UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD …...AUTORA: DANIELA ALEJANDRA PUGA DURAN TUTOR DE TESIS:...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE ODONTOLOGIA

UNIDAD DE INVESTIGACIÓN, TITULACIÓN Y GRADUACIÓN

“ACTIVIDAD ANTI FÚNGICA: ESTUDIO MICROBIOLÓGICO

COMPARATIVO ENTRE AJOENO Y EL ACEITE ESENCIAL DE HIERBA

LUISA AL 100% SOBRE CEPAS DE CANDIDA ALBICANS”

Proyecto de investigación como requisito para la obtención del grado académico

de Odontóloga

AUTORA: DANIELA ALEJANDRA PUGA DURAN

TUTOR DE TESIS: DR. MARCIO ALEJANDRO FARFAN CHACHA.

Quito, Diciembre del 2015

i

DEDICATORIA

Este trabajo está dedicado a mis papitos que siempre han sido un apoyo incondicional, un

amor verdadero y una guía constante durante toda mi vida, a mis papios que han sido

siempre más que abuelitos, también padres.

ii

AGRADECIMIENTOS

Primero quiero agradecer a mis papas por ser todo en mi vida, las personas más importantes

y mis mejores amigos, a mis papios que siempre están presentes en cada etapa de mi vida,

Mi hermano por ser parte de las alegrías y tristezas. Agradecer a toda mi familia, tíos y primos

porque en este proceso de formación siempre tuvieron una palabra de aliento. Un gracias

muy especial para mi mentora, ya que bajo su guía me enamore de mi profesión mucho antes

de empezarla.

A la Universidad Central Del Ecuador, a la Facultad de Odontología, y a cada uno de los

doctores que no solo me supieron brindar su conocimiento sino también su amistad.

Al Dr. Alejandro Farfán por su guía dedicación y tiempo para poder concretar el presente

estudio. A la Dra. Isabel fierro por su disposición y ayuda

Finalmente no puedo dejar de agradecer a Dios por poner a cada una de estas personas en mi

vida.

iii

AUTORIZACION DE LA AUTORIA INTELECTUAL

iv

INFORME DE APROBACION DEL TUTOR

v

CERTIFICACION DE APROBACION DEL JURADO

vi

TABLAS DE CONTENIDO

DEDICATORIA .................................................................................................................................. i

AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................................... ii

AUTORIZACION DE LA AUTORIA INTELECTUAL ...................................................................iii

INFORME DE APROBACION DEL TUTOR .................................................................................. iv

CERTIFICACION DE APROBACION DEL JURADO .................................................................... v

TABLAS DE CONTENIDO ............................................................................................................... vi

RESUMEN ...........................................................................................................................................x

ABSTRACT ........................................................................................................................................ xi

INTRODUCCION .............................................................................................................................. 1

CAPITULO 1 ...................................................................................................................................... 5

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. ....................................................................... 5

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA............................................................................. 6

1.3 DELIMITACIÓN ESPACIAL Y TEMAPORAL .......................................................... 6

1.4 OBEJTIVOS: ..................................................................................................................... 6

1.4.1 OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 6

1.4.2 OBJETIVO ESPECIFICO ....................................................................................... 6

1.5 HIPOTESIS ....................................................................................................................... 7

1.5.1 GENERAL ................................................................................................................. 7

1.5.2 ESPECIFICAS .......................................................................................................... 7

CAPITULO 2 ...................................................................................................................................... 8

2. MARCO TEORICO ................................................................................................................. 8

2.1 Micología ............................................................................................................................ 8

2.1.1 Micosis ............................................................................................................................ 9

2.1.2.1 Cándida Albicans .................................................................................................... 10

2.1.2.2 Clínica ....................................................................................................................... 10

2.1.2.3 Síntomas ................................................................................................................... 11

2.1.2.4 Patogenia y virulencia ............................................................................................. 11

2.1.2.4.1 Patogenia .............................................................................................................. 11

2.1.2.4.2 Virulencia ............................................................................................................. 12

vii

2.1.2.5 Diagnostico ............................................................................................................... 13

2.1.2.6 Tratamiento/ Agentes Anti fúngicos ...................................................................... 13

2.2 HERBOLARIA ............................................................................................................... 14

2.2.1 Ajoeno ....................................................................................................................... 15

2.2.1.1 Obtención del Ajoeno .............................................................................................. 17

2.2.1.2 Propiedades y usos .................................................................................................. 20

2.2.1.3 Mecanismos De Acción ........................................................................................... 21

2.2.2 Hierba Luisa ............................................................................................................ 22

2.2.2.1 Obtención Del Aceite Esencial De Hierba Luisa .................................................. 23

2.2.2.2 Propiedades y Usos .................................................................................................. 24

2.2.2.3 Mecanismo de accion .............................................................................................. 25

CAPITULO 3 .................................................................................................................................... 27

3.1 Lugar y Tipo de Investigación ........................................................................................ 27

3.1.1 Tipo de Investigación .............................................................................................. 27

3.2 Población del Estudio ...................................................................................................... 27

3.2.1 Universo.................................................................................................................... 27

3.2.2 Tipo de Muestra ...................................................................................................... 27

3.3 Unidades de Estudio ........................................................................................................ 28

3.4 Criterios de Inclusión y Exclusión ..................................................................................... 28

3.4.1 Criterios de Inclusión ................................................................................................ 28

3.4.2 Criterios de Exclusión ............................................................................................... 28

3.5 Operacionalización de Variables ...................................................................................... 29

3.6 Aspectos éticos ................................................................................................................. 29

3.7 Procedimiento y Técnica ................................................................................................. 30

3.7.1 Obtención del Ajoeno .............................................................................................. 30

3.7.2 Obtención del aceite esencial de Hierba Luisa al 100% ...................................... 38

3.7.3 Cepa bacteriana ........................................................................................................... 39

3.7.4 Medios de cultivo ..................................................................................................... 40

3.7.5 Preparación del inoculo .......................................................................................... 41

3.7.6 Siembra .................................................................................................................... 41

3.7.7 Preparación de discos y colocación ........................................................................ 42

3.7.8 Incubación ................................................................................................................ 43

3.7.9 Recolección de Datos ............................................................................................... 43

viii

CAPITULO 4 .................................................................................................................................... 47

4. Resultados. ............................................................................................................................... 47

4.2 Discusión ...................................................................................................................... 51

CAPITULO 5 .................................................................................................................................... 54

5.1 CONCLUSIONES ........................................................................................................... 54

5.2 RECOMENDACIONES ................................................................................................. 55

BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................... 57

ANEXOS ............................................................................................................................................. 61

Índice de anexos

Anexo 1. Ficha técnica de producto

“Cándida Albicans ATCC 10231”

…………………………………………………..62

Anexo 2. Certificación de la elaboración del

“Ajoeno”

…………………………………………………..63

Anexo 3. Hoja de recoleccion datos del

laboratorio clínico de la Facultad de

Ciencias Químicas de la Universidad

Central del Ecuador.

……………………………………………..…..64

Anexo 4. Hoja certificada del Urkund ………………………………………………... 65

Índice de tablas

Tabla 1: valores recolectados ……………………………………………………47

Tabla 1: valores de sendibilidad ……………………………………………………50

Índice de Gráficos

Ilustración 1. Compuestos de azufre extraído de ajo en diversas condiciones …………….. 18

Ilustración 2: Transformación de los principales tiosulfinatos …………….. 19

Ilustración 3: Principales transformaciones de los tiosulfinatos …………….. 19

Ilustración 4: peso de 200gr de ajo …………….. 30

ix

Ilustración 5: ajo triturado …………….. 31

Ilustración 6: 120 ml de aceona …………….. 31

Ilustración 7: 180 ml de agua …………….. 32

Ilustración 8: precipitación en plancha de calentamiento …………….. 32

Ilustración 9: equipo de filtración al vacio …………….. 33

Ilustración 10: proceso de filtrado …………….. 33

Ilustración 11: producto obtenido …………….. 34

Ilustración 12: dilución metanol- agua al 50% …………….. 34

Ilustración 13: adición de pentano al producto …………….. 35

Ilustración 14: producto separado …………….. 35

Ilustración 15: adición del sulfato de amonio …………….. 36

Ilustración 16: separación de productos por diferencia de densidades …………….. 36

Ilustración 17: adición del diclorometano …………….. 37

Ilustración 18: sistema rotavapor …………….. 37

Ilustración 19: técnica de arrastre por vapor de agua …………….. 38

Ilustración 20: cepa ATCC 10231 de Cándida Albicans viable en agar

Saboureaud

…………….. 39

Ilustración 21: cepa ATCC 10231 de Cándida Albicans viable en caldo

nutritivo

…………….. 40

Ilustración 22: medios de cultivo de agar Dextrosa Sabouraud …………….. 40

Ilustración 23: medios de cultivo de agar Dextrosa Sabouraud marcadas …………….. 41

Ilustración 24: siembra de la Cándida …………….. 41

Ilustración 25: impregnación de las sustancias de interés en los discos de

papel

…………….. 42

Ilustración 26: transferencia de los discos de papel …………….. 42

Ilustración 27: cajas peri en la incubadora …………….. 43

Ilustración 28: calibrador de sensibilidad microbiológica …………….. 44

Ilustración 29: cuantificador de colonias de campo oscuro …………….. 44

Ilustración 30: cajas petri, muestras 1, 2, 3,4 …………….. 45

Ilustración 31: cajas Petri, muestras 5, 6, 7,8 …………….. 45

Ilustración 32: cajas Petri, muestras 9,10, 11,12 …………….. 46

Ilustración 33: cajas Petri, muestras 13, 14,15 …………….. 46

x

UNIVERSIDAD CENTRAL DE ECUADOR


“ACTIVIDAD ANTI FÚNGICA: ESTUDIO MICROBIOLÓGICO

COMPARATIVO ENTRE AJOENO Y EL ACEITE ESENCIAL DE HIERBA

LUISA AL 100% SOBRE CEPAS DE CANDIDAALBICANS”

AUTOR: Daniela Alejandra Puga Duran

RESUMEN

Uno de los mayores microorganismos patógenos oportunistas de la cavidad oral es la cándida

Albicans, estudios han demostrado la reciente resistencia que muestra este hongo frente a los

tratamientos farmacológicos convencionales, exponiendo alternativas naturales como

terapéutica. Se realizó un estudio comparativo tomando al aceite esencial de Hierba Luisa

al 100 %t como control positivo para evaluar el efecto anti fúngico del Ajoeno, sobre cepas

puras de cándida Albicans. Se extrajo el Ajoeno bajo la metodología de Soto, V. et-al. (2007).

Usando una cepa ATCC 10231 de Cándida Albicans, previamente activada y se efectúa la

siembra en 15 cajas Petri de agar dextrosa sabouraud, para posteriormente colocar los discos

de papel empapados con las sustancias de interés, se incuba a una temperatura de 35o ± 2o

C. por 72 horas finalisando con la medición de los halos, concluyendo que el efecto

inhibitorio del Ajoeno mostraba un resultado positivo mayor en 1%

PALABRAS CLAVE: AJOENO, HIERBA LUISA, CÁNDIDA ALBICANS, MANN-

WHITNEY

xi

UNIVERSIDAD CENTRAL DE ECUADOR


“ANIFUNGIAL ACTIVITY: COMPARARTIVE MICROBIOLOGICAL

STUDY BETWEEN AJOENE AND LEMONGRASS ESSENTIAL OIL AT 100%

OVER CANDIDA ALBICANS STRAINS”

AUTHOR: Daniela Alejandra Puga Duran

ABSTRACT

One of the most oral pathogenic opportunist microorganism is Candida Albicans. Recent

studies have shown a recently resistance development for conventional alternatives of

treatment for this yeast. Therefore this study shows a natural alternative therapy for the

treatment. We initiate a comparative study using lemon grass essential oil as control group

to evaluate the antifungal effect of Ajoene, over Candida Albicans yeast. The extraction

technique used was the one from Soto, V. et-al. (2007). We purchase a 10231 ATCC Candida

Albicans yeast, earlier activated, then we sow the strain in 15 sabouraud dextrose agar petri

dishes, subsequently we positioned the formerly soaked sterile discs impregnated already with

the involved substances. The samples were incubated at 35o ± 2o C. for over 72h. To ultimate,

the measure the formatted inhibition halo. Concluding that Ajoene shown positive data and

a 1 % major effect.

KEY WORDS: AJOENO, LEMON GRASS, CÁNDIDA ALBICANS, MANN-WHITNEY

1

INTRODUCCION

Zongxin L. et. al (2015) señala a la microbiota oral como uno de los ambientes de mayor

localización microbiológica en el cuerpo humano, los cuales se hallan formado una

comunidad compleja pero que normalmente se encuentra en equilibrio. Liébana J. (2002).

enuncia que dentro de este ambiente se registran más de 200 especies de microorganismos

transitorios y residentes. Siendo el número de residentes alrededor 20 especies destacando

a la Cándida spp. Como uno de los más importantes.

Ceccotti et al. (2007). Afirman que dentro de las especies de Cándida mencionadas “existen

solo 9 patógenas para el hombre: C Albicans, C. Guilliermondii, C Krusei, C Parapsilosi, C.

Tropicalis, C Pseudotropicalis, C. Lustiniae C. Dubliniensis y C Glabrata.” Estas candidiasis

son clasificadas como infecciones oportunistas.

La Cándida Albicans al invadir cavidad oral presentaría sintomatología variable y diferente

causando molestias a los pacientes que la padecen, por lo que el tratamiento ha perseguido

como objetivo disminuir eliminar y controlar al agente causal así como también los signos

y síntomas que esta manifiesta.

Aguirre J. (2002). expone a las candidiasis como el tipo de infección micotica oral más

frecuente, la cual en la mayoría de los pacientes, se produce a partir de un reservorio

endógeno. La patología es compleja y dependerá de factores facilitadores y mecanismos por

parte de la Cándida y del hospedador. En este último existen muchos aspectos que pueden

facilitar el desarrollo de una candidiasis oral, local y sistémica.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ling%20Z%5Bauth%5D

2

Dentro del tratamiento del Cándida Albicans (Sapp, J., Eversole, L. y Wysocki. 2005).

mencionan que la primera alternativa son elementos químicos antimicóticos. Los cuales

producirán su efecto en una o dos semanas. Encontrando a la nistatina como un

medicamento que mayor efecto produce localmente, mermando así la colonización,

asistiendo como tratamiento sistémico, como manifiesta Negroni, M. (2009).

Wen et al. (2011). (citado por Chamba, M. 2015). Manifestó que el uso de la medicina

moderna ha generado resistencia a los medicamentos además de niveles de toxicidad altos en

el organismo, por lo que se ha ahondado en encontrar remedios que puedan sustituir los

fármacos sintéticos brindando nuevas oportunidades terapéuticas a través de la Medicina

Tradicional.

Gracias a estos argumentos podemos aseverar que cierto grupo de personas van a presentar

una mayor tendencia a contraer infecciones de tipo oportunistas. Por lo que es necesario

estudiar varias alternativas de tratamientos, ya sean farmacológicos como de medicina

natural según (Malpartida, 2010). La cual es aprobada y validada por el Organización

Mundial de la Salud OMS.

Basados en el conocimiento rutinario del alivio que causan muchas de las plantas usadas

cotidianamente como el ajo, cebolla, manzanilla, hierba luisa, cedron, café, entre otras, se

procede a la investigación profunda de dichas vegetaciones y sus propiedades.

Las investigaciones derivadas del ajo se remontan a Adetumbi M. et-a1 (1986). Yoshida S.

(1987) y Mahmoud G. (1988). Los cuales son tres de los primeros grupos en interesarse e

investigar los efectos del ajo y sus beneficios para el cuerpo humano, ya que encuentran que

el ajo viene siendo usado de forma empírica por las diferentes comunidades y culturas para

3

la cura de muchas enfermedades, cada una de las investigaciones concluyen individualmente

que dentro de las principales propiedades benéficas del ajo se encontraba el uso de este para

el tratamiento y cura de afecciones cutáneas producida por hongos

Bayam L, Hossain P, Gorji A. (2013). Estudian el posible efecto terapéutico del ajo, en

prevención y control de varias enfermedades encontrando como resultados una fuerte

actividad anti fúngica.

Yoursuf. (2011). (Citado por Bayam, L. et al. 2013). Afirma que muchos de los hongos

incluyendo la Cándida son sensibles al ajo. Así como también estudios posteriores

demostraron una actividad anti fúngica igual con el producto destilado de ajo, el Ajoeno.

Para Bandyopadhyay et al., (2001); Banerjee et al., (2004):

En los últimos 30 años se han realizado numerosos estudios, tanto in vitro como in vivo,

sobre la química y las propiedades farmacológicas del ajo. Actualmente están documentadas

muchas de sus propiedades, entre las que destacan su acción antioxidante, hipolipemiante,

antiaterogénica, antitrombótica, hipotensora, antimicrobiana, anti fúngica, anti

carcinogénica, antitumorogénica e inmunomoduladora. Todas estas propiedades

farmacológicas se atribuyen principalmente a sus componentes azufrados.

En base a estos descubrimientos, Bakhshi et al. (2012). reporta en sus resultados que los

pacientes con estomatitis causada por Cándida Albicans se observaron mejores resultados

usando al ajo como método de curación en comparación con nistatina. Esto evidencia que los

agentes naturales y la medicina natural son también una opción válida de tratamiento.

Dentro de otros estudios el aceite esencial de Hierba Luisa ha confirmado que posee acción

anti fúngica evidente contra varios hongos causantes de infecciones. (Duke J. 1998).

4

secundando, Rojas. et al. (2012). al encontrar que el aceite esencial de Hierba Luisa goza de

propiedades benéficas como: antioxidantes, antiinflamatorias, tranquilizantes, y anti fúngicas

principalmente contra la “Cándida Albicans”.

El presente estudio compara el efecto anti fúngico de estos dos agentes naturales para

demostrar la diferencia o la similitud en cuanto a la eficacia sobre las cepas de Cándida

Albicans. Con el objetivo de que en un estudio posterior estos agentes puedan ser utilizados

de manera individual o conjunta para elaboración y desarrollo de diferentes alternativas

terapéuticas naturales y eficaces para el control y eliminación de esta cepa. O a su vez en la

fabricación de nuevos medicamentos en base a esta investigación.

5

CAPITULO 1

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

Dentro de las enfermedades crónicas, las bucales son las más usuales; la principal productora

de micosis es la Cándida Albicans. Como enuncia, Sapp, J. (2005). “los miembros del genero

están presentes como comensales que se vuelven patógenos cuando tienen lugar una

alteración de la inmunidad del huésped, ya que estas sacan partido de cualquier reducción

del sistema defensivo”.

Por lo que cualquier sujeto esta propenso a contraer una candidiasis, existiendo grupos más

susceptibles a desarrollarla.

Las infecciones por Cándida Albicans, según (Negroni, M. 2009). exhiben cuadros clínicos

diversos y puede observarse más de un tipo de manifestación en un mismo paciente.

Por lo que es de vital importancia considerar varias alternativas para el control y la

eliminación de la cepa, tomando en cuenta que la opción de la medicina tradicional o natural

ofrece grandes resultados en la inhibición de Cándida Albicans.

Dentro de las alternativas se conoce el efecto antifugico de dos opciones considerados como

agentes naturales, el Ajoeno y el aceite esencial de Hierba Luisa al 100%.

Por lo tanto ¿al existir un efecto anti fúngico del Ajoeno y el aceite esencial de Hierba Luisa,

cuál de estos agentes naturales presenta una mayor actividad anti fúngica sobre cepas de

Candida Albicans?

6

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

Cuáles son las principales evidencias del efecto anti fúngico del Ajoeno y el aceite

esencial de Hierba Luisa.

Como reconocer los efectos anti fúngicos del Ajoeno y el aceite esencial de Hierba

Luisa sobre cepas de Cándida Albicans.

Como diferenciar el nivel de eficacia anti fúngica entre el Ajoeno y el aceite esencial

de Hierba Luisa sobre cepas de Cándida Albicans.

1.3 DELIMITACIÓN ESPACIAL Y TEMAPORAL

Nuestro estudio se realizara en la ciudad de Quito. En el Laboratorio De Microbiología De

La Facultad De Ciencias Químicas De La Universidad Central Del Ecuador en el año 2015.

1.4 OBEJTIVOS:

1.4.1 OBJETIVO GENERAL

Comparar la actividad anti fúngica mediante un estudio microbiológico entre el Ajoeno y el

aceite esencial y Hierba Luisa al 100% sobre cepas de Cándida Albicans.

1.4.2 OBJETIVO ESPECIFICO

Evaluar el efecto anti fúngico del Ajoeno y el aceite esencial de Hierba Luisa al 100%,

sobre cepas de Cándida Albicans.

7

Cuantificar los halos de inhibición formados por Ajoeno y el aceite esencial de

Hierba Luisa al 100% frente a cepas de Cándida Albicans. En un cultivo bacteriano

en 72 h.

Comparar mediante la medición de los halos de inhibición formados en el cultivo el

efecto anti fúngico producido por el Ajoeno y el aceite esencial de Hierba Luisa al

100%, sobre cepas de Cándida Albicans

1.5 HIPOTESIS

1.5.1 GENERAL

El Ajoeno y el aceite esencial de Hierba Luisa al 100% presentan propiedades anti fúngicas

equivalentes sobre cepas de Cándida Albicans.

1.5.2 ESPECIFICAS

El efecto antifungico del Ajoeno es una opción válida de tratamiento para Cándida

Albicans

Al cuantificar los halos de inhibición formados por el Ajoeno, este tiene mayor efecto

antifungico que los formados por la Hierba Luisa

Al comparar la medición de los halos de inhibición formados en el cultivo, el efecto

antifungico producido por el Ajoeno es mayor al de la Hierba Luisa

8

CAPITULO 2

2. MARCO TEORICO

2.1 Micología

La micología se encarga del estudio de los hongos tanto en su estructura, función y

características.

Negroni, M. (2009). Afirma que eran considerados vegetales inferiores pero hoy por hoy se

los categoriza como parte del reino fungí o eumyvota del dominio eukarya.

(Jawetz, Melnick y Adelberg. 2010) definen a los hongos como organismos eucariotas

poseyendo al menos un núcleo y una membrana nuclear, también retículo endoplásmico,

mitocondrias y aparato secretor. Varios son aerobios facultativos, quimiótrofos, secretores

de enzimas los cuales se encargan de degradar varios sustratos orgánicos en nutrientes

solubles para posteriormente ser absorbidos pasivamente o integrados a la célula por

transporte activo

Montoya, H. (2008). Por su parte expresa que los hongos “obtienen su alimento en forma

soluble, incorporándolo a través de la membrana plasmática de una manera similar a las

células procariotas, poseen una gruesa pared celular constituida por polisacáridos

sencillos… pueden encontrarse en dos tipos, las levaduras unicelulares y los mohos

pluricelulares. Las levaduras se reproducen por gemación crecen y se reproducen más

rápidamente que los mohos, mientras que los mohos tiene un crecimiento ramificado, micelio

formado por filamentos individuales”

Existen diferentes tipos de hongos, entre estos existen aquellos que son de beneficio para los

humanos y animales como aquellos destinados a la degradación de alimentos y materiales

9

orgánicos, por otro lado tenemos también las especies patógenas, las cuales son las

responsables de causar en el individuo signos y síntomas característicos de las micosis.

2.1.1 Micosis

Las micosis en si se refieren a las infecciones producidas por los hongos, (Jawetz. et al,

2010). Enuncia que las micosis más prevalentes, son la candidiasis y las dermatofitosis,

producidas por hongos que forman parte de la flora microbiana habitual o que han generado

mecanismos de adaptación. (Liébana, J. 2002). Al tratar el tema de las micosis expone que

la colectividad de las infecciones micoticas en cavidad oral están producidas por levaduras

del género Cándida, primariamente por la especie C. Albicans.

2.1.2 Candidiasis y Cándida

Según lo enunciado por (Sapp J. 2006). la palabra Candidiasis es un término que incluye

muchas formas clínicas de infección por los miembros de genero Cándida, los cuales también

se los identifica bajo el nombre de << candidosis>> y <<moniliais>>. Siendo parte de la

flora habitual de piel, vías gastrointestinales y mucosas algunas especies de Cándida crean

colonias en la superficie de mucosas por lo que existe el riesgo de padecer una infección

endógena. (Jawetz et al. 2010).

Liébana (2002). Identifica que el género Cándida comprende más de 150 especies de

levaduras pero C. Albicans es el agente implicado más frecuentemente en la candidiasis oral.

Siendo las infecciones producto de una sobrepoblación de microorganismos oportunistas en

ausencia de la micro flora competitiva, según (Ingraham, L. 1998). Mientras que Raspall, G.

(2005). Atribuye a los factores locales o sistémicos como los benefactores para la infección

10

por Cándida dentro de los que se encuentran injurias de la piel, embarazo, diabetes o el

tratamiento con corticoides o antibióticos de amplio espectro. (Ingrham J, 1998) menciona

también que los grupos más susceptibles a contraer una candidiasis son los niños y las

personas de edad avanzada así como también las personas que padecen de inmunodeficiencia.

2.1.2.1 Cándida Albicans

Negroni, M. (2009). Explica que la “Cándida Albicans se ubica entre los deuteromicetes,

dentro de la familia cryptococcaceae, se la encuentra en muchos ambientes pero es

interesante recordar que forma parte de la microbiota oral accesoria y complementaria”

Mientras que Sapp J. (2006). Enuncia que la Cándida Albicans puede presentarse en “forma

de levadura (espora), levadura con psuedohifas o en forma de largas hifas tabicadas y

ramificas, estas están presentes cuando se aísla los microorganismos a partir de procesos

infecciosos”.

2.1.2.2 Clínica

Raspall, G. (2002). Describe que la candidiasis se presenta en forma de placas blancas

adherentes y confluentes y suelen hallarse en toda la mucosa siendo dolorosas y pudiendo

llegar hasta faringe.

Mientras que la sintomatología clínica que expone, Sapp, J. (2006). Señala, que la infección

puede manifestar algunas formas clínicas pudiendo ser estas blancas de fácil remoción, otras

11

por el contrario poseen una apariencia rojo brillante, producida por la atrofia y erosión del

epitelio o a su vez por la inflamación aguda del tejido conjuntivo subyacente.

Cawson, R.A. (2009). Por otro lado propone como sintomatología clínica común la

formación de “placas color crema friables y blandas sobre la mucosa, la característica

definitiva es que pueden ser fácilmente deprendidas y dejar expuesta una mucosa eritematosa.

Su extensión varía desde pequeños flecos aislados a pacas confluentes diseminadas”

Otras manifestaciones que provoca la Cándida son las gingivitis evidentes algunas de aspecto

hipertróficos ubicadas en mucosa adherida, también existen atrofias y otros cuadros

psuedomembranosos, hiperplasicos y leucoplasiforme, produce también diferentes tipos de

glositis, queilitis con características descamativas costrosas. (Negroni, M. 2009)

2.1.2.3 Síntomas

Negroni M. (2009). Describe como sintomatología “ardor, pirosis, dolor, perdida del gusto,

disgeusia, sequedad y dificultad para alimentarse. Aunque también existen casos en los que

el paciente es asintomático”.

2.1.2.4 Patogenia y virulencia

2.1.2.4.1 Patogenia

Jawetz, M. et al. (2010). Manifiesta que la candidiasis surge por un aumento en el numero

habitual de células de Cándida más el daño epitelial que favorece a la colonización local por

las levaduras y las psudohifas”.

12

Liébana (2002). Por otro lado atribuye que:

Depende tanto de la alteración de los mecanismos defensivos de la persona colonizada como

del complejo esencial de factores de virulencia del hongo. La protección adecuada del ser

humano frente a Cándida depende de mecanismos específicos humorales y celulares. Las

defensas primarias son: a) la barrera física epitelial b) un péptido antimicrobiano lingual c)

IgA secretora d) diferentes factores salivales e) flujo de arrastre de saliva… Entre los factores

que facilitan la infección candidiasica destacan a) la cantidad y el tipo de saliva b) la dieta c)

pH, d) la temperatura e) la presencia de algunas bacterias o de prótesis dental f) el tratamiento

antibiótico y g) los cortico esteroides y cualquier tipo de inmunodepresión primaria o

adquirida.

2.1.2.4.2 Virulencia

Liébana (2002). En su texto asegura que la virulencia que presenta Cándida Albicans se debe

principiante a su destreza para eludir los mecanismos de defensa del hospedero o la

resistencia que presenta frente a los anti fúngicos, la cual también aumenta cuando lesiona

las células y tejidos que invade. Negroni M. (2009). Por otro lado manifestó que la capacidad

de adherencia es el mayor factor de virulencia de este hongo, esto lo logra a través de

características químicas y estructurales de la pared celular, siendo una nano proteína la

responsable de la adherencia, la pared está recubierta por una capa fibrilar.

Así también existen otros factores como el trigmotropismo, mediante el cual la Cándida

busca nutrientes en la profundidad de los tejidos invadiéndolos, efecto demostrado por

Sherwood.

13

Liébana (2002). Enuncia que “Los factores de virulencia están controlados por genes que

se expresan en un número determinado y en un momento concreto, determinan así el fenotipo

y la virulencia del hongo”

2.1.2.5 Diagnostico

Para el diagnostico de Cándida Albicans, Jawetz M. et al. (2010). propone cuatro

alternativas, las cuales incluyen a) muestra, la cual consiste en obtenerlas a través de

raspaduras de lesiones superficiales. B) examen microscópico a través de pruebas Gram

donde se teñirá el microorganismo en cuestión a través del raspado de la muestra, al cual se

le prepara para después transportar a una lamilla portaobjetos c) cultivo, los cuales serán

sembrados en medios óptimos para hongos y d) serología, pero esta no es recomendable para

Cándida ya que no existen criterios nítidos para confirmar su presencia, por otro lado

Negroni, M. (2009) propone que el mejor diagnóstico para Cándida Albicans es a través de

métodos directos, considerados así exámenes microscópicos cultivos e identificación.

2.1.2.6 Tratamiento/ Agentes Anti fúngicos

Dentro del tratamiento para Cándida Albicans (Cawson, R.A. 2009). Enuncia que los

tratamientos tópicos con nistatina o conanfotericina van a dar resultados pero que, sin

embargo este tratamiento presenta inconvenientes con los portadores de prótesis. Negroni,

M. (2009). Por su lado asevera que lo primero es controlar o corregir las causas o factores

predisponentes para después dar una terapéutica apropiada usando antimicóticos, y vuelve a

14

reiterar el uso local de la nistatina y los azolicos por vía digestiva. Jawetz M. et al. (2010).

así mismo indica la nistatina como tratamiento anti fúngico tópico, menciona también al

cetoconazol y fluconazol por vía oral. Sin embargo (Espinoza, 2009). Expone que la nistatina

tiene efectos bastantes tóxicos a nivel sistémico, por eso es recomendable solo su uso local.

Tomado en cuenta las restricciones adecuadas, por otro lado (Gómez, C. et al 2010) certifica

la resistencia de la Cándida Albicans frente al fluconazol, demostrando que Cándida spp. Va

aumentando la prevalencia en pacientes hospitalizados. Los cuales al ser tratados con

fluconazol no muestran recuperación por lo que se la define como un tipo de resistencia

adquirida, esto se seria consecuencia del uso indeliberado de azoles.

2.2 HERBOLARIA

Lozoya, X. (1997). Define a la herbolaria como la tradición de usar Hierbas medicinales para

curar enfermedades o preservar la salud, coleccionando conocimientos de ámbito religioso,

medico, científico o cultural teniendo en cuenta que las Hierbas medicinales son un recurso

natural y de libre adquisición. Denotando también que esta es una costumbre de antaño la

cual a pesar de la evolución de la medicina sigue difundiéndose a través de la oralidad

generacional.

Por otro lado Hoffman, P. (2005). Indica que para obtener el mayor provecho de las plantas

estas deben recolectarse en su plena madures y cuando ya hayan florecido, ya que la manera

de cosecharlas influye en su frescura posterior.

Vernat, V. y Cañigeral, S. (2003). Consideran que muchos casos, la actividad farmacológica

de una planta radica en una sola parte de la misma, como raíces, flores o cortezas sin embargo

15

en lo que fitoterapia o herbolaria se denomina, depende de varios principios activos y no solo

de uno aislado, ya que existen sinergismos y acciones coadyuvantes entre ellos por lo que

concluyen que es mejor usar toda la plata.

Mencionan también que dentro de la herbolaria la rama de la farmacognosia se encarga del

estudio de las partes activas de un vegetal, “siendo los principios activos aquellas sustancias

de composición química establecida, las responsables de farmacológica de estas drogas” las

cuales contribuyen con la terapéutica de una enfermedad.

Para concluir Fernández, T. (2000). Afirma que la integración de la medicina natural y la

medicina química deber ser integradas para el tratamiento de pacientes, ya que la naturaleza

nos ha brindado un abanico de posibilidades para la terapéutica.

2.2.1 Ajoeno

El género Allium (del latín oloroso), es conocido por que la principal característica de este

es el olor fuerte que tienen, contiene más de 300 especies, entre ellas el allium sativun (ajo).

Bajaj, Y. (1997). Señala al ajo como parte de la especies liliceas, cuyo bulbo caracteriza el

olor fuerte y penetrante, el cual es usado para motivos médico.

Esta mata viene siendo utilizada desde tiempos remotos y por diversas civilizaciones en

muchas preparaciones medicinales así como para rituales religiosos y pociones mágicas

(Ledezma, E. y Apitz Catro, R. 2006.)

Es originaria de Asia central y territorios de Rusia, ahora es cultivada en varios países por el

conocimiento de los grandes beneficios que posee.

16

Con Wertheir en 1844 comienza el interés por el estudio de las propiedades del ajo,

encontrando que el compuesto alilo es el que le da la característica olorosa penetrante, con

los años Cavallito es quien en 1945 describe a la Alicina derivada de la acción enzimática de

la Aliinaza.

En la investigación de Díaz L. (2003) comenta:

El principio activo del ajo es la alicina la cual se obtiene de la ruptura de células del ajo, “

En su producción interviene una enzima denominada aliinasa la cual cataliza la aliina en

alicina, a continuación la alicina sufre una descomposición rápida hacia compuestos

sulfurosos solubles en aceite tales como sulfuro dialico, di sulfuro dialico y tri sulfuro di

alico. La alicina también se da en proceso de destilación.

(Ledezma, E. y Apitz Catro, R. 2006.) En 1983 “reportan el descubrimiento de una nueva

molécula en extractos alcohólicos del ajo, poseedora de una potente actividad anti

plaquetaria, posteriormente esta molécula seria sintetizada en 1986 y se lo conocería con el

nombre de ajoene” (Ajoeno en habla hispana). La mezcla de 3 moléculas de alicina originan

dos moléculas de Ajoeno: cis y trans.

En los estudios realizados por Susumu, Y. et al (1887), relata que el Ajoeno tiene un gran

potencial anti fúngico, inhibiendo el crecimiento de los fungí, actuando sobre la pared

celular. Su experimentación se basó en cepas de Cándida Albicans. Así también demostró

que el Ajoeno tuvo gran efecto inhibitorio sobre C. Tropicalis, Trichophyton

Mentagrophyles, Tricosporon Beigelii Y Saccharomyces Cerevisiae.

17

2.2.1.1 Obtención del Ajoeno

Bravo, L. (2006) indica que los principios activos del ajo son azufrados, como la aliina, la

cual por acción de la alinasa se convierte en alicina, la cual se descompone rápidamente por

su inestabilidad produciendo:

Sulfuros volátiles: principalmente di sulfuro de dialilo, sustancias oleosas bastante

estables responsables del sabor y olor del ajo

Ajoenos: en los que se encuentra el z como el e-Ajoeno y sus derivados metil Ajoeno

y dimetil Ajoeno

Otros compuestos: heterosidos azufrados lectinas y alixina.

Susumu, Y. et al. (1987) alude que el Ajoeno va a resultar de la destilación de vapor de

alicina. Munayco, E. (2011). Mensiona que Wertheim mediante el proceso mencionado antes

obtuvo un aceite olor a acre del bulbo de ajo. El cual propuso como nombre del compuesto:

alilo, al hidrocarburo contenido en el aceite. Por otro lado Semmler (2011). Obtiene de la

misma manera un destilado con propiedades antimicrobianas y posteriormente, Cavallito y

Bailey hicieron estudios sobre diferentes métodos de extracción aislando el di sulfuro de

dialilo, la alicina y su precursor la aliina y determinaron que la mayoría de efectos

antimicrobianos aparecen en alcohol etílico.

18

Ilustración 1. Compuestos de azufre extraído de ajo en diversas condiciones

Munayco E. 2011

Como se mencionó anteriormente La alicina se descompone rápidamente y produce dióxido

de azufre, alcohol alico trisulfuro de dimetil, mono di tri sulfuro de dialino y di tri sulfuro de

metilalilo.

Otros compuestos se obtienen a partir de ajo por las vías de degradación varían, dependiendo

del entorno en el que el extracto existe, por ejemplo, Ajoeno y vinilditiínas también han sido

aislados.

19

Ilustración 2: Transformación de los principales tiosulfinatos

Munayco E. 2011

Ilustración 3: Principales transformaciones de los tiosulfinatos

Cordova M. 2010

20

“ En presencia de un medio alcohólico se encuentra el di tri, y tetra sulfuro de dialilo, así

como también el tri sulfuro de metilalilo, los derivados cíclicos, 2-vinil-2,4- dihidr-1,3 ditina

y 3 vinil-3-4- dihidr-1,-2 ditina y los dos isómeros geométricos del 4,5,9 triadoteca-

1,6,11triene9 oxido o AJOENO” (Ledezma, E. y Apiz Castro, R. 2006), derivado de la

unión de 3 moleculas de alicina.

A partir de la alicina a través de la ruta de eliminación de cope el cual nos permite obtener

“alquenos a partir de amidas terciarias, firmando un N.oxido de amina que por calentamiento

elimina de forma intramolecular, originando el alqueno”. Fernandez, G. (2014), asi se origina

el ácido 2 propenil sulfenico y la tioacroleina el cual inicia una serie de reacciones de

condensación con alicina para originar el disulfuro de alilo que en unión con el propenil

sulfenico, origina el Ajoeno en sus dos formas isomericas (Ledezma, E. y Apiz Castro, R.

2006).

2.2.1.2 Propiedades y usos

Desde tiempos remotos se le atribuye al ajo varias propiedades medicinales, dentro de la

historia el ajo se distribuía entre los esclavos que construían las pirámides para evitar

enfermedades.

Leyla B. et al (2013) menciona los efectos sobre enfermedades cardiacas, diabetes mellitus,

enuncia también que posee un efecto anti tumoral, anti fúngico, anti bacteriológico, anti

protozooico, antiviral y un efecto químico inducido de hepatotoxicicidad.

21

Bravo L. (2006) describe como propiedades del ajo la característica de inhibir la síntesis de

colesterol, reducir la presión arterial, inhibir la agregación plaquetaria por lo que se le otorga

actividad antitrombotica, todas estas propiedades son atribuidas principalmente a los

Ajoenos así como también se les atribuye las propiedades anti fúngicas y antibacterianas.

2.2.1.3 Mecanismos De Acción

El Ajoeno es considerado como un agente que posee varios sitios de acción produciendo

varios efectos y reacciones en la célula, por lo que su expresión sobre el patógeno se

evidenciaran tempranamente, Susumu, Y. et al. (1987). asegura que la célula presentara

cambios en su morfología, menciona la desaparición de varios ornamentos de la superficie

celular y destrucción de organelos celulares y ensanchamiento de la pared celular,

demostrando asi la destrucción de la misma. Por otro lado Gonzales, et al. (1998). da un

enfoque más profundo de la acción que tiene el Ajoeno sobre la membrana celular del hongo,

menciona que existe una alteración a nivel de los fosfolípidos y ácidos grasos encontrados a

nivel de membrana, produciendo la disminución de la fosfatildilcolina y a su vez el aumento

de fosfatiletanolamina, al producir este desequilibrio la célula sufre deterioro. Años después

(Ledezma, E. y Apiz Castro, R. 2006). Explican de manera más profunda este mecanismo, e

indican además otros principales del Ajoeno como:

1. La inhibición de la biosíntesis de fosfatildilcolina

2. Presenta un desorden a nivel de los fosfolípidos de la membrana, produciendo que

las cadenas hidrocarbonadas tengas mayor fluidez, sin embargo esto no altera ni la

estructura de dicha membrana ni tampoco la superficie hidrófila de la mismas

22

3. Existe una enzima llamada glutatión reductasa, la cual está encargada de disminuir

la carga oxidativa producida por la aparición de radicales libres producidas el

momento del metabolismo celular, sin esta enzima conseguiremos un desequilibrio

y este conducirá a su vez a la lisis celular

4. Va a intervenir en las funciones de adhesión entre el huésped y el patógeno, en

receptores celulares de superficie, transductores de señalización celular entre otras ,

esto se dará a través de la reacción que presenta con los grupos sulfhidros que se

originan de los residuos de cisteína, producto de proteínas de membrana.

2.2.2 Hierba Luisa

Dentro de muchos países y diversas culturas el uso de plantas medicinales y aromáticas toma

importancia en el desarrollo de la medicina alternativa.

Opeyemi, A. et al (2015). Expresa que planta es bastante resiste por lo que tiene la habilidad

de crecer en climas moderados así como también en ambientes extremadamente hostiles,

puede crecer tanto en climas tropicales y subtropicales, en regiones de Asia, África y

América. Ekpenyong, C. Akpan, E. y Nyoh, A. (2015). Indica que las características

principales de esta planta y su valor ha sido grabada a través de la historia y es de la

preferencia de muchos el momento de un tratamiento natural por su sabor a limón, olor y

color agradable. La Hierba Luisa pertenece a la familia de las “gramineae” que son conocidas

fundamentalmente por su contenido oleoso. Los cuales en su mayoría han sido usado como

agentes cosméticos en perfumería y en usos farmacéuticos, también misionan su valor

nutricional (Opeyemi A. et al 2015). Por otro lado Duke J. (1998) comenta que esta planta

23

ha sido señalada por varios científicos como anti fúngica significativa contra varios hongos

especialmente aquellos que producen infecciones.

Esta planta es conocida a nivel mundial, identificada especialmente x todas sus propiedades

curativas las cuales han sido usadas para la medicina natural especialmente se la denomina

“Hierba Luisa, caña santa, te limón, citronela” y miden aproximadamente “1” m de y “5 a

15” mm de ancho. (Rojas.et al. 2012)

2.2.2.1 Obtención Del Aceite Esencial De Hierba Luisa

El aceite esencial de Hierba Luisa es extraído mediante destilación de las hojas ya estén estas

en estado fresco o seco, la destilación nos da como resultado la obtención de aceites

esenciales más hidrosoles y agua aromática. Estos compuestos son los poseedores de las

características antibacterianas, anti fúngicas analgésicas y repeledoras antes indicadas.

Mohamed, N. et al (2014). Ekpenyong, C. et al. (2015). en su estudio encuentra la presencia

de saponinas, taninos, antraquinonas, flavonoides, fenoles y alcaloides así como también

terpenos, aldehidos alcoholes y esteres. Sin embargo la investigación más adelante muestra

la detección de otros compuestos como mirceno, geraniol, limoeno, burneol,citronelolo,

nerol, alfa-terpineol, elemicina, catecolaminaluteolina y 6c-7c glicosidos, ácido cafeico,

apigenina, luteolina entre otros. De manera más general (Opeyemi A. et al 2015). Sugiere

que los principales compuestos del aceite esencial se dividen en 4 grandes grupos: los

alcaloides, los flavonoides, los terpenoides del cymbopogon (Hierba Luisa), dentro de estos

se divide en los terpenoies volátiles y no volátiles y por último grupo están los taninos.

24

Ekpenyong, C. et al. (2015) también acota que el aceite esencial “está compuesto por

electrolitos y minerales (Na, K, Ca, Cu, Mg, Mn, Se, P, Fe y Zn) vitaminas (folato, niacina,

piridoxina, riboflamina y vitaminas de la A la E) macronutrientes (carbohidratos y proteínas),

es por esto que existe un margen amplio de acciones terapéuticas”.

Ekpenyong, C. et al (2015) explica también el proceso farmacocinético del aceite esencial

de Hierba Luisa: la absorción se realiza ya sea por vía oral, pulmonar o cutánea; su

metabolismo es a través de riñón y la secreción, se realiza a nivel renal o mediante la

eliminación de Co2.

2.2.2.2 Propiedades y Usos

Fernández, et al (2001) citado por Chamba L. (2015). Argumenta que el uso de la medicina

alternativa y de plantas medicinales puede ser una opción para reemplazar el tratamiento

químico de las patologías actuales, ya que presentan las mismas características inhibitorias

y terapéuticas a un costo menor, aludiendo también que el uso de alternativas naturales

causarían menores efectos adversos. Mohamed, N. et al. (2014). También menciona que

dentro de las actividades más indicadas de la Hierba Luisa están sus propiedades

antiinflamatorias, anti fúngicas analgésicas, así como también su uso en infecciones

bacterianas, fúngicas dolores intestinales y odontalgias , las investigaciones de (Opeyemi, A.

et al 2015). También señalan sus usos como repelente de insectos, insecticida, como

suplemento en el control de la gripe y como analgésico, mientras que los estudios de

Ekpenyong, C. et al. (2015) revelan otras características curativas como el control del estrés,

25

resfriados, fiebres y manejando la artritis. También como los demás considera importante el

efecto antibacteriano anti fúngico antiinflamatorio y aumenta también propiedades como

actividad anti protozoaria antioxidante, de protección cardiaca, antitusígena, antiséptica y

anti reumática, también nombra su uso en tratamientos anti agregación plaquetaria el

tratamiento de diabetes ansiedad malaria y neumonía.

Su uso también se encuentra enfocado en la preservación y confección de alimentos.

2.2.2.3 Mecanismo de accion

El mecanismo de acción para Ekpenyong, C. et al. (2015) es:

La actividad anti fúngica que presenta el aceite esencial de Hierba Luisa puede ser retribuida

a la presencia de un sin número de constituyentes incluyendo: citral, beta mirceno, linalol y

geraniol asi mismo cometa que el linalool es el que provoca la reducción de tamaño por parte

de la célula, así como también una germinación anómala del hongo. Por lo que esta actividad

va a llevar a una clara inhibición de la CándidaAlbicans, tanto en su formación como en

células ya formadas, esta actividad ha sido también registrada para otras cepas como

dermatofitos como Trychopyton Metagrophytes, Trichophyton Rubrum Aspergillus

Fumigatus, Espidemophyton Floccosum Y Microsporum Gypseum.

En base a este estudio Ekpenyong, C. et al. (2015) señala que existen otros componentes en

el aceite como los aldehídos cinámicos, el citral, geraniol, eugenol y menthol los cuales

poseen y reflejan gran actividad antimicrobiana.

Expone que el linalol es el compuesto con mayor actividad antibiótica, mientras que el citral

y geranol son los compuestos que poseen la mayor actividad anti fúngica

26

Los aceites esenciales parecen no tener células blanco específicas, por la variedad de sus

componentes, siendo esto es beneficioso ya que existe poca probabilidad de que la célula

desarrolle resistencia. Al ser liposolubles pasan por la pared y membrana celular

desorganizando su estructura, por otro lado también producen la coagulación del citoplasma

y dañando lípidos y proteínas, este daño producido a nivel de membrana conduce a un

derrame de macromoléculas y como resultado producirá la muerte celular.

27

CAPITULO 3

3.1 Lugar y Tipo de Investigación

La presente investigación se realizó en la Universidad Central del Ecuador en los laboratorios

de la Facultad de Química, en el mes de julio del presente año.

3.1.1 Tipo de Investigación

Experimental: se realizó bajo un ambiente controlado y se observó la acción anti

fúngica de los agentes naturales para determinar resultados en el lapso de 72 h.

Comparativo: se evaluó el efecto anti fúngico de dos agentes naturales, Ajoeno y

aceite esencial de Hierba Luisa al 100% contra cepas de Cándida Albicans.

Transversal: el presente estudio se desarrolló en aproximadamente 2 semanas del mes

de julio del presente año.

3.2 Población del Estudio

3.2.1 Universo

El efecto anti fúngico de los agentes Ajoeno y aceite esencial de Hierba Luisa se valoró a

través de la reacción que mostraron las cepas de Cándida Albicans, hongos oportunistas

pertenecientes a la flora bucal normal

3.2.2 Tipo de Muestra

Se aplicó selección aleatoria no probabilística por conveniencia.

28

3.3 Unidades de Estudio

Se empleó Ajoeno como grupo experimental y el aceite esencial de Hierba Luisa al 100%

como grupo positivo para comparación, y se trabajó con cepas de Cándida Albicans ATCC

10231 obtenidos a través de SAFEM LAB-“SOLUCIONES MICROBIOLÓGICAS”

3.4 Criterios de Inclusión y Exclusión

3.4.1 Criterios de Inclusión

Cepas puras de Cándida Albicans sin contacto con contaminantes ni fármacos

Ajoeno, destilado del ajo obtenido en el laboratorio de Química de la Universidad

Central del Ecuador

Aceite esencial de Hierba Luisa exclusivamente al 100%, donado por el Dr. Wilfrido

Palacios

3.4.2 Criterios de Exclusión

Cepas de hongos no pertenecientes a Cándida

Otro derivado del ajo diferente al Ajoeno

Aceite esencial de Hierba Luisa que difiera de la concentración del 100%

29

3.5 Operacionalización de Variables

Variable Conceptualización Dimensiones Indicador Valor

Dep

end

ien

te

Ajo

eno

Destilado del ajo en

medio cetónico con

la capacidad de

inhibir el

crecimientos de hongos

Cuantitativa Halos de

inhibición En

milímetros

Cualitativa Halos de

inhibición

Nula (-)

Sensible (+)

Muy sensible

(++)

Sumamente

sensible

(+++)

Ace

ite

esen

cial

de

Hie

rba

Lu

isa

al

100%

Producto natural

derivado de la

Hierba Luisa capaz

de impedir el

crecimiento fúngico

Cuantitativa Halos de

inhibición En

milímetros

Cualitativa Halos de

inhibición

Nula (-)

Sensible (+)

Muy sensible

(++)

Sumamente

sensible

(+++)

Ind

epen

die

nte

Cán

did

a

Alb

ican

s

Hongo oportunista

de cavidad oral

responsable de micosis

Cuantitativa Crecimiento

bacteriano

Crecimiento

bacteriano turbidez

3.6 Aspectos éticos

La actual tesis, al ser un estudio microbiológico experimental in vitro no requirió ser

sometido al comité de ética de Universidad Central del Ecuador

30

3.7 Procedimiento y Técnica

3.7.1 Obtención del Ajoeno

Para la elaboración del Ajoeno se utilizó la técnica mencionada por Soto, V. et-al. (2007).

Quien a su vez cita a Block et al. 1989. Para esta fase experimental se requiero de 200 gr. de

dientes de ajo. (Ilustración 4.)

Ilustración 4: peso de 200gr de ajo

FUENTE: Laboratorio de Nanotecnología de la Facultad de Posgrado de Química de la Universidad Central del Ecuador

ELABORADO: Autor, Daniela Puga Durán

Los dientes de ajo una vez ya pesados fueron triturados con la ayuda de un procesador

eléctrico de alimentos para de esta manera obtener la alicina. (Ilustración 5.)

31

Ilustración 5: ajo triturado



A continuación se procedió con la técnica citada previamente para la obtención del ajeno.

Soto, V. et-al. (2007). Quien a su vez cita a Block et al. 1989. Manifiesta que hay q disolver

la alicina cruda en acetona-agua al 40 %. Usando 120 ml de acetona (Ilustración 6.) Y 180

ml de agua. (Ilustración 7.)

Ilustración 6: 120 ml de aceona



32

Ilustración 7: 180 ml de agua



Se procedió a mezclar la alicina obtenida con la solución mencionada y se dejó reposar en

una plancha de calentamiento con magneto, para que este al ponerse a girar, provoque la

precipitación del contenido (ilustración 8.), en una temperatura de 60o -70o por 4 horas.

Ilustración 8: precipitación en plancha de calentamiento



33

El siguiente paso fue realizado mediante el equipo de filtración al vacío. (Ilustración 9.)

Ilustración 9: equipo de filtración al vacio



Proceso de filtración. (Ilustración 10.)

Ilustración 10: proceso de filtrado



Producto obtenido. (Ilustración 11.)

34

Ilustración 11: producto obtenido



El siguiente paso realizado fue disolver la solución con metanol- agua al 50% (ilustración

12.), y a esta mezcla, se le agrega pentano. (Ilustración 13.).

Ilustración 12: dilución metanol- agua al 50%



35

Ilustración 13: adición de pentano al producto



Se deja reposar la mezcla por un periodo de 12 horas hasta q haya la completa separación de

los productos (ilustración 14). Al resultado obtenido se le agrega el sulfato de amonio

(ilustración 15.) y se espera un aproximado de 36 horas para q este se separe por diferencia

de densidades (ilustración 16.)

Ilustración 14: producto separado



36

Ilustración 15: adición del sulfato de amonio



Ilustración 16: separación de productos por diferencia de densidades



37

Una vez separada la mezcla se le agrega el diclorometano.(figura 17.)

Ilustración 17: adición del diclorometano



El paso final es la extracción del diclorometano de la muestra a través del sistema rota vapor,

para obtener la concentración del Ajoeno. (figura 18.)

Ilustración 18: sistema rotavapor



38

3.7.2 Obtención del aceite esencial de Hierba Luisa al 100%

El aceite esencial de Hierba Luisa fue donado por el Dr. Wilfrido Palacios, el cual provino

de una investigación precedente, el “efecto antifúngico del aceite esencial del origanum

vulgare (orégano) y cymbopogon citratus (hierba luisa), sobre cepas de cándida albicans en

comparación con la nistatina estudio invitro” cuyo autor fue Chamba, L. en el año 2015. Esta

muestra fue conservada en un ambiente adecuado parecido al que describe Sonker, N. et-al

(2014), hasta el momento de su uso; Sin embargo el método que se usa para la obtención de

dicho producto es mediante la técnica de arrastre por vapor de agua. “Esta técnica es una de

las más conocidas para obtener los aceites esenciales de diversos tipos de plantas

medicinales” Chamba L. (2015). El arrastre por vapor de agua se fundamenta en principio de

arrastre del aceite por acción del vapor proveniente de una fuente de agua, la cual estará

siendo contantemente calentada, y este producto pasara por medio de refrigerantes de vidrio

y será condensada. Este producto por diferencia de densidades mostrara la disociación del

agua y el aceite. Como se muestra en la imagen ejemplo usando otra yerba medicinal en ese

caso menta. (Ilustración 19.)

Ilustración 19: técnica de arrastre por vapor de agua

ELABORADO: tomado de https://esperanza96.wordpress.com/2012/04/29/destilacion/

https://esperanza96.wordpress.com/2012/04/29/destilacion/

39

3.7.3 Cepa bacteriana

La cepa de Cándida Albicans ATCC 10231 fue adquirida a través de “SAFEM LAB-

SOLUCUONES MICROBIOLOGICAS” a través del proveedor nacional

MICROBIOLOGICSTM el cual fue revitalizado en caldo TBS por 48h. A 35o C. Para

posteriormente ser sembrado en agar saboureaud suplementado con gentamicina,

posteriormente se realiza un paso subsecuente en caldo de cultivo y agar Saboureaud. El

producto entregado es una cepa ATCC 10231 de Cándida Albicans viable en agar

Saboureaud (Ilustración 20). y en caldo nutritivo, (Ilustración 21.) la cual después de 72

horas estuvo en su fase logarítmica ideal para su uso.

Ilustración 20: cepa ATCC 10231 de Cándida Albicans viable en agar Saboureaud

FUENTE: Laboratorio clínico de la Facultad de Química de la Universidad Central del Ecuador


40

Ilustración 21: cepa ATCC 10231 de Cándida Albicans viable en caldo nutritivo



3.7.4 Medios de cultivo

Los medios de cultivo de agar Dextrosa Sabouraud fueron ya entregados listos para la fase

experimental por parte del laboratorio clínico de la Facultad de Química de la Universidad

Central del Ecuador. (Ilustración 22.), las cuales fueron señaladas en su parte posterior con

las letras A para Ajoeno y H para Hierba Luisa. (Ilustración 23.)

Ilustración 22: medios de cultivo de agar Dextrosa Sabouraud



41

Ilustración 23: medios de cultivo de agar Dextrosa Sabouraud marcadas



3.7.5 Preparación del inoculo

Se usó la Cándida que se encontraba en el caldo nutritivo, agregando una solución neutra

hasta llegar a un grado de turbidez de la solución.

3.7.6 Siembra

La siembra fue realizada a través de la técnica de barrido con la ayuda de un hisopo. En forma

horizontal rotando la caja Petri en 3 direcciones. Para así obtener una siembra uniforme.

(Ilustración 24.)

Ilustración 24: siembra de la Cándida



42

3.7.7 Preparación de discos y colocación

Se procede a impregnar los discos de papel estériles mediante el uso de una micropipeta

graduada, con 20 microlitros de las diferentes sustancias Ajoeno y aceite esencial de Hierba

Luisa (Ilustración 25.), para después por medio de una pinza transferirlos respectivamente a

las cajas Petri que previamente fueron marcadas. (Ilustración 26.)

Ilustración 25: impregnación de las sustancias de interés en los discos de papel



Ilustración 26: transferencia de los discos de papel



43

3.7.8 Incubación

Se llevó las placas de agar listas a la incubadora, con una temperatura de 35o ± 2o C. por 72

horas, (Ilustración 27.) además para comprobar la viabilidad de la Cándida así como también

la ausencia de contaminación del medio de cultivo se agregó a la incubadora una placa

control.

Ilustración 27: cajas peri en la incubadora



3.7.9 Recolección de Datos

Mediante un calibrador de sensibilidad microbiológica (Ilustración 28.) se procedió a la

medición de los halos de inhibición producidos por el Ajoeno y la Hierba Luisa, a través de

un cuantificador de colonias de campo oscuro (Ilustración 29.),para que la visualización sea

más exacta dichos halos se formaron alrededor de los discos impregnados con las sustancias

de interés, después de un periodo de 72 horas en la estufa. A continuación se tomó un

registro escrito de dichas medidas para posterior análisis.

44

Ilustración 28: calibrador de sensibilidad microbiológica



Ilustración 29: cuantificador de colonias de campo oscuro



45

Ilustración 30: cajas petri, muestras 1, 2, 3,4



Ilustración 31: cajas Petri, muestras 5, 6, 7,8



46

Ilustración 32: cajas Petri, muestras 9,10, 11,12



Ilustración 33: cajas Petri, muestras 13, 14,15



47

CAPITULO 4

4. Resultados.

MUESTRA (caja Petri con cultivo de

Cándida Albicans)

AJOENO

(mm)

HIERBA LUISA

(mm)

1 14mm 14mm

2 18mm 16mm

3 18mm 16mm

4 14mm 14mm

5 14mm 18mm

6 20mm 18mm

7 18mm 12mm

8 14mm 14mm

9 14mm 12mm

10 18mm 18mm

11 16mm 16mm

12 18mm 16mm

13 20mm 16mm

14 18mm 16mm

15 18mm 18mm

Tabla 2: VALORES RECOLECTADOS



48

Los resultados obtenidos son detallados en la tabla 1. Con mediciones tanto del Ajoeno como

de la Hierba Luisa, a partir de estos datos vamos a obtener una media evidenciando que el

ajeno en promedio mide 16.8 mm y la Hierba Luisa 15.6 mm. El máximo valor obtenido por

el efecto del Ajoeno es de 20 mm mientras que el de la Hierba Luisa fue de 18mm

Para realizar el análisis de varianza que pruebe si los resultados obtenidos por el Ajoeno no

son significativamente diferentes de los obtenidos por la Hierba Luisa, con un nivel de

significancias del 0.05, se plantea la hipótesis:

H0 : j = 0

HA : j 0

En la que se plantea como Hipótesis nula H0 que el efecto observado en las Cajas Petri con

cultivo de Cándida Albicans no es igual en el Ajoeno y en la Hierba Luisa. Los resultados

del procesamiento son los siguientes:

Con estos datos podemos observar que hay un efecto relativamente mayor del Ajoeno

respecto a la Hierba Luisa. Con una variación del 1%, sin embargo las dos muestran un efecto

inhibitorio alto frente a la Cándida Albicans. Recordando que la Hierba Luisa en ese caso

fue nuestro control positivo podemos observar una relación bastante similar al efecto

ocurrido con el Ajoeno; estadísticamente son equivalentes de acuerdo a la prueba realizada.

FUENTE DE VARIACIÓNSUMA DE

CUADRADOS

GRADOS DE

LIBERTAD

MEDIA

CUADRÁTICAF Sig.

Entre grupos 10,800 1 10,800 2,363 ,136

Error 128,000 28 4,571

Total 138,800 29

49

Para realizar la prueba U de Mann-Whitney se planea la hipótesis nula de que el promedio

de los dos tratamientos utilizados: Ajoeno y Hierba Luisa, son iguales y por tanto su

diferencia es igual a cero, esto es:

H0 : j - = 0

HA : j - 0

Los resultados de la prueba para un nivel de significancia de 0.05, son los siguientes:

Siendo los valores de significación mayores a 0.05, se acepta la Hipótesis nula y se concluye

en que los promedios del Ajoeno y de la Hierba Luisa son iguales.

Bajo la consideración de que las muestras obtenidas son muestras independientes, se realizó

la prueba correspondiente en la que se postula como Hipótesis nula que el promedio

registrado en el Ajoeno es igual al promedio registrado en la Hierba Luisa, esto es:

H0 : 1 = 2

HA : 1 2

El resultado de la prueba realizada para el 5% de significancia, es el siguiente:

EFECTO

U de Mann-Whitney 78,500

W de Wilcoxon 198,500

Z -1,471

Sig. asintót. (bilateral) ,141

Sig. exacta [2*(Sig.

unilateral)],161

a

b. Variable de agrupación: GRUPO

Estadísticos de contrasteb

a. No corregidos para los empates.

50

El valor de significación bilateral Sig.(bilateral) = 0.136, ratifica que los promedio del Ajoeno

y de la Hierba Luisa son iguales.

Con estos datos y bajo el método de Kirby-Bauer podemos determinar el grado de

sensibilidad que revelan los resultados de la fase experimental del presente estudio

recordándonos que solo es para valoración cualitativa, consideramos que existen 3

categorías: resistente, intermedio y sensible. Así mismo National Committee for Clinical

Laboratory Standards (NCCLS). Explica cada una de las condiciones donde, sensible revela

la probabilidad de que el paciente responda efectivamente a la sustancia de interés, resistente

indica que puede existir alto riesgo de falla, y el intermedio puede revelar varias opciones

como por ejemplo la falta de concentración de la así como también una interferencia en la

fase de elaboración de la experimentación. Los valores referentes para un disco de 10µg que

se usaron fueron de:

DISCO DE 10 µG

RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

12 mm o menos 13-16mm 17 mm o mas

Tabla 3: valores de sensibilidad



Inferior Superior

Se han asumido varianzas

iguales

,938 ,341 1,537 28 ,136 1,20000 ,78072 -,39923 2,79923

No se han asumido varianzas

iguales

1,537 27,723 ,136 1,20000 ,78072 -,39995 2,79995

gl Sig. (bilateral)

Diferencia de

medias

Error típ. de la

diferencia

95% Intervalo de confianza

para la diferencia

EFECTO

Prueba de muestras independientes

Prueba de Levene para la

igualdad de varianzas Prueba T para la igualdad de medias

F Sig. t

51

4.2 Discusión

El presente estudio realizado demostró la eficaz acción anti fúngica del Ajoeno, demostrando

la sensibilidad de Cándida Albicans frente a dicho agente, aseverando la eficacia que

presentaría el Ajoeno en tratamientos clínicos así como para posteriores investigaciones

farmacológicas. El inicio de las investigaciones remonta al año de 1986,1987 y 1988, donde

se empieza a conocer los beneficios y las propiedades que el ajo demuestra tener a nivel

general en el cuerpo humano. Haciendo investigaciones profundas encuentran un

componente denominado “Ajoeno”, el cual, de los compuestos derivados del ajo es uno de

los más estables y que a su vez presenta un mayor efecto sobre hongos virus protozoos y

bacterias. Se somete el compuesto tanto a experimentaciones in vivo e in vitro para demostrar

dichas teorías, las cuales revelan resultados positivos. Para la parte experimental cada uno

de estos grupos usan distintas cepas de Cándida, demostrando con todas un efecto anti

fúngico importante. Lo que coincide con el presente estudio al demostrar dicha acción anti

fúngica usando una cepa pura de Cándida Albicans como hongo patógeno a evaluar.

Las investigaciones se hacen más profundas con Gonzales M. et-al (1998) exponiendo la

acción que posee el Ajoeno sobre la membrana celular de los hongos. Sus estudios revelan

una alteración a nivel de fosfolípidos y ácidos grasos, ocasionando un deterioro en la

estructura del hongo.

Continuando la línea de investigación Lemar K.M et-al. Prueban sobre Cándida Albicans la

eficacia que tienen los productos derivados del ajo al utilizar, como materia prima el ajo en

su estado natural, congelado y seco. Obteniendo como conclusión de esa investigación que

el ajo fresco es el más eficaz para la separación y síntesis de sus derivados en un 42% sobre

el estado inicial del ajo congelado y seco. Ultimando así que las propiedades del ajo y sus

52

derivados pueden ser explotados de una manera alternativa y a la vez efectiva para muchas

preparaciones farmacológicas. Concordado con el criterio del uso de ajo fresco en la parte

experimental de mi tesis para la posterior extracción y síntesis del producto de interés,

Ajoeno para la evaluación de su efecto antifungico.

Muchos estudios más continúan revelando las propiedades presentes en el ajo por lo que

Ledesma E. y Apiz-Catro R. (2006). No solo evalúan el efecto del Ajoeno como un efectivo

agente terapéutico en infecciones micoticas sino que además revelan que el Ajoeno se

caracteriza por poseer varios puntos blancos de acción a diferencia de muchos anti fúngicos

que actúan específicamente sobre un mecanismo de la célula, haciendo su acción menos

eficaz frente a otras condiciones. El Ajoeno tiene mayor efectividad por estar asociado a

varios mecanismos de acción sobre la célula fúngica. Inhibiendo la síntesis de fosfatidilcolina

sino que a su vez también produce un empaquetamiento desordenado sobre los fosfolípidos

de la membrana, origina el aumento de radicales libres, igualmente interviene en los

mecanismos de adhesión celular, de esta manera el Ajoeno tiene varias vías pata producir la

muerte celular, estas acciones mencionadas también interponen drásticamente en su

reproducción. Esta característica del Ajoeno que le permite actuar sobre varios blancos

beneficia al paciente reduciendo los riesgos de toxicidad sistémica.

En la investigación de Bayan L. et-al. (2013) Se siguen estudiando los diferentes medios por

los cuales el Ajoeno es efectivo frente a las cepas fúngicas, demostrando que el Ajoeno

produce una reducción de oxígeno en la membrana de la célula, reduciendo así la capacidad

de crecimiento del organismo para consecutivamente producir su muerte, también se

encuentran propiedades como la inhibición de la síntesis de lípidos, proteínas y ácidos

nucleicos provocando los cuales provocan así mismo un daño marcado sobre la membrana

53

celular. En esta misma investigación se da conocer el uso terapéutico del Ajoeno sobre

pacientes con estomatitis oral demostrando un mejor resultado terapéutico que en los

pacientes que usaron nistatina.

Pokpong A. et-al.(2014) consternados por el incremento de infecciones mucocutaneas

causadas principalmente por Cándida Albicans en individuos inmunodeprimidos, motiva a

la investigación de agentes naturales que ayuden a la reducción de esta patología, mostrando

interés a las propiedades de la Hierba Luisa evaluándola a nivel in vitro e in vivo.

Ekpenyong C. et-al. (2015) en su investigación atribuyen las actividades anti fúngicas a los

componentes del extracto especialmente a la presencia de linalool, ya que este actúa

reduciendo el tamaño celular del hongo y produce también, germinación anormal,

conduciendo a una disminución de formación de biofilm de la Cándida. Pero así mismo

concluye que existen otras propiedades que requieren mayores investigaciones como por

ejemplo el efecto que presenta sobre la adhesión de la Cándida. Otra propiedad que se le

atribuye a la Hierba Luisa para lograr el efecto anti fúngico es la coagulación del citoplasma

celular dañando lípidos y proteínas, causando fuga del citoplasma a través de la membrana

dando como resultando lisis y apoptosis.

Todas las investigaciones previas concuerdan con el presente el cual manifiesta una vez más

la gran capacidad del Ajoeno en la inhibición del crecimiento de Cándida Albicans, el cual

al ser comparado con los efectos anti fúngicos de la Hierba Luisa en rangos cualitativos

demuestran similitud, al ser la Cándida sensible a estos agentes. Sin embargo el Ajoeno

muestra un efecto 1% mayor. Concluyendo así que tanto la Hierba Luisa como el Ajoeno son

dos agentes náurales efectivos contra las cepas de Cándida Albicans, pero el Ajoeno tiene un

grado mayor de poder anti fúngico.

54

CAPITULO 5

5.1 CONCLUSIONES

Mediante la actual investigación tanto con base teórica como experimental, se puede

llegar a la conclusión de que el Ajoeno, es un efectivo agente anti fúngico, ya que

logramos demostrar que este, si inhibe el crecimiento de Cándida Albicans.

Al proceder con medición de los halos y su posterior análisis logramos sacar un a

media aritmética, esta demuestra que tanto el Ajoeno como la Hierba Luisa son

indiscutibles agentes anti fúngicos produciendo sobre la cándida una reacción de

sensibilidad, es sustancial observar que el Ajoeno produjo un efecto mayor al de la

Hierba Luisa, demostrando así que este tiene un mayor poder inhibitorio.

Comparando la medida de los halos de inhibición formados en el cultivo, tanto en el

Ajoeno como en la Hierba Luisa podemos confirmar que el efecto anti fúngico

producido por el Ajoeno es mayor al de la Hierba Luisa, lo cual concuerda con la

investigación ya que en la cuantificación de los halos obtuvimos medidas mayores

del ajeno en comparación con los halos que se formaron con la Hierba Luisa.

Se ultima que el Ajoeno es un agente anti fúngico opimo y eficaz para el tratamiento

de Cándida Albicans, por lo que se considerara una opción válida en el momento de

usar alternativas de origen natural.

55

Se confirma que el uso de Ajoeno sobre cepas de Cándida Albicans va a presentar

resultados favorables en cuanto a la inhibición de la misma, siendo este un auxiliar

para la terapéutica o control de estas cepas.

5.2 RECOMENDACIONES

Diseñar nuevas investigaciones evaluando al Ajoeno en sus diferentes propiedades,

no solo como anti fúngico sino también como antibacterial, antiprotozoorio,

antiagregante plaquetario y antitrombotico

Evaluar la actividad anti fúngica del Ajoeno frente a otros fármacos de interés para

demostrar su efecto y las diferencias que pueden existir.

Continuar las investigaciones del Ajoeno de manera que se logre encontrar una

manera de disminuir su olor característico, para poder usarlo de manera tópica en

cavidad oral.

Comprobar las propiedades del Ajoeno sobre diferente microrganismos de la cavidad

oral, responsables de causar diferentes patologías.

Se recomienda probar la extracción del Ajoeno bajo diferentes metodologías, para la

optimización de sus propiedades.

56

Se invita a conservar el Ajoeno almacenado por un corto periodo de tiempo, máximo

1 mes ya que este al ser un compuesto acuoso sufre de evaporación y alteración de

sus principales compuestos.

Es importante tener en cuenta el periodo de vida que posee un aceite esencial ya que

este al cabo de 6 meses comienza a dañarse y perder sus características terapéuticas

en gran porcentaje

Los compuestos acuosos y oleosos deben ser conservados en refrigeración para una

mayor estabilidad.

57

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17098

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20X%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cheng%20Y%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jiang%20X%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jiang%20H%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20Y%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20L%5Bauth%5D

62

ANEXO 1

63

ANEXO 2.

64

ANEXO 3

CLIENTE: DANIELA ALEJANDRA PUGA DURAN

MUESTRA: AJOENO Y ACEITE ESCENCIAL DE HIERBA LUISA

FECHA DE PROCEDIMIENTO: 201 5/08/12

ACTIVIDAD ANTIFUNGICA: ESTUDIO MICROBIOLOGICO

COMPARATIVO ENTRE AJOENO Y ACEITE ESCENCIAL DE HIERBA

LUISA AL 100O/ SOBRE CEPAS DE CANDIDA ALBICANS

MEDIO DE CULTIVO UTILIZADO: AGAR SABOUREAUD 4%

GLUCOSA CEPA DE ESTUDIO: CANDIDA ALBICANS

RESULTADOS

HALOS DE lNHlBlClON (mm)

REPETICION ACEITE ESCENCIAL DE HIERBA

LUISA 100%

AJOENO

14 14

16 18

3 16 18

4 14 14

5 18 14

6 18 20

7 12 18

14 14

9 12 14

10 18 18

11 16 16 12 16 18 13 16 20 14 16 18 15

18

DRA. ACOSTA

65

ANEXO 4.

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD …...AUTORA: DANIELA ALEJANDRA PUGA DURAN TUTOR DE TESIS:...

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