a phase 1study. Eur. J. Nucl. Med. 30, 207–216.

Bogdanov, A., Tung, C.-H., Bredow, S., Weissleder, R., 2001. DNA binding chelates fornonviral gene delivery imaging. Gene Ther. 8, 515–522.

Canney, D.J., Billings, J., Francesconi, L.C., Guo, Y.-Z., Haggerty, B.S., Rheingold, A.L.,Kung, H.F., 1993. Dicarboxylate diamide dimercaptide (N2S2) technetium-99mcomplexes: synthesis and biological evaluation as potential renal radiopharma-ceuticals. J. Med. Chem. 36, 1032–1040.



Fig. 6. Uptake of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) in the cytoplasm of (A) PC3, (B) MCF7 and (C) MDA-MB231cancer cell lines.

Table 4

Biodistribution in nude mice with induced PC-3 tumors 2 h after administration of99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) (n = 3) or 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) (n = 3).

Tissue % IA/g (mean ± SD)

99mTc-BN 99mTc-Tat-BN

Blood 0.40 ± 0.03 1.22 ± 0.16Heart 0.25 ± 0.02 0.43 ± 0.08Lung 0.50 ± 0.04 0.54 ± 0.07Liver 0.85 ± 0.04 2.14 ± 0.05Spleen 0.40 ± 0.05 0.42 ± 0.04Pancreas 3.29 ± 0.21 1.69 ± 0.12Kidney 23.5 ± 1.21 28.12 ± 2.18Intestine 0.85 ± 0.13 1.96 ± 0.23Muscle 0.25 ± 0.03 0.48 ± 0.05Tumor 1.75 ± 0.11 3.84 ± 0.25

4. Discussion

The minimum energies of the calculated hybrid peptide are ade-quate for its molecular structure since the large size, complexityand high charge of this peptide impose steric and electrostaticrepulsions against its stabilization at lower minimum energies.However, the comparison of its minimum energy (271 kcal/mol) tothose reported for other calculated structures of smaller chargedpeptides like UBI(29–41) (Melendez-Alafort et al., 2003), Tat-Scr(Ferro-Flores et al., 2004), 90 and 72–90 kcal/mol, respectively, sug-gested that the hybrid peptide has to be stable. In addition, theconformation acquired by the peptide molecule does not interferewith the recognition capability of BN. These facts supported theproposal that the preparation of the hybrid peptide has to be viableand the specificity maintained.

[TcO(N2S2)]−1-Tat(49–57)-Lys3-BN peptide structure acquiredin the chelating site a distorted square pyramidal geometrywith the oxo group at the apical position of the pyramid andTc about the center of the plane formed by the N2S2 donors(see expanded segment of the molecule, Fig. 2B). This geome-try has been found by X-ray diffraction for other five-coordinateTc(O) complexes neutral or charged compounds like negativelycharged five coordinate Tc(O)N2S2 complexes (Bandoli et al., 2001;Canney et al., 1993). The minimum energy of this complex doesnot differ significantly from that of the hybrid peptide beforecoordination to [Tc(O)]3+. This evidence together the geometricalarrangement acquired by the complexed hybrid peptide (Fig. 2B)demonstrate that the recognition capability of the peptide islittle affected by the formation of the Tc(O)N2S2 complex. How-ever, the stability of the [Tc(O)(N2S2)]−1 chelate itself could beaffected.

In general 99mTc-Tat-BN did not show the excellent radio-chemical characteristics as that previously reported for 99mTc-BN(Ferro-Flores et al., 2006b), since the first one showed slightlylower radiochemical purity (>95% for 99mTc-BN) and lower sta-bility in cysteine and human serum. These results were expectedsince HYNIC core with additional co-ligands has demonstratedto be highly stable for labeling peptides (Liu and Edwards,1999; Decristoforo et al., 2000). Nevertheless, the technetium-binding region consisting of Gly-Gly-Cys-NH2 or Cys-Gly-Cys-NH2

peptide (to form a –N2S2– or –N3S– ligand) has been suc-cessfully used to prepare stable complexes with the Tc = O3+

core producing minimum alteration of the molecule bioac-tivity in agreement with results obtained in this research(Bogdanov et al., 2001; Francesconi et al., 2004; Zhang et al.,2006b).



Table 299mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) cell uptake in different cancer cell lines (% of total activity ± SD).

Time (h) PC3 MCF7 MDA-MB231

99mTc-Tat-BN 99mTc-BN 99mTc-Tat-BN 99mTc-BN 99mTc-Tat-BN 99mTc-BN

0.083 22.01 ± 2.08 10.29 ± 1.47 19.27 ± 3.55 7.83 ± 0.71 24.33 ± 2.82 5.91 ± 0.261 21.43 ± 2.91 8.59 ± 0.59 17.43 ± 1.13 6.79 ± 0.45 19.43 ± 1.30 5.48 ± 0.212 24.88 ± 2.12 12.85 ± 0.90 18.27 ± 2.14 8.97 ± 0.92 15.98 ± 1.07 5.06 ± 0.574 28.10 ± 3.86 17.62 ± 1.86 13.15 ± 1.27 7.48 ± 0.30 14.40 ± 1.79 4.16 ± 0.396 25.43 ± 1.79 9.63 ± 0.47 12.65 ± 0.94 7.98 ± 0.22 13.60 ± 0.96 4.19 ± 0.52

24 23.91 ± 1.53 8.21 ± 0.64 12.30 ± 1.16 2.32 ± 0.49 14.24 ± 0.34 3.43 ± 0.27

Table 3

Biodistribution of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN in healthy Balb-C mice at different times after radiopharmaceutical administration (n = 3 in each time).

Tissue % IA/g (mean ± SD)

0.25 h 0.5 h 2 h 4 h 24 h

Blood 7.81 ± 2.62 6.02 ± 2.59 1.12 ± 0.17 1.00 ± 0.03 0.07 ± 0.02Heart 2.43 ± 0.78 1.62 ± 0.63 0.33 ± 0.07 0.32 ± 0.03 0.09 ± 0.10Lungs 2.68 ± 0.94 2.26 ± 0.44 0.60 ± 0.08 0.56 ± 0.04 0.09 ± 0.03Liver 4.91 ± 1.57 3.97 ± 1.70 2.03 ± 0.04 2.11 ± 0.32 0.52 ± 0.17Spleen 1.28 ± 0.40 0.80 ± 0.30 0.35 ± 0.05 0.55 ± 0.17 0.23 ± 0.07Pancreas 2.89 ± 1.01 2.65 ± 0.77 1.87 ± 0.11 1.43 ± 0.24 0.21 ± 0.04Kidneys 16.87 ± 4.85 22.99 ± 8.57 29.02 ± 2.78 27.72 ± 2.18 8.45 ± 0.81Intestine 3.70 ± 1.49 11.30 ± 7.71 2.06 ± 0.33 2.05 ± 0.98 0.17 ± 0.08Muscle 1.47 ± 0.26 1.28 ± 0.70 0.58 ± 0.23 0.43 ± 0.14 0.03 ± 0.02Bone 2.44 ± 0.79 1.74 ± 0.60 0.42 ± 0.05 0.78 ± 0.26 0.19 ± 0.17

Table 4 shows biodistribution in mice with induced PC-3 tumors.Tumor-to-blood, tumor-to-muscle and pancreas-to-blood ratios for99mTc-BN were 4.4, 7 and 8.2, respectively, and 3.2, 8 and 1.4for 99mTc-Tat-BN correspondingly. In vivo images showed a cleartumor uptake and a dissection process to eliminate internal vis-

cera, highlighted the 99mTc-BN and 99mTc-Tat-BN uptake in tumorPC-3 cells (Fig. 7). The tumor/muscle ratio obtained from imagecounts per pixel corresponding to 99mTc-BN was 7 and for 99mTc-Tat-BN was 8.5, demonstrating a minimal difference between thetwo.

Fig. 5. Time dependent internalization of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) in (A) PC3, (B) MCF7 and (C) MDA-MB231 cancer cell lines.



Table 1

Bond distances of the calculated Tc(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN complex using Augmented MM3 and CONFLEX semiempirical procedures.

Compound Geometry Bond distances (Å) Bond distance ratio

[99mTc-(N2S2DADS]−1 Square pyramida Tc-N1: 2.002 RN = 1.009Tc-N2: 1.984 RS = 1.006Tc-S1: 2.300 TcN2/TcO = 1.190Tc-S2: 2.286 TcS1/TcO = 1.38Tc = O: 1.667

[(99mTc(O)-(N2S2))−1-Tat-Lys3-BN Distorted square pyramid Tc-N1: 2.314 RN = 1.003Tc-N2: 2.308 RS = 1.003Tc-S1: 2.618 TcN2/TcO = 1.04Tc-S2: 2.611 TcS1/TcO = 1.19Tc = O: 2.210

a By X-ray diffraction (Canney et al., 1993).

TAT(49–57)-Lys3-BN peptide complex was calculated (Fig. 2B) usingthe most stable conformer of the hybrid peptide molecule. The min-imum energy of the optimized structure was 300 kcal/mol and thatof the most stable conformer equal to 262 kcal/mol. In Table 1 aregiven some geometrical parameters of this complex.

3.2. Evaluation of 99mTc-Tat-BN radiochemical purity and stability

The results obtained by ITLC, Sep-Pak and HPLC analyses showeda mean radiochemical purity for 99mTc-Tat-BN of 92 ± 2% (n > 30)and remains stable after 24 h without post-labeling purification(Fig. 3). The average specific activity was 14 MBq/nmol. After 1 hin human serum the radiochemical purity remained >90% anddecreased to 82% and 65% after 3 and 24 h, respectively. Proteinbinding was 36.4 ± 2.7 at 2 h without 99mTc transchelation to cys-teine (Fig. 4). After incubation with 5:1, 50:1 and 500:1 molar ratiosof cysteine to peptide, ITLC analysis revealed that the radioactivitydissociated from 99mTc-Tat-BN was 7%, 16% and 41%, respectively,indicating adequate radiopharmaceutical stability towards cysteinepresent in blood.

3.3. In vitro uptake

The in vitro results showed an important uptake in the threecancer cell lines PC3, MCF7 and MDA-MB231 which is inhibitedsignificantly by pre-incubation with cold bombesin (Table 2). Ingeneral cell binding in blocked cells was less than 3% of total activityfor 99mTc-BN and less than 9% for 99mTc-Tat-BN in all cell lines andduring all times. This confirmed in vitro specificity of both radio-pharmaceuticals for GRP receptors found in cell membranes of the

Fig. 3. Reverse phase HPLC radiochromatograms of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BNafter labeling, and 24 h after preparation (kept at room temperature).

three cell lines due to the fact that both compounds contain BN.However, the hybrid 99mTc-Tat-BN shows a higher uptake (p < 0.05)due to Tat’s capacity to internalize the molecule into the cytoplasmand even into the nucleus (Costantini et al., 2008).

Internalization increase of 99mTc-Tat-BN compared with that of99mTc-BN in the cell lines is shown in Fig. 5, demonstrating thatthe hybrid peptide has the ability to penetrate the cell membrane.Maximum internalization is reached in PC3 and MCF7 cells between2 and 4 h after incubation. However MDA-MB231 cells showed adistinct pattern where cellular internalization reaches a maximumduring the first few minutes decreasing with time.

The percentage activity in cytoplasm of the total internal activity(Fig. 6) shows a great difference between both radiopharmaceu-ticals. Most of 99mTc-BN remains in the cell membrane while99mTc-Tat-BN is released in the cytoplasm, where it can be internal-ized into the nucleus because of its amino acid nuclear localizationsequence (NLS) (Costantini et al., 2008).

3.4. Biodistribution and imaging

99mTc-Tat-BN biodistribution is shown in Table 3. Renal excre-tion is predominantly observed but hepatobiliary clearance is alsopresent. GRP-r receptors are naturally expressed in lungs show-ing radiopharmaceutical uptake (Shriver et al., 2000). However,pancreas shows higher uptake than non-excretory organs such asspleen, muscle and even lungs because of its GRP-r expression,indicating that BN acts as the targeting vector.

Fig. 4. Size-exclusion HPLC. Solid line represents the UV-chromatogram (280 nm)of human serum proteins and dotted line the radiochromatogram of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN 2 h after incubation in human serum at 37 ◦C.



obtain the percentage of injected activity per gram of tissue% IA/g.

2.9.1. Tumor induction in athymic mice

Athymic male mice (20–22 g) were kept in sterile cages withsterile wood-shavings bed, constant temperature, humidity, noiseand 12:12 light periods. Water and feed (standard PMI 5001 feed)were given ad libitum.

Prostate tumors were induced by subcutaneous injection of PC-3cells (1 × 106) resuspended in 0.2 mL of phosphate-buffered saline,into the upper back of four 6–7-week-old nude mice. Injection siteswere observed at regular intervals for tumor formation and pro-gression.

2.9.2. Imaging

The nude mice with the implanted tumors were sacrificed andscanned with a gamma camera with a pinhole collimator 2 h after99mTc-Tat-BN or 99mTc-BN administration in the tail vein (3 MBq in0.04 mL). Finally, complete dissection was carried out to determinepercentage of injected activity per gram of tissue % IA/g as describedabove.

3. Results

3.1. Design of (Acm)2S2N2-Tat-Lys3-bombesin and

Tc(O)S2N2-Tat-Lys3-bombesin by semiempirical calculations

A good molecular modeling yields structures which are similarto those obtained experimentally. However, this similarity couldbe affected by the size, charge and mobility of the molecule, e.g. inthe case of big and charged peptides. Without forgetting this fact,the hybrid N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN peptide (Fig. 2A) was designedusing semiempirical calculations to investigate the feasibility of itsformation. The minimum energies of its most stable structure andconformer were 271 and 233 kcal/mol, respectively.

The technetium-oxo complex formed with this hybrid peptidewas also modeled considering two well-known facts of this typeof chelating site: (1) the two terminal thiols S2(Acm)2 are able tobe ionized by removing the acetamidomethyl protecting groups(Canney et al., 1993; Bandoli et al., 2001), (2) the amide groups eas-ily undergo deprotonation (Bandoli et al., 2001). Then it is expectedthat the chelating site yields a [N2S2]4− coordination around the[Tc(O)]3+ core forming this way a negative charged five-coordinatecomplex. Based on the latter, the molecule of the [TcO(N2S2)]−1-

Fig. 2. (A) The most stable conformer of the modeled N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN hybrid peptide molecule using CONFLEX. (B) The most stable conformer of the modeledTc(O)N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN hybrid peptide molecule using CONFLEX. The expanded geometry of the Tc(O) chelate: [Tc(O)N2S2]−1 is given for clarity.



Fig. 1. General scheme of the N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN hybrid peptide.

2.6. Cysteine challenge

99mTc-Tat-BN was tested for instability towards cysteine. A freshcysteine solution was prepared (10 mg/mL in 0.1 M PBS, pH 7.0) anddiluted to different concentrations. Then 10 �L of each cysteinesolution was mixed with 90 �L of 20 �M of the labeled peptidesolutions. The molar ratios of cysteine to peptide were 5:1, 50:1and 500:1. Each test tube was incubated at 37 ◦C and radiochemicalpurity analyzed 1 h later by ITLC.

2.7. Preparation of 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN)

As previously reported, a lyophilized formulation containingHYNIC-Lys3-BN, EDDA, tricine, and stannous chloride was prepared(Ferro-Flores et al., 2006b). The radiolabeling procedure was car-ried out by adding 1 mL of 0.2 M phosphate buffer pH 7.0 to thefreeze-dried kit formulation and immediately 740–1110 MBq (1 mL)of 99mTc-pertechnetate followed by incubation in boiling water for15 min. Radiochemical purity was also evaluated by reverse phaseHPLC and ITLC.

2.8. In vitro kinetic studies

2.8.1. Cell lines

Human prostate cancer cell PC-3 line and human breast carci-noma cell lines MDA-MB231 and MCF7 were originally obtainedfrom ATCC (USA). The cells were routinely grown at 37 ◦C, with5% CO2 atmosphere and 100% humidity in RPMI medium supple-mented with 10% newborn calf serum and antibiotics (100 �g/mLstreptomycin).

2.8.2. Internalization assay and non-specific binding

PC-3 or MDA-MB231 or MCF7 cells supplied in fresh mediumwere diluted to 1 × 106 cells/tube and incubated with about200,000 cpm of 99mTc-BN (0.3 nmol total peptide) or 99mTc-Tat-BN(0.3 nmol total bombesin) in triplicate at 37 ◦C for 0.083, 2, 4, 6 and

24 h. The test tubes were centrifuged (3 min, 500 g), washed twicewith phosphate buffer saline (PBS), and the activity of the cell pelletdetermined in a crystal scintillation well type detector. Radioactiv-ity in the cell pellet represents both externalized peptide (surfacebound) and internalized peptide. An aliquot with the initial activitywas taken to represent 100%, and the cell uptake activity was thencalculated.

The externalized peptide activity was removed with 1 mL of0.2 M acetic acid/0.5 M NaCl solution added to the resuspendedcell pellet. The test tubes were centrifuged, washed with PBS, re-centrifuged, and pellet activity was considered as internalization.The cell pellet was re-suspended with 1 M NaOH to break up themembranes, centrifuged and washed with PBS. The supernatantactivity represents cytoplasm uptake. Non-specific binding wasdetermined in parallel but in presence of 10 �M Lys3-BN (Bachem-USA) (blocked receptor cells).

2.8.3. Statistical analysis

Differences between the in vitro cell data for BN-radiopharmaceuticals were evaluated with the Student t-test.

2.9. Biodistribution studies

Biodistribution and tumor uptake studies in mice were carriedout according to the rules and regulations of the Official MexicanNorm 062-ZOO-1999.

Healthy 6-week-old Balb-C mice were used for biodistribu-tion studies. 99mTc-Tat-BN, 1.11 MBq (30 �Ci) in 0.04 mL wasinjected in a tail vein. The mice (n = 3) were sacrificed at0.25, 05, 2, 4 and 24 h post-injection. Whole heart, lung,liver, spleen, pancreas, kidneys, intestines, muscle, bone andblood samples were saline rinsed, paper blotted and placedinto pre-weighed plastic test tubes. The activity was deter-mined in a well-type scintillation detector (Canberra) alongwith six 0.5 mL aliquots of the diluted standard representing100% of the injected activity. Mean activities were used to



ceutical with high stability in human serum, specific cell receptorbinding and rapid internalization. Biodistribution data in miceshowed rapid blood clearance, with predominant renal excretionand specific binding towards GRP receptor-positive tissues such aspancreas and PC-3 tumors (Ferro-Flores et al., 2006b). Images ofGRP-r expression in breast cancer patients demonstrated distinctradioactivity accumulation in malignant tissue (Santos-Cuevas etal., 2008).

Targeted entry into cells is an increasingly important researcharea. Disease diagnoses and treatment by novel methods wouldbe greatly enhanced by efficiently transporting materials to livingcell nuclei. Penetrating peptides are emerging as attractive drugdelivery tools. The HIV Tat-derived peptide is a small basic pep-tide called “trojan horse” for successfully delivering a large varietyof cargoes into cells such as nanoparticles, proteins, peptides andnucleic acids. The “transduction domain” or region conveying cellpenetrating properties appears to be confined to a small stretchof basic amino acids with the sequence RKKRRQRRR and knownas Tat(49–57) (Koch et al., 2003; Dietz and Bähr, 2004; Deshayeset al., 2005; Zhang et al., 2006b; Hu et al., 2007; Jain et al., 2007;Youngblood et al., 2007; Chen and Harrison, 2007; Cornelissen etal., 2008).

Therefore, a new hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-bombesin (99mTc-Tat-BN) would signifi-cantly increase cancer cell uptake and consequently image contrastof cancer tumors and their metastases, improving sensitivity andspecificity of diagnostic studies in breast cancer.

The aim of this research was to prepare and assess in vitro

and in vivo uptake kinetics in GRP receptor-positive cancer cells of99mTc-Tat-BN and to compare its cellular internalization with thatof 99mTc-BN.

2. Experimental

2.1. Design and preparation of hybrid N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN

peptide

Tat(49–57) peptide (H-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2) was conjugated to Gly-Gly-Cys-Gly-Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm)-NH2 to produce the Tat(49–57)-spacer-N2S2 peptide(H-Arg1-Lys2-Lys3-Arg4-Arg5-Gln6-Arg7-Arg8-Arg9-Gly10-Gly11-Cys12-Gly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2). The sequenceGly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2 was added for use as thespecific N2S2 chelating site for 99mTc (Fig. 1).

Lys3-bombesin (Pyr-Gln-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Vla-Gly-His-Leu-Met-NH2) was conjugated to maleimidopropyl (MPA)through Lys3 and the MPA group used as the branch position form-ing a thioether with the Cys12 side chain of Tat(49–57)-spacer-N2S2

peptide (Fig. 1). Synthesis, HPLC analysis, Mass Spectral Analysis(MALDI), Amino Acid Analysis (AAA) and peptide content deter-mination were carried out in the Bachem Laboratories obtaininga certified white powder product with chemical purity >90% andmolecular weight of 3779.5 g/mol (Bachem, CA, USA).

2.2. Molecular modeling

The N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN peptide molecule was built takinginto account valence, bond type, charge and hybridization. The min-imum energies (Molecular Mechanics calculations by AugmentedMM3 procedure) and the lowest energy conformer (CONFLEX pro-cedure) associated to the optimized geometry of its structure werecalculated using the CAChe Pro 5.02 and/or 5.04 program pack-age for windows® (Fujitsu Ltd., 2000–2001). Sequential applicationof Augmented MM3/CONFLEX procedures yielded the most stableconformers for the N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN and for Tc(O)N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN structures.

2.3. Technetium-99 labeling of N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN

99mTc-pertechnetate was obtained from a GETEC 99Mo/99mTcgenerator (ININ-Mexico). All the other reagents were purchasedfrom Sigma–Aldrich Chemical Co., and used as received.

Acetamidomethyl (Acm) groups deprotection and N2S2-Tat(49–57)-Lys3-bombesin labeling were accomplished in one stepby pertechnetate reduction with stannous chloride in ammoniumacetate and sodium tartrate presence at room temperature. Alka-linity (pH 9.5) was necessary to de-acetylate Cys14(Acm) andCys16(Acm) side chains of TAT(49–57)-spacer-N2S2 peptide that areessential for oxotechnetate binding (Bogdanov et al., 2001; Zhanget al., 2006a,b).

One milligram of N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN was dissolved in200 �L of injectable water (Pisa®, Mexico). Ten microliters ofthis solution were added to 25 �L of sodium 99mTc-pertechnetate(185 MBq) followed by 7 �L of deprotection mixture (50 mg/mLsodium tartrate in 0.1 M NH4OH/NH4CH3COOH, pH 9.5) and3 �L of reducing solution (0.5 mg SnCl2/mL in 0.05 M HCl).The final mixture was incubated for 20 min at room tempera-ture.

2.4. Evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN

(99mTc-Tat-BN) radiochemical purity

Radiochemical purity analyses were performed by instant thin-layer chromatography on silica gel (ITLC-SG, Gelman Sciences),solid phase extraction (Sep-Pak C-18 cartridges) and reverse phasehigh-performance liquid chromatography (HPLC).

ITLC-SG analysis was accomplished using 2 different mobilephases: 2-butanone to determine the amount of free 99mTcO4

−

(Rf = 1) and 0.1 M sodium citrate pH 5 to determine 99mTc-tartrateand 99mTcO4

− (Rf = 1). Rf value of the radiolabeled peptide in eachsystem was 0.0.

The Sep-Pak cartridges were preconditioned with 5 mL ofethanol followed by 5 mL of 1 mM HCl and 5 mL of air. An aliquot of0.1 mL of the labeled peptide was loaded on the preconditioned Sep-Pak cartridge followed by 5 mL of 1 mM HCl to elute free 99mTcO4

−

and 99mTc-tartrate. The radiolabeled peptide was eluted with 3 mLof ethanol:saline (1:1) mixture and the hydrolyzed-reduced 99mTcor 99mTc-colloid remained in the cartridge.

HPLC analyses were carried out with a Waters instrumentrunning Millennium software with both radioactivity and UV-photodiode array in-line detectors and YMC ODS-AQ S5 column(5 �m, 4.6 mm × 250 mm). The gradient was run at a flow rateof 1 mL/min with the following conditions: 0.1% trifluoroaceticacid (TFA)/water (solvent A) and 0.1% TFA/acetonitrile (solventB). The gradient started with 100% solvent A for 3 min, changedto 50% solvent A over 10 min, was maintained for 10 min,changed to 30% solvent A over 3 min and finally returned to100% solvent A over 4 min. In this system retention times forfree 99mTcO4

−, and 99mTc-Tat-BN were 3–4 min and 10–10.5 min,respectively.

2.5. Serum stability

Size exclusion HPLC analysis and a ITLC-SG were used to esti-mate serum stability of 99mTc-Tat-BN. A 50 �L volume of labeledpeptide solution (0.5 �g/50 �L) was incubated at 37 ◦C with 1 mLof fresh human serum. Radiochemical stability was determinedfrom samples of 10 �l taken at different times from 20 min to24 h for analysis. A shift of the HPLC radioactivity profile to highermolecular weight indicates protein binding, while lower-molecularweight peaks indicate labeled catabolites or serum cysteinebinding.


International Journal of Pharmaceutics 375 (2009) 75–83

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International Journal of Pharmaceutics

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Design, preparation, in vitro and in vivo evaluation of99mTc-N2S2-Tat(49–57)-bombesin: A target-specific hybrid radiopharmaceutical

Clara L. Santos-Cuevas a,b, Guillermina Ferro-Flores a,∗, Consuelo Arteaga de Murphy c,Flor de M. Ramírez a, Myrna A. Luna-Gutiérrez a,b, Martha Pedraza-López c,Rocío García-Becerra c, David Ordaz-Rosado c

a Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Mexicob Universidad Autónoma del Estado de México, Mexicoc Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, Mexico

a r t i c l e i n f o

Article history:

Received 24 December 2008Received in revised form 11 April 2009Accepted 14 April 2009Available online 22 April 2009

Keywords:

Radiolabeled bombesinHybrid radiopharmaceuticalPeptide-receptor imagingTat-bombesin

a b s t r a c t

The gastrin-releasing peptide receptor (GRP-r) is over-expressed in various human tumors. Recently,99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-bombesin (99mTc-BN) was reported as a radiopharmaceutical with specific cellGRP-r binding and images in breast cancer patients demonstrated distinct radioactivity accumulation inmalignant tissue. The HIV Tat-derived peptide has been used to deliver a large variety of cargoes into cells.Therefore, a new hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-bombesin (99mTc-Tat-BN) would increase cell uptake. The aim of this research was to prepare and assess in vitro and in vivo

uptake kinetics in cancer cells of 99mTc-Tat-BN and to compare its cellular internalization with that of99mTc-BN. Structures of N2S2-Tat-BN and Tc(O)N2S2-Tat-BN were calculated by an MM procedure. 99mTc-Tat-BN was synthesized and stability studies carried out by HPLC and ITLC-SG analyses in serum andcysteine solutions. In vitro internalization was tested using human prostate cancer PC-3 cells and breastcarcinoma cell lines MDA-MB231 and MCF7. Biodistribution was determined in PC-3 tumor-bearing nudemice. Results showed a minimum energy of 271 kcal/mol for N2S2-Tat-BN and 300 kcal/mol for Tc(O)N2S2-Tat-BN. 99mTc-Tat-BN radiochemical purity was >90%. In vitro studies demonstrated stability in serum andcysteine solutions, specific cell receptor binding and internalization in three cell lines was significantlyhigher than that of 99mTc-BN (p < 0.05). The tumor-to-muscle radioactivity ratio was 8.5 for 99mTc-Tat-BNand 7 for 99mTc-BN. Therefore, this hybrid is potentially useful in breast and prostate cancer imaging.

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1. Introduction

Molecular imaging is defined as the visualization, characteri-zation and measurement of biological processes at the molecularand cellular levels in humans and other living systems (Thakurand Lentle, 2005). Cancer imaging techniques using radiotrac-ers targeted to specific receptors have yielded successful resultsdemonstrating the utility of such approaches for developing specificradiopharmaceuticals.

Regulatory peptide receptors are over-expressed in numeroushuman cancer cells. These receptors have been used as molecu-lar targets for radiolabeled peptides to localize cancer tumors. Theuseful clinical results achieved during the last decade with somato-statin receptor-expressing neuroendocrine tumor imaging, have

∗ Corresponding author at: Departamento de Materiales Radiactivos, InstitutoNacional de Investigaciones Nucleares, Carretera México-Toluca S/N, La Marquesa,Ocoyoacac, Estado de México, C.P. 52750, Mexico. Tel.: +52 55 53297200x3863;fax: +52 55 53297306.

E-mail addresses: ferro [email protected], [email protected](G. Ferro-Flores).

been extended to the study of other radiopeptides to target alterna-tive cancer-associated peptide receptors such as gastrin-releasingpeptide, cholecystokinin, peptide ligands for integrin receptors orneurotensin. The improvement of radiopeptide analogues allowsspecific clinical imaging of different tumor types, including breast,prostate, intestine, pancreas and brain tumors (Ferro-Flores et al.,2006a; de Visser and Verwijnen, 2008).

The bombesin (BN) peptide was isolated from frog skin andbelongs to a large group of neuropeptides with many biologicalfunctions. The human equivalent is the gastrin-releasing peptide(GRP, 27 amino acids) and its receptors (GRP-r) are over-expressedin the tumor cell membrane in an early stage of carcinogenesis (Luiet al., 2003). GRP and BN differ by only 1 of 10 carboxy-terminalresidues and this explains the similar biological activity of the twopeptides (Reubi, 2003). The strong-specific BN–GRP-r binding is thebasis for labeling BN with radionuclides (Baidoo et al., 1998; La Bellaet al., 2002; Varvarigou et al., 2002; Smith et al., 2003; Faintuch etal., 2005; Nock et al., 2005; Lin et al., 2005; Alves et al., 2006; Zhanget al., 2006a; Garcia-Garayoa et al., 2007; Kunstler et al., 2007).

99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) obtained fromlyophilized kit formulations has been reported as a radiopharma-

0378-5173/$ – see front matter © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.doi:10.1016/j.ijpharm.2009.04.018

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Peptides for In Vivo Target-Specific Cancer Imaging Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, No. 1 97

insights into nanoparticle uptake, intracellular transport, and vesicle

shedding. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 14759-66. [107] Wadia, J.S.; Dowdy, S.F. Transmembrane delivery of protein and

peptide drugs by TAT-mediated transduction in the treatment of cancer. Adv. Drug Deliv. Rev., 2005, 57, 579-96.

[108] Gonczy, P.; Pichler, S.; Kirkham, M.; Hyman, A.A. Cytoplasmic dynein is required for distinct aspects of Mtoc positioning,

including centrosome separation, in the one cell stage caenorhabditis elegans embryo. J. Cell Biol., 1999, 147, 135-50.

[109] Liu, Z.; Cai, W.; He, L,; Nakayama, N.; Chen, K.; Sun, X.; Chen, X.; Dai, H. In vivo biodistribution and highly efficient tumour

targeting of carbon nanotubes in mice. Nat. Nanotechnol., 2007, 2,47-52.

[110] De La Zerda, A.; Zavaleta, C.; Keren, S.; Vaithilingam, S.; Bodapati, S.; Liu, Z.; Levi, J.; Smith, B.R.; Ma, T.; Oralkan, O.;

Cheng, Z.; Chen, X.; Dai, H.; Khuri-Yakub, B.T.; Gambhir, S.S. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in

living mice. Nat. Nanotechnol., 2008, 3, 557-62. [111] Connor, E.E.; Mwamuka, J.; Gole, A.; Murphy, C.J.; Wyatt, M.

Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small, 2005, 1, 325-7.

[112] Brust, M.; Fink, J.; Bethell, D.; Schiffrin, D.J.; Kiely, C. Synthesis and reactions of functionalised gold nanoparticles. J. Chem. Soc.

Chem. Commun., 1995, 16, 1655-56. [113] Pissuwan, D.; Valenzuela, S.M.; Cortie, M.B. Therapeutic

possibilities of plasmonically heated gold nanoparticles. Trends Biothecnol., 2006, 24, 62-67.

[114] Chompoosor, A.; Han, G.; Rotello, V.R. Charge dependence of ligand release and monolayer stability of gold nanoparticles by

biogenic thiols. Bioconjug. Chem., 2007, 19, 1342-5. [115] Surujpaul, P.P.; Gutierrez-Wing, C.; Ocampo-Garcia, B.; Ramirez,

F. de M.; Arteaga de Murphy, C.; Pedraza-Lopez, M.; Camacho-Lopez, M.A.; Ferro-Flores, G. Gold nanoparticles conjugated to

[Tyr3]octreotide peptide. Biophys. Chem., 2008, 138, 83-90. [116] De la Fuente, J.M.; Berry, C.C. Tat Peptide as an efficient molecule

to translocate gold nanoparticles into the cell nucleus. Bioconjug. Chem., 2005, 16, 1176-80.

[117] De la Fuente, J.M.; Berry, C.C.; Riehle, M.O.; Curtis, S.G. NPs targeting at cells. Langmuir, 2006, 22, 3286-93.

[118] Montet, X.; Montet-Abou, K.; Reynolds, F.; Weissleder, R.; Josephson, L. Nanoparticle imaging of integrins on tumor cells.

Neoplasia, 2006, 8, 214-22. [119] Sun, S.H.; Zeng, H.; Robinson, D.B.; Raoux, S.; Rice, P.M.; Wang,

S.X.; Li, G.X. Monodisperse MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) Nanoparticles. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 273-9.

[120] Lee, J.H.; Huh, Y.M.; Jun, Y.W.; Seo, J.W.; Jang, J.T.; Song, H.T.; Kim, S.; Cho, E.J.; Yoon, H.G.; Suh, J.S.; Cheon, J. Artificially

engineered magnetic nanoparticles for ultra-sensitive molecular imaging. Nat. Med., 2007, 13, 95-99.

[121] Xu, C.J.; Sun, S.H. Monodisperse magnetic nanoparticles for biomedical applications. Polym. Int., 2007,56, 821-26.

[122] Baldi, G.; Bonacchi, D.; Franchini, M.C.; Gentili, D.; Lorenzi, G.; Ricci, A.; Ravagli, C. Synthesis and coating of cobalt ferrite

nanoparticles: a first step toward the obtainment of new magnetic nanocarriers. Langmuir, 2007, 23, 4026-8.

[123] Peng, S.; Wang, C.; Xie, J.; Sun, S. Synthesis and stabilization of monodisperse Fe nanoparticles. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128,

10676-77.

[124] Qiang, Y.; Antony, J.; Sharma, A.; Nutting, J.; Sikes, D.; Meyer, D.

Iron/iron oxide core-shell nanoclusters for biomedical applications. J. Nanopart. Res., 2006, 8, 489-96.

[125] Sun, S.H. Recent advances in chemical synthesis, self-assembly, and applications of FePt nanoparticles. Adv. Mater., 2006, 18, 393-

403. [126] Kogan, M.J.; Olmedo, I.; Hosta, L.; Guerrero, A.R.; Cruz, L.J.;

Albericio, F. Peptides and metallic nanoparticles for biomedical applications. Nanomedicine, 2007, 2, 287-306.

[127] Berry, C.C.; Curtis, S.G. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. J. Phys. D Appl.

Phys., 2003, 36, R198-206. [128] Montet, X.; Weissleder, R.; Josephson, L. Imaging pancreatic

cancer with a peptide-nanoparticle conjugate targeted to normal pancreas. Bioconjug. Chem., 2006, 17, 905-11.

[129] Zhao, M.; Kircher, M.F.; Josephson, L.; Weissleder, R. Differential Conjugation of Tat Peptide to Superparamagnetic Nanoparticles

and Its Effect on Cellular Uptake. Bioconjug. Chem., 2002, 13, 840-4.

[130] Garden, O.A.; Reynolds, P.R.; Yates, J. A rapid method for labelling CD4+ T cells with ultra small paramagnetic iron oxide

NPs for magnetic resonance imaging that preserves proliferative, regulatory and migratory behaviour in vitro. J. Inmunol. Methods,

2006, 314, 123-33. [131] Josephson, L.; Tung, C.H.; Moore, A.; Weissleder, R. High-

efficiency intracellular magnetic labelling with novel superpara-magnetic–Tat peptide conjugates. Bioconjug. Chem., 1999, 10, 186-

91. [132] Dodd, C.H., Hsu, H.C.; Chu, W.J. Normal T cell response and in

vivo magnetic resonance imaging of T cells loaded with HIV transactivator-peptide-derived superparamagnetic NPs. J. Immunol.

Methods, 2001, 256, 89-105. [133] Lee, S.J.; Jeong, J.R.; Shin, S.C.; Huh Y.M.; Song, H.T.; Suh, J.S.;

Chang, Y.H.; Jeon, B.S.; Kim, J.D. Intracellular translocation of superparamagnetic iron oxide NPs encapsulated with peptide

conjugated poly(D,L lactide-co-glycolide). J. Appl. Phys., 2005, 97,10Q913 (Online Publication).

[134] O´Connor, M.K.; Kemp, B.J. Single-photon emission computed tomography/ computed tomography: basic instrumentation and

innovations. Semin. Nucl. Med., 2006, 36, 258-66. [135] Delbeke, D.; Coleman, R.E.; Guiberteau, M.J.; Brown, M.L.;

Royal, H.D.; Siegel, B.A. Procedure guideline for SPECT/CT Imaging. J. Nucl. Med., 2006, 47, 1227-34.

[136] Cai, W.; Chen, K.; Li, Z.B.; Gambhir, S.S.; Chen, X. Dual-Function Probe for PET and Near-Infrared Fluorescence Imaging of Tumor

Vasculature. J. Nucl. Med., 2007, 48, 1862-70. [137] McCann, C.M.; Waterman, P.; Figueiredo, J.L.; Aikawa, E.;

Weissleder, R.; Chen, J.W. Combined magnetic resonance and fluorescence imaging of the living mouse brain reveals glioma

response to chemotherapy. Neuroimage, 2009, 45, 360-9. [138] Devaraj, N.K.; Keliher, E.J.; Thurber, G.M.; Nahrendorf, M.;

Weissleder, R. F Labeled nanoparticles for in vivo PET-CT imaging. Bioconjug. Chem., 2009, 20, 397-401.

[139] Bhushan, K.R.; Misra, P.; Liu, F.; Mathur, S.; Lenkinski, R.E.; Frangioni, J.V. Detection of breast cancer microcalcifications using

a dual-modality SPECT/NIR fluorescent probe. J. Am. Chem. Soc.,2008, 130, 17648-49.

Received: August 25, 2009 Revised: November 16, 2009 Accepted: November 16, 2009

96 Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, No. 1 Ferro-Flores et al.

[62] Ntziachristos, V.; Weissleder, R. Charge-coupled-device based

scanner for tomography of fluorescent near-infrared probes in turbid media. Med. Phys., 2002, 29, 803-9.

[63] Gao, M.; Lewis, G.; Turner, G.M.; Soubret, A.; Ntziachristos, V. Effects of background fluorescence in fluorescence molecular

tomography. Appl. Opt., 2005, 44, 5468-74. [64] Gremlich, H.U.; Martinez, V.; Kneuer, R.; Kinzy, W.; Weber, E.;

Pfannkuche, H.J. Non-invasive assessment of gastric emptying by near-infrared fluorescence reflectance imaging in mice: pharma-

cological validation with tegaserod, cisapride, and clonidine. Mol. Imaging, 2004, 3, 303-11.

[65] Tung, C.H.; Quinti, L.; Jaffer, F.A.; Weissleder, R. A branched fluorescent peptide probe for imaging of activated platelets. Mol.

Pharm., 2005, 2, 92-5. [66] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Graves, E.E.; Ripoll, J.; Weissleder,

R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol. Imaging, 2002, 1, 82-88.

[67] Cai, W.; Chen, X. Preparation of peptide-conjugated quantum dots for tumor vasculature-targeted imaging. Nat. Prot., 2008, 3, 89-96.

[68] Lyons, A.B.; Parish, C.R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods, 1994, 171, 131-7.

[69] Lin, Y.; Weissleder, R.; Tung, C.H. Synthesis and properties of sulfhydryl-reactive near-infrared cyanine fluorochromes for

fluorescence imaging. Mol. Imaging, 2003, 2, 87-92. [70] Licha, K.; Riefke, B.; Ntziachristos, V.; Becker, A.; Chance, B.;

Semmler, W. Hydrophilic cyanine dyes as contrast agents for near-infrared tumor imaging: synthesis, photophysical properties and

spectroscopic in vivo characterization. Photochem. Photobiol.,2000, 72, 392-98.

[71] Pham, W.; Lai, W.F.; Weissleder, R.; Tung, C.H. High efficiency synthesis of a bioconjugatable near-infrared fluorochrome.

Bioconjug. Chem., 2003, 14, 1048-51. [72] Frangioni, J.V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr.

Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 626-34. [73] Kim, S.; Lim, Y.T.; Soltesz, E.G.; Lee, J.; Nakayama, A. Near-

infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping. Nat. Biotechnol., 2004, 22, 93-97.

[74] Kojima, H. Development of near-infrared fluorescent probes for in vivo imaging. Yakugaku Zasshi, 2008, 128, 1653-63.

[75] Chen, X.; Conti, P.S.; Moats, R.A. In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin v 3 in brain tumor xenografts.

Cancer Res., 2004, 64, 8009-14. [76] Cheng, Z.; Wu, Y.; Xiong, Z.; Gambhir, S.S.; Chen, X. Near-

infrared fluorescent RGD peptides for optical imaging of integrin v 3 expression in living mice. Bioconjug. Chem., 2005, 16, 1433-

41. [77] Hsu, A.R.; Hou, L.C.; Veeravagu, A.; Greve, J.M.; Vogel, H.; Tse,

V.; Chen, X. In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin v 3 in an orthotopic glioblastoma model. Mol. Imaging Biol.,

2006, 8, 315. [78] Wang, W.; Ke, S.; Wu, Q.; Charnsangavej, C.; Gurfinkel, M.;

Gelovani, J.G.; Abbruzzese, J.L.; Sevick-Muraca, E.M.; Li, C. Near-infrared optical imaging of integrin alphavbeta3 in human

tumor xenografts. Mol. Imaging, 2004, 3, 343-51. [79] Gurfinkel, M.; Ke, S.; Wang, W.; Li, C.; Sevick-Muraca, E.M.

Quantifying molecular specificity of v 3 integrin-targeted optical contrast agents with dynamic optical imaging. J. Biomed. Opt.,

2005, 10, 34019 (doi:10.1117/1.1924696). [80] Wu, Y.; Cai, W.; Chen, X. Near-infrared fluorescence imaging of

tumor integrin v 3 expression with Cy7-labeled RGD multimers. Mol. Imaging Biol., 2006, 8, 226-36.

[81] Waldeck, J.; Häger, F.; Höltke, C.; Lanckohr, C.; Wallbrunn, A.; Torsello, G.; Heindel, W.; Theilmeier, G.; Schäfers, M.; Bremer, C.

Fluorescence reflectance imaging of macrophage-rich atheroscle-rotic plaques using an v 3 integrin–targeted fluorochrome. J.

Nucl. Med., 2008, 49, 1845-51. [82] Achilefu, S.; Bloch, S.; Markiewicz, M. A.; Zhong, T. X.; Ye, Y.

P.; Dorshow, R. B.; Chance, B.; Liang, K. X. Synergistic effects of light-emitting probes and peptides for targeting and monitoring

integrin expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2005, 102, 7976-81.

[83] Bloch, S.; Liang, K.; Dorshow, R. B.; Ye, Y.; Achilefu, S. Targeting the expression of integrin receptors in tumors. Proc.

SPIE, 2004, 5329, 222 (doi:10.1117/12.533160).

[84] Ye, Y.; Bloch, S.; Xu, B.; Achilefu, S. Design, synthesis, and

evaluation of near infrared fluorescent multimeric RGD peptides for targeting tumors. J. Med. Chem., 2006, 49, 2268-75.

[85] Wu, P.; He, X.; Wang, K.; Tan, W.; Ma, D.; Yang, W.; He, C. Imaging breast cancer cells and tissues using peptide-labeled

fluorescent silica nanoparticles. J. Nanosci. Nanotechnol., 2008, 8,2483-7.

[86] Ma. L.; Yu, P.; Veerendra, B.; Rold, T.L.; Retzloff, L.; Prasanphanich, A.; Sieckman, G.; Hoffman, T.J.; Volkert, W.A.;

Smith, C.J. In vitro and in vivo evaluation of alexa fluor 680-Bombesin[7-14]NH2 peptide conjugate, a high-affinity fluorescent

probe with high selectivity for the gastrin-releasing peptide receptor. Mol. Imaging, 2007, 6, 171-80.

[87] Chan, W.C.W.; Maxwell, D.J.; Gao, X.H.; Bailey, R.E.; Han, M.Y.; Nie, S.M. Luminescent quantum dots for multiplexed biological

detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 40-46. [88] Han, M.Y.; Gao, X.H.; Su, J.Z.; Nie, S.M. Quantum dot-tagged

microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nat. Biotechnol., 2001, 19, 631-35.

[89] Gao, X.H.; Nie, S.M. Doping mesoporous materials with multicolor quantum. J. Phys. Chem. B, 2003, 107, 11575-78.

[90] Gao, X.H.; Nie, S.M. Quantum dot-encoded mesoporous beads with high brightness and uniformity: rapid readout using flow

cytometry. Anal. Chem., 2004, 76, 2406-10. [91] Gao, X.H.; Yang, L.; Petros, J.A.; Marshall, F.M.; Simons, J.W.;

Nie1, S. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Curr. Opin. Biotechnol., 2005, 16, 63-72.

[92] Manna, L.; Milliron, D.J.; Meisel, A.; Scher, E.C.; Alivisatos, A.P. Controlled growth of tetrapod-branched inorganic nanocrystals.

Nat. Mater., 2003, 2, 382-85. [93] Milliron, D.J.; Hughes, S.M.; Cui, Y.; Manna, L.; Li, J.; Wang,

L.W.; Alivisatos, A.P. Colloidal nanocrystal heterostructures with linear and branched topology. Nature, 2004, 430, 190-5.

[94] Dick, K.A.; Deppert, K.; Larsson, M.W.; Martensson, T.; Seifert, W.; Wallenberg, L.R.; Samuelson, L. Synthesis of branched

‘nanotrees’ by controlled seeding of multiple branching events. Nat. Mater., 2004, 3, 380-84.

[95] Yu, W.W.; Wang, Y.A.; Peng, X.G. Formation and stability of size-, shape-, and structure-sontrolled CdTe nanocrystals: ligand effects

on monomers and nanocrystals. Chem. Mater., 2003, 15, 4300-8. [96] Hines, M.A.; Guyot-Sionnest, P. Synthesis and characterization of

strongly luminescing ZnS-capped CdSe nanocrystals. J. Phys. Chem. B, 1996, 100, 468-71.

[97] Peng, X.G.; Schlamp, M.C.; Kadavanich, A.V.; Alivisatos, A.P. Epitaxial growth of highly luminescent CdSe/CdS core/shell

nanocrystals with photostability and electronic accessibility. J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 7019-29.

[98] Dabbousi, B.O.; Rodriguez-Viejo, J.; Mikulec, F.V.; Heine, J.R.; Mattoussi, H.; Ober, R.; Jensen, K.F.; Bawendi, M.G. (CdSe)ZnS

core shell quantum dots: synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. J. Phys. Chem. B,

1997, 101, 9463-75. [99] Bailey, R.E.; Nie, S. Alloyed semiconductor quantum dots: tuning

the optical properties without changing the particle size. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 7100-6.

[100] Gao, X.H.; Cui, Y.Y.; Levenson, R.M.; Chung, L.W.K.; Nie, S.M. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum

dots. Nat. Biotechnol., 2004, 22, 969-76. [101] Smith, A.; Duan, H.; Mohs, A.M.; Nie, S. Bioconjugated quantum

dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv. Drug Deliv. Rev., 2008, 60, 1226-40.

[102] Medintz, I.L.; Clapp, A.R.; Mattoussi, H.; Goldman, E.R.; Fisher, B.; Mauro, J.M. Self-assembled nanoscale biosensors based on

quantum dot FRET donors. Nat. Mater., 2003, 2, 630-8. [103] Shah, B.S.; Clark, P.A.; Moioli, E.K.; Stroscio, M.A.; Mao, J.J.

Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett., 2007, 7, 3071-79.

[104] Young, S.H.; Rozengurt, E. Qdot nanocrystal conjugated to bombesin or ANG II label the cognate G protein-coupled receptor

in living cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2006, 290, C728-32. [105] Chen, F.; Gerion, D. Fluorescent CdSe/ZnS nanocrystal peptide

conjugates for long-term, nontoxic imaging and nuclear targeting in living cells. Nano Lett., 2004, 4, 1827-32.

[106] Ruan, G.; Agrawal, A.; Marcus, A.I.; Nie, S.M. Imaging and tracking of tat peptide-conjugated quantum dots in living cells: new


receptor-expressing prostate cancer. J. Nucl. Med., 2006, 47, 492-

501. [22] Kunstler, J.U.; Veerendra, B.; Figueroa, S.D.; Sieckman, G.L.;

Rold, T.L.; Hoffman, T.J.; Smith, C.J.; Pietzsch, H.J. Organometallic (99m)Tc(III) ‘4 + 1’ bombesin(7–14) conjugates:

synthesis, radiolabeling, and in vitro/in vivo studies. Bioconjug. Chem., 2007, 18, 1651-716.

[23] de Visser, M.; van Weerden, W.M.; de Ridder, C-M. Androgen-dependent expression of the gastrin-releasing peptide receptor in

human prostate tumor xenografts. J. Nucl. Med., 2007, 48, 88-93. [24] Santos-Cuevas, C.L.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.;

Pichardo-Romero, P. Targeted imaging of gastrin-releasing peptide receptors with 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin: biokinetics

and dosimetry in women. Nucl. Med. Commun., 2008, 29, 741-47. [25] van de Wiele, C.; Phonteyne, P.; Pauwels, P. Gastrin-releasing

peptide receptor imaging in human breast carcinoma versus immunohistochemistry. J. Nucl. Med., 2008, 49, 260-64.

[26] Schroeder, R.P.J.; van Weerden, W.M.; Bangma, C.; Krenning, E.P.; de Jong, M. Peptide receptor imaging of prostate cancer with

radiolabelled bombesin analogues. Methods, 2009, 48, 200-4. [27] von Guggenberg, E.; Behe, M.; Behr, T.M.; Saurer, M.; Seppi, T.;

Decristoforo, C. 99mTc-labeling and in vitro and in vivo evaluation of HYNIC- and (Nalpha-His)acetic acid-modified [D-Glu1]-

minigastrin. Bioconjug. Chem., 2004, 15, 864-71. [28] Nock, B.A.; Maina, T.; Behe, M.; Nikolopoulou, A.; Gotthardt, M.;

Schmitt, J.S.; Behr, T.M.; Macke, H.R. CCK-2/Gastrin receptor–targeted tumor imaging with 99mTc-labeled minigastrin analogs. J.

Nucl. Med., 2005, 46, 1727-36. [29] Bhattacharya, R.; Mukherjee, P. Biological properties of “naked”

metal nanoparticles. Adv. Drug Deliv. Rev., 2008, 60, 1289-306. [30] Haubner, R.; Wester, H.J.; Reuning, U. Radiolabelled alfavbeta3

integrin antagonists: a new class of tracers for tumor targeting. J. Nucl. Med., 1999, 40, 1061-71.

[31] Haubner, R.; Wester, H.J.; Burkhart, F. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis

imaging with improved biokinetics. J. Nucl. Med., 2001, 42, 326-36.

[32] Haubner. R.; Kuhnast, B.; Mang, C. [18F]Galacto-RGD: synthesis, radiolabeling, metabolic stability, and radiation dose estimates.

Bioconjug. Chem., 2004, 15, 61-9. [33] Haubner, R.; Wester, H.J.; Weber, W.A. Non-invasive imaging of

v 3 integrin expression using 18F-labelled RGD-containing glycopeptide and positron emission tomography. Cancer Res.,

2001, 61, 1781-5. [34] Morrison, M.S.; Ricketts, S.A.; Barnett, J.; Cuthbertson, A.;

Tessier, J.; Wedge, S.R. Use of a Novel Arg-Gly-Asp Radioligand, 18F-AH111585, to determine changes in tumor vascularity after

antitumor therapy. J. Nucl. Med., 2009, 50, 116-22. [35] Yoshimoto, M.; Ogawa, K.; Washiyama, K.; Shikano, N.; Mori, H.;

Amano, R.; Kawai, K. alfavbeta3 integrin-targeting radionuclide therapy and imaging with monomeric RGD peptide. Int. J. Cancer,

2008, 123, 709-715. [36] Jeong, J.M.; Hong, M.K.; Chang, Y.S.; Lee, Y.S.; Kim, Y.J.;

Cheon, G.J.; Lee, D.S.; Chung, J.K.; Lee, M.C. Preparation of a promising angiogenesis PET imaging agent: 68Ga-

labeled c(RGDyK)–isothiocyanatobenzyl-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid and feasibility studies in mice. J. Nucl. Med.,

2008, 49, 830-36. [37] Li, Z.B.; Chen, K.; Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides

for microPET imaging of integrin v 3 expression. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2008, 35, 1100-08.

[38] Kenny, L.M.; Coombes, R.C.; Oulie, I.; Contractor, K.B.; Miller, M.; Spinks, T.J.; McParland, B.; Cohen, P.S.; Hui, A.M.; Palmieri,

C.; Osman, S.; Glaser, M.; Turton, D.; Al-Nahhas, A.; Aboagye, E.O. Phase I Trial of the positron-emitting arg-gly-asp (RGD)

peptide radioligand 18F-AH111585 in breast cancer patients. J. Nucl. Med., 2008, 49, 879-86.

[39] Liu, Z.; Yan, Y.; Chin, F.T.; Wang, F.; Chen, X. Dual integrin and gastrin-releasing peptide receptor targeted tumor imaging using 18F-

labeled PEGylated RGD-bombesin heterodimer 18F-FB-PEG3-Glu-RGD-BBN. J. Med. Chem., 2009, 52, 425-32.

[40] Liu, Z.; Niu, G.; Wang, F.; Chen, X. (68)Ga-labeled NOTA-RGD-BBN peptide for dual integrin and GRPR-targeted tumor imaging.

Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2009, 36, 1483-94.

[41] Haubner, R.; Decristoforo, C. Radiolabelled RGD peptides and

peptidomimetics for tumour targeting. Front. Biosci., 2009, 14,872-86.

[42] Mitrasinovic, P.M. Advances in v 3 integrin-targeting cancer therapy and imaging with radiolabeled RGD peptides. Curr.

Radiopharm., 2009, 2, 214-19. [43] Zaccaro, L.; Del Gatto, A.; Pedone, C.; Saviano, M. Peptides for

tumour therapy and diagnosis: Current status and future directions. Curr. Med. Chem., 2009, 16, 780-95.

[44] Buchegger, F.; Bonvin, F.; Kosinski, M.; Schaffland, A.O.; Prior, J.; Reubi, J.C.; Blauenstein, P.; Tourwe, P.; García-Garayoa, E.;

Bischof A. Radiolabelled neurotensin analog, 99mTc-NT-XI, evaluated in ductal pancreatic adenocarcinoma patients. J. Nucl.

Med., 2003, 44, 1649-54. [45] Korner, M.; Waser, B.; Reubi, J.C. High expression of neuropeptide

Y1 receptors in Ewing sarcoma tumors. Clin. Canc. Res., 2008, 14,5043-49.

[46] Zwanziger, D.; Khan, I.U.; Neundorf, I. Novel chemically modified analogues of neuropeptide Y for tumor targeting. Bioconjug.

Chem., 2008, 19, 1430-38. [47] Kersemans, V.; Kersemans, K.; Cornelissen, B. Cell penetrating

peptides for in vivo molecular imaging applications. Curr. Pharm. Des., 2008, 14, 2415-27.

[48] Deshayes, S.; Morris, M.C.; Divita, G.; Heitz, F. Interactions of primary amphipathic cell penetrating peptides with model mem-

branes: consequences on the mechanisms of intracellular delivery of therapeutics. Curr. Pharm. Des., 2005, 11, 3629-38.

[49] Cornelissen, B.; McLarty, K.; Kersemans, V.; Scollard, D.; Reilly, R. Properties of [111In]-labeled HIV-1 tat peptide radioimmunocon-

jugates in tumor-bearing mice following intravenous or intratumoral injection. Nucl. Med. Biol., 2008, 35, 101-10.

[50] Costantini, D.L.; Hu, M.; Reilly, R. Peptide motifs for insertion of radiolabeled biomolecules into cells and routing to the nucleus for

cancer imaging or radiotherapeutic applications. Cancer Biother. Radiopharm., 2008, 23, 3-23.

[51] Santos-Cuevas, C.L.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.A.; Ramírez, F. de M.; Luna-Gutiérrez, M.A.; Pedraza-López, M.;

García-Becerra, R.; Ordaz-Rosado, D. Design, preparation, in vitroand in vivo evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-bombesin: a

target-specific hybrid radiopharmaceutical. Int. J. Pharm., 2009,375, 75-83.

[52] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in

vivo molecular imaging. Eur. Radiol., 2003, 13, 195-208. [53] Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr.

Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 626-34. [54] Sharma, P.; Brown, S.; Walte, G.; Santra, S.; Moudgil, B.

Nanoparticles for bioimaging. Adv. Colloid Interface Sci., 2006,123, 471-85.

[55] Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat. Biotechnol., 2001, 19, 316-7.

[56] Ntziachristos, V.; Schellenberger, E.A.; Ripoll, J.; Yessayan, D.; Graves, E.; Bogdanov, A. Visualization of antitumor treatment by

means of fluorescence molecular tomography with an annexin V–Cy5.5 conjugate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2004, 101, 12294-

99. [57] Graves, E.E.; Culver, J.P.; Ripoll, J.; Weissleder, R.; Ntziachristos,

V. Singular-value analysis and optimization of experimental parameters in fluorescence molecular tomography. J. Opt. Soc. Am.

A., 2004, 21, 231-41. [58] Graves, E.E.; Yessayan, D.; Turner, G.; Weissleder, R.;

Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J. Biomed.

Opt., 2005, 10, 44019 (doi:10.1117/1.1993427). [59] Graves, E.E.; Ripoll, J.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. A

submillimeter resolution fluorescence molecular imaging system for small animal imaging. Med. Phys., 2003, 30, 901-11.

[60] Graves, E.E.; Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr. Mol. Med.,

2004, 4, 419-30. [61] Ntziachristos, V.; Bremer, C.; Tung, C.; Weissleder, R. Imaging

cathepsin B up-regulation in HT-1080 tumor models using fluorescence-mediated molecular tomography (FMT). Acad.

Radiol., 2002, 9, S323-25.


tumours and is significantly altered for example by systemic chemotherapy. Combined FMT/MR imaging of fluorescent molecular probes could be valuable for brain tumour drug development and other neurological and somatic imaging applications [137].

The synthesis and in vivo characterization of an 18

F-CLIO was reported by Devaraj et al. [138]. This particle consists of cross-linked dextran molecules held together in core-shell formation by a superparamagnetic iron oxide core and functionalized with the radionuclide

18F in high yield via

“click” chemistry. Such nanoparticles could accurately detect lymph nodes (LNs), which are critical for assessing cancer metastasis. In vivo PET/MRI images could clearly identify small (~1 mm) LNs along with precise anatomical information.

NIR fluorescence has the potential to provide rapid, inexpensive, and nonradioactive population-based screening for breast cancer. Bhushan et al. [139] developed a system for detection of breast cancer microcalcifications using a dual-modality SPECT/NIR fluorescent probe.

Two or more different peptides can be bound to one AuNP. In our group we have obtained radiolabelled gold nanoparticles conjugated to two different peptides, one to be used as a bifunctional chelating agent to link the radionuclide and the other one as regulatory peptide analogue:

99mTc-GGC-AuNP-bombesin. This system could

be useful for imaging breast cancer (data not published).

5. SUMMARY AND CONCLUSIONS

Labelled regulatory peptides, as well as RGD and Tat peptides, have far-reaching potential for the study of cellular processes at the single-molecule level, high-resolution cellular imaging, long-term in vivo observation of cell tracking, tumour targeting, and specific cancer diagnostic. Medical imaging modalities such as MRI, SPECT and PET can identify tumours non-invasively, but they do not provide a visual guide during surgery. Nanoparticle probes can endow imaging techniques with enhanced signal, sensitivity and better spatial resolution. For example, the development of magnetic or radioactive QD-peptides could give a visual guide during surgery.

Several molecular imaging strategies using multicom-ponent nanoparticles conjugated to peptides for multimodal imaging techniques are poised for rapid clinical application. Major areas of research are focused on development of molecular, functional and genetic imaging tools, aided by new information technology and image fusion/integration capabilities. Undoubtedly, multimodal imaging techniques using target-specific peptides will enhance the ability to accurately diagnose and evaluate the efficacy of different cancer therapies.

REFERENCES

[1] Reubi, J.C.; Maecke, H.R. Peptide-based probes for cancer

imaging. J. Nucl. Med., 2008, 49, 1735-38. [2] Reubi, J.C.; Waser, B. Concomitant expression of several peptide

receptors in neuroendocrine tumours: molecular basis for in vivo multireceptor tumour targeting. Eur. J. Nucl. Med., 2003, 30, 781-

93.

[3] Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Melendez-Alafort, L.

Third generation radiopharmaceuticals for imaging and targeted therapy. Curr. Pharm. Anal., 2006, 2, 339-52.

[4] de Visser, M.; Verwijnen, S.M.; de Jong, M. Update: improvement strategies for peptide receptor scintigraphy and radionuclide

therapy. Cancer Biother. Radiopharm., 2008, 23, 137-57. [5] Weissleder, R.; Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology, 2001,

219, 316-33. [6] Decristoforo, C.; Meléndez-Alafort, L.; Sosabowski, J.K.; Mather,

S.J. 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-Octreotide for imaging somatostatin-receptor-positive tumors: preclinical evaluation and comparison

with 111In-octreotide. J. Nucl. Med., 2000, 41, 1114-19. [7] Plachcinska, A.; Mikolajczak, R.; Maecke, H.R.; Mlodkowska, E.;

Kunert-Radek, J.; Michalski, A.; Rzeszutek, K.; Kozak, J.; Kusmierek, J. Clinical usefulness of 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC

scintigraphy in oncological diagnostics: a preliminary communication. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2003, 30, 1402-

06. [8] Plachcinska, A.; Mikolajczak, R.; Maecke, H.R.; Michalski, A.;

Rzeszutek, K.; Kozak, J.; Kusmierek, J. 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC scintigraphy in the differential diagnosis of solitary pulmonary

nodules. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2004, 31, 1005-10. [9] Gonzalez-Vazquez, A.; Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.;

Gutierrez-Garcia, Z. Biokinetics and dosimetry in patients of 99mTc-EDDA/HYNIC-Tyr3-octreotide prepared from lyophilized

kits. Appl. Radiat. Isot., 2006, 64, 792-97. [10] Czepczynski, R.; Parisella, M.G.; Kosowicz, J.; Mikolajczak, R.;

Ziemnicka, K.; Gryczynska, M.; Sowinski, J.; Signore, A. Somatostatin receptor scintigraphy using 99mTc-EDDA/HYNIC-

TOC in patients with medullary thyroid carcinoma. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2007, 34, 1635-45.

[11] Pearson, D.A.; Lister-James, J.; McBride, W.J.; Wilson, D.; Martel, L.J.; Civitello, E.R.; Taylor, J.E.; Moyer, B.R.; Dean, R.T.

Somatostatin receptor-binding peptides labelled with technetium-99m: chemistry and initial biological studies. J. Med. Chem.,1996,

39, 1361-71. [12] Blum, J.; Handmaker, H.; Lister-James, J.; Rinne, N. A multicenter

trial with a somatostatin analogue 99mTc-depreotide in the evaluation of solitary pulmonary nodules. Chest, 2000, 117, 1232-

38. [13] Plachcinska, A.; Mikoajczak, R.; Kozak, J.; Rzeszutek, K.;

Kumierek, J. Comparative analysis of 99mTc-depreotide and 99mTc-EDDA/HYNIC-TOC thorax scintigrams acquired for the purpose

of differential diagnosis of solitary pulmonary nodules. Nucl. Med. Rev., 2006, 9, 24-9.

[14] Scottelius, M.; Wester, H.-J. Molecular imaging targeting peptide receptors. Methods, 2009, 48, 161-77.

[15] La Bella, R.; Garcia-Garayoa, E.; Langer, M.; Bläuenstein, P.; Beck-Sickinger, A.G.; Schubiger, P.A. In vitro and in vivo

evaluation of a 99mTc(I)-labeled bombesin analogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positive tumors. Nucl. Med. Biol.,

2002, 29, 553-60. [16] Scopinaro, F.; Varvarigou, A.D.; Ussof, W.; De Vicentis, G.;

Sourlingas, T.G.; Evangelatos, G.P. Technetium labeled bombesin-like peptide: preliminary report on breast cancer uptake in patients.

Cancer Biother. Radiopharm., 2002, 17, 327-35. [17] Scopinaro, F.; De Vicentis, G.; Varvarigou, A.D.; Laurenti, C.; Iori,

F.; Remediani, S. 99mTc-bombesin detects prostate cancer and invasion of pelvic lymph nodes. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging,

2003, 30, 1378-82. [18] Chen, X.; Park, R.; Hou, Y.; Tohme, M.; Shahinian, A.H.; Bading,

J.R. microPET and autoradiographic imaging of GRP receptor expression with 64Cu-DOTA-[Lys3]bombesin in human prostate

adenocarcinoma xenografts. J. Nucl. Med. 2004, 45, 1390-97. [19] Alves, S.; Correia, J.D.; Santos, I.; Veerendra, B.; Sieckman, G.L.;

Hoffman, T.J.; Rold, T.L.; Figueroa, S.D.; Retzloff, L.; McCrate, J.; Prasanphanich, A.; Smith, C.J. Pyrazolyl conjugates of bombesin: a

new tridentate ligand framework for the stabilization of fac-[M(CO)3]+ moiety. Nucl. Med. Biol., 2006, 33, 625-34.

[20] Ferro-Flores, G.; Arteaga de Murphy, C.; Rodriguez-Cortes, J.; Pedraza-Lopez, M.; Ramirez-Iglesias, MT. Preparation and

evaluation of 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin for imaging gastrin-releasing peptide receptor-positive tumours. Nucl. Med.

Commun., 2006, 27, 371-76. [21] Zhang, X; Cai, W.; Cao, F.; Schreibmann, E.; Wu, Y.; Wu, J.C.;

Xing, L.; Chen, X. 18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP


Recently, dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (CLIO) labelled with Cy5.5 were conjugated to the 13- C-terminal amino acids of bombesin, which can bind to any of three receptors, the NMB receptor (BB1), the GRP receptor (BB2), or the orphan bombesin binding receptor BB3, showing the Bombesin-CLIO(Cy5.5) ability to visua-lize tumours in a model of pancreatic ductal adenocarcinoma by MRI [128]. Cy5.5 was included in the probe to assess presence of bombesin receptors by the fluorescein hapten visualization method.

Montet et al. [118] prepared cRGD-CLIO(Cy5.5) nano-particles and evaluated the BT-20 human breast carcinoma cell integrin expression, nanoparticle pharmacokinetics and tumour vascularisation. Results indicated that magneto-fluorescent RGD nanoparticles were targeted to v 3-expressing tumour cells in vivo and were detectable by fluorescence reflectance imaging, fluorescence molecular tomography, and magnetic resonance imaging. Factors permitting the imaging of tumour integrins included the vascularised nature of the BT-20 tumour, the long nanoparticle blood half-life (180 min), and the ability of nanoparticles to slowly escape from the vasculature.

Surface modification of superparamagnetic contrast agents with the HIV-1 Tat peptide is an effective technique for intracellular magnetic labelling, because the conjugation of the Tat peptide to nanoparticles facilitates their cellular uptake [129]. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) nanoparticles have been conjugated to the HIV Tat peptide to label CD4+ T cells. The number of Tat peptide molecules per nanoparticle was estimated to be from 15 to 45. Uptake in CD4+ T cells was determined using inductively coupled plasma optical emission spectrometry to measure iron content. Iron was detected in cells when USPIO-Tat nanoparticles were used, but no uptake was observed when unconjugated USPIO nanoparticles were used. Furthermore, it was demonstrated that labelled CD4+ T cells retained their proliferative and regulatory function invitro and, similarly, no differences were observed in their transmigratory behaviour. The imaging potential of this contrast agent for MRI was evaluated, and USPIO-Tat provided effective contrast enhancement in vitro, while the unlabelled cells did not yield any contrast [130].

Another study in the same field addressed the feasibility of using MRI to monitor T cells in vivo. CLIO–Tat nanoparticles were conjugated to cells and results indicated that labelling of T cells with more than 8000 ng/ml of magnetic nanoparticles did not affect activation, proliferation or upregulation functions. A group of six B6 mice were injected intravenously with a suspension of T cells loaded with 8000 ng/mL of CLIO–Tat. Changes in spleen image intensity caused by the agent were measured by MRI, thereby proving that these particles can be used to analyze T-cell distribution events in vivo [131, 132].

Superparamagnetic nanoparticles of maghemite ( -Fe2O3) have been encapsulated with an Arg-containing cell-penetrating peptide (RRRRRRRRCK–FITC). The FITC was conjugated to observe the intracellular translocation of magnetic nanoparticles into human mesenchymal stem cells, and cellular internalization was examined using a confocal laser scanning microscope (CLSM). Nanoparticles were effectively adsorbed onto the membrane of stem cells. Cell

incubation with NP–peptide conjugates did not show significant cytotoxicity up to 200 g/ml of IONP concentrations [133].

4. MULTIMODAL TECHNIQUES FOR MOLECULAR IMAGING

Molecular imaging represents the future of diagnostic imaging: it evolves from both anatomic and functionalimaging as well as advances in genomics, cell and molecularbiology, chemistry, and physics. Different imaging tech-niques are, in general, complementary rather than compe-titive. Dual-labelled targeting imaging agents, allow cross validation and direct comparison for example between nuclear (the goldstandard) and fluorescence optical image, or MRI and fluorescence, or trimodal nuclear- MRI- fluorescence.

For example, SPECT and PET provide functional information but lack the anatomical information. Computer tomography (CT) is a tomographic imaging technique that uses external X-ray source to produce 3-dimensional anatomic image data. The SPECT/CT and PET/CT systems, currently used in the clinical practice, combine a gammacamara and an integrated X-ray transmission system mounted on the same gantry [134, 135]. The advantage of SPECT/CT or PET/CT is the ability to acquire an anatomic image with CT and a functional image with SPECT or PET sequentially.

In the same direction, a dual-modality PET/NIR fluore-scent peptide has been recently reported by Cai et al. [136]. A QD with an amine-functionalized surface was modified with RGD (90 peptides per QD) and 1,4,7,10-tetraaza-cyclodocecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid (DOTA) chelators for integrin v 3-targeted PET/NIRF imaging. PET/NIRF imaging, tissue homogenate fluorescence mea-surement, and immunofluorescence staining were performed with U87MG human glioblastoma tumour-bearing mice to quantify the

64Cu-DOTA-QD-RGD uptake in tumour and

major organs. Excellent linear correlation was obtained between the results measured by in vivo PET imaging and those measured by ex vivo NIRF imaging and tissue homogenate fluorescence. Histologic examination revealed that

64Cu-DOTA-QD-RGD targets primarily the tumour

vasculature through a RGD-integrin interaction, with little extravasation. Authors concluded that this dual-function probe has significantly reduced potential toxicity and overcomes the tissue penetration limitation of optical imaging, requisite for quantitative targeted imaging in deep tissue [136].

Fluorescent molecular tomographic (FMT) imaging can monitor molecular function in living animals using specific fluorescent probes. However, macroscopic imaging methods such as FMT generally exhibit low anatomical details. To overcome this, McCann et al. [137] reported a quantitative technique to image both structure and function by combining FMT and MRI. Authors demonstrated that FMT/MR imaging can produce three-dimensional, multimodal images of living mouse brains indispensable to serial monitoring of tumour morphology and protease activity. Combined FMT/MR tumour imaging provides a unique in vivodiagnostic parameter, which reflects histological changes in


[105]. Ruan et al. have recently used QDs-Tat as a model system to examine the cellular uptake and intracellular transport of nanoparticles in living cells [106]. The authors obtained dynamic fluorescence imaging. Results indicated that the peptide-conjugated QDs are internalized by macropinocytosis, in agreement with the recent work of Dowdy et al. [107]. It is interesting, that the internalized QDs-Tat are bound to the inner surface of vesicles and trapped in intracellular organelles. An important finding is that the QD-loaded vesicles are actively transported along microtubule tracks to an asymmetric perinuclear region called the microtubule organizing centre (MTOC) [108]. Furthermore, it was found that QDs-Tat strongly bind to cellular membrane structures. These results not only provide new insight into the mechanisms of Tat peptide-mediated delivery, but also are important for the development of nanoparticles probes for intracellular targeting and imaging.

2.3 Carbon Nanotubes

Single-walled carbon nanotubes (SWNTs) show physical properties that make them promising candidates for biological applications. However SWATs conjugated to peptides have only been studied in nuclear and photoacustic imaging. Liu et al. investigated the biodistribution of

64Cu

labelled SWNTs conjugated to PEG and RGD in mice with induced tumours by PET, ex vivo biodistribution and Raman spectroscopy. Results showed a high tumour conjugate accumulation attributed to the multivalent effect of the SWNTs [109]. The SWNT-RGD probe was also used as a photoacoustic molecular imaging agent in living mice [110].

2.4 Gold Nanoparticles

Gold nanoparticles (AuNPs) are inert and non-toxic, since Au(0) gold cores are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity [111]. A second advantage is their easy synthesis [112]. There are two gold-nanoparticle properties that are most relevant: resistance to oxidation and plasmon resonance with light [113]. The plasmon resonance for ordinary gold nanospheres is at 520 nm, in the middle of the visible spectrum, but this can be red-shifted into the near infrared region (NIR) from 800 to 1200 nm. Further versatility is imparted by their readily functionalization with biological molecules to make them interact with a specific biological target. The conjugation of molecules to one AuNP is by means of the spontaneous reaction of a thiol (Cys) or a primary amine with the AuNP surface. Thiols are the most important type of stabilizing molecules for AuNPs of any size. It is an accepted assumption that the use of thiols leads to the formation of strong Au–S bonds [112, 114].

The fluorescence of AuNP rises from the surface plasmon resonance and can be enhanced, quenched or photobleached by the AuNP size, the nature of bounded cap to AuNP as well as the surrounding of the capped-AuNP. Ideally, the efficiency of the energy transfer to the AuNP from its organic cap only depends on the extent of the overlap of the cap band emission and the surface plasmon resonance band of the nanoparticle, which would be translated in a fluorescence resonance energy transfer (FRET) [115]. Fluorescence emission is very important in the study of AuNP conjugated to peptides since in general

peptides contain aromatic residues which transfer their energy to the AuNP following the pathway: fluorescence level (peptide) to phosphorescence level (peptide) to surface plasmon resonance level (AuNP) and the absorbed light re-emitted, usually in the NIR range or close to- if the NIR fluorescence emission is not quenched or masked by the luminescence background in particular, in tissues.

Surujpaul et al. [115] prepared a stable multifunctional system of gold nanoparticles (AuNP) conjugated to [Tyr

3]Octreotide (TOC) peptide which was characterized by

TEM, UV–Vis, infrared and fluorescence spectroscopy. AuNP and AuNP-TOC fluorescence emission spectra were obtained both in solution and in murine AR42J-tumour tissues. The fluorescence analyses in tissue revealed the recognition of the AuNP-TOC conjugate by the neuroendocrine tumour because of the lower energy position of the fluorescence resonance (692 nm) with respect to that of the AuNP in the same tumour tissue (684 nm). The emission band observed in the near infrared region (692 nm) opens the possibility for using AuNP-TOC in bioimaging. More than 500 TOC peptides can be bound to one 20 nm AuNP.

De La Fuente et al. have successfully prepared AuNPs functionalized with the Tat protein-derived peptide sequence GRKKRRQRRR in order to transport the NPs to the cell nucleus [116], and AuNP-RGD for possible phototherapeutic applications [117].

3. IRON OXIDE NANOPARTICLES CONJUGATED TO PEPTIDES FOR MRI

The quest for more potent and selective tumour-targeted diagnostic and therapeutic agents, and the widespread interest in nanotechnology have led to recent proposals that targeted nanoparticle-based pharmaceuticals might be designed to fit this need [118]. Nanoparticles offer two key advantages as targeted agents: nanoparticle geometry consisting of a core, typically with thousands of detectable atoms (iron and gold) and a coating, typically consisting of targeting peptides, antibodies or any molecule with biological activity. Nanoparticles produce multivalent effects due to multiple simultaneous interactions between the surface of the nanoparticle and the surface of the cell, whereas signals in nuclear imaging are the result of biological properties of single radiolabelled peptides.

The MRI technique is a non-invasive imaging modality capable of providing high resolution anatomical images. Basically, it uses the tissue contrast that is generated from the nuclear magnetic resonance (NMR) signals received from hydrogen nuclei located in different physiological environments in living systems. MRI can be expanded through the use of magnetic nanoparticles which improve the differentiation between malignant and healthy tissue. Iron oxide nanoparticles have magnetic properties and have been extensively investigated for biomedical applications due to their excellent biocompatibility and easy of synthesis [119-125]. The main requirement for MRI is the efficient capture of the magnetic nanoparticles by the cell and, when a cell is sufficiently loaded with magnetic material, MRI can also be used for cell tracking [126-127].


injection of Cy5.5 dye alone showed nonspecific binding [77].

Wang et al. [78] worked with a cyanine labelled cyclic RGD pentapeptide. The tumour-to-background ratios for human Kaposi's sarcoma in mice injected with Cy5.5-c(KRGDf) and Cy5.5 were 5.5 and 1.5, respectively [78]. Gurfinkel et al. [79] obtained dynamic fluorescence images from a subcutaneous human Kaposi's sarcoma tumour model in mice immediately following the intravenous injection of Cy5.5-c(KRGDf). The fluorescence images, acquired via an intensified charge-coupled device detection system, were used in conjunction with a pharmacokinetic model to determine kinetic properties of target binding in the presence and absence of a competitive ligand (free c(KRGDf)). Results indicated that the conjugate dye behaves similarly in normal tissue to the free Cy5.5 while it possesses increased uptake in tumour tissue. Authors concluded that in vivopharmacokinetic analysis based on dynamic optical imaging may be potentially useful in molecular medicine.

Mono-, di-, and tetrameric RGD peptides were synthe-sized and conjugated with Cy7 by Wu et al. [80]. The integrin specificity of these fluorescent probes was tested invitro for receptor binding assay and fluorescence microscopy and in vivo for subcutaneous U87MG tumour targeting. The tetrameric Cy7-RGD peptide probe with the highest integrin affinity showed the highest tumour activity accumulation and strongest tumour-to-normal tissue contrast.

Waldeck et al. [81] reported that Cy5.5-RGD, combined with near-infrared optical imaging methods, allows the specific imaging of v 3 integrin expression on macro-phages recruited to vascular lesions and may serve to estimate macrophage-bound inflammatory activity of athero-sclerotic lesions.

The development of fluorescent molecules using dicar-boxylic acid-containing carbocyanine fluorophore (cypate)-RGD with high and selective tumour uptake in vivo for optical tumour imaging in mice has also been reported [82, 83]. Such fluorescent molecules not only accelerate the screening of new compounds for lead discovery and opti-mization at cellular levels, but they are also advantageous in tracking, visualizing, and quantifying target specific fluorescent probes in vivo for distribution and metabolism studies. Recently, the evaluation of novel NIR fluorescent multimeric RGD systems based on the simplest RGD motif and cypate showed a remarkable increase in binding affinity respect to the monomer cypate-RGD-NH2. In vivo non-invasive optical imaging showed that the compounds were retained in A549 human non-small-cell lung tumour tissue [84].

Red-region fluorescent dye doped silica nanoparticles (FSiNPs) have also been reported for molecular in vivoimaging. In these nanoparticles, cyanine derivative mole-cules are covalently bound to silica matrix to avoid the dye leaking out nanoparticles in bio-applications. Wu et al. [85] reported the targeting and optical imaging of MDA-MB-231 human breast cancer cells using RGD peptide-labelled FSiNPs. Tissue images demonstrated that the high v 3expression level of the MDA-MB-231 tumours in nude mice was clearly visible and the tumour fluorescence reached maximum intensity at 1 h postinjection [85].

In 2007 Ma et al. developed the fluorescent probe Alexa Fluor 680-G-G-G-Bombesin[7-14]NH2 and demonstrated the ability of this new conjugate to specifically target T-47D breast cancer tissue in mice by fluorescence images [86].

2.2 Quantum Dots

Quantum dots (QDs) or nanocrystals are fluorescent semiconductor nanoparticles (2-10 nm) with many unique optical properties including bright fluorescence, resistance to photobleaching, and a narrow emission bandwidth [87-90]. Their fluorescence emission wavelength can be continuously tuned from 400 nm to 2000 nm by changing both the particle size and chemical composition, at room temperature. Their quantum yields are as high as 85 %. The particles are generally made from hundreds to thousands of atoms (~200-10,000 atoms) of group II and VI elements (e.g. CdSe and CdTe) or group III and V elements (e.g. InP and InAs) [91]. Recent advances have allowed the precise control of particle size, shape and internal structure (core-shell, gradient alloy or homogenous alloy) [92-99]. As cadmium is potentially toxic, Gao et al. [100] developed a class of QD conjugates that contains an amphiphilic triblock copolymer for in vivo protection and multiple PEG molecules for improving biocompatibility and circulation. To make QDs more useful for in vivo imaging, they need to be effectively, specifically and reliably directed to a specific organ or disease site without alteration. Specific targeting can be achieved by attaching targeting molecules to the QD surface. Peptides and peptide analogues are suitable targeting ligands, as large numbers of these molecules can be linked to the surface of a single QD, Fig. (1) [67].

Water-soluble QDs may be cross-linked to peptides using standard bioconjugation protocols, such as the coupling of maleimide-activated QDs to thiol groups [101]. QDs can also act as sensors to detect the presence of biomolecules using intricate probe designs incorporating energy donors or acceptors. For example, QDs can be adapted to sense the presence of the sugar maltose by conjugating the maltose binding protein to the nanocrystal surface [102].

Recently, a detailed procedure for the preparation of QDs-RGD using commercially available PEG-coated QDs was reported by Cai and Chen [67]. A thiolated-RGD peptide was conjugated to QDs through 4-maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester. Prior to in vivo imaging of human glioblastoma tumours which was successful in mice, competitive cell binding assay and live cell staining were carried out to confirm the successful attachment of the RGD peptides to the QD surface.

Shah et al. [103] used QDs-RGD for labelling of human mesenchymal stem cells (hMSCs) during self-replication and multilineage differentiations into osteogenic, chondrogenic, and adipogenic cells. Authors concluded that QDs-RGD is an effective probe for long-term labelling of stem cells.

Young and Rozengurt [104] demonstrated that QDs-bombesin conjugates can label the bombesin-preferring G protein-coupled receptors (GPCR) in living mice, suggesting that QDs technology can be adapted to monitor in vivoligand binding to GPCRs.

QDs conjugated to the HIV Tat peptide, were quickly bound to cells and become internalized via endocytosis


tissues close to the surface of the skin and tissues accessible by endoscopy and intraoperative visua-lization [67].

2.1 Near-Infrared Fluorochromes

Organic fluorescent dyes are the most commonly used fluorochromes. Dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester (CFSE) have been used for various biological applications, such as fluorescent-labelled antibodies and molecules that are used to stain cells or organelles [68]. However, they are prone to rapid photobleaching (fast photochemical destruc-tion of a fluorophore by the light exposure) and, thus, are unsuitable for extended periods of bioimaging observations. Most organic dyes have a relatively broad emission spec-trum. Emission/excitation wavelength is often affected by changes in local chemical environment (e.g., pH, interacting ions,etc.). Because of this, exogenously administered fluoro-chromes that fluoresce in the NIR region [60-71] such as cyanine (Cy) dyes, are now finding increasingly application in fluorescence imaging, but when the emitted light wavelength is beyond =850 nm their quantum yield is low (low brightness) with low photostability [72, 73] (Fig. 2). However, the commercial available near-IR carboxyfluore-scein (Near-IR CF

TM dyes Biotum, USA), with absorption

and emission wavelengths between 650 and 800 nm, is reported to be significantly brighter and more stable than other commercial dyes of similar wavelength, Fig. (2). CF750 is so bright and can be excited at 633 nm (i.e., at the shoulder wavelength of the absorption maximum) but still emits stronger fluorescence at ~770 nm than APC-based tandem dyes, i.e. Cy7. It is possible to find in the near future interesting NIR fluorescence images using this new dye.

Fluorescence intensity of some cyanine dyes changes upon specific reaction with nitric oxide, which is an important signalling molecule involved in the regulation of a wide range of physiological and pathophysiological mechanisms, and many disorders [74].

In the particular case of peptides, novel NIR fluorescent arginine-glycine-aspartic acid (RGD) compounds with imp-roved receptor binding affinity, cellular internalization, and other activities are being studied to improve the sensitivity and specificity of tumour targeting. The combination of the specificity of RGD peptide/integrin interaction with near-infrared fluorescence detection may be applied to non-invasive imaging of integrin expression and monitoring anti-integrin treatment efficacy providing near real-time mea-surements.

Chen et al. [75] showed that the Cy5.5-RGD conjugate exhibits affinity for v 3 integrin (IC(50) = 58.1 ± 5.6 nmol/L). In vivo imaging with a prototype three-dimensional small-animal imaging system visualized subcutaneous U87MG glioblastoma xenograft with a broad range of concentrations of fluorescent probe administered via the tail vein. Tumour uptake was blocked by unlabelled c(RGDyK) demonstrating the Cy5.5-RGD specificity [75]. Authors also synthesized Cy5.5-conjugated mono-, di-, and tetrameric RGD peptides to investigate the effect of multimerisation of RGD peptide on integrin avidity and tumour targeting efficacy. All three peptide-dye conjugates had integrin specific uptake both in vitro and in vivo. Among them, tetramer displayed the highest tumour uptake and tumour-to-normal tissue ratio from 0.5 to 4 h postinjection. Tumour-to-normal tissue ratio for Cy5.5-conjugated RGD monomer, dimer, and tetramer were found to be 3.18 ± 0.16, 2.98 ± 0.05, and 3.63 ± 0.09, respectively, at 4 h postinjection. These results suggested that Cy5.5-conjugated monomeric, dimeric, and tetrameric RGD peptides are all suitable for integrin expression imaging [76].

The v 3 expression has also been assessed in an orthotopic brain tumour model by using a three-dimensional optical imaging system (IVIS 200) after administration of monomeric Cy5.5-RGD. NIRF imaging showed the highest tumour uptake and tumour to normal brain tissue ratio at 2 h postinjection (2.64 ± 0.20). Tumour uptake of Cy5.5-RGD was effectively blocked by using unlabelled c(RGDyK) and

Fig. (2). Absorption spectra of Cy7 and CF750 NIR-dyes, before (t=0) and after (t=30 min) exposure to sunlight. (Biotum, USA).


growth factors in several tumours, such as colon and gastric cancers. They are structurally related in that they have the same C-terminal five amino acids (-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2), which is the active site for binding to cholecystokinin-2 (CCK-2) receptor. CCK-2 receptor protein has been iden-tified in cell-membranes of medullary thyroid carcinomas (92 %), whereas it is absent in differentiated thyroid cancers. Specifically,

99mTc-labelled minigastrin has shown a high

affinity for the CCK-2/gastrin-receptors in vivo [1,27,28]. Approximately 13 different peptides labelled with

99mTc or

111In have been recently reported to target CCK-B receptors

[14].

1.4 Peptide Ligands for Integrin v 3: Markers of Tumour Angiogenesis

“Angiogenesis represents the formation of new capilla-ries by cellular outgrowth from existing microvessels” [29]. Integrins are cell-adhesion receptors able to convert extra-cellular ligand binding into activation of intracellular pro-cesses (outside-in signalling) as well as employing intra-cellular processes to activate cellular responses (inside-out signalling). The alpha(v)beta(3) ( v 3) integrin is involved in tumour induced angiogenesis and tumour metastasis. The high binding specificity to v 3 integrins of peptides containing Arg-Gly-Asp (RGD) residues has been used to radiolabel RGD peptides useful as tumour specific imaging agents.

A considerable number of synthetic peptides containing RGD have been developed. It has been found that constraining the RGD mobility in a cyclised pentapeptide increased the potency in vitro. These data suggest that the binding site in the v 3 receptor is limited.

Monomeric c-RGDyV (cyclic-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Val) peptide was first labelled in 1999 by Haubner et al. with

125I

[30]. This relatively lipophilic compound had rapid tumour washout and unfavourable hepatobiliary excretion. The resulting high liver and intestinal activity accumulation limited its further application. Glycosylation of the RGD peptide decreased the lipophilicity and, consequently, the hepatic uptake [31]. The same glycopeptides was then labelled with

18F [32-33].

The peptide ligands for v 3 receptors mostly used in the labelling with

99mTc,

18F or

68Ga are c-RGDyK and c-RGDfK

(cyclic-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) in both forms, as mono-mers or as dimers [34-40]. In these peptides the lysine side chain provides primary amine functionality for coupling bifunctional chelating agents. To improve targeting effi-ciency multimeric RGD systems have been design and more than 30 RGD derivatives labelled with

18F,

64Cu,

68Ga or

99mTc have been developed [14, 41-43]. It is important to

mention that RGD peptides do not belong to the regulatory peptide family, but are important since they can target neoangiogenic vessels through integrin receptors.

1.5 Peptide Ligands for Neurotensin Receptors

Neurotensin (NT) is a 14 amino acid linear peptide that is found in high concentration in the ileum and hypothalamus, and induces various physiologic effects such as hypotension, analgesia, gut contraction, and an increase of vascular permeability. Receptors of neurotensin are expressed in

pancreatic and prostate cancer [1, 44]. 99m

Tc-labelled neuro-peptide-Y (NPY) analogues are also useful for detecting sarcomas [45, 46].

Another receptors such as melanocortin-1 (MC1R), vasointestinal peptide (VPAC-1), glucagon-like-peptide-1 (GLP-1) and chemokine 4 (CXCR4) have also been targeted in vivo with radiolabelled peptides and recently discussed [14, 43].

1.6 Tat Penetrating Peptides

Targeted entry into cells is an increasingly important research area. Diagnoses and treatment of disease by novel methods would be greatly enhanced by efficiently transpor-ting materials to living cell nuclei. Penetrating peptides (PPs) are attractive drug delivery tools. The PPs used in molecular imaging are mainly based on two peptides, HIV Tat peptide (TATp; RKKRRQRRR) and antennapedia homeodomain peptide (Antp or “penetrating”; RQIKIWFQNRRMKWKK) [47]. The HIV Tat-derived peptide is a small basic peptide called “trojan horse” because it has been successfully used to deliver a large variety of cargoes into cells such as nanoparticles, proteins, peptides and nucleic acids. The “transduction domain” or region conveying cell penetrating properties appears to be confined to a small stretch of basic amino acids with the sequence RKKRRQRRR and known as Tat(49-57) [47-50]. Hybrid radiopharmaceuticals, as for example

99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys

3-Bombesin, have dem-

onstrated a significant increasing cancer cell uptake and consequently image contrast of breast cancer tumours [51]. Tat peptides do not belong to the regulatory peptide family.

2. PEPTIDES FOR OPTICAL IMAGING

Nuclear imaging is limited by several factors such as time consuming data acquisition, expensive equipment, exposure to radioactivity, the need for highly skilled person-nel [5]. Optical imaging offers real-time, nonradioactive, and, depending on the technique, high-resolution imaging of fluorophores embedded in diseased tissues [52]. Of the various optical imaging techniques investigated to date, near-infrared (NIR, 700-1000 nm wavelength) fluorescence-based imaging is of particular interest for non-invasive in vivoimaging because of the relatively low tissue absorption, scatter, and minimal autofluorescence of NIR light [53]. This is because haemoglobin (the primary absorber of visible light), water and lipids (the primary absorbers of infrared light) have their lowest absorption coefficients in the NIR region [54,55]. Deeper tissue areas are thus accessible for tomographic display of the optical signals. Advanced fluore-scence imaging techniques, such as fluorescence molecular tomography (FMT) [56-63] and fluorescence reflectance imaging (FRI) [64-66], commonly employ NIR wavelengths for in vivo molecular imaging applications. Fluorescence imaging methods are generally superior in terms of sensitivity and ease of use [54]. However, NIR fluorescence imaging in small animals cannot be directly scaled up to invivo imaging in patients due to the limited optical signal penetration depth ( 7 mm by fluorescence resonance imag-ing and 20 cm by fluorescence molecular tomography) [54]. In clinical settings, fluorescence imaging is relevant for


1.1 Somatostatin Analogues

Somatostatin is a cyclic peptide comprised of 14 amino acids and plays an important role in the secretion of hormones, such as growth hormone, insulin and glucagon. It is now recognized that there are five somatostatin receptor subtypes. Octreotide (OC) was developed as a somatostatin analogue for hypersecretion suppression to control the symptoms of neuroendocrine diseases. OC contains eight amino acids retaining an internal disulfide crosslink to constrain the geometry of the four essential amino acids, and is stable against enzymatic degradation in vivo. Pituitary adenomas and several neuroendocrine, tumours over-express somatostatin receptors such as: carcinoid, pancreas, pheo-chromocytomas, medullary thyroid carcinoma, paragan-gliomas, gastrinoma, glucagonoma, neuroblastoma, menin-gioma, insulinoma and small cell lung cancer. In somato-statin-based cancer imaging, a stable somatostatin analogue is linked to a bifunctional chelating agent that can bind radioactive elements such as,

111In and

99mTc for SPECT or

18F and

68Ga for PET. Radiolabelled Tyr

3-OC (TOC) is

currently used in the clinical practice as a stable complex to detect neuroendocrine tumours by molecular imaging in nuclear medicine [6-10].

99mTc-Depreotide, a radiolabelled

OC analogue developed in 1996 by Pearson et al. [11], has been recently approved for human use in USA and Europe because of its successful results in the diagnosis of solitary pulmonary nodules [12, 13]. A detailed list of 145 peptides labelled with

99mTc,

18F,

68Ga,

111In,

64Cu or

86Y (29 to target

somatostatin receptors) already investigated in clinical studies and those developed during the last five years (agonist and antagonist) has been recently reviewed [1,14].

1.2 Bombesin/Gastrin-Releasing Peptide Analogues

The small peptide bombesin (BN, 14 amino acids) was isolated from frog skin and it belongs to a large group of neuropeptides with many biological functions. The human equivalent is the gastrin-releasing peptide (GRP, 27 amino acids) and its receptors (GRP-r) are over-expressed in the tumour cell membrane. GRP differs from bombesin in only one of the 10 carboxy-terminal residues and this explains the similar biological activity of the two peptides. The strong, specific BN-GRP-r binding is the basis for labelling BN with radionuclides such as

68Ga,

64Cu,

18F and

99mTc for nuclear

imaging [15-22]. BN receptor subtype 2 (GRP receptor) is over-expressed in various human tumours including breast, prostate, small cell lung and pancreatic cancer, Fig. (1) [23-25]. Approximately 30 different radiolabelled peptides (agonist or antagonist) to target GRP-R have been recently reviewed [1,14,26].

1.3 Peptide Ligands for Cholecystokinin (CCK) and Gastrin receptors

Cholecystokinin (CCK) and gastrin act as neurotrans-mitters in the central nervous system, as regulators of various functions in the gastrointestinal tract, and as stimulatory

Fig. (1). Schematic illustration of the multiple modalities for in vivo target-specific cancer imaging with peptides conjugated to quatum dots,

metallic nanoparticles, near-infrared fluorochromes or radionuclides.

Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, 10, 87-97 87

1389-5575/10 $55.00+.00 © 2010 Bentham Science Publishers Ltd.

Peptides for In Vivo Target-Specific Cancer Imaging

G. Ferro-Flores*,1

, F. de M. Ramírez2, L. Meléndez-Alafort

3 and C.L. Santos-Cuevas

1,4

1Department of Radioactive Materials. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Estado de México, Mexico

2Department of Chemistry. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Estado de México, Mexico

3Deparment of Pharmaceutical Science, Facoltà di Farmacia, Università di Padova, Italy

4Faculty of Medicine, Universidad Autónoma del Estado de México, Mexico

Abstract: Molecular imaging comprises non-invasive monitoring of functional and spatiotemporal processes at molecular

and cellular levels in living systems. Advanced imaging techniques can monitor such processes. Peptide receptors over-

expressed in tumours can be targeted by peptides conjugated to radionuclides, near-infrared fluorochromes, metallic

nanoparticles or quantum dots for target-specific cancer imaging.

Key Words: Peptides, molecular imaging, quantum-dots, nanoparticles.

INTRODUCTION

Regulatory peptide analogues represent a class of molecules developed for specific cancer targeting. In spite of having a relatively short history of about 2 decades, they are now receiving increasing interest, as they often are advan-tageously compared with immunotargeting using antibodies [1]. These peptides control and modulate the function of almost all key organs and metabolic processes and include neuropeptides which are present in the brain, gut peptide hormones, as well as peptides present in vascular (vasoactive peptides) and endocrine systems [2].

Regulatory peptide-receptors are proteins over-expressed in numerous human cancer cells. These receptors have been used as molecular targets for labelled peptides to localize tumours. The useful clinical results achieved during the last decade with somatostatin receptor-expressing neuroendo-crine tumour imaging, have been useful for the study of other peptides to target alternative cancer-associated peptide receptors such as gastrin-releasing peptide, cholecystokinin, peptide ligands for integrin receptors or neurotensin. The improvement of peptide analogues allows specific clinical imaging and therapy of different tumour types, including breast, prostate, lung, intestine, pancreas and brain tumours [1,3,4]. Therefore, specific cancer targeting through selective peptides for diagnostic and therapeutic purposes is consi-dered to be a promising strategy in oncology.

Molecular imaging comprises non-invasive monitoring of functional and spatiotemporal processes at molecular and cellular levels in humans and other living systems. Imaging techniques such as magnetic resonance imaging (MRI), single photon emission computed tomography (SPECT),

*Address correspondence to this author at the Departamento de Materiales

Radiactivos, Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Carretera

México-Toluca S/N., La Marquesa, Ocoyoacac, Estado de México, C.P.

52750, México, Tel: + (52) (55)-53297200 ext. 3863; Fax. + (52) (55)-

53297306; E-mail: [email protected],

[email protected]

positron emission tomography (PET) and optical fluore-scence imaging (OI) have been used to monitor such processes. The present review affords an overview of the most outstanding in vivo peptides for cancer imaging using the different medical diagnostic techniques such as those mentioned above, which rely mostly on the use of radio-peptides and peptides conjugated to near-infrared fluorochro-mes, metallic nanoparticles or quantum dots (nanocrystals).

1. COMMON PEPTIDES USED AS RADIOLABELLED DIAGNOSTIC AGENTS

The term molecular imaging implies the in vivo charac-terization and measurement of biologic processes at cellular and molecular levels. In contrast to conventional diagnostic imaging, endeavours to probe the molecular abnormalities that are the basis of disease rather than to image the end effects of these molecular alterations [5].

Molecular biology, cell biology and imaging technology gave birth to molecular imaging as it is today. Three diffe-rent non-invasive in vivo imaging technologies have been developed in parallel (MRI, OI, Nuclear Imaging), and peptide-specific targeting of a particular cell receptor can be imaged with a paramagnetic, fluorescent, or radionuclide-labelled probe. The convergence of these disciplines is the key of the molecular imaging success story and constitutes the source for further advances in the field.

Nuclear imaging is an established clinical molecular imaging modality that offers good sensitivity deep in tissue. Radiolabelled peptides (for PET and SPECT imaging) pro-duce signals constantly through the decay of a radionuclide, whereas some probes produce signals only when they interact with its target (e.g., near-infrared fluorescent probes for optical imaging). Most radiolabelled peptides are administered at doses free of pharmacologic side effects (nonpharmacological nanogram levels) as compared with peptides for MRI and optical techniques that are usually dosed in mass levels (typically micrograms to milligrams).

23 Lundqvist H, Stenerlow B, Gedda L. The Auger effect in molecular targetingtherapy. In: Stigbrand T, Carlsson J, Adams GP, editors. Targetedradionuclide tumor therapy. 1st ed. New York: Springer; 2008. pp. 195–214.

24 Tavares AAS, Tavares JMRS. Evaluating 99mTc Auger electrons for targetedtumor radiotherapy by computational methods. Med Phys 2010; 37:3551–3560.

25 Rupnow BA, Knox SJ. The role of radiation-induced apoptosis as a determinantof tumor responses to radiation therapy. Apoptosis 1999; 4:115–143.

26 Friesen C, Lubatschofski A, Kotzerke J, Buchmann I, Reske SN, Debatin KM.Beta-irradiation used for systemic radioimmunotherapy induces apoptosisand activates apoptosis pathways in leukaemia cells. Eur J Nucl Med Mol

Imaging 2003; 30:1251–1261.27 Urashima T, Nagasawa H, Wang K, Adelstein S, Little J, Kassis A. Induction

of apoptosis in human tumor cells after exposure to Auger electrons:comparison with gamma-ray exposure. Nucl Med Biol 2006; 33:1055–1063.

28 Kassis A. Cancer therapy with auger electrons: are we almost there? J Nucl

Med 2003; 44:1479–1481.29 Chen P, Wang J, Hope K, Jin L, Dick J, Cameron R, et al. Nuclear localizing

sequence promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of theAnti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labelled with 111In in humanmyeloid leukemia cells. J Nucl Med 2006; 47:827–836.

30 Costantini DL, Chan C, Cai C, Vallis KA, Reilly RM. 111In-labelledtrastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences

(NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. J Nucl Med 2007; 48:1357–1368.

31 Ginj M, Hinni K, Tschumi S, Schulz S, Maecke HR. Trifunctional

somatostatin-based derivatives designed for targeted radiotherapy usingAuger electron emitters. J Nucl Med 2005; 46:2097–2103.

32 Costantini DL, Bateman K, McLarty K, Vallis KA, Reilly RM. Trastuzumab-

resistant breast cancer cells remain sensitive to the Auger electron-emittingradiotherapeutic agent 111In-NLS-trastuzumab and are radiosensitized bymethotrexate. J Nucl Med 2008; 49:1498–1505.

33 Schally AV, Nagy A. Cancer chemotherapy based on targeting of cytotoxic

peptide conjugates to their receptors on tumors. Eur J Endocrinol 1999;141:1–14.

34 Buchholz S, Keller G, Schally AV, Halmos G, Hohla F, Heinrich E,

et al. Therapy of ovarian cancers with targeted cytotoxic analogs ofbombesin, somatostatin, and luteinizing hormone-releasing hormoneand their combinations. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103:10403–10407.

35 Ziegler CG, Brown JW, Schally AV, Erler A, Gebauer L, Treszl A, et al.

Expression of neuropeptide hormone receptors in human adrenal tumorsand cell lines: antiproliferative effects of peptide analogues. Proc Natl Acad

Sci U S A 2009; 106:15879–15884.

99mTc-Tat-BN: dosimetry and effect on DNA Santos-Cuevas et al. 313

Copyright © Lippincott Williams & Wilkins. Unauthorized reproduction of this article is prohibited.

all of which remains in the membrane [7]. Biodistribu-

tion studies in mice with PC3 tumours showed that the

tumour-to-muscle radioactivity ratio was 8.5 for 99mTc-

Tat-BN and 7 for 99mTc-BN [7]. It has been calculated

that the nuclear-absorbed dose from 99mTc-BN located in

the MCF7 membrane is 0.09Gy/Bq (data not published)

and, therefore, is approximately two orders of magnitude

lower than that of 99mTc-Tat-BN (8.19Gy/Bq) interna-

lized in the cell nucleus.

NLS peptides have been successfully used to route

different molecules to the cell nucleus [29–32]. It has

been shown that NLS conjugation to 111In-HuM195

(anti-CD33) and 111In-trastuzumab (anti-HER2) anti-

bodies considerably increases their nuclear uptake in

leukaemia and breast cancer cells, enhancing their

toxicity [29,30]. It is possible that in all of these hybrid

radiopharmaceuticals, the positive charges of Tat (49-57)

or of any NLS peptide generate an electrostatic interac-

tion with the negatively charged DNA, producing cell

toxicity from a biological Auger effect and not only from

a simple increase in the macroscopic absorbed dose. It

is important to point out that an advantage of 99mTc

(T1/2=6h) with respect to 111In (T1/2=67h) is its

shorter half-life; 99mTc is able to produce a higher number

of disintegrations in a few hours and reach higher

absorbed doses per unit of time.

The 99mTc-Tat-BN hybrid radiopharmaceutical could be

used in targeted radiotherapy as part of a combined

therapy scheme. Multidrug resistance (MDR) in cancer

cells is the simultaneous development of resistance to a

variety of antitumour agents; one MDR mechanism of

action is the increased efflux of chemotherapeutic agents

by transport proteins. The expression of breast cancer

resistance protein mediates this drug efflux-type of MDR

[33]. Cytotoxic analogues of bombesin in combina-

tion with other peptides have been successfully used

to inhibit cancer cell proliferation in MDR cancer cells

[33–35]. As an example of combined therapy, Costantini

et al. [30] have shown that 111In-NLS-trastuzumab can

kill trastuzumab-resistant breast cancer cell lines through

the emission of Auger electrons in combination with

methotrexate for cell radiosensitization.

ConclusionThe presence of Tat(49-57) in 99mTc-Tat-BN efficiently

routed radiopharmaceuticals to the nuclei of PC-3 cells

and breast carcinoma cell lines, MDA-MB231 and MCF7,

in which the nanometre-to-micrometre range Auger and

IC electrons significantly reduced the cellular prolifera-

tion when depositing from 0.142 to 0.434mGy/decay.

The hybrid could be potentially useful in breast and

prostate cancer therapy as part of a combined therapy

scheme.

AcknowledgementThis study was supported by the National Council of Science

and Technology (CONACyT-SALUD-69051-Mexico).

References1 Sharkey RM, Goldenberg DM. Novel radioimmunopharmaceuticals for

cancer imaging and therapy. Curr Opin Investig Drugs 2008; 9:1302–1316.

2 Buchegger F, Perillo-Adamer F, Dupertuis YM, Bischof A. Auger radiationtargeted into DNA: a therapy perspective. Eur J Nucl Med Mol Imaging

2006; 33:1352–1363.

3 Howell R. Radiation spectra for Auger-electron emitting radionuclides:report 2 of AAPM nuclear medicine task group no. 6. Med Phys 1992;19:1371–1383.

4 Reubi JC,Waser B. Concomitant expression of several peptide receptors inneuroendocrine tumours: molecular basis for in vivo multireceptor tumourtargeting. Eur J Nucl Med 2003; 30:781–793.

5 Baidoo KE, Lin KS, Zhan Y, Finley P, Scheffel U, Wagner HN. Design,synthesis, and initial evaluation of high-affinity technetium bombesinanalogues. Bioconjugate Chem 1998; 9:218–225.

6 Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Rodriguez-Cortes J, Pedraza-Lopez M,Ramirez-Iglesias MT. Preparation and evaluation of 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin for imaging gastrin-releasing peptide receptor-positivetumours. Nucl Med Commun 2006; 27:371–376.

7 Santos-Cuevas CL, Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy CA, Ramirez F de M,Luna-Gutierrez MA, Pedraza-Lopez M, et al. Design, preparation, in vitro andin vivo evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-bombesin: a target-specifichybrid radiopharmaceutical. Int J Pharm 2009; 375:75–83.

8 Santos-Cuevas CL, Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Pichardo-Romero P.Targeted imaging of gastrin-releasing peptide receptors with 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin: biokinetics and dosimetry in women. Nucl Med

Commun 2008; 29:741–747.

9 Garcia-Garayo E, Ruegg D, Blauenstein P, Zwimpfer M, Khan IU, Maes V,et al. Chemical and biological characterization of new Re(CO)3/[99mTc](CO)3 bombesin analogues. Nucl Med Biol 2007; 34:17–28.

10 Koumarianou E, Mikołajczak R, Pawlak D, Zikos X, Bouziotis P, Garnuszek P,et al. Comparative study on DOTA-derivatized bombesin analog labelledwith 90Y and 177Lu: in vitro and in vivo evaluation. Nucl Med Biol 2009;36:591–603.

11 Linder KE, Metcalfe E, Arunachalam T, Chen J, Eaton SM, Feng W, et al.In vitro and in vivo metabolism of Lu-AMBA, a GRP-receptor bindingcompound, and the synthesis and characterization of its metabolites.Bioconjugate Chem 2009; 20:1171–1178.

12 Cornelissen B, McLarty K, Kersemans V, Scollard D, Reilly R. Properties of[111In]-labelled HIV-1 tat peptide radioimmunoconjugates in tumor-bearingmice following intravenous or intratumoral injection. Nucl Med Biol 2008;35:101–110.

13 Costantini DL, Hu M, Reilly R. Peptide motifs for insertion of radiolabeledbiomolecules into cells and routing to the nucleus for cancer imaging orradiotherapeutic applications. Cancer Biother Radiopharm 2008; 23:3–23.

14 Stabin MG, Sparks RB, Crowe E. OLINDA/EXM: The second-generationpersonal computer software for internal dose assessment in nuclearmedicine. J Nucl Med 2005; 46:1023–1027.

15 Garcia-Ferreiro RE, Kerschensteiner D, Major F, Monje F, Stumer W, PardoLA. Mechanism of block of hEag1 K+ channels by imipramine andastemizole. J Gen Physiol 2004; 124:301–317.

16 ICRU 44, 1989. Tissue substitutes in radiation dosimetry and measurement.ICRU Report 44- International Commission on Radiation Units andMeasurements.

17 Rodwell V. Organic chemistry: the elemental basis of life. New York: JohnWiley & Sons Inc.; 1979.

18 Halmos G, Wittliff JL, Schally AV. Characterization of bombesin/gastrinreleasing peptide receptors in human breast cancer and their relationship tosteroid receptor expression. Cancer Res 1995; 55:280–287.

19 La Bella R, Garcia-Garayoa E, Langer M, Blauenstein P, Beck-Sickinger AG,Schubiger PA. In vitro and in vivo evaluation of a 99mTc (I)-labelled bombesinanalogue for imaging of gastrin releasing peptide receptor-positve tumors.Nucl Med Biol 2002; 29:553–560.

20 Bettaccini AA, Baj A, Accolla RS, Basolo F, Toniolo AQ. Proliferative activityof extracellular HIV-1 tat protein in human epithelial cells: expression profileof pathogenetically relevant genes. BMC Microbiology 2005; 5:20.doi:10.1186/1471-2180-5-20.

21 Emfietzoglou D, Kostarelos K, Hadjidoukas P. Subcellular S-factors for low-energy electrons: A comparison of Monte Carlo simulations and continous-slowing-down calculations. Int J Rad Biol 2008; 84:1034–1044.

22 Torres GE, Carrillo CT. Specific energy from Auger and conversion electronsof 131I, 188Re-anti-CD20 to a lymphocyte’s nucleus. Rad Eff Def Solids

2010 doi: 10.1080/10420150.2010.488692.

312 Nuclear Medicine Communications 2011, Vol 32 No 4


The results presented herein show that 99mTc-Tat-BN

was internalized in cancer cells with specific recognition

for GRP-r. In general, immunohistochemical analyses

showed an increased Tat-BN abundance in the nucleus,

an event that was associated with the inhibition of cellu-

lar proliferation, mainly as a result of Auger and low-

energy IC electrons from 99mTc-Tat-BN inside the nuclei.

The biological effect of Auger and low-energy IC elect-

rons is not the only therapeutic property possible for99mTc-Tat-BN because the cellular radiation dose can also

damage membranes and organelles and initiate signalling

of apoptotic pathways within the cells [25,26]. The CD95

ligand is a member of the family of Tumour necrosis

factor-related cytokines and is found in both soluble and

membrane-bound forms. A number of studies have shown

that activation of the death receptor CD95 system

induces apoptosis. Friesen et al. [26] reported that after

irradiation of leukaemia cells, upregulation of the CD95

ligand and the CD95 receptor was detected, along

with the consequent activation of caspases. In addition,

irradiation-mediated mitochondrial damage resulted in

the perturbation of the mitochondrial membrane poten-

tial, cytochrome c release and caspase-9 activation. It has

also been shown that the incorporation of 125I (24.9 Auger

electrons/decay) into the DNA induces apoptosis through

caspase 3 [27]. The bystander effect of radiation also plays

an important role in Auger-targeted radiotherapy [28].

It is noteworthy to mention that the proliferation assay

using DNA provides an accurate indication of the relative

cell number, but may reflect both cell cycle arrest and

apoptosis; therefore, the evaluation of a proapoptotic

effect of 99mTc-Tat-BN and Tat-BN should be taken into

account and deserves further investigation.

Earlier, we have shown that the conjugation of 99mTc-BN

with Tat peptide produces a significant increase in can-

cer cell internalization, compared with 99mTc-BN, nearly

Fig. 5

150MDA-MB231

100

50

0

∗

∗ ∗

80

MCF7

40

0

DN

A c

oncentr

ation (

ng

/ml)

∗∗

∗

60

PC3

30

0

Untreated 2.5 µmol/l 1.3 µmol/l 2.0 µmol/l

Tat-BNAstemizolecells

5.4 MBq 8.1 MBq

∗

∗∗

99mTc-Tat-BN

Effect of Tat-BN and 99mTc-Tat-BN on cancer cell proliferation. Proliferation is correlated directly with DNA concentration (ng/ml). 99mTc-Tat-BNsignificantly inhibited cell proliferation. *Statistically significant difference (P<0.05) vs. control (untreated cells)



The Tat mitogenic activity could also explain the lower

DNA concentration obtained with astemizole (inhibitor

of the cellular proliferation process) compared with that

of 99mTc-Tat-BN in PC-3 and MDA-MB231 cells.

However, the proliferation in MCF7 cells was similar

with 99mTc-Tat-BN and with astemizole treatment.

These data correlate well with the kinetic and absorbance

dose results, which indicate that a higher number of

disintegrations, and therefore a higher absorbed dose,

occur in the MCF7 nucleus (Table 4).

DiscussionAbsorbed doses at the subcellular level using Monte Carlo

methods have been reported earlier. However, spherical

cell models with a radius of 1–10 mm were assumed

[21,22]. Cancer cell geometries and sizes are quite differ-

ent from ideal spheres (Table 1, Figs 2–4), and geo-

metry and size are considered critical factors for assessing

the IC absorbed-energy fraction over nuclear dimensions.

The consideration of radiopharmaceutical subcellular kine-

tics from the experimental data is also a critical factor to

improve accuracy in cellular radiation-absorbed dose cal-

culations. Although dimensions of cancer cells in vivo are

expected to be somewhat smaller than in vitro, the kine-

tics of nuclear internalization are expected to be the same.

Low-energy Auger electrons have traditionally been

considered to be the most suitable particles for the

inactivation of single-spread malignant cells. However, in

the case of 99mTc, IC electrons emitted with the highest

yield per decay (99.9–88%) and the lowest energy (i.e.

1.82 keV), deposited, on average, 13.66% of their energy

over the nuclear dimensions (ellipsoids from 23� 17–

16� 11 mm) and were the principal contributors to the

nuclear-absorbed dose (70.26%). Therefore, these parti-

cles (IC) could be extremely radiotoxic if they were able

to contact DNA. Lundqvist et al. [23] have shown that

it is important to distinguish between what might be a

normal increased cellular dose and the biological Auger

effect. Electron energies close to the ionization potential

(< 30 eV) will only have a marginal biological effect, and

electrons above 5 keV will not contribute to the local

effect. For example, an Auger electron with an energy of

approximately 20 keV is ideal for full deposition within

the size of a mammalian cell, but it will be far from

the DNA and will not have the local DNA impact that

is usually associated with the biological Auger effect,

which occurs within cubic nanometres. Recently, Tavares

and Tavares [24] calculated that 99mTc CKMMX [all

M-shell Coster–Kronig (CK) and super CK transitions,

where one of the two new vacancies (X) is in the M-shell]

electrons and Auger MXY [all M-shell Auger transitions,

where neither of the two new vacancies (X, Y) is in the

M-shell] near the DNA have a therapeutic potential

comparable to 211At a particles (high linear energy

transfer).

Fig. 4

Tat-BNis not observedin the nucleus

Tat-BNis observed inthe nucleus

CF

20 µm

CF

20 µm

20 µm

E

20 µm

E

(a)

(b)

Immunohistochemical analysis of Tat-BN in MDA-MB231 cells. (a) Control: without Tat-BN and anti-Tat, followed by fluorescence-labelled secondantibody anti-Tat. (b) Cells incubated with Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody anti-Tat. CF: phase contrast image,E: cell excitation at l=488nm. Tat-BN was located in the nucleus of cancer cells, as indicated by arrows.



unit (1 Bq) captured by the cell (Gy/Bq) was calculated

as a sum of dose contribution from membrane activity to

nucleus (N’M), and dose from cytoplasm to nucleus

(N’C), and dose from nucleus to nucleus (N’N). For

example, in MCF7, the dose contribution from mem-

brane activity to the nucleus was 0.0155±0.0005Gy/Bq;

the dose from cytoplasm to the nucleus was 0.0447

±0.0011Gy/Bq and the dose from the nucleus to the

nucleus was 8.1315±0.0168Gy/Bq, so that the total dose to

the MCF7 nucleus was 8.1918±0.0185Gy per cell-bound

activity unit (1 Bq). 99mTc-Tat-BN-absorbed doses in the

cytoplasm and nucleus of PC-3, MCF7 and MDA-MB231

cells are shown in Table 4. It is important to mention

that, in general, a 2Gy acute dose will kill 50% of an in-

vitro cell sample but a 100Gy acute dose is necessary to

kill all of them. The IC electrons of 99mTc deposited

13.66±0.29% of their emitted energies, whereas Auger

electrons deposited 99.61± 0.24% of their emitted

energies over the cell nucleus dimensions. Nevertheless,

in all cases, the average contribution to the total absorbed

dose in the cell nuclei was 70.26±0.36% of IC electrons

and 29.23±0.55% of Auger electrons because of the low

Auger energy and yield per decay. These results mean

that, for example, in PC3 cells (total nucleus absorbed

dose=2.49Gy/Bq), the nuclear-absorbed dose by Auger

contribution is 0.73Gy/Bq, whereas the nuclear-absorbed

dose by IC contribution is 1.75Gy/Bq. Although the main

absorbed dose is from IC electrons, the DNA damage

probability is higher from Auger electrons (discussed

below).

The effects of 99mTc-Tat-BN on cellular proliferation at

different concentrations (5.4 or 8.1MBq) were tested on

cancer cells (Fig. 5). As shown in Fig. 5, 99mTc-Tat -BN

(5.4MBq) significantly inhibited cell proliferation on

MDA-MB231 (35.80%), MCF7 (45.71%) and PC-3

(52.98%) with respect to that of untreated cells (P<

0.05). However, in the presence of 1.3 and 2.0mmol/l of

Tat-BN cell growth was observed in cells because of the

well-known mitogenic activity of Tat [20] and this may be

the reason by which apparently 8.1MBq (2.0 mmol/l Tat)

of 99mTc is not more effective than 5.4MBq (1.3 mmol/l

Tat) in reducing DNA concentration. Nevertheless, it can

be deduced that in the 99mTc-Tat-BN radiopharmaceu-

tical, the antiproliferative effect of 99mTc (Auger and IC

electrons) prevails over the Tat mitogenic effect (Fig. 5).

Fig. 3



CF

20 µm

CF

20 µm

20 µm

E

20 µm

E

(a)

(b)

Immunohistochemical analysis of Tat-BN in MCF7 cells. (a) Control: without Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody-anti-Tat. (b) Cells incubated with Tat-BN plus anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody anti-Tat. CF: phase contrast image, E: cellexcitation at l=488nm. Tat-BN was located in the nucleus of cancer cells, as indicated by arrows.



Table 4 Total disintegrations and mean absorbed doses in cancer cells per cell-bound activity unit (Bq) for 99mTc-Tat-BN obtained fromexperimental biokinetic data and Monte Carlo simulation (Penelope, 2008)

N=Total disintegrations per Bq

N ¼

Z

t

0

AðtÞdt

0

@

1

A

Absorbed dose (Gy/Bq)

Cell line Membrane Cytoplasm Nucleus Cytoplasm Nucleus

PC3 3229 8766 17826 0.2389±0.0009 2.4973±0.0058MCF7 5338 6826 19 151 0.4309±0.0018 8.1918±0.0185MDA-MB231 4810 13380 12880 0.4688±0.0014 3.5437±0.0088

Fig. 2



CF

20 µm

CF

20 µm

20 µm

E

20 µm

E

(a)

(b)

Immunohistochemical analysis of Tat-BN in PC3 cells. (a) Control: without Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody-anti-Tat. (b) Cells incubated with Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody-anti-Tat. CF: phase contrast image, E: cellexcitation at l=488 nm. Tat-BN was located in the nucleus of cancer cells, as indicated by arrows.

Table 3 Biokinetic model of 99mTc-Tat-BN internalized in cancer cells

A(t) =Activity as a function of time

Cell line Membrane Cytoplasm Nucleus

PC3 41:4e� 0:847t þ 8:63e� 0:850t þ 1:31e� 0:0427t

R2 ¼ 0:956

� 45:5e� 0:579t þ 31:4e� 0:137t þ 27:4e� 0:295t

R2 ¼ 0:998

� 91:8e� 0:628t þ 54:4e� 0:123t þ 63:9e� 0:321t

R2 ¼ 0:994

MCF7 63:8e� 1:1t þ 4:02e� 0:075t þ 2:74e� 0:0747t

R2 ¼ 0:987

� 60e� 0:508t þ 8:65e� 0:0871t þ 59:4e� 0:285t

R2 ¼ 0:998

� 103e� 0:630t þ 45:9e� 0:103t þ 81:7e� 0:327t

R2 ¼ 0:990

MDA-MB231 � 19:8e� 2:31t þ 6:83e� 0:0948t þ 19:4e� 0:277t

R2 ¼ 1

1:82e� 0:353t þ 25:7e� 0:0847t þ 5:35e� 0:0848t

R2 ¼ 0:976

� 188e� 6:83t þ 41:8e� 0:183t þ 12:3e� 0:0784t

R2 ¼ 1



The absorbance of the wells was measured in a micro-

plate reader (Bio-Tek, Sinergy HT, Nova Biotech, El

Cajon, California, USA). Finally, the well absorbances

were correlated with DNA concentrations (ng/ml) using

the standard curve.

Subcellular dosimetry

The radiation-absorbed doses delivered to the nucleus of

PC3, MCF7 and MDA cells from 99mTc-Tat-BN were esti-

mated by Monte Carlo methodology using the Penmain

programme of Penelope 2008 code. The geometry and

size of the cells and nuclei were built from cell immuno-

fluorescent images (n=50), and the average dimen-

sions were determined using the Zeiss LSM Image

Examiner Software (Carl Zeiss AG, Jena, Germany).

The volumes of the subcellular compartments were cal-

culated (Table 1), and the elemental compositions of the

membrane, cytoplasm and nucleus were obtained from

the literature [16,17]. In the source simulation, all

emission of IC and Auger electrons (including Coster–

Kronig and super Coster–Kronig) of 99mTc spectrum

presented in the Auger Electron Dosimetry AAPM Report

were used [3]. The deposited energy (MeV) per dis-

integration and per gram of cell nucleus was converted to

grays (J/kg)/disintegration, and the nucleus absorbed

doses for 99mTc-labelled Tat-BN were calculated by

multiplying the grays/disintegration by the total number

of disintegrations (N) that occurred in the nucleus per

internalized radioactivity unit (becquerel), based on the

experimental biokinetic results described above. Con-

tributions to nuclear-absorbed doses from 99mTc-labelled

Tat-BN localized in membrane and cytoplasm were also

calculated to obtain the total nucleus absorbed dose per

internalized becquerel (Gy/Bq).

ResultsThe radiochemical purity of 99mTc-Tat-BN was 94±2%,

as obtained with good correlation by ITLC, Sep-Pak

and HPLC analysis without postlabelling purification

(n>30). 99mTc-Tartrate determined by ITLC was less

than 2%. The average specific activity was 14MBq/nmol.

As can be seen in Table 2, 99mTc-Tat-BN was internalized

with specific recognition for GRP-r that are overexpressed

in PC3, MCF7 and MDA-MB-MB231 cancer cells

because there were significant differences in the percen-

tage of internalization between blocked and unblocked

cells (P<0.05). Although MCF7 and MDA-MB231 are

both breast cancer cell lines, the difference in cell

internalization can be related to the fact that MCF7 are

oestrogen-dependent and MDA-MB231 are oestrogen-

independent cell lines; it has been suggested that the

GRP-r expression is oestrogen-dependent in the early

stages of breast carcinoma [18].

In-vitro kinetics showed that 59.77, 61.15 and 41.45%

of total disintegrations per cell-bound 99mTc-Tat-BN acti-

vity unit (1 Bq) occurred in the nucleus of PC-3, MCF7,

and MDA-MB231 cells, respectively (Tables 3 and 4).99mTc-Tat-BN average residence times (N/Ao) in cell

nuclei were 4.95 h (PC-3), 5.31 h (MCF7) and 3.57 h in

MDA-MB231. The higher number of disintegrations that

occur in the MDA-MB231 cytoplasm with respect to that

of MCF7 cytoplasm (Table 4) could be associated with

the higher MDA-MB231 lysosomal activity because the

internalization process of the ligand/GRP-r complex in-

volves some trapping by lysosomes [19].

Confocal microscopy images seen in Figs 2–4 show that

Tat-BN is internalized in the nuclei of the three cancer

cell lines used in this study. In control images (without

Tat-BN), the fluorescence-labelled second antibody-anti-

Tat conjugate is internalized to the cytoplasm but not to

the nucleus. When the Tat-BN peptide was added and

followed by anti-Tat antibody and the second fluores-

cence-labelled antibody, fluorescence was observed in the

nuclei, showing Tat-BN nucleus internalization.

99mTc-Tat-BN-absorbed doses delivered to the nuclei

were 0.142mGy/disintegration (PC-3), 0.434mGy/disin-

tegration (MCF7) and 0.276mGy/disintegration (MDA-

MB231). The total nuclear absorbed dose per activity

Table 1 Geometry and volume of the cytoplasm and nuclei of PC3,MCF7 and MDA-MB231 cells

Volume (mm3)

Cell line Cytoplasm Nucleus Geometry

PC3(Average length 80�33 mm,depth 20 mm; nucleus23�17mm)

23 048 3568

MCF7(Average length56�22�49mm, depth14 mm; nucleus 16�11 mm)

10239 1112

MDA-MB231(Average length 66�32 mm,depth 17mm; nucleus18�14 mm)

16 114 1770

Table 2 Internalization of 99mTc-Tat-BN in unblocked and blockedcancer cells at 2 h (% of total activity± s.d.)

Internalization

Cell line Unblocked Blockeda

PC3 23.89±2.14* 2.15±0.18*MCF7 16.50±0.51* 1.48±0.17*MDA-MB231 12.65±0.78* 1.24±0.08*

s.d., standard deviation.aBlocked cells were incubated with an additional GRP-r blocking dose of Lys3-BN to determine the nonspecific binding of radioactivity.*Statistically significant difference (P<0.05) between blocked and unblocked.



Nuclear internalization of 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-

Lys3-BN99mTc-Tat-BN distribution in the cytoplasm and nucleus

was studied in PC3, MCF7 and MDA-MB231 cells. After

incubation of the cells with radiopharmaceuticals for 0.5,

1, 2, 4, 6 or 24 h, the nuclei and cytoplasm were separated

using a Nuclear Extraction Kit (Chemicon Internati-

onal Inc., California, USA) following the manufacturer’s

protocol. The cells were washed with 1ml of 0.2mol/l

acetic acid/0.5mol/l NaCl. The test tubes were centri-

fuged (250� g), washed with PBS and recentrifuged. The

pellet activity was measured in a crystal scintillation well-

type detector (g-counter) and considered to be 100% of

the internalized activity. The cell pellet was resuspended

with a cytoplasmic lysis buffer (with dithiothreitol and

protease inhibitor cocktail). The cell suspension was

drawn up and ejected out of a syringe with a small 27-

gauge needle to disrupt cell suspension. The suspension

was centrifuged at 8000� g for 20min at 41C, and the

supernatant containing the cytosolic portion of the cell

lysate was measured in a g-counter. The pellet containing

the nuclear portion of the cell lysate was resuspended in

the nuclear extraction buffer (with dithiothreitol and pro-

tease inhibitor cocktail), and after nuclear disruption, the

suspension was centrifuged at 16 000� g for 5min at 41C.

The supernatant was the nuclear extract; the membranes

remained in the pellet. The radioactivity in the nuclear

extract fraction and the pellet were measured in a g-

counter, and the percentage of activity in each subcellular

compartment at different times was calculated.

Biokinetic model

The activity percentages in the membrane, cytoplasm

and nucleus of cancer cells were used to derive 99mTc

time–activity curves for each subcellular compartment.

The OLINDA/EXM code allows the user to enter kinetic

data and fit it to one or more exponential terms [14].

Activity, as the number of disintegrations per unit time

and integrated over time, gives the total number of

disintegrations (N) in the membrane, cytoplasm or

nucleus expressed per unit of initial activity internalized

in the cancer cells (Eq. 1).

N ¼

Z

t

0

A0e� ltðtÞdt ð1Þ

Statistical analysis

Differences between the in-vitro cell data were evaluated

with the Student’s t-test.

In-vitro immunocytochemistry localization

of internalized Tat-BN

The PC3, MCF7 and MDA-MB231 cells (1� 105/well)

were grown at 371C, with 5% CO2 atmosphere and 100%

humidity in the RPMI medium supplemented with 10%

newborn calf serum and antibiotics (100 mg/ml strepto-

mycin) in glass well slides. The cells were incubated with

5ml of Tat-BN diluted with 1ml of the RPMI medium

for 1 h.

After treatment, the cells were immediately rinsed in ice-

cold PBS, fixed in 4% formaldehyde, permeabilized in

0.25% Triton X-100, and washed in PBS. After 30-min

incubation at room temperature in 1% bovine serum

albumin in PBS, the cells were incubated for 1 h at room

temperature with HIV Tat primary antibody (Abcam Inc.,

Cambridge, UK) and then with fluorophore-conjugated

secondary antibody (sheep immunoglobulin G secondary

antibody – heavy and light chains, (fluorescein isothio-

cyanate); Abcam Inc., UK). After primary and secondary

antibody labelling, the cells were rinsed with PBS before

mounting onto slides (ProLong Gold; Molecular Probes,

Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA).

The negative controls included non-Tat-BN-treated cells

and/or omission of primary antibodies.

Images in the three cell lines of immunofluorescently

labelled internalized Tat-BN were taken using a Zeiss

LSM510 META confocal microscope using a Plan-

Neofluar 40� /0.75Ph2 objective, a BP 500-530 IR filter

and a wavelength of 488 nm, 20%.

Effect of 99mTc-N2S2-Tat (49-57)-Lys3-BN on cellular

proliferation

The effect of 99mTc-Tat-BN on cellular proliferation was

evaluated using a CyQuant cell proliferation assay kit

(Molecular Probes, Invitrogen). The kit uses a proprietary

green fluorescent dye that exhibits strong fluorescence

enhancement when it is bound to cellular nucleic acids.

A reference standard curve was created for converting

fluorescence values into DNA content using bacterioph-

age l DNA and following the manufacturer’s protocol.

Approximately 1� 103 PC3, MCF7 or MDA-MB231 cells

were dispensed into wells (96-well culture plate). The

cells were cultured for 24 h, and the growth medium

was replaced with a fresh medium containing two dif-

ferent concentrations of Tat-BN (1.3 and 2.0 mmol/l) or99mTc-Tat-BN [14MBq/nmol, 1.3 mmol/l (3.6MBq) and

2.0 mmol/l (5.4MBq); n=6]. Negative and positive

controls included incubating cells in the growth medium

without any stimulus (untreated cells as negative control)

or with the antiproliferative agent, astemizole [15] at

2.5 mmol/l (positive control; n=6). The cells were cul-

tured for 6 days at 371C, and the growth medium with or

without the pharmaceuticals was replaced on day 3 using

a second stimulus dose of Tat-BN (1.3 and 2.0 mmol/l) or99mTc-Tat-BN (7MBq/nmol, 1.3 and 2.0 mmol/l). On day

6, the cells were frozen for 30min ( – 701C), thawed and

lysed by the addition of the buffer containing CyQuant

green fluorescent dye. Fluorescence was measured

directly at excitation/emission maxima of 480/520 nm.



solvent A for 3min, changed to 50% solvent A over 10min,

was maintained for 10min, changed to 30% solvent A over

3min and finally returned to 100% solvent A over 4min.

Using this system retention times for free 99mTcO4– and

99mTc-tartrate were 3–4 and 10–11min for 99mTc-Tat-BN.

In-vitro kinetic studies

Cell lines

The human prostate cancer cell PC-3 line and human

breast carcinoma cell lines MCF7 and MDA-MB231 were

originally obtained from American Type Culture Collec-

tion (USA). The cells were routinely grown at 371C, with

a 5% CO2 atmosphere and 100% humidity in a RPMI

medium supplemented with 10% newborn calf serum and

antibiotics (100 mg/ml streptomycin).

Internalization assay and nonspecific binding

The PC-3, MCF7 or MDA-MB231 cells supplied in

a fresh medium were diluted to 1� 106 cells/tube

(approximately 0.5ml) and incubated with approximately

3MBq of 99mTc-Tat-BN (10 ml, 0.3 nmol total peptide) in

triplicate at 371C for 2 h. The test tubes were centrifuged

(3min, 500� g) and washed twice with a phosphate-

buffered saline (PBS), and the activity of the cell pellet was

determined in a crystal scintillation well-type detector.

Radioactivity in the cell pellet represents both externalized

peptide (surface-bound) and internalized peptide (internal

membrane-bound radioactivity). An aliquot with the initial

activity was taken to represent 100%, and the cell uptake

activity with respect to this value was then calculated.

The externalized peptide activity was removed with 1ml

of 0.2mol/l acetic acid/0.5mol/l NaCl solution added

to the resuspended cell pellet. The test tubes were

centrifuged, washed with PBS, and recentrifuged, and the

remaining pellet activity was considered to be the

internalized peptide. Nonspecific binding was deter-

mined in parallel, using 0.04mmol/l Lys3-BN (Bachem)

and blocked receptor cells.

Fig. 1

99mTc-Tat(49-57)-Lys3-BN

H3N+

H3N+

+NH2

+NH2

+NH2

+NH2

+NH2

+NH2

NH2

NH2

Lys3-BN

NH2

NH

H2N

H2N

H2N

H2N

H2N

H2N

H2N

H2NH2N

HN HN

O

Tat (49-57) Spacer M = 99mTcChelating site (N2S2)

O

O O O

O

OO O

O

O N

O

O

O

S S

NO

O

OO

M

N

MAPO

O

O

O

O

O

OO O

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

OS

S

O

HN

HN

HN

HN

HN

HN

HN

HN

HN

HN

NH

NH

NH N

H

NH

HN

HN

HN

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

HN

HN

HN

NH

NH

NH

N

HN

HN

H2N

General scheme of the N2S2-Tat (49-57)-Lys3-BN hybrid peptide labelled with technetium-99m.



Auger energy of 0.90 keV/decay and IC electron energy

of 15.40 keV/decay, which represent 11.4% of the total99mTc energy release per decay [2,3].

The receptors overexpressed on the surface of cancer

cells represent promising targets for cancer diagnosis or

therapy. The gastrin-releasing peptide receptor (GRP-r)

is a seven-transmembrane G-protein coupled receptor

that is overexpressed on primary prostate, breast cancer

and lymph node metastases [4,5]. Bombesin is a tetra-

decapeptide that binds with high affinity to the GRP-r.

Specifically, the Lys3-bombesin analogue labelled with99mTc through diaminedithiol, hydrazinonicotinamide or

N2S2-chelator has been reported as a radiopeptide with

high stability in the human serum, specific cell receptor

binding and rapid internalization [5–7]. Biodistribution

data in mice showed rapid blood clearance with pre-

dominant renal excretion and specific binding towards

GRP-r-positive PC-3 prostate tumours [6,7]. Images of

GRP-r expression in patients with breast cancer using99mTc-hydrazinonicotinamide-Lys3-bombesin have shown

distinct radioactivity accumulation in malignant tissue [8].

Although radiolabelled bombesin analogues have been

successfully applied in preclinical, targeted radiotherapy,

the targets were restricted almost exclusively to the cell

membrane [9–11]. Current challenges are conjugating

biomolecules with cell-penetrating peptides and/or nu-

clear localization peptide sequences (NLSs) to promote

their internalization and routing to the cell nucleus.

Tat (49-57) is a peptide derived from the transcription

protein transactivator of the HIV-1 virus that has a

membrane translocation domain and an NLS [12,13].

A hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat

(49-57)-bombesin (99mTc-Tat-BN) could significantly

increase cancer cell internalization. Internalizing IC and

Auger electrons in the nucleus of a malignant cell would

increase the effectiveness of targeted radiotherapy.

The aim of this study was to assess the in-vitro nuclear

internalization kinetics of 99mTc-Tat-bombesin in GRP-r-

positive cancer cells and to evaluate the radiation-

absorbed dose at the subcellular level associated with

the observed effect on cancer cell DNA proliferation.

Materials and methodsDesign and preparation of hybrid N2S2-Tat (49-57)-Lys

3-

BN peptide

Tat (49-57) peptide (H-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-

Arg-NH2) was conjugated to Gly-Gly-Cys-Gly-Cys(Acm)-

Gly-Cys(Acm)-NH2 to produce the Tat (49-57)-spacer-N2S2peptide (H-Arg1-Lys2-Lys3-Arg4-Arg5-Gln6-Arg7-Arg8-Arg9-

Gly10-Gly11-Cys12-Gly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2).

The sequence Gly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2

was added for use as the specific N2S2 chelating site for99mTc (Fig. 1).

Lys3-bombesin (Pyr-Gln-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Vla-

Gly-His-Leu-Met-NH2) was conjugated to a maleimidopropyl

moeity through Lys3, and the maleimidopropyl group was

used as the branch position to form a thioether with

the Cys12 side chain of Tat (49-57)-spacer-N2S2 peptide

(Fig. 1). Synthesis, high-performance liquid chromato-

graphy (HPLC) analysis, matrix-assisted laser desorption/

ionization mass spectral analysis (MALDI), amino acid

analysis and peptide content determination were carried

out in the Bachem Laboratories (Bachem, California,

USA) to ultimately obtain a certified white powder

product with a chemical purity of more than 90% and a

molecular weight of 3779.5 g/mol.

Radiolabelling of N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN

99mTc-pertechnetate was obtained from a GETEC 99Mo/99mTc

generator (ININ, Ocoyoacac, Mexico).

99mTc-labelled Tat-BN was prepared as detailed by

Santos-Cuevas et al. [7]. One milligram of N2S2-Tat(49-

57)-Lys3-BN was dissolved in 200 ml of injectable water

(Pisa, Mexico). Ten microlitres of this solution were

added to 25ml of sodium 99mTc-pertechnetate (185MBq),

followed by 7 ml of acetamidomethyl group deprotection

mixture (50mg/ml sodium tartrate in 0.1mol/l NH4OH/

NH4CH3COOH, pH 9.5) and 3 ml of reducing solution

(0.5mg SnCl2/ml in 0.05mol/l HCl). The final mixture

was incubated for 20min at room temperature.

Evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN

radiochemical purity

Radiochemical purity analyses were performed by instant

thin-layer chromatography on silica gel (ITLC-SG; Gelman

Sciences, Pall Corporation, Port Washington, New York,

USA), solid phase extraction (Sep-Pak C-18 cartridges)

and reverse-phase HPLC.

ITLC-SG analysis was accomplished using two different

mobile phases: saline solution to determine the amount

of free 99mTcO4– (Rf=1) and 0.1mol/l of sodium citrate

(pH 5) to determine 99mTc-tartrate (Rf=1). The Rf value

of the radiolabelled peptide in each system was 0.0.

The Sep-Pak cartridges were preconditioned with 5ml of

ethanol followed by 5ml of 1mmol/l HCl and 5ml of air.

An aliquot of 0.1ml of the labelled peptide was loaded

onto the preconditioned Sep-Pak cartridge followed by

5ml of 1mmol/l HCl to elute-free 99mTcO4– and 99mTc-

tartrate. The radiolabelled peptide was eluted with 3ml

of acidified ethanol (0.001N HCl); hydrolysed/reduced99mTc remained in the cartridge.

HPLC analyses were carried out with a Waters instrument

running Millennium software (Waters Corp., Milford,

Massachusetts, USA) with both radioactivity and ultra-

violet photodiode array in-line detectors and a YMC

ODS-AQ S5 column (5 mm, 4.6� 250mm). A gradient

using 0.1% trifluoroacetic acid/water as solvent A and

0.1% trifluoroacetic acid/acetonitrile as solvent B was run

at a flow rate of 1ml/min. The gradient began at 100%



99mTc-N2S2-Tat (49-57)-bombesin internalized in nucleiof prostate and breast cancer cells: kinetics, dosimetryand effect on cellular proliferationClara L. Santos-Cuevasa,b, Guillermina Ferro-Floresa, Eva L. Rojas-Calderona,Rocıo Garcıa-Becerrac, David Ordaz-Rosadoc, Consuelo Arteaga de Murphyc

and Martha Pedraza-Lopezc

Background The gastrin-releasing peptide receptor

(GRP-r) is overexpressed in prostate and breast cancers.

technetium-99m-bombesin (99mTc-BN) has been reported

as a radiopharmaceutical with specific cell GRP-r binding.

The HIV Tat (49-57)-derived peptide has been used to

deliver a large variety of molecules to cell nuclei. A new

hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-

Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) internalized in cancer cell nuclei

could act as an effective system of targeted radiotherapy

using Auger and internal conversion electron emissions

near DNA.

Aim The aim of this study was to assess the in-vitro

nucleus internalization kinetics of 99mTc-Tat-BN in GRP

r-positive cancer cells and to evaluate the subcellular-level

radiation-absorbed dose associated with the observed

effect on cancer cell DNA proliferation.

Methods 99mTc-Tat-BN in-vitro internalization kinetics

were evaluated in human prostate cancer PC-3 cells and

breast carcinoma cell lines MCF7 and MDA-MB231. Nuclei

from cells were isolated using a nuclear extraction kit.

Total disintegration in each subcellular compartment was

calculated by the integration of experimental time–activity

kinetic curves. Nucleus internalization was corroborated by

confocal microscopy images using immunofluorescently

labelled Tat–BN. The PENELOPE code was used to

simulate and calculate the absorbed dose by the

contribution of Auger and internal conversion electrons

in the cytoplasm and nucleus using geometric models

built from immunofluorescent cell images. A cell

proliferation kit was used to evaluate DNA concentration

after cancer cell incubation with 99mTc-Tat-BN.

Results The results showed that 59.7, 61.2 and 41.5% of

total disintegration per unit of 99mTc-Tat-BN activity (1Bq)

bound to the cell occurred in the nucleus of PC-3, MCF7

and MDA-MB231, respectively. The 99mTc-Tat-BN absorbed

doses delivered to nuclei were 0.142mGy/decay (PC-3),

0.434mGy/decay (MCF7) and 0.276mGy/decay (MDA-

MB231). 99mTc-Tat-BN produced a significant decrease in

PC-3 (52.98%), MCF7 (45.71%) and MDA-MB231 (35.80%)

cellular proliferation with respect to untreated cells.

Conclusion The hybrid radiopharmaceutical could be

potentially useful as a therapeutic agent for prostate and

breast cancers. Nucl Med Commun 32:303–313 �c 2011

Wolters Kluwer Health | Lippincott Williams & Wilkins.

Nuclear Medicine Communications 2011, 32:303–313

Keywords: hybrid radiopharmaceutical, peptide-receptor therapy,radiolabelled bombesin, subcellular dosimetry, Tat-bombesin

aInstituto Nacional de Investigaciones Nucleares, bUniversidad Autonoma delEstado de Mexico, Estado de Mexico and cInstituto Nacional de CienciasMedicas y Nutricion Salvador Zubiran, Mexico D.F., Mexico

Correspondence to Guillermina Ferro-Flores, PhD, Departamento de MaterialesRadiactivos Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares Carretera Mexico-Toluca S/NLa Marquesa, Ocoyoacac, Estado de Mexico, C.P. 52750, MexicoTel: + 52 55 53297200 x3863; fax: + 52 55 53297306;e-mail: [email protected]; [email protected]

Received 8 September 2010 Revised 19 October 2010Accepted 19 October 2010

IntroductionAs interest in targeted therapies for cancer increases,

radionuclides stand out not only for their ability to be

detected by external scintigraphy, but also for their

therapeutic capacity [1]. The objective is to deliver a

maximum radiation dose to tumour areas in a selective and

localized manner, generating a therapeutic effect because

of energy deposition from charged particle emissions. At

the single-cell level, short-range charged particles, such

as a, internal conversion (IC) electrons and Auger elec-

trons, impart a dense ionizing energy deposition pattern

associated with increased radiobiological effectiveness.

However, they must be able to penetrate the cytoplasm

and reach the nucleus, which is considered to be the most

radiosensitive component of the cell. Auger and IC

electron emitters that can be targeted to the DNA of

tumour cells represent an attractive system of radiation

therapy because of their high linear energy transfer within

nuclear dimensions (4–26 keV/mm) [2]. In contrast to

a radiation, Auger and IC radiation are of low toxicity

when decaying outside the cell nucleus, such as in the

cytoplasm or outside the cells during blood transport.

Technetium-99m (99mTc) is the most frequently used radio-

nuclide for in-vivo diagnostic imaging studies because

of its monoenergetic g rays of 140 keV and easy complex

formation with a large number of ligands. 99mTc produces

Original article

0143-3636 �c 2011 Wolters Kluwer Health | Lippincott Williams & Wilkins DOI: 10.1097/MNM.0b013e328341b27f


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