UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA División Ciencias Biológicas y de la Salud

Unidad Iztapalapa

Unidad: Iztapalapa

División: División Ciencias Biológicas y de la Salud

Licenciatura: Licenciatura en Biología Experimental

Título del Servicio Social: “Evaluación del efecto de la hidralazina en la capacidad metastásica de líneas celulares tumorales”

Nombre: Herrera Solorio Abril Marcela

Asesor Externo: M. en C. Zeferino Enrique Pérez Cárdenas

Investigador en Ciencias Médicas “C”

Instituto Nacional de Cancerología

Asesor Interno: Dr. Pablo Gustavo Damián Matzumura

Profesor titular de tiempo completo

UAM-Iztapalapa

Lugar y fecha de realización: Laboratorio de Epigenética, Unidad de Investigación Básica en Cáncer, Subdirección de Investigación Básica del Instituto Nacional de Cancerología.

Del 21 de Noviembre de 2006 a 22 de Mayo de 2006

“Evaluación del efecto de la hidralazina en la capacidad metastásica de líneas celulares

tumorales” Laboratorio de Epigenética, Unidad de Investigación Biomedica en Cáncer, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología.

Asesor Externo: M. en C. Z. Enrique Pérez Cárdenas Asesor Interno: Dr. Pablo Gustavo Damián Matzumura

Periodo comprendido del 21 de Noviembre de 2005 al 21de mayo del 2006. Introducción El desarrollo tumoral comprende una serie de pasos constituidos por: invasión del tejido local, degradación de la membrana basal, intravasación en vasos sanguíneos o canales linfáticos, viaje y supervivencia en estos vasos, extravasación y arresto en un sitio secundario, colonización, supervivencia y proliferación celular seguida por la angiogénesis en un sitio a distancia. Todo este proceso ha sido denominado cascada metastásica (14). Las células que presentan este fenotipo metastático se lo deben en gran parte a la pérdida en el balance entre los genes supresores de tumores y los oncogenes, lo cual le confiere a las células: a) autosuficiencia a señales de crecimiento, b) insensibilidad a señales de detención del crecimiento, c) alto potencial de proliferación, d) evasión de la apoptosis, e) inhibición de la diferenciación, f) angiogénesis, g) habilidad de invasión y metástasis e h) inestabilidad genética (15). Parte crucial en este proceso, es la pérdida de la expresión de los genes supresores de metástasis, definidos así por su habilidad de suprimir in vivo el desarrollo de metástasis sin afectar el crecimiento primario; generalmente están involucrados en el control del crecimiento, adhesión y reorganización del citoesqueleto, de tal forma que tumores altamente metastásicos no expresan estos genes y viceversa (14). Los genes supresores de metástasis se encuentran raramente mutados en las metástasis sino que pueden ser regulados por mecanismos epigenéticos como la metilación del DNA, sugiriendo así, que estos genes posiblemente pueden ser reactivados (31). La metilación del DNA es una modificación post-sintética (12) en la cual es adicionado un grupo metilo en el carbono 5 del anillo pirimídico de las citosinas en zonas denominadas islas CpG presentes en las regiones promotoras del 60-80 % de los genes (13). Esta modificación es fundamental para el desarrollo, la diferenciación, la impronta génica y la inactivación del cromosoma X (26). Cambios en el patrón de metilación contribuyen a la carcinogénesis e inmunidad (18); en células neoplásicas, se ha observado una hipometilación global asociada a los oncogenes, así como una hipermetilación regional asociada a genes supresores de tumores (3). La metilación del DNA es catalizada por una familia de enzimas denominadas DNA metiltransferasas (DNMT’s), las cuales emplean S-adenosil-metionina como donador de grupos metilo (30). Esta familia de enzimas esta constituida, a la fecha, por 5 DNMT’s, de las cuales dos se encuentran involucradas en la metilación de novo del DNA (DNMT 3a y 3b), una en el mantenimiento de la metilación (DNMT 1), otra que al parecer está involucrada en el reconocimiento del daño y reparación al DNA (DNMT 2) y por ultimo una que pudiera participar en el remodelamiento de la cromatina y la represión transcripcional (DNMT 3L) (19, 30). Dentro de los genes supresores de metástasis se encuentra el gen nm23, el cual fue descubierto en la línea celular de melanoma murino K-1735, ya que modificaba su potencial metastático in vivo (23, 28). En humanos se han reportado hasta el momento 8 miembros de la familia nm23 (16), los cuales han sido relacionados con varios procesos biológicos como la proliferación celular, la diferenciación, el desarrollo y la movilidad celular (8, 20). El gen nm23-H1 es el mejor estudiado y la pérdida de su expresión se ha correlacionado con un alto potencial metastásisco en carcinoma hepático, cáncer de mama, de estómago, de ovario, cervico uterino y en melanomas (6, 16). Se localiza en el cromosoma 17q21.3 (1) y codifica una proteína celular citoplasmática de 17 kD constituida por 152 aminoácidos (4). Dentro de las actividades que se le han asignado, se encuentra como la de posible cinasa de serina/treonina, interacción con numerosas proteínas incluyendo proteínas G pequeñas y heterodiméricas, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína del citoesqueleto, así como en la regulación del ciclo celular (11). La mejor establecida es como nucleósidos difosfato cinasa, catalizando la conversión de nucleósidos difosfatados ((d)NDPs) a nucleósidos trifosfatados (d)NTPs) mediante una reacción de “pin pong" (21). La región promotora del gen nm23-H1 no posee caja TATA pero sí secuencias de reconocimiento para proteínas reguladoras de la transcripción como sitios AP1, secuencias consenso ETS, TFIID y CTF/NF1 (5, 6); también se identificaron dos islas CpG de 832 y 672 bp respectivamente localizados en la región promotora (10). La presencia de estas dos islas CpG sugiere la posible participación de la metilación del DNA en la regulación de la expresión del gen nm23-H1; en experimentos recientes (11) se ha reportado la re-expresión del gen nm23-H1 en líneas celulares de cáncer de mama, incluidas líneas celulares con capacidad metastásica, después de haber expuesto a la células al agente desmetilante 5-azacitidina por 3 días (10). La terapia epigenética representa actualmente un blanco atractivo para el tratamiento contra el cáncer; evidencia experimental demuestra que el empleo de agentes desmetilantes como la 5-aza-2-deoxicitidina y la 5-azacitidina (análogos de la citosina) son

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capaces de re-expresar genes supresores de tumores con buenos resultados; sin embargo, los efectos secundarios son desalentadores por su alto potencial carcinogénico y mutagénico (2, 25). Es por ello que el empleo de fármacos como la hidralazina, la cual ha sido descrita como un agente desmetilante y el cual es capaz de inhibir la metilación de genes supresores de tumores tanto in vitro, in vivo y en pacientes sin efectos secundarios graves, ha abierto la ventana a fármacos que tengan la misma capacidad desmetilante basándose en su estructura química (26, 32), aumentando el número de nuevos compuestos con pocos efectos secundarios nocivos. Objetivo: Analizar el efecto de la hidralazina en la capacidad metastásica en líneas celulares tumorigénicas y con capacidad metastásica previamente establecidos en la literatura. Objetivos específicos a. Determinar la expresión de la proteína Nm23-H! por la técnica de Western blot en las líneas celulares expuestas a los

agentes desmetilantes hidralazina y 5-azacitidina. b. Determinar el efecto de la hidralazina sobre la metilación del gen anti-metastásico nm23-H1. c. Determinar el número de macrometástasis en pulmones de ratones Balb C nu/nu después de haber sido expuestos al

tratamiento con el agente desmetilante hidralazina. Material y Método a) Células y cultivo celular: Se emplearon células de melanoma de ratón B16 F0 y B16 F10 obtenidas del Hospital de Sanidad del Ejército, células epiteliales de carcinoma mamario humano MCF7 y MDA-MD-231, así como fibroblastos de ratón 3T3 NIH obtenidas del American Type Culture Collection (ATCC) transfectadas con los siguientes plásmidos:

1) Clona celular N5: transfectada con el gen de resistencia a neomicina pSV2neo. 2) Clona celular J20: transfectada con el oncogen ras mutado unido al gen de neomicina pSV2neo (pEJ-neo).

Las células se cultivaron en monocapa en Medio Mínimo Esencial Dulbeco (DMEM, Gibco) suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB, GIBCO). Para el conteo y viabilidad celular se utilizó azul tripán al 0.05 % en PBS (solución amortiguadora de fosfatos). b) Exposición de las líneas celulares a hidralazina y 5-aza-citidina: 2.5x105 células de las líneas celulares antes mencionadas se expusieron 5 días a hidralazina 10 μM (SIGMA), 5-aza-citidina 1 μM (SIGMA) como control positivo de desmetilación y células expuestas solo a vehículo (agua destilada estéril) como testigo en un porcentaje del 0.2% con respecto al volumen total de medio de cultivo. c) Obtención de tejido pulmonar metastásico: 3 ratones hipotímicos Balb C nu/nu fueron inyectados vía intravenosa con 1x106 células de la línea celular J20; pasados 30 días los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, se disectó el pulmón en condiciones estériles y el tejido fue congelado -70 °C para su posterior utilización. Por otra parte, 10 ratones hipotímicos Balb C nu/nu se inyectaron vía intravenosa con 2x106 células de la línea celular J20, pasados 4 días se inyectaron vía intraperitoneal con solución salina para el grupo control (3 ratones) y con hidralazina en dosis farmacológica de 5 mg/kg peso (7 ratones) por 30 días. Después de ser sacrificados el pulmón fue disectado y se contó el número de metástasis macroscópicas que presentaron. d) Cuantificación de proteínas: Para la cuantificación de proteíanas se emplearon pulmones sin metástasis macroscópicas, pulmones que presentaban metástasis macroscópicas, así como las líneas celulares expuestas al vehículo o a los fármacos. Los tejídos o células se lisaron en de buffer de lisis RIPA con inhibidor de proteasas (Sigma) (150 mM de NaCl, 10 mM Tris pH 7.2, 0.1 % SDS, 1.0 % Tritón X-100, 1% deoxicolato, 5 mM EDTA) por cambios de temperatura en nitrógeno líquido o mediante un homogenizador (BIOSPEC). Se cuantificó la concentración de proteínas citosólicas totales con ácido biscinconínico (27) utilizando una curva patrón de albúmina sérica bovina (SIGMA). Las muestras se leyeron en un lector de ELISA a 570 nm. Con la curva patrón se determinó la ecuación de la recta y se intrapolaron los valores de las muestras problema a la curva patrón. e) Western blot: Se separaron por electroforesis en condiciones desnaturalizantes las proteínas citosólicas (25 μg) de las líneas celulares tumorales (MCF-7, B16 F0, N5) y metastáticas (MDA-MD-231, B16 F10, J20) expuestas a los agentes desmetilantes así como de los lisados de pulmón con y sin macrometástasis. Las condiciones de corrida fueron 80 volts a temperatura ambiente por aproximadamente 1h 30 min realizando posteriormente la transferencia a membranas PVDF en cámara semi-seca a 120 volts por 30 min con buffer de transferencia (Tris 25 mM, glicina 150 mM, metanol 20%, pH 8.3). Transcurrido este tiempo la membrana se lavó con solución TBS (10X: 24.2 g Tris-Base, 80 g NaCl, pH 7.6) y se bloquearon los sitios de unión inespecífica con solución de bloqueo (TBS-Tween-20 con leche sin grasa al 5 %) por 1 h a temperatura ambiente y se lavó con

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TBS-T (TBS pH 7.6, 0.1 % Tween-20). Finalmente se incubó la membrana con el anticuerpo primario contra nm23 (Santa Cruz) en una dilución de 1:1000 así como con el anticuerpo primario contra actina (Santa Cruz) como control de carga en una dilución 1:500 incubándose toda la noche a 4°C. Al día siguiente se lavó con TBS-T, se incubó la membrana con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo para nm23 y anticuerpo anti-IgG de cabra para actina por 1 h a temperatura ambiente, se lavó la membrana con TBS-T y se utilizó solución de quimio-luminiscencia (ECL, Amersham) para la detección de nm23. Actividades realizadas: Durante el servicio social se realizaron actividades como cultivo celular, electroforesis, Western blot, manejo de animales de laboratorio, exposición de artículos científicos. Objetivos y metas alcanzadas. Se determinó la expresión del gen nm23-H1 en las líneas celulares expuestas a hidralazina y 5-azacitidina como control positivo de desmetilación así como en los tejidos normales y con macrometástasis de los pulmones de los ratones. Resultados y Conclusiones Diferentes reportes han sugerido que el gen nm23-H1 es un gen supresor de metástasis (27, 28) lo cual se ha correlacionado con la disminución de su expresión en la capacidad metastásica (7, 22, 24). Es por ello que se esperaba que las líneas celulares metastásicas (MDA-MB-231, B16 F10, J20) expuestas a los agentes desmetilantes aumentaran la expresión de nm23-H1, en comparación con las líneas con solo capacidad tumorigénica (MCF-7, B16 F0, N5). Sin embargo, el análisis por Western Blot no indicó variación significativa en la expresión del gen nm23-H1 con el tratamiento, lo cual podría indicar, que la metilación del DNA de las islas CpG presentes en la región promotora del mismo no estan involucrados en la regulación de la expresión de este gen, tanto en las líneas expuestas solo a vehículo como a los agentes desmetilantes (Fig. 1A, 1B, 1C). En los lisados del tejido normal así como en el tejido metastático obtenido de los ratones, no se presentaron modificaciones en la expresión del gen nm23-H1 (Fig 1D); estos resultados contradictorios podrían explicarse por la posible contaminación por eritrocitos, los cuales expresan grandes cantidades de la proteína Nm23-H1 o NDPK A así como de su homologo Nm23-H2 o NDPK B (9), o tal vez debido a la presencia de tejido normal.

B16-F0

B16-F10

co nm23-H1 en líneas celulares tumorales, líneas celu

0.5

Control Hidra 5-Aza

Análisis de la expresión del gen nm23-H1 en líneas celulares de melanoma de ratón

MCF-7

MDA-231

1.2

0.8

0.4

Control Hidra 5-Aza

Análisis de la expresión del gen nm23-H1 en líneas celulares de cáncer de mama

1.5

1.0

0.5

J20 Pulmón Metas

Análisis de la expresión del gen nm23-H1 en lisados de macrometástasis y tejido normal

1.5

1.0 N5

J20

0.5

Control Hidra 5-Aza

Análisis de la expresión del gen nm23-H1 en fibroblastos de ratón transfectados

1.0

1.5

A B

DC

Fig 1. Análisis de la expresión del gen anti-metastási lares con capacidad metastásica y lisados de tejido normal y con macrometá stasis por western blot.

notable disminución en la formación de metástasis, lo cual sugeriría que el proceso metastático in vivo podría estar regulado por

sta

Por otra parte, las metástasis generadas en los ratones hipotímicos Balb C nu/nu, los cuales fueron divididos en 2 grupos, control e hidralazina, no se observaron grandes cambios en cuanto al número de metástasis formadas en los ratones que fueron tratados con el fármaco, lo cual sugeriría que el tratamiento con este agente desmetilante como terapia única. no disminuye la formación de metástasis in vivo; por lo que sería conveniente la utilización de una terapia combinada de agentes desmetilantes con agentes desacetilantes como el ácido valpróico, pues experimentos recientes realizados en nuestro laboratorio revelan una

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modificaciones a nivel de las histonas y/o por metilación del DNA, lo cual tendría un efecto directo en la expresión o represión de algunos de los genes involucrados en este proceso. En la siguiente tabla se resumen los resultados obtenidos:

Tratamiento Núm. Animales Promedio Rango Control 3 6.5 6-7

Hidralazina 7 6.23 1-17 Recomendaciones: Es necesario analizar la secuencia del gen nm23-H1 en las líneas celulares tumorales y con capacidad metastásica antes y después de exponerlas a los agentes desmetilantes, así como realizar cortes histológicos e inmunohistoquímica para confirmar que la expresión de nm23-H1 en los lisados es debido a la contaminación por eritrocitos o de pulmón sin macro o micrometástasis. Bibliografía 1. Backer, J. M., Mendola, C. E., Kovesdi, I., Fairhurst, J. L., O’Hara, B., Eddy, R. L. Jr., Shows, T. B., Mathew, S., Murty, V. V.

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