UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO Y FRACCIONES SEMIPURIFICADAS DE LA ESPONJA

Aplysina gerardogreeni.

TESIS

QUE COMO UNO DE LOS REQUISISTOS PARA OBTENER EL TITULO DE:

BIOLOGO MARINO

PRESENTA:

Sonia Scheherazad Valencia Agamí

La Paz Baja California Sur, México OCTUBRE de 2010

La presente tesis se realizó en el Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas

(CICIMAR-IPN) bajo la dirección de la Dr. Claudia Judith Hernández Guerrero, dentro

de los proyectos “Bioactividad de metabolitos secundarios derivados de macroalgas y

esponjas y su papel ecológico en un arrecife rocoso del Golfo de California”. CONACYT

79707, y “Variación temporal de la bioactividad y comunidad microbiana asociada la

esponja Aplysina spp.” SIP20090866 y SIP 20100862.

III

DEDICATORIA

Les dedico esta tesis a todas las personas que me ayudaron a seguir este sueño.

Comenzando por mi familia en general por siempre confiar y creer en mí, en especial

A mi madre Raquel Agami quien me ha apoyado desde el día que nací.

A mis tíos Sandra Agami y Sansón Minquiz por siempre estar a mi lado

en los buenos y en los malos momentos.

A mis hermanos Ari, Angélica y Jorge quienes me han brindado una

profunda alegría con cada tontería y momento compartido, a mi sobrino Ángel

por ser una alegría que complementa mi vida y a mi cuñado Israel.

A mis amigos quienes me han apoyado y acompañado en este viaje y en cada locura

muchas gracias chicos y chicas. En especial a las gordas (Abi, Tony, Susy y Mare)

por todas y cada una de las experiencias vividas y las que faltan por vivir.

A la familia Fita-Andrade por el apoyo que me ha brindado durante mi estancia en La

Paz.

A Claudia Hernández por la paciencia y tiempo invertido en esta tesis y en mí.

IV

AGRADECIMIENTOS

Quiero comenzar agradeciendo a la institución del CICIMAR-IPN que prestó sus

instalaciones para la realización de esta tesis.

A Claudia Hernández por aceptarme en este proyecto, y dedicar parte de su tiempo

para que saliera bien.

A la Dra. Bárbara González Acosta por ayudarnos con las pruebas de actividad

antibacteriana.

A la Dra. Eva Zubia Mendoza por su ayuda en la realización de los espectros de

Resonancia Magnética Nuclear en la Universidad de Cádiz.

A todos los que facilitaron la realización de esta tesis muchas gracias.

V

INDICE

RELACION DE TABLAS Y FIGURAS ...................................................................................... VI GLOSARIO ............................................................................................................................. VIII ABREVIATURAS ...................................................................................................................... XI RESUMEN. .............................................................................................................................. XII INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1

ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 4

BIOLOGÍA DE LA ESPECIE Y TAXONOMIA ........................................................................... 12

JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ |3

HIPÓTESIS ............................................................................................................................... 14 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 14

METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 15

Área de estudio................................................................................................................. 15

Obtención del material biológico .................................................................................... 16 Extracción y fraccionamiento .......................................................................................... 16

Ensayos de actividad de extractos y fracciones frente a bacterias patógenas para el hombre. .............................................................................................. 18

Análisis cromatográfico y espectroscópico de las diferentes fracciones obtenidas..21

RESULTADOS.......................................................................................................................... 22

Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni. ......................... 22

Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A. gerardogreeni. .................................................................................................................. 24

Fracciones F1 y F2. ................................................................................................. 25

Fracción F3 .............................................................................................................. 27

Fracción F4 y F5. ..................................................................................................... 28

VI

DISCUSIÓN. ............................................................................................................................. 30

Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni .......................... 30

Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A. gerardogreeni ................................................................................................................... 32

Fracciones F1 y F2………………………..………………………………………………33

Fracción F3 .............................................................................................................. 35

Fracción F4 y F5. ..................................................................................................... 35

CONCLUSIONES. .................................................................................................................... 36

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 37

VII

RELACION DE TABLAS Y FIGURAS

Figura 1. Compuestos derivados de la dibromotirosina aislados a partir de esponjas del genero Aplysina ......................................................................... 7

Figura 2. Área de estudio en la zona de Punta Arena de la Ventana, B.C.S. ............... 15

Figura.3 fraccionamiento del extracto NI ...................................................................... 17

Figura 4. Fracciones que fueron probadas frente a las cepas bacterianas................... 20

Figura 5. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a S.aureus. .......................................................................................... 22

Figura 6. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a E.coli. . ............................................................................................. 23

Figura 7. Espectro de 1H-RMN del producto 1 en CDCl3 .............................................. 26

Figura 8. Espectro de 1H-RMN de la fracción F3 en CDCl3. ......................................... 28

Figura 9. Espectro de 1H-RMN de las fracciones F4 y F5 en CDCl3. ............................ 29

Figura 10. Estructura química de la aerothionina ........................................................ 34

Tabla 1. Actividad antibacteriana de diversos compuestos aislados de esponjas del género Aplysina. .......................................................................... 8

Tabla I. promedio de los halos y desviación estándar del extracto a diferentes concentraciones.. ........................................................................... 24

Tabla II. Halos para el primer fraccionamiento del extracto. Se muestra el promedio y la desviación estándar. ............................................................. 25

VIII

Tabla III. Halos de las fracciones correspondientes al fraccionamiento de la alícuota 1. .............................................................................................. 27

Tabla IV. Desplazamientos químicos de 1H-RMN del compuesto aerothionina en acetona y cloroformo deuterado .............................................................. 33

IX

GLOSARIO

Actividad Antimicrobiana: capacidad de una sustancia que es efectiva contra

microorganismos, ya sea porque suprime su crecimiento o eventualmente puede

destruirlos.

Alelopatia: fenómeno que implica la inhibición directa de una especie por otra ya sea

vegetal o animal usando sustancias toxicas o disuasivas.

Antibiotico: sustancia química producida por un ser vivo o sintetizada por métodos de

laboratorio que a determinada concentración mata o impide el crecimiento de

ciertas clases de microorganismos sensibles.

Bioensayo: Proceso experimental mediante el cual se determinan las características y

la fuerza de una sustancia potencialmente tóxica o de un desecho metabolito, a

través del estudio de sus efectos sobre organismos cuidadosamente escogidos y

bajo condiciones específicas de laboratorio.

Biotoxina: Sustancia tóxica producida por animales y derivados de plantas

Cabeza de serie: Primero de una serie de fármacos de estructura química y perfil

farmacológico similares.

Cepa: variante genotípica de una especie o, incluso, de un taxón inferior, usualmente

propagada clonalmente, debido al interés en la conservación de sus cualidades

definitorias.

Citotóxico: Agente o sustancia que daña o destruye cualquier variedad de célula o

tejido.

Deuterado: compuesto orgánico en el que los hidrógenos fueron reemplazados por

deuterio.

Fármaco: sustancia química purificada utilizada en la prevención, diagnóstico,

tratamiento, mitigación y cura de una enfermedad; para evitar la aparición de un

X

proceso fisiológico no deseado; o para modificar condiciones fisiológicas con

fines específicos.

Gram Negativa: bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de

Gram, y lo hacen de un color rosado tenue. Esta característica está íntimamente

ligada a la estructura de la envoltura celular.

Gram Positiva: bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram.

Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular.

Halogenado: compuestos orgánicos sintéticos, y algunos naturales que contienen

halógenos.

Hemoaglutinación: Aglutinación de las células sanguíneas.

Hemolisis: fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o hematíes).

Lecounoide: Organización de mayor complejidad que presentan la mayoría de las

esponjas de la clase Demoespongia.

Metabolito Secundario: compuestos orgánicos sintetizados por el organismo que no

tienen un rol directo en el crecimiento o reproducción del mismo.

Morbilidad: proporción de personas que enferman en un sitio y tiempo determinado.

Olefínico: compuestos con doble enlaces.

Porifero (porífera): filo de animales invertebrados acuáticos que se encuentran dentro

del subreino Parazoa. Son mayoritariamente marinos, sésiles y carecen de

auténticos tejidos.

Resistencia Bacteriana: fenómeno creciente caracterizado por una refractariedad

parcial o total de los microorganismos al efecto del antibiótico generado

principalmente por el uso indiscriminado e irracional de éstos y/o sólo por la

presión evolutiva que se ejerce en el uso terapéutico.

XI

Sensidisco: Disco de papel filtro de poro grueso y de diámetro variable, impregnado

con el antibiótico de prueba.

Tirosina: uno de los 20 aminoácidos que forman las proteínas. Se clasifica como un

aminoácido no esencial en los mamíferos ya que su síntesis se produce a partir

de la hidroxilación de otro aminoácido: la fenilalanina.

XII

ABREVIATURAS

AcOEt: Acetato de etilo

(CD3)2CO: Acetona

1H-RMN: RMN de protón

CC: Cromatografía en columna

CHCl3: Cloroformo

d : Doblete (tipo de desdoblamiento de una señal de RMN)

HEX: Hexano

J: Coeficiente de acoplamiento (ayuda a explicar los espectros de los compuestos)

MeOH: Metanol

Rf: Factor de retención

RMN: Resonancia magnética Nuclear

s : singlete (tipo de desdoblamiento de una señal de RMN)

TSA: Agar soya Tripticasa

UV: Ultra violeta

δ : Desplazamiento químico (ayuda a explicar los espectros de los compuestos)

XIII

RESUMEN.

La mayoría de los productos bioactivos de origen marino se han aislado a partir de

invertebrados, siendo las esponjas una de las fuentes más prometedoras de nuevas

sustancias para el desarrollo de fármacos. A partir de esponjas del género Aplysina se

han descrito diversos compuestos que han mostrado actividad antimicrobiana,

antitumoral, antiadherente, antiparasitaria, antihistamínica y como inhibidores de

diversas enzimas. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad

antibacteriana del extracto y fracciones semi-purificadas de la esponja Aplysina

gerardogreeni del arrecife rocoso de Punta Arena, B.C.S., México. La recolección de

los ejemplares se realizó en septiembre de 2008, en el arrecife de Punta Arena de la

Ventana, B.C.S., empleando equipo de buceo SCUBA. Los cuales se trasladaron en

hielo al Departamento de Desarrollo de Tecnologías del CICIMAR, donde se

mantuvieron a -30°C hasta su utilización. A partir de los ejemplares se realizó una

extracción con acetona-MeOH 1:1 y posteriormente metanol. El extracto obtenido fue

sometido a fraccionamiento mediante cromatografía en columna (CC). Se obtuvieron

3 fracciones, donde solo la Fracción 1 fue activa, por lo que fue sometida a un

segundo fraccionamiento hasta la obtención de varias fracciones semipurificadas. A

cada una de las fracciones se les sometió a un análisis de cromatografía en capa fina

y de RMN, dando lugar a la obtención del compuesto aereothionina y las fracciones

semipurificadas F3, F4 y F5. Los resultados de actividad antibacteriana del extracto

crudo, mostraron que fue activo con una concentración mínima inhibitoria (MIC) de 40

mg mL-1 frente a las cepas Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Con respecto a

las fracciones, F4 fue la más activa presentando a una concentración de 0.5 mg, halos

de inhibición de 17.2 y 18.2 mm frente a S.aureus y E.coli respectivamente.

Palabras Clave. Esponjas, Aplysina, actividad antibacteriana, MIC.

1

INTRODUCCIÓN

La búsqueda de productos naturales de origen marino tienen gran interés

debido a varios factores, como son la extraordinaria biodiversidad que existe en los

ecosistemas marinos que cubren aproximadamente el 70% de la superficie del

planeta, la capacidad de los organismos para sintetizar metabolitos secundarios

bioactivos como mecanismos de defensa química (Pawlik, 1993), así como las

novedosas y variadas estructuras químicas que presentan estos metabolitos

(Faulker, 2002; Blunt, 2006).

La mayoría de los productos bioactivos de origen marino se han aislado a

partir de invertebrados, siendo las esponjas las fuentes más prometedoras de nuevas

sustancias para el desarrollo de fármacos (Munro, 1999). A partir de ellas se han

aislado compuestos pertenecientes a muy diversos tipos estructurales incluyendo

terpenos, esteroides, poliacetilenos, alcaloides, nucleosidos y péptidos, muchos de

los cuales tienen interés biomédico debido a sus propiedades antivirales,

antimicrobianas, antiinflamatorias o antitumorales (Faulker, 2002; Blunt, 2006) .

Las esponjas del orden Verongida (Phylum Porífera; Clase Demospongia)

constituyen la principal fuente natural de metabolitos bromados biogenéticamente

relacionados con la tirosina. Este orden incluye los géneros Aplysina, Ianthella,

Psammaplysilla, Pseudoceratina y Verongula entre otros (León, 2000). Las especies

del género Aplysina contienen altas concentraciones de metabolitos bromados (hasta

el 13% del peso seco), los cuales le confieren a la esponja características

2

antidepredatorias y por otra parte algunos de estos compuestos presentan actividad

antimicrobiana y citotóxica (Sharma y Burkholder 1967, Kreuter et al. 1990, Weiss et

al. 1996, citados por Hentschel et al. 2001; Kazanjian & Fariñas, 2006).

En México, los padecimientos infecciosos producidos por bacterias, en

particular diarreas e infecciones respiratorias agudas, propician elevados índices de

mortalidad en los menores de 5 años (Programa Nacional de Salud, 2007). Desde

los años cuarentas se han obtenido, comercializado y utilizado una gran cantidad de

antimicrobianos (Daza-Pérez, 1998), pero estos no han sido cien por ciento

eficientes debido a que las cepas bacterianas han presentado resistencia a algunos

de estos fármacos. A partir de 1950 se comenzaron a ver manifiestos de que las

bacterias eran capaces de desarrollar mecanismos de resistencia, los casos más

conocidos fueron los de las cepas de S. aureus resistentes a la penicilina. (Daza-

Pérez, 1998). De tal forma que las infecciones causadas por bacterias resistentes

se asocian a una mayor morbilidad y costos que las causadas por bacterias

sensibles de la misma especie (Daza-Pérez, 1998).

Puesto que no se puede evitar la resistencia ni predecir con fiabilidad la

irrupción de nuevos agentes infecciosos, la forma de mitigar estos efectos es la

búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos que se constituyan en “cabezas de

serie” por su estructura química o por su mecanismo de acción. En este sentido los

extractos orgánicos de la esponja Aplysina gerardogreeni, han demostrado que

presentan una interesante actividad antibacteriana frente a cepas de bacterias

resistentes (Montes-Plascencia et al., 2010) y en el área de Punta Arena de la

3

Ventana esta esponja es abundante, por lo que resulta interesante continuar con el

estudio de esta especie con la finalidad de fraccionar el extracto hasta aislar y

caracterizar ya sea las fracciones activas o los compuestos responsables de la

actividad antibacteriana.

4

ANTECEDENTES

La información sobre el uso de los productos naturales con fines medicinales

data de por lo menos 4000 años, aunque se considera que su aplicación es tan

antigua como el hombre mismo (Bongiorni & Pietra, 1996).

Los estudios realizados en las últimas décadas muestran que las esponjas

producen una gran variedad de biotoxinas, algunas de ellas bastante potentes. Las

Investigaciones sobre la bioquímica de las esponjas han puesto de manifiesto que

los antibióticos también son frecuentes en el cuerpo de una gran variedad de estos

organismos. Las diferentes especies de esponjas han desarrollado compuestos

químicos llamados sustancias alelopáticas, que pueden ser disuasorias específicas

o incluso “armas letales” contra competidores por el espacio; por lo tanto muchas de

las sustancias químicas que producen, están siendo estudiadas por los

farmacéuticos, químicos y biólogos por su interés como productos naturales con

una posible utilización en la industria farmacéutica (Brusca y Brusca, 2005).

Los poríferos constituyen uno de los grupos más biodiversos y abundantes

de invertebrados con más de 7000 especies descritas, aunque se ha estimado que

el número real podría superar las 15000 especies (Hooper & Van Soest 2002;

Carballo, 2008), las cuales están clasificadas dentro del phylum Porifera, que está

compuesto de tres grupos distintos: Hexactinelidae, Demospongiae y Calcarea

(Dembitsky, et al., 2005).

5

Las esponjas, son uno de los grupos marinos con mayor cantidad y variedad

de compuestos químicos secundarios con potencial farmacológico (Blunt et al.,

2006; Fenical, 1982; Rodriguez & Piña, 1993 en Lanza et al., 2006). Hasta 1999 se

habían aislado 12,000 compuestos procedentes de organismos marinos, de los

cuáles, una tercera parte tiene su origen a partir de las esponjas (Garson, 1994 en

Navarro, 2005; Dembitsky et al., 2005).

Las esponjas pertenecientes al orden Verongida contienen una gran cantidad

de metabolitos derivados de la dibromotirosina. Estos alcaloides presentan una

bioactividad muy variada que incluye actividad antimicrobiana, citotóxica,

antiincrustante, antiviral, reguladora de ATPasas y moduladora de canales de calcio

(Peng et al., 2005; Alvarez, 2007).

Existen diversos trabajos relacionados con la búsqueda de actividad biológica

a partir de extractos de esponjas del género Aplysina. Keer (1988), que realizó una

selección de organismos con actividad antimicrobiana utilizando esponjas, cnidarios

y equinodermos marinos; las pruebas de actividad se realizaron frente a Bacillus

subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis (bacterias Gram positiva),

Escherichia coli (Gram negativa) y Candida albicas. De los extractos etanólicos

analizados, se encontró que una esponja del género Aplysina presento actividad

antimicrobiana, al igual que seis especies más de cnidarios. Por otra parte a partir del

extracto acuoso de la esponja Aplysina lacunosa, se analizaron sus actividades

biológicas, tales como, la hemoaglutinación, la hemolisis, actividad antibacterial y

antifungal. Los ensayos de actividad antibacteriana resultaron positivos frente a

6

Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Escherichia coli, y Salmonella enteritidis, ésta

actividad fue atribuida a la presencia de saponinas, alcaloides, taninos y polifenoles

(Kazanjian y Fariñas, 2006). Bonay y Fresno (2000), realizaron la purificación y

caracterización de lectinas a partir de extractos de diferentes especies del género

Aplysina, (Aplysina archeri, A. lacunosa, y A. cauliformis); las cuales fueron

altamente reactivas y con actividad panaglutinante frente al panel de células rojas

probadas. Un estudio realizado con el extracto de la esponja A. caissara recolectada

en Brasil, permitió evaluar su efecto antiinflamatorio y analgésico en ratones, los

resultados indicaron un efecto significativo para aliviar el dolor y la inflamación de las

constricciones abdominales (Azevedo et al., 2008). Estudios de la variación

estacional de la actividad antibacteriana de extractos de Aplysina fistularis, mostraron

que la esponja presenta actividad, la cual se ve modificada en función de la cantidad

de organismos asociados a la esponja (Betancourt et al., 1998).

A partir de esponjas del género Aplysina se han aislado compuestos que se

derivan de modificaciones que se generan en el anillo aromático de la tirosina y en

su cadena lateral, así como de la unión de varios restos derivados de la

bromotirosina entre sí y/o con otras unidades, que frecuentemente derivan de otros

aminoácidos. Dando lugar a compuestos desde monómeros simples como la

aeroplysinina-1 o con cadenas laterales como la aerophobina-1, hasta compuestos

formados por dos restos derivados de la tirosina enlazados a través de una unidad

central de naturaleza y extensión variable, como la aerothionina o la fistularina-3

(Fig. 1).

7

aeroplysinina-1 Aerophobina-1

tirosina tirosina histamina

Aerothionina

tirosina tirosina

11-desoxifistularina-3 O

N

O

NH

O

OHHN

O

NO OH

OMeBr

MeO

Br

Br

Br

BrOH

Br

tirosina tirosina tirosina

Figura 1. Compuestos derivados de la dibromotirosina aislados a partir de esponjas del genero Aplysina.

Este tipo de compuestos presentan diversos tipos de actividades biológicas,

entre las cuales se puede mencionar que son inhibidores enzimáticos (Koulman et

al., 1996), presentan actividad frente a cepas resistentes de Plasmodium falciparum

y Trypanosoma cruzi (Gutiérrez et al., 2005), inmunosupresores (Gunasekera et al.,

1991), actividad citotóxica frente a diferentes líneas de células humanas (Ciminiello

MeO

Br

Br

OHO N

O

NH

NH

N

ON

O

NH

HN

O

NO

OH

BrBr

MeO

OHBr

Br OMe

8

et al., 1999; Compagnone et al., 1999) y actividad antibacteriana, que es una de las

más significativas. En la tabla 1 se muestran los compuestos aislados de este

género que presentan actividad antibacteriana.

Tabla 1. Actividad antibacteriana de diversos compuestos aislados de esponjas del género

Aplysina.

compuestos Especie (Localidad)

Actividad antibacteriana

(Cita)

Aereoplisinina-2

OMe

BrBr

OHO

O

H

A. Aerophoba (Panamá)

Streptococcus aureus S. pyogenes Samonella typhi Shigella sonnei (Minale et al., 1972)

Aeroplisinina-1

A. aerophoba S. albus B. cerus B. subtilis (Fattorusso et al., 1972)

Aplisinadieno

A. aerophoba S. aureus Streptococuss pyogenes Samonella typhi Shigella sonnei (Norte & Fernández, 1987)

Aplisinamisina-I

A. cauliformis

Venezuela

P.aeruginosa (Ávila-Nuñes, 2000)

E. coli P.aeruginosa S.aureus

(Rodríguez & Piña, 1993)

OMe

BrBr

HOHO

CN

O

O

Br

HO

Br

MeO

Br

Br

OHO N

O

NH

N

NH

NH2

9

ON

O

NH

OH

O

OHHN

O

NO OH

OMeBr

MeO

Br

Br

Br

BrOH

Br

Aplisinamisina II

A. cauliformis Puerto rico

E. coli P.aeruginosa S.aureus (Rodríguez & Piña, 1993)

11-oxoaereothionina

A. lacunosa Puerto rico

E. coli P.aeruginosa S.aureus

Mic=30µg/ml

(Acosta & Rodríguez,

1992)

Aerofobina-2

A. lacunosa

Venezuela

E.coli (Ávila-Nuñes, 2000)

11-desoxifistularina-3

ON

O

NH

O

OHHN

O

NO OH

OMeBr

MeO

Br

Br

Br

BrOH

Br

A. lacunosa

Venezuela

P.aeruginosa S.aureus (Ávila-Nuñes, 2000)

Fistularina-3

A. caissara

Brasil

E. coli P.aeruginosa S.aureus (De Lira et al., 2006)

MeO

Br

Br

OHO N

O

NH

N

NH

NH2

ON

O

NH

HN

O

NO

OH

OMe

Br

Br

Br

MeO

OH

O

Br

MeO

Br

Br

OHO N

O

NH NH

N NH2

10

11-hidroxiaereothionina

B. caissara Brasil

E. coli P.aeruginosa S.aureus (De Lira et al., 2006)

Aerothionina

A. gerardogreeni

México

M. tuberculosis H37Rv

monoresistentes Mic= 12.5 µg/ml (Encarnacion-Dimayuga et al., 2003)

Calafianina

ON

O

NH

HN

O

NO

OBr

Br

OO

O

A. gerardogreeni

México

M. tuberculosis H37Rv

multiresistentes Mic= 6.5 µg/ml (Encarnacion-Dimayuga et al., 2000)

2-hidroxi-3,5-dibromo-4-metoxifenil A. gerardogreeni

México

S. aureus MIC=250µg/ml

A. subtilis

Mic= 250 µg/ml Streptococuss fecalis

Mic= 62.5 µg/ml E.coli Mic= 500 µg/ml Vibrio harveyi

Mic= 500 µg/ml Candida albicans.

Mic= 500 µg/ml (León, 2003)

En lo referente a la esponja Aplysina gerardogreeni, Se han aislado diversos

compuestos con actividad antibacteriana, antimicobacteriana y citotóxica.

Encarnación et al. (2000) realizaron el aislamiento de los compuestos, aerothionina,

el ácido 3,5-dibromo-2-hidroxi-4-metoxifenilacético y el nuevo compuesto

ON

O

NH

HN

O

NO

OH

BrBr

MeO

OHBr

Br OMe

ON

O

NH

HN

O

NO

OH

OMe

Br

Br

Br

MeO

OH

OH

Br

11

calafianina. La estructura de este último fue determinada por análisis de RMN y

espectrometría de masas y en 2006 Ogamino y Nishiyama realizaron una revisión

de la estructura de la calafianina, la cual revela una relación trans de dos átomos de

oxigeno entre el epioxido y la isoxazolina. Tanto la calafianina como la aerothionina

presentaron actividad frente a diferentes variantes de M. tuberculosis (Tabla 1)

(Encarnación et al., 2003). Por otra parte el compuesto 2-hidroxi-3,5-dibromo-4-

metoxifenil presentó actividad antibacteriana (Tabla 1) (León, 2003). Posteriormente

Hernández-Guerrero et al. (2007) aislaron 18 compuestos derivados de la

dibromotirosina, de los cuales cuatro fueron descritos por primera vez, las

aplysinonas A-D, las cuales mostraron actividad citotóxica frente a las líneas de

células tumorales humanas MDA-MB-3231, A-549 y HT-29.

A partir de extractos de A. gerardogreeni, se ha realizado una evaluación de la

variación estacional de la actividad antibacteriana de los extractos frente a las cepas

de S. aureus y E.coli. Donde se encontró que la mayor actividad se presentó en

otoño, con halos de inhibición de 24.6mm y 24.4mm para cada cepa a una

concentración de 80mg mL-1 (Montes-Plascencia et al., 2010).

12

BIOLOGIA DE LA ESPECIE Y TAXONOMIA

Aplysina gerardogreeni (Gómez & Bakus, 1992) es una esponja tipo

Leuconoide, su color natural es amarillo- ocre en la base y rojiza en la parte superior.

Es de constitución masiva, provista de tubos pequeños en la cima, la superficie es

finamente conulosa, con conulos no menores a 1mm de alto. La dermis mide entre

60 a 278µm de grosor. Los canales excurrentes miden de 1 - 2mm de diámetro. Las

cámaras de coanocitos varían de 12 – 17 µm de diámetro. Presenta una

fibroreticulación poligonal irregular, sin distinción entre primarias y secundarias, el

diámetro de la fibra es de 200-2000 µm. A. gerardogreeni habita en las comunidades

rocosas y se distribuye a lo largo de la costa del Pacifico Mexicano hasta los 33m de

profundidad. Es muy frecuente encontrar a esta esponja asociada a moluscos

opistobranquios del genero Tylodina, los cuales se alimentan activamente de la

esponja e incluso depositan sobre ella las puestas para que la siguiente generación

eclosione directamente sobre su alimento (Suarez, 2002).

Phyllum: porífera

Clase: Demospongia

Subclase: Ceranctinomorpha

Orden: Verongida (Bergquist, 1978)

Familia: Aplysinidae (Carter, 1875)

Género: Aplysina (Nardo, 1813)

Aplysina gerardogreeni (Gómez y Bakus, 1992).

13

JUSTIFICACION

En la actualidad existe una evidente problemática con el uso de agentes

antibacterianos, debido a la resistencia por parte de las bacterias hacia los fármacos

existentes. Diversas cepas de bacterias Gram positivas (Streptococcus pneumoniae,

Enterococcus spp, Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Klebsiella spp y

Escherichia coli) presentan una resistencia creciente. Por lo que la industria

farmacéutica ha dirigido sus esfuerzos a la investigación de nuevos medicamentos.

Mucha de esta investigación está orientada principalmente hacia bacterias Gram

positivas, que son las que afectan en mayor medida a Norteamérica y Europa y

menos peso se le ha dado a bacterias Gram negativas, que presentan mayores

problemas en América Latina (Sader, 2002).

La búsqueda de nuevas sustancias bioactivas con actividad farmacológica, a partir

de organismos marinos representa un gran potencial económico, en este sentido las

esponjas del género Aplysina, presentan una gran cantidad de metabolitos bromados

derivados de la tirosina que se han caracterizado por presentar interesantes

actividades y dado que en el arrecife rocoso de Punta Arena, dentro del Golfo de

California, Aplysina gerardogreeni se encuentran ampliamente representada y se ha

observado que presenta actividad antibacteriana, resultaría de gran importancia

determinar la concentración mínima que inhibe el crecimiento bacteriano de una

cepa Gram positiva y una Gram negativa y tratar de identificar a las fracciones o

metabolitos secundarios responsables de dicha actividad biológica.

14

HIPOTESIS

El extracto orgánico de A. gerardogreeni del arrecife rocoso de Punta Arena

de la ventana puede inhibir el crecimiento de las cepas S. aureus (Gram positiva) y

E. coli (Gram negativa) a concentraciones menores de 80 mg mL-1 y las fracciones

semipurificadas presentaran una mayor actividad que el extracto.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antibacteriana del extracto y fracciones semi-purificadas

de la esponja Aplysina gerardogreeni (Gómez y Bakus, 1992) del arrecife

rocoso de Punta Arena, B.C.S., México.

OBJETIVOS PARTICULARES

Obtención del extracto orgánico y separación de fracciones de la esponja A.

gerardogreeni.

Análisis cromatográfico y espectroscópico de las diferentes fracciones

obtenidas.

Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto y fracciones frente a las

cepas patógenas Staphyloccocus aureus y Escherichia coli.

15

METODOLOGIA

Área de estudio

La recolección de los ejemplares se llevo a cabo en la localidad conocida

como Punta Arena de la Ventana, localizada en el litoral de Baja California Sur, entre

los 24°02’ N y los 109° 49’ W (Fig. 2). El área está formada por un macizo batolítico

llamado bloque de los cabos, constituido principalmente de rocas graníticas

metamórficas y clásticas originadas en el cretácico (Suárez, 2002).

En Punta Arena se observa una plataforma rocosa submarina y paralela a la

costa, que tienen por su parte más ancha 70m y una profundidad máxima de 3m;

donde termina la plataforma se advierte un borde vertical que desciende a una

profundidad no mayor a 7 m (Suárez, 2002).

Figura 2. Área de estudio en la zona de Punta Arena de la Ventana, B.C.S.

16

Obtención del material biológico.

Los ejemplares de Aplysina gerardogreeni se recolectaron a mano mediante

buceo SCUBA en Punta Arena de la Ventana (Fig. 2) por el grupo de Productos

Naturales Marinos del CICIMAR. La recolecta se realizó en el mes de septiembre de

2008 a una profundidad de 2m. Las esponjas debidamente etiquetados se

trasladaron en hielo al laboratorio de microbiología del CICIMAR, donde se

mantuvieron a -30 °C hasta su estudio químico. Una muestra de la esponja fue

preservada debidamente y se envió al Laboratorio de Ecología del Bentos a cargo

del Dr. José Luis Carballo, en el Instituto de Ciencias del Mar y Limnología (Campus

Mazatlán) para su identificación taxonómica.

Extracción y fraccionamiento.

Se registró el peso de los organismos y posteriormente se realizó una

extracción con una mezcla de acetona/metanol 1:1 a temperatura ambiente, el

volumen de disolvente utilizado fue 940 ml. La disolución restante se filtro y el

disolvente se evaporó a presión reducida, a este extracto se le añadió repetidamente

metanol y se separó la parte del extracto soluble en metanol. Esta disolución se

evaporó a presión reducida y se obtuvieron 7.23 g de extracto de color marrón. El

rendimiento del extracto se calculó mediante la siguiente fórmula:

Peso fresco del organismo (g) = Rendimiento del extracto 100%

Peso del extracto (g)

17

El extracto de MeOH se sometió a fraccionamiento mediante cromatografía en

columna de gel de sílice compactada con CHCl3/MeOH (9:1), usando como eluyente

mezclas de CHCl3/MeOH de polaridad creciente (9:1, 8:2, 7:3, 1:1, 4:6, 3,7) y MeOH.

Con base en el estudio de cromatografía en capa fina (CCF), las diferentes alícuotas

se agruparon en cuatro fracciones (A, 1, 2, 3) (Figura 3).

Figura.3 fraccionamiento del extracto NI

18

De acuerdo al análisis de CCF, se decidió continuar con el estudio de la

fracción 1, la cual fue sometida al proceso de purificación mediante cromatografía de

columna de gel de sílice compactada con He/AcOEt (6.5:3.5) y eluida con mezclas

de He/AcOEt de polaridad creciente (6.5:3.5, 6:4, 1:1, 4:6, 3:7, 2:8), AcOEt y MeOH.

A partir de esta columna se obtuvieron 69 alicuotas y mediante análisis de CCF se

agruparon en 10 fracciones (FA, FB, FC, F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7). La fracción F1

fue sometida a CC, para lo cual la cabeza de la columna se monto con CHCl3/MeOH

(96:4), usando como eluyente mezclas de CHCl3/MeOH de polaridad creciente (96:4,

95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9) y MeOH, obteniéndose 8 fracciones (de la A1 a la A8).

La fracción F2 también fue sometida a CC bajo las mismas condiciones que F1,

obteniéndose 6 fracciones (B1, B2, B3, B4, B5, B6) (Fig. 3).

Ensayos de actividad de extractos y fracciones frente a bacterias patógenas

para el hombre.

Tanto el extracto como algunas de las fracciones obtenidas fueron sometidos

a pruebas de actividad antibacteriana, la selección de las fracciones se realizó con

base en un análisis previo de CCF (Fig. 4).

Los ensayos se llevaron a cabo mediante el método de difusión en agar frente

a las cepas Staphyloccocus aureus (Gram positiva) y Escherichia coli (Gram

negativa). A partir de la cepa patógena se realizó una resiembra en medio TSA para

tener un inoculo de 12 hrs. Para los ensayos de actividad se utilizó medio Müeller

Hinton, el cual se preparo y se colocó en alícuotas de 12 mL en tubos de ensaye, los

19

cuales posteriormente fueron esterilizadas a 15 libras durante 15 minutos. En

ambiente estéril cada alícuota fue vaciado en cajas petri de 10cm de diámetro, para

tener una capa de agar de un mismo espesor, esto permitió estandarizar la

susceptibilidad del bioensayo, ya que se sabe que este es uno de los factores que

pueden modificar la difusión de las sustancias sobre el agar (Washington, 1988).

Para la preparación de los sensi-discos, se realizaron diluciones del extracto con

metanol para tener diferentes concentraciones (80, 60, 40, 20, 10 y 5 mg mL-1), a

partir de estas diluciones se colocaron 25µl sobre cada sensidisco de 6mm de

diámetro en condiciones estériles para obtener una concentración en cada disco de

2, 1.5, 1, 0.5, 0.25 y 0.125 mg. Las fracciones que mostraron señales de compuestos

en las placas de CCF fueron sometidas a los ensayos de actividad (Fig. 4). Estas se

diluyeron con cloroformo a una concentración de 20 mg mL-1 y se colocaron en los

discos, en alícuotas de 25µl. Para la inoculación de la cepa, se preparó una

suspensión de aproximadamente 1x108 cel/ml, esparciéndose en el medio con un

hisopo estéril. Posteriormente se colocaron los discos con el extracto y las fracciones

en las placas, así como un disco con Tetraciclina de 30µg como control positivo y un

disco con el disolvente utilizado como control negativo. De todas las pruebas se

realizaron cuatro replicas.

Las cajas de petri con los sensidiscos se colocaron en el refrigerador durante

40 min, con el fin de retardar el crecimiento microbiano mientras las sustancias

antibióticas se difunden sobre el agar. Posteriormente, las cajas de petri se

20

introdujeron en la incubadora a una temperatura de 35°C durante 24 hrs. Después se

midieron los diámetros de halos de inhibición (en mm).

Figura 4. Fracciones que fueron probadas frente a las cepas bacterianas.

21

Análisis cromatográfico y espectroscópico de las diferentes fracciones

obtenidas.

Los análisis de cromatografía en capa fina (CCF) se realizaron sobre placas

de gel de sílice Kiesegel 60 F254 (Merck) de 0.2 mm de espesor, con indicador

fluorescente. Las cromatografías se siguieron por UV (254 nm) y se revelaron

mediante pulverización con una disolución de ácido sulfúrico al 10% y calentamiento

de la placa. A los diferentes productos observados se les determino su factor de

retención (Rf) mediante la siguiente fórmula:

Rf= distancia que recorre la mancha del producto

Distancia recorrida por el disolvente.

Las diferentes fracciones se analizaron mediante espectros de Resonancia

Magnética Nuclear (RMN). Los espectros de protón (1H-RMN), se registraron en un

equipo Varian INOVA 400 del Servicio Central de Ciencia y Tecnología de la

Universidad de Cádiz. Como disolventes se utilizó cloroformo (CDCl3) y acetona

((CD3)2CO) deuterados. Los desplazamientos químicos se expresan en la escala δ

(ppm). Se utilizó como referencia interna la señal del disolvente residual no

deuterado, a δ 7.26 para el cloroformo y δ 2.04 para la acetona.

22

RESULTADOS

Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni.

A partir de los ejemplares de A. gerardogreeni se obtuvieron 7.2 g de extracto

de color café oscuro y aspecto oleoso, con un rendimiento de extracción con

acetona-MeOH 1:1 del 6.1%. Un análisis del extracto mediante CCF eluida con

CHCl3/MeOH 9:1 indicaba la presencia de varios compuestos fluorescentes al UV

con un Rf entre 0.8 y 0.2.

El ensayo de actividad antibacteriana del extracto mostró una evidente

actividad frente a las cepas S. aureus y E.coli, dando lugar a amplios y bien definidos

halos de inhibición a diferentes concentraciones (80, 60, 40, 20, 10 y 5 mg mL-1),

mientras que los discos de control negativo con disolvente no presentaron efectos

sobre el crecimiento microbiano (Fig. 5 y 6).

Figura 5. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a S.aureus. A: 80 mg mL-1, B: 60 mg mL-1, C: 40 mg mL-1, D: 20 mg mL-1, E: 10 mg mL-1, F: 5 mg mL-1, G: control positivo tetraciclina 30 µg y H: control negativo.

A

B

C D

E

F

G G

H H

23

Figura 6. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a E.coli. A: 80

mg mL-1, B: 60 mg mL-1, C: 40 mg mL-1, D: 20 mg mL-1, E: 10 mg mL-1, F: 5 mg mL-1, G: control positivo tetraciclina 30 µg y H: control negativo.

Frente a S. aureus se obtuvieron halos de inhibición de 38.8 mm a la

concentración más alta (80 mg mL-1) y de 17.5 mm a la concentración más baja

(0.125 mg) como se muestra en la tabla I.

Los resultados de actividad frente a E.coli mostraron que el extracto fue

menos activo frente a esta cepa en comparación con los valores obtenidos frente a

S. aureus. Los halos de inhibición fueron de 9.8 mm a una concentración de 0.125mg

y de 21.5 mm con la concentración de 2 mg (Tabla I).

Para ambos casos se considero que la concentración mínima inhibitoria (MIC)

es de 1mg donde se encuentran halos de 31.5 mm para S. aureus y de 18 mm para

E.coli.

G

H

H

G

.25mg

F

A

B

C

D

E

24

Tabla I. promedio de los halos y desviación estándar del extracto a diferentes

concentraciones. Superíndices (mayúscula) iguales indican que no hay diferencia significativa entre tratamientos ANDEVA, ≤ p 0.01.

S. aureus E.coli

concentacion del extracto Promedio (mm)

Desviación estándar

Promedio (mm)

Desviación estándar

80 mg mL-1 A 36.8

1.7 A 21.5 1.3

60 mg mL-1 AB 33.8

2.5 A 20.8 0.95

40 mg mL-1 B 31.3

0.95 B 18 0

20 mg mL-1 C 19.5 0.57 B 16 1

10 mg mL-1 C 18.8 0.95 C 13 0.81

5 mg mL-1 C 17.5 0.57 D 9.8 1.5

(Cp) Tetraciclina 30µg 36.9 3.7 29.4 1.8

Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A.

gerardogreeni.

El fraccionamiento del extracto crudo dio lugar a tres fracciones (1, 2 y 3), de

las cuales, la fracción 1 fue la mayoritaria con 200 mg y la única que presentaba

actividad antibacteriana (Tabla II).

25

Tabla II. Halos para el primer fraccionamiento del extracto. Se muestra el promedio y la desviación estándar.

S. aureus E.coli

Fracción Promedio (mm)

Desviación estándar

Promedio (mm)

Desviación estándar

1 23.2 3.6 17.7 0.81

2 --- --- --- ---

3 ---

--- --- ---

Cp 35.8 1.5 24.9 1.9

El espectro de 1H-RMN de esta fracción mostraba varias señales

correspondientes a compuestos derivados de la dibromotirosina y el análisis de CCF

(eluido con He/AcOEt 6:4) mostraba la presencia de varios productos fluorescentes a

la luz UV y con valores de Rf de entre 0.1 y 0.8. La purificación de la fracción 1 dio

lugar a 10 fracciones, de las cuales se continúo con el estudio de cinco de ellas (F1-

F5) tomando como criterio su peso y análisis en CCF.

Fracciones F1 y F2.

A partir de las fracciones F1 y F2 se obtuvieron 7 y 10 mg respectivamente de

un compuesto (1) solido amorfo (subfracciones A2 y B2), que en CCF eluida con

He/AcOEt 3:7 mostraba la presencia de un compuesto fluorescente a la luz UV y con

un Rf= 0.9. El espectro de 1H-RMN de este compuesto (1) en CDCl3 (Figura 7)

mostraba las señales de un metoxilo a δH 3.75 (s), un metino olefínico a δH 6.33 (s),

26

un metileno a δH 3.95 (d, J=18.46 Hz) y a δH 3.01 (d, J=18.44 Hz), un metileno a δH

1.68 (m), también se observo el protón de hidroxilo a δH 4.43 (s), y de un grupo

amino a δH 6.66 (t).

Figura 7. Espectro de 1H-RMN del producto 1 en CDCl3.

Tanto las fracciones F1 y F2 como el producto 1 no fueron activos frente a S.

aureus y E. coli a una concentración de 0.5 mg (Tabla III)

27

Tabla III. Halos de las fracciones correspondientes al fraccionamiento de la alícuota 1. Se muestra el promedio y la desviación estándar.

S. aureus E.coli

Fracción Promedio (mm)

Desviación estándar

Promedio (mm)

Desviación estándar

F1

--- --- --- ---

F2 --- --- --- ---

F3 22.5 2.9 23.8 4.4

F4 17.2

2.7 18.2 .75

F5 11 0 12.7 0.81

Cp 35.8 1.5 24.9 1.9

Fracción F3.

El análisis mediante CCF de la fracción F3 mostraba la presencia de dos

compuestos con Rf=0.6 y 0.9, los cuales eran fluorescentes a la luz UV.

Por otra parte el espectro de 1H-RMN indicaba la presencia de señales de un

grupo metoxilo, un par de metilenos, un metino olefínico características de

compuestos derivados de la dibromotirosina (Fig. 8). Contrario a las fracciones

anteriores, F3 si presento actividad frente a las cepas de S. aureus y E. coli. En la

tabla III se muestra que esta fracción fue la más activa con halos de inhibición de

22.5 mm para S. aureus y para el caso de E. coli fueron de 23.8 mm a una

concentración de 0.5 mg.

28

Figura 8. Espectro de 1H-RMN de la fracción F3 en CDCl3.

Fracción F4 y F5.

El análisis en CCF de las fracciones F4 y F5 mostraba la presencia de dos

manchas fluorescentes a la luz UV con un Rf de 0.7 y 0.9 y de 0.7 y 0.8

respectivamente. Las señales en el espectro de 1H-RMN de estas fracciones

indicaron que se trataba de un compuesto similar, sin embargo, no se juntaron

debido a que la actividad antibacteriana fue diferente, siendo más activa F4 y de la

cual se muestra el espectro de RMN (Fig. 9).

29

Figura 9. Espectro de 1H-RMN de las fracciones F4 en CDCl3.

30

DISCUSIÓN.

Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni

La esponja Aplysina gerardogreeni del Golfo de California presenta una

evidente actividad antibacteriana, ya sea a nivel de extractos orgánicos frente a

cepas de bacterias patógenas (Betancourt-Lozano, 1998; Montes-Plascencia, 2010),

o a nivel de compuestos puros frente a Mycobacterium tuberculosis (Encarnación et

al., 2000; Encarnación-Dimayuga et al., 2003) o cepas de s. aureus, B. subtilis,

Streptococuss fecalis, E.coli, Vibrio harveyi y Candida albicans (León, 2000). En este

trabajo se confirmo esta actividad antibacteriana y se estableció la concentración del

extracto de esta especie del área de Punta Arena de la Ventana con mejor actividad,

así como las fracciones con potencial para continuar con su estudio químico en la

búsqueda de compuestos antibacterianos.

En cuanto a los porcentajes de rendimiento del extracto se sabe que existe

una variación dependiendo de la época del año en que se recolectan los ejemplares,

siendo en verano cuando se obtienen los mejores rendimientos de extracción para A.

gerardogreeni (6.2%) (Montes-Plascencia et al., 2010), nuestros resultados

concuerdan con esto, ya que con ejemplares de septiembre se obtuvo un porcentaje

de rendimiento del 6.1 %. Por lo que puede decirse que verano es la mejor época de

recolecta para obtener los mejores rendimientos con ejemplares de esta localidad.

El extracto de MeOH de A. gerardogreeni de Punta Arena de la Ventana,

mostro actividad antibacteriana frente a S. aureus y se observó que 5 mg mL-1 fue la

mínima concentración (MIC) que inhibe el crecimiento de la cepa dando lugar a

31

halos de inhibición de 17.5 mm y frente a E. coli la MIC fue de 20 mg mL-1 con halos

de inhibición de 16 mm. Es evidente que el extracto fue más activo frente a S.

aureus, lo cual resulta interesante ya que esta cepa muta fácilmente e incorpora

genes de resistencia frente a los antibióticos (Walker, 2000). De igual modo el hecho

de que el extracto sea activo frente a una cepa Gram negativa como E. coli es de

interés ya que estas bacterias causantes del 90% de las infecciones en el tracto

urinario (Del Rio-Pérez, 1997; Daza-Pérez, 1998), presentan una membrana externa

que las protege de varios antibióticos, colorantes y detergentes que normalmente

dañarían la membrana interna o la pared celular de peptidoglicano. La membrana

externa proporciona a estas bacterias resistencia a la lisozima y a la penicilina. Por lo

que es importante conocer tratamientos alternativos para combatir la membrana

externa de protección de estos patógenos. Así como comprender el funcionamiento

de los metabolitos bromados con actividad biológica frente a bacterias Gram-

positivas y negativas in vitro e in vivo (Cruz et al, 1990; Rodríguez & Piña, 1993;

León, 2000).

Los extractos orgánicos son una mezcla de diversos componentes y en

determinadas ocasiones generan reacciones antagónicas entre los compuestos

activos, por lo que se puede observar la misma actividad a diferentes

concentraciones del extracto. Para el caso de A. gerardogreeni no ocurre esto, ya

que se observó que al incrementar la concentración del extracto, también se

incrementa la actividad antibacteriana.

32

Estudios de actividad antibacteriana con ejemplares de la misma zona durante

otoño mostraron una menor actividad frente a S. aureus (halos de 22.6 mm) y muy

similar frente a E. coli (halos de 22.4 mm) a una concentración de 80 mg mL-1

(Montes-Plascencia et al., 2010). Por otro lado, al comparar los resultados con los

obtenidos a partir de un extracto de A. fistularis se observa que a una concentración

de 40mg/mL-1 se obtuvieron halos similares frente a S. aureus (31mm), por otra parte

frente a E. coli, el extracto de A. fistularis presento una mayor actividad con halos de

23mm (Vilma-lanza et al., 2006) Al comparar la actividad frente a S. aureus de otros

géneros de esponjas como Dragmacidon reticulata, Xetospongia próxima, Petromica

ciocalyptoides y Halichondria sp. que presentaron halos de inhibición de entre 10 y

12.7 mm con concentraciones de 500 mg mL-1 (Mora-Cristancho et al., 2008), se

observa que Aplysina tiene una mayor actividad frente a esta cepa.

Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A.

gerardogreeni

Al fraccionar el extracto crudo de A. gerardogreeni se observo que de las tres

primeras fracciones obtenidas, sólo una fue activa, y a la concentración de 20 mg

mL-1 presento mayor actividad que el extracto crudo (S. aureus: 19.5mm, E.coli:

16mm), un comportamiento similar se observó en un estudio químico del extracto de

A. fistularis de Brasil donde conforme se purificaba el extracto la actividad

antimicrobiana fue mayor y aun con una concentración menor a la probada

inicialmente los halos de inhibición fueron mayores (Lanza et al., 2006).

33

Conforme esta fracción activa se fue purificando, se realizó el estudio de

cinco fracciones, que se discuten a continuación.

Fracciones F1 y F2.

Al analizar las fracciones F1 y F2, por medio de la placa de CCF y el espectro

de 1H-RMN, se observó que se trataba de un compuesto puro (1). Al comparar los

desplazamientos químicos de los espectros en cloroformo y acetona deuterados con

los obtenidos por Shingeru, 1985 (Tabla IV) se determino que el compuesto (1)

correspondía con la aerothionina (Figura 10).

Tabla IV. Desplazamientos químicos de 1H-RMN del compuesto aerothionina en acetona y

cloroformo deuterado.

δ 1H (mult., J en Hz)

# H Shingeru, 1985

Acetona d6

Acetona d6 CDCL3

1/ 1’ 4.18 (7.5) 4.18

5/ 5´ 6.53 6.51 6.33

7/ 7’ 3.15 (18)

3.85 (18)

3.16 (18)

3.82 (18)

3.01 (18)

3.85 (18)

10/ 10’ 3.2-3.5 3.32 3.3

3.45

11 / 11’ 1.62 1.61 1.68

OCH3 3.77 (s) 3.77 (s) 3.75 (s)

OH 5.40 (7.5) 5.42 (7.5) 4.43

NH 7.60 7.60 6.66

34

ON

O

NH

HN

O

NO

OH

BrBr

MeO

OHBr

Br OMe

27

Figura 10. Estructura química de la Aerothionina.

La aerothionina fue aislada originalmente de las esponjas Aplysina aerophoba

y Verongia thiona (Fattorusso, 1970). Desde entonces ha sido re-aislada en diversas

especies del género Aplysina (Moody et al., 1972; Andersen y Faulkner 1973;

Gopichand y Schmitz, 1979; McMillan et al., 1981; Acosta y Rodríguez, 1992;

Ciminiello et al., 1994; Compagnone et al., 1999; Encarnación et al., 2000; Payuana

et al. 2002; Thoms et al., 2004; Hernández-Guerrero et al., 2007), lo cual confirma

que es uno de los principales componentes de estas esponjas aportando

aproximadamente el 10% (Minale, 1976). Este compuesto es un derivado de la 3,5-

dibromotirosina y la cadena central C4N2 se deriva de la ornitina (Peng et al., 2005).

Los resultados obtenidos en este estudio indicaron que la aerothionina no

presentó actividad antibacteriana frente a las cepas probadas, resultados similares

fueron obtenidos por León (2003). Sin embargo, existe un registro de que presentó

actividad frente a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Candida albicans (Peng

et al., 2005 citado en Alvarez, 2007). Cabe mencionar que en una de las replicas del

bioensayo de este trabajo, se presentó un halo pequeño, pero debido al tamaño no

1

3 5

7

9

10

11

1’

3´

5´

7’

9’

10’ 11´

35

fue considerado como activo. Este compuesto ha presentado actividad

antimicobacteriana frente a Mycobacterium tuberculosis, (Encarnación et al., 2003)

así como actividad neuroprotectora y como inhibidor del incremento de la

concentración de calcio intracelular (Álvarez 2007).

Fracción F3

Esta fracción fue la más activa y además se observó que la actividad frente a

E. coli se incremento. Lo cual sugiere que los productos presentes en esta fracción

tienen mayor selectividad frente a bacterias Gram negativas. Los compuestos

pueden actuar de diferentes formas en la pared celular de una bacteria, una forma

podría ser que estos compuestos posean una importante actividad antibacteriana,

debido a que reducen la tensión superficial y actúan sobre los lípidos de la

membrana provocando alteraciones de las mismas, lo que conlleva a la muerte

celular; para ello se sugiere la formación de complejos con el colesterol presente en

la membrana, otro caso podría ser la desnaturalización de las proteínas (Marcano &

Hasegawa 2002; Kazanjian & Fariñas, 2006).

Fracción F4 y F5.

Las fracciones F4 y F5, a pesar de ser muy similares en CCF y en el espectro de 1H-

RMN, mostraron diferencias en los valores de actividad, siendo F4 más activo, lo cual

podría deberse a que el producto se encuentre más puro y por lo tanto la

concentración a la que se probaron ambas fracciones no fuera la misma.

36

CONCLUSIONES.

El extracto de la esponja Aplysina gerardogreeni presento actividad

antibacteriana frente a las cepas de S.aureus y E.coli y la concentración

mínima inhibitoria fue de 40 mg mL-1 presentando halos de inhibición de 31 y

18 mm respectivamente.

El análisis químico del extracto de A. gerardogreeni dio lugar al aislamiento de

un compuesto puro y varias fracciones semipurificadas.

El compuesto puro fue identificado mediante la comparación de sus señales

de RMN como la aerothionina, la cual no presento actividad frente a las cepas

de S.aureus y E.coli a una concentración de 0.5 mg.

De las fracciones semipurificadas (F3, F4 y F5), F4 fue la más activa

presentando a una concentración de 0.5 mg, halos de inhibición de 17.2 y 18.2

mm frente a S.aureus y E.coli respectivamente. Por lo que se recomienda

continuar con el estudio químico de esta fracción para identificar el compuesto

responsable de esta actividad.

37

BIBLIOGRAFÍA

Acosta A.L., A.D. Rodríguez. 1992. 11-oxoaerothionin: a cytotoxic antitumor

bromotyrosine derived alkaloid from the caribbean marine sponge Aplysina

lacunosa. J. Nat. Prod. 55, 1007-1012.

Andersen R.J., D.J. Faulkner. 1973. A novel antibiotic from a sponge of the genus

Verongia. Tetrahedron Lett.1175-1178.

Álvarez-Villalobos R.M. 2007. Estudio de las propiedades de bloqueo de canales de

calcio neuronales de compuestos orgánicos asilados de especies del Phylum

Porifera. Tesis doctoral. Universidad Autonoma de Madrid. Facultad de

medicina. Departamento de farmacognosia y terapéutica.102pp.

Azevedo L. G., Ana L. Muccillo-Baisch, Daza de M.V.B. Filgueira, Robert T. Boyle,

Daniela F. Ramos, Andrea D. Soares, Clea Lerner, Pedro A. Silva and Gilma

S. Trindade. 2008. Comparative cytotoxic and anti-tuberculosis activity of

Aplysina caissara marine sponge crude extracts. Comparative Biochemistry

and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology.Volume 147, Issue 1,

January, Pages 36-42.

Betancourt-Lozano, M., F. González-Farías, B. González-Acosta, A. García-Gasca &

J.R. Bastida-Zavala. 1998. Variation of antimicrobial activity of the sponge

Aplysina fistularis (Pallas, 1776) and its relation to associated fauna. J. Exp.

Mar.Biol. Ecol., 223: 1-18.

Bonay M.P. y M. Fresno. 2000. Lectins from Tropical Sponges. Purification and

caracterización of Lectins from genus Aplysina. Journal of Biological

Chemistry. 275(38): 29283-29289.

38

Bongorni L. & F. Pietra. 1996 Marine natural products for industrial applications.

Chem & Ind. 15: 15-58.

Blunt J.W., B.R. Copp, M.H.G. Munro, P.T. Northcote y M.R. Prinsep. 2006. Marine

Natural Products. Nat. Prod. Rep. 23: 26-78.

Brusca R.C. y G.J. Brusca. 2005. Invertebrados. McGraw-Hill Interamericana,

España. 1005 p.

Carballo J.L., Vega C., Cruz-Barraza J.A. Yañes B., Nava H., Ávila E & M. Wilson.

2008. Short and long-term patterns of sponge diversity on rocky tropical

coast: evidence of large structuring factors.Marine Ecology an Evolutionary

Perspective. En prensa

Ciminiello, P., V. Costantino, E. Fattorusso,S Magno, A. Mangoni, M. Pansini. 1994.

Chemistry of Verongida sponges, II. Constituents of the Caribbean sponge

Aplysina fistularis forma fulva. J. Nat. Prod. 57, 705-712.

Ciminiello P., V. Costantino, E. Fattorusso, S. Magno y M. Pansini. 1999. Chemistry

of Verongida sponges. 9 Secondary metabolite composition of the Caribbean

sponge Aplysina cauliformis. Journal of Natural Products. 62(4): 590-593 pp.

Compagnone R.S., R. Avila, A.I. Suárez, O.V. Abrams, H.R. Ragel, F. Arvelo, I.C.

Piña, y E. Merentes. 1999. 11-Deoxyfistularin-3, a new cytotoxic metabolite

from the Caribbean sponge Aplysina fistularis insularis. Journal of Natural

Products. 62(10):1143-1444.

Cruz, F., L. Quijano, F. Gómez-Garibay,T. Rios. 1990. Brominated metabolites from

the sponge Aplysina (Verongia) thiona. J. Nat. Prod. 53, 543-548.

39

Daza-Perez R.M. 1998. Resistencia bacteriana a antimicrobianos: su importancia en

la toma de decisiones en la práctica diaria. Inf.Ter. Sist. Nac. Salud. 22:57-

67.

De Lira T.O., R.G.S. Berlinck, G.G.F. Nascimiento, E. Hajdu. 2006. Further

dibromotyrosine derivated metabolites from the marine sponge Aplysina

caissara. J. Braz. Chem. Soc. 17(7):1233-1240.

Del Río-Perez G. 1997. Tratamiento de las infecciones urinarias. En: Tratamiento

antimicrobiano. Ed. Emisa. Madrid. 429-444.

Dembitsky M.V., A.T. Gloriozova, y V.V. Poroikov. 2005. Novel antitumor agents:

marine sponges alkaloids, their synthetic analogs and derivatives. Mini-

Reviews in Medicinal Chemistry. 5(3):319-336.

Encarnación R.D., E.S. Olachea, J. Malmstrom y C. Christophersen. 2000.

Calafianine a bromotyrosine derivative from the marine sponge Aplysina

gerardogreeni. Journal of Natural Products 63(6):874-875.

Encarnación R.D., M.R. Ramírez, y J. Luna-Herrera. 2003. Aerothionin, a

bromotyrosine derivative with antimycobacterial activity from the marine

sponge Aplysina gerardogreeni (Demospongia). Pharmaceutical Biology.

41(5):384-387.

Faulkner D.J. 2002. Marine Natural Products. Nat. Prod. Rep. 19:1-48.

Fattorusso, E., L. Minale, G. Sodano. 1972. Aeroplysinin-1, an antibacterial bromo-

compound from the sponge Verongia aerophoba. J. Chem. Soc. Perkin1, 16-18.

Fattorusso, E., L. Minale, G. Sodano, K. Moody, R.H.Thomson. 1970. Aerothionin, a

tetrabromo-compound from Aplysina aerophoba and Verongia thiona. Chem

Comm. 752-753.

40

Fenical W.1882. Natural products chemistry in the marine environment. Science. 215

(4535). 923-928.

Garson M.J.,R.Van Soest., Van Kempe T., Braekman J., Balkema y Rotterdan 1994.

The biosyntesis of sponges secundary metabolites. Sponges in time and

space.

Gopichand Y., F.J. Schmitz. 1979. Marine natural products: Fistularin-1, -2, and -3

from the sponge Aplysina fistularis forma fulva. Tetrahedron Lett. 3921-3924.

Gómez, P. y G.J. Bakus. 1992. Aplysina gerardogreeni y Aplysina aztecus (Porifera;

Demospongiae), nuevas especies del Pacífico Mexicano. Anales del Instituto

de Ciencias del Mar y Limnología, Universidad Autónoma de México.

19(2):175-180.

Guanasekera, S.P. y S.S. Cross. 1992. Fistularin 3 y 11-ketofistularin 3. Feline

leucemia virus active bromotyrosine metabolites from the marine sponge

Aplysina archeri. Journal of Natural Products. 55(4):509-512.

Gutiérrez, M., Capson, T., Guzmán, H.M., González, J., Ortega-Barría, E., Quiñoá,

E., y Riguera, R. 2005. Antiprotozoal activity against Plasmodium falciparum

and Trypanosoma cruzi of Aeroplysinin-1 isolated from the new sponge

Aplysina chiriquensis. Pharmaceutical Biology. 43 (9):762–765 pp.

Hentschel U., M. Schmid, M. Wagner, L. Fieseler, C. Gernert, J. Hacker. 2001. Isolation

and phylogenetic analysis of bacteria with antimicrobial activities from the

mediterranean sponges Aplysina aerophoba and Aplysina cavernícola. FEMS

Microbial. Ecol. 305:305-312.

41

Hernández-Guerrero CJ, E. Zubía, M.J. Ortega, y J.L. Carballo. 2007. Cytotoxic

dibromotyrosine-derived metabolites from the sponge Aplysina gerardogreeni.

Bioorganic & Medicinal Chemistry. 15: 5275-5282.

Hooper J. Van Soest RWM.2002. Systema Porifera: A gude to the classification of

sponges. Kluwer Academy. New York. 1101 pp.

Kazanjian, A. y M. Fariñas. 2006. Actividades biológicas del extracto acuoso de la

esponja Aplysina lacunosa (Porifera: Aplysinidae). Revista de Biología

Tropical. 54.

Keer, G.S. 1988. Selección antimicrobiana de esponjas, cnidarios y equinodermos

marinos, y detección de saponinas. Tesis de Licenciatura. Universidad

Autónoma de Baja California Sur, La Paz. 58 pp.

Koulman A., P. Porksch, R. Ebel, A.C. Beekman, W. van Uden, A.W.T. Konings,

J.A. Pedersen, N. Pras, y H.J. Woerdenbag. 1996. Cytotoxicity and mode of

action of aeroplysin-1 and a related dienone from the sponge Aplysina

aerophoba. Journal of Natural Products. 59(6):591-594.

Lanza, V., Crescente, O. y Henríquez, W. (2006). Aislamiento y actividad

antibacteriana de un terpeno de la esponja marina Aplysina fistularis. Bol.

Inst. Oceanogr. 45 (2): 93-99pp.

León D.L. 2000. Búsqueda de compuestos con actividad biológica en Aplysina

gerardogreeni, Gómez y Bakus, 1992 (Porifera; Demospongia, Verongida).

Tesis de Licenciatura. Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz,

BCS. 37 p.

42

León D.L. 2003. Aislamiento, purificación, identificación y evaluación de la actividad

antimicrobiana de compuesto de Aplysina gerardogreeni, Gómez y Bakus,

1992 (Porifera; Demospongia, Verongida). Tesis de Maestría. Instituto

Politécnico Nacional, La Paz, BCS. 77 pp.

Marcano, D. & M. Hasegawa. 2002. Fitoquímica Orgánica. Consejo Científico, Univ.

Central Venezuela, Caracas. 451 p.

McMillan J.A., I.C. Paul, Y.M. Goo,K.L. Rinehart Jr., W.C. Krueger, L.M. Pschigoda.

1981. An X-ray study of aerothionin from Aplysina fistularis (Pallas). Tetrahedron

Lett., 22, 39-42.

Minale L. 1976. Natural Product Chemistry of the Marine Sponges. Pure Appl.

Chem.48, 7.

Montes-Plascencia, C.I., C.J. Hernández-Guerrero, B. González-Acosta & R.N.

Águila Ramírez. 2010. Seasonal variation of anti bacterial activity of Aplysina

gerardogreeni from the Gulf of California. CICIMAR-Oceánides, 25(1):79-81.

Moody K., R.H. Thomson, E. Fattorusso, L. Minale, G. Sodano. 1972. Aerothionin

and homoaerothionin: Two tetrabromo spirocyclohexadienylisoxazoles from

Verongia sponges. J. Chem. Soc. Perkin 1. 18-24.

Mora-Cristancho J.A., F. Newmark, M. Santos-Acevedo, J. Sánchez-Nieves. 2008.

Evaluación de extractos de esponjas marinas como nuevas fuentes de

sustancias antimicrobianas. Rev Esp Quimioter. 21(3):174-179

Munro M.H.G.; J.W. Blunt, E.J. Dumdei, S.J.H. Hickford, R.E. Lill, S. Li, C.N.

Battershill y A.R. Duckworth. 1999. The discovery and development of marine

compounds with pharmaceutical potential. J. Biotechnol. 70, 15-25.

43

Navarro S. M. J. 2005. Evaluación antimicrobiana del extracto hexánico Aplysina

gerardogreeni Gómez y Backus, 1992 (Porífera: Demospongia, Verongida).

Tesis de Licenciatura.Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz,

52 pp.

Norte M., J.J. Fernández. 1987. Isolation and synthesis of aplysinadiene, a new

rearranged dibromotyrosine derivative from Aplysina aerophoba. Tetrahedron

Lett. 28, 1693-1696.

Nuñez C. V., E. V.R. de Almeidaa, Granatoa A. C., Suzi O. M., Santosa K. O.,

Pereiraa F.R., Macedoa M.L., Ferreirab A.G., Hajduc E., Pinheiroc U.S.,

Muricyc G., S. Peixinhod, Freemane C.J., Gleasone D.F. and R.G.S.

Berlincka. 2008. Chemical variability within the marine sponge Aplysina fulva.

Biochemical Systematics and Ecology Volume 36. Issue, April, Pages 283-

296.

Ogamino T., R. Obata, H. Tomoda, S. Nishiyama. 2006. Total synthesis, structural

revision, and biological evaluation of calafianin, a marine spiroisoxazoline from

the sponge, Aplysina gerardogreeni. Bull Chem. Soc. Jpn. 79, 134-139.

Payuana M., N. V. Petrichtcheva, A.L. Morales, C. Duque & S. Zea. Algunos

aspectos de ecología química de las esponjas del Caribe Axinyssa Ambrosia y

Aplysina Insularis. Rev. Acad. Colomb. Cienc. 26(101): 565-574. ISSN 0370-

3908.

Pawlik J.R. 1993. Marine Invertebrate Chemical Defenses. Chem. Rev. 93:1911-

1922.

Peng J., J. Li, M.T. Hamann. 2005. The marine bromotyrisine derivatives. Alkaloids

Chem Biol. 61. 59-562.

44

Programa Nacional de Salud 2007-2012. 2007. Secretaria de Salud. México. ISBN

978-970-721-414-9.

Rodríguez A.D. y I.C. Piña. 1993. The structures of aplysinamisines I, II and III: New

bromotyrosine-derived alkaloids from the Caribbean sponge Aplysina

cauliformis. J. Nat. Prod. 56: 907-914.

Sader H.S. 2002. Nuevas alternativas en el armamento anti infeccioso que el clínico

debe conocer. Revista Chilena de Infectología. 19(1) versión en línea doi:

10.4067/S0716-10182002019100002.

Shigeru, N, S. Yamamura. 1985. Total syntheses of (±)-aerothionin, (±)-

homoaerothionin and (±)-aerophobin-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 50: 3453-3456.

Suarez G.I. 2002. Estructura de las asociaciones de moluscos en corales del género

Pocillopora Lamarck, 1818; en Punta Arena de la Ventana, B.C.S. México.

Tesis de Licenciatura. Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz,

35 pp.

Thoms, C., M. Wolff, K. Padmakumar, R. Ebel y P. Proksch. 2004. Chemical defense

of Mediterranean sponges Aplysina cavernicola and Aplysina aerophoba. Z.

Naturforsch. 59: 113-122.

Walker T. 2000. Microbiología. México: McGraw Hill Interamericana.