UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE COAHUILA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

APUNTES DE APOYO PARA EL CURSO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL.

PROGRAMA EDUCATIVO: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

IV SEMESTRE

AUTOR. DR. GERARDO DE JESÚS SOSA SANTILLÁN

ELABORADO: ENERO DE 2006. MODIFICADO: ENERO 2007.

SALTILLO, COAHUILA, MÉXICO

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ÍNDICE

Pág I. Introducción a la Microbiología……………………………….……………………. 1 1.1 El Descubrimiento de los Microorganismos………………..…………………… 1 1.2 El Conflicto de la Generación Espontánea…………………...………………… 1 1.3 El Reconocimiento del Papel de los Microorganismos en el Desarrollo de Enfermedades…………………………………………………………………………..

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1.4 El Descubrimiento del Efecto Microbiano Sobre la Materia Orgánica e Inorgánica………………………………………………………………………………..

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1.5 Composición del Mundo Microbiano…………………………………………….. 6 1.6 Relevancia de la Microbiología en la Vida Diaria………………………………. 8 II. Estudio de la Estructura Microbiana………………………………………………. 9 2.1 Microscopio Óptico (de Campo Claro, de Campo Oscuro, de Contraste de Fases, de Fluorescencia)………………………………………………………………

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2.2 Preparación y Tinción de Muestras (Fijación, Colorantes y Tinción Simple, Tinción Diferencial)……………………………………………………………………..

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2.3 Microscopia Electrónica…………………………………………………………… 14 III. Estructura y Función de la Célula Procariota…………………………………… 16 3.1 Tamaño, Forma y Organización Procariota…………………………………….. 16 3.2 Membranas de Células Procariotas (Membrana Plasmática y Sistemas de Membranas Internas)............................................................................................

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3.3 Matriz Citoplasmática...................................................................................... 20 3.4 Nucleoide........................................................................................................ 22 3.5 Pared Celular Procariota................................................................................. 23 3.6 Componentes Externos a la Pared Celular..................................................... 27 3.7 Quimiotaxis..................................................................................................... 31 3.8 Endospora Bacteriana..................................................................................... 32 IV. Nutrición Microbiana……………………………………………………………….. 35 4.1 Requerimientos Comunes de Nutrientes……………………………………….. 35 4.2 Tipos Nutricionales de Microorganismos……………………………………….. 38 4.3 Factores de Crecimiento………………………………………………………….. 40 4.4 Toma de Nutrientes por la Célula………………………………………………... 40 4.5 Medios de Cultivo………………………………………………………………….. 45 4.6 Aislamiento de Cultivos Puros…………………………………………………… 47 V. Crecimiento Microbiano……………………………………………………………. 50 5.1 Curva de Crecimiento……………………………………………………………... 50 5.2 Medición del Crecimiento Microbiano…………………………………………… 54 5.3 Productividad del Crecimiento y Efecto del Nutriente Limitante……………… 56 5.4 Cultivo Continuo de Microorganismos…………………………………………... 57 5.5 Crecimiento Balanceado y No Balanceado…………………………………….. 59 5.6 Influencia de Factores Ambientales Sobre el Crecimiento Microbiano……… 59

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VI. Control de Microorganismos por Agentes Físicos y Químicos........................ 66 6.1 Patrón de Muerte Microbiana.......................................................................... 67 6.2 Condiciones que Influyen Sobre la Efectividad de la Actividad de Agentes Microbianos……………………………………………………………………………...

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6.3 Uso de Métodos Físicos en Control……………………………………………... 68 6.4 Uso de Agentes Químicos en Control…………………………………………… 72 6.5 Evaluación de la Efectividad de Agentes Antimicrobianos……………………. 76 VII. Microorganismos Como Componentes del Medio Ambiente………………… 78 7.1 Microorganismos y la Estructura de los Ambientes Naturales……………… 78 7.2 Estado Fisiológico de los Microorganismos en el Medio Ambiente………….. 80 7.3 Procesos de Reciclamiento de Nutrientes……………………………………… 81 7.4 Interacciones en la Utilización de Recursos……………………………………. 85 7.5 Sustratos Orgánicos Utilizados por los Microorganismos…………………….. 86 VIII. Hongos. Generalidades………………………………………………………….. 87 8.1 Hongos Filamentosos. Mohos……………………………………………………. 88 8.2 Hongos Unicelulares. Las Levaduras…………………………………………… 89 8.3 Hongos Mucosos…………………………………………………………………... 90 IX. Protozoarios. Generalidades……………………………………………………… 92 9.1 Mastigophora. Los Flagelados…………………………………………………… 93 9.2 Sarcodina. Las Amebas…………………………………………………………... 93 9.3 Ciliophora. Los Ciliados…………………………………………………………… 94 9.4 Sporozoa (Apicomplejos)…………………………………………………………. 95 X. Virus. Introducción y Características Generales………………………………… 96 10.1 Propiedades Generales de los Virus…………………………………………... 96 10.2 Genomas Víricos…………………………………………………………………. 97 10.3 Hospederos de Virus y Taxonomía…………………………………………….. 97 Referencias Bibliográficas…………………………………………………………….. 99

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CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA . 1.1 El descubrimiento de los microorganismos.

Incluso antes de que los microorganismos fueran vistos, algunos investigadores sospecharon de su existencia y los responsabilizaron de las enfermedades. Entre otros, el filósofo Romano Lucrecius (98-55 A.C.) y el físico Girolamo Fracastoro (1478-1553) sugirieron que las enfermedades eran causadas por criaturas vivas invisibles. Las primeras observaciones microscópicas fueron hechas al parecer entre 1625 y 1630 por el Italiano Francesco Stelluti, utilizando un microscopio facilitado muy probablemente por Galileo. Sin embargo, la primera persona en observar y describir microorganismos de manera sistemática fue el microscopista Holandés Antonio van Leeuwenhoek (1632-1723). Leeuwenhoek se ganaba la vida como comerciante de telas, pero gasto gran parte de su tiempo construyendo microscopios simples compuestos de lentes dobles convexos montados entre dos placas de plata. Sus microscopios podían amplificar de 50 a 300 veces y se podían mantener iluminadas sus muestras líquidas colocándolas entre dos piezas de vidrio e incidiendo la luz sobre ellas en un ángulo de 450 con respecto al plano de la muestra. Esto pudo haber proporcionado una forma de iluminación parecida a la de campo oscuro e hizo a las bacterias claramente visibles. A principios de 1673 Leeuwenhoek envió cartas detalladas describiendo sus observaciones a la Real Sociedad de Londres; de acuerdo con dichas descripciones, es claro que él observó tanto bacterias como protozoarios. 1.2 El conflicto de la generación espontánea.

Desde tiempos muy remotos, la gente había creído en la generación espontánea, esto es, que los organismos vivos podrían desarrollarse a partir de materia no viva. Incluso el gran Aristóteles (384-322 A.C.) pensaba que algunos invertebrados simples se originaban por generación espontánea. Esta visión fue finalmente cambiada por Francesco Redi (1626-1697) quien llevó a cabo una serie de experimentos sobre la descomposición de la carne y su habilidad para producir larvas espontáneamente. Redi colocó carne en tres contenedores: uno no estaba cubierto, el segundo fue cubierto con papel y el tercero fue cubierto con una gasa fina que podía excluir las moscas. Las moscas dejaron sus huevecillos en la carne al descubierto y se generaron larvas; las otras dos piezas de carne no produjeron larvas de manera espontánea. Sin embargo, las moscas fueron atraídas hacia el contenedor cubierto con gasa y dejaron sus huevecillos sobre ésta; estos huevecillos produjeron larvas. Así, la generación de larvas como resultado de la descomposición de la carne es debida a la presencia de huevecillos de moscas, y por lo tanto la carne no genera larvas de manera espontánea como se creía. Experimentos similares realizados por otros científicos ayudaron a desacreditar la teoría al menos en lo que se refiere a organismos grandes.

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El descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek renovó la controversia. Algunos propusieron que los microorganismos se generaban por generación espontánea, incluso aunque los organismos de gran tamaño no lo hicieran. Ellos pensaban que los extractos hervidos de carne podían dar origen a microorganismos si se dejaban en reposo por un rato. En 1748 el sacerdote Inglés John Needham (1713-1781) reportó el resultado de sus experimentos sobre generación espontánea. Needham calentó caldo de carnero y luego tapó herméticamente los frascos. Eventualmente muchos de los frascos de volvieron turbios y contenían microorganismos. Él pensó que la materia orgánica contenía una fuerza vital que podía conferir las propiedades de vida a materia no viva. Unos cuantos años más tarde el sacerdote y naturalista Italiano Lázaro Spallanzani (1729-1799) mejoró el diseño experimental de Needham sellando primero los frascos de vidrio que contenían agua y semillas. Si los frascos sellados eran colocados en agua hirviendo por 45 minutos, no había crecimiento mientras permanecieran sellados. Él propuso que el aire acarreaba gérmenes al medio de cultivo. Sin embargo, quienes apoyaban la teoría de la generación espontánea sostenían que calentar el aire en los frascos sellados destruía su habilidad para soportar la vida.

Diversos investigadores intentaron rebatir tales argumentos, aunque con poco

éxito. En 1859 el naturalista francés Félix Pouchet afirmó haber realizado experimentos que determinaban de manera concluyente que el crecimiento microbiano podía ocurrir sin contaminación debida al aire. Está afirmación provocó que Luis Pasteur (1822-1895) se decidiera a intentar resolver esta situación de una vez por toda. Pasteur primero filtró aire a través de algodón y encontró que algunos objetos que asemejaban esporas de plantas habían sido atrapados. Si un pedazo de este algodón se colocaba en medio estéril, aparecía crecimiento microbiano. Enseguida él colocó solución nutritiva en frascos, calentó sus cuellos en una flama y los dobló en una variedad de curvas mientras mantenía el extremo del cuello abiertos a la atmósfera. Pasteur calentó luego las soluciones por unos cuantos minutos y permitió que se enfriaran. No hubo crecimiento aún y cuando los contenidos de los frascos estaban expuestos al aire. Pasteur señaló que el crecimiento no se presentaba porque el polvo y gérmenes habían sido atrapados en las paredes del cuello curvo de los frascos. Si los cuellos eran rotos, el crecimiento comenzaba inmediatamente. Pasteur no sólo resolvió la controversia en 1861, sino que también mostró cómo mantener estériles las soluciones.

El científico Inglés John Tyndall (1820-1893) puso punto final al asunto de la

generación espontánea en 1877 al demostrar que el polvo acarreaba gérmenes y que, si el polvo estaba ausente, los cultivos permanecían estériles incluso si eran expuestos al aire. Durante el curso de sus estudios, Tyndall proporcionó evidencia de formas bacterianas excepcionalmente resistentes al calor. Trabajando independientemente, el botánico Alemán Ferdinand Cohn (1828-1898) demostró la existencia de endosporas bacterianas resistentes al calor.

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1.3 El reconocimiento del papel de los microorganis mos en el desarrollo de enfermedades.

Aunque Fracastoro y algunos otros habían sugerido que organismos invisibles

producían las enfermedades, la mayoría creía que las enfermedades eran causadas por fuerzas sobrenaturales, vapores venenosos llamados miasmas y el desbalance entre los cuatro humores presentes en el cuerpo (sangre, flema, bilis amarilla o cólera y bilis negra o melancolía). Los apoyos a la teoría de los gérmenes como productores de enfermedades comenzaron a acumularse a principios del siglo XIX. Agostino Bassi (1773-1856) fue el primero en mostrar que un microorganismo podría ser el causante de una enfermedad cuando demostró que una enfermedad en el gusano de seda era debida a una infección por hongos. Él también sugirió que muchas enfermedades eran causadas por hongos. Después de su éxito con el estudio de las fermentaciones, Pasteur fue llamado por el gobierno francés para investigar una enfermedad en el gusano de seda que estaba acabando con la industria de la seda. Después de varios años de trabajo, demostró que la enfermedad era debida a un protozoario parásito. La enfermedad fue controlada desarrollando gusanos a partir de huevecillos de palomillas sanas.

Evidencia indirecta de que los microorganismos eran agentes causantes de

enfermedades humanas derivó de los estudios del cirujano Inglés Joseph Lister (1827-1912) sobre la prevención de infecciones en heridas. Lister, impresionado con los trabajos de Pasteur sobre fermentaciones y putrefacción, desarrolló un sistema de cirugía antiséptica diseñado para prevenir la entrada de microorganismos en las heridas. Los instrumentos eran esterilizados por calor y el fenol era utilizado sobre las ropas quirúrgicas y asperjado a intervalos de tiempo sobre el área de cirugía. Este sistema fue notablemente exitoso y transformó a la cirugía después de que Lister publicó sus trabajos en 1867. Esto también proporcionó fuerte evidencia indirecta del papel de los microorganismos en las enfermedades debido a que el fenol, el cual mataba bacterias, también prevenía la infección de las heridas.

La primera demostración directa del papel de las bacterias como causantes de

enfermedades llegó con los estudios del ántrax por el científico Alemán Robert Koch (1843-1910). Koch utilizó los criterios propuestos por su maestro y formador Jacob Henle (1809-1885) para establecer la relación entre Bacillus anthracis y el ántrax y publicó sus hallazgos en 1876. Koch inyectó ratones sanos con material proveniente de animales enfermos, y los ratones se enfermaron. Después de transferir ántrax por inoculación a través de una serie de 20 ratones, incubó un fragmento de bazo que contenía el bacilo del ántrax en suero de carne de res. Los bacilos crecieron, se reprodujeron y produjeron esporas. Cuando bacilos aislados o esporas fueron inyectados en los ratones, el ántrax se desarrolló. Sus criterios para probar la relación causal entre un microorganismo y una enfermedad específica son conocidos como Postulados de Koch y pueden resumirse como sigue:

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1. El microorganismo debe estar presente en cada caso de enfermedad, pero ausente en organismos sanos.

2. El microorganismo sospechoso debe ser aislado y crecido en cultivo puro.

3. La misma enfermedad debe resultar cuando el microorganismo aislado es inoculado en un hospedero sano.

4. El mismo microorganismo debe ser aislado otra vez a partir del hospedero enfermo.

Aunque Koch utilizó lo descrito en sus postulados durante sus estudios sobre el

ántrax, él no los estableció completamente hasta 1884 en su publicación sobre la tuberculosis.

Durante los estudios de Koch sobre las enfermedades bacterianas se volvió

necesario aislar bacterias patógenas en suspensión. Al principio él cultivo las bacterias en la superficie estéril de papas cortadas y hervidas. Esto no era satisfactorio debido a que las bacterias no siempre crecían bie sobre las papas. Luego intentó solidificar medio líquido regular añadiendo gelatina. Colonias separadas de bacterias se desarrollaban después de que la superficie era estriada con una muestra de bacterias. La muestra podía también ser mezclada con el medio de gelatina líquida; cuando la gelatina solidificaba bacterias individuales desarrollaban colonias separadas. A pesar de sus ventajas, la gelatina no era el agente solidificante ideal debido a que era digerida por muchas bacterias y se derretía a temperaturas superiores a 280C. Una mejor alternativa fue proporcionada por Fannie Eilshemius Hesse, esposa de Walter Hesse, uno de los asistentes de Koch. Ella sugirió el uso de agar como agente solidificante ya que ella lo había utilizado de manera exitosa durante algún tiempo para hacer jaleas. El agar no era atacado por la mayoría de las bacterias y no se derretía sino hasta alcanzar una temperatura de 1000C. Uno de los asistentes de Koch, Richard Petri, desarrolló la caja petri, un contenedor para medio de cultivo sólido. Estos desarrollos hicieron posible el aislamiento de cultivos puros que contenían sólo un tipo de bacteria, y estimularon de manera directa el progreso en todas las áreas de la bacteriología.

Koch también desarrolló medios adecuados para crecer bacterias aisladas del

cuerpo. Debido a su similitud con los fluidos corporales, los extractos de carne y digeridos de proteínas fueron usados como fuentes de nutrientes. El resultado fue el desarrollo de caldos nutritivos y del agar nutritivo, medios que son utilizados ampliamente aún en la actualidad.

Para 1882 Koch había utilizado estas técnicas para aislar el bacilo que cusa la

tuberculosis. A esto le siguió una edad de oro de cerca de 30 a 40 años en los cuales la mayor parte de los principales patógenos bacterianos fueron aislados.

El descubrimiento de los virus y su papel en las enfermedades fue hecho

posible cuando Charles Chamberland (1851-1908), uno de los asociados de Pasteur, construyó un filtro bacteriano de porcelana en 1884. El primer patógeno viral en ser estudiado fue el virus de la enfermedad del mosaico del tabaco.

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En este período también se hicieron progresos en la determinación de cómo los animales resisten a las enfermedades y en el desarrollo de técnicas para proteger a los humanos y al ganado contra patógenos. Durante sus estudios sobre el cólera en pollos, Pasteur y Roux descubrieron que incubando sus cultivos por intervalos largos entre transferencias, podían atenuar las bacterias, lo cual significa que éstas habían perdido su capacidad para causar la enfermedad. Si los pollos eran inyectados con estos cultivos atenuados, permanecían saludables y desarrollaban la habilidad de resistir a la enfermedad. Ellos llamaron vacuna a los atenuados (del latín vacca, vaca) en honor de Edward Jenner quien, muchos años antes, había usado la vacunación con materia proveniente de lesiones de viruela de ganado para proteger a la gente contra la viruela. Poco después de esto, Pasteur y Chamberland desarrollaron una vacuna atenuada de ántrax por dos caminos distintos: tratando los cultivos con dicromato de potasio, y por incubación de las bacterias a 42-430C.

Poco después Pasteur preparó vacunas contra la rabia por una vía distinta. El

patógeno fue atenuado haciéndolo crecer en un hospedero no común, el conejo. Después de que los conejos infectados murieron, sus cerebros y médula espinal fueron removidas y deshidratadas. Durante el curso de estos estudios, Joseph Meister, un niño de nueve años de edad que había sido mordido por un perro rabioso, fue llevado a Pasteur. Puesto que la muerte del niño era irremediable en ausencia de un tratamiento, Pasteur estuvo de acuerdo en aplicar su vacuna. Joseph fue inyectado 13 veces en los siguientes 10 días con preparaciones con virulencia creciente del virus atenuado. El niño sobrevivió.

La lucha contra las enfermedades infecciosas estaba en marcha, y la ciencia

disponía ya de armas para hacerles frente. 1.4 El descubrimiento del efecto microbiano sobre l a materia orgánica e

inorgánica.

Aunque Theodore Schwann (1810-1882) y otros habían propuesto en 1837 que las células de levadura eran responsables de la conversión de azúcar a alcohol, un proceso llamado fermentación alcohólica, los químicos más relevantes de la época creían que los microorganismos no tenían nada que ver en el asunto. Ellos estaban convencidos de que la fermentación era debida a una inestabilidad química que degradaba los azúcares a alcohol. Pasteur no estaba de acuerdo. Al parecer Pasteur se interesó en las fermentaciones muy temprano en su carrera debido a sus investigaciones sobre la actividad óptica de las moléculas. Él creía que las fermentaciones eran realizadas por organismos vivos y producían productos asimétricos tales como el alcohol amílico que tenían actividad óptica. Había una íntima conexión entre la asimetría molecular, la actividad óptica y la vida. Entonces, en 1885 M. Bigo, un industrial francés requirió la ayuda de Pasteur. Su negocio era la producción de etanol por fermentación a partir de remolacha y el alcohol producido había declinado recientemente y el producto se había acidificado. Pasteur descubrió que la fermentación fallaba porque la levadura normalmente responsable de la formación de alcohol había sido reemplazada por microorganismos productores de

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ácido láctico más que de etanol. Al resolver este problema práctico, Pasteur demostró que todas la fermentaciones eran debidas a actividades de levaduras y bacterias específicas, reportando sus trabajos en diversos artículos sobre fermentaciones entre 1857 y 1860. Su éxito lo llevo al estudio de las enfermedades del vino y al desarrollo de la pasteurización para preservar el vino durante su almacenamiento. Los estudios de Pasteur sobre fermentación continuaron durante casi 20 años. Uno de sus más importantes descubrimientos fue que algunos microorganismos fermentativos eran anaerobios y podían vivir sólo en ausencia de oxígeno, mientras que otros eran capaces de vivir tanto aerobia como anaeróbicamente.

Unos pocos de los primeros microbiólogos escogieron investigar el papel

ecológico de los microorganismos. En particular estudiaron los microorganismos involucrados en los ciclos del carbono, nitrógeno y azufre que tiene lugar en el suelo y en ambientes acuáticos. Dos de los pioneros en este tema fueron Sergei N. Winogradsky (1856-1953) y Martinus W. Beijerinck (1851-1931).

El microbiólogo ruso Sergei N. Winogradsky hizo muchas contribuciones a la

microbiología del suelo. Descubrió que las bacterias del suelo podían oxidar hierro, azufre y amonio para obtener energía, y que muchas bacterias podían incorporar CO2 como materia orgánica tal y como lo hacían muchos organismos fotosintéticos. Winogradsky también aisló bacterias del suelo anaerobias fijadoras de nitrógeno y estudió la descomposición de la celulosa.

Martines W. Beijerinck fue uno de los grandes microbiólogos generales que hizo

aportaciones fundamentales a la ecología microbiana y muchos otros campos. Él aisló la bacteria anaerobia fijadora de nitrógeno Azotobacter; una bacteria de nódulos de raíz capaz de fijar nitrógeno (llamada posteriormente Rhizobium); y bacterias sulfato reductoras. Beijerinck y Winogradsky desarrollaron la técnica de cultivo enriquecido y el uso de medios selectivos, los cuales han sido de gran importancia en el desarrollo de la microbiología. 1.5 Composición del mundo microbiano.

Existen dos tipos fundamentales de células. Las células procariotas (organismos con un núcleo primordial) tienen una morfología mucho más simple que los organismos eucariotas y carecen de una verdadera membrana que delimite el núcleo. Todas las bacterias son procariotas. En contraste, las células eucariotas tienen una membrana que rodea al núcleo y son morfológicamente más complejas y usualmente más grandes que las procariotas. Algas, hongos, protozoarios, plantas superiores y animales son eucariotas.

La antigua descripción de los organismos como plantas o animales es

claramente demasiado simple, y por muchos años los biólogos han dividido a los organismos en cinco reinos:

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1. Los organismos procariotas se encuentran en el reino Monera o Procaryotae.

2. El reino Protista contiene organismos eucariotas unicelulares o coloniales que carecen de tejidos verdaderos. Los protozoarios, los hongos inferiores, y la mayoría de las algas microscópicas están colocados en este reino.

3. Los miembros del reino Fungi son organismos eucariotas que se nutren por absorción y a menudo son multinucleados. Los hongos superiores pertenecen a este reino.

4. El reino Animalia contiene animales multicelulares con nutrición por ingestión.

5. Las plantas multicelulares con células eucariotas poseedoras de pared celular y fotosíntesis se localizan en el reino Plantae.

En las últimas décadas se han hecho grandes progresos en tres áreas que

afectan profundamente la clasificación de los microorganismos. Primero, Se ha aprendido mucho sobre la estructura a detalle de las células microbianas con el uso de la microscopia electrónica. Segundo, los microbiólogos han determinado las características bioquímicas y fisiológicas de muchos microorganismos diferentes. Tercero, se han comparado las secuencias de proteínas y RNA ribosomal de una amplia variedad de organismos. Está claro ahora que hay dos grupos de organismos procariotas con diferencias importantes: eubacterias y archaeobacterias. Más aún, el reino Protista es tan diverso que puede ser necesario dividirlo en tres o más reinos. Así, muchos taxónomos han concluido que el sistema de cinco reinos es demasiado simple. Un sistema de clasificación más reciente divide a los organismos en dos imperios y ocho reinos.

Imperio Bacteria 1. Reino Eubacteria. Bacterias verdaderas. 2. Reino Archaeobacteria. Bacterias ancestrales, por lo general extremófilas.

Imperio Eucaryota 3. Reino Archezoa. Organismos primitivos eucariotas unicelulares, tales como

Giardia, que tienes ribosomas 70S y carecen de aparato de Golgi, mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas.

4. Reino Protozoa. Protozoarios complejos. 5. Reino Chromista. Organismos fotosintéticos que tiene sus cloroplastos

dentro del lumen del retículo endoplasmático rugoso y no en la matriz citoplasmática.

6. Reino Fungi. Organismos eucariotas que se nutren por absorción y a menudo son multinucleados. Los hongos superiores pertenecen a este reino.

7. Reino Plantae. Plantas multicelulares con células eucariotas poseedoras de pared celular y fotosíntesis.

8. Reino Animalia. Animales multicelulares con nutrición por ingestión.

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1.6 Relevancia de la microbiología en la vida diari a.

Los microorganismos son excepcionalmente diversos, se encuentran casi donde sea y afectan a las sociedades humanas de incontables maneras. Así, la microbiología moderna es una disciplina compleja con muchas diferentes especialidades; tiene gran impacto en medicina, agricultura y ciencias alimentarias, ecología, genética, bioquímica y muchos otros campos.

La microbiología tiene aspectos tanto básicos como aplicados. Muchos

microbiólogos tienen un interés primario en la biología de los microorganismos en si mismos. Ellos pueden centrarse en un grupo específico de microorganismos y convertirse en virólogos (virus), bacteriólogos (bacterias), ficólogos o algólogos (algas), micólogos (hongos) o protozoologos (protozoarios). Otros están interesados en la morfología microbiana o en procesos funcionales particulares y trabajan en campos tales como citología microbiana, fisiología microbiana, ecología microbiana, genética y biología molecular microbiana, y taxonomia microbiana. Muchos microbiólogos tienen una orientación más aplicada y trabajan sobre problemas prácticos en campos tales como la microbiología médica, microbiología de alimentos o de la leche, microbiología de salud pública, biotecnología, microbiología industrial e ingeniería genética, entre otros.

El futuro de la microbiología es brillante. Con el advenimiento de la tecnología

del DNA recombinante la microbiología se expandirá y cambiará mucho más rápido en el futuro. La necesidad de microbiólogos para trabajar en problemas de medicina, protección ambiental, producción y conservación de alimentos y en el desarrollo industrial, crecerá indudablemente. El microbiólogo René Dubos ha resumido bien lo prometedor de la microbiología:

“Cuan extraordinario es que, en todo el mundo, los microbiólogos están ahora involucrados en actividades tan diferentes como el estudio de la estructura genética, el control de enfermedades, y los procesos industriales basados en las fenomenales habilidades de los microorganismos para descomponer y sintetizar moléculas orgánicas complejas. La microbiología es una de las profesiones más reconfortantes debido a que da a quienes la practican a oportunidad de estar en contacto con todas las demás ciencias naturales y contribuir así de muchas maneras diferentes al mejoramiento de la calidad de vida humana.”

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CAPÍTULO II. ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA MICROBIANA Usualmente la microbiología se relaciona con organismos tan pequeños que no pueden ser distinguidos con el ojo desnudo. Debido a la naturaleza de esta disciplina, el microscopio es de importancia crucial: mucho de lo que se conoce de los microorganismos ha sido descubierto gracias a los microscopios. Así, es importante entender cómo trabajan los microscopios y la manera en la cual los especimenes son preparados para su observación. 2.1 Microscopio óptico (de campo claro, de campo os curo, de contraste de fases, de fluorescencia). Los microbiólogos emplean una variedad de microscopios ópticos (de luz) en su trabajo; los de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases y de fluorescencia son los utilizados más comúnmente. Los microscopios modernos son todos compuestos, esto es, la imagen amplificada formada por los lentes del objetivo es posteriormente agrandada por uno o más lentes adicionales. Microscopio de campo claro. El microscopio ordinario es llamado de campo claro debido a que se genera una imagen oscura sobre un fondo brillante. El microscopio consiste en un cuerpo robusto de metal compuesto de una base y un brazo en el cual se fijan el resto de las partes. Una fuente de luz, que puede ser un espejo o un iluminador electrónico, se localiza en la base. Dos botones, el de ajuste grueso y el de ajuste fino (llamados tornillos macro y micrométrico, respectivamente) están localizados sobre el brazo y pueden moverse para enfocar la imagen. La platina está localizada en la parte media del brazo y en ella se colocan las laminillas de observación, sujetas por un clip simple o por un clip mecánico. El clip mecánico permite al operador mover una laminilla en cuatro direcciones (atrás, adelante, derecha e izquierda) durante la observación. El condensador de la platina está montado dentro o por debajo de la platina y su función es transmitir un cono de luz sobre la muestra. A menudo su posición es fija en los microscopios simples, pero puede ajustarse verticalmente en los modelos más avanzados. La curvada parte superior del brazo sostiene el revólver y uno o más oculares. Los microscopios más avanzados tienen oculares para ambos ojos y son llamados microscopios binoculares. El cuerpo del ocular contiene en sí mismo una serie de espejos y prismas y el tubo que los sostiene puede estar inclinado para facilitar la observación. El revólver sostiene de tres a cinco objetivos con lentes de diferente poder de amplificación y pueden ser rotados para posicionar cualquiera de ello debajo del cuerpo del ocular. Idealmente un microscopio deber ser parfocal, esto es, que la imagen debe permanecer enfocada cuando los objetivos son cambiados. Las lentes de los objetivos forman una imagen real amplificada dentro del microscopio, y las lentes del ocular amplifican aún más esta imagen primaria. El

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aumento total es calculado multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Por ejemplo, si se utiliza el objetivo 45x con un ocular 10x, el aumento total de la muestra será de 450x. La parte más importante del microscopio es el objetivo, el cual debe producir una imagen clara y no sólo amplificarla. Por ello, la resolución es extremadamente importante. La resolución es la capacidad de una lente para separar o distinguir entre dos objetos pequeños que están demasiado cerca uno del otro. Mucho de la teoría óptica respecto al diseño de microscopios fue desarrollada por el físico Alemán Ernst Abbé en los 1870’s. La distancia mínima (d) entre dos objeto que los revela como entidades separadas está dada por la ecuación de Abbé en la cual lambda (λ) es la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra y (nsenθ) es la apertura numérica (AN).

θλ

nsend

5.0=

Conforme d se vuelve más pequeña, la resolución se incrementa y pueden discernirse detalles más finos de la muestra. La ecuación anterior indica que el principal factor en la resoluciones la longitud de onda de la luz empleada. La longitud de onda debe ser más corta que la distancia entre dos objetos o éstos no serán vistos claramente. Así, la mayor resolución se obtiene con luz de longitud de onda más corta, la del extremo azul del espectro visible (en el rango de 450 a 500 nm). Normalmente, un microscopio está equipado con tres o cuatro objetivos en el rango de 4x a 100x. La distancia de trabajo de un objetivo es la distancia entre la superficie frontal de la lente y la superficie del cubreobjetos (si es utilizado) o de la muestra cuando está enfocada. Los objetivos con apertura numérica grande y gran poder de resolución tienen distancias de trabajo pequeñas. La mayoría de los microscopios estándar vienen con ocular de 10x y tiene un límite superior de amplificación de 1000x con aceite de inmersión. Un ocular de 15x puede usarse con objetivos adecuados y obtener una amplificación de 1500x. Cualquier aumento superior no capacita a la persona para observar más detalles. Puede construirse un microscopio de luz capaz de amplificar hasta 10,000x, pero se estaría amplificando simplemente una imagen borrosa. Sólo el microscopio electrónico proporciona suficiente resolución para hacer útil tan alta capacidad de amplificación. La siguiente tabla muestra las propiedades de los objetivos más comunes del microscopio de luz.

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Objetivo

Propiedades De escaneo Seco débil Seco fuerte De in mersión Amplificación 4x 10x 40-45x 90-100x

Apertura numérica 0.10 0.25 0.55-0.65 1.25-1.4

Longitud focal aproximada (f) 40 mm 16 mm 4 mm 1.8-2.0 mm

Distancia de trabajo 17-20 mm 4-8 mm 0.5-0.7 mm 0.1 mm

Poder de resolución aproximado con luz de 450 nm (azul)

2.3 µ 0.9 µ 0.35 µ 0.18 µ

Microscopio de campo oscuro. Células y organismos vivos no teñidos pueden ser observados simplemente cambiando la manera en la cual son iluminados. Un cono hueco de luz es enfocado sobre la muestra de manera tal que la luz no reflejada y no refractada no entra al objetivo. Sólo la luz que ha sido reflejada o refractada por la muestra forma una imagen. El campo alrededor de la muestra aparece negro, mientras que el objeto a observar está brillantemente iluminado; debido a que el fondo es negro, este tipo de microscopia es llamada microscopia de campo oscuro. Considerables estructuras internas son visibles en microorganismos eucariotas. El microscopio de campo oscuro es utilizado para identificar bacterias tales como Treponema palidium, el agente causante de la sífilis. Microscopio de contraste de fases. Las células vivas no pigmentadas no son claramente visibles en el microscopio de campo claro debido a que hay poca diferencia en contraste entre las células y el agua. Así, los microorganismos a menudo deben ser fijados y teñidos antes de ser observados para incrementar el contraste y crear variaciones en color entre las estructuras celulares. Un microscopio de contraste de fases convierte pequeñas diferencias en el índice de refracción y de densidad celular en variaciones de intensidad de luz fácilmente detectables y es una excelente manera de observar células vivas. El condensador de un microscopio de contraste de fases tiene un alto anular, un disco opaco con un delgado anillo transparente el cual produce un cono hueco de luz. Conforme este cono pasa a través de la célula, algunos rayos de luz son curvados debido a variaciones en densidad e índice de refracción dentro de la muestra y son retardados cerca de ¼ de longitud de onda. La luz desviada es enfocada para formar una imagen del objeto. El fondo de la imagen, formado por la luz no desviada, es brillante, mientras que los objetos no teñidos aparecen oscuros y bien definidos. A menudo se utilizan filtros de color para mejorar la imagen.

El microscopio de contraste de fase es especialmente útil para la detección de componentes bacterianos tales como endosporas o inclusiones que contienen poli-β-

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hidroxibutirato, polimetafosfato, azufre y otras sustancias. Éstas son claramente visibles debido a que tiene índices de refracción marcadamente diferentes al del agua. El microscopio de contraste de fases es también ampliamente utilizado para el estudio de células eucariotas. Microscopio de fluorescencia. Los microscopios hasta ahora considerados producen una imagen a partir de la luz que pasa a través de la muestra. Un objeto también puede ser observado debido a que emite luz, y esto es la base del microscopio de fluorescencia. Cuando algunas moléculas absorben energía radiante se excitan y después liberan la energía capturada como luz. Cualquier luz emitida por una molécula excitada tendrá una menor longitud de onda (o será de menor energía) que la radiación absorbida originalmente. El microscopio de fluorescencia expone una muestra a luz ultravioleta, violeta, o azul y forma una imagen de los objetos con la luz fluorescente resultante. Una lámpara de vapor mercurial u otra fuente produce un rayo intenso y el calor transferido es limitado por un filtro infrarrojo especial. La luz pasa a través de un filtro excitador que transmite sólo la longitud de onda deseada. Un condensador de campo oscuro proporciona un campo oscuro contra el cual brillan los objetos fluorescentes. Usualmente la muestra ha sido teñida con moléculas colorantes llamadas fluorocromos que fluorescen brillantemente al ser expuestas a luz de una longitud de onda específica, pero algunos microorganismos son autofluorescentes. El microcopio forma una imagen a partir de la luz emitida cuando el objeto fluoresce. Un filtro de barrera posicionado después de las lentes del objetivo remueve cualquier luz ultravioleta remanente, la cual podría dañar los ojos del observador, o la de color azul o violeta, la cual podría reducir el contraste de la imagen. La microscopia de fluorescencia se ha vuelto una herramienta esencial en microbiología médica y en ecología microbiana. 2.2 Preparación y tinción de muestras (fijación, co lorantes y tinción simple, tinción diferencial). Aunque los microorganismos vivos pueden ser examinados directamente con el microscopio de luz, a menudo deben ser fijados y teñidos para incrementar su visibilidad, acentuando características morfológicas específicas y preservándolas para su estudio posterior. Fijación. Las células teñidas vistas al microscopio deben recordar a la célula viva tanto como sea posible. La fijación es el proceso mediante el cual las estructuras externas e internas de las células y microorganismos son preservados y fijados en una posición definida. Esto inactiva las enzimas que podrían alterar la morfología celular

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y endurece las estructuras celulares de manera que no cambien durante el teñido y la observación. El microorganismo es usualmente muerto y adherido firmemente a la laminilla durante la fijación. Hay dos tipos fundamentales diferentes de fijación. (1) Los bacteriólogos fijan las muestras de bacterias al calor, pasando la laminilla, previamente secada al aire, cuidadosamente por la flama del mechero. Esto preserva adecuadamente la morfología de las estructuras externas, pero no las estructuras celulares internas. (2) La fijación química debe ser usada para proteger las finas estructuras subcelulares y la morfología de microorganismos más grandes y delicados. Los químicos para fijación penetran las células y reaccionan con los componentes celulares, usualmente proteínas y lípidos, para volverlos inactivos, insolubles e inmóviles. Las mezclas comunes para fijación contienen componentes tales como etanol, ácido acético, cloruro mercúrico, formaldehído y glutaraldehído. Uso de colorantes. Los muchos tipos de colorantes usados para teñir microorganismos tiene dos características en común. (1) Tienen grupos cromóforos, es decir, grupos con dobles enlaces que dan al colorante su color. (2) Pueden unirse con las células por enlaces iónicos, covalentes o hidrofóbicos. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a una estructura celular cargada negativamente. Los colorantes ionizables pueden dividirse en dos clases generales en base a la naturaleza de sus grupos cargados.

1. Colorantes básicos. Son catiónicos o tienen grupos cargados positivamente (usualmente algunos en forma de nitrógeno pentavalente) y se venden generalmente como sales de cloruro. Los colorantes básicos se unen a moléculas cargadas negativamente, tales como los ácidos nucleicos y muchas proteínas. Debido a que la superficie de las células bacterianas está también cargada negativamente, los colorantes básicos son de los más comúnmente usados en bacteriología. Dentro de este grupo se encuentran el azul de metileno, la fucsina básica, el cristal violeta, la safranina y el verde malaquita.

2. Colorantes ácidos. Son aniónicos o poseen grupos cargados negativamente

tales como el carboxilo (-COOH) e hidroxilos fenólicos (-OH). Los colorantes ácidos, debido a su carga negativa, se unen a estructuras celulares cargadas positivamente. Dentro de este grupo se encuentran la eosina, el rosa de bengala y la fucsina ácida.

El pH puede afectar la efectividad del colorante puesto que la naturaleza y el

grado de carga de los componentes celulares cambia con el pH. De esta manera, los colorantes aniónicos tiñen mejor bajo condiciones de acidez cuando las proteínas y muchas otras moléculas llevan una carga positiva; los colorantes básicos son más efectivos a pH altos.

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Aunque las interacciones iónicas son probablemente el medio más común de unión de los colorantes, también pueden hacerlo mediante enlaces covalentes o debido a sus características de solubilidad. El Sudan III (negro sudan), por ejemplo, tiñe selectivamente los lípidos debido a que es lípido soluble, pero no se disuelve en las porciones acuosas de la célula.

A menudo los microorganismos pueden ser teñidos de manera satisfactoria

por tinción simple, en la cual se usa sólo un agente de tinción. El valor de la tinción simple radica en su simplicidad y facilidad de uso. Se cubre la muestra fijada con colorante durante un tiempo apropiado, se lava el exceso de colorante con agua y se deja la laminilla a secar. Colorantes básicos como el cristal violeta, el azul de metileno y la carbolfucsina son frecuentemente usados para determinar el tamaño, forma y arreglo de las bacterias.

Los procedimientos de tinción diferencial dividen a las bacterias en grupos

separados en base a sus propiedades de tinción. La tinción de Gram, desarrollada en 1884 por el Danés Christian Gram, es el método de tinción más ampliamente usado en bacteriología. Éste es un procedimiento de tinción diferencial debido a que divide a las bacterias en dos clases, gram negativos y gram positivos. Otra técnica muy usada de tinción diferencial es la tinción ácido-resistentes. 2.3 Microscopia electrónica. Microscopio electrónico de transmisión. El mejor microscopio de luz tiene un límite de resolución de cerca de 0.2 µ. Debido a que las bacterias usualmente tienen un diámetro de 1 µ, con este tipo de microscopio sólo se puede apreciar su forma general y sus principales características morfológicas. La estructura interna a detalle de los microorganismos más grandes tampoco puede ser estudiada de manera efectiva con el microscopio de luz. Estas limitaciones surgen de la naturaleza de la longitud de onda de la luz visible y no de una inadecuación del microscopio de luz en si mismo.

Hay que recordar que la resolución de un microscopio de luz se incrementa con una disminución de la longitud de onda de la luz empleada para la iluminación. Un rayo de electrones se comporta como radiación y puede ser enfocado mucho mejor que la luz en un microscopio de luz. Si los electrones iluminan la muestra la resolución del microscopio se incrementa enormemente debido a que la longitud de onda de la radiación es cercana a 0.005 nm, aproximadamente 100,000 veces más corta que la de la luz visible. El microscopio electrónico de transmisión tiene una resolución práctica de aproximadamente 1,000 veces mejor que la del microscopio de luz; en muchos microscopios electrónicos pueden distinguirse puntos 5 Å ó 0.5 nm cercanos entre sí y la amplificación útil es de casi 100,000x.

Un microscopio electrónico de transmisión moderno (TEM) es complejo y

sofisticado, pero el principio básico detrás de su operación puede ser entendido

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fácilmente. Un filamento caliente de tungsteno en el emisor de electrones genera un rayo de electrones que es luego enfocado sobre la muestra por el condensador. Puesto que los electrones no pueden pasar a través de lentes de vidrio, para enfocar el rayo se utilizan electromagnetos con forma de dona llamados lentes magnéticos. La columna que contiene las lentes y la muestra debe estar al alto vacío para lograr una imagen clara debido a que los electrones son deflectados al colisionar con moléculas en el aire. La muestra dispersa los electrones cuando pasan a través de ella y el rayo es enfocado por las lentes magnéticas para formar una imagen amplificada y visible de la muestra sobre una pantalla fluorescente. Regiones más densas de la muestra dispersa más electrones y por lo tanto aparece más oscura en la imagen puesto que pocos electrones golpean esa área de la pantalla. En contraste, regiones electro-transparentes son más brillantes. La pantalla puede también ser movida hacia un lado y la imagen capturada en película fotográfica para su registro. Microscopio electrónico de barrido. El microscopio descrito previamente forma una imagen a partir de la radiación que ha pasado a través de la muestra. El microscopio electrónico de barrido (SEM), en cambio, ha sido utilizado para examinar la superficie de los microorganismos en gran detalle; muchos instrumentos tienen una resolución de 7 nm o menos. El SEM difiere de otros microscopios electrónicos en que produce la imagen a partir de electrones emitidos por la superficie del objeto, más que de los electrones transmitidos. El SEM escanea un rayo de electrones que incide sucesivamente sobre la muestra. Cuando el rayo golpea un área en particular, los átomos de la superficie descargan un delgado baño de electrones llamado electrones secundarios los cuales son atrapados por un detector especial. Los electrones secundarios entran al detector golpeando un cintilador causando que éste emita flashes de luz que un fotomultiplicador convierte en una corriente eléctrica y la amplifica. La señal es enviada a un tubo de rayos catódicos y produce una imagen como de televisión la cual puede ser vista o fotografiada. El número de electrones secundarios que alcanzan el detector depende de la naturaleza de la superficie de la muestra. Cuando el rayo de electrones golpea un área elevada, un gran número de electrones secundarios entran al detector; en contraste, pocos electrones escapan a una depresión en la superficie y alcanzan el detector. Así, las áreas elevadas aparecen más brillantes sobre la pantalla y las depresiones más oscuras. El resultado es una imagen tridimensional muy realista de la superficie del microorganismo con gran enfoque y profundidad.

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CAPÍTULO III. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA CÉLULA PRO CARIOTA. 3.1 Tamaño, forma y organización procariota.

Podría esperarse que los organismos pequeños y relativamente simples como las bacterias fueran uniformes en forma y tamaño. Aunque es verdad que muchas bacterias son similares en morfología, hay una remarcable cantidad de variaciones. Se describen aquí los principales patrones morfológicos y algunas variantes interesantes para la supervivencia bacteriana.

Forma.

Las bacterias más comúnmente encontradas tienen una o dos formas. Los cocos

son células aproximadamente esféricas. Pueden existir como células individuales, pero también están asociados en arreglos característicos que con frecuencia son útiles en la identificación de bacterias. Los diplococos se presentan cuando los cocos se dividen y permanecen juntos formando pares (por ejemplo Neisseria). Cadenas largas de cocos (estreptococos) resultan cuando las células se adhieren después de repetidas divisiones en un plano; este patrón se observa en los géneros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus. Staphylococcus se divide en planos aleatorios para formar grupos irregulares como racimos de uvas. La división en dos o tres planos puede producir grupos simétricos de cocos. Los miembros del género Micrococcus a menudo se dividen en dos planos para formar grupos cuadrados de cuatro células llamados tétradas. En el género Sarcina los cocos se dividen en tres planos produciendo paquetes cúbicos de ocho células.

La otra forma bacterial común es la de bastón, a menudo llamada bacilo. Bacillus

megaterium es un típico ejemplo de una bacteria con forma de bastón. Los bacilos difieren considerablemente en su ancho y longitud; los cocobacilos son tan cortos y anchos que parecen cocos. La forma del bastón varía entre especies y puede ser plana, redondeada, en forma de cigarro, o bifurcada. Aunque muchos bacilos se presentan solos, pueden permanecer juntos para formar pares o cadenas. Unas cuantas bacterias con forma de bastón, los vibrios, están curvados para formar comas distintivas o espirales incompletos.

Las bacterias pueden asumir una gran variedad de formas, aunque a menudo

son simples esferas o bastones. Los Actinomycetes forman de manera característica largos filamentos multinucleados o hifas que pueden ramificarse para producir una red llamada micelio. Muchas bacterias tienen forma de largos bastones rotados en espirales o hélices; éstos son llamados espirilos si son rígidos y espiroquetas si son flexibles. La bacteria con forma de oval a pera Hyphomicrobium produce un brote en el extremo de una larga hifa. Unas pocas bacterias son de hecho planas. Por ejemplo, E. Walsby descubrió una bacteria cuadrada viviendo en pozas saladas. Esta bacteria tiene forma de caja aplanada, de cuadrada a rectangular, de cerca de 2 µ por 2 a 4 µ, y sólo 0.25 µ de espesor. Finalmente, algunas bacterias son variables en forma y carecen de una forma simple y característica. Éstas son llamadas

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pleomórficas incluso aunque pueden, como Corynebacterium, tener una forma general semejante a un bastón.

Tamaño.

Las bacterias varían en tamaño mucho más que en forma. Las más pequeñas

(por ejemplo algunos miembros del género Mycoplasma) tienen de 100 a 200 nm de diámetro, aproximadamente el tamaño de los virus más grandes (los poxvirus). Escherichia coli, un bacilo de tamaño promedio, es de 1.1 a 1.5 µ de ancho por 2.0 a 6.0 µ de largo. Unas pocas se han vuelto bastante largas; algunas espiroquetas alcanzan ocasionalmente 500 µ de longitud y la cianobacteria Oscillatoria tiene cerca de 7 µ de diámetro (el mismo diámetro que un eritrocito). Recientemente, se ha descubierto una bacteria enorme en el intestino de un pez Acanthurus nigrofuscus (pez cirujano café). Epulopiscium fishelsoni crece tan grande como 600 µ por 80 µ, un poco más pequeña que un guión de imprenta. Ahora es claro que unas cuantas bacterias son mucho más grandes que la célula eucariota promedio.

Organización de la célula procariota. En las células procariotas se encuentran una variedad de estructuras. No todas las estructuras se encuentran en cada género. Más aún, las células gram negativas y las gram positivas difieren, particularmente con respecto a su pared celular. A pesar de estas variaciones, las células procariotas son consistentes en su estructura fundamental y en sus componentes más importantes. Casi siempre las células procariotas están limitadas por una pared celular químicamente compleja. Dentro de esta pared, y separada por un espacio periplásmico, se encuentra la membrana plasmática. Esta membrana puede estar invaginada para formar estructuras membranales internas simples. Puesto que las células procariotas no contienen organelos membranales internos, su interior parece morfológicamente simple. El material genético está localizado en una región discreta, el nucleoide, y no está separado del citoplasma circundante por membranas. Los ribosomas y las inclusiones citoplasmáticas están dispersos en la matriz citoplasmática. Tanto las gram positivas como las gram negativas pueden utilizar flagelos para la locomoción. Además, muchas células están rodeadas por una cápsula o delgada capa externa a la pared celular.

Las células procariotas son morfológicamente más simples que las eucariotas. 3.2 Membranas de células procariotas (membrana plas mática y sistemas de

membranas internas).

Las membranas son un requerimiento absoluto para todos los organismos vivos. La célula debe interactuar de una manera selectiva con su ambiente, ya sea el ambiente interno de un organismo multicelular o un menos protegido y más variable

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ambiente externo. Las células deben no solo ser capaces de adquirir nutrientes y eliminar desechos, sino que también deben mantener su interior en un estado constante altamente organizado a pesar de los cambios externos. La membrana plasmática rodea al citoplasma tanto de células procariotas como eucariotas. Esta membrana es el principal punto de contacto con el ambiente de la célula y es por lo tanto responsable de muchas de sus relaciones con el mundo exterior. Para entender la función de las membranas es necesario familiarizarse con su estructura, particularmente con la de la membrana plasmática.

La membrana plasmática. Las membranas contienen tanto proteínas como lípidos, aunque la proporción exacta entre ambos varía ampliamente. La mayoría de los lípidos asociados a membranas son estructuralmente asimétricos con extremos polares y no polares y son llamados amfipáticos. El extremo polar interactúa con el agua y es hidrofílico; el extremo no polar es insoluble en agua y tiende a asociarse con otro igual. Esta propiedad de los lípidos los capacita para formar una bicapa en las membranas. Las superficies externas son hidrofílicas, mientras que los extremos hidrofóbicos están enterrados en el interior, lejos del agua circundante. Muchos de estos lípidos amfipáticos son fosfolípidos. Las membranas bacterianas usualmente difieren de las membranas eucariotas en que carecen de esteroles tales como el colesterol. Sin embargo, muchas membranas bacterianas contienen moléculas pentacíclicas parecidas al esterol llamadas hopanoides. Los hopanoides son sintetizados a partir de los mismos precursores que los esteroides. Como los esteroides en las eucariotas, los hopanoides probablemente estabilizan la membrana bacteriana. Los lípidos de membrana están organizados en dos capas, u hojas, de moléculas arregladas extremo con extremo. Muchas membranas archeobacterianas difieren de otras membranas bacterianas en que tienen una monocapa con moléculas de lípidos abarcando la membrana entera. Las membranas celulares son estructuras muy delgadas, de 5 a 10 nm de espesor, y sólo pueden ser vistas con el microscopio electrónico. La técnica de criofractura ha sido usada para romper membranas por el centro de la bicapa lipídica, partiéndola en dos y exponiendo el interior. De esta manera se ha descubierto que muchas membranas, incluyendo la plasmática, tienen una compleja estructura interna. Las pequeñas partículas globulares vistas en estas membranas son proteínas de membrana que se encuentran dentro de la bicapa lipídica. El modelo de estructura de membrana más ampliamente aceptado en la actualidad es el modelo de mosaico fluido de S. Jonathan Singer y Garth Nicholson. Ellos distinguen entre dos tipos de proteínas de membrana. Las proteínas periféricas están escasamente conectadas a la membrana y pueden ser fácilmente removidas. Son solubles en solución acuosa y constituyen del 20 al 30 % de las proteínas totales de la membrana. Cerca del 70 al 80 % de las proteínas de membrana son proteínas

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integrales, las cuales no se extraen tan fácilmente de la membrana y son insolubles en solución acuosa cuando están libres de lípidos. Las proteínas integrales, como los lípidos de membrana, son amfipáticas; sus regiones hidrofóbicas están enterradas en la fase lipídica mientras que las porciones hidrofílicas se proyectan hacia la superficie de la membrana. Algunas de estas proteínas se extienden incluso a través de toda la capa de lípidos. Las proteínas integrales pueden difundirse lateralmente a lo largo de la superficie para tomar nuevas posiciones, pero no pueden moverse o rotar hacia la otra capa lipídica. A menudo hay carbohidratos unidos a la superficie externa de las proteínas de la membrana plasmática, en donde desempeñan funciones importantes. La membrana celular es uno de los sistemas más altamente organizados y asimétricos, y además flexible y dinámico. Aunque las membranas tienen aparentemente un diseño básico común, hay amplias variaciones tanto en estructura como en capacidades funcionales. La membrana plasmática de las células bacterianas debe desempeñar una increíble variedad de funciones de manera exitosa. La membrana plasmática retiene al citoplasma, particularmente en células sin pared celular, y lo separa del medio circundante. La membrana plasmática también sirve como una barrera permeable selectiva: permite el paso de algunos iones y moléculas particulares, ya sea hacia adentro o hacia afuera de la célula, mientras que impide el paso de otros. De esta manera la membrana previene la pérdida de componentes esenciales a través de fugas al mismo que tiempo que permite el movimiento de otras moléculas. Debido a que muchas sustancias no pueden cruzar la membrana plasmática sin ayuda, ésta debe auxiliar estos movimientos cuando sea necesario. Usualmente se emplean sistemas de transporte para realizar tareas tales como la toma de nutrientes, la excreción de desechos y la secreción de proteínas. La membrana plasmática bacteriana es también el sitio de localización de una variedad de procesos metabólicos cruciales: respiración, fotosíntesis, y síntesis de lípidos y constituyentes de la pared celular. Finalmente, la membrana contiene moléculas receptoras especiales que ayudan a la bacteria a detectar y responder a químicos en el ambiente. Claramente se ve que la membrana plasmática es esencial para la supervivencia de los microorganismos. Sistemas de membranas internas. Aunque el citoplasma bacteriano no contiene organelos membranales complejos como las mitocondrias o los cloroplastos, pueden observarse estructuras membranales de diversos tipos. Una estructura común es el mesosoma. Los mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmática en forma de vesículas, túbulos o lamelas. Estas estructuras se encuentran tanto en bacterias gram positivas como gram negativas, aunque generalmente son más prominentes en las primeras. A pesar de los años de investigación sobre mesosomas, su función exacta es aún desconocida. Algunas veces se observan cerca de los septos o de la pared

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celular en bacterias en división, y algunas veces se les observa unidos al cromosoma bacteriano. Así, pueden estar involucrados en la formación de la pared celular durante la división o jugar un papel en la replicación del cromosoma y su distribución hacia las células hijas. Los mesosomas también pueden estar involucrados en procesos secretorios. Actualmente muchos bacteriólogos creen que los mesosomas son estructuras generadas durante la fijación química de la bacteria para microscopia electrónica. Posiblemente representan partes de la membrana plasmática que son químicamente diferentes y más desorganizadas debido a la fijación. Sin embargo los mesosomas han sido vistos ocasionalmente en bacterias criofracturadas y por lo tanto algunas veces pueden estar presentes en células vivas. Resolver esta controversia requiere por supuesto de investigación adicional. Muchas bacterias tienen sistemas de membranas internas muy diferentes a los mesosomas. Plegamientos de la membrana plasmática pueden volverse extensos y complejos en bacterias fotosintéticas tales como las cianobacterias y las bacterias púrpura, o en bacterias con actividad respiratoria muy alta como las bacterias nitrificantes. Estos sistemas pueden ser agregados de vesículas esféricas, vesículas aplanadas, o membranas tubulares. Su función parece ser proporcionar una gran superficie de membrana para mayores actividades metabólicas. 3.3 Matriz citoplasmática (inclusiones celulares, r ibosomas).

El citoplasma procariota, a diferencia del eucariota, carece de organelos de unidad membranal. La matriz citoplásmica es la sustancia localizada entre la membrana plasmática y el nucleoide. Esta matriz es en gran medida agua (cerca del 70% de la masa bacteriana es agua). La membrana plasmática y cada cosa hacia su interior es llamada protoplasto, así, la matriz citoplasmática es la mayor parte del protoplasto.

Inclusiones celulares. Una gran variedad de inclusiones celulares (cuerpos de inclusión), gránulos de materiales orgánicos e inorgánicos, son vistos a menudo dentro de la matriz citoplasmática de las bacterias con ayuda del microscopio electrónico. Algunas de estas inclusiones no están rodeadas por una membrana y se encuentran libres en el citoplasma (los gránulos de polifosfato y los de cianoficina, por ejemplo); otras, en cambio, están encerradas por una membrana monocapa no unitaria de 2.0 a 4.0 nm de espesor. Ejemplos de estas inclusiones rodeadas por membranas son los gránulos de poli-β-hidroxibutirato (PHB), algunos gránulos de glucógeno y azufre, carboxisomas y vacuolas de gas. Las membranas de las inclusiones celulares varían mucho en composición; algunas son de naturaleza proteínica, mientras que otras contienen lípidos. No todas las bacterias poseen todos los tipos de inclusiones, e incluso existen bacterias que no poseen ninguna de ellas. Se trata, por tanto, de estructuras opcionales producidas solamente por algunas clases de procariotas. Una

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breve descripción de algunas de las inclusiones de mayor importancia se da a continuación. Las inclusiones orgánicas usualmente contienen glucógeno o poli-β-hidroxibutirato. El glucógeno es un polímero de unidades de glucosa compuesto de largas cadenas unidas por enlaces α(1,4) glicosídicos y cadenas ramificadas conectadas por enlaces α(1,6) glicosídicos. El poli-β-hidroxibutirato contiene moléculas de β-hidroxibutirato unidas por enlaces éster entre grupos carboxilo e hidroxilos de moléculas adyacentes. Usualmente sólo uno de estos polímeros se encuentra en una especie, pero las bacterias púrpura fotosintéticas tienen ambos. El PHB se acumula en inclusiones distintivas, de cerca de 0.2 a 0.7 µ de diámetro, que son fácilmente teñibles con negro Sudan para microscopia de luz y que son fácilmente visibles con microscopio electrónico. El glucógeno está disperso más homogéneamente como pequeños gránulos (cerca de 20 a 100 nm de diámetro) a lo largo de la matriz y a menudo sólo pueden ser vistos con microscopio electrónico. Si las células contienen una gran cantidad de glucógeno, su tinción con una solución de yodo las volverá café rojizas. Las inclusiones de glucógeno y de PHB son almacén de reserva de materiales para proporcionar energía y para biosíntesis. Muchas bacterias también almacenan carbono en forma de gotas de lípidos. Las cianobacterias tienen dos inclusiones orgánicas distintivas. Los gránulos de cianoficina están compuestos de polipéptidos que contienen cantidades aproximadamente iguales de los aminoácidos arginina y ácido aspártico. Estos gránulos son a menudo lo suficientemente grandes para ser visibles en el microscopio de luz y almacenan nitrógeno extra para la bacteria. Los carboxisomas están presentes en muchas cianobacterias, bacterias nitrificantes y tiobacilos. Éstos gránulos son poliédricos, de cerca de 100 nm de diámetro y contiene la enzima ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa en un arreglo paracristalino. Su función es servir como reserva de esta enzima y pueden ser un sitio de fijación de CO2. Unas inclusiones orgánicas más remarcables, las vacuolas de gas, están presentes en muchas cianobacterias, en bacterias fotosintéticas púrpuras y verdes y en algunas otras formas acuáticas como Halobacterium y Thiothrix. Estas bacterias flotan en o cerca de la superficie debido a que las vacuolas de gas les dan flotación. Las vacuolas de gas son agregados de un enorme número de estructuras cilíndricas, pequeñas y huecas, llamadas vesículas de gas. La pared de las vesículas de gas no contiene lípidos y está compuesta de una simple y pequeñas proteína. Estas subunidades de proteína se ensamblan para formas un cilindro rígidamente cerrado que es hueco e impermeable al agua, pero permeable a gases atmosféricos. Las bacterias con vacuolas de gas pueden regular su flotación para moverse a la profundidad necesaria para obtener niveles adecuados de intensidad de luz, concentración de oxígeno y de nutrientes. Estas bacterias descienden simplemente colapsando sus vesículas, y flotan hacia la superficie cuando son formadas nuevas vesículas. Se han observado dos tipos principales de inclusiones inorgánicas. Muchas bacterias almacenan fosfato como gránulos de polifosfato o gránulos de volutina. El

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polifosfato es un polímero lineal de ortofosfatos unidos por enlaces éster. Así, los gránulos de volutina funcionan como almacén de reserva de fosfatos, un componente importante de constituyentes celulares tales como los ácidos nucleicos. En algunas células actúan como reserva de energía y el polifosfato puede servir como una fuente de energía en algunas reacciones. En ocasiones estos gránulos son llamados gránulos metacromáticos debido precisamente a que muestran un efecto metacromático, esto es, aparecen rojos o con diferente sombreado en azul cuando son teñidos con los colorantes azul de metileno o azul de toluidina. Algunas bacterias también almacenan azufre temporalmente como gránulos de azufre, un segundo tipo de inclusiones inorgánicas. Por ejemplo, las bacterias púrpuras fotosintéticas pueden usar sulfuro de hidrógeno como donador de electrones en la fotosíntesis y acumulan el azufre resultante ya sea en el espacio periplásmico o en glóbulos especiales en el citoplasma. Ribosomas. La matriz citoplasmática procariota está a menudo empacada con ribosomas, los cuales también se encuentra estrechamente adheridos a la membrana celular. Con baja amplificación de micrografías electrónicas, los ribosomas se observan como pequeñas partículas sin rasgos distintivos, pero son de hecho objetos muy complejos formados tanto de proteínas como de ácido ribonucleico (RNA). Ellos son el sitio de síntesis de proteínas: los ribosomas de la matriz sintetizan proteínas destinadas a permanecer dentro de la célula, mientras que los ribosomas de la membrana plasmática fabrican proteínas para transporte al exterior. Los ribosomas procariotas son más pequeños que los eucariotas. Son comúnmente llamados ribosomas 70S y tienen dimensiones de cerca de 14 a 15 nm por 20 nm, un peso molecular de aproximadamente 2.7 millones, y están construidos por dos subunidades llamadas 50S y 30S. La S de 70S y valores similares se adopta por las unidades Svedberg, las cuales son las unidades del coeficiente de sedimentación, una medida de la velocidad de sedimentación en una centrifuga. El coeficiente de sedimentación está en función del peso molecular de la partícula, su volumen y su forma. Normalmente las partículas más pesadas y compactas tienen número de Svedberg más grandes o sedimentan más rápidamente. Debe enfatizarse que los valores de Svedberg no son directamente proporcionales al peso molecular: el peso de los ribosomas 70S es igual a la suma de los pesos moleculares de sus subunidades 50S y 30S, aunque la suma de 50 y 30 es 80 y no 70. Los ribosomas de la matriz citoplasmática eucariota son 80S y de cerca de 22 nm de diámetro. A pesar de sus diferencias en tamaño, ambos tipos de ribosomas están compuestos de manera similar por una subunidad grande y una pequeña. 3.4 Nucleoide.

Probablemente la diferencia más marcada entre las células procariotas y las eucariotas es la manera en la cual está empacado su material genético. Las células eucariotas tienen dos o más cromosomas contenidos dentro de un organelo delimitado por membranas, el núcleo. En contraste, las procariotas carecen de un

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núcleo delimitado por membranas. El cromosoma procariota, casi siempre uno sólo, circular y formado por DNA de doble cadena, se localiza en una región de forma irregular llamada nucleoide (otros nombres que recibe son cuerpo nuclear, cuerpo de cromatina, y región nuclear). Aunque el nucleoide parece variar con el método de fijación y tinción, en las micrografías electrónicas a menudo se observan fibras las cuales muy probablemente son DNA. El nucleoide también es visible con el microscopio de luz si se utiliza colorante de Feulgen el cual reacciona específicamente con el DNA. Una célula puede tener más de un nucleoide cuando ocurre la división celular después de que el material genético se ha duplicado. En bacterias creciendo activamente el nucleoide tiene proyecciones que se extienden dentro de la matriz citoplasmática; presumiblemente estas proyecciones contienen DNA que está siendo trascrito activamente para producir RNAm.

Cuidadosos estudios de microscopia electrónica han mostrado a menudo que

el nucleoide está en contacto con los mesosomas o con la membrana plasmática. En nucleoides aislados también se han encontrado membranas. Hay por lo tanto evidencia de que el DNA bacteriano está unido a membranas celulares, y las membranas pueden estar involucradas en la separación del DNA hacia las células hijas durante la división celular.

Se han aislado nucleoides intactos y libres de membranas. Su análisis químico

revela que están compuestos de cerca del 60 % de DNA, algo de RNA y una pequeña cantidad de proteínas. En Escherichia coli, un bacilo de 2 a 6 µ de longitud, el DNA circular mide cerca de 1400 µ; obviamente debe haber un empaquetamiento muy eficiente para colocarlo dentro del nucleoide. El DNA está extensamente enrollado, probablemente con ayuda de proteínas nucleoides, las cuales difieren de las proteínas histonas presentes en el núcleo eucariota.

Muchas bacterias poseen plásmidos además de su cromosoma. Los

plásmidos son moléculas de DNA circular de doble cadena que pueden existir y replicarse independientemente del cromosoma o pueden estar integrados con él; en cualquier caso los plásmidos son heredados a la descendencia. Los plásmidos no se requieren para el crecimiento y la reproducción, aunque pueden llevar genes que dan a las bacterias ventajas selectivas. Los genes de los plásmidos pueden volver a las bacterias resistentes a drogas, darles nuevas habilidades metabólicas, hacerlas patógenas, o dotarlas con otras propiedades. 3.5 Pared celular procariota.

La pared celular es una de las partes más importantes de la célula procariota por diversas razones. Excepto para los micoplasmas y algunas arqueobacterias, la mayoría de las bacterias tiene paredes sólidas que les dan forma y las protegen de la lisis osmótica. La pared celular de muchos patógenos tiene componentes que contribuyen a su patogenicidad. La pared puede proteger a la célula de sustancias tóxicas y es el sitio de acción de diversos antibióticos.

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Después de que Christian Gram desarrolló la tinción de Gram en 1884, se hizo evidente que las bacterias podían ser divididas en dos grupos principales en base a su respuesta a la tinción de Gram. Las bacterias Gram-positivas se tiñen de púrpura, mientras que las Gram-negativas se tiñen de rosa o rojo. La verdadera diferencia estructural entre estos dos grupos se volvió clara con el advenimiento de la microscopia electrónica. La pared de las células Gram-positivas consiste en una sola capa de peptidoglicano o mureína homogénea y de 20 a 80 nm de espesor la cual se encuentra hacia el exterior de la membrana plasmática. En contraste, la pared celular de las Gram-negativas es muy compleja. Tiene una capa de peptidoglicano de 1 a 3 nm de espesor rodeada por una membrana externa de 7 a 8 nm de espesor. Los microbiólogos llaman comúnmente a todas estas estructuras exteriores a la membrana plasmática la envoltura celular. Este término incluye a la pared celular y a otras estructuras como las cápsulas, cuando están presentes.

En las micrografías electrónicas de las bacterias Gram-negativas se observa

frecuentemente un espacio entre la membrana plasmática y la membrana externa, y en algunas ocasiones se observa un espacio similar, aunque más pequeño entre la membrana plasmática y la pared celular de bacterias Gram-positivas. Este espacio es llamado espacio periplásmico. Evidencia reciente indica que el espacio periplásmico puede estar ocupado por una red laxa de peptidoglicano. Posiblemente es más un gel que un espacio ocupado por fluido. La sustancia que ocupa el espacio periplásmico es el periplasma. El tamaño estimado del espacio periplásmico en las bacterias Gram-negativas está en el rango de 1 nm hasta tanto como 71 nm. Algunos estudios recientes indican que puede constituir del 20 al 40 % del volumen celular total (cerca de 30 a 70 nm), pero se requieren más estudios para establecer un valor más exacto. El espacio periplásmico de las bacterias Gram-negativas contiene muchas proteínas que participan en la adquisición de nutrientes (por ejemplo, enzimas hidrolíticas que atacan ácidos nucleicos y moléculas fosforiladas), y proteínas involucradas en el transporte de materiales hacia el interior celular. Las bacterias desnitrificantes y las quimiolitoautotróficas a menudo tienen proteínas transportadoras de electrones en su periplasma. El espacio periplásmico también contiene enzimas involucradas en la síntesis de peptidoglicano y en la modificación de compuestos tóxicos que pudieran dañar a la célula. Las bacterias Gram-positivas pueden no tener un espacio periplásmico visible y no parecen tener muchas proteínas periplásmicas; más aún, secretan diversas enzimas que ordinariamente serían periplásmicas en las bacterias Gram-negativas. Tales enzimas secretadas son comúnmente llamadas exoenzimas.

Las arqueobacterias difieren de otras bacterias en muchos aspectos. Aunque

pueden ser positivas o negativas, sus paredes celulares son distintivas tanto en estructura como en composición química. La pared carece de peptidoglicano y está compuesta de proteínas, glicoproteínas y polisacáridos.

Estructura del peptidoglicano. El peptidoglicano o mureína es un enorme polímero compuesto de muchas subunidades idénticas. El polímero contiene dos derivados de azúcares, N-

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acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico (el éter lactil de la N-acetilglucosamina), y varios aminoácidos diferentes, tres de los cuales (ácido D-glutámico, D-alanina y ácido meso-diaminopimélico) no se encuentran en las proteínas. El esqueleto de este polímero está compuesto de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico alternados. Una cadena polipeptídica de cuatro D- y L-aminoácidos alternados está conectada al grupo carboxil del ácido N-acetilmurámico. Muchas bacterias substituyen otro diaminoácido, usualmente L-lisina, en la tercera posición por el ácido meso-diaminopimélico. Cadenas de subunidades de peptidoglicano se forman mediante enlaces entrecruzados entre los péptidos. A menudo el grupo carboxil de la D-alanina terminal está conectada directamente al grupo amino del ácido diaminopimélico, pero en su lugar puede ser utilizado un puente peptídico. La mayoría de las paredes celulares Gram-negativas carecen de este puente peptídico. Estos entrecruzamientos resultan al final en un enorme saco de peptidoglicano, que en realidad es una densa red interconectada. Estos sacos han sido aislados de bacterias Gram-positivas y son lo suficientemente fuertes para retener su forma e integridad, aún cuando son elásticos y algo flexibles, a diferencia de la celulosa (constituyente de la pared celular vegetal). La pared celular procariota es además porosa, de manera que algunas moléculas pueden penetrarla. Pared celular Gram-positiva. Normalmente la gruesa y homogénea pared celular de las Gram-positivas está compuesta primariamente de peptidoglicano, el cual a menudo contiene puentes peptídicos. Sin embargo la pared celular Gram-positiva usualmente también contiene grandes cantidades de ácidos teicoicos, polímeros de glicerol o ribitol unidos por grupos fosfato. Aminoácidos tales como la D-alanina y azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol. Los ácidos teicoicos están conectados tanto al peptidoglicano mismo mediante enlaces covalentes con el hidroxilo seis del ácido aceilmurámico, o a los lípidos de la membrana plasmática; en este último caso son llamados ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos parecen extenderse por toda la capa de peptidoglicano y, debido a que están cargados negativamente, ayudan a dar a la pared de las Gram-positivas su carga negativa. La función de estas moléculas no es aún clara, pero pueden ser importantes para mantener la estructura de la pared. Los ácidos teicoicos no están presentes en las bacterias Gram-negativas. Pared celular Gram-negativa. La pared celular Gram-negativa es mucho más compleja que la de las Gram-positivas. La delgada capa de peptidoglicano enseguida de la membrana plasmática puede constituir no más de 5 a 10% del peso de la pared. En E. coli es de cerca de 1 nm de espesor y contiene sólo una o dos capas de hojas de peptidoglicano. Como se mencionó antes, el peptidoglicano puede estar en forma de gel más que como capa compacta.

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La membrana externa se encuentra hacia afuera de la delgada capa de peptidoglicano. La proteína más abundante en esta membrana es la lipoproteína de Braun, una pequeña lipoproteína unida covalentemente a la región superior del peptidoglicano y embebida en la membrana externa por su extremo hidrofóbico. La membrana externa y el peptidoglicano están tan firmemente unidos por esta lipoproteína que pueden ser aislados como una unidad. Posiblemente los constituyentes más inusuales de la membrana externa son sus lipopolisacáridos (LPSs). Estas moléculas grandes y complejas contienen tanto lípidos como carbohidratos y constan de tres partes: (1) lípido A, (2) núcleo polisacárido, y (3) el poliscárido O ó cadena lateral O. El LPS de Salmonella typhimurium ha sido el más estudiado y su estructura general se describe aquí. La región del lípido A contiene dos glucosalinas, cada una con tres ácidos grasos y fosfato o pirofosfato unido. Éste está sepultado en la membrana externa y el resto del LPS se proyecta desde su superficie. El núcleo polisacárido está unido al lípido A. En salmonela está construido de 10 azúcares, muchos de ellos de estructura inusual. La cadena lateral O ó antígeno O es un polisacárido de cadena corta que se extiende hacia el exterior desde el núcleo polisacárido. Tiene varios azúcares peculiares y varía en composición entre cepas bacterianas. Aunque el polisacárido O es reconocida por los anticuerpos de los hospederos, las bacterias Gram-negativas pueden frustrar las defensas del hospedero cambiando rápidamente la naturaleza de su cadena lateral O para evitar la detección. La interacción de los anticuerpos con el LPS antes de alcanzar la membrana externa puede proteger a la pared celular de un ataque directo. El LPS es importante por diversas razones además de burlar las defensas del hospedero. Puesto que el núcleo polisacárido normalmente contiene azúcares cargados y fosfato, el LPS contribuye a la carga negativa de la superficie de la bacteria. El lípido A es el principal constituyente de la membrana externa y el LPS ayuda a estabilizar la estructura de la membrana. Más aún, el lípido A a menudo es tóxico por lo cual el LPS puede actuar como endotoxina y causar algunos de los síntomas que se presentan en infecciones por bacterias Gram-negativas. Una función más importante de la membrana externa es servir como barrera protectora. Previene o disminuye la entrada de sales biliares, antibióticos y otras sustancias tóxicas que pueden matar o dañar a la bacteria. Incluso así, la membrana externa es más permeable que la membrana plasmática y permite el paso de pequeñas moléculas como la glucosa y otros monosacáridos. Esto es debido a la presencia de proteínas porinas especiales. Tres moléculas de porina se agrupan y atraviesan la membrana externa para formar un canal hueco a través del cual pueden pasar moléculas pequeñas de 600 a 700 daltons. Moléculas más grandes, tales como la vitamina B12, deben ser transportadas a través de la membrana externa por acarreadores específicos. La membrana externa también previene de la pérdida de constituyentes como las enzimas periplásmicas.

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La pared celular y la protección osmótica. Usualmente la pared celular es requerida para proteger a la bacteria contra la destrucción por la presión osmótica. Los solutos están mucho más concentrados dentro de la célula que en la mayoría de los hábitats microbianos, los cuales son hipotónicos. Durante la ósmosis, el agua se mueve a través de membranas selectivamente permeables, tales como la membrana plasmática, de soluciones diluidas (alta concentración de agua) a soluciones más concentradas (baja concentración de agua). Así, el agua normalmente entra a la célula bacteriana y la presión osmótica puede alcanzar 20 atmósferas o 300 libras por pulgada cuadrada. Sin una pared celular que la proteja, la membrana plasmática no puede resistir tales presiones y la célula se hinchará y será destruida físicamente, un proceso llamado lisis. En hábitats hipertónicos, donde los solutos están más concentrados que dentro de la célula, el agua fluye hacia el exterior y el citoplasma se seca, fenómeno llamado plasmólisis. Aunque la mayoría de la bacterias requieren de la pared celular para sobrevivir, algunas no la poseen. Por ejemplo, los micoplasmas carecen de pared celular y sin embargo a menudo crecen en medios diluidos o en ambientes terrestres porque su membrana plasmática es más fuerte de lo normal. La razón precisa de esto no es bien conocida, aunque la presencia de esteroles en la membrana de muchas especies puede proporcionar fuerza adicional. Sin una pared celular rígida, los micoplasmas tienden a ser pleomórficos o variables en forma. Las formas L (llamadas así en honor al Instituto Lister de Londres, donde fueron descubiertas) también carecen de pared celular. La falta puede ser completa o parcial (algunas tienen una pared defectuosa) y pueden ser Gram-positivas o Gram-negativas. 3.6 Componentes externos a la pared celular.

Las bacterias tienen una variedad de estructuras externas a la pared celular cuyas funciones son protección, adhesión a objetos, o movimiento celular.

Cápsulas, capa mucosa, y capas S. Algunas bacterias tienen una capa de material al exterior de la pared celular. Cuando la capa está bien organizada y no se lava con facilidad se le llama cápsula. Una capa mucosa es una zona difusa de material no organizado que se remueve con facilidad. Un glicocáliz es una red de polisacáridos que se extiende desde la superficie de las bacterias y otras células (en este sentido, podría rodear tanto a la cápsula como a la capa mucosa). Las cápsulas y las capas mucosas usualmente están compuestas de polisacáridos, pero pueden estar construidas de otros materiales. Bacillus anthracis, por ejemplo, tiene una cápsula de ácido poli-D-glutámico. Las cápsulas son claramente visibles en el microscopio de luz cuando se

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emplean tinciones negativas o tinciones especiales para cápsulas; pueden ser estudiadas también con el microscopio electrónico. Aunque las cápsulas no se requieren para el crecimiento bacteriano en condiciones de laboratorio, éstas confieren varias ventajas cuando las bacterias crecen en hábitats normales. Ayudan a las bacterias a resistir fagocitosis por células fagocíticas de los organismos hospederos. Streptococcus pneumoniae proporciona un ejemplo clásico. Cuando carece de cápsula es destruido fácilmente y no causa enfermedad, mientras que la variante capsulada mata rápidamente a los ratones. Las cápsulas contienen una gran cantidad de agua y pueden proteger a la bacteria contra la desecación; además excluyen a los virus bacterianos y a la mayoría de los materiales tóxicos hidrofóbicos como los detergentes. El glicocáliz también ayuda a la fijación bacteriana a superficies de objetos sólidos en ambientes acuáticos o a superficies de tejidos en hospederos vegetales y animales. Muchas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tienen una capa regularmente estructurada llamada capa S en su superficie. La capa S es común entre las arqueobacterias, donde puede de hecho ser la única estructura de pared externa a la membrana plasmática. La capa S tiene un patrón parecido a un mosaico y está compuesta de proteína o glicoproteína. En las bacterias Gram-negativas la capa S se adhiere directamente a la membrana externa; en las Gram-positivas está asociada con la superficie del peptidoglicano. La capa S puede proteger a la célula contra iones y fluctuaciones del pH, estrés osmótico, enzimas, o contra el depredador bacteriano Bdellovibrio. La capa S también ayuda a mantener la rigidez de la envoltura y la forma de al menos algunas bacterias. Finalmente, la capa parece proteger a algunos patógenos contra el ataque del complemento y la fagocitosis, contribuyendo así a su virulencia. Pili y fimbrias. Muchas bacterias Gram-negativas tienen apéndices parecidos a pelos, cortos y finos, que son más delgados que los flagelos y no están involucrados en la motilidad. Usualmente estas estructuras son llamadas fimbrias (en ocasiones son referidas también como pili). Aunque una célula puede estar cubierta con más de 1,000 fimbrias, debido a su pequeño tamaño son visibles sólo con microscopio electrónico. Las fimbrias parecen ser estructuras tubulares compuestas de subunidades proteínicas en arreglo helicoidal, de cerca de 3 a 10 nm de diámetro y varias micras de longitud. Al menos algunos tipos de fimbrias adhieren a la bacteria a superficies sólidas tales como tejidos de hospederos o rocas en corrientes de agua. Los pili sexuales son apéndices similares, de 1 a 10 por célula, que difieren de la fimbrias en los siguientes aspectos. Los pili a menudo son más largos que las fimbrias (alrededor de 9 a 10 nm de diámetro) y están genéticamente determinados por factores sexuales o plásmidos conjugativos y son requeridos para el apareamiento bacteriano. Algunos virus bacterianos atacan específicamente a receptores en los pili sexuales al comienzo de su ciclo reproductivo.

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Flagelos y motilidad. La mayoría de las bacterias mótiles se mueven usando flagelos, apéndices locomotores filamentosos que se extienden hacia afuera de la membrana plasmática y la pared celular. Son estructuras esbeltas y rígidas de cerca de 20 nm de diámetro y de más de 15 a 20 µ de longitud. Los flagelos son delgados y no pueden observarse directamente con el microscopio de campo brillante, sino que deben teñirse con técnicas especiales diseñadas para incrementar su grosor. La estructura detallada del flagelo sólo puede observarse con el microscopio electrónico. A menudo las especies bacterianas difieren distintivamente en sus patrones de distribución de flagelos. Las bacterias monótricas tienen sólo un flagelo; si está localizado en un extremo se dice que el flagelo es polar. Las bacterias amfítricas tienen un flagelo solitario en cada polo. En contraste, las bacterias lofótricas tienen un grupo de flagelos en uno o en ambos polos. En las bacterias perítricas los flagelos están distribuidos a lo largo de la superficie completa de la célula. Los patrones de flagelación son muy útiles en la identificación de bacterias.

- Ultraestructura flagelar.

Estudios con microscopia electrónica de transmisión han demostrado que el flagelo bacteriano está compuesto de tres partes. (1) La porción más larga y obvia es el filamento, el cual se extiende desde la superficie celular hasta la punta. (2) Un cuerpo basal que está embebido en la célula; y (3) un segmento corto y curvo, el gancho, que une al filamento con el cuerpo basal y actúa como unión flexible. El filamento es un cilindro rígido y hueco construido de una sola proteína llamada flagelina, la cual tiene un peso molecular en el rango de 30,000 a 60,000.

El gancho y el cuerpo basal son bastante diferentes del filamento.

Ligeramente más ancho que el filamento, el gancho está hecho de diferentes subunidades de proteína. El cuerpo basal es la parte más compleja del flagelo. En E.coli y la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el cuerpo tiene cuatro anillos conectados a un eje central. Los anillos más externos, L y P, se asocian con la capa de lipopolisacáridos y de peptidoglicano, respectivamente. El anillo interno M está en contacto con la membrana plasmática. Las bacterias Gram-positivas tienen sólo dos anillos en el cuerpo basal, un anillo interno conectado a la membrana plasmática y un anillo externo probablemente unido al peptidoglicano.

- Síntesis flagelar.

La síntesis del flagelo es un proceso complejo que involucra al menos de 20 a

30 genes. Además del gen para la flagelina, 10 ó más genes codifican para las proteínas del gancho y del cuerpo basal; otros genes conciernen al control de la construcción flagelar o a su funcionamiento. No es bien conocido cómo la célula regula o determina la localización exacta del flagelo.

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Las bacterias pueden desflagelarse y de esta manera estudiar la regeneración del filamento flagelar. Se cree que las subunidades de flagelina son transportadas a través del hueco del filamento. Cuando alcanzan la punta las subunidades de agregan espontáneamente de manera que el filamento crece desde su extremo más que desde la base. La síntesis del filamento es un excelente ejemplo de ensamble a sí mismo. Muchas estructuras se forman espontáneamente por la asociación de sus partes componentes sin la ayuda de alguna enzima en especial u otros factores. La información requerida para la construcción del filamento está presente en la estructura de la subunidad de flagelina por sí misma.

- Mecanismo de movimiento flagelar.

Los flagelos procariotas operan de manera diferente a como lo hacen los

eucariotas. El filamento está en la forma de una hélice rígida y las bacterias se mueven cuando la hélice rota. Existe considerable evidencia que demuestra que los flagelos actúan como las propelas de un bote. Las bacterias mutantes con flagelos rectos o regiones del gancho anormalmente largas (mutantes poligancho) no pueden nadar. Cuando las bacterias son fijadas a una laminilla de vidrio usando anticuerpos para proteínas del filamento o del gancho, el cuerpo de la célula rota rápidamente sobre el flagelo estacionario. El motor flagelar puede rotar muy rápidamente; en E. coli, por ejemplo, rota a 270 revoluciones por segundo (r.p.s.) y Vibrio alginolyticus promedia 1,100 r.p.s.

La dirección de la rotación flagelar determina la naturaleza del movimiento

bacteriano. Las bacterias monótricas con un flagelo polar rotan en dirección contraria a las manecillas del reloj (vistas desde fuera de la célula) durante el movimiento normal hacia adelante mientras que la célula en sí rota lentamente en dirección de las manecillas del reloj. El movimiento flagelar rotando helicoidalmente empuja a la célula hacia adelante con el flagelo siguiéndola atrás. Las bacterias monótricas se detienen y cambian de dirección de manera aleatoria revirtiendo la dirección de la rotación del flagelo. Las bacterias flageladas perítricas operan de una manera algo similar. Para moverse hacia delante, los flagelos rotan en dirección contraria a las manecillas del reloj; conforme los hacen, ellas doblan sus ganchos para formar un haz rotatorio que las impulsa hacia adelante. La rotación del flagelo en dirección de las manecillas del reloj rompe al haz y la célula se detiene o cambia de dirección.

Debido a que las bacterias nadan gracias a la rotación de sus flagelos rígidos,

debe haber algún tipo de motor en su base. De acuerdo con una hipótesis, un flagelo rota debido a interacciones entre los anillos S y M. Un eje se extiende desde el gancho y termina en el anillo M, el cual puede rotar libremente en la membrana plasmática. Se cree que el anillo S está unido a la pared celular en las Gram-positivas y no rota. De esta manera, si los dos anillos interactúan de alguna manera, el resultado es un movimiento giratorio. Los anillos O y L de las Gram-negativas podrían actuar como orientadores para la rotación del eje. En contraste, hay alguna evidencia de que el cuerpo basal es una estructura pasiva y rota dentro de un complejo de proteínas embebidas en la membrana de una manera similar a como lo hace un motor eléctrico en el centro de un anillo de electromagnetos.

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El mecanismo exacto que regula la rotación del cuerpo basal aún no está claro. Hay evidencia de que el flujo de protones pasando los dos anillos o entre el cuerpo basal y circundando las proteínas de la membrana lleva a la rotación. No parece que el ATP proporcione directamente la energía para la rotación flagelar en las bacterias.

El flagelo es un dispositivo para nadar muy efectivo. Desde el punto de vista

de las bacterias, nadar es bastante difícil debido a que el medio acuoso circundante parece muy denso y viscoso, como melaza. La célula debe perforar a través del agua con su flagelo helicoidal o en forma de sacacorchos y, si la actividad flagelar cesa, se detiene casi instantáneamente. A pesar de tal resistencia del ambiente a su movimiento, las bacterias pueden nadar de 20 a casi 90 µ/segundo. Esto es equivalente a viajar de 2 a 100 longitudes celulares por segundo; en contraste, un humano excepcionalmente rápido de 1.5 m de altura, puede ser capaz de correr cerca de cinco cuerpos de longitud por segundo.

Las bacterias pueden moverse por mecanismos diferentes a la rotación

flagelar. Las espiroquetas son bacterias helicoidales que viajan a través de sustancias viscosas, tales como moco o fango, mediante movimientos de flexión y expansión causados por un filamento axial especial. Un tipo diferente de motilidad, motilidad por deslizamiento, es empleado por muchas bacterias: las cianobacterias, los miembros de los órdenes Myxobacteriales y Cytophagales, y algunos micoplasmas. Aunque no hay estructuras visibles asociadas con el deslizamiento, estas bacterias pueden moverse a lo largo de superficies sólidas a tasas de 3 µ/segundo. 3.7 Quimiotaxis.

Las bacterias no siempre nadan de manera errática sino que son atraídas por nutrientes tales como azúcares o aminoácidos y repelidas por muchas sustancias dañinas y productos de desecho bacteriano (las bacterias también pueden responder a otros factores ambientales como temperatura, luz y gravedad). El movimiento hacia un atrayente químico o lejos de un repelente es conocido como quimiotaxis. Tal comportamiento es una ventaja obvia para las bacterias.

La quimiotaxis positiva y negativa puede ser estudiada con cultivos en caja

petri. Si las bacterias son colocadas en el centro de una placa de agar que contiene un atrayente, las bacterias agotarán los nutrientes locales y luego nadarán hacia el gradiente del atrayente que han creado. El resultado es un anillo en expansión de bacterias. Cuando un disco de repelente es colocado en una caja petri de agar semisólido y bacterias, las bacterias nadarán lejos del repelente creando una zona clara alrededor del disco.

Las bacterias pueden responder a niveles muy bajos del atrayente (cerca de

10-8 M para algunos azúcares), la magnitud de su respuesta se incrementa con la concentración del atrayente. Usualmente los repelentes sólo son detectados a concentraciones altas. Si un atrayente y un repelente están presentes juntos, la

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bacteria comparará ambas señales y responderá al químico con la concentración más efectiva.

Tanto los atrayentes como los repelentes son detectados por

quimiorreceptores, proteínas especiales que se unen a los químicos y transmiten señales a otros componentes del sistema quimiosensitivo. Se han descubierto cerca de 20 quimioreceptores de atrayentes y 10 para repelentes. Estas proteínas quimioreceptoras pueden estar localizadas en el espacio periplásmico o en la membrana plasmática. Algunos receptores participan en las etapas iniciales del transporte de azúcar hacia el interior de la célula.

El comportamiento quimiotáctico de las bacterias ha sido estudiado usando el

microscopio de rastreo, un microscopio con una fase móvil que de manera automática mantiene en foco a una bacteria individual. En ausencia de un gradiente químico, E. coli y otras bacterias se mueven aleatoriamente. Una bacteria viaja en línea recta o ligeramente curva, una corrida, por unos cuantos segundos: luego se parará y cambiará de rumbo. El cambio de rumbo es seguido por una corrida en una dirección diferente. Cuando la bacteria es expuesta a un gradiente del atrayente, cambia de dirección con menos frecuencia (o tiene corridas más largas) cuando viaja hacia el gradiente, pero regresa a su frecuencia normal de cambios de dirección cuando se mueve lejos del gradiente. El comportamiento es moldeado por cambios temporales en la concentración química: la bacteria compara su ambiente actual con el experimentado en los momentos previos; si la concentración del atrayente es más alta, los cambios en dirección se suprimen y la corrida es más larga. La respuesta opuesta ocurre con un gradiente de repelente. La frecuencia de cambios de dirección disminuye cuando la bacteria se mueve lejos del gradiente del repelente.

Como ya se dijo, las bacterias pueden responder a factores diferentes a los

químicos. Un ejemplo fascinante lo constituyen las bacterias magnetotácticas que en los ambientes acuáticos se orientan a sí mismas en el campo magnético de la Tierra. La mayoría de estas bacterias tienen cadenas intracelulares de partículas de magnetita (Fe3O4) o magnetosomas, de cerca de 40 a 100 nm de diámetro y rodeadas por una membrana. Algunas especies de hábitats sulfídricos tienen magnetosomas que contienen greigita (Fe3S4) y pirita (FeS2). Puesto que cada partícula de hierro es un pequeño magneto, las bacterias usan sus cadenas de magnetosomas para determinar los rumbos hacia arriba o hacia abajo, y nadar hacia los sedimentos ricos en nutrientes o localizar la profundidad óptima en ambientes marinos o de agua dulce. Los magnetosomas también están presentes en la cabeza de aves, atún, delfines, tortugas verdes y otros animales, para ayudar presumiblemente a la navegación. Los animales y las bacterias comparten más rasgos de comportamiento en común que lo que podríamos imaginarnos.

3.8 Endospora bacteriana.

Un número de bacterias Gram-positivas pueden formar una estructura de resistencia llamada endospora. Las endosporas se desarrollan dentro de las células

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bacterianas vegetativas de varios géneros: Bacillus y Clostridium (bacilos), Sporosarcina (cocos) y otros. Estas estructuras son extraordinariamente resistentes a estrés ambiental tal como calor, radiación ultravioleta, desinfectantes químicos, y desecación. De hecho, algunas endosporas han permanecido viables por más de 500 años, y esporas de actinomicetes (las cuales no son esporas verdaderas) han sido recuperadas vivas después de estar enterradas en el fango por 7,500 años. Debido a su resistencia y al hecho de que varias especies de bacterias formadoras de endosporas son patógenas peligrosas, las endosporas son de importancia práctica en microbiología de alimentos, industrial y médica. Esto es debido a que es esencial ser capaces de esterilizar soluciones y objetos sólidos. Las endosporas a menudo sobreviven al calentamiento por una hora o más; por lo tanto las autoclaves deben ser utilizadas para esterilizar muchos materiales. Las endosporas son también de considerable interés teórico. Debido a que las bacterias fabrican estas intrincadas entidades de una manera muy organizada en un periodo de pocas horas, la formación de esporas es un modelo adecuado para la investigación sobre la construcción de estructuras biológicas complejas. En el ambiente, las endosporas ayudan a la supervivencia cuando los nutrientes son escasos.

Las endosporas pueden ser examinadas tanto con microscopio de luz como

electrónico. Debido a que las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, a menudo se les observa como áreas sin teñir en bacterias tratadas con azul de metileno y otros colorantes simples; colorantes especiales para esporas son utilizados para hacerlas claramente visibles. La posición de la espora en la célula madre o esporangio difiere frecuentemente entre especies, haciendo esto de considerable valor para la identificación. Las esporas pueden estar localizadas de forma central, cerca de un extremo (subterminal), o definitivamente terminales. Algunas veces una espora es tan larga que hace que el esporangio se hinche.

Las micrografías electrónicas muestran que la estructura de la endospora es

compleja. La espora a menudo está rodeada por una cubierta delgada y delicada llamada exosporium. Por debajo del exosporium hay una cubierta de la espora que está compuesta de varias capas de proteína y puede ser bastante gruesa. Es impermeable y responsable de la resistencia de la espora a químicos. El córtex (corteza), el cual puede ocupar tanto como la mitad del volumen de la espora, descansa por debajo de la cubierta de la espora. Está hecho de un tipo de peptidoglicano con menos entrecruzamientos que el de las células vegetativas. La pared celular de la espora (o corazón de la pared) está dentro del córtex y rodea al protoplasto o núcleo de la espora. El núcleo tiene las estructuras celulares normales, tales como ribosomas y un nucleoide.

No se conoce con precisión por qué la espora es tan resistente al calor y a

otros agentes letales. Tanto como el 15 % del peso seco de la espora consiste en ácido dipicolínico acomplejado con iones de calcio. Durante mucho tiempo se pensó que el ácido dipicolínico estaba involucrado directamente en la resistencia de la espora al calor, pero se han aislado mutantes resistentes al calor que carecen de este tipo de ácido. Puede ser que el complejo calcio-dipicolinato estabilice los ácidos nucleicos de las esporas. La deshidratación del protoplasto parece ser muy

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importante en la resistencia al calor. El córtex puede remover agua osmóticamente desde el protoplasto, así protege a la espora tanto del calor como del daño por radiación. En resumen, la resistencia de la endospora al calor muy probablemente sea debida a diversos factores: estabilización de diferentes componentes (como el DNA) por el complejo calcio-dipicolinato, deshidratación del protoplasto, la mayor estabilidad de proteínas celulares en bacterias adaptadas a crecer a altas temperaturas, y otros.

La formación de la espora, llamada esporogénesis o esporulación, comienza

normalmente cuando cesa el crecimiento por la falta de nutrientes. Es un proceso complejo y puede ser dividido en siete etapas. Se forma un filamento axial de material nuclear (etapa I) seguido de una invaginación de la membrana celular para encerrar parte del DNA y producir el septo de la espora preliminar (etapa II). La membrana continúa creciendo y envuelve a la espora inmadura en una segunda membrana (etapa III). En seguida, el córtex es colocado en el espacio entre las dos membranas y se acumulan tanto el calcio como el ácido dipicolínico (etapa IV). Después las proteínas de la cubierta son formadas alrededor del córtex (etapa V) y ocurre la maduración de la espora (etapa VI). Finalmente, enzimas líticas destruyen el esporangio dejando libre la espora (etapa VII). En Bacillus megaterium la esporulación requiere de sólo 10 horas.

La transformación de una espora latente en una célula vegetativa activa

parece un proceso casi tan complejo como la esporulación. Ocurre en tres etapas: (1) activación, (2) germinación y (3) eclosión. A menudo una espora no germinará exitosamente, incluso en un medio rico en nutrientes, si no ha sido previamente activada. La activación es un proceso reversible que prepara a la espora para la germinación y usualmente es el resultado de tratamientos como el calor. La activación es seguida por la germinación, el rompimiento del estado latente de la espora. Este proceso está caracterizado por una hinchazón de la espora, ruptura y absorción de la cubierta de la espora, pérdida de la resistencia al calor y otros tipos de estrés, liberación de los componentes de la espora, e incremento de la actividad metabólica. Muchos metabolitos normales o nutrientes (por ejemplo aminoácidos y azúcares) pueden desencadenar la germinación después de la activación. La germinación es seguida por la tercera etapa, la eclosión. El protoplasto de la espora fabrica nuevos componentes, emerge del resto de la cubierta de la espora, y se desarrolla de nuevo a una bacteria activa.

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CAPÍTULO IV. NUTRICIÓN MICROBIANA. Para obtener energía y construir nuevos componentes celulares, los organismos deben tener una fuente de materias primas o nutrientes. Los nutrientes son sustancias utilizadas en biosíntesis y en la producción de energía y por lo tanto se requieren para el crecimiento microbiano. Este capítulo describe los requerimientos nutricionales de los microorganismos, cómo son adquiridos los nutrientes, y el cultivo de los microorganismos. Factores ambientales tales como la temperatura, los niveles de oxígeno y la concentración osmótica del medio son críticos para el cultivo exitoso de los microorganismos. Estos tópicos se describirán en el siguiente capítulo. 4.1 Requerimientos Comunes de Nutrientes.

Un análisis de la composición de la célula microbiana muestra que cerca del 95% de su peso seco está basado en unos cuantos elementos principales: carbono, oxígeno, hidrógeno, nitrógeno, azufre, fósforo, potasio, calcio, magnesio y hierro. Éstos son llamados macroelementos o macronutrientes debido a que el organismo los requiere en cantidades relativamente grandes. Los primeros seis (C, O, H, N, S y P) son componentes de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los restantes cuatro macroelementos existen en la célula como cationes y juegan una variedad de papeles. Por ejemplo, el potasio (K+) es requerido para la actividad de un gran número de enzimas, incluidas algunas de las involucradas en la síntesis de proteínas. El calcio (Ca2+), entre otras funciones, contribuye a la resistencia al calor de las endosporas. El magnesio (Mg2+) sirve como cofactor de muchas enzimas, acomplejado con ATP, y estabiliza los ribosomas y las membranas celulares. El hierro (Fe2+ y Fe3+) es parte de los citocromos y cofactor de enzimas y proteínas transportadoras de electrones.

Todos los microorganismos requieren de varios elementos traza (también

llamados microelementos o micronutrientes) además de macroelementos. Estos elementos traza (manganeso, zinc, cobalto, molibdeno, níquel y cobre), son necesarios para la mayoría de las células. Sin embargo, las células los requieren en cantidades tan pequeñas que presentes como contaminantes en agua, recipientes de vidrio o en medios regulares, son adecuados para el crecimiento. Normalmente los elementos traza son parte de enzimas y cofactores y ayudan en la catálisis de reacciones y en el mantenimiento de la estructura de las proteínas. Por ejemplo, el zinc (Zn2+) está presente en el sitio activo de algunas enzimas y está también involucrado en la asociación de subunidades regulatorias y catalíticas en la aspartato carbamoiltransferasa de E. coli. El manganeso (Mn2+) ayuda a muchas enzimas a catalizar la transferencia de grupos fosfato. El molibdeno (Mo2+) es requerido para la fijación de nitrógeno y el cobalto (Co2+) es componente de la vitamina B12.

Los elementos pueden ser categorizados de una manera un poco diferente

con respecto a los requerimientos nutricionales. Los elementos mayores (C, O, H, N,

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S, P) son necesario en cantidades de gramos por litro de medio de cultivo. Los elementos menores (K, Ca, Mg, Fe) se requieren a menudo en cantidades de miligramos. Los elementos traza (Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu) deben estar disponibles en cantidades de microgramos.

Además de los macroelementos comunes y de los elementos traza, los

microorganismos pueden tener requerimientos particulares que reflejan la naturaleza especial de su morfología o ambiente. Las diatomeas necesitan ácido silícico (H4SiO4) para construir sus hermosas paredes celulares de sílica [(SiO2)n]. Aunque la mayoría de las bacterias no requieren grandes cantidades de sodio, muchas bacterias crecen en lagos salinos y en océanos dependiendo de la presencia de altas concentraciones del ión sodio (Na+).

Requerimientos de carbono, hidrógeno y oxígeno. A menudo, los requerimientos de carbono, hidrógeno y oxígeno son satisfechos juntos. El carbono es requerido para el esqueleto de todas las moléculas orgánicas, y las moléculas que sirven como fuente de carbono usualmente también contribuyen al aporte de hidrógeno y oxígeno. Una fuente de carbono para la cual esto no es verdad es el bióxido de carbono (CO2) debido a que está oxidado y carece de hidrógeno. Probablemente todos los microorganismos pueden fijar CO2, esto es, reducirlo e incorporarlo a moléculas orgánicas. Sin embargo, por definición, sólo los autótrofos pueden usar CO2 como su fuente principal o única de carbono. Muchos microorganismos son autotróficos: muchos de ellos son fotosintéticos, pero algunos autótrofos oxidan moléculas inorgánicas para obtener energía. La reducción de CO2 es un proceso muy costoso en términos de energía. Por ello, muchos microorganismos no pueden utilizarlo como su única fuente de carbono, sino que dependen de la presencia de moléculas complejas más reducidas para obtener el carbono. Los organismos que usan moléculas prefabricadas más reducidas como fuente de carbono son heterótrofos (estas moléculas prefabricadas normalmente proceden de otros organismos). La mayoría de los heterótrofos usan nutrientes orgánicos tanto como fuente de carbono como de energía. Por ejemplo, la vía glicolítica atrapa la energía como ATP y NADH y también produce esqueletos de carbono para su uso en biosíntesis. Una característica nutricional más remarcable de los microorganismos es su extraordinaria flexibilidad con respecto a la fuente de carbono. No hay molécula orgánica de ocurrencia en la naturaleza que no pueda ser utilizada por algún microorganismo. Los Actinomicetos pueden degradar alcohol amílico, parafina, e incluso caucho. Algunas bacterias parecen capaces de emplear casi cualquier cosa como fuente de carbono; por ejemplo, Pseudomonas cepacia puede usar alrededor de 100 diferentes compuestos de carbono. Desafortunadamente, muchas sustancias hechas por el hombre, como plásticos y DDT son degradados muy lentamente o incluso no son degradados. En contraste con las bacterias omnívoras, algunas bacterias son extremadamente meticulosas y catabolizan pocas fuentes de carbono. Las bacterias metilotróficas, por ejemplo, metabolizan sólo metano, metanol,

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monóxido de carbono, ácido fórmico y unas cuantas moléculas relacionadas de un carbono. Los miembros parasíticos del género Leptospira usan sólo ácidos grasos de cadena larga como su principal fuente de carbono y energía. Los requerimientos nutricionales de los microorganismos varían enormemente entre las diferentes especies. Además, estos requerimientos pueden cambiar dentro de una especie debido a mutaciones. Un microorganismo que requiere los mismos nutrientes como la mayoría de los miembros de su especie es un protótrofo. Un microorganismo prototrófico puede mutar de manera que no puede sintetizar una molécula esencial para el crecimiento y reproducción. Requerirá entonces una molécula, o un compuesto que pueda ser convertida a, como nutriente. Un microorganismo mutado que carece de la habilidad para sintetizar un nutriente esencial y por lo tanto debe obtenerlo, o a un precursor, de su entorno es un auxótrofo. El requerimiento de un aminoácido específico es una forma común de auxotrofía. Muchos microorganismos pueden sintetizar todos los aminoácidos comunes necesarios para el crecimiento. Ocasionalmente una mutación bloquea la síntesis de un aminoácido esencial y el microorganismo se volverá auxótrofo para éste, esto es, el aminoácido debe estar disponible para que el crecimiento tenga lugar. La producción de auxótrofos es utilizada en el estudio de genética microbiana, entre otras áreas. Requerimientos de nitrógeno, fósforo y azufre. Para crecer, un microorganismo debe ser capaz de incorporar grandes cantidades de nitrógeno, fósforo y azufre. Aunque estos elementos pueden ser adquiridos de los mismos nutrientes que proveen el carbono, los microorganismos usualmente también emplean fuentes inorgánicas. El nitrógeno es necesario para la síntesis de aminoácidos, purinas, pirimidinas, algunos carbohidratos y lípidos, cofactores de enzimas, y otras sustancias. Muchos microorganismos pueden usar el nitrógeno de aminoácidos, y el amonio es a menudo incorporado directamente por la acción de enzimas tales como la glutamato deshidrogenasa o la glutamina sintetasa y la glutamato sintetasa. La mayoría de los fotótrofos y muchos microorganismos no fotosintéticos reducen el nitrato a amonio e incorporan el amonio en una nitrato reducción asimilatoria. Una variedad de bacterias (por ejemplo muchas cianobacterias y la bacteria simbiótica Rhizobium) pueden reducir y asimilar nitrógeno atmosférico usando el sistema nitrogenasa. El fósforo está presente en los ácidos nucleicos, fosfolípidos, nucleótidos como el ATP, diversos cofactores, algunas proteínas, y otros componentes celulares. Casi todos los microorganismos usan fosfato inorgánico como fuente de fósforo y lo incorporan directamente. Algunos microorganismos (como E. coli) adquieren fosfato de manera activa directamente de su ambiente. Niveles bajos de fosfato limitan el crecimiento microbiano en muchos ambientes acuáticos. El azufre es necesario para la síntesis de sustancias como los aminoácidos cisteína y metionina, algunos carbohidratos, biotina, y tiamina. La mayoría de los

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microorganismos usan sulfato como fuente de azufre y lo reducen por sulfato reducción asimilativa; unos cuantos requieren formas reducidas de azufre tales como la cisteína. 4.2 Tipos Nutricionales de Microorganismos.

Todos los organismos requieren también de una fuente de energía, hidrógeno y electrones para que el crecimiento tenga lugar. Los microorganismos pueden ser agrupados en clases nutricionales de acuerdo a cómo satisfacen estos requerimiento (Tablas 4.1 y 4.2). Hay sólo dos tipos de fuentes de energía disponibles para los organismos: (1) energía lumínica atrapada durante la fotosíntesis, y (2) energía derivada de la oxidación de moléculas orgánicas e inorgánicas. Los fototrofos usan luz como fuente de energía; los quimiotrofos obtienen energía de la oxidación de compuestos químicos (tanto orgánicos como inorgánicos). Los microorganismos también tienen sólo dos fuentes de átomos de hidrógeno o electrones. Los litotrofos (esto es, “comedores de rocas”) usan sustancias inorgánicas reducidas como fuente de electrones, mientras que los organotrofos extraen electrones o hidrógeno de compuestos orgánicos.

Tabla 4.1 Fuente de carbono, energía, e hidrógeno/e lectrones Fuente de carbono Autótrofos CO2 como fuente única o principal de carbono para

biosíntesis. Heterótrofos Moléculas orgánicas reducidas y prefabricadas

procedentes de otros organismos. Fuente de energía Fototrofos Luz. Quimiotrofos Oxidación de compuestos orgánicos o inorgánicos. Fuente de hidrógeno o electrones Litotrofos Moléculas inorgánicas reducidas. Organotrofos Moléculas orgánicas. Tabla 4.2 Principales tipos nutricionales de los mi croorganismos.

Principales tipos nutricionales a

Fuente de energía, hidrógeno/electrones y

carbono.

Microorganismos representativos.

Autótrofos Fotolitotrofos Energía lumínica. Donador inorgánico de hidrógeno/electrones (H/e-) CO2 como fuente de carbono

Algas. Bacterias púrpura y verde azufrosas. Bacterias verde-azules (cianofíceas).

Heterótrofos Fotoorganotrofos

Energía lumínica. Donador orgánico H/e- Fuente orgánica de carbono (también pueden utilizar CO2).

Bacterias púrpura no sulfurosas. Bacterias verdes no sulfurosas.

Autótrofos Quimiolitotrofos Fuente de energía química (inorgánica) Donador inorgánico H/e- CO2 como fuente de carbono

Bacterias oxidativas azufrosas Bacterias del hidrógeno. Bacterias nitrificantes Bacterias del hierro.

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Heterótrofos Quimiorganotrofos

Fuente de energía química (orgánica). Donador orgánico H/e-

Fuente orgánica de carbono.

Protozoarios. Hongos. La mayoría de las bacterias no fotosintéticas (incluidas la mayoría de las patógenas).

a Se han encontrado bacterias en otras categorías nutricionales. Las categorías se definen en términos de energía, electrones, y fuente de carbono. A pesar de la gran diversidad metabólica observada entre los microorganismos, la mayoría puede ser colocada en una de cuatro clases nutricionales en base a su fuente primaria de energía, hidrógeno y/o electrones, y carbono (Tabla 4.2). La gran mayoría de los microorganismos más extensamente estudiados son autótrofos fotolitotrofos o heterótrofos quimiorganotrofos. Los autótrofos fotolitotrofos (a menudo llamados fotoautótrofos) usan la energía lumínica y CO2 como fuente de carbono. Los heterótrofos quimiorganotrofos (a menudo llamados quimioheterótrofos e incluso heterótrofos) usan compuestos orgánicos como fuente de energía, hidrógeno, electrones y carbono para biosíntesis. Frecuentemente los mismos nutrientes orgánicos satisfarán todos esos requerimientos. Es de apuntar que esencialmente todos los microorganismos patógenos son quimioheterótrofos. Las otras dos clases tienen menos microorganismos pero a menudo son muy importantes ecológicamente. Algunas bacterias púrpuras y verdes son fotosintéticas y usan materia orgánica como donadora de electrones y fuente de carbono. Estos heterótrofos fotoorganotrofos son habitantes comunes de lagos contaminados. Algunas de estas bacterias también pueden crecer como fotoautótrofos con hidrógeno molecular como donador de electrones. El cuarto grupo, los autótrofos quimiolitotrofos oxidan compuestos orgánicos reducidos tales como moléculas de hierro, nitrógeno o azufre para obtener tanto energía como electrones para biosíntesis. El bióxido de carbono es la fuente de carbono. Unos cuantos quimiolitotrofos pueden obtener carbono de fuentes orgánicas y ser así heterótrofos. Bacterias que dependen de fuentes inorgánicas de energía y de fuentes orgánicas de carbono (o en ocasiones CO2) pueden ser llamadas mixotróficas (son una combinación de procesos metabólicos autótrofos y heterótrofos). Los quimiolitotrofos contribuyen enormemente a la transformación química de elementos (por ejemplo, la conversión de amonio a nitrato o de azufre a sulfato) que ocurre continuamente en los ecosistemas. Aunque usualmente una especie particular pertenece a sólo una de las cuatro clases nutricionales, algunas muestran una gran flexibilidad metabólica y alteran sus patrones metabólicos en respuesta a cambios en el ambiente. Por ejemplo, muchas bacterias púrpura no sulfurosas actúan como heterótrofos fotoorganotrofos en ausencia de oxígeno, pero oxidan moléculas orgánicas y funcionan quimiotróficamente a niveles normales de oxígeno. Cuando el oxígeno es bajo, la fotosíntesis y el metabolismo oxidativo pueden funcionar simultáneamente. Este tipo de flexibilidad parece complejo y confuso, incluso si da a quien lo posee una ventaja definitiva si las condiciones ambientales cambian frecuentemente.

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4.3 Factores de Crecimiento.

Los microorganismos, especialmente muchos autótrofos fotolitotrofos, crecen y se reproducen cuando son suplementados minerales, fuente de energía, carbono, nitrógeno, fósforo y azufre. Estos microorganismos tienen las enzimas y vías metabólicas necesarias para sintetizar todos los componentes celulares requeridos para su buen desarrollo. Por otra parte, muchos microorganismos carecen de una o más enzimas esenciales. Por lo tanto no pueden fabricar todos los constituyentes indispensables sino que deben obtenerlo, o a sus precursores, del ambiente. Los compuestos orgánicos que son requeridos debido a que son esenciales para los componentes celulares o para los precursores de dichos componentes y que no pueden ser sintetizados por el microorganismo, son llamados factores de crecimiento. Hay tres clases principales de factores de crecimiento: (1) aminoácidos, (2) purinas y pirimidinas, y (3) vitaminas. Los aminoácidos son necesarios para la síntesis de proteínas, y las purinas y pirimidinas para la síntesis de ácidos nucleicos. Las vitaminas son pequeñas moléculas orgánicas que usualmente toman parte como cofactores de enzimas y sostienen el crecimiento en cantidades muy pequeñas. Algunos microorganismos requieren muchas vitaminas; por ejemplo, Enterococus faecalis (una bacteria ácido láctica) necesita ocho diferentes vitaminas para crecer. También se observan otros factores de crecimiento; el grupo hemo (de la hemoglobina o los citocromos) es requerido por Haemophilus influenzae, y algunos micoplasmas necesitan colesterol.

El conocimiento del factor de crecimiento específico requerido de muchos

microorganismos hace posible ensayos cuantitativos de crecimiento-respuesta para una variedad de sustancias. Por ejemplo, las especies de los géneros bacterianos Lactobacillus y Streptococcus pueden ser usados en análisis microbiológico de la mayoría de las vitaminas y aminoácidos. La bacteria apropiada es crecida en una serie de tubos de cultivo, cada uno conteniendo medio con una cantidad excesiva de todos los componentes requeridos, excepto el factor de crecimiento a ser analizado. A cada vaso se le añade una cantidad diferente del factor de crecimiento. Se prepara una curva estándar graficando la concentración o cantidad del factor de crecimiento contra el crecimiento bacteriano total. Idealmente, la cantidad de crecimiento resultante es directamente proporcional a la cantidad de factor de crecimiento presente; si la concentración del factor de crecimiento se dobla, el crecimiento final se duplica. La cantidad de factor de crecimiento presente en una muestra problema se determina comparando el crecimiento obtenido en la muestra desconocida con el crecimiento resultante en la curva estándar. Los análisis microbiológicos son específicos, sensibles y simples. Son aún usados en el análisis de sustancias como la vitamina B12 y la biotina, además de los avances en técnicas de análisis químico. 4.4 Toma de Nutrientes por la Célula.

El primer paso para el uso de nutrientes es la toma del nutriente requerido por la célula microbiana. Los mecanismos de toma deben ser específicos, esto es, debe adquirirse la sustancia necesaria, y no otra. Esto vuelve a las células malas para

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tomar una sustancia que no pueden usar. Puesto que los microorganismos a menudo viven en hábitats pobres en nutrientes, deben ser capaces de transportar los nutrientes de soluciones diluidas hacia la célula en contra del gradiente de concentración. Finalmente, las moléculas de nutrientes deben pasar a través de una selectivamente permeable membrana plasmática que no permite el paso libre de la mayoría de las sustancias. En vista de la enorme variedad de nutrientes y la complejidad de la tarea, no es de sorprender que los microorganismos hagan uso de varios mecanismos de transporte diferentes. Los más importantes de éstos son la difusión facilitada, el transporte activo, y la translocación de grupos. Los microorganismos eucariotas no parecen emplear translocación de grupos, pero toman nutrientes por procesos de endocitosis.

Difusión facilitada. Unas cuantas sustancias, tales como el glicerol, pueden cruzar la membrana plasmática por difusión pasiva. La difusión pasiva, a menudo llamada simplemente difusión, es el proceso en el cual las moléculas se mueven de una región de alta concentración a una de menos concentración debido a la agitación térmica aleatoria. La tasa de difusión pasiva depende del tamaño del gradiente de concentración entre el exterior celular y el interior. Un gradiente de concentración grande es requerido para una adecuada toma de nutrientes por difusión pasiva y, a menos que los nutrientes sean utilizados de manera inmediata, la tasa de toma de nutrientes decrece conforme éstos son adquiridos. La difusión pasiva es un proceso ineficiente y no es empleado de manera extensiva por los microorganismos. Moléculas muy pequeñas tales como H2O, O2 y CO2 a menudo se mueven a través de la membrana por difusión pasiva. La tasa de difusión a través de membranas selectivamente permeables se incrementa enormemente usando proteínas transportadoras, algunas veces llamadas permeasas, las cuales están embebidas en la membrana plasmática. Debido a que los transportadores ayudan al proceso de difusión, este mecanismo es llamado difusión facilitada. La tasa de difusión facilitada se incrementa con el gradiente de concentración mucho más rápido y a concentraciones más bajas de la molécula que se difunde que la difusión pasiva. Nótese que los niveles de difusión alcanzan un plato por encima de valores específicos de gradiente debido a que el transportador se satura, esto es, la proteína transportadora está unida y transportando tantas moléculas de soluto como es posible. La curva que resulta se asemeja a una curva enzima-sustrato y es diferente de la respuesta linear que se observa con difusión pasiva. Las proteínas transportadoras también se asemejan a las enzimas en su especificidad por la sustancia a ser transportada; cada transportador es selectivo y transportará sólo solutos cercanamente relacionados. Aunque hay proteínas transportadoras involucradas, la difusión facilitada es realmente una difusión. Un gradiente de concentración a lo largo de la membrana dirige el movimiento de moléculas y no se requiere energía extra; si el gradiente de concentración desaparece, el movimiento hacia el interior de la célula cesa.

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Aunque se ha hecho mucha investigación sobre el mecanismo de la difusión facilitada, el proceso no es aún comprendido por completo. Parece que los complejos de proteínas transportadoras cruzan la membrana. Después de que la molécula de soluto se une en el exterior, el transportador puede cambiar su conformación y llevar la molécula hacia el interior celular. El transportador puede subsecuentemente regresar a su forma original y estar listo para tomar otra molécula. El efecto neto es que una molécula no liposoluble puede entrar a la célula en respuesta a su gradiente de concentración. Hay que recordar que el mecanismo es reversible; si la concentración del soluto es más grande adentro de la célula, éste se moverá hacia afuera. Debido a que la célula metaboliza los nutrientes al entrar, el influjo se ve favorecido. La difusión facilitada no parece ser importante en procariotas. El glicerol es transportado por difusión facilitad en E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Bacillus y muchas otras bacterias. El proceso es mucho más prominente en células eucariotas donde es usado para transportar una variedad de azúcares y aminoácidos. Transporte activo. Aunque los transportadores de difusión facilitada pueden mover eficientemente moléculas hacia el interior cuando la concentración del soluto es más alta en el exterior, éste no puede ser tomado cuando la concentración es mayor en el interior de la célula (es decir, en contra del gradiente de concentración). Los microorganismos a menudo viven en hábitats caracterizados por fuentes diluidas de nutrientes y, para desarrollarse, deben ser capaces de transportar y concentrar dichos nutrientes. Así, el mecanismo de difusión facilitada no siempre es adecuado, y deben utilizarse otras formas. Los dos procesos de transporte más importantes en tales situaciones son el transporte activo y la translocación de grupos. El transporte activo es el transporte de moléculas de soluto hacia una concentración más alta, o en contra del gradiente de concentración, con el uso de energía metabólica. Debido a que el transporte activo involucra actividad de proteínas acarreadoras, en algunos aspectos de parece a la difusión facilitada. Las proteínas transportadoras se unen a solutos particulares con gran especificidad. Moléculas de solutos similares pueden competir por la misma proteína transportadora tanto en la difusión facilitada como en el transporte activo. El transporte activo también se caracteriza por el efecto de saturación de acarreadores a altas concentraciones de solutos. Sin embargo, el transporte activo difiere de la difusión facilitada en el uso de energía metabólica y en su habilidad para concentrar sustancias. Los inhibidores metabólicos que bloquean la producción de energía inhibirán el transporte activo, sin afectar la difusión facilitada (al menos en el corto plazo). El sistema de unión con proteínas transportadoras emplea proteínas especiales de unión con el sustrato localizadas en el espacio periplásmico de las bacterias gram-negativas. Estas proteínas periplásmicas, que también participan en la quimiotaxis, se unen a la molécula a ser transportada y luego interactúan con las proteínas de transporte de la membrana para mover la molécula de soluto hacia el

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interior celular. Estos complejos de membrana tienen al parecer varias subunidades y forman un poro en la membrana. La fuente de energía es ATP, aunque también pueden utilizarse otros compuestos fosfatados de alta energía. E. coli transporta una variedad de azúcares (arabinosa, maltosa, galactosa, ribosa) y aminoácidos (glutamato, histidina, leucina) por este mecanismo. El transporte mediado por ATP está también presente en gram-positivas, pero no está tan bien entendido como en organismos gram-negativos. Las bacterias también usan fuerza protonmotriz (usualmente en la forma de un gradiente de protones generado durante el transporte de electrones) para realizar el transporte activo. Las proteínas transportadoras de membrana responsables de este proceso carecen de proteínas especiales de unión a solutos en el periplasma. La lactosa permeasa de E. coli es un ejemplo bien estudiado. La permeasa es una proteína sencilla que tiene un peso molecular de 30,000. Transporta una molécula de lactosa hacia el interior conforme un protón entra de manera simultánea (una alta concentración de protones es mantenida fuera de la membrana por actividad de la cadena transportadora de electrones). Este transporte ligado de dos sustancias en la misma dirección es llamado simportador. Aquí, la energía almacenada como gradiente de protones dirige el transporte de solutos. Aunque el mecanismo de transporte no está completamente entendido, se cree que la unión del protón a la proteína transportadora le cambia su forma y afinidad por el soluto a ser transportado. E. coli también usa simportadores para adquirir aminoácidos y ácidos orgánicos tales como el succinato y el malato. La fuerza protonmotriz también puede accionar el transporte activo indirectamente, a menudo a través de la formación de un gradiente de sodio. Por ejemplo, un sistema de transporte de sodio en E. coli bombea sodio hacia el exterior en respuesta al movimiento de protones hacia el interior. Tal transporte ligado en el cual las sustancias transportadas se mueven en direcciones opuestas es llamado antiportador. El gradiente de sodio generado por este sistema dirige entonces la toma de azúcares y aminoácidos. Un ión sodio puede unirse a una proteína transportadora ocasionando un cambio en su configuración; el transportador puede unirse luego al azúcar o al aminoácido y orientar sus sitios de unión para conducirlos al interior celular. Debido a la baja concentración de sodio intracelular, el ión sodio puede disociarse del trasportadora y enseguida lo hará la otra molécula también. Las proteínas transportadoras en E. coli llevan el azúcar melibiosa y al aminoácido glutamato cuando el sodio se mueve simultáneamente al interior de la célula. El simportador de sodio es también un proceso importante en células eucariotas, donde es usado en la toma de azúcares y aminoácidos. El ATP, más que la fuerza protonmotriz, dirige usualmente el transporte de sodio en este tipo de células. Parece razonable que los microorganismos pudieran tener un solo sistema de transporte para cada nutriente, pero a menudo esto no es así, como se ha observado en E. coli. Esta bacteria tiene al menos cinco sistemas de transporte para el azúcar galactosa, tres sistemas para cada uno de los aminoácidos glutamato y leucina, y dos complejos de transporte de potasio. Cuando hay varios sistemas de transporte para la misma sustancia el sistema difiere en propiedades tales como su fuente de

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energía, su afinidad por el soluto transportado, y la naturaleza de su regulación. Presumiblemente esta diversidad da a su poseedor una ventaja competitiva adicional en un ambiente variable. Translocación de grupos. En el transporte activo, las moléculas de soluto se mueven a través de una membrana sin ser modificadas. Muchas procariotas también toman moléculas por translocación de grupos, un proceso en el cual una molécula es transportada dentro de la célula mientras es químicamente alterada. El mejor sistema de translocación conocido es el sistema fosfoenolpiruvato: azúcar fosfotransferasa (PTS). Este sistema transporta una variedad de azúcares hacia dentro de la célula procariota mientras las fosforila usando fosfoenolpiruvato (PEP) como donador de fosfato.

PEP + azúcar (exterior) -------------> Piruvato + azúcar-P (interior) El PTS es bastante complejo. En E. coli y Salmonella typhimurium consiste de dos enzimas y una proteína termoestable de bajo peso molecular (HPr). La HPr y la enzima I (EI) son citoplásmicas. La enzima II (EII) es más variable en estructura y a menudo está compuesta de tres subunidades o dominios. EIIA (anteriormente llamada EIII) es citoplásmica y soluble. EIIB también es hidrofílica, pero frecuentemente está unida a EIIC, una proteína hidrofóbica que está embebida en la membrana. Un fosfato de alta energía es transferido del PEP a la enzima II con la ayuda de la enzima I y la HPr. Luego, conforme una molécula de azúcar es transportada a través de la membrana por la enzima II, es fosforilada. La enzima II transporta sólo azúcares específicos y varía con el PTS, mientras que la enzima I y la HPr son comunes a todos los PTS.

Los PTS están ampliamente distribuidos entre los procariotas. Excepto para algunas especies de Bacillus que tienen tanto la vía de Embden-Meyerhof como el sistema fosfotransferasa, las bacterias aerobias parecen carecer de PTS. Los miembros de los géneros Escherichia, Salmonella, Staphylococcus y otras bacterias anaerobias facultativas tienen sistema fosfotransferasa; algunas bacterias anaerobias obligadas (como Clostridium) también tienen PTS. Muchos carbohidratos son transportados por este sistema. E coli toma glucosa, fructosa, manitol, sacarosa, N-acetilglucosamina, celobiosa, y otros carbohidratos por translocación de grupos. Además de su papel en el transporte, las proteínas del PTS pueden actuar como receptores para quimiotaxis. Toma de hierro. Casi todos los microorganismos requieren hierro para usarlo en citocromos y en muchas enzimas. La toma de hierro se dificulta por la gran insolubilidad del ión férrico (Fe3+) y sus derivados, los cuales dejan poco hierro libre disponible para el transporte. Muchas bacterias y hongos vencen esta dificultad secretando sideróforos. Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular que son capaces de

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acomplejarse con iones de hierro y suplementarlos a la célula. Estas moléculas transportadoras de hierro son normalmente hidroxamatos o fenolatos-catecolatos.

El ferrocromo es un hidroxamato producido por muchos hongos: la enterobactina es un catecolato producido por E. coli. Al parecer tres grupos sideróforos de acomplejan con los orbitales del hierro para formar un complejo hexacoordinado octahédrico. Los microorganismos secretan sideróforos cuando hay poco hierro disponible en el medio. Una vez que los complejos hierro-sideróforo han alcanzado la superficie celular, se unen a una proteína receptora de sideróforos. Luego el hierro es liberado para entrar directamente a la célula, o bien el complejo entero es transportado hacia el interior. En E. coli el receptor sideróforo está en la membrana externa de la envoltura celular; cuando el hierro alcanza el espacio periplásmico se mueve a través de la membrana plasmática con la ayuda de otras proteínas. Después de que el hierro ha entrado a la célula, se reduce a su forma ferrosa (Fe2+). El hierro es tan crucial para los microorganismos que ellos pueden usar más de una ruta de adquisición para asegurar su suplemento adecuado. 4.5 Medios de Cultivo.

Gran parte de la microbiología depende de la habilidad para crecer y mantener los microorganismos en el laboratorio, y esto es posible sólo si están disponibles medios de cultivo adecuados. Además, los medios especializados son esenciales en el aislamiento e identificación de microorganismos, el análisis de sensibilidad a antibióticos, análisis de agua y alimentos, microbiología industrial, y otras actividades. Aunque todos los microorganismos necesitan una fuente de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio satisfactorio dependerá de la especie que se pretende cultivar debido a que los requerimientos nutricionales varían enormemente. El conocimiento del hábitat normal de un microorganismo es a menudo útil en la selección de un medio de cultivo apropiado debido a que sus requerimientos nutricionales reflejan su ambiente natural. Frecuentemente un medio es usado para seleccionar y crecer microorganismos específicos o ayudar a identificar una especie en particular. En tal caso la función del medio también determinará su composición.

Medio definido o sintético. Algunos microorganismos, particularmente autótrofos fotolitotrofos tales como cianobacterias y algas eucariotas, pueden crecer en medios relativamente simples que contengan CO2 como fuente de carbono (a menudo añadido como carbonato de sodio o bicarbonato), nitrato o amonio como fuente de nitrógeno, sulfato, fosfato, y una variedad de minerales. Tales medios en los cuales se conocen todos los componentes, son conocidos como medios definidos o medios sintéticos. Muchos heterótrofos quimiorganotrofos también pueden ser crecidos en medios definidos con

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glucosa como fuente de carbono y sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los medios definidos son usados ampliamente en investigación, ya que a menudo es deseable conocer lo que el microorganismo experimental está metabolizando. Medio complejo. Los medios que contienen algunos ingredientes de composición química desconocida son llamados medios complejos. Tales medios son muy útiles ya que pueden ser lo suficientemente ricos y completos como para garantizar los requerimientos nutricionales de muchos microorganismos diferentes. Además, los medios complejos son a menudo necesarios debido a que no se conocen los requerimientos nutricionales de un microorganismo en particular. Esta es la situación con muchas bacterias meticulosas, algunas de las cuales incluso requieren un medio que contenga sangre o suero.

Los medios complejos contienen componentes indefinidos tales como peptonas, extracto de carne y extracto de levadura. Las peptonas son hidrolizados de proteínas preparados por digestión proteolítica parcial de carne, caseína, soya, gelatina, y otras fuentes de proteína. Pueden servir como fuente de carbono, energía y nitrógeno. El extracto de carne y el extracto de levadura son extractos acuosos de carne magra y levadura de cerveza, respectivamente. El extracto de carne contiene aminoácidos, péptidos, nucleótidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales. El extracto de levadura es una excelente fuente de vitaminas B así como de nitrógeno y compuestos de carbono. Tres medios complejos usados comúnmente son (1) caldo nutritivo, (2) caldo soya-tripticasa, y (3) agar McConkey.

Si se necesita un medio sólido para cultivo de microorganismos en superficie,

el medio líquido puede ser solidificado con la adición de 1.0% a 2.0% de agar, más comúnmente 1.5%. El agar es un polímero sulfatado compuesto principalmente de D-galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa, y ácido D-glucorónico. Usualmente es extraído de algas rojas. El agar es adecuado como agente solidificante debido a que después de que ha sido calentado en baño maría puede ser enfriado a 40-420C antes de endurecer y no se fundirá de nuevo hasta que la temperatura alcance de 80 a 900C. El agar es también un excelente agente solidificante debido a que la mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo.

A menudo se emplean también otros agentes solidificantes. Por ejemplo, la

sílica gel es usada para crecer bacterias autótrofas sobre medio sólido en ausencia de sustancias orgánicas y para determinar la fuente de carbono para bacterias heterótrofas suplementando el medio con varios compuestos orgánicos.

Tipos de medios. Los medios como el caldo soya-tripticasa y el agar soya-tripticasa son llamados medios para propósitos generales ya que soportan el crecimiento de muchos microorganismos. La sangre y otros nutrientes especiales pueden añadirse a los medios de propósitos generales para fomentar el crecimiento de bacterias

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heterótrofas meticulosas. Estos medios especialmente fortificados (por ejemplo el agar sangre) son llamados medios enriquecidos.

Los medios selectivos favorecen el crecimiento de microorganismos en particular. Las sales biliares o los colorantes como la fucsina básica y el cristal violeta favorecen el crecimiento de bacterias gram-negativas inhibiendo el crecimiento de bacterias gram-positivas. El agar endo, el agar eosina azul de metileno y el agar McConkey tres medios ampliamente usados para la detección de E. coli y bacterias relacionadas en fuentes de agua, contienen colorantes que suprimen el crecimiento de bacterias gram-positivas. El agar McConkey también contiene sales biliares. Las bacterias también pueden ser seleccionadas por incubación con nutrientes que pueden usar específicamente. Un medio que contiene sólo celulosa como fuente de carbono y energía es bastante efectivo en el aislamiento de bacterias que digieren celulosa. Las posibilidades de selección son inmensas, y hay docenas de medios selectivos especiales en uso.

Los medios diferenciales son medios que distinguen entre diferentes grupos

de bacterias e incluso permiten la identificación tentativa de microorganismos en base a sus características biológicas. El agar sangre es tanto un medio diferencial como enriquecido ya que distingue entre bacterias hemolíticas y no hemolíticas. Las bacterias hemolíticas (por ejemplo muchos estreptococos y estafilococos aislados de la garganta) producen zonas claras alrededor de sus colonias debido a la destrucción de las células rojas. El agar McConkey es tanto selectivo como diferencial. Puesto que contiene lactosa y el colorante rojo neutro, las colonias que fermentan la lactosa aparecen de rosa a rojo y se distinguen fácilmente de las colonias no fermentativas. 4.6 Aislamiento de Cultivos Puros.

En hábitats naturales los microorganismos usualmente crecen en poblaciones mezcladas y complejas que contienen diversas especies. Esto representa un problema para el microbiólogo ya que un tipo específico de microorganismo no puede ser estudiado adecuadamente en un cultivo mezclado. Es necesario un cultivo puro, una población de células originadas a partir de una única célula, para caracterizar una especie individual. Los cultivos puros son tan importantes que el desarrollo de las técnicas de cultivo puro por el bacteriólogo Roberto Koch transformó la microbiología. Hay varias maneras de preparar cultivos puros; a continuación se explican algunas de las más comunes.

Extendido en placa y estriado en placa. Si una mezcla de células es extendida sobre una superficie de agar de manera que cada célula crezca en una colonia completamente separada, un crecimiento macroscópicamente visible en medio sólido, cada colonia representará un cultivo puro. El extendido en placa es una técnica fácil y directa para obtener este resultado. Un pequeño volumen de mezcla microbiana diluida conteniendo alrededor de 100 a

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200 células o menos es transferido al centro de una caja petri con agar y extendida uniformemente sobre la superficie con un asa de vidrio en forma de bastón. Las células dispersadas se desarrollarán en colonias aisladas. Debido a que el número de colonias debería igualar al número de organismos viables en la muestra, la técnica de extendido en placa puede ser usada para contar la población microbiana. También pueden obtenerse colonias puras por estriado en placa. La mezcla microbiana es transferida al borde de una caja petri con agar con un asa de inoculación (o bacteriológica) y luego distribuida por estriado sobre la superficie siguiendo diferentes patrones. En algún punto del proceso células solitarias serán separadas en la superficie y se desarrollaran en colonias individuales. Tanto en la técnica de extendido como en la de estriado, el éxito del aislamiento depende de la separación espacial de células únicas. Vertido en placa. La técnica de vertido en placa, usada extensivamente para bacterias y hongos, también produce colonias aisladas. La muestra original es diluida varias veces para reducir la población microbiana lo suficiente para obtener colonias separadas cuando se los coloca en la caja petri. Luego, volúmenes pequeños de varias muestras diluidas son mezclados con agar líquido que ha sido enfriado a cerca de 450C, y las mezclas son vertidas inmediatamente en cajas petri estériles. La mayor parte de las bacterias y hongos no mueren por una corta exposición al agar tibio. Después de que el agar se ha solidificado cada célula queda fija en lugar y forma como una colonia individual. El número total de colonias iguala al número de microorganismos viables en la muestra diluida. Las colonias que crecen en la superficie pueden también ser utilizadas para preparar medio fresco y preparar cultivos puros. Los métodos descritos son incluso más efectivos cuando se utilizan con medios selectivos o diferenciales. Un buen ejemplo es el aislamiento de bacterias que degradan el herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Las bacterias capaces de metabolizar el 2,4-D pueden obtenerse con un medio líquido que contenga 2,4-D como fuente única de carbono y los componentes requeridos de nitrógeno, fósforo, azufre y minerales. Cuando este medio es inoculado con suelo, sólo crecerán las bacterias capaces de utilizar el 2,4-D. Después de la incubación, una muestra del cultivo original se transfiere a un matraz con medio selectivo fresco para enriquecimiento adicional de las bacterias metabolizadoras de 2,4-D. Después de varias transferencias similares se obtendrán poblaciones mixtas de bacterias degradadoras de 2,4-D. Los cultivos puros pueden obtenerse cultivando esta mezcla en agar que contenga 2,4-D como fuente única de carbono. Sólo las bacterias capaces de crecer en 2,4-D formarán colonias visibles y pueden ser subcultivadas. Esta misma metodología general es utilizada para aislar y purificar una gran cantidad de bacterias seleccionándolas por características fisiológicas específicas.

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Morfología colonial y crecimiento. El desarrollo de colonias sobre superficies de agar ayuda al microbiólogo a identificar bacterias debido a que especies individuales forman colonias de tamaño y apariencia característicos. Cuando una población mixta ha sido cultivada en placa de manera apropiada, es algunas veces posible identificar la colonia deseada en base a su apariencia y usarla entonces para obtener un cultivo puro. La estructura de las colonias bacterianas ha sido examinada también con el microscopio electrónico de barrido. La estructura microscópica de las colonias es a menudo tan variable como la apariencia visible. En la naturaleza, las bacterias y muchos otros microorganismos crecen a menudo como colonias sobre superficies. Por lo tanto, el entendimiento del crecimiento colonial es esencial para los ecomicrobiológos. Generalmente el crecimiento celular más veloz ocurre en el extremo de la colonia. El crecimiento es más lento en el centro, y la autolisis celular tiene lugar en la porción central más vieja de algunas colonias. Estas diferencias en crecimiento aparecen debido a la creación de gradientes de oxígeno, nutrientes y productos tóxicos dentro de la colonia. En los extremos de la colonia el oxígeno y los nutrientes son más abundantes. El centro de la colonia, por supuesto, es mucho más delgado que el extremo. Consecuentemente, el oxígeno y los nutrientes no se difunden rápidamente hacia el centro, mientras que los productos de desecho no pueden ser rápidamente eliminados, y entonces el crecimiento en el centro de la colonia disminuye y se detiene. Debido a estas variaciones ambientales dentro de una colonia, las células en la periferia pueden estar creciendo a tasa máxima mientras que las células en el centro están muriendo.

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CAPÍTULO V. CRECIMIENTO MICROBIANO. El crecimiento puede ser definido como un incremento en los constituyentes celulares. Si el microorganismo es cenocítico, esto es un organismo multinucleado en el cual las divisiones nucleares no se acompañan de división celular, el crecimiento resulta en un incremento en el tamaño celular, pero no el número de células. El crecimiento lleva a un aumento en el número de células cuando los microorganismos se reproducen por un proceso como la fisión binaria. Al final, las células individuales se alargan y dividen dos hijas de aproximadamente igual tamaño. Usualmente no es conveniente investigar el crecimiento y reproducción de microorganismos individuales debido a su pequeño tamaño. Por lo tanto, cuando se estudia el crecimiento, los microbiólogos siguen normalmente los cambios en la población total. 5.1 Curva de Crecimiento.

El crecimiento de una población se estudia analizando la curva de crecimiento de un cultivo microbiano. Cuando los microorganismos son cultivados en medio líquido usualmente son crecidos en cultivo batch o sistema cerrado, esto es, se incuban en un vaso de cultivo cerrado con sólo un lote de medio. Debido a que no se proporciona medio fresco durante la incubación, la concentración de nutrientes declina y la concentración de desechos se incrementa. El crecimiento de lo microorganismos reproduciéndose por fisión binaria puede graficarse como el logaritmo del número de células contra el tiempo de incubación. La curva resultante tiene cuatro fases distintivas.

a. Fase Lag. Cuando los microorganismos son introducidos en medio de cultivo

fresco, el número de células no se incrementa usualmente de manera inmediata y por lo tanto este período es llamado fase lag. Aunque no tiene lugar la división celular y no hay incremento en masa, la célula está sintetizando nuevos componentes. Una fase lag previa al inicio de la división celular puede ser necesaria por diversas razones. Las células pueden ser viejas y deficientes de ATP, cofactores esenciales, y ribosomas; todo esto debe ser sintetizado antes de que el crecimiento pueda iniciar. El medio puede ser diferente de aquel en el que el microorganismo estaba creciendo previamente. Así, pueden requerirse nuevas enzimas par usar los diferentes nutrientes. Posiblemente el microorganismo ha sido dañado y requiere tiempo para recuperarse. Sin importar las causas, eventualmente las células se revitalizan, replican su DNA, comienzan a incrementar su masa, y finalmente se dividen. La fase lag varía considerablemente en longitud con las condiciones del microorganismo y la naturaleza del medio. Esta fase puede ser bastante larga si el inóculo proviene de un cultivo viejo o uno que ha sido refrigerado. La inoculación de un cultivo en un medio químicamente diferente también resulta en una fase lag larga. Por otra parte, cuando un cultivo joven, vigoroso y en fase exponencial es transferido a medio fresco de la misma composición, la fase lag será muy corta o incluso estará ausente.

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b. Fase Exponencial. Durante la fase exponencial o fase log los microorganismos están creciendo y dividiéndose a la tasa máxima posible dada por su potencial genético, la naturaleza del medio, y las condiciones bajo las cuales ellos están creciendo. Su tasa de crecimiento es constante durante la fase exponencial, el microorganismo se divide y dobla su número a intervalos regulares. Debido a que cada individuo se divide en momentos ligeramente diferentes, la curva de crecimiento se eleva suavemente más que a saltos discretos. La población es más uniforme en términos de sus propiedades químicas y fisiológicas durante esta fase; por lo tanto, los cultivos en fase exponencial son usados en estudios bioquímicos y fisiológicos.

c. Fase Estacionaria. Eventualmente el crecimiento de la población cesa y la curva de crecimiento de vuelve horizontal. Esta fase estacionaria usualmente es alcanzada por las bacterias a un nivel de población de cerca de 109 células por mililitro. Otros microorganismos no alcanzas niveles tan altos de densidad de población; los cultivos de protozoarios y de algas a menudo tienen concentraciones máximas de cerca de 106 células por mililitro. Por supuesto que el tamaño final de la población depende de la disponibilidad de nutrientes y de otros factores, así como del tipo de microorganismo que está siendo cultivado. En la fase estacionaria el número total de microorganismos viables permanece constante. Esto puede resultar de un balance entre la división celular y la muerte celular, o la población puede simplemente cesar su división aunque mantengan su actividad metabólica. Las poblaciones microbianas entran a fase estacionaria por diversas razones. Un factor obvio es la limitación de nutrientes; si un nutriente limitante está severamente escaso, la población crecerá muy lentamente. Los microorganismos aerobios están usualmente limitados por la disponibilidad de O2. El oxígeno no es muy soluble y puede agotarse muy rápidamente de manera que sólo en la superficie se encuentra en concentraciones adecuadas para el crecimiento. Las células pro debajo de la superficie no serán capaces de crecer a menos que el cultivo sea agitado o aireado de otra manera. El crecimiento de la población también puede cesar debido a la acumulación de producto de desecho tóxicos. Este factor parece limitar el crecimiento de muchos cultivos anaerobios. Por ejemplo, los estreptococos pueden producir mucho ácido láctico y otros ácidos orgánicos por la fermentación del azúcar de manera que el medio se vuelve ácido y se inhibe el crecimiento. Los cultivos de estreptococos también pueden entrar en fase estacionaria debido al agotamiento de su fuente de azúcar. Así, la entrada en fase estacionaria puede ser el resultado de diversos factores operando en conjunto.

d. Fase de Muerte. El deterioro ambiental ocasionado por el agotamiento de nutrientes o la acumulación de desechos tóxicos lleva a la disminución del número de células viables, característica distintiva de la fase de muerte celular. La muerte de una población microbiana, como su crecimiento durante a fase exponencial, es usualmente logarítmica (esto es, una proporción constante de células muere cada hora). Este patrón se mantiene incluso cuando el número total de células permanece constante debido a que las células simplemente fallan en lisarse después de morir. A menudo la única manera de decidir si una célula bacteriana es viable o no es mediante

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incubación en medio fresco; si no crece y se reproduce, se asume que está muerta. Aunque usualmente la mayor parte de la población microbiana muere en forma logarítmica, la tasa de muerte puede disminuir después de que la población ha sido reducida drásticamente. Esto es debido a la presencia de células sobrevivientes o particularmente resistentes.

Las matemáticas del crecimiento. El conocimiento de la tasa de crecimiento microbiano durante la fase exponencial es indispensable para los microbiólogos. Los estudios de la tasa de crecimiento contribuyen a la investigación básica de fisiología y ecología y a la solución de problemas aplicados en la industria. Por lo tanto, los aspectos cuantitativos del crecimiento en fase exponencial se discutirán a continuación. Durante la fase exponencial cada microorganismo se divide a intervalos constantes. Así, la población se duplica en número en una longitud específica de tiempo llamada tiempo de generación o tiempo de duplicado. Esta situación puede ser ilustrada con un ejemplo simple. Suponga que un tubo de cultivo es inoculado con una célula que se divide cada 20 minutos (Tabla 5.1). La población será de 2 células después de 20 minutos, 4 células después de 40 minutos, y así. Debido a que la población se duplica cada generación, el incremento en la población es siempre 2n, donde n es el número de generaciones. El incremento resultante en la población es exponencial o logarítmico. Tabla 5.1 Un ejemplo de crecimiento exponencial.

Tiempo a Número de divisiones

2n Población (N0 x 2n)

Log 10Nt

0 20 40 60 80 100 120

0 1 2 3 4 5 6

20 = 1 21 = 2 22 = 4 23 = 8 24 = 16 25 = 32 26 = 64

1 2 4 8

16 32 64

0.000 0.301 0.602 0.903 1.204 1.505 1.806

a El cultivo hipotético comienza con una célula que tiene un tiempo de generación de 20 minutos. Estas observaciones pueden ser expresadas como ecuaciones para el tiempo de generación. Sea N0 = número inicial de la población. Nt = la población al tiempo t n = el número de generaciones al tiempo t

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La inspección de resultados de la tabla 5.1 muestra que

nt xNN 20=

Resolviendo para n, el número de generaciones, donde todos los logaritmos son en base 10,

( )2logloglog 0 nxNNt +=

y

301.0

loglog

2log

loglog 00 NNNNn tt −

=−

=

La tasa de crecimiento en un cultivo batch puede ser expresada en términos de la constante de velocidad de crecimiento (k). Este es el número de generaciones por unidad de tiempo, a menudo expresada como las generaciones por hora.

t

NN

t

nk t

301.0

loglog 0−==

El tiempo que toma una población para doblar su tamaño, esto es el tiempo medio de generación o tiempo medio de duplicación (g), puede ahora ser calculado. Si la población se duplica (t=g), entonces

02NNt = Sustituyendo 2N0 en la ecuación para la constante de crecimiento y resolviendo para k.

( )g

NN

g

NNk

301.0

loglog2log

301.0

log2log 0000 −+=

−=

gk

1=

El tiempo medio de generación es el recíproco de la constante de crecimiento.

kg

1=

El tiempo medio de generación (g) puede determinarse directamente de una gráfica semilogarítmica de los datos de crecimiento y la constante de velocidad calculada a partir del valor de g. El tiempo de generación también puede ser

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calculado directamente de las ecuaciones previas. Por ejemplo, suponga que una población bacteriana se incrementa de 103 células a 109 células en 10 horas.

( )( ) hesgeneracionhh

k /0.201.3

39

10301.0

10log10log 39

=−=−=

Los tiempos de generación varían marcadamente con las especies de microorganismos y con las condiciones ambientales. Su rango va desde menos de 10 minutos (0.17 h) para unas cuantas bacterias, hasta varios días para el caso de algunos microorganismos eucariotas. Los tiempos de generación en la naturaleza sin usualmente más largos que en cultivo. 5.2 Medición del Crecimiento Microbiano

Hay muchas maneras de medir el crecimiento microbiano para determinar la velocidad de crecimiento y el tiempo de generación. Puede monitorearse tanto la masa como el número de la población ya que el crecimiento lleva al incremento en ambos. Las técnicas más comúnmente empleadas para la medición del crecimiento se examinan brevemente y se señalan las desventajas de cada una de ellas.

Medición del número de células. La manera más obvia de determinar números microbianos es a través de su cuenta directa. El uso de una cámara contadora es fácil, barato, y relativamente rápido; además se obtiene también información sobre el tamaño y morfología de los microorganismos. La cámara de Petroff-Hausser para conteo puede ser usada para contar bacterias; los hemocitómetros pueden ser usados para los más grandes microorganismos eucariotas. Estas laminillas especialmente diseñadas tienen cámaras de profundidad conocida con una cuadrícula grabada sobre el fondo de la cámara. El número de microorganismos en una muestra puede ser calculado considerando en la cuenta el volumen de la cámara y cualquier dilución de la muestra requerida. Hay algunas desventajas en esta técnica. La población microbiana debe ser bastante grande para tener exactitud debido a que sólo se analiza un volumen pequeño. Esa bastante difícil o imposible distinguir entre células vivas y células muertas en la cámara de conteo. Microorganismos más grandes como protozoarios, algas y levaduras no filamentosas pueden ser contados directamente con contadores electrónicos tales como el Contador Coulter. La suspensión microbiana es forzada a pasar a través de un pequeño orificio. Una corriente eléctrica fluye a través del orificio y electrodos colocados a ambos lados miden la resistencia eléctrica. Cada vez que una célula microbiana pasa a través del orificio la resistencia eléctrica se incrementa (o la conductividad disminuye) y la célula es contada. El contador Coulter da resultados exactos con células grandes y es extensamente utilizado en laboratorios de hospitales para contar células rojas y blancas. No es útil para contar bacterias debido

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a la interferencia por pequeñas partículas de polvo, la formación de filamentos, y otros problemas. Las cámaras de conteo y los contadores eléctricos producen cuentas de células, estén vivas o no. Hay también diversas técnicas de cuanta de viables, procedimientos específicos para células capaces de crecer y reproducirse. En la mayoría de los procedimientos de cuenta de viables una muestra diluida de bacterias u otros microorganismos es dispersada sobre una superficie sólida. Cada microorganismo o grupo de microorganismos se desarrolla en una colonia distintiva. El número original de microorganismos viables en la muestra puede calcularse a partir del número de colonias formadas y la dilución de la muestra. Por ejemplo, si 1.0 mL de una dilución 1x10-6 produce 150 colonias, la muestra original contenía cerca de 1.5 x 108 células por mililitro. Usualmente la cuenta se hace más exacta usando un contador especial de colonias. De esta manera, las técnicas de vertido y estriado en placa pueden emplearse para determinar el número de microorganismos presentes en una muestra. Las técnicas en placa son simples, sensibles, y ampliamente usadas para contar bacterias y otros microorganismos en muestras de alimentos, agua y suelo. Varios problemas, sin embargo, pueden llevar a un conteo inexacto. Un bajo conteo puede resultar si grupos de células no son dispersados. Debido a que no es posible estar absolutamente seguros de que cada colonia fue originada de una célula individual, el resultado a menudo se expresa como unidades formadoras de colonias (UFC) más que como número de microorganismos. Las muestras deben producir entre 25 y 250 colonias para mejores resultados. Por supuesto que la cuenta será también baja si el medio empleado no puede soportar el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes. El agar caliente usado en la técnica de vertido en placa puede dañar o matar a células sensibles.; así, a veces la técnica de estriado en placa da cuentas mayores que la de vertido. El número de microorganismos se determina frecuentemente a partir de cuentas de colonias que crecen sobre filtros especiales de membrana que tienen poros lo suficientemente pequeños para atrapar bacterias. En esta técnica, llamada de filtro de membrana, la muestra es pasada a través de filtros de membrana especiales. El filtro es luego colocado sobre un medio con agar o en una almohadilla empapada con medio líquido, e incubado hasta que cada célula forma una colonia separada. El número de colonias contadas da el número de microorganismos en la muestra filtrada y un medio especial puede ser utilizado para seleccionar microorganismos específicos. Los filtros de membrana también son utilizados para contar bacterias directamente. Primero la muestra se filtra a través de un filtro de membrana de policarbonato que ha sido teñido de negro para proporcionar un buen fondo de observación de objetos fluorescentes. Luego las bacterias son teñidas con un colorante fluorescente tal como el naranja de acridina y observadas microscópicamente. Los microorganismos teñidos con naranja de acridina brillan de color naranja o verde y son fácilmente contados con un microscopio de

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epifluorescencia. Usualmente la cuentas obtenidas con esta técnica son más altas que las obtenidas con cultivos. En la actualidad existen kits comerciales con colorantes que diferencian entre células vivas y células muertas. Medición de la masa celular. El incremento en la masa celular, así como en el número de células, acompaña al crecimiento de la población. Por lo tanto, las técnicas de medición de la masa celular pueden utilizarse para medir el crecimiento. La técnica más directa es la determinación del peso seco microbiano. Las células creciendo en medio líquido se recolectan por centrifugación, lavadas, secadas en un horno, y pesadas. Esta es una técnica especialmente útil para medir el crecimiento de los hongos. Sin embargo, es tardada y poco sensible. Debido a que el peso de las bacterias es pequeño, puede ser necesario centrifugar varios cientos de mililitros de cultivo para colectar suficiente muestra. Una técnica más rápida y sensible depende del hecho de que las células microbianas dispersan la luz que incide sobre ellas. Debido a que las células microbianas en una población son aproximadamente de tamaño constante, la cantidad de dispersión es proporcional a la concentración de células presentes. Cuando la concentración de bacterias alcanza cerca de 10 millones de células (107) por mililitro, el medio se vuelve turbio. Incrementos posteriores en la concentración resultan en mayor turbidez y menos luz es transmitida a través del medio. El grado de luz dispersada puede ser medido con un espectrofotómetro y es casi lineal respecto a la concentración bacteriana a niveles bajos de absorbancia. De esta manera, el crecimiento de la población puede ser medido fácilmente espectrofotométricamente mientras la población sea lo suficientemente grande para dar turbidez detectable. Si la cantidad de sustancia en cada célula es constante la cantidad total de los constituyentes celulares de dicha célula está relacionada directamente con la masa celular microbiana total. Por ejemplo, una muestra de células lavadas colectadas de un volumen conocido de medio puede ser analizado por proteína o nitrógeno total. Un incremento en la población microbiana se reflejará en mayor nivel de proteína total. Similarmente, pueden usarse determinaciones de clorofila para medir las poblaciones de algas, y la cantidad de ATP puede usarse para estimar la cantidad de masa microbiana viva. 5.3 Productividad del Crecimiento y Efecto del Nutr iente Limitante.

Cuando el crecimiento microbiano está limitado por una concentración baja de un nutriente requerido, el crecimiento neto final o producción de células se incrementa con la cantidad inicial del nutriente limitante presente. Esta es la base del análisis microbiológico de vitaminas y otros factores de crecimiento. La tasa de crecimiento también se incrementa con la concentración del nutriente, pero de manera hiperbólica. La forma de la curva parece reflejar la velocidad de toma del

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nutriente por las proteínas de transporte del microorganismo. A niveles suficientemente altos del nutriente los sistemas de transporte están saturados y la velocidad de crecimiento no mejora con el incremento en la concentración del nutriente.

La cantidad de masa microbiana producida a partir de un nutriente puede

expresarse cuantitativamente como la producción de crecimiento (Y):

consumidosustratodemasa

formadosismosmicroorgandemasaY =

La producción de crecimiento de bacterias fermentativas se ha estudiado extensivamente. Cuando crecen en medio nutricionales ricos las bacterias pueden utilizar la fermentación de carbohidratos sólo para generación de energía y emplear otras sustancias, como aminoácidos, como materia prima para biosíntesis. La eficiencia del ATP usado durante la fermentación se refleja en el valor YATP:

producidosATPdemoles

formadascélulasdegramosYATP =

Aunque los valores de YATP pueden variar a concentraciones muy bajas de azúcar, el YATP de la mayoría de las bacterias es de cerca de 10.5 g/mol a niveles altos de azúcar. Así, parece que las bacterias usan generalmente la energía en biosíntesis con una eficiencia bastante constante. Más aún, el valor medido de YATP es mucho más bajo que el máximo teórico de 32, el cual es el valor de YATP esperado si todo el ATP fuera usado en biosíntesis. Mucho del ATP es usado en transporte, trabajo mecánico, y probablemente otras formas. 5.4 Cultivo Continuo de Microorganismos.

Hasta este punto, se ha puesto atención en sistemas cerrados, denominados cultivos batch, en los cuales el aporte de nutrientes no se renueva y los desechos no son removidos. El crecimiento exponencial dura sólo unas pocas generaciones y la fase estacionaria se alcanza pronto. Sin embargo, es posible crecer microorganismos en un sistema abierto, un sistema en el cual se mantienen condiciones ambientales constantes a través de la provisión continúa de nutrientes y la remoción de desechos. Estas condiciones se alcanzan en el laboratorio por medio de sistemas continuos de cultivo. Una población microbiana puede ser mantenida en fase de crecimiento exponencial y a una concentración constante de biomasa por largos periodos en un sistema de este tipo.

El quimiostato. Los dos tipos principales de sistemas continuos de cultivo comúnmente usados son: (1) quimiostato y (2) turbidostato. Un quimiostato se construye de

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manera que el medio estéril es alimentado al vaso de cultivo a la misma velocidad que se remueve el medio conteniendo microorganismos. El medio de cultivo para un quimiostato posee un nutriente esencial (por ejemplo un aminoácido) en cantidad limitante. Debido a la presencia de este nutriente limitante, la velocidad de crecimiento está determinada por la velocidad a la cual se alimenta medio nuevo en la cámara de crecimiento y la densidad celular final depende de la concentración del nutriente limitante. La tasa de intercambio de nutrientes está expresada como la tasa de dilución (D), la velocidad a la cual el medio fluye a través del vaso de cultivo, con respecto al volumen de dicho vaso, donde f es la velocidad de flujo (ml/h) y V es el volumen del vaso (mL):

V

fD =

Por ejemplo, si f es 30 mL/h y V es 100 mL, la velocidad de dilución es 0.30 h-

1.

Tanto los niveles de población microbiana como el tiempo de generación se relacionan con la tasa de dilución. La densidad de población microbiana permanece sin cambio en un rango amplio de valores de la tasa de dilución. El tiempo de generación decrece al incrementarse la tasa de dilución. El nutriente limitante estará casi completamente agotado bajo estas condiciones balanceadas. Si la tasa de dilución aumenta demasiado el microorganismo puede de hecho ser lavado fuera del vaso de cultivo antes de que pueda reproducirse debido a que la tasa de dilución es más grande que la velocidad máxima de crecimiento. La concentración del nutriente limitante aumenta a tasas de dilución altas debido a que pocos microorganismos están presentes para utilizarlo.

A tasas de dilución muy bajas un incremento en D causa un aumento tanto en la

densidad celular como en la velocidad de crecimiento. Esto es debido al efecto de la concentración del nutriente sobre la velocidad de crecimiento, a veces llamado relación de Monod. A bajas tasas de dilución hay una baja disponibilidad de nutrientes. Mucha de la energía disponible debe ser utilizada para mantenimiento celular, no para crecimiento y reproducción. Conforme la tasa de dilución se incrementa, la cantidad de nutrientes y la densidad celular resultante aumentan debido a que hay energía disponible tanto para mantenimiento como para crecimiento. La velocidad de crecimiento se incrementa cuando la energía total disponible excede a la energía de mantenimiento.

El turbidostato. El segundo tipo de sistema continuo de cultivo, el turbidostato, tiene una fotocelda que mide la absorbancia o turbidez del cultivo en el vaso de crecimiento. La velocidad de flujo del medio a través del vaso es regulada automáticamente para mantener una turbidez o densidad celular predeterminada. El turbidostato difiere del quimiostato en varios aspectos. La tasa de dilución en el turbidostato varía más que

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permanecer constante y el medio de cultivo carece de un nutriente limitante. El turbidostato opera mejor a tasas de dilución altas; el quimiostato es más estable y efectivo a tasas bajas de dilución. Los sistemas continuos de cultivo son muy útiles debido a que proporcionan una fuente constante de células en fase exponencial y que crecen a velocidad conocida. Esto hace posible el estudio del crecimiento microbiano a niveles muy bajos de nutrientes, concentraciones cercanas a aquellas que se encuentran en ambientes naturales. Estos sistemas son esenciales para la investigación en muchas áreas, por ejemplo en estudios sobre interacciones entre especies microbianas bajo condiciones ambientales semejantes a pozas o lagos dulces. 5.5 Crecimiento Balanceado y No Balanceado.

El crecimiento exponencial, ya sean en sistema batch o continuo, es crecimiento balanceado. Esto es, todos los constituyentes celulares se sintetizan a tasas constantes y relacionadas con los otros componentes. Si los niveles de nutrientes u otras condiciones ambientales cambian, resulta un crecimiento no balanceado debido a que la tasa de síntesis de los componentes celulares varía con respecto a la de otros hasta que se alcance un nuevo estado balanceado. Esta respuesta es observada en un experimento en el cual se transfieran bacterias de un medio nutricional pobre a uno rico. Las células primero construyen nuevos ribosomas para mejorar su capacidad de síntesis de proteínas; esto es seguido por un incremento en la síntesis de proteínas y DNA. Finalmente, tiene lugar el esperado aumento en la velocidad de reproducción.

El crecimiento no balanceado también resulta cuando una población

bacteriana es desplazada de un medio rico a uno pobre. El microorganismo puede previamente haber sido capaz de obtener muchos componentes celulares directamente del medio. Cuando se le cambia aun medio nutricionalmente inadecuado necesita tiempo para sintetizar las enzimas requeridas para la biosíntesis de los nutrientes no disponibles. Consecuentemente la división celular y la replicación del DNA continúan después del desplazamiento, pero la síntesis de proteínas se vuelve lenta. Las células se vuelven más pequeñas y se reorganizan a sí mismas metabólicamente hasta que sean capaces de crece nuevamente y el crecimiento balanceado sea reanudado.

Estos experimentos de desplazamiento demuestran que el crecimiento

microbiano está bajo control preciso y coordinado y responde rápidamente a cambios en las condiciones ambientales.

5.6 Influencia de Factores Ambientales Sobre el Cre cimiento Microbiano.

El crecimiento de los microorganismos es afectado enormemente por la naturaleza física y química de su ambiente. El entendimiento de la influencia

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ambiental ayuda al control del crecimiento microbiano y al estudio de la distribución ecológica de los microorganismos.

Solutos y actividad del agua. Debido a que una membrana selectiva y semipermeable separa a los microorganismos de su ambiente, éstos pueden ser afectados por cambios en la concentración osmótica de su entorno. Si un microorganismo es colocado en una solución hipotónica el agua entrará a la célula y causará su estallido a menos que de algún modo se impida el flujo de agua. La mayoría de las bacterias, algas y hongos tienen paredes celulares rígidas que mantienen la forma e integridad de la célula. Además, muchos microorganismos mantienen la concentración osmótica de su protoplasma por encima de la del medio circundante con el uso de solutos compatibles, así la membrana plasmática está siempre presionada firmemente contra la pared celular. Los solutos compatibles son solutos que son compatibles con el metabolismo y el crecimiento a altas concentraciones intercelulares. La mayoría de las bacterias incrementan su concentración osmótica interna a través de la síntesis o toma de colina, botaina, prolina, ácido glutámico y otros aminoácidos; niveles elevados de ión potasio están también involucrados en algún grado. Las algas y los hongos emplean sacarosa y polioles (arabitol, glicerol, y manitol) para el mimo propósito. Los polioles y aminoácidos son solutos ideales para esta función porque normalmente no destruyen la estructura enzimática y su función. Unas pocas bacterias, como Holobacterium salinarium, mejoran su concentración osmótica con iones potasio. Las enzimas de este microorganismo han sido alteradas de manera que requieren altas concentraciones de sal para su actividad normal. Puesto que los protozoarios no tiene una pared celular, deben usar vacuolas contráctiles para eliminar el exceso de agua cuando viven en ambientes hipotónicos. Cuando microorganismos con pared celular rígida son colocados en un ambiente hipertónico, el agua fluye hacia fuera y la célula se encoge, un proceso conocido como plasmólisis. Esto deshidrata la célula y puede dañar la membrana plasmática: usualmente la célula se vuelve metabólicamente inactiva y cesa de crecer. La cantidad de agua disponible para los microorganismos puede reducirse por interacción con moléculas de soluto (efecto osmótico) o por adsorción a la superficie de sólidos (efecto de matriz). Debido a que la concentración osmótica de un hábitat tiene un efecto profundo sobre los microorganismos, es útil tener la capacidad de expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad de agua. Los microbiólogos por lo general usan el la actividad del agua (aw) para este propósito. La actividad del agua de una solución es 1/100 de la humedad relativa de la solución (cuando se expresa como por ciento). Esto es equivalente a la tasa de presión de vapor de la solución (Psoln) sobre la del agua pura (Pagua).

agua

sow P

Pa ln=

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La actividad del agua de una solución o un sólido puede determinarse en una cámara sellada midiendo la humedad relativa después de que el sistema ha alcanzado el equilibrio. Suponga que después de que una muestra ha sido tratada de esta manera el aire por encima esta 95% saturado, esto es, al aire contiene el 95% de la mezcla que podría tener en el equilibrio a la misma temperatura con una muestra de agua pura. La humedad relativa sería 95% y la actividad de agua de la muestra 0.95. La actividad del agua se relaciona inversamente a la presión osmótica; si una solución tiene alta presión osmótica, su aw es bajo. Los microorganismos difieren ampliamente en su habilidad para adaptarse a hábitats con baja actividad de agua. Un microorganismo debe hacer un esfuerzo extra para crecer en hábitats con bajo aw porque debe mantener una alta concentración interna de solutos para retener agua. Algunos microorganismos pueden hacer esto y se les llama osmotolerantes; crecen en un amplio rango de actividades de agua y concentración osmótica. Por ejemplo, Staphylococcus aureus puede cultivarse en medios que contienen cualquier concentración de cloruro de sodio por arriba de 3 M. La levadura Saccharomyces rouxii crecerá en soluciones de azúcar con valores de aw tan bajos como 0.6. El alga Dunaliella viridis tolera concentraciones de cloruro de sodio desde 1.7 M hasta soluciones saturadas. Aunque unos pocos microorganismos son en verdad osmotolerantes, la mayoría sólo crecen bien a actividades de agua de alrededor de 0.98 (el aw aproximado del agua de mar) o más altos. Las halófilas se han adaptado de tal manera a condiciones salinas que requieren cerca de 2.8 M a saturación (cerca de 6.2 M) para bacterias halofílicas extremas. Halobacterium y otras bacterias halofílicas extremas han modificado significativamente la estructura de sus proteínas y membranas más que simplemente modificar la concentración intracelular de solutos, la estrategia utilizada por la mayoría de las osmotolerantes. Las halofílicas extremas se han adaptado exitosamente a un ambiente que destruye a la mayoría de los microorganismos. En el proceso se han vuelto tan especializadas que han perdido flexibilidad ecológica y sólo pueden prosperar en pocos hábitats extremos. pH. No es de sorprender que el pH afecte dramáticamente el crecimiento microbiano. Cada especie tiene un rango definido de pH de crecimiento y un pH óptimo.

- Acidófilas . Tienen su pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5. - Neutrófilas . Tienen su pH óptimo de crecimiento entre 5.5 y 8.0. - Alcalófilas . Tienen su pH óptimo de crecimiento entre 8.5 y 11.5. - Alcalófilas extremas . Prefieren pH por encima de 10.0.

En general los diferentes grupos microbianos tienen preferencias de pH

características. La mayoría de las bacterias y los protozoarios son neutrófilos. La

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mayoría de los hongos prefieren entornos ligeramente ácidos, de cerca de 4 a 6; las algas también parecen preferir estas condiciones. Hay muchas excepciones a esta generalización. Por ejemplo, el alga Cyanidium caldarium y la bacteria Sulfolobus acidocaldarius son habitantes comunes de manantiales termales ácidos; ambos crecen bien a pH de alrededor de 1 a 3 y altas temperaturas.

Aunque los microorganismos generalmente crecen bien a rangos amplios de

pH, hay límites a su tolerancia. Variaciones drásticas en el pH pueden dañar al microorganismo rompiendo la membrana plasmática o inhibiendo la actividad de enzimas y proteínas transportadoras de membrana. La muerte bacteriana ocurre si el pH interno baja más allá de 5.0 y 5.5. Cambios en el pH externo también pueden alterar la ionización de las moléculas de nutrientes y reducir así su disponibilidad para el organismo.

A pesar de la amplia variación en el pH de su hábitat, el pH interno de la

mayoría de los microorganismos es cercano a la neutralidad. Los microorganismos a menudo deben adaptarse a cambios de pH en su ambiente para sobrevivir. Los microorganismos frecuentemente cambian el pH de su propio hábitat produciendo desechos metabólicos ácidos o básicos.

Temperatura. La temperatura ambiental afecta profundamente a los microorganismos, al igual que a otros organismos. Además, los microorganismos son especialmente susceptibles porque usualmente son unicelulares y poiquilotermos, es decir, su temperatura varía con la del ambiente externo. Por estas razones, la temperatura de la célula microbiana refleja directamente la de su entorno. Un factor más importante para la influencia de la temperatura sobre el crecimiento es la sensibilidad de las reacciones catalizadas por enzimas a la temperatura. A bajas temperaturas un aumento en la temperatura incrementa la velocidad de crecimiento debido a que la velocidad de una reacción catalizada por enzimas, al igual que cualquier reacción química, se dobla cada 100C de incremento en temperatura. Debido a que la velocidad de cada reacción se incrementa, el metabolismo en su totalidad es más activo a temperaturas altas, y el microorganismo crece más rápido. Más allá de cierto punto incrementos adicionales desaceleran el crecimiento y temperaturas suficientemente altas son letales. Las temperaturas altas dañan al microorganismo desnaturalizando las enzimas, las proteínas transportadoras, y otras proteínas. Las membranas microbianas son también rotas por el calor. Así, aunque las enzimas funcionales operan más rápidamente a temperaturas altas, el microorganismo puede ser dañado a tal grado que el crecimiento sea inhibido debido a que el daño no puede se reparado adecuadamente. Debido a esta influencia opuesta de la temperatura, el crecimiento microbiano tiene una dependencia característica de la temperatura con temperaturas cardinales distintivas, temperaturas de crecimiento mínima, óptima, y máxima. Aunque la forma de a curva de dependencia de la temperatura puede variar, la temperatura óptima es siempre más cercana a la máxima que a la mínima. Las temperaturas cardinales de

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una especie en particular no son fijas de manera rígida sino que a menudo dependen hasta cierto grado de otros factores ambientales tales como el pH y los nutrientes disponibles. Las temperaturas cardinales varían ampliamente entre los microorganismos. El rango de temperatura óptima va desde 00C hasta 750C, mientras que el crecimiento microbiano ocurre a temperaturas que se extienden desde -200C hasta arriba de 1000C. El rango de temperatura de crecimiento de un microorganismo en particular tiene usualmente un rango de 30 grados. Algunas especies (como Neisseria gonorrhoeae) tienen rangos pequeños y son llamados estenotermales; otros, como Enterococcus faecalis, crecen en rangos amplios de temperatura y son llamados euritermales. Los principales grupos de microorganismos difieren en sus temperaturas máximas de crecimiento. El límite superior para los protozoarios es de cerca de 500C. Algunas algas y hongos pueden crecer a temperaturas tan altas como 55 a 600C. Se han encontrado bacterias creciendo a o cerca de 1000C, el punto de ebullición del agua. Claramente, las procariotas pueden crecer a temperaturas mayores que los eucariotas. Los microorganismos pueden ser colocados en una de cinco clases de acuerdo a su rango de temperatura de crecimiento.

- Psicrófilas. Crecen bien a 00C y tienen una temperatura óptima de crecimiento de 150C o menos; la máxima es de alrededor de 200C.

- Psicrotrofas o psicrófilas facultativas. Pueden crecer a 00C aunque tienen una óptima entre 20 y 300C y una máxima de cerca de 350C. Estas bacterias son importantes en el deterioro de alimentos refrigerados.

- Mesófilas. Temperatura óptima de crecimiento entre 20 y 450C; mínima de 150C y máxima de cerca de 450C. La mayoría de los microorganismos caen probablemente en esta categoría.

- Termófilas. Pueden crecer a temperaturas de 550C o más altas. Su mínima es de cerca de 450C y a menudo tienen una óptima de entre 55 y 650C. Máxima entre 90 y 1000C.

- Hipertermófilas. Tienen una temperatura óptima de crecimiento entre 80 y 1100C. Usualmente no crecen bien por debajo de 550C.

Concentración de oxígeno. Un organismo capaz de crecen en presencia de O2 atmosférico es un aerobio, mientras que uno que puede crecer en su ausencia es un anaerobio. Casi todos los organismos superiores son completamente dependientes del O2 atmosférico para crecer, esto es, son aerobios obligados. El oxígeno sirve como el aceptor final de electrones para la cadena transportadora de electrones en la respiración aerobia. Además, las eucariotas aerobias emplean O2 en la síntesis de esteroles y ácidos grasos insaturados. Las anaerobias facultativas no requieren oxígeno para crecer, pero crecen mejor en su presencia. Las anaerobias aerotolerantes, tales como Enterococcus faecalis, simplemente ignoran el O2 y crecen igualmente bien si está presente o no. En contraste, las anaerobias estrictas u obligadas no toleran el

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oxígeno y mueren en su presencia. Las aerotolerantes y las anaerobias estrictas no pueden generar energía a través de la respiración y deben emplear la fermentación o respiración anaerobia para este propósito. Finalmente, hay unas pocas aerobias tales como Campylobacter, llamadas microerófilas, que son dañadas por niveles normales de O2 atmosférico (20%) y requieren niveles de O2 en un rango del 2 al 10% para crecer. Un grupo microbiano puede mostrar más de un tipo de relación para el O2. Los cinco tipos se encuentran entre las bacterias y protozoarios. Los hongos son normalmente aerobios, pero algunas especias, particularmente levaduras, son anaerobias facultativas. Las algas son casi siempre aerobias obligadas. Presión. La mayoría de los microorganismos pasan su vida en tierra o en la superficie del agua, siempre sujetos a presiones de 1 atmósfera (atm) y nunca son afectados significativamente por la presión. Pero la presión hidrostática puede alcanzar 600 a 1100 atm en el fondo del océano, con temperaturas de 2 a 30C. A pesar de estos extremos, las bacterias sobreviven y se adaptan. Muchas son barotolerantes: el incremento en la presión no las afecta adversamente tanto como a las bacterias no tolerantes. Algunas bacterias del intestino de invertebrados del fondo del océano, tales como anfípodos, son barofílicas, esto es, crecen más rápidamente a presiones altas. Estas bacterias juegan un papel importante en el reciclado de nutrientes en el fondo del océano. Radiación. Nuestro planeta es bombardeado con radiación electromagnética de varios tipos. Muchas formas de esta radiación son muy dañinas para los microorganismos. Esto es en particular valido para la radiación ionizante, radiación de muy corta longitud de onda o alta energía la cual puede causar que los átomos pierdan electrones y se ionicen. Los dos tipos principales de radiación ionizante son los rayos X (producidos artificialmente) y los rayos gamma (emitidos el desintegrarse radioisótopos). Bajos niveles de radiación ionizante producirán mutaciones que pueden resultar indirectamente en la muerte, mientras que niveles altos son directamente letales. Aunque los microorganismos son más resistentes a la radiación ionizante que los organismos mayores, pueden ser destruidos por dosis suficientemente largas de radiación. La radiación ionizante puede ser utilizada para esterilizar. Algunas bacterias (como Deinococcus radiodurans) y algunas esporas bacterianas, pueden sobrevivir a grandes dosis de radiación ionizante. La radiación ultravioleta (UV) mata todo tipo de microorganismos debido a su corta longitud de onda (aproximadamente 10 a 400 nm) y alta energía. La radiación UV más letal tiene una longitud de onda de 260 nm, la longitud de onda más efectivamente absorbida por el DNA. El mecanismo primario de daño por UV es la formación de dímeros de timina en el DNA. Dos timinas adyacentes en una cadena de DNA son unidas covalentemente e inhiben la función y replicación del DNA. Este

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daño es reparado de diversas maneras. En la fotoreactivación, la luz azul es utilizada por una enzima fotoreactivadora para romper los dímeros de timina. Una secuencia corta que contenga los dímeros de timina puede también ser cortada y reparada. Este proceso ocurre en ausencia de luz y es llamado reactivación oscura. Cuando la exposición a UV es demasiado larga, el daño es tan extenso que la reparación es imposible.

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CAPÍTULO VI. CONTROL DE MICROORGANISMOS POR AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS.

La gente ha practicado desinfección y esterilización desde el comienzo del registro histórico, incluso antes de que se sospechara la existencia de microorganismos. En nuestros días, la habilidad para destruir microorganismos no es menos importante; esto hace posible el uso de técnicas asépticas en investigación microbiológica, preservación de alimentos, y prevención de enfermedades. Las técnicas descritas en este capítulo también son esenciales para la seguridad personal tanto en el laboratorio como en el hospital. La terminología es especialmente importante cuando se discute sobre el control de microorganismos debido a que palabras como desinfectante y antiséptico son a menudo usadas erróneamente. Esta situación es incluso más confusa porque un tratamiento puede inhibir el crecimiento o matar dependiendo de las condiciones. La habilidad para controlar poblaciones microbianas u objetos inanimados, como utensilios para comida e instrumentos quirúrgicos, es de considerable importancia práctica. Algunas veces es necesario eliminar todos los microorganismos de un objeto, mientras que en otras situaciones sólo se requiere destrucción parcial de la población microbiana. La esterilización es el proceso mediante el cual todas las células vivas, esporas viables, virus y tiroides, son destruidos y removidos de un objeto o hábitat. Un objeto estéril está totalmente libre de microorganismos viables, esporas, y otros agentes infecciosos. Cuando la esterilización es alcanzada por un agente químico, el químico es llamado esterilizante. En contraste, la desinfección es la muerte, inhibición, o remoción de microorganismos que pueden causar enfermedades. Los desinfectantes son agentes, usualmente químicos, usados para realizar la desinfección y normalmente son usados sólo en objetos inanimados. Un desinfectante no necesariamente esteriliza un objeto porque pueden permanecer esporas y algunos pocos microorganismos. La sanitización está muy cercanamente relacionada con la desinfección. En la sanitización la población microbiana es reducida a niveles considerados seguros según estándares de salud pública. A menudo objetos inanimados son limpiados y parcialmente desinfectados; por ejemplo, se utilizan sanitizadores para limpiar los utensilios en los restaurantes. Frecuentemente es necesario controlar los microorganismos en los tejidos vivos con el uso de agentes químicos. La antisepsia es la prevención de infecciones o sepsis y es lograda con el uso de antisépticos, los cuales son agentes químicos que se aplican a los tejidos para prevenir infecciones matando o inhibiendo el crecimiento de patógenos. Debido a que no deben destruir mucho el tejido del hospedero, generalmente loa antisépticos no son tan tóxicos como los desinfectantes.

Puede emplearse un sufijo para denotar el tipo de agente antimicrobiano. Las sustancias que matan al microorganismo llevan a menudo el sufijo -cida: un germicida mata microorganismos patógenos (y muchos no patógenos), pero no necesariamente endosporas. Un desinfectante o antiséptico puede ser

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particularmente efectivo contra un grupo específico, en este caso puede ser llamado bactericida, fungicida, algicida, o viricida. Otros químicos no matan sino que previenen el crecimiento. Sus nombres terminan en –estáticos; por ejemplo, bacteriostáticos o fungistáticos.

Aunque estos agentes han sido descritos en términos de su efecto sobre

patógenos, debe observarse que también pueden matar o inhibir no patógenos. Su habilidad para reducir la población microbiana total, no sólo de afectar los niveles de patógenos, es muy importante en muchas situaciones. 6.1 Patrón de Muerte Microbiana.

Una población microbiana no muere instantáneamente cuando es expuesta a un agente letal. La muerte poblacional, como el crecimiento poblacional, es generalmente exponencial o logarítmico, esto es, la población se reducirá en la misma fracción a intervalos constantes. Si el logaritmo de la población remanente es graficado contra el tiempo de exposición del microorganismo al agente, la gráfica resultantes es una línea recta. Cuando la población ha sido reducida en gran medida, la velocidad de muerte puede disminuir debido a la supervivencia de cepas más resistentes de microorganismos.

Para estudiar la efectividad de un agente letal, uno debe ser capaz de decidir

cuándo el microorganismo está muerto, una tarea nada fácil. Una bacteria es definida como muerta si no crece cuando es inoculada en un medio de cultivo que normalmente soportaría su crecimiento. De esta manera, un virus inactivo no puede infectar a un hospedero adecuado.

6.2 Condiciones que Influyen Sobre la Efectividad d e la Actividad de Agentes

Microbianos.

La destrucción de los microorganismos y la inhibición del crecimiento microbiano no son asuntos simples porque la eficacia de un agente antimicrobiano (un agente que mata microorganismos o inhibe su crecimiento) es afectada por al menos seis factores.

1) El tamaño de la población. Debido a que una fracción igual de una población

microbiana es eliminada durante cada lapso de tiempo, una población grande requiere de un mayor tiempo de exposición que una más pequeña.

2) La composición de la población. La efectividad de un agente varía enormemente con la naturaleza de los organismos que son tratados debido a que los microorganismos difieren ampliamente en susceptibilidad. Las endosporas bacterianas son mucho más resistentes a la mayoría de los agentes antimicrobianos que las formas vegetativas, y las células jóvenes son usualmente destruidas más fácilmente que los organismos maduros. Algunas especies son capaces de resistir condiciones adversas mejor que otras.

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Mycobacterium tuberculosis, el cual causa la tuberculosis, es mucho más resistentes a los agentes antimicrobianos que la mayoría de otras bacterias.

3) Concentración o intensidad de un agente antimicrobiano. A menudo, pero no siempre, a mayor concentración de un agente químico o mayor intensidad de uno físico, mayor rapidez en la destrucción de los microorganismos. La dependencia de la eficacia con respecto a la concentración o la intensidad generalmente es no linear. En un rango corto, pequeños incrementos en la concentración llevan a un aumento exponencial en la eficacia; más allá de cierto punto, incrementos posteriores no aumentarán la tasa de muerte en gran medida. Algunas veces un agente es más efectivo a concentraciones bajas. Por ejemplo, el etanol al 70% es más efectivo que el etanol al 95%.

4) Duración de le exposición. Cuanto mayor sea la exposición de una población a un agente antimicrobiano, más organismos serán eliminados. Para alcanzar la esterilización, debe usarse una la duración de la exposición que reduzca la probabilidad de supervivencia a 10-6 o menos.

5) Temperatura. Un incremento en la temperatura a la cual actúa un químico mejora a menudo su actividad. Frecuentemente puede usarse una concentración más baja de agente desinfectante o esterilizante a temperatura más alta.

6) Ambiente local. La población a ser controlada no está aislada, sino rodeada por factores ambientales que pueden ya sea ofrecerle protección o bien ayudar a su destrucción. Por ejemplo, debido a que el calor mata más rápidamente a un pH ácido, los alimentos y bebidas ácidos tales como frutas y tomates, son mucho más fáciles de pasteurizar que los alimentos más neutrales como la leche. Un segundo factor ambiental importante es la materia orgánica que puede proteger a los microorganismos contra el calor y desinfectantes químicos. Puede ser necesario limpiar un objeto antes de su desinfección o esterilización. Las jeringas y el equipo médico o dental debe limpiarse antes de su esterilización debido a la presencia de mucha materia orgánica que podría proteger a los patógenos e incrementar el riesgo de infección. Los mismos cuidados deben tomarse cuando los patógenos son destruidos durante la preparación de agua potable. Cuando la fuente de abastecimiento de agua de una ciudad tiene un alto contenido de materia orgánica, debe añadirse más cloro para la desinfección.

6.3 Uso de Métodos Físicos en Control.

El calor y otros agentes físicos son comúnmente utilizados para esterilizar objetos, como puede verse por el usos continuo del autoclave en cada laboratorio de microbiología. Los cuatro agentes físicos más utilizados son calor, filtración, radiación ultravioleta, y radiación ionizante.

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Calor. El fuego y el agua hirviendo han sido utilizados para esterilizare y desinfectar desde tiempos de los Griegos, y el calor es aún uno de los métodos más populares para destruir microorganismos, ya sea como calor húmedo o como calor seco. El calor húmedo mata fácilmente virus, bacterias y hongos. La exposición a agua hirviendo por 10 minutos es suficiente para destruir células vegetativas y esporas eucariotas. Desafortunadamente, la temperatura de ebullición del agua (1000C ó 2120F) no es lo suficientemente alta para destruir endosporas bacterianas que pueden sobrevivir horas en ebullición. Por lo tanto, este método puede ser usado para desinfección de agua potable y objetos que no se dañan con el agua, pero hervir no esteriliza. Debido a que el calor es tan útil para controlar microorganismos, es esencial tener una medición precisa de la eficacia del calor para matar. Inicialmente la efectividad fue expresada en términos del punto de muerte termal (TDP), la temperatura más baja a la cual una suspensión microbiana es matada en 10 minutos. Debido a que la TDP implica que cierta temperatura es inmediatamente letal a pesar de las condiciones, ahora es más comúnmente usado el tiempo de muerte termal (TDT). Éste es el tiempo más corto necesario para matar todos los microorganismos en una suspensión microbiana a una temperatura específica y bajo condiciones definidas. Sin embargo, tal destrucción es logarítmica y teóricamente no es posible destruir completamente a los microorganismos presentes en una muestra, incluso con exposiciones grandes al calor. Por lo tanto, un concepto aún más preciso, el tiempo de reducción decimal (D) o valor D, ha ganado amplia aceptación. El tiempo de reducción decimal es el tiempo requerido para matar al 90% de los microorganismos o esporas en una muestra a una temperatura específica. En una gráfica semilogarítmica de la población remanente contra el tiempo de calentamiento, el valor D es el tiempo requerido para que la línea baje un ciclo logarítmico ó 10 veces. Usualmente el valor D se escribe con un subíndice que indica la temperatura a la cual se aplica. Los valores D son usados para estimar la resistencia relativa de un microorganismo a diferentes temperaturas a través del cálculo del valor de z. El valor z es el incremento en la temperatura requerido para reducir D a 1/10 de su valor o reducirlo en un ciclo logarítmico cuando D se grafica contra temperatura. Otra manera de describir la efectividad del calentamiento es con el valor F. El valor F es el tiempo en minutos a una temperatura específica (usualmente 2500F ó 121.10C) necesario para matar una población de células o esporas. La esterilización por calor húmedo puede realizarse a temperaturas por encima de 1000C para destruir endosporas bacterianas, y esto requiere el uso de vapor saturado bajo presión. La esterilización con vapor se realiza en un autoclave, un equipo que parece una extravagante olla de presión. El agua es hervida para producir vapor el cual es llevado hacia la cámara del autoclave. El aire presente inicialmente en la cámara es forzado a salir hasta que la cámara está llena con vapor saturado y las salidas son cerradas. El caliente vapor saturado continúa entrando hasta que la cámara alcanza la temperatura y presión deseados, usualmente 1210C y

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15 libras de presión. A esta temperatura el vapor saturado destruye todas las células vegetativas y endosporas en un volumen pequeño de líquido en un tiempo de 10 a 12 minutos. El tratamiento se continúa usualmente por 15 minutos para proporcionar un margen de seguridad. El autoclavado debe realizarse apropiadamente o el material procesado no estará estéril. Si el aire no es completamente desalojado de la cámara, ésta no alcanzará 1210C incluso aunque alcance las 15 libras de presión. La cámara no debe empacarse muy apretadamente porque el vapor necesita circular libremente y estar en contacto con cada cosa en el autoclave. Las endosporas bacterianas serán eliminadas sólo si se mantienen a 1210C por 10 a 12 minutos. Cuando debe esterilizarse un gran volumen de líquido será necesario un tiempo mayor de esterilización ya que tomará más tiempo para que el centro del líquido alcance 1210C; 5 litros de líquido pueden requerir cerca de 70 minutos. En vista de estas potenciales dificultades, un indicador biológico es a menudo autoclavado junto con otro material. Estos indicadores consisten comúnmente en un tubo de cultivo que contiene una ámpula estéril de medio y una tira de papel cubierta con esporas de Bacillus stearothermophilus o Clostridium PA3679. Después del autoclavado, la ámpula es asépticamente rota y el cultivo incubado por varios días. Si la bacteria de la prueba no crece en el medio, la esterilización ha sido exitosa. En algunos casos una cinta especial que tiene escrita la palabra “estéril” de manera invisible o una tira de papel indicador que cambia de color con suficiente calentamiento, es autoclavada con una carga de material. Si la palabra aparece en la cinta o la tira cambia de color, se supone que el material está estéril. Esta metodología es útil y ahorra tiempo, pero no son tan confiables como el uso de endosporas bacterianas. Muchas sustancias, tales como la leche, son tratadas con calentamiento controlado a temperaturas por debajo del punto de ebullición, un proceso conocido como pasteurización en honor de su desarrollador, Luis Pasteur. La leche puede ser pasteurizada de dos maneras. En el método antiguo la leche se mantiene por 30 minutos a 630C. Pero en la actualidad grandes cantidades de leche son procesadas por pasteurización flash o pasteurización de temperatura de corto tiempo (HTST) la cual consiste en calentarla rápidamente a cerca de 720C por 15 segundos y luego enfriarla rápidamente. La industria láctea también usa a menudo esterilización por temperatura ultraalta (UHT). La leche y los productos lácteos son calentados a 140 ó 1500C por uno a tres segundos. La leche procesada por UHT no requiere refrigeración y puede ser almacenada a temperatura ambiente por cerca de dos meses sin cambio de sabor. Las pequeñas porciones de crema para café utilizadas en los restaurantes son a menudo preparadas por esterilización UHT. Algunos objetos son esterilizados mejor en ausencia de agua por esterilización con calor seco. Los productos a ser esterilizados son colocados en un horno a 160 o 1700C por 2 a 3 horas. Aparentemente la muerte microbiana resulta de la oxidación de los constituyentes celulares y la desnaturalización de proteínas. Aunque el calor con aire seco es menos efectivo que el calor húmedo, las esporas de Clostridium botulinum son eliminadas en 5 minutos con calor húmedo a 1210C pero sólo después de 2 horas a 1600C con calor seco, hay algunas ventajas. El calor seco no corroe los

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vasos de vidrio y los instrumentos de metal como lo hace el calor húmedo, y puede ser usado para esterilizar polvos, aceites y productos similares. La mayor parte de la esterilización de material de vidrio como cajas petri y pipetas s realiza con calor seco. A pesar de estas ventajas, la esterilización por calor seco es lenta y no adecuada para materiales sensibles al calor como muchos artículos de plástico y de caucho. Filtración. La filtración es una excelente manera para reducir las poblaciones microbianas en soluciones de materiales sensibles al calor, y en algunos casos puede ser utilizada para esterilizar soluciones. Más que destruir directamente los microorganismos contaminantes, el filtro simplemente los remueve. Hay dos tipos de filtros. Los filtros de profundidad consisten en materiales fibrosos o granulares que han sido unidos en una capa delgada llena con canales retorcidos de diámetro pequeño. La solución que contiene los microorganismos es absorbida a través de esta capa al vacío y las células son removidas por atrapamiento y por adsorción a la superficie del material del filtro. Este tipo de filtros están hechos de tierra de diatomeas, vidrio porcelanizado, asbestos, y otros materiales similares.

Recientemente los filtros de membrana han reemplazado a los filtros de profundidad para muchos propósitos. Estos filtros circulares son membranas porosas, de 0.1 mm de espesor, hechos de acetato de celulosa, nitrato de celulosa, policarbonato, y otros materiales sintéticos. Aunque están disponibles una gran variedad de tamaño de poro, las membranas con poro de cerca de 0.2 µ de diámetro son usadas para remover células vegetativas de soluciones que van desde 1 mL hasta varios litros en volumen. Las membranas son mantenidas en contenedores especiales y a menudo precedidas por filtros de profundidad hechos de fibra de vidrio para remover partículas grandes que pudieran tapar el filtro de membrana. La solución es forzada a través del filtro con vacío, o a presión con una jeringa, bomba peristáltica o tanque de gas nitrógeno, y colectada en contenedores previamente esterilizados. Los filtros de membrana remueven microorganismos separando partículas pequeñas de las grandes. Estos filtros son utilizados para esterilizar farmacéuticos, medios de cultivo, aceites, antibióticos, y otras soluciones sensibles al calor.

El aire también puede ser esterilizado por filtración. Dos ejemplos comunes

son las máscaras quirúrgicas y los tapones de algodón de los vasos de cultivo que dejan pasar el aire pero no los microorganismos presentes en él. Las campanas de seguridad biológica de flujo laminar emplean filtros de alta eficiencia de aire particulado (HEPA) los cuales remueven 99.97% de las partículas de 0.3 µ y son uno de los sistemas de filtración de aire más importantes.

Radiación. Los tipos de radiación y la manera en que dañan o destruyen a los microorganismos se mencionaron en el capítulo anterior. El uso práctico de las

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radiaciones ultravioleta e ionizante para esterilizar objetos se describe brevemente a continuación. La radiación ultravioleta de alrededor de 260 nm es bastante letal pero no penetra muy efectivamente al vidrio, películas de polvo, agua, y otras sustancias. Debido a estas desventajas, la radiación UV es usada como agente esterilizante sólo en una pocas situaciones específicas. Lámparas UV son algunas veces colocadas en los techos de habitaciones o en campanas de seguridad biológica para esterilizar el aire y cualquier superficie expuesta. Debido a que la radiación UV quema la piel y daña los ojos, la gente que trabaja en dichas áreas debe cerciorarse de que las lámparas están apagadas cuando las áreas están en uso. Existen unidades UV disponibles para el tratamiento de agua. Patógenos y otros microorganismos son destruidos cuando una delgada capa de agua es pasada bajo estas lámparas. La radiación ionizante es un excelente agente esterilizante y penetra profundamente en los objetos. La radiación gamma de una fuente de cobalto 60 es usada en la esterilización en frío de antibióticos, hormonas, suturas, y desechables plásticos como las jeringas. La radiación gamma ha sido también utilizada para esterilizar y “pasteurizar” carne y otros alimentos. Tanto la FDA (Food and Drug Administration) como la Organización Mundial de la Salud (OMS) han aprobado la irradiación de alimentos y la han declarado segura. 6.4 Uso de Agentes Químicos en Control.

Aunque los objetos son algunas veces desinfectados con agentes físicos, los químicos se emplean más a menudo en desinfección y antisepsia. Muchos factores influyen sobre la efectividad de los desinfectantes y antisépticos químicos. Factores tales como el tipo de microorganismo potencialmente presente, la concentración y naturaleza del desinfectante a ser usado, y la extensión del tratamiento, deben considerarse. Las superficies sucias deben limpiarse antes de que el desinfectante o antiséptico sea aplicado. El uso apropiado de agentes químicos es esencial para la seguridad en laboratorios y hospitales. Es importante mencionar que los químicos también son usados para prevenir el crecimiento microbiano en alimentos.

Hay muchos químicos diferentes disponibles para usarse como desinfectantes

y cada uno de ellos tiene sus propias ventajas y desventajas. En la selección de un agente es importante tener en mente las características del desinfectante deseado. Idealmente el desinfectante debe ser efectivo contra una amplia variedad de agentes infecciosos (bacterias gram-positivas y gram-negativas, bacterias ácido resistentes, endosporas bacterianas, hongos, y virus) a diluciones altas y en presencia de materia orgánica. Aunque los químicos deben ser tóxicos para los agentes infecciosos, no deben ser tóxicos para la gente ni corrosivos para los materiales comunes. Deben ser estables en almacenamiento, inodoros o con olor agradable, solubles en agua y lípidos para poder penetrar en el microorganismo, y tener una baja tensión superficial. Si es posible, los desinfectantes deben ser relativamente baratos.

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A continuación se generaliza sobre las propiedades y usos de varios grupos comunes de desinfectantes y antisépticos. Compuestos fenólicos. El fenol fue el primer antiséptico y desinfectante usado ampliamente. En 1867 Joseph Lister lo empleó para reducir el riesgo de infección durante las operaciones. Hoy en día el fenol y los compuestos fenólicos (derivados del fenol) tales como los cresoles, los xilenoles, y el ortofenilfenol son usados como desinfectantes en laboratorios y hospitales. Los fenólicos actúan desnaturalizando proteínas y rompiendo las membranas celulares. Estos compuestos tienen algunas ventajas reales como desinfectantes: los fenólicos son tuberculocidas, efectivos en presencia de materia orgánica, y permanecen activos sobre las superficies por un período largo después de la aplicación. Sin embargo, tienen un olor desagradable y pueden causar irritación en la piel. El hexaclorofeno ha sido uno de los antisépticos más populares debido a su persistencia sobre la piel una vez aplicado y porque reduce la cantidad de bacterias en la piel. Sin embargo, puede causar daño cerebral y ahora es utilizado sólo en guarderías de hospitales como respuesta a brotes de estafilococos. Alcoholes. Los alcoholes están entre los desinfectantes y antisépticos más ampliamente usados. Estos compuestos son bactericidas y fungicidas pero no esporocidas; algunos virus que contienen lípidos también son destruidos. Los dos alcoholes germicidas más populares son el etanol y el isopropanol, comúnmente usados a concentración de 70 a 80%. Actúan por desnaturalización de proteínas y posiblemente disolviendo lípidos de membrana. Un empapado durante 10 a 15 minutos con alcohol es suficiente para desinfectar termómetros e instrumentos pequeños. Halógenos. Un halógeno es cualquiera de los cinco elementos (flúor, cloro, bromo, yodo y astato) del grupo VIIA de la tabla periódica. Existen como moléculas biatómicas en estado libre y forman sales con sodio y la mayoría de los otros metales. Los halógenos yodo y cloro son importantes antimicrobianos. El yodo es usado como antiséptico en piel y mata oxidando los constituyentes celulares y yodizando proteínas celulares. A altas concentraciones puede incluso matar algunas esporas. El yodo se aplica a menudo como tintura de yodo, 2% ó más de yodo en una solución de yoduro de potasio en agua-etanol. Aunque es un antiséptico efectivo, la piel puede ser dañada, se mantiene la coloración, y puede ocasionar alergias al yodo. Más recientemente el yodo ha sido acomplejado con un acarreador orgánico para formar un iodóforo. Los iodóforos son solubles en agua, estables, no tiñen y liberan el yodo lentamente para minimizar la irritación en la piel. Los iodóforos son usados

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en hospitales para limpiar la piel antes de las operaciones y en hospitales y laboratorios para desinfectar. El cloro es el desinfectante usual para el abasto de agua municipal y en las albercas y también se emplea en la industria láctea y de alimentos. Puede ser aplicado como gas cloro, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio; todos ellos producen ácido hipocloroso (HCIO) y luego oxígeno atómico. El resultado es la oxidación de materiales celulares y la destrucción de bacterias vegetativas y hongos, aunque no esporas.

( ) ( )OHClHClO

HClOOHCaOHOClCa

HClOHClOHCl

+→+→+

+→+22 222

22

La muerte de casi todos los microorganismos usualmente ocurre dentro de los 30 minutos. Puesto que la materia orgánica interfiere con la acción del cloro al reaccionar con éste y sus productos, se añade un exceso de cloro para asegurar la destrucción microbiana. El cloro es también un excelente desinfectante para uso individual debido a que es efectivo, barato y fácil de emplear. Pequeñas cantidades de agua para beber pueden ser desinfectadas con tabletas de halazono. El halazono (ácido parasulfono dicloroamidobenzóico) libera lentamente el cloro cuando se añade al agua y la desinfecta en cerca de media hora. Metales pesados. Por muchos años los iones de metales pesados tales como el mercurio, la plata, el arsénico, el zinc y el cobre, fueron usados como germicidas. Más recientemente estos elementos han sido reemplazados por otros germicidas menos tóxicos y más efectivos (muchos metales pesados son más bateriostáticos que bactericidas), pero hay algunas excepciones. Una solución al 1% de nitrato de plata es a menudo añadida a los ojos de infantes para prevenir gonorrea oftálmica (en muchos hospitales la eritromicina se utiliza en lugar de nitrato de plata ya que es más efectiva contra Chlamydia y contra Neisseria). En quemaduras de utiliza sulfadiacina de plata. El sulfato de cobre es un algicida efectivo en lagos y albercas. Los metales pesados se combinan con proteínas, a menudo con grupos sulfhidrilo, y las inactivan. También pueden precipitar las proteínas celulares. Compuestos de amonio cuaternario. Los detergentes son moléculas orgánicas que sirven como agentes humectantes y emulsificantes debido a que tienen tanto extremos hidrofílicos polares como hidrofóbicos no polares. Debido a su naturaleza amfipática solubilizan residuos

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insolubles y son muy efectivos como agentes limpiadores. Los detergentes son diferentes de los jabones, los cuales derivan del las grasas. Aunque los detergentes aniónicos tienen algunas propiedades antimicrobianas, sólo los detergentes catiónicos son desinfectantes efectivos. Los más populares de estos desinfectantes son los compuestos de amonio cuaternario, caracterizados por un nitrógeno cuaternario cargado positivamente y una larga cadena alifática hidrofóbica. Estos compuestos rompen las membranas microbianas y pueden también desnaturalizar proteínas. Los detergentes catiónicos matan a la mayoría de las bacterias, pero no a M. tuberculosis ni a endosporas. Tienen la ventaja de ser estables, no tóxicos y suaves, pero son inactivados por el agua dura y el jabón. Los detergentes catiónicos se utilizan a menudo como desinfectantes para utensilios de alimentación, instrumentos pequeños, y como antisépticos en piel. Aldehídos. Los dos aldehídos más comúnmente usados, el formaldehído y el glutaraldehído, son moléculas altamente reactivas que se combinan con las proteínas y las inactivan. Son esporocidas y pueden usarse como esterilizantes químicos. El formaldehído normalmente se disuelve en agua o en alcohol antes de su uso. Una solución amortiguadora al 2% de glutaraldehído es un desinfectante efectivo. Es menos irritante que el formaldehído y es usado para desinfección en hospitales y en equipo de laboratorio. El glutaraldehído generalmente desinfecta objetos en cerca de 10 minutos, pero puede requerir tanto como 12 horas para destruir esporas. Gases esterilizantes.

Muchos artículos sensibles al calor tales como cajas petri desechables de plástico y jeringas, componentes de respiradores artificiales, suturas y catéteres, son esterilizados en la actualidad con el gas óxido de etileno (EtO). Este gas es tanto microbicida como esporocida y mata al combinarse con las proteínas celulares. Es un agente esterilizante particularmente efectivo debido a que penetra rápidamente materiales empacados, incluso envolturas plásticas.

La esterilización de realiza en esterilizadores especiales, que en su

apariencias recuerdan mucho a los autoclaves, que controlan la concentración de EtO, temperatura y humedad. Debido a que el EtO puro es explosivo, usualmente se suministra en una concentración de 10 a 20% mezclado ya sea con CO2 o diclorodifluorometano. La concentración el EtO, la temperatura y la humedad influyen en la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si es tratado por 5 a 8 horas a 380C o por 3 a 4 horas a 540C cuando la humedad relativa es mantenida a 40-50% y la concentración de EtO a 700 mg/L. Es necesaria una aireación extensiva del material esterilizado para eliminar el EtO residual ya que es tóxico.

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La betapropiolactona (BPL) es empleada ocasionalmente como gas esterilizante. En forma líquida se ha utilizado para esterilizar vacunas y suero. La BPL se descompone a una forma inactiva después de varias horas y por lo tanto no es tan difícil de eliminar como el EtO. También destruye a los microorganismos más fácilmente que el óxido de etileno pero no penetra bien los materiales y puede ser carcinogénico. Por estas razones, la BPL no ha sido utilizada tan ampliamente como el EtO.

Recientemente se ha usado peróxido de hidrógeno en fase de vapor para

descontaminar campanas de seguridad biológica.

6.5 Evaluación de le Efectividad de Agentes Antimic robianos.

La evaluación de los agentes antimicrobianos es un proceso complejo regulado, en estado Unidos, por dos agencias diferentes. La Agencia de Protección Ambiental (EPA) regula los desinfectantes, mientras que los agentes usados en humanos y en animales están bajo el control de la Administración de Alimentos y Drogas (FDA). La evaluación de un agente antimicrobiano comienza a menudo con un análisis de búsqueda inicial para ver si es efectivo y a que concentración.

El mejor examen de evaluación de desinfectantes conocido es el examen de

coeficiente fenólico en el cual la potencia de un desinfectante se compara con la del fenol. Una serie de diluciones de fenol y del desinfectante experimental, se inoculan con las bacterias de prueba Salmonella typhi y Staphylococcus aureus, luego son colocados en baño de agua a 20 ó 370C. Estos tubos con desinfectante inoculados son enseguida subcultivados en un medio regular fresco e incubados por dos o más días. La más alta dilución que mate a las bacterias después de 10 minutos de exposición, pero no después de 5, se usan para calcular el coeficiente fenólico. El recíproco de la dilución apropiada del desinfectante es dividido por el del fenol para obtener el coeficiente. Suponga que la dilución del fenol fue 1/90 y la dilución máxima efectiva del desinfectante X fue de 1/450. El coeficiente fenólico de X será 5. A mayor coeficiente fenólico, mayor efectividad del desinfectante bajo esas condiciones. Un valor mayor de 1 significa que el desinfectante es más efectivo que el fenol.

El examen del coeficiente fenólico es un procedimiento adecuado de

evaluación inicial, pero es un error tomarlo como un indicativo directo de la potencia de un desinfectante durante su uso normal. Esto es debido a que el coeficiente fenólico se determina bajo condiciones cuidadosamente controladas con cepas bacterianas puras, mientras que los desinfectantes normalmente son usados sobre poblaciones complejas en presencia de materia orgánica y con variaciones significativas en los factores ambientales tales como pH, temperatura, y presencia de sales.

Para un estimado más realista de la efectividad de un desinfectante, se usan a

menudo otras pruebas. La velocidad a la cual una bacteria seleccionada es destruida con varios agentes químicos puede ser determinada y comparada. Puede realizarse

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un examen de la dilución usada. Cilindros de acero inoxidable son contaminados con especies bacterianas específicas bajo condiciones cuidadosamente controladas. Los cilindros son brevemente secados, sumergidos en el desinfectante por 10 minutos, transferidos a un medio de cultivo e incubados por dos días. Se determina entonces la concentración de desinfectante que mata a los organismos en la muestra con un nivel de 95% de confianza bajo estas condiciones. Los desinfectantes también pueden ser evaluados bajo condiciones diseñadas para simular situaciones de uso normal.

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CAPÍTULO VII. MICROORGANISMOS COMO COMPONENTES DEL MEDIO AMBIENTE .

El medio ambiente es un componente de un ecosistema y se define como el total de las condiciones externas que influyen sobre un organismo o un grupo de organismos. Los ambientes naturales, ya sea suelo, lagos, ríos, océanos u otros hábitats, tienen muchas características en común, incluyendo la presencia de microorganismos. Estos microorganismos pueden tener dos papeles complementarios: la síntesis de nueva materia orgánica a partir de CO2 y otros compuestos orgánicos a través de la producción primaria, y la descomposición de esta materia orgánica acumulada.

7.1 Microorganismos y la estructura de los ambiente s naturales.

Los microorganismos juegan muchos papeles importantes en los ambientes naturales. Las relaciones generales entre los productores primarios que acumulan materia orgánica, los descomponedores heterótrofos y los consumidores, son obvias. Microorganismos de diferentes tipos contribuyen a cada una de estas relaciones complementarias.

En ambientes terrestres los productores primarios son usualmente plantas

vasculares. En ambientes acuáticos y marinos las cianobacterias y las algas juegan un papel similar. La fuente principal de energía que maneja la producción primaria es la luz solar y ambos hábitats. Los consumidores superiores, incluyendo los humanos, son quimioheterótrofos. Estos consumidores dependen de tal sistema básico de soporte de la vida proporcionado por organismos que acumulan y descomponen materia orgánica. El reto es apreciar mejor el papel que desempeñan los microorganismos en el funcionamiento de la gran variedad de ambientes naturales.

Este punto de vista sobre la naturaleza de la producción primaria y el papel de

los microorganismos en este proceso ha cambiado desde 1977 cuando se descubrieron grietas hidrotermales en las profundidades marinas las cuales producían sulfuro de hidrógeno. Estas grietas soportan grandes poblaciones de gusanos con forma de tubo y mejillones gigantes. La fuente de carbono orgánico de la cual dependían estos organismos consumidores resulto ser bacterias quimiolitoautotróficas. Estas bacterias con principalmente de los géneros Thiobacillus, Thiomicrospyra, Thiothrix y Beggiatoa.

Otra cadena alimenticia única involucra a microorganismos fijadores de

metano como el primer paso para proporcionar materia orgánica a los consumidores. En este caso las metilótrofas, bacterias capaces de utilizar metano, ocurren como simbiontes intracelulares de mejillones.

La materia orgánica, una vez disponible, puede ser utilizada por muchos

organismos diferentes, incluyendo al humano. El proceso de descomposición de la

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materia orgánica hacia compuestos inorgánicos más simples se llama mineralización.

Además, microorganismos como protozoarios actúan como consumidores, tal

y como lo hacen los insectos y los animales. Los consumidores microbianos usan materia orgánica producida por plantas superiores, cianobacterias y algas.

Los microorganismos juegan otro papel importante en el funcionamiento de los

ambientes naturales. Las células microbianas, en base a su peso seco, consisten típicamente de aproximadamente 50% carbono, 14% nitrógeno, y 3% fósforo, por nombrar sólo a los elementos principales, y son ricos en nutrientes. Esto los convierte en una fuente de nutrientes muy deseada para otros organismos.

Así, los microorganismos llevan a cabo muchas funciones en los ambientes

naturales, donde puede ocurrir crecimiento. Algunos ejemplos incluyen los siguientes:

1. Descomposición (mineralización) de sustratos orgánicos. 2. Servir como fuente de alimentos rico en nutrientes para otros microorganismos

quimioheterótrofos. Esto resulta en la transformación de materiales orgánicos a formas minerales.

3. Servir como alimento para protozoarios, nemátodos e insectos del suelo, creando así una red alimenticia.

4. Modificar sustancias para su uso por otros organismos. 5. Cambiar la cantidad de materiales en forma soluble y gaseosa. Esto ocurre

directamente por procesos metabólicos o indirectamente modificando el ambiente.

6. Producir compuestos inhibidores que disminuyen la actividad microbiana o limitan la supervivencia y funcionamiento de plantas y animales. Los microorganismos existen en hábitats naturales tanto como poblaciones de

tipos de organismos similares, así como en comunidades formadas de diferentes tipos de poblaciones interactuantes. El ambiente microbiano es complejo y cambia constantemente. Se caracteriza por la presencia de gradientes superpuestos de recursos, materiales tóxicos, y otros factores limitantes. Por ejemplo, se pueden formar gradientes cuando regiones aerobias y anaerobias intersectan o cuando una zona iluminada cambia a una zona oscura, creándose así microambientes únicos. El estudio de los microorganismos y sus relaciones en ambientes particulares de denomina ecología microbiana. Donde las condiciones de un microambiente son adecuadas grupos especializados de microorganismos pueden mantenerse a sí mismos con competencia mínima de otros microorganismos que tienen requerimientos funcionales ligeramente diferentes.

Los gradientes de factores esenciales también influyen en la supervivencia y

funcionamiento de las poblaciones microbianas, una expresión de la Ley de Liebig del mínimo que establece que el crecimiento de un organismo depende de los nutrientes disponibles sólo en cantidades mínimas. Los factores que pueden limitar a

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los microorganismos (y a otros organismos vivos) incluyen agua, energía en forma de luz y compuestos químicos, temperatura, nutrientes, presión, pH, y salinidad. La situación puede ser incluso más compleja que esto. Múltiples factores limitantes pueden influir a poblaciones en particular, y los factores limitantes pueden cambiar en el tiempo y en el espacio. Demasiado de algunos factores (metales, sales, hidrógeno, iones, calor) pueden también limitar la actividad microbiana, una expresión de la Ley de la tolerancia de Shelford, la cual establece que: “la existencia y prosperidad de un organismo depende del carácter completo de un conjunto de condiciones. La ausencia o el mal estado de un organismo podrán ser debidos a la deficiencia o al exceso, cualitativo o cuantitativo, con respecto a uno cualquiera de diversos factores que se acercarán tal vez a los límites de tolerancia del organismo en cuestión”. 7.2 El estado fisiológico de los microorganismos en el medio ambiente.

La mayoría de los microorganismos están confrontados con deficiencias que limitan sus actividades, excepto cuando los nutrientes en exceso permiten crecimiento ilimitado. Tal rapidez de crecimiento agotará rápidamente los nutrientes y resultará posiblemente el la generación de productos tóxicos de desecho, los cuales limitarán aún más el crecimiento.

En respuesta a niveles bajos de nutrientes y a la intensa competencia, muchos

microorganismos se vuelven más competitivos en la toma de nutrientes y en la explotación de los recursos disponibles. A menudo la morfología de los organismos cambiará para incrementar su área superficial y su habilidad para absorber nutrientes. Esto puede involucrar la conversión de bacterias con forma de bacilo a “mini” o “ultramicro” células o cambiar a la morfología de prosteca (una extensión de la célula, incluyendo la membrana plasmática y la pared celular, que es más estrecha que la célula madura) en respuesta a la hambruna. La incrementará la adhesión específica e inespecífica a superficies, creando biopelículas. Estas biopelículas permiten a los microorganismos usar nutrientes que a menudo están presentes a altas concentraciones localizadas sobre las superficies.

Los microorganismos pueden también secuestrar nutrientes limitantes críticos,

tales como el hierro, haciéndolos menos disponibles para los microorganismos competidores. De hecho, muchos microorganismos pueden sobrevivir en estos ambientes pobres en nutrientes y crecer bajo condiciones oligotróficas.

Las sustancias naturales pueden también inhibir directamente el crecimiento

microbiano en ambientes con pocos nutrientes. Estos agentes incluyen fenólicos, taninos, amonio, etileno y compuestos volátiles de azufre. La presencia de tales compuestos puede llevar a un fenómeno generalizado de microbiostasis, o bacteriostasis y fungistasis, que afectan a las bacterias y a los hongos, respectivamente. Esto puede ser una forma por medio de la cual los microorganismos evitan gastar la limitada reserva energética a menos que haya disponibilidad de una fuente adecuada de nutrientes. Tales químicos son también

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importantes en patología de plantas y pueden ayudar en el control de las enfermedades microbianas generadas en el suelo. 7.3 Procesos de reciclamiento de nutrientes.

Las comunidades microbianas juegan un papel principal en los ciclos biogeoquímicos. Tal como lo sugiere este término, procesos tanto biológicos como químicos están involucrados en el reciclamiento y transformación de nutrientes importantes para microorganismos, plantas y animales. Esto involucra a menudo reacciones de oxido-reducción que pueden cambiar las características físicas y químicas de los nutrientes.

Los microorganismos juegan papeles esenciales en la transformación de

carbono, nitrógeno, azufre y hierro. Componentes gaseosos significativos se presentan en los ciclos de carbono y nitrógeno, y de manera menos extendida en los ciclos de azufre y fósforo. Así, un microorganismo del suelo, acuático o marino puede a menudo fijar formas gaseosas de compuestos de carbono y nitrógeno. En los ciclos sedimentarios, tales como el del hierro, no hay componentes gaseosos.

Un importante punto a enfatizar es que estos ciclos no operan

independientemente de otros ciclos, sino que están ligados operando a diferente escala de tiempo y a distancias que van desde lo microbiano a lo global.

Ciclo del Carbono.

El carbono puede estar presente en formas reducidas, tales como metano (CH4) y materia orgánica, y en más formas oxidadas, tales como monóxido de carbono (CO) y bióxido de carbono (CO2). Los reductores (e.g. hidrógeno, el cual es un reductor fuerte) y los oxidantes (e.g. O2) influyen en el curso de las reacciones biológicas y químicas involucradas en el ciclo del carbono. El hidrógeno puede se producido durante la degradación de la materia orgánica, especialmente bajo condiciones anaerobias cuando ocurre fermentación. Si se generan hidrógeno y metano, pueden movilizarse desde regiones anaerobias a regiones aerobias.

Los niveles de metano en la atmósfera se han incrementado

aproximadamente 1% por año, desde 0.7 hasta 1.6 a 1.7 ppm (volumen) en los últimos 300 años. Este metano deriva de una serie de fuentes diversas. Si una columna aerobia de agua está encima de una zona anaerobia donde se localizan las metanogénicas, el metano puede ser oxidado antes de alcanzar la atmósfera. En muchas situaciones, tales como los arrozales, donde no hay una zona aerobia por encima, el metano alcanza directamente la atmósfera, contribuyendo así al incremento global del metano atmosférico. Los rumiantes pueden producir de 200 a 400 litros de metano por día. Otras fuentes son las minas de carbón, las plantas de tratamiento de aguas residuales, los pantanos y las ciénegas. Los microorganismos anaerobios en el intestino de las termitas también pueden contribuir en la producción de metano.

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La fijación del carbono ocurre a través de la actividad de las cianobacterias y las algas verdes, bacterias fotosintéticas, y quimiolitoautótrofos.

Ciclo del Azufre Los microorganismos contribuyen enormemente al ciclo del azufre. Los microorganismos fotosintéticos transforman azufre utilizando sulfuro como fuente de electrones. En ausencia de luz el sulfuro puede cruzar en ambientes oxidantes, permitiendo el funcionamiento de Thiobacillus y géneros quimiolitoautótrofos similares. En contraste, cuando el sulfato se difunde en habitats reducidos, proporciona una oportunidad para diversos grupos de microorganismos que realizan sulfato reducción. Por ejemplo, cuando está presente un reductor orgánico utilizable, Desulfovibrio puede derivar energía utilizando al sulfato como oxidante. Este uso del sulfato como un aceptor de electrones externo para formar sulfuro, el cual se acumula en el ambiente, es un ejemplo de un proceso de reducción desasimilatoria y respiración anaerobia. En comparación, la reducción del sulfato para su uso en la biosíntesis de aminoácidos y proteínas es descrita como un proceso de reducción asimilatoria. Se ha encontrado que otros organismos llevan a cabo reducción desasimilatoria de azufre elemental. Éstos incluyen Desulfuromonas, una arqueobacteria termofílica, y también cianobacterias en sedimentos hipersalinos. El sulfito es otro intermediario crítico que puede ser reducido a sulfuro por una amplia variedad de microorganismos, incluyendo Alteromonas y Clostridium, así como Desulfovibrio y Desulfotomaculum. Cuando las condiciones de pH y oxido-reducción son favorables, también ocurren varias transformaciones clave en el ciclo del azufre como resultado de reacciones químicas en ausencia de microorganismos. Un importante ejemplo de tales procesos abióticos es la oxidación del sulfuro a azufre elemental, Esto tiene lugar rápidamente a pH neutro, con una vida media de aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. Ciclo del Nitrógeno. El ciclo del nitrógeno es más simple que el del carbono o el del nitrógeno, ya que nos hay distinción y usos diferentes por os microorganismos fotosintéticos. A pesar de esta simplificación, deben enfatizarse varios aspectos importantes del ciclo del nitrógeno: los procesos de nitrificación, desnitrificación, y fijación de nitrógeno. La nitrificación es el proceso aerobio de oxidación del ión amonio (NH4

+) a nitrito (NO2

-) y la subsecuente oxidación del nitrito a nitrato (NO3-). Las bacterias de

los géneros Nitrosomonas y Nitrosococcus, por ejemplo, juegan papeles importantes en el primer paso, y Nitrobacter y otras bacterias quimiolitoheterótrofas relacionadas realizan el segundo paso. Además, la nitrificación heterotrófica realizada por bacterias y hongos contribuye significativamente a este proceso en ambientes más ácidos.

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El proceso de desnitrificación requiere un set diferente de condiciones ambientales. Este proceso desasimilatorio, en el cual el nitrato es utilizado como oxidante en la respiración anaerobia, involucra usualmente heterótrofos como Pseudomonas denitrificans. Los productos principales de la desnitrificación incluyen gas nitrógeno (N2) y óxido nitroso (N2O), aunque el nitrito (NO2

-) también suele acumularse. El nitrito es importante desde el punto de vista ambiental debido a que contribuye a la formación de nitrosaminas carcinogénicas. Finalmente, el nitrato puede ser transformado a amonio en la reducción desasimilatoria por una variedad de bacterias que incluyen Geobacter metallireducens, Desulfovibrio spp., y Clostridium. La asimilación del nitrógeno ocurre cuando el nitrógeno inorgánico es usado como nutriente y es incorporado en nueva biomasa microbiana. El ión amonio, debido a su estado reducido, puede ser incorporado directamente sin mayor costo de energía. Sin embargo, cuando el nitrato es asimilado, debe ser reducido con un gasto significativo de energía. En este proceso el nitrito puede acumularse como un intermediario. La fijación del nitrógeno puede ser realizada por bacterias aerobias o anaerobias. Bajo condiciones aerobias un rango amplio de géneros microbianos de vida libre (Azotobacter, Azospirillum) contribuye a este proceso. Bajo condiciones anaerobias los fijadores de vida libre más importantes son los pertenecientes al género Clostridium. La fijación del nitrógeno por cianobacterias tales como Anabaena y Oscillatoria, pueden llevar al enriquecimiento con nitrógeno de aguas dulces y marinas. Además, la fijación del nitrógeno puede ocurrir a través de la actividad de bacterias que desarrollan asociaciones simbióticas con plantas. Estas asociaciones incluyen Rhizobium y Bradyrhizobium con leguminosas, Frankia en asociación con muchos arbustos leñosos, y Anabaena con Azolla, un helecho acuático de importancia en el cultivo de arroz. El proceso de fijación del nitrógeno involucra una secuencia de pasos de reducción con importante gasto energético. El amonio, el producto de la reducción del nitrógeno, es inmediatamente incorporado a materia orgánica como una amina. Los procesos reductores son extremadamente sensibles al O2 y deben ocurrir bajo condiciones anaerobias incluso en organismos aerobios. La protección de las enzimas fijadoras de nitrógeno se logra por medio de una variedad de mecanismos, incluyendo barreras físicas, como ocurre con le heterocistos en algunas cianobacterias, barredoras de moléculas de O2, y tasas altas de actividad metabólica. La fijación de nitrógeno es catalizada por la enzima nitrogenasa, la cual utiliza ferredoxina como fuente inmediata de poder reductor. Otros procesos cíclicos. El ciclo del hierro es especialmente importante en términos del funcionamiento microbiano. Los principales géneros que lleva a cabo la oxidación del hierro, transformándolo en ión ferroso (Fe2+) a ión férrico (Fe3+), son Thiobacillus ferrooxidans bajo condiciones ácidas, Gallionella bajo condiciones de pH neutro, y

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Sulfolobus bajo condiciones ácida, todos en ambientes termofílicos. Mucha de la literatura inicial sugiere que géneros adicionales podrían oxidar el hierro, incluyendo Sphaerotilus y Leptothrix; estos dos géneros son aún llamados “bacterias del hierro” por los no microbiólogos. La confusión sobre el papel de estos géneros proviene de la ocurrencia de oxidación química del ión ferroso a ión férrico (formado precipitados insolubles de hiero) a valores de pH neutros, donde los microorganismos también crecen sobre sustratos orgánicos. Estos microorganismos están actualmente clasificados como quimioheterótrofos. La reducción del hierro ocurre bajo condiciones anaerobias resultando en la acumulación de de ión ferroso. Aunque muchos microorganismos pueden reducir pequeñas cantidades de hierro durante su metabolismo, la mayor parte de la reducción de hierro la realiza microorganismos especializados tales como Geobacter metallireducens y Shewanella putrefaciens, los cuales pueden obtener energía para crecer sobre materia orgánica usando al ión férrico como oxidante. En adición a estas reducciones relativamente simples a ión ferroso, algunas bacterias magnetotácticas tales como Aquaspirillum magnetotacticum transforman hierro extracelular al óxido de hierro magnetita (Fe3O4) y construyen brújulas magnéticas intracelulares. Más aún, las bacterias hierro reductoras desasimilatorias acumulan magnetita como producto extracelular. La magnetita ha sido detectada en sedimentos, donde se encuentra en partículas similares a las detectadas en bacterias, indicando una contribución a largo plazo de las bacterias a los procesos del ciclo del hierro. Se ha sugerido que la reducción del Fe3+ pudo haber sido el primer proceso significativo global para la oxidación de materia orgánica a CO2. La magnetita también es importante en la bioremediación ambiental y particularmente en medicina. Las partículas pueden ser cubiertas con reactivos inmunológicos y con sus propiedades magnéticas pueden recuperarse del torrente sanguíneo simplemente con un magneto. Además, los genes para la síntesis de magnetita han sido clonados en otros microorganismos, creando nuevos microorganismos magnéticamente sensibles. La importancia de los microorganismos en el ciclo del manganeso es fácil de apreciar. El ciclo del manganeso involucra la transformación del ión manganoso (Mn2+) a MnO2 (equivalente al ión mangánico, Mn4+) el cual ocurre en grietas hidrotermales, ciénegas, y como parte importante de rocas resinosas. Leptothrix, Arthrobacter y Metallogenium son importantes en la oxidación del Mn2+. Shewanella, Geobacter y otros quimioorganótrofos puede llevar a cabo procesos complementarios de reducción de manganeso. El ciclo del manganeso está relacionado muy cercanamente con el ciclo del hierro. Los microorganismos también pueden usar una amplia variedad de metales como aceptor de electrones. Metales tales como el europio, telurio, selenio y rodio pueden ser reducidos. Entre los microorganismos importantes que realizan esta actividad se incluyen los fotoorganótrofos Rhodobacter, Rhodopirillum y Rhodopseudomonas. Para selenio son activos, Pseudomonas stutzeri, Thauera

85

selenatis y Wolinella succinogenes. Tales reducciones pueden disminuir la toxicidad de un metal. La transformación microbiana del fósforo involucra primariamente la transformación de fósforo (valencia +5) de ortofosfato simple a diversas formas más complejas, incluyendo polifosfatos encontrados en los gránulos metacromáticos. Un producto único (presumiblemente microbiano) es la fosfina (PH3) con valencia -3, el cual es liberado en los pantanos y que arde cuando entra en contacto con el aire. Esto puede luego prender al metano producido en ese mismo ambiente. 7.4 Interacción en la utilización de recursos.

La sucesión microbiana puede ocurrir cuando la materia orgánica es usada como fuente de nutrientes y energía. Bajo condiciones aerobias los productos oxidados tales como nitrato, sulfato, y bióxido de carbono se producirán por la degradación de materia orgánica compleja. En comparación, bajo condiciones anaerobias se tienden a acumular productos reducidos. El uso de productos de desecho de un grupo de microorganismos por otros organismos es una relación de comensalismo que se ve a menudo en ambientes naturales.

Las interacciones microbianas y la sucesión también ocurren cuando están

disponibles mezclas de aceptores de electrones. Si el O2, nitrato, ión manganeso, ión férrico, sulfato, CO2 o cualquier combinación similar está disponible en un ambiente en particular, tiene lugar una secuencia predecible de uso de oxidantes cuando un sustrato oxidable está disponible. El oxígeno es empleado como primer aceptor de electrones debido a que inhibe el uso de nitrato por parte de microorganismos capaces de respirar con uno u otro. Mientras el O2 esté disponible, los sulfato reductores y los metanógenos estarán inhibidos debido a que estos grupos son anaerobios obligados.

Una vez que el oxígeno y los nitratos se han agotado y los productos de la

fermentación, incluyendo hidrógeno, se han acumulado, comienza la competencia por el uso de otros oxidantes. Las formas oxidadas de manganeso y hierro serán utilizadas primero, seguidas de la competencia entre sulfato reductoras y metanógenas. Esto es influenciado por la mayor cantidad de energía obtenida con el sulfato utilizado como aceptor de electrones. Diferencias en la afinidad enzimática por el hidrógeno, un sustrato importante utilizado por ambos grupos, juegan también un papel crítico. La sulfato reductora Desulfovibrio crece rápidamente y usa el hidrógeno disponible a una tasa mayor que Methanobacterium. Cuando el sulfato es agotado, Desulfovibrio no oxida más hidrógeno, y la concentración de hidrógeno aumenta. Las metanógenas finalmente dominan el hábitat y reducen el CO2 a metano.

Ester orden del uso de oxidantes se repite siempre que el O2, nitrato, Mn4+,

Fe3+, y/o sulfato estén disponibles. En base a estas interacciones, el uso microbiano de los oxidantes disponibles puede ser entendido, predicho, y manejado.

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7.5 Sustratos orgánicos utilizados por los microorg anismos.

En las discusiones anteriores sobre los ciclos de nutrientes no se hizo distinción entre los diferentes tipos de sustratos orgánicos. Esto es simplemente debido a que los sustratos orgánicos difieren en su susceptibilidad a ser degradados.

Los factores que influyen en la degradación incluyen los siguientes: - Composición elemental. - Estructura de unidades básicas repetitivas. - Enlaces entre las unidades repetitivas. - Nutrientes presentes en el ambiente. - Condiciones abióticas (pH, potencial de oxido-reducción, O2, condiciones

osmóticas) - Comunidad microbiana presente.

De los sustratos complejos utilizados por los microorganismos, sólo la biomasa

microbiana previamente producida contiene todos los nutrientes requeridos para el crecimiento microbiano. La quitina, las proteínas, la biomasa microbiana y los ácidos nucleicos contienen nitrógeno en grandes cantidades. El resto de lo sustratos complejos contienen primariamente, o incluso sólo, carbono, hidrógeno y oxígeno. Si los microorganismos están creciendo usando estos sustratos, deben adquirir del ambiente el resto de los nutrientes necesarios para su desarrollo.

Las relaciones de O2 para el uso de estos sustratos son también de interés

debido a que la mayoría de lo sustratos pueden ser fácilmente degradados con o en ausencia de oxígeno. La principal excepción es la lignina.

Los hidrocarburos son únicos en que la degradación microbiana,

especialmente la de aquellos de forma ramificada, involucra la adición inicial de oxígeno molecular. Recientemente se ha observado la degradación anaerobia de hidrocarburos con sulfato o nitrato como oxidante. Con sulfato presente, organismos del género Desulfovibrio están activos. Esto ocurre sólo lentamente y con comunidades microbianas que han sido expuestas a estos compuestos por largos períodos.

La lignina, un componente estructural importante en material vegetal maduro,

es un caso especial en el cual la biodegradabilidad depende de la disponibilidad de oxígeno. A menudo no hay degradación significativa debido a que la mayoría de los hongos filamentosos que degradan lignina nativa in situ sólo funcionan en presencia de oxígeno. La falta de biodegradabilidad de lignina bajo condiciones anaerobias resulta en la acumulación de materiales lignificados.

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VIII. HONGOS. GENERALIDADES.

A diferencia de los protozoarios, los hongos poseen pared celular y esporas de diversos tipos y forman un grupo coherente filogenéticamente hablando (Tabla 10.1). Se reconocen tres grandes grupos: mohos u hongos filamentosos, levaduras y setas. Los hábitat de los hongos son bastante diversos. Algunos son acuáticos, principalmente de agua dulce, aunque existen también algunos de medios marinos. La mayoría de ellos son de medios terrestres, crecen en suelos o sobre materia orgánica en descomposición y contribuyen notablemente a la mineralización del carbono orgánico. Un gran número de hongos es parásito de plantas terrestres. De hecho, los hongos causan pérdidas económicas muy notables en la producción hortofrutícola. Algunos hongos son parásitos de animales, incluido en hombre, aunque, en general, desde este punto de vista, son mucho menos importantes que las bacterias y los virus. Tabla 8.1 Clasificación y principales propiedades d e los hongos a.

Grupo Nombre común

Hifas Representantes típicos

Tipos de esporas sexuales

Hábitat Enfermedades

Ascomicetos

Hongos

Septadas

Neurospora, Saccharomyces, Morchela

Ascospora

Suelo, materia vegetal en descomposición

Tizón del castaño, ergot, podedumbre.

Basidiomicetos

Setas

Septadas

Amanita (venenosa), Agaricus (comestible)

Basidiospora

Suelo, materia vegetal en descomposición

Tallo negro en trigo, maíz, etc.

Zigomicetos

Hongos del pan

Cenocíticas

Mucor, Rhizopus (deterioro de alimentos)

Zigospora

Suelo, materia vegetal en descomposición

Deterioro de alimentos, rara vez implicados en enfermedades parasitarias.

Oomicetos Hongos acuáticos

Cenocíticas

Allomyces Oospora Acuáticos Ciertas enfermedades de los peces

Deuteromicetos

Hongos

imperfectos

Septadas

Penicillium, Aspergillus, Candida

Ninguna Suelo, material vegetal en descomposición, piel de animales

Incluyen parásitos de plantas y animales (pie de atleta, dermatomicosis, infecciones sistémicas).

a Con excepción de los oomicetos, que son filogenéticamente distintos, los otros grupos de hongos están muy relacionados entre si.

Las paredes fúngicas se parecen a las de las plantas, pero sólo desde el punto de vista de su arquitectura y no desde la composición química. Aunque la celulosa está presente en ciertos hongos, muchos de ellos poseen paredes no

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celulósicas. La quitina, un polímero de N-acetil-D-glucosamina es un constituyente común de las paredes celulares fúngicas. Se dispone en grupos de microfibrillas como la celulosa y en algunas especies existen otros polímeros como mananos, galactanos o quitosán. En un 80-90%, las paredes celulares fúngicas están compuestas de polisacáridos, mientras que los lípidos, polifosfatos e iones inorgánicos forman una matriz cementante. El conocimiento de la pared celular fúngica es muy importante por la aplicación biotecnológica de estos microorganismos y, además, porque su naturaleza química se ha usado en la clasificación de los hongos. Los hongos son típicamente quimioorganotrofos y tienen pocos requerimientos nutricionales. Muchas especies pueden crecer en ambientes extremos con pHs bajos o altas temperaturas de hasta 620C y esto, junto con la ubicuidad de las esporas fúngicas, hacen que sean los contaminantes más frecuentes de alimentos, medios de cultivo microbianos, etc. Sin embargo, los mohos y las levaduras no son clasificados sobre bases fisiológicas, sino por sus diferentes ciclos celulares que incluyen la formación de una gran diversidad de esporas. 8.1 Hongos Filamentosos. Mohos.

Los mohos son hongos filamentosos. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se ven frecuentemente sobre pan viejo, queso o frutas. Cada filamento crece fundamentalmente en el extremo por un mecanismo de extensión celular. Cada filamento se denomina hifa. Las hifas crecen en masa en lo que se denomina micelio, que puede verse fácilmente sin ayuda del microscopio. En la mayoría de los casos, las hifas fúngicas contienen más de un núcleo, a veces cientos de núcleos. Por tanto, una hifa es como un tubo nucleado con citoplasma (referida como cenocítica).

A partir del micelio, otras hifas buscan la superficie donde forma esporas o conidios. Los conidios son esporas asexuales (su formación no implica la fusión de gametos), a menudo muy pigmentadas y resistentes a la desecación, que sirven como forma de dispersión del hongo en nuevos hábitat. Cuando se forman los conidios, cambia el color blanco del micelio adquiriendo el de éstos que puede ser negro, rojo, azul-verdoso, amarillo o marrón. La presencia de esas esporas da a la masa micelial la apariencia de ser una capa de polvo.

Algunos mohos también producen esporas sexuales, formadas como resultado de una reproducción sexual. Esta se produce por fusión de gametos unicelulares o de hifas especializadas llamadas gametangios. Alternativamente, las esporas sexuales se pueden originar de la fusión de dos células haploides que sufren meiosis y mitosis para dar esporas individuales. Dependiendo a qué grupo pertenezca el hongo en cuestión se pueden formar diversos tipos de esporas sexuales. Cuando se forman dentro de un saco o asca se denominan ascosporas y si se forman en los extremos de estructuras en forma de porra se denominan basidiosporas. Las zigosporas producidas por los zigomicetos como es Rhizopus son estructuras macroscópicamente visibles. Eventualmente, la zigospora madura y

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produce esporas asexuales que son dispersadas en el aire y germinan para dar un nuevo hongo.

Las esporas sexuales de los hongos son generalmente resistentes a la

desecación, congelación y a algunos compuestos químicos. No son tan resistentes como las endosporas bacterianas. Tanto una espora sexual como asexual puede germinar para originar un nuevo micelio.

Una actividad ecológica muy significativa de los hongos es la descomposición de la madera, papel, tela y otros productos derivados de fuentes naturales, utilizando estos productos como fuentes de carbono y de energía. La lignina es un polímero complejo en el que las unidades son compuestos fenólicos. Es una parte muy importante de las plantas leñosas y junto con la celulosa proporciona rigidez a la planta. La descomposición de la lignina en la naturaleza se produce casi exclusivamente a través de la acción de ciertos basidiomicetos que producen «la podredumbre de la madera». Se conocen dos tipos: podredumbre marrón en la que se degrada la celulosa, pero no la lignina y podredumbre blanca en la que se descomponen ambos polímeros. Los hongos que producen esta última forma de podredumbre son muy importantes, ya que están activamente implicados en la descomposición del material leñoso de los bosques. 8.2 Hongos Unicelulares. Las Levaduras.

Las levaduras son hongos unicelulares, la mayoría perteneciente a los Ascomicetos. Normalmente son ovales, esféricas o casi cilíndricas y la división es, casi siempre, asimétrica o por gemación. En este proceso, la nueva célula forma como un pequeño bulto en la célula madre que crece hasta separarse de ella. Aunque la mayoría de las levaduras se reproducen como células aisladas, bajo ciertas condiciones pueden filamentar. Por ejemplo, la fase filamentosa es esencial para la patogenicidad de Candida albicans, una levadura que puede causar infecciones bucales, vaginales o de pulmones, e incluso, en enfermos de SIDA, daño sistémico tisular.

Las células de levaduras son mucho más grandes que las bacterias y pueden distinguirse de ellas no solamente por su tamaño sino también por poseer sistemas membranosos intracitoplasmáticos así como núcleo. Algunas levaduras poseen reproducción sexual por conjugación en la que se fusionan dos células. La célula resultante es un zigoto verdadero y de él emergen esporas sexuales por reducción meiótica.

Las levaduras prosperan típicamente en hábitat con azúcares, tales como

frutos, flores y cortezas de los árboles. Un buen número vive simbionte con animales, especialmente insectos y algunas son patógenas para animales, incluido el hombre. La levadura más conocida es Saccharomyces cerevisiae. El hábitat original de estas levaduras son indudablemente las frutas y zumos de frutas, pero las levaduras comerciales de hoy en día son muy diferentes de su ancestro silvestre, ya que ha

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sido manipulada por el hombre voluntaria o involuntariamente durante los últimos 7000 años. Fue el primer eucariota cuyo genoma se secuenció por vez primera. 8.3 Hongos mucosos.

Los hongos mucosos son microorganismos eucarioticos que poseen similitudes fenotípicas con hongos y protozoos. Como los primeros, pueden producir esporas y como los protozoos pueden moverse por superficies con un movimiento flexible a modo de amebas. Desde una perspectiva filogenética, los hongos mucosos son más antiguos que hongos y protozoos tales como los ciliados, pero más derivados que los flagelados.

Los hongos mucosos pueden dividirse en dos grupos: los celulares (semejantes a amebas) y los acelulares, que son masas amorfas de protoplasma que llamamos plasmodios. Algunos hongos mucosos viven principalmente en material vegetal en descomposición, tales como restos de hojas, troncos, etc. Su alimento suele ser otros microorganismos, especialmente bacterias que ingieren por fagocitosis. Pueden mantenerse durante mucho tiempo en fase vegetativa o, por diversas razones, desarrollar esporas que al germinar regeneran el estado ameboideo.

Hongos mucosos acelulares.

En la fase vegetativa, hongos mucosos acelulares tales como Physarum existen como una masa protoplásmica de tamaño indefinido. Esta forma o plasmodio es móvil por movimiento ameboideo englobando por fagocitosis las partículas de alimento a medida que se mueve. Este peculiar movimiento es el resultado de las corrientes citoplasmáticas que empujan contra un extremo del plasmodio que es menos viscoso y, lógicamente, la corriente sigue el camino de mínima resistencia. Estas corrientes, como en el resto de los microorganismos eucarióticos que las poseen, están facilitadas por microfilamentos que forman una delgada capa debajo de la membrana citoplasmática. En hongos mucosos acelulares, las corrientes citoplasmáticas forman unas bandas bien definidas y cada una rodeada de una delgada membrana citoplasmática. Las corrientes en sí mismas son unos mecanismos de distribución celular de los metabolitos.

El plasmodio de hongos mucosos es diploide. A partir de esta masa protoplásmica, se produce un esporangio y esporas haploides. Bajo condiciones favorables las esporas germinan y producen una forma natatoria. La fusión de dos de estas formas regenera al plasmodio diploide.

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Hongos mucosos celulares.

Dictyostelium discoideum es un hongo mucoso celular que tiene un ciclo de vida muy característico en el que Ias células vegetativas se agregan, migran como una masa y eventualmente producen cuerpos fructíferos en los que las células se diferencian y forman esporas. A medida que sus células entran en fase de deprivación, se agregan para formar un seudo plasmodio, una estructura en la que las células pierden su individualidad pero no se fusionan. Esta agregación se inicia por la producción de adenosinmonofosfato cíclico (cAMP) y una glicoproteína; ambos funcionan como agentes quimiotácticos. Aquellas células que son las primeras en producir estos compuestos, sirven como centros de atención de otras formas vegetativas lo que conduce a la formación de una masa que se mueve coordinadamente.

A partir de esta masa, emerge un cuerpo fructífero cuando cesa el movimiento

de la misma y se pone en posición vertical. El cuerpo fructífero consta de dos partes: un pedúnculo y una cabeza. Las células en la parte delantera de la masa se diferencian en pedúnculo las de la parte trasera en esporas. Las células que se diferencian en pedúnculo comienzan a producir celulosa, que da rigidez al sistema. En la maduración de la cabeza, las esporas se liberan y se dispersan. Cada espora germina y regenera una ameba.

El ciclo del cuerpo fructificante y formación de esporas de Dictyostelium es un

proceso asexual. Sin embargo, se pueden producir también esporas sexuales o macrocistos. Los macrocistos se forman de agregados de amebas que quedan encerrados en una pared celulósica. Siguiendo la conjugación de dos amebas, se desarrolla una más grande que procede a fagocitar al resto de las amebas. En este punto, se forma una gruesa pared celulósica alrededor de la ameba gigante originando así el macrocisto que puede permanecer durmiente durante largos periodos de tiempo. Eventualmente, el núcleo diploide sufre meiosis para formar núcleos haploides, que se integran en las nuevas amebas que, una vez más, inician el crecimiento vegetativo.

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IX. PROTOZOARIOS. GENERALIDADES Los protozoarios o protozoos son microorganismos eucariotas unicelulares que

carecen de pared celular. En general no poseen color y son móviles. Los protozoos se distinguen fácilmente de los procariotas porque son inconfundiblemente más grandes; de las algas porque carecen de clorofila; de los hongos y levaduras por su movilidad y ausencia de pared celular y de los hongos mucosos por su incapacidad para originar cuerpos fructíferos. Además, los protozoarios son filogenéticamente diversos, apareciendo en varios linajes en el árbol de Eukarya. Los protozoos se encuentran tanto en hábitat de aguas dulces como marinas; un gran número de ellos son parásitos del hombre y animales y otros son saprofitos en otros hábitats como suelo, el aire o la superficie de los árboles.

La mayoría de los protozoos se alimentan por fagocitosis, proceso por el que una partícula de alimento es rodeada por una porción de su membrana celular flexible, introduciéndola en la célula. Algunos protozoos pueden “tragar” literalmente bacterias o células eucarióticas pequeñas a través de una estructura especial, más o menos desarrollada, que funciona a modo de boca y que se conoce como citostoma.

Como es lógico, y por ser organismos que podríamos considerar como

“cazadores”, los protozoos son móviles. De hecho, el tipo de movilidad es una de las características que se emplean para dividirlos en grupos taxonómicos (Tabla 11.1). Los protozoos que se mueven por movimientos ameboides se llaman Sarcodina; los que utilizan flagelos, Mastigophora y los que utilizan cilios, Ciliophora. Existe un cuarto grupo Apicomplexa, generalmente inmóviles, que son parásitos de animales superiores. Tabla 9.1 Características de los principales grupos de protozoarios.

Grupo Nombre común Representantes típicos

Hábitat Enfermedades

Mastigophora Flagelados Trypanosoma, Giardia, Leishmania, Trichomonas

Agua dulce; parásitos de animales.

Enfermedad del sueño; giardiasis; leismaniasis.

Euglenoidesa Flagelados fototrópicos

Euglena Agua dulce, algunos marinos.

Ninguna conocida.

Sarcodina Amebas Amoeba, Entamoeba

Aguas dulces y saladas; parásitos de animales.

Disentería amebiana (amebiasis)

Ciliophora Ciliados Balantidium, Paramecium

Agua dulce y marina; parásitos de animales; rumen.

Disentería

Apicomplexa Esporozoos Plasmodium, Toxoplasma

Parásitos de animales: insectos (vectores).

Malaria; toxoplasmosis.

a Este grupo es considerado también como algas.

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9.1 Mastighopora: los Flagelados.

Los miembros de este grupo de protozoos son móviles por la acción de flagelos. Aunque muchos protozoos flagelados son de vida libre, un buen número de ellos son parásitos de animales, incluido el hombre. El más importante de ellos es Trypanosoma. Estos organismos causan una serie de enfermedades graves en el hombre, como la enfermedad del sueño. En Trypanosoma, género que infecta a humanos, el protozoo es bastante pequeño, aproximadamente de 20 µ de longitud, son organismos delgados con forma curvada. El flagelo se origina en un cuerpo basal y se repliega lateralmente a través de la célula quedando rodeado por una ondulación de la membrana de la superficie. Tanto el flagelo como la membrana están implicados en el movimiento a través de sustancias viscosas, como es el caso de la sangre. Trypanosoma gambiense es la especie que produce la enfermedad del sueño africana, una enfermedad crónica y generalmente mortal. En el hombre, el parásito vive y se multiplica inicialmente en el torrente sanguíneo, invade el sistema nervioso central, causando una inflamación del cerebro y de la espina dorsal responsable de los síntomas neurológicos característicos de la enfermedad. El parásito se transmite por la mosca tse-tse Glossina que, al contrario que el resto de las moscas, se alimenta chupando la sangre de los animales de sangre caliente y vive en ciertas partes de África. El parásito prolifera en el tracto intestinal de la mosca e invade sus glándulas salivares, desde donde se transmite por picadura al hospedador humano.

Los flagelados fototróficos son los euglenoides, flagelados que contienen clorofila que permite el crecimiento fotosintético. Sin embargo, en la oscuridad Euglena puede sobrevivir y crecer como un quimioorganotrofo y, como tal, es indistinguible de los protozoos. Se conocen muchos euglenoides y son exclusivamente acuáticos; por lo general, se encuentran en aguas dulces siendo saprofitas. A diferencia de otros protozoos flagelados, los euglenoides no son patógenos. 9.2 Sarcodina: las Amebas.

Dentro de las sarcodinas se encuentran organismos como Amoeba, que en fase vegetativa se encuentran siempre desnudos; y los foraminíferos, amebas que secretan una especie de concha durante el crecimiento vegetativo. Se conocen un buen número de amebas «desnudas» parásitas de humanos y otros vertebrados, cuyo hábitat es la cavidad bucal y el tracto intestinal. En estos hábitats, se mueven por movimiento ameboide, un mecanismo que también emplean los hongos mucosos. Entamoeba histolytica es un buen ejemplo de amebas parásitas. En muchos casos la infección es asintomática, pero en algunos individuos produce ulceraciones en el tracto intestinal, que produce un estado diarreico denominado disentería amebiana (amebiasis). El organismo se transmite de persona a persona como cistos cuando hay contaminación fecal de las aguas o los alimentos.

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Las sarcodinas con concha presentan una interesante variedad de formas. Las mejor estudiadas son los foraminíferos. Los foraminíferos son organismos exclusivamente marinos, que viven en zonas próximas a las costas. Las conchas, llamadas testas, de las diferentes especies tienen diversas características y a menudo están decoradas (ornamentadas). Las testas están hechas de carbonato cálcico y las células no se anclan firmemente a ellas, de modo que la célula puede extenderse cuando se alimenta.

Debido al peso de la concha, los foraminíferos se hunden hasta el fondo y se piensa que estos organismos se alimentan de depósitos particulados en los sedimentos, principalmente bacterias y detritus. Las conchas son bastante resistentes y, por ello, se fosilizan rápidamente (los acantilados de Dover, Inglaterra, son en gran medida conchas de foraminíferos). Debido a que dejan un excelente registro fósil, se tiene una mejor idea de su distribución a través de las edades geológicas que a partir de cualquier otro protozoo.

9.3 Ciliophora: los Ciliados.

Los ciliados son aquellos protozoos que al menos en alguna fase de su vida, poseen cilios. Son únicos entre los protozoos y poseen dos clases de núcleo: el micronúcleo que está implicado en la herencia y en la reproducción sexual y el macronúcleo que está implicado en la formación de diversos mRNAs de crecimiento y otras funciones celulares.

Probablemente, el ciliado mejor estudiado es Paramecium, que será utilizado

aquí como ejemplo grupo. La mayor parte de los ciliados obtienen su alimento ingiriendo partículas a través de una especie de boca hasta una zona ciliada que es como un esófago. Al llegar al citoplasma, la partícula es englobada en una vacuola digestiva en la que se vierten las enzimas digestivas. Además de cilios, muchos ciliados poseen tricocistos que son filamentos largos, de naturaleza contráctil anclados debajo de la capa más externa de la célula. Estas estructuras permiten a los protozoos asirse literalmente a sustratos sólidos y también sirven para dar señales de peligro cuando están siendo atacados por otros predadores. En el caso de Didinium, los tricocistos paralizan la presa como preludio a la ingestión.

Muchas especies de Paramecium (así como muchos otros protozoos) sirven

de eficientes hospedadores para bacterias endosimbiontes que viven en su citoplasma o, incluso, dentro del macronúcleo. Existen evidencias de que en muchos casos juegan un importante papel en la nutrición del protozoo, sintetizando vitaminas u otros factores nutricionales, que de lo contrario tendrían que ser obtenidos del medio exterior. En el caso de los protozoos del tracto intestinal de las termitas, poseen un endosimbionte metanogénico que elimina el hidrógeno producido por la oxidación del piruvato en el hidrogenosoma; el metano producido es liberado a la atmósfera.

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Aunque algunos ciliados son parásitos, no es ésta una forma de vida habitual en el grupo. La especie Balantidium coli es primariamente una especie parásita de animales domésticos, pero ocasionalmente infecta el intestino de humanos dando lugar a cuadros disentéricos que pueden confundirse con Entamoeba histolytica. Además, existe una fauna característica de ciliados anaerobios obligados en el rumen; estos protozoos juegan un papel beneficioso en los procesos digestivos y fermentativos que ocurren allí. 9.4 Sporozoa (Apicomplejos).

Los apicomplejos o esporozoos es un gran grupo de protozoos que son parásitos obligados. Se caracterizan por ser inmóviles en estado adulto y porque los alimentos los toman disueltos en fase acuosa a través de las envolturas celulares como ocurre en los procariotas y hongos. Aunque el nombre esporozoos implica la formación de esporas, estos organismos no las forman; no al menos en el sentido en que se entiende este tipo de formaciones para procariotas u hongos, en su lugar originan formaciones semejantes que se llaman esporozoitos, que están implicados en la transmisión a un nuevo hospedador. Tanto animales vertebrados como invertebrados pueden ser hospedadores de los esporozoos e incluso en algún caso pueden tener lugar fases alternas. Los miembros más importantes de esporozoos son los coccidios, normalmente parásitos de pájaros y los plasmodios (parásitos de la malaria) que infectan pájaros y mamíferos incluyendo el hombre.

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X. VIRUS. INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES.

Los virus son elementos genéticos que pueden replicarse independientemente de los cromosomas de una célula pero no independientemente de dicha células. A fin de multiplicarse, los virus deben entrar en una célula en la cual puedan replicarse. Dicha célula se denomina hospedadora. Los virus se caracterizan también por tener una forma infecciosa madura que es típicamente extracelular.

Los virus, al igual que los plásmidos y otros elementos genéticos, se aprovechan de la maquinaria metabólica codificada por los cromosomas de la célula hospedadora. Como otros elementos, los virus pueden conferir importantes propiedades a la célula hospedadora. Estas propiedades serán heredadas cuando la célula se divida, si las dos células hijas heredan el genoma vírico. Estos cambios frecuentemente no son dañinos, e incluso pueden ser beneficiosos. Sin embargo, los virus a diferencia de los otros elementos genéticos como los plásmidos, tienen una forma extracelular que los capacita para ser fácilmente transmitidos de un hospedador a otro. Esta forma extracelular ha capacitado a los virus a replicarse dentro de un hospedador de una manera dañina para la célula hospedadora. Esta replicación destructiva es la causa de que algunos virus sean agentes de enfermedades. En muchos casos, el que un virus cause enfermedad o cambio hereditario depende de la célula hospedadora y de las condiciones ambientales. Debido a que los virus tienen una fase independiente de las células, algunas personas los denominan «organismos vivos» o «formas de vida». Sin embargo algunas de las propiedades que caracterizan a los sistemas vivientes no se dan en la forma extracelular de los virus. Sin células en las que replicarse, los virus no podrían existir.

Los virus están entre los más numerosos “microorganismos” de nuestro planeta e

infectan todos los tipos de organismos celulares. Por tanto, son interesantes por si mismos. Sin embargo, los científicos han estudiado y siguen estudiando los virus por lo que pueden enseñarnos sobre la genética y bioquímica del metabolismo celular en el caso de algunos virus, sobre el desarrollo de las enfermedades. Además, los virus son también importantes herramientas para la genética microbiana y la ingeniería genética. 10.1 Propiedades Generales de los Virus.

Describiremos aquí los estados intra y extracelular de los virus. En el estado extracelular, un virus es una partícula minúscula que contiene ácido nucleico rodeado por proteína y que, dependiendo del virus específico, ocasionalmente contiene otros componentes macromoleculares. En este estado extracelular, la partícula vírica, también llamada virión, es metabólicamente inerte y carece de funciones respiratorias y biosintéticas. El virión es la estructura mediante la cual el genoma del virus se transporta desde la célula en la que se ha producido a otra célula en la que el ácido nucleico vírico puede ser introducido. Una vez dentro de la nueva célula, se

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inicia el estado intracelular. Durante este estado tiene lugar la replicación del virus: se producen nuevas copias del genoma vírico, y se sintetizan los componentes de la cubierta del virus. Cuando un genoma vírico se introduce y se reproduce en una célula hospedadora, el proceso se denomina infección. La célula que puede ser infectada por un virus que, además, se reproduce en ella, se denomina hospedador. Los genomas virales son muy limitados en tamaño y codifican primariamente las funciones que no pueden adaptar de sus hospedadores. Por tanto, durante la replicación dentro de una célula, los virus dependen de manera determinante de los componentes estructurales y metabólicos de las células hospedadoras. El virus reconduce las funciones metabólicas la maquinaria del hospedador al servicio de su propia replicación y al ensamblaje de los nuevos viriones. (Por tanto, para la mayoría de los virus pueden encontrarse viriones dentro de la célula al final de la infección). 10.2 Genomas Víricos.

Como es bien sabido, todas las células tienen ácido desoxirribonucleico de doble cadena (DNA) como material genético. Por el contrario, los virus contienen o bien DNA o ácido ribonucleico (RNA) como material genético, y en ambos casos puede ser de cadena sencilla o doble. Los virus se dividen a veces en dos tipos, según contengan DNA o RNA como material genético, y todos los virus contienen uno u otro en el virión. Sin embargo, existe un tercer tipo de virus que usan ambos, DNA y RNA, como material genético, pero en distintos estadios de su ciclo reproductivo. El último grupo incluye los retrovirus, que contienen un genoma de RNA en el virión pero se replican a través de un intermediario de DNA, y el virus de la hepatitis B, que contiene DNA en el virión pero tiene RNA como intermediario de replicación. Estas clases pueden ser subdivididas sobre la base de si el ácido nucleico del virión es de cadena sencilla o doble. La clasificación de los virus basada en el tipo de ácido nucleico en los viriones y las estrategias de replicación asociadas a los mismos ha sido formalizada como el Sistema de Clasificación de Baltimore.

A pesar de la diversidad en la estructura del genoma, los virus obedecen al

dogma central de la biología molecular: toda la información genética fluye desde el ácido nucleico a la proteína. Además, todos los virus usan la maquinaria traduccional de la célula; y así, con independencia de la estructura del genoma vírico, debe generarse RNA mensajero (mRNA) que pueda ser traducido en los ribosomas del hospedador.

10.3 Hospedadores de Virus y Taxonomía.

Los virus pueden clasificarse también en función de los hospedadores que pueden infectar. Así, tenemos virus de animales, virus de plantas y virus bacterianos. Los virus de bacterias, a veces llamados bacteriófagos (o, abreviadamente, fago, del griego phagein que significa «comer»), han sido estudiados primariamente como sistemas modelo convenientes de investigación en biología molecular y genética de la reproducción vírica.

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Muchos de los conceptos básicos de virología se generaron trabajando con virus bacterianos y se aplicaron posteriormente a virus de organismos superiores. Dada su frecuente importancia médica, los virus de animales también llamados virus animales han sido estudiados extensamente. Los dos grupos de virus animales más estudiados son los que infectan insectos y los que infectan animales de sangre caliente. Los virus de plantas o virus vegetales son importantes en agricultura y han sido menos estudiados que los virus de animales.

Finalmente, existe un sistema formal de taxonomía vírica que organiza los virus en niveles taxonómicos jerárquicos: orden, familia (y subfamilia), genero y especie. Aunque, a veces, este sistema taxonómico formal puede parecer bastante arbitrario (y a pesar de que los nombres comunes están todavía en uso), su utilidad aumenta continuamente debido al incremento de los datos filogenéticos que se van acumulando. El taxón familia parece particularmente útil. Los miembros de una familia de virus poseen morfología (del virión), estructura del genoma y/o estrategias de replicación distintivas. Las familias de virus tienen nombres que incluyen el sufijo -‘iridae’ (como en Poxviridae).

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