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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE MEDICINA COMISION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO CURSO DE ESPECIALIZACION EN CIRUGIA PLASTICA Y RECONSTRUCTIVA HOSPITAL CARLOS J BELLO - CRUZ ROJA VENEZOLANA CÉLULAS MESENQUIMALES DE GELATINA DE WHARTON Y CÉLULAS EPIDÉRMICAS: CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN SOBRE MATRICES DE QUITOSANO. Trabajo Especial de Grado que se presentara para optar al título de Especialista en Cirugía Plástica y Reconstructiva Nohelia Nouhad Abou Kheir Caballero Joelys Enrique Bracho Rondón Caracas, enero 2015
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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE MEDICINA
COMISION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
CURSO DE ESPECIALIZACION EN CIRUGIA PLASTICA Y RECONSTRUCTIVA
HOSPITAL CARLOS J BELLO - CRUZ ROJA VENEZOLANA
CÉLULAS MESENQUIMALES DE GELATINA DE WHARTON Y CÉLULAS
EPIDÉRMICAS: CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN SOBRE MATRICES DE
QUITOSANO.
Trabajo Especial de Grado que se presentara para optar al título de
Especialista en Cirugía Plástica y Reconstructiva
Nohelia Nouhad Abou Kheir Caballero
Joelys Enrique Bracho Rondón
Caracas, enero 2015
UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE MEDICINA
COMISION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
CURSO DE ESPECIALIZACION EN CIRUGIA PLASTICA Y RECONSTRUCTIVA
HOSPITAL CARLOS J BELLO - CRUZ ROJA VENEZOLANA
CÉLULAS MESENQUIMALES DE GELATINA DE WHARTON Y CÉLULAS
EPIDÉRMICAS: CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN SOBRE MATRICES DE
QUITOSANO.
Trabajo Especial de Grado que se presentara para optar al título de
Especialista en Cirugía Plástica y Reconstructiva
Nohelia Nouhad Abou Kheir Caballero
Joelys Enrique Bracho Rondón
Tutor: Carmen Urdaneta Troconis.
Caracas, enero 2015
____________________________________________
DRA. CARMEN URDANETA TROCONIS
TUTOR DEL PROYECTO
ADJUNTO DOCENTE DEL POST GRADO DE CIRUGIA PLASTICA Y
RECONSTRUCTIVA
HOSPITAL “CARLOS J BELLO”, CRUZ ROJA VENEZOLANA
____________________________________________
DR. MARCOS OZIEL DIRECTOR DEL CURSO DE POSTGRADO DE CIRUGÍA PLÁSTICA Y
RECONSTRUCTIVA
HOSPITAL “CARLOS J BELLO”, CRUZ ROJA VENEZOLANA
______________________________________________
DRA. CARMEN URDANETA TROCONIS
COORDINADOR DEL CURSO DE POST GRADO DE CIRUGIA PLASTICA Y
RECONSTRUCTIVA
HOSPITAL “CARLOS J BELLO”, CRUZ ROJA VENEZOLANA
____________________________________________
DRA. KAREM NORIS-SUAREZ. ASESORA DEL PROYECTO
PROFESORA CATEGORIA ASOCIADO
LABORATORIO DE INGENIERIA DE TEJIDOS
DPTO. BIOLOGIA CELULAR. UNIVERSIDAD SIMÓN BOLIVAR
____________________________________________
LIC. DOUGLAS ANGULO ASESOR ESTADISTICO
ÍNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN…………………………………………………………………………………… 3
INTRODUCCIÓN……………………………….………………………….……………….. 6
MÉTODOS……………………………….………………………..…….………………….. 26
RESULTADOS……………………………….…………………………..……………..….. 30
DISCUSIÓN……………………………….……………………………..……...………….. 32
REFERENCIAS……………………………….………………………….….…..…………. 36
ANEXOS……………………………….……………………………..…………………….. 40
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CÉLULAS MESENQUIMALES DE GELATINA DE WHARTON Y CÉLULAS
EPIDÉRMICAS: CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN SOBRE MATRICES DE
QUITOSANO.
Nohelia Nouhad Abou Kheir Caballero, C.I. 15.300.122. Sexo: Femenino. E-mail:
[email protected], Telf.: 0212 5763378 / 04144287244. Dirección: Avenida Principal
Prados del Este Caracas. Curso de Especialización en Cirugía Plástica y Reconstructiva.
Joelys Enrique Bracho Rondón, C.I. 13.131.480. Sexo: Masculino. E-mail:
[email protected], Telf.: 0212 5763378 / 04265125566. Dirección: Avenida
Washington El Paraíso Caracas. Curso de Especialización en Cirugía Plástica y
Reconstructiva.
Tutor: Carmen Urdaneta Toconis. C.I. 2.001.174. Sexo: Femenino. Email:
[email protected], Telf.: 02125763378/ 04128060608 Dirección: Urbanización la
Florida Caracas. Especialista en Cirugía Plástica y Reconstructiva.
Asesor: Karem Noris Suárez. C.I.7.955.648. Sexo: Femenino, E-mail:
[email protected]. Tlfs.: 0412-9944352 / 0212-9063111 / 0212-9064218. Dirección:
Laboratorio de Ingeniería de Tejidos. Dpto. Biología Celular. Universidad Simón Bolívar.
Biólogo.
RESUMEN: Existe enorme demanda mundial de desarrollar sustitutos biológicos que
restauren, mantengan y mejoren la función tisular basándose en el uso combinado de:
biomateriales, células y andamios para reparar tejidos lesionados o enfermos. Objetivo:
Cultivar y caracterizar las células epidérmicas y mesenquimales de gelatina de Wharton sobre
matrices de quitosano. Método: Procesamiento de gelatina de Wharton: Los cordones
umbilicales fueron obtenidos de gestantes a término que firmaron el consentimiento
informado. Después de cada nacimiento se secciono 5 a 10 cm de cordón umbilical, las
muestras se colectaron en quirófano, conservadas en medio de transporte y llevadas al
Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos de la Universidad Simón Bolívar. El tejido se cortó en
pequeños fragmentos y se colocó en placas de cultivos para obtener células por migración. Se
mantuvo en incubadora y el medio de cultivo se cambió cada 3 días hasta obtener el cultivo
primario, el cual se amplificó hasta lograr 3 a 4 millones de células que permitió la fabricación
del sustituto dérmico empleando geles de quitosano. Se evaluó su capacidad de diferenciación
al ser tratadas con medio osteogénico. Obtención de células epidérmicas: Las muestras de piel
se lavaron con tampón y se retiró la hipodermis. Las muestras se cortaron en fragmentos de 3–
4 mm2 y se separó la epidermis de la dermis por digestión. Los cultivos celulares se
mantuvieron en DMEM suplementado con 20% de suero fetal bovino. Se evaluó la
biocompatibilidad celular sobre la membrana de quitosano mediante: Determinación de
adhesión y proliferación por MTS, Tinción con Faloidina-FITC y DAPI.
PALABRAS CLAVE: Células epidérmicas, células madre mesenquimales, quitosano,
gelatina Wharton, sustituto dérmico.
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JELLY WHARTON MESENCHYMAL CELLS AND EPIDERMAL CELLS : ON
GROWING AND CHARACTERIZATION ON CHITOSAN MATRIX
Nohelia Nouhad Abou Kheir Caballero, C.I. 15.300.122. Sexo: Femenino. E-mail:
[email protected], Telf.: 0212 5763378 / 04144287244. Dirección: Avenida Principal
Prados del Este Caracas. Curso de Especialización en Cirugía Plástica y Reconstructiva.
Joelys Enrique Bracho Rondón, C.I. 13.131.480. Sexo: Masculino. E-mail:
[email protected], Telf.: 0212 5763378 / 04265125566. Dirección: Avenida
Washington El Paraíso Caracas. Curso de Especialización en Cirugía Plástica y
Reconstructiva.
Tutor: Carmen Urdaneta Toconis. C.I. 2.001.174. Sexo: Femenino. Email:
[email protected], Telf.: 02125763378/ 04128060608 Dirección: Urbanización la
Florida Caracas. Especialista en Cirugía Plástica y Reconstructiva.
Asesor: Karem Noris Suárez. C.I.7.955.648. Sexo: Femenino, E-mail:
[email protected]. Tlfs.: 0412-9944352 / 0212-9063111 / 0212-9064218. Dirección:
Laboratorio de Ingeniería de Tejidos. Dpto. Biología Celular. Universidad Simón Bolívar.
Biólogo.
SUMMARY: There is huge global demand to develop biological substitutes that restore,
maintain and improve tissue function based on the combined use of biomaterials, cells and
scaffolds to repair damaged or diseased tissues. Objective: To cultivate and characterize
epidermal and mesenchymal cells of Wharton's jelly on chitosan matrices. Method: Processing
of Wharton's jelly: Umbilical cords were obtained from pregnant women at term who signed
the informed consent. After each birth was sectioned 5 to 10 cm of umbilical cord samples
were collected in the operating room, preserved in transport medium and taken to Tissue
Bioengineering Laboratory at Simon Bolivar University. The tissue was cut into small pieces
and placed into culture plates for migrating cells. Incubator and remained in the culture
medium was changed every 3 days until the primary culture , which was amplified to a further
3 to 4 million cells allowed the production of the dermal substitute employing chitosan gels .
Their ability to differentiate when treated with osteogenic medium was evaluated. Obtaining
epidermal cells : The skin samples were washed with buffer and retired hypodermis . Samples
were cut into 3-4 mm2 pieces and epidermis the dermis was separated by digestion. The cell
cultures were maintained in DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum.
Determination of adhesion and proliferation by MTS, FITC - phalloidin staining and DAPI:
cellular biocompatibility of chitosan membrane was evaluated by.
KEYWORDS: epidermal cells, mesenchymal stem cells, chitosan, gelatin Wharton, dermal
substitute.
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INTRODUCCIÓN
Existen numerosas patologías que afectan a la piel, destacando por su frecuencia las
heridas, úlceras por presión y quemaduras. Los tratamientos actuales, basados en el uso de
colgajos o injertos de piel, están asociados a numerosos problemas. La necesidad de
solucionar estos problemas hace necesaria la búsqueda de alternativas basadas en la
generación de productos de piel artificial humana generados mediante ingeniería tisular.
Hasta el momento se han diseñado distintos tipos de piel artificial, incluyendo coberturas
cutáneas sintéticas y biológicas, aunque ninguno de ellos ha logrado reproducir fielmente la
estructura y las funciones de la piel humana nativa. Por un lado, las coberturas dérmicas
sintéticas consisten en biomateriales no reabsorbibles y exentos de células vivas que se pueden
utilizar como cubiertas temporales o como agentes inductores de la reparación tisular guiada.
Estos tejidos artificiales e inertes poseen muy poca actividad biológica, por lo que no pueden
ser empleados en lesiones profundas o extensas. Por otro lado, las coberturas biológicas
consisten en la utilización de piel humana artificial en la que existen células vivas y matrices
extracelulares que tratan de reproducir la estructura de la piel humana normal.
El presente trabajo se encuadra en el campo de la biomedicina y, más específicamente,
de la ingeniería tisular, se refiere a un método in vitro de preparación de un tejido artificial, a
partir de una matriz de quitosano, colocándole células mesenquimales aisladas a partir de
gelatina de Wharton, estructura presente en el cordón umbilical, obtenidas de mujeres
gestantes a término en cesáreas programadas realizadas por el servicio de obstetricia en el
Hospital Carlos J. Bello, y células epidérmicas, aisladas a fragmentos de piel de pacientes
sometidos a procedimientos reconstructivos de dermolipectomía y mamoplastía reductoras,
efectuadas por el servicio de cirugía plástica del mismo hospital, previa autorización
(consentimiento informado), las muestras fueron colectadas en quirófano, conservadas en
medio de transporte y llevadas al laboratorio de bioingeniería de tejidos de la Universidad
Simón Bolívar. Una vez en el laboratorio se aislaron y amplificaron empleando sistemas de
7
cultivo apropiados y posteriormente colocadas sobre geles de quitosano, se evaluó la
biocompatibilidad sobre estas membranas determinando la adhesión y proliferación celular.
Planteamiento y delimitación del problema
La piel es el órgano más grande del cuerpo humano; está compuesto de tres capas: la
epidermis, la dermis y la hipodermis. Cada una de ellas se encuentra constituida por diversas
estructuras celulares, las cuales en su conjunto interaccionan de forma coordinada para que
funcionalmente la piel actué como una capa de protección contra las agresiones externas.
Adicionalmente, de esta forma la piel permite contribuir a mantener la homeostasis mediante
la prevención de la pérdida de agua y por ende regular la temperatura corporal a través de
redes capilares y las glándulas sudoríparas (1).
En el ámbito de la medicina se presentan patologías que alteran de forma temporal o
permanente la integridad de la piel entre las cuales tenemos las quemaduras en sus diferentes
grados, heridas crónicas y enfermedades genéticas. Zonas amplias de quemaduras en la piel
además de ser dolorosas, pueden ser mortales, debido a la pérdida excesiva de agua, invasión
por bacterias, u otras alteraciones relacionadas con las quemaduras. Las heridas crónicas como
úlceras diabéticas o de presión, pueden ser muy peligrosas y en muchos casos resultan en la
amputación de las extremidades afectadas. Otras enfermedades de la piel incluyen trastornos
genéticos tales como epidermólisis bullosa y la ictiosis lamelar. Finalmente, se encuentran
los tumores de la piel, los cuales son frecuentes, posiblemente debido a la exposición frecuente
a los rayos ultravioletas favorecido, por la cercanía geográfica de Venezuela a la línea
ecuatorial¨. Entre estos tumores se encuentran el melanoma y el carcinoma de células basales
y de células escamosas (2,3).
Por todo lo anterior en la actualidad con los avances de la ciencia, la tecnología
mundial y el surgimiento de la ingeniería de tejidos se hacen esfuerzos para ofrecer nuevas
herramientas terapéuticas, dirigidas a sustituir de forma temporal o permanente la piel,
8
manteniendo su funcionalidad, mediante la implantación de métodos sistemáticos que buscan
imitar los complejos procesos biológico de la regeneración tisular que permitan lograr este
objetivo en un tiempo menor al natural. Estos avances no están exentos de las implicaciones
económicas para su frecuente aplicación en la práctica clínica sobre todo cuando no son
desarrollados a nivel nacional y es necesario adquirirlos en el exterior. Por todo lo anterior
cabe preguntarse: ¿Es una opción viable la confección de una estructura similar a la piel con
el empleo tanto de células epidérmicas como mesenquimales de la gelatina de Wharton
cultivadas sobre una matriz de quitosano en Venezuela?
Esta investigación se llevó a cabo en el Hospital Carlos J. Bello Cruz roja Venezolana
La recolección de muestra fue desde abril, 2013 hasta septiembre, 2013; en el caso de cordón
umbilical fue de pacientes gestantes a término, seleccionándose solo muestras derivadas de
cesáreas realizadas en el servicio de obstetricia, Mientras que las muestras de piel provenían
de pacientes sometidas a procedimientos reconstructivos (dermolipectomias, mamoplastia
reductora) en el servicio de cirugía plástica del mismo hospital.
Justificación e importancia
Existe una enorme demanda mundial de terapias para promover la regeneración
eficiente de las heridas mediante el desarrollo de sustitutos biológicos que restauren,
mantengan y mejoren la función tisular basándose en el uso combinado de tres elementos:
biomateriales, células y andamios para reparar tejidos lesionados o enfermos (4).
Recientes estudios in vitro con células madre mesenquimales (CMM) han identificado
numerosos mecanismos por los cuales estas células pueden promover el proceso de
cicatrización de la herida y existe un interés significativo en la definición clínica de una
terapia para promover la regeneración dérmica. Las CMM pueden acelerar el cierre de heridas
mediante la modulación de la respuesta inflamatoria y liberación de factores de crecimiento,
promoviendo de esta manera la formación de una matriz de granulación bien vascularizada,
9
fomentando la migración de los queratinocitos desde los bordes sanos de la herida y la
inhibición de la apoptosis de las células implicadas en el cierre de heridas. El efecto trófico
observado en los estudios de con la terapia de CMM también parece aumentar la cicatrización
de heridas en pacientes diabéticos, evitando así la formación de úlceras que no cicatrizan. Por
lo cual las CMM podrían ser la base de una terapia versátil para satisfacer las necesidades
clínicas de la regeneración dérmica (5).
Por otra parte los queratinocitos juegan también un rol de importancia como el que
derivan de células madre unipotentes y se emplean de rutina para estos tratamientos en otras
latitudes. Por lo cual, la posibilidad de cultivar y verificar si mantienen sus propiedades sobre
una matriz de quitosano a nivel de laboratorio en Venezuela, constituiría un aporte de gran
valor terapéutico en el desarrollo de estructuras biológicas que contribuyan a promover la
regeneración de la piel (5) , contribuyendo además al fortalecimiento en el desarrollo de estas
terapias emergentes en el ámbito nacional.
Antecedentes
En 2012, Simantiraki y Rasouli, realizaron una investigación comparativa entre las
células mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (CMDA) como soporte para el
crecimiento de queratinocitos in vitro (en cultivo en monocapa y en los modelos 3D, en
cultivos de células de epidérmicas) e in vivo, empleando modelos de cicatrización de herida en
ratón y como control los soportes cultivados con uso de fibroblastos dérmicos. En este estudio
obtuvieron que las células mesenquimales inducían la reepitelización de forma más eficiente
que los fibroblastos dérmicos, estimulando proliferación de queratinocitos a través del ciclo
celular. Sostienen que la migración y homeostasis epidérmica están regulados por la influencia
de las células mesenquimales gracias a que estas pueden liberar el factor de crecimiento de
queratinocitos-1 (KGF-1, por sus siglas en inglés) y factor derivado de plaqueta-BB (PDGF-
BB, por sus siglas en inglés), los cuales se expresan de manera más prominente en las células
mesenquimales derivadas del tejido subcutáneo. Por otra parte, la sustitución de los
10
fibroblastos dérmicos por CMDA en el compartimiento dérmico de cultivos de piel
organotípicos conduce a una epidermis artificial parecida al de la piel normal, sobre la
histología general, aunque con una mayor expresión de las citoqueratinas 5 y 19. En ratones
las CMDA indujeron una reepitelización y cicatrización más rápida, en comparación con los
fibroblastos dérmicos. Estos resultados aportan evidencia de que las CMDA pueden servir
como células de apoyo para los cultivos primarios de queratinocitos in vivo. Además, debido a
su abundancia y al rendimiento celular alcanzado, representan una fuente celular interesante y
potencial para el uso clínico (6).
En otros avances en el área de la bioingeniería se ha planteado un modelo estructural
de piel donde se emplea dermis de cadáver humano y queratinocitos humanos de donantes. En
los cuales se observa que la dermis mantiene la estructura de colágeno, así como la elastina,
componentes que contribuyen a las propiedades de flexibilidad. Redes preexistente de
conductos vasculares en la dermis pueden ayudar a la rápida vascularización del tejido de la
piel después de la implantación. Para generar la epidermis se siembra esta estructura con
queratinocitos primarios y el tejido es cultivado logrando formar todas las capas epidérmicas.
Estas estructuras tisulares en diversos modelos animales mostraron un excelente
comportamiento como injerto, y sus autores lo proponen como una herramienta para el
tratamiento de las quemaduras en amplias zonas del cuerpo donde la cobertura de la piel debe
ser rápida y los sitios donantes escasos (7).
Seshareddy, et al en su publicación del 2008, relacionada a los métodos de aislamiento
de células mesenquimales en la gelatina de Wharton, afirman que el cordón umbilical
constituye una fuente importante de células madre mesenquimales ya que se encuentran en
varios compartimentos de tejido del cordón umbilical, la placenta y decidua. Los
investigadores señalan que estas células tienen potencial terapéutico como un sustituto de la
célula madre mesenquimal derivada de la médula ósea y plantean protocolos tanto para el
aislamiento de estas células, así como para su cultivo in vitro y almacenamiento mediante
criopreservación. La descripción de estos métodos proporcionarían elementos básicos para las
investigación científica con la visión de que tanto la sangre del cordón umbilical y las células
11
mesenquimales derivadas de la gelatina de Wharton pueden ser comercialmente recolectadas y
almacenadas para su uso en el futuro en el área clínica (8).
Dada la posibilidad de obtener células madre mesenquimales de diferentes tejidos se
han realizado investigaciones que buscan compararlas específicamente con las obtenidas del
tejido adiposo. Se ha evaluado que la aplicación tópica de las células proveniente de tejido
adiposo en la reparación de heridas usando como modelo animal las orejas de conejo son
útiles, confirmando que estás células expresan como marcadores de superficie (CD29, CD44,
CD 90 y CD105), y tanto se mantienen en los cultivos como a la vez son capaces de
diferenciarse en las células del mesodermo, tales como adipocitos, condrocitos, y osteocitos,
por lo cual son útiles para las terapias destinadas a la reparación de heridas (9). Por otra parte
existen estudios en los cuales se ha resaltado el papel inmunológico de las células
mesenquimales derivadas de la gelatina de Wharton donde se ha observado que son capaces de
modular las células llamadas natural killer (NK), las cuales juegan un papel importante en la
defensa del sistema inmunológico (9).
En una revisión realizada por Anzalone, et al en el 2010, evalúan la capacidad de las
células mesenquimales obtenidas del cordón umbilical para diferenciarse en hepatocitos lo
cual hace que estas células tengan aplicaciones muy prometedoras en la medicina regenerativa
en diferentes contextos patológicos. Si bien existen pocas dudas acerca de su capacidad de
diferenciación in vitro, refieren que se necesitan más investigaciones para demostrarlo in vivo.
Señalan que estas células son capaces de expresar un número de funciones de hepatocitos
maduros in vitro y contribuir para mejorar la disfunción del hígado cuando se trasplantan en
animales receptores (10).
Con el desarrollo de las investigaciones en células madre han surgido nuevas ideas en
proponer estructuras similares a la piel que sirva de andamio para ser colocadas estas células y
favorecer sus efectos benéficos. Es por esto que se han desarrollado investigaciones como la
de Tchemtchoua y colaboradores en el 2011 con el desarrollo de apósitos 3-D quitosano que
acortarían el tiempo de curación de heridas de la piel por estimular la migración, invasión y
12
proliferación de las células cutánea residente. Estos andamios tridimensionales de quitosano
nanofibrilar son producidos por electrospinning y se han comparado con películas evaporadas
y esponjas liofilizadas demostrando claras ventajas de la estructura de quitosano en el ámbito
de la adhesión celular y proliferación in vitro. Cuando se utilizó quitosano nanofibrilar como
apósito para cubrir heridas de espesor completo de piel en ratones, indujo una regeneración
más rápida de la epidermis y dermis. En conjunto estos datos ilustran la importancia
fundamental de la estructura de los dispositivos nanofibrilares de quitosano para su plena
biocompatibilidad y demuestran el efecto beneficioso significativo de quitosáno como un
biomaterial de cicatrización de heridas (11).
Arvelo et al en el 2004, en su trabajo titulado: “Obtención de láminas de piel humana
mediante ingeniería de tejido” realizaron un estudio in vitro donde desarrollaron un sistema
de cultivo de queratinocitos humanos sobre un equivalente dérmico que permitía tratar
diferentes lesiones producidas en la piel. Para ello, los queratinocitos obtenidos de cultivos
primarios derivados de biopsias de piel fueron sembrados sobre una matriz de fibrina con
fibroblastos humanos incluidos. Las células creciendo sobre los equivalentes dérmicos
rápidamente alcanzaron confluencia y un epitelio estratificado fue obtenido al cabo de 20-25
días de cultivo. Las láminas de piel así producidas fueron removidas del fondo de los frascos
de cultivo mediante un procedimiento simple y rápido, sin necesidad de utilizar tratamientos
químicos o enzimáticos. Plantean con este método ventajas, que incluye la gran expansión de
los queratinocitos obtenidos de los cultivos primarios sin necesidad del uso de capas
alimentadoras, la disponibilidad del plasma en los bancos de sangre y la versátil y segura
manipulación de la lámina obtenida in vitro permiten asegurar que este sistema sea muy
apropiado para el tratamiento eficaz de lesiones, tanto pequeñas como extensas, producidas en
la piel. Con la limitación de usar andamios de mallas de nylon las cuales terminan dejando
marcas evidentes en la piel regenerada (12).
13
Marco teórico
La piel
Es un órgano destinado a mantener la forma del cuerpo, establecer relaciones sensoriales con
el medio ambiente y protegerlo de las agresiones externas (microorganismos, luz ultravioleta,
traumas mecánicos (13).
Epidermis: Constituye el estrato superficial o externo de la piel. Es un epitelio
estratificado pavimentado cuyas células superficiales se carnifican. Los queratinocitos son las
células más abundantes de la epidermis y son la que le dan forma y funcionalidad. Está
constituida por las siguientes capas:
A) El estrato basal o germinativo: Formado por una sola línea de células cilíndricas.
Estas células asientan en la unión dermoepidérmica y se unen a ella por unas estructuras de
unión llamadas hemidesmosomas. En este estrato las células se están dividiendo y con el
microscopio de luz se aprecian numerosas mitosis. Las Células Básales tienen filamentos de
aproximadamente 10 nm de diámetro que son citoqueratinas. Conforme la célula asciende a
estratos superiores, el número de filamentos aumenta, llegando a ser en el estrato córneo casi
el 50% de sus proteínas. Se encuentran los queratinocitos basales, melanocitos, células de
Merkel, células de Langerhans y células dendríticas.
B) Estrato mucoso de Malpighi o capa espinosa: Está formado por varias capas de
células poligonales o células espinosas que se van aplanando hacia la superficie. En su
citoplasma contienen tonofibrillas que al proyectarse a la periferia forman los desmosomas.
Esta sustancia y las tonofibrillas poseen gran capacidad antigénica, de importancia en procesos
dermatopatológicos.
C) Estrato granuloso: Está constituido por una o más filas de células aplanadas con
gránulos de queratohialina en su citoplasma. Son de núcleos pálidos en vías de desintegración.
Su grosor es proporcional al de la capa córnea. Los gránulos contienen material azufrado
(uniones disulfídicas) que permite que estas células sean resistentes y estables y contribuyen a
14
la adhesión de las tonofibrillas, lo que permite la constitución de láminas córneas hacia la
superficie.
D) Estrato lucido: Es la porción inferior de la capa córnea. Se observa en áreas donde
ésta es más gruesa (palmas y plantas). Está formado por capas de células aplanadas que están
impregnadas por una sustancia oleosa, la eleidina, que se comporta como material hidrófobo
(evita la pérdida de agua y electrolitos).
E) Estrato corneo: Está formado por numerosos células sin núcleo, aplanadas,
eosinofílicas y cornificadas que se disponen en láminas, adoptando una configuración de red o
canastillo. Su función es proteger contra la penetración de microorganismos, agentes tóxicos,
pérdida de líquidos corporales (13).
La dermis: Es un tejido conectivo irregular, blando y moderadamente denso y sirve de
soporte a la epidermis, compuesto por un conjunto de elementos celulares y fibras:
A) Fibroblastos: Son las células más abundantes. Se observan como células fusiformes,
de núcleo claro Son unas células especializadas en la síntesis de las fibras de colágeno,
elásticas y reticulares. Los fibroblastos también tienen que ver con la destrucción del colágeno
pues producen colagenasa, una enzima encargada de la degradación del colágeno.
B) Colágeno: El colágeno es la proteína principal de los vertebrados y se dispone en
haces formando una red tridimensional irregular. La formación de la estructura helicoidal de la
molécula de colágeno se produce al interior del fibroblasto siendo secretado en forma de pro
colágeno. Al exterior se produce el ensamble para formar fibras y así constituir la sustancia
fundamental.
C) Histiocitos: Fagocitan la melanina dando origen a los melanófagos
D) Mastocitos o células cebadas: Tienen importancia en las reacciones inflamatorias de
naturaleza alérgica
15
F) Fibras elásticas: Solo se evidencian con tinciones especiales (orceína o resorcina).
Se disponen entre las fibras colágenas y forman un plexo subepidérmico del que se desprenden
fibrillas verticales que presentan las papilas dérmicas y participan en el anclaje de la
epidermis. Derivan de la elastina (proteína sintetizada por los fibroblastos y miocitos).
G) Sustancia fundamental: Es el material que junto con las gliocoproteínas y proteínas
fibrilares forman la matriz extracelular del dermis y el subcutáneo. está compuesta por:
mucopolisarcáridos (ácido hialurónico, dermatán sulfato), agua, sales, glicoproteínas similares
a las del plasma (fibronectina, laminina, nidogen). Dentro de sus funciones destaca: regulación
del balance hidroelectrolítico, rol en el crecimiento, diferenciación y migración celular, unión
de los componentes dérmicos, rol estructural en la constitución de la membrana basal.
En la dermis se distinguen dos tipos de capas
Dermis papilar: Las papilas dérmicas son proyecciones de la dermis hacia la epidermis
y que se alternan con los procesos interpapilares de la epidermis. En las papilas dérmicas los
haces de colágeno están dispuestos en forma perpendicular a la superficie de la piel. En
humanos un grosor no mayor a 5 mm. Se caracteriza por la presencia de prolongaciones
dístales de la dermis o papilas, de forma mamelonada que ascienden a la epidermis. Contienen
vasos sanguíneos capilares, linfáticos y fibras nerviosas. Esta zona tiene mayor celularidad y
es asiento de los principales procesos metabólicos de la piel. Las fibras colágenas son más
finas y cuando están sometidas a radiación solar sufren un proceso degenerativo conocido
como degeneración basofílica del colágeno o elastosis solar (13).
Dermis reticular: Es la porción más profunda y de mayor espesor. Las fibras colágenas
son más gruesas y sirven de soporte a los anexos cutáneos, se encuentra localizada debajo de
las papilas dérmicas y es de un grosor mayor que la dermis papilar.
16
Hipodermis o tejido celular subcutáneo: Es un tejido conjuntivo laxo constituido por
grandes lóbulos de tejido graso limitados por tabiques de fibras colágenas delgadas y escasas
fibras elásticas (13).
Células madre mesenquimales
También conocidas como células madre estromales o MSC (del inglés Mesenchymal
Stem Cells o Mesenchymal Stromal Cells), son células multipotentes primitivas, con
morfología fibroblastoide, originadas a partir de la capa germinal mesodermal, con la
capacidad de diferenciarse en diversos tipos de células, incluyendo osteocitos (células óseas),
condrocitos (células del cartílago), adipocitos (células grasas), mioblastos (precursores de
células musculosas) cardiomiocitos (células del corazón), neuronas y astrocitos (Células
gliales). En 1924, el científico ruso Alexander A. Maximow utilizó los extensos hallazgos
histológicos para identificar un tipo singular de célula precursora en el interior de la
mesénquima que se diferencia en distintos tipos de células sanguíneas (14).
McCulloch et al fueron los primeros en demostrar la naturaleza clonal de las células de
la médula en la década de 1960 (15). Posteriormente, en los años 70, Friedenstein et al llevaron
a cabo un experimento para examinar el potencial de clonación de las células de la médula (16).
En este estudio, las células del estroma fueron definidas como células formadoras de la unidad
de fibroblastos (CFU-f).
Experimentos posteriores dieron a conocer la plasticidad de las células medulares y
cómo su desarrollo podría estar condicionado a factores ambientales. El cultivo de células
madre mesenquimales en presencia de estímulos osteogénicos como el ácido ascórbico, el
fosfato inorgánico y la dexametasona podría determinar su desarrollo a osteoblastos. En
cambio, el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-beta 1) las induciría a convertirse
en condrocitos.
17
Detección: No existe ningún método para detectar a una célula madre mesenquimal
aislada. Sin embargo existen antígenos de superficie que pueden ser utilizados para identificar
una población de células con capacidad de diferenciación y proliferación similar al de las
células madre mesenquimales. Hay que tener en cuenta que, como población en sí, las células
madre mesenquimales no suelen expresar todos los marcadores propuestos y todavía no se
sabe con seguridad cuales deben expresarse necesariamente para poder clasificar a las células
de esa población como células madre mesenquimales. Se ha sugerido que las propiedades
terapéuticas atribuidas a este tipo de células se deben a la interacción intercelular y que, por
tanto, no existe ninguna célula que posea todas las características. Por lo anteriormente
mencionado, “The Mesenchymal and Tissue Stem Cells Committe of the Internaltional Society
for Cellular Therapy” (ISCT) propuso las siguientes normas para definir las MSC:
• Las MSC deben adherirse al plástico cuando se mantienen en condiciones normales
de cultivo.
• Más del 95 % de la población de MSC debe expresar los antígenos específicos de
superficie CD105, CD73 y CD90, adicionalmente, estas células no deben expresar (menos del
2 % positivas) CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19 y HLA de clase II.
• Las células deben ser capaces de diferenciarse a osteoblastos, adipocitos y
condroblastos bajo condiciones estándares de diferenciación in vitro (17).
Las MSC son un blanco prometedor como terapéutico biológico para un amplio rango
de necesidades médicas no resueltas. Las razones para esto son muchas e incluyen: fácil
aislamiento y expansión en cultivo, multipotencialidad, efectos paracrinos, propiedades
inmunomoduladoras, conducta migratoria y consideraciones éticas (17).
Multipotencialidad: Las células madre mesenquimales del tejido embrionario son las
células precursoras del tejido conjuntivo en general: la capacidad de diferenciación y
especialización de estas células pluripotenciales da lugar a los diferentes tipos de tejidos
conectivos especializados (tejido adiposo, tejido cartilaginoso, tejido óseo, tejido
18
hematopoyético y tejido muscular); las que no se especializan forman los tejidos conectivos
laxo (tejido mucoso, tejido reticular y el propio tejido mesenquimal) y denso (regular e
irregular).
Las células madre mesenquimales tienen además la capacidad de transformarse en un
tejido diferente del que formaban parte y adaptarse a las nuevas condiciones del medio. Estos
procesos de regeneración y proliferación son inducidos tras la formación de desmosomas y la
secreción de factores de crecimiento y citoquinas.
Las células pertenecientes a tejidos ya especializados también pueden ser diferenciadas
in vitro mediante técnicas de activación y supresión de genes, dando lugar a células
funcionales distintas a las de origen. Esto implica la producción guiada de osteoblastos,
adipocitos, condrocitos así de como miocitos y células similares a neuronas. El nivel de
diferenciación de estas células cultivadas varía entre individuos y depende de si ésta es
inducida mecánica o químicamente La capacidad de diferenciación y proliferación decrece a
medida que aumenta la edad del donante, así como el tiempo en que permanecen las células en
cultivo.
Efectos paracrinos: cada vez más evidencias indican que las señales paracrinas de las
MSC son el mecanismo predominante responsable para el potenciamiento de la reparación de
las heridas. Los medios condicionados de las MSC presentan un efecto similar para inducir
regeneración al que se obtiene al emplear a las propias células. (17) Es importante destacar que,
estos resultados no son específicos para medio condicionado colectado a partir de MSC
derivadas de médula ósea, también ha sido observado usando medio condicionado de MSC
aisladas de tejido adiposo. Esto cambia un paradigma centrado en la diferenciación a una
visión en la cual las MSC pueden ser terapéuticas incluso si estas no son implantadas o se
diferencian en un tejido específico. Los efectos paracrinos de las MSC pueden dividirse en
tróficos, inmunomoduladores, anti-cicatrizantes, y quimioatrayentes. Los efectos tróficos
pueden ser subdivididos en anti-apoptóticos, de apoyo (estimulación de la mitosis,
proliferación y diferenciación de células madre precursoras intrínsecas de órganos) y
19
angiogénicos. La identificación del número de moléculas que median la acción paracrina de
las MSC aumenta cada día (18).
Propiedades inmunomoduladoras: Numerosos estudios han demostrado que las células
madre mesenquimales evitan el reconocimiento de antígenos interfiriendo en la función de las
células dendríticas y de los linfocitos T. Tienen por tanto un efecto inmunosupresor local
debido a su capacidad de secretar citoquinas. Este efecto se ve potenciado cuando las células
son expuestas a un medio inflamatorio caracterizado por la presencia de niveles elevados de
interferón gamma. Otros estudios contradicen algunos de estos descubrimientos, reflejando la
naturaleza heterogénea de las células madre mesenquimales, así como las diferencias que
pueden surgir de la aplicación de diferentes métodos de estudio en desarrollo (19).
Conducta migratoria: EL uso de MSC para aplicaciones terapéuticas ha sido
particularmente aprobado por su capacidad inherente de llegar a los sitios de inflamación
causados por lesión en los tejidos después de que son inyectadas vía intravenosa. Chapel et al
(2009) demostraron en un modelo de insuficiencia de múltiples órganos que las MSC
marcadas con la proteína verde fluorescente se alojaban en numeroso tejidos, con localización
en relación a la gravedad y a la geometría de la lesión. Este proceso es conocido como homing
(o anidamiento, en español) es el proceso esencial por medio del cual las células migran y se
implantan en el tejido en el que tendrán efectos funcionales y de protección. Durante la
inflamación, el reclutamiento de células inflamatorias requiere una secuencia coordinada de
adhesión de múltiples pasos y eventos de señalización, laminación mediada por selectinas,
activación celular por citoquinas y quimiocinas activación de integrinas, adhesión firme al
endotelio mediada por integrinas, migración transendotelial y, finalmente, la
migración/invasión en la matriz extracelular involucrando interacciones dependientes de
integrinas y proteasas que degradan la matriz. Es bien sabido que la dirección migratoria sigue
un gradiente de densidad de quimiocinas. El aumento de la concentración de quimiocinas
inflamatorias en el lugar de la inflamación es un mediador clave del anidamiento de las MSC
en el sitio de la lesión. Las quimiocinas son liberadas después de los daños y las MSC
20
expresan varios receptores de quimiocinas. La activación de quimiocinas es también un paso
importante en el tráfico de MSC hacia el sitio de la lesión (19).
Sitios de obtención: En estudios recientes se ha señalado que las MSC pueden ser
aisladas de muchos tejidos, además de la médula ósea, incluyendo tejido adiposo, hígado,
bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial,
músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical humano, pulmón,
pulpa dental, e incluso de sangre periférica, sugiriendo que las MSC son ampliamente
distribuidas in vivo. En los últimos años, el interés ha aumentado por las células madre
mesenquimales aisladas de tejido adiposo (AT-MSC) dada su plasticidad de desarrollo y su
potencial terapéutico, además de que su obtención es mucho menos invasiva que las realizadas
a partir de la médula ósea y se obtienen en mayor abundancia. Varios informes indican que las
células de la gelatina de Wharton, el componente principal la matriz extracelular del cordón
umbilical, son células madre multipotentes, que expresan marcadores de células madre
mesenquimales de médula ósea (BM-MSC), y dando lugar a diferentes tipos celulares, tanto
de tejido conectivo y nervioso (18, 19).
Uso clínico: Todas las características anteriormente nombradas, convierten a las MSC
en un potencial terapéutico para la terapia celular, la ingeniería de tejidos y la medicina
regenerativa para un diverso rango de necesidades médicas, tales como: el Parkinson y el
Alzhéimer, lesiones de médula espinal, tratamiento de quemaduras extensas, enfermedades
cardiacas y osteoartritis, entre otras condiciones (20).
Las células madre mesenquimales pueden ser activadas y movilizadas si es necesario,
aunque la eficiencia es muy baja. Por ejemplo, afecciones musculares son de lenta
recuperación. En cambio, si hubiera un método para activar las células madre mesenquimales,
entonces esos daños se curarían más rápidamente (20).
La inyección directa o el emplazamiento de las células en el tejido donde son
requeridas para realizar su función de reparación es el método de tratamiento preferible, ya
21
que el reparto vascular queda afectado por un efecto de acumulación y retención en los
pulmones de las células inyectadas por vía intravenosa (“pulmonary first pass effect”). Han
sido publicados algunos casos clínicos en aplicaciones ortopédicas, aunque el número de
pacientes tratados es pequeño y esos métodos todavía carecen de estudios rigurosos que
demuestren su efectividad (21).
El cordón umbilical
En mamíferos placentarios, el cordón umbilical es un cordón que une un embrión en
vías de desarrollo o feto a su placenta. Contiene arterias principales y venas (las arterias
umbilicales y vena umbilical) para el intercambio de sustancias nutritivas y sangre rica en
oxígeno, entre el embrión y la placenta.
En el feto humano, el cordón umbilical es por lo general, de unos 56 cm de longitud y
de 1 a 2 cm de diámetro. Dicha longitud puede variar desde la acordia, que es la ausencia del
cordón umbilical, hasta más de 300 cm. Los cordones umbilicales son de naturaleza helicoidal,
con hasta 380 hélices. En promedio el cordón umbilical tiene 10 a 11 hélices. Por razones que
se desconocen, la mayoría de los cordones giran o rotan hacia la izquierda. Más del 5% de los
cordones son más cortos de 35 cm, y otro 5 % miden más de 80 cm (22). Contiene dos arterias
umbilicales y una vena umbilical, sepultada dentro de la gelatina de Wharton. Recientemente,
se ha descubierto que la sangre del cordón umbilical es una fuente fácilmente disponible de
células madre que se pueden utilizar para el trasplante de médula destruida al tratar leucemia.
La sangre del cordón umbilical no solamente tiene células madre hematopoyéticas (con
capacidad de formar varios tipos de células sanguíneas) también tienen células madre
mesenquimales con lo cual pueden dar células neuronales, células óseas, músculo cardíaco y
otras células musculares. Los resultados de numerosos ensayos clínicos indican que hay
menos posibilidades de tener un rechazo de trasplante realizando un trasplante alogénico, entre
distintas personas, de sangre del cordón umbilical que en el caso del trasplante de médula
22
ósea. Según la comunidad científica, la razón más probable de este hecho es que las células del
sistema inmunitario del recién nacido están menos desarrolladas que en el adulto. Se han
puesto en marcha bancos de cordones que almacenan cordones umbilicales para utilizarlos en
trasplantes a personas compatibles (22).
Gelatina de Wharton
La gelatina de Wharton se encuentra en el cordón umbilical; es decir, es el mismo
tejido conectivo laxo mucoso, y está conformado por células mesenquimatosas, que luego se
convertirán en fibroblastos inmaduros.
En un corte histológico se observa el cordón umbilical con la siguiente estructura en
forma triangular: dos arterias en la base del triángulo y una vena en el vértice, todo ello
inmerso en la gelatina de Wharton (22).
Quitina y quitosano
El quitosano es un polisacárido catiónico lineal derivado de la quitina (del griego tunic,
envoltura), polímero natural o biopolímero que se encuentra en la estructura de insectos,
artrópodos, caparazones de crustáceos, paredes celulares de hongos, algas, etc. La quitina se
encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza después de la celulosa (materia base del
papel), es decir, es el segundo polisacárido en abundancia. La quitina, es un poli (β-(1-4)-2
acetamida-2-desoxi-D-glucopiranosa), la cual, mediante una reacción de desacetilación que
elimina al menos un 50 % de sus grupos acetilo; cuando el grado de desacetilación alcanza el
100 % el polímero se conoce como quitosano el cual está compuesto por unidades de β-(1,4)-
2-deoxi-2-amino-D-glucopiranosa (D-glucosamina) (GlcN) y β-(1-4)-2-desoxi-2-acetaminido-
D-glucopiranos (N-acetyl-D-glucosamina) (GlcNAc) (23).
23
Cabe mencionar que el quitosano se puede encontrar de forma natural en las paredes
celulares de algunas plantas y hongos (por ejemplo en el Mucor rouxii llega a representar
hasta un tercio de su peso). Sin embargo, la fuente más importante de quitosano, a nivel
industrial, lo constituye la quitina, la cual, mediante el proceso de desacetilación química o
enzimática, ha permitido producirlo a gran escala. Desde el punto de vista químico, los
procesos para obtener la quitina y el quitosano son relativamente sencillos, aunque el
tratamiento con álcali concentrado a temperaturas relativamente altas implica riesgos
importantes para los operadores de las plantas de producción y hostilidad hacia el ambiente
(24).
Entre las aplicaciones en la medicina hoy en día se sabe que la quitina y el quitosano
han sido usados desde la antigüedad para acelerar el saneamiento de heridas. Por ejemplo, los
antepasados de los coreanos usaban la quitina en el tratamiento de abrasiones (obteniéndola a
partir de las plumas del calamar) y los antepasados de los mexicanos aplicaban quitosano para
la aceleración de la cicatrización de heridas (obteniéndolo de las paredes celulares de algunos
hongos). En la actualidad, entre los usos médicos más sencillos de estos materiales podemos
mencionar: 1) Producción de suturas quirúrgicas a partir de quitina, 2) Producción de gasas y
vendajes tratados con quitosano, 3) Cremas bactericidas para el tratamiento de quemaduras,
entre otros. Sin embargo, quizás las aplicaciones más importantes que lograrán tener estos
biomateriales en un futuro muy próximo, serán en el campo de la terapia genética no viral,
utilizando una vía alterna a la introducción física directa del material genético dentro de las
células (25). Esta vía, ya probada con resultados alentadores, utiliza la formación de complejos
poli electrolitos entre las macromoléculas de ADN y sales inorgánicas, policationes, lípidos,
etc., para introducir el ADN en las células. En el caso del quitosano ya comienzan a
vislumbrarse algunas posibilidades en el área, como por ejemplo las que puedan derivarse de
los estudios de transfección in vitro e in vivo de células de mamíferos, en el tratamiento de
enfermedades hereditarias y cáncer. En el área farmacéutica, el quitosano se está aplicando
como matriz de liberación prolongada de drogas. (26)
24
Objetivo general
Cultivar y caracterizar células epidérmicas y células mesenquimales obtenidas de la
gelatina de Wharton, sobre matrices de quitosano.
Objetivos específicos
1. Aislar y cultivar células epiteliales a partir de muestras de piel humana
2. Aislar y cultivar células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton
3. Evaluar la adhesión y proliferación de las células epiteliales y mesenquimales sobre
matrices de quitosano.
4. Caracterizar potencialidad de las células mesenquimales aisladas mediante ensayo de
diferenciación hacia linaje osteogénico.
Hipótesis
Si la matriz de quitosano constituye una estructura viable para el mantenimiento y
proliferación, tanto de células epiteliales como de células mesenquimales obtenidas de la
gelatina de Wharton, entonces será posible desarrollar en Venezuela sustitutos dérmo-
epidérmicos, funcionales para ser utilizados en terapias con daños extensos de la piel.
Aspecto ético
El establecimiento de cultivos celulares humanos en el laboratorio, es una esperanza
para la medicina regenerativa del futuro, de ahí la importancia de la investigación con células
troncales embrionarias y adultas.
25
La aplicación de las células madre adulta provenientes de la médula ósea se ha ido
incrementando, con las que se han conseguido resultados muy alentadores. También pueden
ser colectadas de la sangre del cordón umbilical del recién nacido, recientemente se han
conseguido resultados prometedores con las células madre provenientes del tejido adiposo
extraído mediante liposucción (27).
En el presente trabajo la fuente principal de células fue de piel, obtenida en
procedimientos reconstructivos donde la resecciones parciales de la misma es parte del
protocolo quirúrgico; realizados por el servicio de Cirugía plástica del Hospital Carlos J Bello,
así también, del cordón umbilical de recién nacidos a término, en cesáreas programadas
realizadas por el servicio de obstetricia del mismo hospital.
Las restricciones éticas son las que habitualmente se emplean en los ensayos clínicos, y
que incluyen el consentimiento informado del paciente donante de tejido, también ese
consentimiento fue emitido cuando la obtención era de cordón umbilical y fue firmado por la
madre del recién nacido. En todas estas situaciones, se explicó a los signatarios del documento
los posibles beneficios y riesgos del proceder. Haciendo énfasis en que estos tejidos son
habitualmente material de desecho y la obtención del mismo no implica ningún riesgo para los
pacientes.
El protocolo, fue aprobado por el Comité de Ética de la institución, de forma tal que el
procedimiento está completamente avalado por criterios éticos y científicos fundamentados en
los principios estipulados en la Declaración de Helsinki.
26
METODOS
Tipo de estudio
El estudio fue de tipo exploratorio, diseño de la investigación experimental, pre-
experimento.
Población y Muestra
Para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales:
Gelatina de Wharton: Se siguió el procedimiento descrito por Rojas et al (2012). Los
cordones umbilicales fueron colectadas en quirófano, conservadas en medio de transporte
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium complementado con Penicilina/Estreptomicina y
anfotericina) y llevadas al Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos de la Universidad Simón
Bolívar conservadas durante su transporte a una temperatura de 4 ºC.
Se realizaron cultivos primarios en seis placas de Petri de 100mm de diámetro,
subcultivando para amplificar y obtener un total de dieciocho (18) placas de cultivos
Para el aislamiento y cultivo de células epidérmicas
Piel: Las muestras de piel fueron obtenidas de pacientes sometidos a procedimientos
reconstructivos y cedidas a la investigación con previa autorización (consentimiento
informado) de estos. Una vez transportadas las muestras al Laboratorio de Bioingeniería de
Tejidos-USB, se efectuaron cultivos primarios en seis (6) placas de Petri de 100mm de
diámetro, subjetivando para amplificar y a partir de estos se obtuvieron cuatro subcultivos para
un total de veinticuatro (24) placas de las mismas dimensiones.
27
Procedimientos
Preparación de muestras
Gelatina de Wharton: Se siguió el procedimiento descrito por Rojas et al (2012). Los
cordones umbilicales fueron obtenidos de mujeres gestantes a término que previamente
aceptaron participar en el estudio a través de un consentimiento informado (ver Anexos).
Después de cada nacimiento se seccionó bajo estrictas normas de asepsia y antisepsia 5 a 10
cm de cordón umbilical, las muestras fueron colectadas en quirófano, conservadas en medio
de transporte DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium complementado con
penicilina/estreptomicina y anfotericina) a 4 oC y llevadas al Laboratorio de Bioingeniería de
Tejidos de la Universidad Simón Bolívar (USB). En el laboratorio, se realizó un corte
transversal sobre la muestra de cordón umbilical, y se procedió a retirar los vasos sanguíneos y
restos de sangre, haciendo 3 lavados con buffer fosfato salino. El tejido se cortó en fragmentos
de tamaño pequeño, cerca de los 2 mm2 y se colocaron en las placas de cultivos a fin de
obtener las células por migración. Los trozos se mantuvieron en medio alfa-MEM (modified
Eagle médium, Gibco®) complementado con suero fetal bovino (SFB por sus siglas inglés) al
10%, en incubadora con ambiente de humedad de 98%, temperatura de 37oC y 5% de CO2. El
medio de cultivo se cambió cada 3-4 días hasta obtener el cultivo primario por proceso de
migración que al llegar a la confluencia de las células de un 70% a 80% al décimo día se
amplificaron los cultivos mediante el uso de método enzimático de tripsinizacion para obtener
subcultivos hasta 3 pasajes, y lograr 3 a 4 millones de células, lo cual permitió la fabricación
del sustituto dérmico empleando geles de quitosano.
Métodos de diferenciación de las células mesenquimales: Para demostrar la
potencialidad de las células mesenquimales por su capacidad de diferenciación a otros linajes
celulares, posterior a su obtención a través de los cultivos, se realizó el protocolo de
diferenciación de las mismas a osteoblastos, utilizando en este caso un medio de cultivo
osteogénico no comercial. La diferenciación se obtuvo a los 21 días de tratamiento.
28
Piel: Las muestras de piel fueron obtenidas de pacientes sometidos a procedimientos
reconstructivos (dermolipectomía y mamoplastia reductoras) y cedidas a la investigación con
previa autorización (consentimiento informado) de estos. Una vez transportadas las muestras
al Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos-USB se lavaron extensivamente con tampón
fosfato salino pH 7,4 (PBS por sus siglas en inglés) y se diseccionaron, retirando y separando
la hipodermis de la dermis. Las muestras se cortaron en fragmentos de 3–4 mm2 y la
separación de la epidermis de la dermis se realizó por digestión. Las muestras se colocaron
sobre la placa de cultivo. Luego de obtener los cultivos primarios se realizaron subcultivos,
teniendo cuidado no superar de 6-8 pasajes. Mediante este procedimiento se obtuvieron
queratinocitos por migración. Los cultivos obtenidos se emplearon para la evaluación de
biocompatibilidad de las membranas de quitosano (28).
Preparación de geles de quitosano ultradelgados:
Se utilizó la mezcla de quitosano, agarosa y polietilenglicol 400 (PEG-400) diluidos en
ácido acético grado analítico al 2 %, la cual se mantuvo en agitación constante a temperatura
ambiente, por 24 h. Para la obtención de las láminas, la solución se vertió en placas de Petri y
se dejó secar en estufa convencional a 50 ºC por 24 h. Una vez secas se neutralizaron con 5 %
NaOH, incubando por 2h a temperatura ambiente, y posteriormente se realizaron lavados
extensos con agua destilada. Las membranas ultradelgadas obtenidas se conservaron en etanol
al 70 % (28).
Evaluación de biocompatibilidad sobre membranas de quitosano:
a) Determinación de adhesión y proliferación empleando el kit comercial CellTiter
96R (MTS-Promega®), siguiendo las instrucciones del comerciante
b) Se realizó la tinción con Faloidina-FITC siguiendo el protocolo descrito por Rojas
et al, 2012
c) Se realizó la tinción con DAPI siguiendo las instrucciones del fabricante.
29
Tratamiento estadístico adecuado
Se calculó el promedio y la desviación estándar de las variables continúas; en el caso
de las variables nominales se calculó sus frecuencias y porcentajes. Los datos fueron
analizados con JMP-SAS 11.0
30
RESULTADOS
1. Obtención de células madre mesenquimales:
Se realizaron cultivo de células mesenquimales, a partir de la gelatina de Wharton
obtenida de muestras de cordón umbilical; se obtuvieron células de los cultivos posteriores a
cultivos primarios, que al ser evaluada por microscopia electrónicas presentaron las
características morfológicas de células mesenquimales, con morfología fibroblastoide por su
aspecto fusiforme y su abundante citoplasma (Figura 1).
2. Diferenciación de células madre mesenquimales:
Posterior a la obtención de cultivos de células mesenquimales se tomaron de los
subcultivos células para la diferenciación, utilizando como método un medio osteogénico no
comercial, logrando la obtención de la diferenciación de las células mesenquimales a
osteoblastos a los 21 días de cultivo, observándose a través de microscopia óptica
convencional por medio de tinción de rojo aliazarina la coloración de los depósitos de cristales
de calcio creados durante los procesos de biomineralizacion propios de los osteoblastos a
partir de los 15 días de cultivo (Figura 2).
3. Obtención de células epidérmicas (queratinocitos):
Se realizaron cultivo de células epidérmicas previa la obtención de las muestras de
piel, el cual posterior a cultivos primarios se obtuvieron células que al ser evaluada por
microscopía óptica convencional presentaron las características morfológicas de células
epidérmicas tipo mosaico, con gran citoplasma y núcleo oval y figuras mitóticas propias de
queratinocitos, los cuales crecieron formando colonias para ser confluente en el 9 º y 12 º día
de cultivo para formar una monocapa continua y única la cual posterior a proceso enzimático
de tripsinización se obtuvo cultivos secundarios de 6 a 8 pasajes (Figura 3)
31
4. Elaboración de membranas de quitosano:
Se obtuvieron membranas ultra delgadas de quitosano a través del método de Rojas et
al (2012), las cuales se muestran en la figura 4.
5. Evaluación de la biocompatibilidad de los cultivos celulares sobre las membranas de
quitosano:
En la evaluación de la adhesión celular de las células epidérmicas sobre la matriz de
quitosano posterior a las 48 horas de incubación mediante el empleo del kit comercial
CellTiter 96R (MTS) se pudo observar adhesión aceptable de las células epidérmica tanto en el
cultivo control como sobre la matriz de quitosano lo cual sugiere la viabilidad del empleo del
mismo como andamio para el cultivo celular (Tabla 1).
Se observaron las células adheridas a la membrana de quitosano que destacan debido a
la tinción nuclear fluorescente DAPI, el cual permite observar los núcleos de las células una
vez que estas fueron fijadas sobre la membrana de quitosano. Ello permitió revelar la
organización de las células a manera de colonias o agrupaciones sobre la superficie.
Coincidiendo dichas agrupaciones con las estructuras que presenta la membrana de quitosano
y que lucen en apariencia como “bolsillos”o levantamientos de la superficie (Figura 5).
Se pudo observar una adhesión de células mesenquimales aceptable tanto en el cultivo
control como sobre la matriz de quitosano a las 48 horas del estudio in vitro. Se observaron las
células mesenquimales adheridas a la membrana de quitosano atreves de microscopía de
fluorescencia mediante el medio de tinción DAPI, el cual permite observar los núcleos de las
células vivas sobre la membrana de quitosano (Figura 6), y mediante microscopia electrónica
(Figura 7).
Al observar los resultados de la tabla 1 es evidente que a las 24 horas se evidenció en
el grupo control un 83% de adherencia celular epidérmica mientras que sobre la matriz de
32
quitosano se evidencio un 5,6 %. A las 48 horas se obtuvo un 22 % de adhesión celular en el
grupo control y un 0,41 % en el grupo de quitosano respectivamente (Tabla 1).
En la tabla 2 se puede observar un 81,3 % de adherencia celular mesenquimal en el
cultivo control a las 24 horas mientras que sobre la matriz de quitosano se evidencio un 21,1
%. A las 48 horas se obtuvo un 12,8 % de adhesión celular en el grupo control y un 10,5 %,
en el grupo de quitosano respectivamente.
Posterior a la obtención de cultivo de células mesenquimales a una muestra de cultivo
se le colocaron medios de cultivo no comercial de diferenciación osteogenicos el cual se pudo
desmostras la potencialidad de estas células obtentiendo células tipo ostiocitos a partir de la
diferenciación de las células mesenquimales.
DISCUSIÓN
Posterior a la obtención de los resultados de la presente investigación podemos afirmar
que como lo señalado por Seshareddy, et al, en su publicación de 2008, la gelatina de Wharton
constituye una fuente aceptable y eficaz de células madre mesenquimales para ser utilizadas
como objeto de estudio in vitro de una forma relativamente sencilla , en nuestro caso particular
bastó el empleo de una muestra de solo 4 cm de cordón umbilical para el desarrollo de la
investigación que consistió en evaluar su viabilidad sobre matrices de quitosano, para lo cual
no se presentó dificultad alguna durante las mediciones realizadas tanto a las 24 como a las 48
horas del estudio in vitro siguiendo los procedimientos ya citados para su correcto
aislamiento, en búsqueda de ofrecer una nueva alternativa para su uso clínico como sustitutos
dermo- epidérmicos (5-11).
Da Silva y colaboradores además de señalar que las células de la gelatina de Wharton,
el componente principal de la matriz extracelular del cordón umbilical, son células madre
multipotentes, capaces de expresar marcadores de células madre mesenquimales de médula
33
ósea (BM-MSC), también realzan las bondades de las mismas en su fácil obtención y
manipulación a la hora de ser utilizadas in vitro lo cual es evidenciado en la presente
investigación (18, 19).
Por otra parte tan solo fue necesaria la muestra de 1 cm de piel para la obtención de
los queratinocitos.
En este orden de ideas se obtuvo resultados alentadores con la utilización de matrices
de quitosano como andamio para la adhesión de células mesenquimales y epidérmicas, sobre
todo estas últimas ya que no había sido posible su cultivo previamente en otros medios, y en
esta investigación fue valorada su adhesión celular tanto a las 24 como a las 48 horas de
incubación donde se demostró la posibilidad de su viabilidad de ambos grupos celulares sobre
el quitosano. Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Tchemtchoua y
colaboradores en 2011 los cuales planteaban el desarrollo de apósitos 3-D quitosano que
permitirían acortar el tiempo de curación de heridas de la piel por estimular la migración,
invasión y proliferación de las células cutánea residente (11-19).
Al analizar los resultados obtenidos en ambos grupos celulares (epidérmicas y
mesenquimales) en cuanto a la capacidad de adhesión al quitosano tanto a las 24 como a las 48
horas podemos evidenciar que no hubo diferencias significativas sobre todo en el grupo de
células epidérmicas, y se observó en ambos experimentos la muerte de una cantidad
importante de células tanto en los grupos control como el de quitosano si tomamos en cuenta
el contaje celular inicial al realizar el experimento, lo cual nos lleva a plantear nuevas
interrogantes en la manipulación de posibles variables intervinientes que nos puedan llevar a
mejorar estos resultados obtenidos mediante la realización de nuevos ensayos experimentales
a futuro.
En 2012, Alexaki V, Simantiraki D y colaboradores en su investigación comparativa
entre las células mesenquimales como soporte para el crecimiento de queratinocitos in vitro
34
(en cultivo en monocapa y en los modelos 3D, en cultivos de células de epidérmicas) e in vivo,
empleando modelos de cicatrización de herida en ratón y como control los soportes cultivados
con fibroblastos dérmicos. Concluyeron que las células mesenquimales inducen la re-
epitelización de forma más eficiente que los fibroblastos dérmicos, induciendo proliferación
de queratinocitos a través del ciclo celular (6). Además Yanas y colaboradores también
Sostienen que la migración y homeostasis epidérmica están regulados por la influencia de las
células mesenquimales (29). Por lo cual con los resultados obtenidos en nuestra investigación
nos abre nuevas opciones de mejoramiento de los experimentos realizados para el
cumplimiento de nuevos objetivos en estudios posteriores.
Por tanto, se demuestra en este trabajo, a pesar de lo señalado previamente el efecto
beneficioso del quitosano en cuanto a su “utilidad”, dado que se puede evidenciar la no
toxicidad del mismo para la adhesión y el crecimiento tanto de las células epidérmicas como
de las mesenquimales ,y que aunado a que con el quitosano se permite el desarrollo de mallas
ultradelgadas que garantizan el no dejar marcas en la piel como otros medios ya estudiados, se
puede plantear en función de estos resultados obtenidos al quitosano como un biomaterial útil
y con posibles aplicaciones clínicas de importancia en el manejo de la cicatrización de las
heridas.
35
AGRADECIMIENTO
Al servicio de Cirugía Plástica y Reconstructiva del hospital Carlos J Bello centro de
enseñanza que inculco en nosotros la responsabilidad, el trabajo y la dedicación. A todo el
equipo de adjuntos de este servicio, por su apoyo incondicional tanto en nuestra formación
profesional como en la elaboración de este trabajo.
Nuestro más profundo y sentido agradecimiento a todos los miembros del Instituto de
Ingeniería de tejidos de la universidad Simón Bolívar, especialmente a la Dra. Karem Noris-
Suarez por aceptarnos para realizar esta investigación bajo su dirección. Su apoyo, su
confianza y su capacidad para guiarnos ha sido un aporte invaluable. Las ideas propias,
siempre enmarcadas en su orientación y rigurosidad, han sido la clave del buen trabajo que
hemos realizado. Así mismo a la Dra. Loly Rojas por su importante aporte y participación
activa en el desarrollo de este trabajo, debemos destacar por encima de todo su disponibilidad
y paciencia. No tenemos duda que su intervención ha enriquecido el trabajo elaborado y
además ha significado el surgimiento de una solidad amistad.
36
REFERENCIAS
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2) Hilal L, Rochat A, Duquesnoy P. A homozygous insertion-deletion in the type VII collagen
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properties of mesenchymal stem cells. Cytokine Growth F R. 2009;20:419–427
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20) Concise review: mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of
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biocompatibles para diversas aplicaciones en ingeniería de tejidos.
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artificial skin. 2. control of chemical composition. J. Biomed: Mater. Res. 14:107-131, 1980.
39
ANEXOS
CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL DONANTE
Yo _______________________, CI_____________ autorizo a los residentes Nohelia Abou Kheir y Joelys
Enrique Bracho pertenecientes al postgrado universitario de Cirugía Plástica y reconstructiva avalado por la
Universidad Central De Venezuela, que funciona en el hospital “Carlos J. Bello” de la Cruz Roja
Venezolana, para que en conjunto con el Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos – USB puedan utilizar
piel de desecho obtenida de los procedimientos cutáneos realizados en mi persona según el protocolo
quirúrgico previamente acordado, con fines exclusivos para la realización de un proyecto piloto de
investigación clínica titulado “Células mesenquimales de gelatina de Wharton y células epidérmicas:
cultivo y caracterización sobre matrices de quitosano”.
Certifico que he leído las condiciones y se me han aclarado todas las dudas generadas en mi
persona, por lo que comprendo perfectamente lo anterior señalado y me encuentro en capacidad de expresar
mi libre albedrío. Entiendo que este estudio es solo de carácter científico y de beneficio social por lo que
expreso mi voluntad de contribuir al mismo sin que ello implique alguna remuneración económica hacia mi
persona por ello, por lo cual doy mi consentimiento para su realización
Nombre del paciente
______________________________
Firma del paciente
Nombre del testigo
______________________________
Firma del testigo
Médico tratante
______________________________
Firma del médico tratante
En Caracas a los días del mes del año 2013
40
CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL DONANTE
Yo _______________________, CI._____________ autorizo a los residentes Nohelia Abou Kheir y Joelys
Enrique Bracho pertenecientes al postgrado universitario de Cirugía Plástica y reconstructiva avalado por la
Universidad Central De Venezuela, que funciona en el hospital “Carlos J. Bello” de la Cruz Roja
Venezolana, para que en conjunto con el laboratorio de Bioingeniería de Tejidos – USB puedan utilizar el
cordón umbilical (Material biológico del producto de mi gestación), con fines exclusivos para la realización
de un proyecto piloto de investigación clínica titulado “Células mesenquimales de gelatina de Wharton y
células epidérmicas: cultivo y caracterización sobre matrices de quitosano”.
Certifico que he leído las condiciones y se me han aclarado todas las dudas generadas en mi
persona, por lo que comprendo perfectamente lo anterior señalado y me encuentro en capacidad de expresar
mi libre albedrío. Entiendo que este estudio es solo de carácter científico y de beneficio social por lo que
expreso mi voluntad de contribuir al mismo sin que ello implique alguna remuneración económica hacia mi
persona por ello, doy mi consentimiento para su realización
Nombre del paciente
______________________________
Firma del paciente
Nombre del testigo
______________________________
Firma del testigo
Médico tratante
______________________________
Firma del médico tratante
En Caracas a los días del mes del año 2013
41
FIGURAS
Figura 1. Micrografías correspondientes a los cultivos de células mesenquimales morfología
fibroblastoide y refringente, característica de estos cultivos.
Figura 2. Micrografía correspondiente a los depósitos de cristales de calcio observados por
medio de tinción rojo alizarina creados en el proceso de biomineralizacion propio de los
osteoblastos.
42
Figura 3. Se muestra las micrografías correspondientes a los cultivos obtenidos, observándose
la morfología tipo mosaico de las células epiteliales.
Figura 4. Se observan las membranas ultradelgadas de quitosano deshidratadas.
43
Figura 5. Se observa mediante microscopia óptica convencional a la izquierda y microscopia
de fluorescencia a la derecha de la figura, a las 48hrs, cultivos de células epiteliales donde se
destacan las células adheridas a la membrana de quitosano al emplear la tinción especifica
nuclear DAPI.
Figura 6. Micrografías de los cultivos tratados con líquido de montaje/DAPI que
revela por inmunofluorescencia la distribución de las células mesenquimales sobre
la superficie de las membranas de quitosano ultradelgado.
44
Figura 7. Micrografías mediante microscopia electrónica que muestran la distribución
de las células mesenquimales sobre la superficie de las membranas de quitosano
ultradelgado.
45
TABLA 1
Evaluación de la adhesión celular de las células epidérmicas sobre la matriz de
quitosano a las 24 y 48 horas de incubación mediante el empleo del kit comercial CellTiter
96R (MTS). Sembradas 6000 células por cultivo. Distribucion según grupo control y
quitosano.
CULTIVO CELULAS ADHERIDAS
24 HORAS
CELULAS ADHERIDAS
48 HORAS (MTS)
CONTROL 5000 1324
QUITOSANO 338 25
Fuente: Hoja de recolección de datos del autor.
46
TABLA 2
Evaluación de la adhesión celular de las células mesenquimales sobre la matriz de
quitosano a las 24 y 48 horas de incubación mediante el empleo del kit comercial CellTiter
96R (MTS) Sembradas 3000 células por cultivo. Distribuidas según grupo control y quitosano.
CULTIVO CELULAS ADHERIDAS
24 HORAS
CELULAS ADHERIDAS
48 HORAS (MTS)
CONTROL 2440 385
QUITOSANO 633 317
Fuente: Hoja de recolección de datos del autor.
