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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA Aislamiento y caracterización de resistencia a los antibióticos de Salmonella en coches de supermercados ubicados en la ciudad de Quito, provincia de Pichincha. Trabajo de titulación previo a la obtención del título de Médica Veterinaria y Zootecnista. AUTORA: Heredia Coba Andrea Leonor TUTOR: Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos PhD. Quito, Junio 2018
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Aislamiento y caracterización de resistencia a los antibióticos de
Salmonella en coches de supermercados ubicados en la ciudad de Quito,
provincia de Pichincha.
Trabajo de titulación previo a la obtención del título de Médica Veterinaria
y Zootecnista.
AUTORA:
Heredia Coba Andrea Leonor
TUTOR:
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos PhD.
Quito, Junio 2018
ii
AUTORIZACIÓN DE AUTORIA INTELECTUAL
Yo, ANDREA LEONOR HEREDIA COBA, en calidad de autora del trabajo
de investigación o tesis realizada sobre “AISLAMIENTO Y
CARACTERIZACIÓN DE RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS DE
Salmonella EN COCHES DE SUPERMERCADOS UBICADOS EN LA
CIUDAD DE QUITO, PROVINCIA DE PICHINCHA”, por la presente autorizo
a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los
contenidos que nos pertenecen o de parte de los que contiene esta obra,
con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autores no corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a nuestro favor, de conformidad
con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley
intelectual y su Reglamento.
Quito, a 11 de junio de 2018
Andrea Heredia Coba
CC: 1723647655
iii
APROBACIÓN DE TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo Christian Vinicio Vinueza Burgos en mi calidad de tutor del trabajo de
titulación, modalidad presencial, elaborado por ANDREA LEONOR
HEREDIA COBA; cuyo título es AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE
RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS DE Salmonella EN COCHES DE
SUPERMERCADOS UBICADOS EN LA CIUDAD DE QUITO, PROVINCIA
DE PICHINCHA, previo a la obtención del Grado de Médico Veterinario y
Zootecnista; considero que el mismo reúne los requisitos y méritos
necesarios en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido
a la evaluación por parte del tribunal examinador designado, por lo que
APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el
proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los ___ días del mes de mayo de 2018.
Dr. Christian Vinueza Burgos PhD
TUTOR
iv
DEDICATORIA
A mi familia por su apoyo incondicional en todo lo que me propongo hacer,
por saber guiarme en esta etapa y ser mi inspiración todos los días.
Andrea Heredia Coba
v
AGRADECIMIENTO
A mis padres Mariana y José, a mis hermanos Valquiria y Sebastián por
acompañarme en este camino y ser siempre mi inspiración y apoyo en todo lo que
me propongo hacer.
A mi tutor el Dr. Christian Vinueza, que con su extenso conocimiento y experiencia
me supo guiar en este trabajo. A la Dra. María Inés Baquero, por sus enseñanzas
que me guiaron en mi etapa de pasantía y tesis, gracias de corazón por
expresarme siempre su confianza para ser mejor persona cada día.
Quisiera hacer extensivo mi agradecimiento a las empresas que financiaron este
proyecto, Academia de Investigación y Educación Superior (ARES), Advisory
Group on Integrated Surveilance of Antimicrobial Resistance (AGISAR),
Organización Mundial de la Salud (OMS), a la Unidad de Investigación de
Enfermedades Transmitidas por los Alimentos y Resistencia a los antimicrobianos
(UNIETAR), y al Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador que sin
ellos no hubiese sido posible la realización de esta investigación.
A mis amigos José Luis y Cristina por su tiempo y dedicación a mi trabajo por
siempre guiarme en la escritura y procedimientos en el laboratorio.
Mi compañera de tesis y amiga Jacqueline, extenso agradecimiento por haberme
apoyado y ayudado en este camino y me enorgullece saber que cuento con tu
amistad incondicional en cualquier situación.
A mis amigos que de una manera u otra han sido claves en mi vida personal y
estudiantil, gracias infinitas por ser siempre los cómplices en esta etapa llamada
vida.
A mis pequeñas mascotas, gracias a ellos con solo verlos y que me devuelvan una
mirada y movimiento de colita, me han inspirado a diario a salir y ayudar a dar una
mejor forma de vida a otros animalitos y enseñar a las personas la responsabilidad
de tener una mascota.
INDICE DE CONTENIDO
CONTENIDO
Lista de Tablas .................................................................................. iv
Lista de Gráficos ............................................................................... iv
RESUMEN ........................................................................................ v
ABSTRACT ....................................................................................... vi
Introducción ....................................................................................... 1
CAPÍTULO I ...................................................................................... 2
El Problema ....................................................................................... 2
Planteamiento del Problema ............................................................. 2
Justificación: ...................................................................................... 4
Objetivos: .......................................................................................... 7
General: ............................................................................................ 7
Específicos: ....................................................................................... 7
CAPITULO II ..................................................................................... 8
Revisión bibliográfica ........................................................................ 8
Historia de Salmonella....................................................................... 8
Taxonomía del género Salmonella .................................................... 8
Morfología ......................................................................................... 9
Patógeno humano ........................................................................... 10
Distribución geográfica y reservorios ............................................... 11
Cifras reportadas en Ecuador durante el año 2017 ......................... 12
Patogénesis .................................................................................... 13
ii
Prevención y Control de Salmonella en Salud Pública .................... 14
Tratamiento ..................................................................................... 14
Resistencia a antimicrobianos ......................................................... 15
Estudios en Supermercados ........................................................... 16
Serotipificación ................................................................................ 16
CAPITULO III .................................................................................. 18
Metodología .................................................................................... 18
Determinación de Métodos a utilizar................................................ 18
Tipo de investigación ....................................................................... 18
Diseño de la investigación ............................................................... 18
Descripción de la zona de estudio ................................................... 18
Muestra ........................................................................................... 18
Procedimiento de la investigación ................................................... 19
1.Fase de campo (muestreo)........................................................... 19
a) Método de hisopado de superficie inerte ................................. 19
2. Fase de laboratorio ................................................................. 19
a) Enriquecimiento selectivo ...................................................... 19
b) Siembra en medio selectivo ................................................... 19
c) Pruebas Bioquímicas ............................................................. 20
d) Respaldo de cepas (criocongelación) .................................... 20
e) Estudio de perfil de resistencia .............................................. 20
Método de difusión con discos (antibiograma) ................................. 20
i. Preparación de medio de cultivo: ........................................... 21
iii
ii. Preparación del inóculo: ........................................................ 21
iii. Inoculación de las placas de agar:...................................... 21
iv. Aplicación de los discos de antimicrobianos ....................... 21
v. Incubación de las placas: ...................................................... 22
vi. Observación de las placas tras la incubación: .................... 22
vii. Medida de los halos e interpretación de la sensibilidad: ..... 22
Serotipificación bacteriana .............................................................. 22
Técnica de procesamiento de datos ................................................ 22
Análisis de datos ............................................................................. 22
CAPITULO IV .................................................................................. 24
Resultados ...................................................................................... 24
Discusión:........................................................................................ 28
CAPITULO V ................................................................................... 32
Conclusiones y recomendaciones ................................................... 32
Conclusiones ................................................................................... 32
Recomendaciones ........................................................................... 33
Referencias Bibliográficas ............................................................... 34
Anexos ............................................................................................ 43
Anexo 1. Esquema del Aislamiento de Salmonella (Cepas Móviles) 44
Anexo 2. Flujograma Serotipificación de S. Enteritidis, Typhimurium e
Infantis ............................................................................................ 45
Anexo 3: Fotografías de proceso de muestreo y trabajo en laboratorio47
iv
Lista de Tablas
Tabla 1: Esquema de Kauffman-White de los serotipos, Typhimurium,
Infantis y Enteritidis ......................................................................... 17
Tabla 2: Resultados de caracterización de resistencia a antimicrobianos
........................................................................................................ 26
Lista de Gráficos
Gráfico 1: Ciclo de transmisión de Salmonella ................................ 12
Gráfico 2: Porcentaje obtenido de cepas positivas a Salmonella ..... 24
v
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ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE RESISTENCIA A LOS
ANTIBIÓTICOS DE Salmonella EN COCHES DE SUPERMERCADOS
UBICADOS EN LA CIUDAD DE QUITO, PROVINCIA DE PICHINCHA.
Autora: Andrea Leonor Heredia Coba Tutor: Dr. Christian Vinueza PhD.
Fecha: Junio 2018
RESUMEN
Las bacterias pertenecientes al género Salmonella son consideradas uno de los principales agentes causales de enfermedad gastroentérica a nivel mundial. El objetivo del presente estudio fue aislar Salmonella en manubrios de coches de supermercados en la ciudad de Quito a través de métodos bacteriológicos. Salmonella fue aislado en el 2% (2/100) de las muestras analizadas, confirmando la capacidad de la bacteria de sobrevivir en los coches en cuestión. Las cepas de Salmonella aisladas se serotipificaron, identificando a una de ellas como S. Infantis. Se obtuvieron perfiles de resistencia a los antibióticos de las cepas aisladas. Los resultados evidenciaron que las bacterias aisladas son resistentes a cefotaxima, estreptomicina, gentamicina, cloranfenicol, nitrofurantoina, sulfametoxazol + trimetoprim y tetraciclina. La presente investigación denota la importancia de los procesos de limpieza y desinfección de los coches de supermercados.
Palabras clave: Coches supermercados, Salmonella Infantis, Resistencia antimicrobiana.
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ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE RESISTENCIA A LOS
ANTIBIÓTICOS DE Salmonella EN COCHES DE SUPERMERCADOS
UBICADOS EN LA CIUDAD DE QUITO, PROVINCIA DE PICHINCHA.
Autora: Andrea Leonor Heredia Coba Tutor: Dr. Christian Vinueza PhD.
Fecha: Junio 2018
ABSTRACT
Bacteria belonging to the genus Salmonella are considered one of the main causative agents of gastroenteric disease worldwide. The objective of the present study was to isolate Salmonella in the handlebars of supermarket cars in the city of Quito through bacteriological methods. Salmonella was isolated in 2% (2/100) of the samples analyzed, confirming the ability of the bacteria to survive on these cars. The Salmonella isolates were serotyped, identifying that one of them was S. Infantis. Resistance profiles of Salmonella isolates were obtained. It was shown the these isolates were resistant to cefotaxime, streptomycin, gentamicin, chloramphenicol, nitrofurantoin, sulfamethoxazole + trimethoprim and tetracycline. The present investigation shows the importance of the cleaning and disinfection processes of supermarket cars. Keywords: Supermarket cars, Salmonella Infantis, Antimicrobial resistance.
1
Introducción
Las bacterias pertenecientes al género Salmonella son consideradas
uno de los principales agentes causales de enfermedad gastroenterica
a nivel mundial (Bula-Rudas, Rathore, & Maraqa, 2015; Kudaka, Itokazu,
Taira, & Iwai, 2006; OIE, 2014). Se estima que el 99% de los casos de
salmonelosis humana están causados por serotipos de la subespecie
enterica (Betancor, 2012)
Estas infecciones gastroentericas pueden conllevar a una mayor
morbilidad de la enfermedad, así como mayor coste del tratamiento si no
son tratadas eficazmente. (Alós, 2015).
La resistencia bacteriana se la define como la capacidad que tiene una
bacteria para vivir cuando se expone a concentraciones establecidas de
un antibiótico que inhiben o matan a otras de la misma especie (Alós,
2015).
El fenómeno de la resistencia bacteriana es considerado un problema de
Salud Pública mundial de dificíl solución (Fariña, 2016), siendo
considerada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como un
serio y complejo problema que requiere de acciones urgentes (OMS,
2015). El uso indiscriminado de antibioticos de forma profiláctica,
además, de su utilización como promotores de crecimiento en animales,
constituyen las principales causas del aparecimiento de resistencias a
los antimicrobianos (OMS, 2015).
A pesar de la importancia de este patógeno, en el Ecuador no existen
investigaciones relacionadas a la presencia de Salmonella en
supermercados. El objetivo principal de este estudio es obtener perfiles
de resistencia a antibióticos de Salmonella aislada en coches de
supermercados
2
CAPÍTULO I
El Problema
Planteamiento del Problema
La entidad encargada del Control y Prevención de Enfermedades de
Estados Unidos (CDC), estima que las Salmonellas no tifoideas son
responsables de causar aproximadamente 153 millones de casos de
gastroenteritis humana y 57.000 muertes a nivel mundial cada año.
(Hunter & Watkins, 2017).
Dosis de inoculación, inmunidad, antecedentes genéticos del huésped y
el grado de infección son denominados factores de contaminación. Su
interacción determina la probabilidad de contraer gastroenteritis
provocadas por S. enterica, además de la gravedad de las mismas
(Betancor, 2012). Se considera que los principales serovares asociados
a gastroenteritis, son: Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium
(Quinn et al., 2013)
Los antimicrobianos son fármacos fundamentales para el tratamiento de
infecciones bacterianas en salud humana y animal (INFOSAN, 2008).
Lamentablemente su inadecuado uso ha incrementado el surgimiento de
cepas multirresistentes (Fariña, 2016), disminuyendo las opciones de
tratamientos, aumentando el tiempo recuperación y niveles de
mortalidad, además de obligar el uso de medicamentos más costosos
(Fariña, 2016)
Estudios realizados en Estados Unidos entre mayo de 2006 a abril de
2007, demuestran la relación existente entre la presencia de Salmonella
en productos cárnicos y llevar a los niños sobre el coche de
supermercado durante la visita (Patrick, Mahon, Zansky, & Hurd, 2010).
3
Esto debido a que los niños viajan al lado de los paquetes de carne cruda
y aves de corral (Patrick et al., 2010).
Investigaciones realizadas en Adís Adeba, Etiopia, entre diciembre de
2011 a abril 2012, analiza la presencia de Salmonella en cortes de
mortadela desde su planta de procesamiento hasta la venta al
consumidor en los supermercados. Analizadas (119 muestras) de las
cuales (15/119 muestras) fueron obtenidas de los supermercados, como
elemento de análisis se tomó mortadelas colocadas en percha, el
resultado obtenido fue el aislamiento de una Salmonella representando
una prevalencia de 0,7% (Hiko, Ameni, Langkabel, & Fries, 2015).
Otra investigación relacionada, nos indica que en Osaka, Japón, en el
año 2009 comienza la búsqueda de Staphylococcus aureus en manijas
de coches de supermercado, en toda la investigación se obtuvo (760
hisopados) de cuatro supermercados, de los cuales (52/760) fueron
positivas a Staphylococcus aureus, con una prevalencia de 6,84% del
total de muestras obtenidas (Mizumachi et al., 2010).
Existe poca información acerca de la presencia de Salmonella en los
coches de supermercados, aunque, basados en la evidencia antes
nombrada se sospecha que las superficies contaminadas desempeñan
un papel importante en la transmisión bacteriana.
4
Justificación
Entre las bacterias reconocidas causantes de Enfermedades
Transmitidas por los Alimentos (ETAs) se encuentran especies de los
géneros Campylobacter y Salmonella (Gerba & Maxwell, 2012). En el
humano, los microorganismos del género Salmonella son agentes
etiológicos de infecciones intestinales y sistémicas. (OIE, 2014).
Campylobacter, Salmonella y Escherichia coli son bacterias
contaminantes de productos cárnicos crudos (Gerba & Maxwell, 2012),
se las encuentra frecuentemente en infecciones subclínicas en animales
(Quinn et al., 2013), además de frutas y verduras que se han fertilizado
o regado con desechos orgánicos (Gerba & Maxwell, 2012).
Las bacterias del género Salmonella pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae, son bacilos Gram negativos, aerobios facultativos
de 0,7 a 1,5 µm de ancho y de 2 a 5 µm de largo (Bula-Rudas et al.,
2015; Stanchi, 2007). Estas bacterias son no fermentadoras de lactosa,
(Fern, 2015; Stanchi, 2007), no esporulados, (Gonzalez Pedraza,
Sanandres, Varela, Aguirre, & Camacho, 2014; Stanchi, 2007) poseen
flagelos perítricos y son consideradas en su mayoría móviles a
excepción de los serotipos aviares gallinarum y pullorum. (Koneman,
2006; Stanchi, 2007).
El género Salmonella es causante de la salmonelosis, enfermedad de
distribución mundial que provoca intoxicaciones alimentarias
importantes (Quinn et al., 2013; Stanchi, 2007). Los microorganismos
integrantes del género Salmonella están extensamente diseminados en
la naturaleza (Stanchi, 2007), y afectan a los animales de sangre fría y
caliente, incluido el ser humano (Bula-Rudas et al., 2015; Quinn et al.,
2013). La morbilidad y mortalidad de los casos depende del serotipo
encontrado, pudiendo generar pérdidas económicas y humanas
(Gonzalez Pedraza et al., 2014; Stanchi, 2007)
5
Salmonella enterica se clasifica en 6 subespecies, enterica, salamae,
arizonae, diarizonae, houtenae e indica (Fern, 2015). De acuerdo con la
presencia de antígenos O (lipopolisacárido), Vi (polisacárido capsular) y
H (flagelar) las mismas pueden actualmente serotiparse en más de 2600
serovariedades (Giesen et al., 2012; Jurado, Arenas, Doblas, Rivero, &
Torre, 2010; Koneman, 2006).
Salmonella en el transcurso del tiempo se ha ido complementando a
varios grupos, lo cual las hace capaces de no ser detectadas en otras
especies hospedadoras.
Así tenemos, a especies que son propias de ciertos animales: S.
Abortus-equi en caballos, S. Abortus-ovis en ovejas (Quinn et al., 2013).
S. choleraesuis en cerdos y S. dublín en el ganado, las cuales pueden
ser encontradas ocasionalmente en los humanos (Quinn et al., 2013).
S. gallinarum causante de tifoidea aviar y S. pullorum causante de la
pullorosis, estas dos especies encontradas en aves de corral (Merchant
& Packer, 2005; Quinn et al., 2013; Stanchi, 2007)
Existen salmonelas que no se encuentran adaptadas a un hospedador
en especial, y son capaces de infectar a individuos de diferentes
especies, así tenemos a S. Anatum, S. Derby, S. Newport, S. Tennessee
y S. Typhimurium (Quinn et al., 2013)
Para mencionar especies que son tifoides para el ser humano tenemos
a S.Typhi y S. Paratyphi causantes de la fiebre tifoidea (Quinn et al.,
2013; Stanchi, 2007).
Una investigación realizada por Majowicz en el año 2009 estimó que
Salmonella no-tifoidea fue la causa de 93,8 millones de casos de
gastroenteritis, con 155.000 muertes anuales en todo el mundo.
(Majowicz et al., 2010).
6
Dadas las repercusiones económicas y sociales provocadas, Salmonella
se establece como una bacteria de gran importancia en salud pública en
las áreas: alimentaria, humana y animal (W, Bearson, & Allen, 2017).
7
Objetivos:
General:
Aislar e identificar Salmonella en coches de dos supermercados en la
ciudad de Quito.
Específicos:
1. Aislar Salmonella en manubrios de coches de supermercado.
2. Obtener perfiles de resistencia a antimicrobianos de las cepas
aisladas.
8
CAPITULO II
Revisión bibliográfica
Historia de Salmonella
Salmonella fue identificada por primera vez en 1885 (Fern, 2015). El
nombre del género Salmonella fue propuesto por Joseph León Ligniéres
en el año 1900, en honor a Daniel Elmer Salmon (Fern, 2015). Salmon
D. asociado a Theobald Smith, aislaron el agente causante de la peste
porcina en 1885, organismo al que denominaron “Hog-cholerabacillus”
(Brands, 2006), organismo que tiempo después se denominaría
Salmonella choleraesuis. (Brands, 2006; Faura et al., 2003; Feasey,
Dougan, Kingsley, Heyderman, & Gordon, 2012)
Desde su descubrimiento en 1900, Salmonella ha sido clasificada de
varias maneras, actualmente se cuentan más de 2600 serotipos,
causantes de enfermedades en humanos y animales. (Giesen et al.,
2012; Jurado et al., 2010)
Taxonomía del género Salmonella
La taxonomía del género Salmonella inicialmente integraba más de 2000
especies. (Brands, 2006).
La serotipificación fue propuesta inicialmente por Fritz Kauffman y P.
Bruce White en 1934 como un esquema de clasificación de Salmonella
y se basa en las características antigénicas flagelares y somáticas de la
bacteria (McQuiston, Waters, Dinsmore, Mikoleit, & Fields, 2011). Así el
antígeno flagelar se ve representado por la letra H (flagelar: del alemán
hauch) y con la letra O el somático (somático: alemán Ohne hauch, el
cual se establece como “sin movimiento”) (Faura et al., 2003).
9
Una modificación de este esquema propuso la creación de dos especies:
Salmonella enterica y Salmonella bongori, integrando todos los serotipos
dentro de estas (Fern, 2015; McQuiston et al., 2011). Esta clasificación
fue aceptada por la Comisión Judicial del Comité internacional de
Sistemática de Procariotas, en el año 2005. (Quinn et al., 2013).
La clasificación de S. enterica se obtuvo a partir de estudios de
multilocus por electroforesis de sus enzimas (MLLE) y por análisis
filogenético de genes de mantenimiento. (McQuiston et al., 2011)
Salmonella enterica se divide en seis subespecies: S. entérica (I), S.
salamae (II), S. arizonae (IIIa), S. diarizonae (IIIb), S. houtenae (IV), S.
indica (VI) (Castillo, Martínez, & Apodaca, 2008).
Está clasificación conlleva a una terminología de uso práctico en
laboratorio y de aceptación mundial, así, la nomenclatura es diferente
debido a que se toma en cuenta a los serotipos (serovariedades) de
Salmonella como si fuese nombres de especies. Por ejemplo,
“Salmonella enterica subgrupo enterica serotipo Typhimurium”, se
refiere a Salmonella Typhimurium. (Giesen et al., 2012)
Morfología
Salmonella presenta forma de bastones observada al microscopio, son
bacilos gramnegativos, sus dimensiones son 0,7 a 1,5 µm de ancho y 2
a 5 µm de largo (Quinn et al., 2013; Stanchi, 2007), por la presencia de
flagelos distribuidos en forma perítrica la mayoría son bacterias móviles,
la ausencia de estos flagelos se observa en especies de Salmonella
como gallinarum y pullorum, responsables del tifus aviar y pullorosis
respectivamente (Stanchi, 2007).
Esta bacteria se adapta fácilmente a crecer en temperaturas que
bordean los 37oC, pero tiene la capacidad de crecer en un amplio rango
de temperatura, que va desde los 5oC a 45oC (Brands, 2006). El
10
crecimiento adecuado de Salmonella se da en un pH de 6.5 – 7.5 pero
tolera un pH de 4.1 a 9 (Brands, 2006).
Patógeno humano
Salmonella es un patógeno que provoca alteraciones de índole
gastrointestinal con sintomatología variada, que reciben el nombre de
salmonelosis (Abraham et al., 2012). Actualmente la salmonelosis es
considerada una de las zoonosis de mayor alcance en el mundo (Castillo
et al., 2008), dada como consecuencia del consumo de alimentos
contaminados (Castillo et al., 2008).
La mayor incidencia de salmonelosis se da en lactantes, niños y
ancianos (Abraham et al., 2012). Salmonella es la responsable de dos
tipos de enfermedades; salmonelosis no tifoidea y fiebre tifoidea.
(Abraham et al., 2012). La salmonelosis no tifoidea se presenta con
vómitos, diarrea, cólicos y fiebre, estos síntomas duran
aproximadamente dos días y tienden a disminuir en una semana.
(Abraham et al., 2012). Su transmisión entre personas es limitada, en
pacientes con un buen sistema inmune la enfermedad es auto limitante
(Abraham et al., 2012; Villalpando et al., 2017).
La mayoría de los serotipos de Salmonella se encuentran en la
naturaleza habitando el tracto intestinal de mamíferos, reptiles, insectos
y aves (Kudaka et al., 2006).
Salmonella no tifoidea se describe como factor de infección en niños, su
mecanismo de acción actúa trasladándose al torrente sanguíneo.
(Feasey et al., 2012).
Salmonella tifoidea, conocida antiguamente como fiebre tifoidea es la
responsable de la presencia de cuadros clínicos marcados, los cuales
incluyen: fiebre alta, diarrea o estreñimiento muchas veces con
somnolencia y a veces presenta erupciones. En situaciones puntuales
Salmonella paratyphi A, paratyphi B (Salmonella schottmuelleri) y
11
Salmonella paratyphica C ( Salmonella birschfeltii) pueden causar
cuadros clínicos más graves (Abraham et al., 2012; Jurado et al., 2010)
La Salmonella se trasmite a través de los alimentos, especialmente
aquellos que se consumen crudos o a medio cocer (Jurado et al., 2010),
entre ellos: carne, huevos, frutas y verduras, además de frutos secos
como las nueces. (Abraham et al., 2012).
Distribución geográfica y reservorios
Salmonella puede colonizar el tracto intestinal de animales vertebrados,
incluidos ganado, vida silvestre, mascotas domésticas y humanos.
(Abraham et al., 2012). Estas bacterias presentan una gran resistencia,
pudiendo mantener su poder infectivo durante varias semanas en el
agua y suelo. (Faura et al., 2003; Quinn et al., 2013)
El agua, animales de abasto y subproductos agroindustriales como
(harina de hueso, carne y pescado) de no ser procesados correctamente
permiten la diseminación de Salmonella, así también, suelos
contaminados y vegetación son un factor importante de propagación
(Jurado et al., 2010; Quinn et al., 2013)
Salmonella no tifoidea se la considera a un elemento importante en
Salud Pública, causando cada año alrededor de 1.6 billones de
gastroenteritis y 3 millones de muertes a nivel mundial. (WHO, 2015).
Se estima que el mayor número de salmonelosis se presentan en
regiones en vías de desarrollo (Jurado et al., 2010), así, en África se
estima que cada año se presentan 91 millones de casos, alcanzando las
32.000 muertes anuales (WHO, 2015). Aproximadamente 77 millones de
personas enferman cada año en Sudamérica por alimentos
contaminados, siendo el agente causal Salmonella no tifoidea el
responsable del 95% de las infecciones (WHO, 2015).
12
En la región Europea se marca que la carga estimada de enfermedades
transmitidas por los alimentos es baja, teniendo 23 millones de personas
enfermas cada año con 5.000 muertes (WHO, 2015)
En la región Americana se estima que la carga de enfermos por
transmisión alimentaria llega a los 48 millones de personas de los cuales
se tiene registro de 3000 muertes cada año (Reuters, 2017).
Cifras reportadas en Ecuador durante el año 2017
Durante el 2017 en Ecuador se presentaron 2.041 casos notificados de
salmonelosis no tifoidea, distribuidos en varias provincias del país (MSP,
2017). Así Manabí, Loja y Morona Santiago son las provincias con mayor
índice salmonelosis humana con el 16,2% (331/2041), 10.8% (220/2041)
y 9.22% (188/2041) de los casos reportados respectivamente. (MSP,
2017).
Gráfico 1: Ciclo de transmisión de Salmonella
Fuente: (Insunza Mónica; Soto Anita, 1998)
13
Patogénesis
En la actualidad todas las especies de Salmonella y subgrupos
existentes eran incluidos en una misma especie, hoy en día, por métodos
de identificación moleculares se los puede separar en 6 grupos para
Salmonella enterica, tomando en cuenta la excepción de Salmonella
bongori la cual según estudios de hibridación de ADN se determinó que
es una especie distinta a las demás (Renaloa, 2014)
Salmonella enterica posee gran cantidad de factores de virulencia que
le hace adquirir características invasivas, dando un estilo de vida
intracelular a este patógeno. (Wagner & Hensel, 2011).
Los rasgos de virulencia de Salmonella son dependientes de la
introducción de proteínas muy parecidas a toxinas en las células
eucariotas, además que esta bacteria distribuye una gran cantidad de
estructuras adhesivas por sus fimbrias y adhesinas no fimbriales.
(Wagner & Hensel, 2011)
Todos los serotipos de Salmonella son potencialmente patógenas
(Stanchi, 2007). Se menciona que en medicina veterinaria se ha
determinado que esta bacteria puede provocar septicemia y enteritis
aguda, subaguda y crónica, así como abortos en diferentes especies
animales. (Stanchi, 2007)
Cuando las personas o los animales ingieren Salmonella, la presencia
de la enfermedad dependerá de la cantidad de bacterias que haya
ingerido (inóculo) y el desarrollo que tengan las mismas en el organismo
hospedador. (Jurado et al., 2010). También dependerá de la edad del
huésped, sistema inmunológico, la presencia de alguna enfermedad en
ese momento y la composición de la flora normal. (Quinn et al., 2013)
El tiempo aproximado de incubación de la bacteria es de 6 – 48 horas
(Jurado et al., 2010), La sintomatología integra un proceso febril y
14
diarrea. Mientras avanza el cuadro infectivo se desarrollan diarreas
fluidas y sanguinolentas (Jurado et al., 2010).
Prevención y Control de Salmonella en Salud Pública
Las medidas sanitarias de prevención de salmonelosis incluyen una
correcta manipulación de alimentos, limpieza adecuada de superficies y
un adecuado control de aguas residuales, junto con la apropiada higiene
personal y el correcto lavado de las manos. (Jurado et al., 2010)
La ejecución de programas zoosanitarios deben aplicarse a diferentes
animales de producción (aves, bovinos, porcinos, etc.) y animales
domésticos, esto por estar en contacto directo con el ser humano (Borie,
2002), integrando además aves exóticas y reptiles de compañía (CDC,
2018).
Tratamiento
Información dada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), el uso
de antimicrobianos en la Salmonelosis no se encuentra recomendado
debido a que es una infección autolimitante (Organización Mundial de la
Salud [OMS], 2011)
Entre los antimicrobianos sugeridos para tratar la salmonelosis se
encuentran la ampicilina, amoxicilina, gentamicina, trimetoprim –
sulfametoxazol y fluoroquinolonas (CFSPH, 2010)
Desafortunadamente el uso indiscriminado de antibióticos ha llevado a
la presencia de cepas bacterianas resistentes a la acción de los
antimicrobianos, lo cual complica el tratamiento de infecciones
gastrointestinales producidas por Salmonella o por cualquier otra
bacteria. (Fariña, 2016)
Por tanto, es necesario el uso del laboratorio para discernir entre la gama
de fármacos existentes y optar por la solución más adecuada. (Stanchi,
2007).
15
Resistencia a antimicrobianos
Antibiótico o también llamado antimicrobiano es una molécula natural
obtenida a partir de un organismo vivo, hongo o una bacteria (Seija &
Vignoli, 2006), que provoca la muerte o a su vez la inhibición del
crecimiento de las bacterias (Seija & Vignoli, 2006).
Se denomina resistencia bacteriana a la capacidad que desarrolla un
patógeno para evitar el mecanismo de acción del antimicrobiano usado.
(Brands, 2006). La resistencia bacteriana puede darse de dos formas,
resistencia innata (intrínseco), y de forma adquirida (extrínseco) (Quinn
et al., 2013). La primera forma está codificada de forma cromosómica y
se relaciona con la fisiología del microorganismo dada al inicio de su
existencia (Quinn et al., 2013). La forma adquirida se puede dar a partir
de una mutación genética, o la integración de material genético
proveniente de plásmidos y/o bacteriófagos de otras bacterias (Quinn et
al., 2013). La forma de la pared celular bacteriana, flujo de salida o la
inactivación directa del antibiótico, son los principales mecanismos de
acción para evadir el efecto de los antimicrobianos (Alós, 2015). El
empleo de antibióticos sin prescripción médica, subdosificación, y
alteración en intervalos de administración son las principales causas que
ha ocasionado el surgimiento de resistencias a los antibacterianos.
(Fariña, 2016)
En la producción animal, los antibióticos son usados como profilácticos
además de fines terapéuticos (INFOSAN, 2008). Esto ha ocasionado
que los antimicrobianos sean objeto de investigaciones científicas
durante la última década, proponiendo el uso adecuado en animales de
producción a fin de evitar el surgimiento de resistencias en salud humana
y animal (INFOSAN, 2008).
La mayoría de las especies de Salmonella resistentes a los antibióticos
son de origen animal (Deng et al., 2017). Además, se han determinado
que las trazas de antimicrobianos encontrado en alimentos origen
16
animal, son un factor predisponente en la aparición de resistencias
antimicrobianas (Deng et al., 2017).
Estudios en Supermercados
Una investigación realizada en Atlanta Georgia mediante encuestas
estableció como factor de riesgo el coche de supermercado, al trasportar
en paralelo productos cárnicos y niños menores de 5 años (Bula-Rudas
et al., 2015). Este estudio concuerda con las investigaciones previas
realizadas por FoodNet en Estados Unidos en el año 2009, realizada en
niños menores de un año (Patrick et al., 2010).
Investigaciones realizadas en la Universidad de Arizona obtuvieron
hisopados de los manubrios de los coches de supermercados para aislar
bacterias, se tomó 85 carritos al azar de los cuales el 72% de las
muestras tomadas (61/85) indicaron la presencia de bacterias fecales,
en la misma investigación se tomaron 36 carritos para realizar estudios
más detallados y se obtiene un 50% (18) de los coches tenían otro tipo
de bacterias (Carroll, 2011).
No solo los manubrios de los coches de supermercado son los
elementos de contaminación, en otra investigación se determinó que
bolsas reutilizables de la compra en los supermercados que no son
lavados de forma continua se convierten en guaridas bacterianas
potenciales (Carroll, 2011).
Serotipificación
Importante complemento dado para la caracterización química de estas
bacterias, este procedimiento permite establecer la composición
antigénica del organismo a analizar, en decir permite conocer su
composición genética al tener una membrana (antígenos “O”), flagelar
(“H”) y capsular (Vi), para clasificarla en grupos por sus serovariedades
tomando como base al esquema de Kauffman-White (Beltrán, Simental,
& Reyes, 2016)
17
La precisa identificación de los antígenos de Salmonella nos permite
conocer la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas
geográficas siendo también importante el estudio de brotes infecciosos,
vigilancia epidemiológica y sanitaria (Beltrán et al., 2016).
La identificación de Salmonella a nivel serológico incluye la mezcla del
organismo sospechoso con antisueros que tienen anticuerpos
específicos para la bacteria (Beltrán et al., 2016).
Tabla 1: Esquema de Kauffman-White de los serotipos, Typhimurium, Infantis
y Enteritidis
Serotipo Antígeno
Somático (O)
Antígeno fase 1 Flagelar (H) Fase 2
S.
Typhimurium
1,4,*5,12 i 1,2
S. Infantis 6,7,14 r 1,5
S. Enteritidis 1,9,12 g,m
*: Los factores O u H pueden estar presentes o ausentes.
_: Los factores O subrayadas están determinados por la conversión de fagos.
-: Un signo “negativo” indica que la fase está ausente y por lo tanto el serotipo
es monofásico.
Fuente: (Grimont & Weill, 2007)
18
CAPITULO III
Metodología
Determinación de métodos a utilizar
Tipo de investigación
La investigación que se realizó fue de tipo experimental
Diseño de la investigación
Se realizó un estudio observacional – aleatorio ya que cada coche de
supermercado tomado para el muestreo fue elegido completamente al
azar.
Descripción de la zona de estudio
La toma de muestras se realizó en supermercados del norte y sur de la
ciudad de Quito, el procesamiento de cada una de las muestras se
realizó en los laboratorios de Bacteriología y Micología y en la Unidad de
Investigación de Enfermedades Transmitidas por los Alimentos y
Resistencias a los Antimicrobianos (UNIETAR) de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador
(FMVZ-UCE).
Para identificación y respaldo de cada una de las muestras se utilizó un
código alfanumérico, así como para sus respectivos resultados.
Muestra
Se realizó un muestreo probabilístico (aleatorio simple), tomando 4
coches de cada supermercado (total 8 muestras/semana) durante 12
semanas. Finalizando este periodo se recolectaron un total de 100
muestras distribuidas en dos supermercados, con dos sucursales cada
uno (al norte y sur respectivamente).
19
Procedimiento de la investigación
1. Fase de campo (muestreo)
a) Método de hisopado de superficie inerte
Las muestras se tomaron del manubrio de coches de supermercados en
una superficie estimada de 464 cm2, mediante hisopos estériles (Anexo
1) que fueron transportados al laboratorio en tubos de ensayo
sumergidos en 2 ml de agua peptonada tamponada.
2. Fase de laboratorio
Las muestras fueron procesadas en base la norma ISO 6579: 2007
“Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación
animal”. Como control de calidad, se utilizó la cepa Escherichia coli
ATCC 25922.
Pre-enriquecimiento no selectivo
Se realizó una dilución 1:10 con agua peptonada, para ello se tomó la
masa del hisopo húmedo (aproximadamente 0,6 gr) y completó con agua
peptonada hasta llegar a los 6 gr. Realizado esto se homogenizó la
muestra durante 1 minuto y se incubó a 37°C durante 18-24 horas.
a) Enriquecimiento selectivo
Con una micropipeta se inoculó 3 gotas (50 µl/gota) del cultivo obtenido
en el pre-enriquecimiento en placas con el medio Rappaport Vassiliadis
Semisólido Modificado (MSRV). Se llevó a incubación a 42°C por 24 a
48 ± 3 horas.
b) Siembra en medio selectivo
Las placas positivas sembradas en medio MSRV (presencia de un halo
blanco alrededor del inóculo), se sembró por método de estriación por
disminución de carga bacteriana en agar Xilosa Lisina Desoxicolato
20
(XLD), procurando tomar una asada de la parte más distal del halo de
crecimiento. Las placas se incubaron a 37°C de 24 a 48 horas.
c) Pruebas Bioquímicas
De presentarse colonias con centro negro y halo rojizo (Koneman, 2006),
se procedió a realizar pruebas bioquímicas. La batería bioquímica para
colonias sospechosas a Salmonella incluyó: agar Triple Sugar Iron (TSI),
Urea, Indol y Lisina; estos medios se incubaron a 37°C por 24 horas.
Se determinó una muestra como positiva a Salmonella, cuando en la
batería bioquímica se observó los siguientes resultados:
• TSI: K/A, producción de H2S y producción de gas.
• Urea: Negativo, sin cambio de color o cambio a color amarillo.
• Indol: Negativo, se reveló con reactivo de Kovacs, formación de
un anillo amarillo.
• Lisina: Positivo, cambio de color de verde a morado.
d) Respaldo de cepas (criocongelación)
Aquellas cepas identificadas como positivas a Salmonella mediante
pruebas bioquímicas fueron colocadas en microtubos de criocongelación
con 600 µl de caldo triptosa (TSB) y se incubó a 37°C por 24 horas. Al
siguiente día se añadió 900 µl de glicerol, se homogenizó y se llevó a
congelación a -80°C.
e) Estudio de perfil de resistencia
Método de difusión con discos (antibiograma)
Los aislados positivos a Salmonella fueron procesados utilizando la
técnica de difusión en disco (EUCAST, 2014), y los puntos de corte se
tomaron del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) y del
Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana
(EUCAST) por sus siglas en inglés (CLSI, 2017; EUCAST, 2015).
21
De manera resumida se siguió el siguiente protocolo:
i.Preparación de medio de cultivo:
a. Se preparó el medio de cultivo MH (Müeller Hinton) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
b. Este medio de cultivo tuvo un espesor de 4 mm ± 0.5 mm (25 ml
para una placa redonda de 90 mm).
ii.Preparación del inóculo:
a. Se realizó la suspensión de una o dos colonias positivas a
Salmonella en suero salino a partir de un medio de cultivo no selectivo
con asa o hisopo estéril. Este procedimiento se realizó para obtener una
densidad de 0,5 de la escala de McFarland que corresponde
aproximadamente 1-2 x 108 UFC/ml de Salmonella.
b. Para comparar la densidad de la suspensión se puede visualizar
una suspensión estándar de turbidez equivalente al 0,5 de McFarland.
c. La suspensión fue utilizada en los 15 minutos siguientes a su
preparación.
iii.Inoculación de las placas de agar:
a. Se introdujo un hisopo estéril en la suspensión y se distribuyó el
inóculo homogéneamente sobre toda la superficie del medio de cultivo
inoculándolo en varias direcciones.
b. Se colocó los discos dentro de los 15 minutos siguientes a la
inoculación de la placa.
iv.Aplicación de los discos de antimicrobianos
a. Se colocaron los discos firmemente sobre la superficie del agar,
estos no fueron movidos una vez ya colocados, pues la difusión del
antimicrobiano es rápida.
22
v.Incubación de las placas:
a. Se incubaron las placas en las condiciones expuestas para la
familia Enterobacteriaceae 35 ± 1 °C en aerobiosis durante 16-20 horas.
(EUCAST, 2014)
vi.Observación de las placas tras la incubación:
a. El crecimiento estuvo distribuido uniformemente en toda la placa
y se logró halos de inhibición circulares.
vii.Medida de los halos e interpretación de la sensibilidad:
a. Para todos los antimicrobianos, el borde del halo fue leído desde
el punto de inhibición a simple vista.
b. Se leyó las placas por el reverso contra un fondo negro.
c. Se midió los diámetros de los halos de inhibición con una regla
aproximando el resultado al valor más próximo en milímetros.
d. Los resultados negativos se interpretaron como “Sin halo”.
Serotipificación bacteriana
Al confirmar que la cepa de Salmonella no presenta un fenotipo
autoaglutinante, se procede a la serotipificación con antisueros
somáticos y flagelares de acuerdo con el sistema Kauffman-White
(Anexo 2)
Técnica de procesamiento de datos
Los resultados obtenidos de la fase de laboratorio se respaldaron en
Hojas de Excel®, registrándose también la fecha y lugar de recolección
de cada muestra.
Análisis de datos
Se cuantificó la presencia o ausencia de Salmonella por cada una de las
muestras recogidas de los coches de supermercado durante 12
23
semanas que duró el muestreo, dentro de esto se utilizó tablas de
frecuencias y gráficos de barras.
24
CAPITULO IV
Resultados
El aislamiento de Salmonella se realizó en base a lo establecido por la
norma ISO 6579.
Durante las 12 semanas que duró el muestreo se recolectaron un total
de 100 muestras del manubrio de los coches de supermercados por el
método de hisopado en superficie, de las cuales, 50 corresponden a dos
sucursales del supermercado 1 localizadas una al norte y otra al sur,
mientras que las otras 50 muestras corresponden a una sucursal del
supermercado 2 ubicada al norte y otra sucursal al sur de la ciudad de
Quito.
De las 100 muestras analizadas, 2 (2%) muestras fueron positivas a
Salmonella, una obtenida al norte proveniente del supermercado 1 y la
otra al sur de la ciudad de Quito proveniente del supermercado 2, los
resultados se pueden ver en el siguiente gráfico:
Gráfico 2: Porcentaje obtenido de cepas positivas a Salmonella
Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora
Positivo2%
Negativo98%
SALMONELLA EN COCHES DE SUPERMERCADOS
25
La resistencia asociada a antibióticos presentada en este estudio fue el
siguiente: las cepas aisladas C1 y C2 fueron sensibles a ceftazidima,
amoxicilina + ácido clavulánico, kanamicina, ertapenem, cefoxitin,
fosfomicina, ciprofloxacina, azitromicina, cefepime.
Así también, las mismas cepas presentaron resistencia a los antibióticos
cefotaxima, estreptomicina, gentamicina, cloranfenicol, nitrofurantoina,
sulfametoxazol + trimetoprim, tetraciclina.
La caracterización de resistencia a antimicrobianos de los aislados C1 y
C2 pueden observarse en la tabla 2.
26
Tabla 2: Resultados de caracterización de resistencia a antimicrobianos
Familia de antibiótico Antibiótico ECOFF Halo (mm)
≤ (R) C1 C2
CEFALOSPORINAS *Cefepime 18 19 19
*Ceftazidima 17 19 18
*Cefotaxima 18 10 11
Cefoxitin 8 22 23
AMINOGLUCOSIDOS Estreptomicina 16 <5 13
Gentamicina 16 13 15
*Kanamicina 13 21 23
CARBAPENEM *Ertapenem 18 28 27
FENICOLES Cloranfenicol 16 <5 <5
FOSFONATOS *Fosfomicina 12 35 34
FLUOROQUINOLONAS *Ciprofloxacina 20 30 32
MACRÓLIDOS * Azitromicina 12 19 19
NITROFURANOS * Nitrofurantoina 14 10 10
ANTAGONISTAS DEL
FOLATO
*Sulfametoxazol
+ Trimetoprim
10 <5 <5
TETRACICLINAS *Tetraciclina 11 <5 <5
INHIBIDORES DE
BETALACTÁMICOS
*Amoxicilina +
Ácido Clavulánico
13 15 17
*Puntos de corte obtenido de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
(CLSI, 2017) Con negrilla se presenta la resistencia antimicrobiana por parte de las cepas aisladas. Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora
Posteriormente se realizó la serotipificación de las cepas aisladas,
mediante la utilización de diferentes antisueros comerciales (Poly A y
Poly B), para la identificación de antígenos somáticos y flagelares.
27
De las 2 cepas seleccionadas para serotipificación, 1 fue identificada
como Salmonella Infantis, la otra cepa no pudo ser identificada con la
batería de antisueros usada.
28
Discusión
El objetivo del presente estudio fue constatar la presencia de Salmonella
en manubrios de coches de supermercado. Salmonella fue aislado en el
2% (2/100) de las muestras analizadas, confirmando la capacidad de la
bacteria de sobrevivir en estas superficies.
Se ha demostrado que productos de consumo humano con una baja
actividad de agua (Aw) son negativos a Salmonella. (Brenes & Arias,
2016). Sin embargo, esta bacteria es capaz de formar biopelículas sobre
metal, vidrio, polietileno, y superficies de goma (Casarin et al., 2014),
permitiéndole resistir una gran cantidad de condiciones ambientales
(Patrick et al., 2010). Además, Salmonella puede ser viable en
superficies inanimadas hasta 72 horas (Elika, 2013). También hay que
considerar que esta bacteria puede ser viable en un amplio rango de
temperaturas (5 oC a 45 oC) (Elika, 2013). A pesar de que la actividad de
agua óptima de Salmonella es 0.99, estas últimas características le
permitirían sobrevivir en los manubrios de coches de supermercados
como se evidencio en el presente estudio. (Bowman, Waterman,
Williams, & Ponder, 2015; Elika, 2013; Uribe & Suárez, 2006).
Estas observaciones también están apoyadas por estudios que han
documentado la capacidad de adhesión de microorganismos a
superficies inertes, estableciéndose una posible contaminación cruzada
dentro de la industria alimentaria (Casarin et al., 2014). Esta
contaminación se puede extender a superficies de fábricas, equipos y
objetos en el lugar de distribución y venta (Bowman et al., 2015; Elika,
2013). Además, la inadecuada distribución, manipulación y preparación
de los mismos son factores que podrían influir en la diseminación de este
patógeno en la cadena alimenticia (Uribe & Suárez, 2006).
29
Diferentes serotipos de Salmonella pueden estar presentes a lo largo de
la producción de alimentos. Así, en la presente investigación se identificó
el serovar S. Infantis (n=1/2).
Este serotipo ha sido identificado en varios puntos del procesamiento de
los alimentos. Estudios realizados en Brasil mostraron que S. Infantis se
encuentra en carcasas de pollo (Da Cunha-Neto et al., 2018). También
existen estudios realizados en Ecuador en los cuales el mismo serotipo
ha sido aislado en materias primas de origen animal (25%), granja
(87,5%) y camal (100%) (Villagómez, Logacho, & Vinueza, 2017). La
presencia del patógeno desde el inicio de la cadena productiva podría
influir en la contaminación del producto final a ser comercializado y
posiblemente una contaminación cruzada desde los productos cárnicos
en percha hacia los coches de supermercado. Estos datos se corroboran
con un estudio realizado en Estados Unidos donde se vinculó casos de
salmonelosis en niños menores de 5 años a su transporte en conjunto
con productos de cárnicos dentro del coche de supermercado (Patrick
et al., 2010). Esta hipótesis podría estar respaldada por estudios que
demuestran la presencia de Salmonella en productos cárnicos
expendidos en supermercados (Tessmann et al., 2008; Villalpando et al.,
2017).
Otra de las muestras de este estudio no pudo ser serotipificada con la
batería de antisueros disponibles. Esto no debería ser excepcional ya
que el género Salmonella posee más de 2600 serotipos identificados
(Giesen et al., 2012; Scott, Kennedy, & Chengappa, 2013)
Adicionalmente, los resultados de susceptibilidad a los antibacterianos
en el presente estudio mostraron patrones multirresistentes a siete
diferentes antibióticos. Esto concuerda con estudios realizados en
Ecuador, que indican la presencia de fenotipos multirresistentes de
cepas encontradas a nivel de granja, etapa de crianza, planta de
30
faenamiento y carcasas de pollo (Villagómez et al., 2017; Vinueza,
Cevallos, Ron, Bertrand, & De Zutter, 2016).
De igual forma, resultados de estudios realizados en México y Alemania
encontraron cepas multirresistentes de Salmonella aisladas de
vegetales en supermercados (Schwaiger, Helmke, Hölzel, & Bauer,
2011; Thai, Lan, Hirai, & Yamaguchi, 2012).
Las dos cepas aisladas en esta investigación presentaron el 100% de
resistencia a los antibióticos sulfametoxazol + trimetoprim, cloranfenicol,
cefotaxima, nitrofurantoína, tetraciclina, estreptomicina y gentamicina.
Estos antibióticos están en la lista de medicamentos esenciales de la
OMS determinados por categorías. Por ejemplo, sulfametoxazol +
trimetoprim, cloranfenicol, cefotaxima, nitrofurantoína, gentamicina y
tetraciclina están catalogados como antimicrobianos de 1ra prioridad.
Este grupo de antibióticos se define como medicamentos que deben
estar ampliamente disponibles, asequibles y con calidad garantizada.
Por su lado, estreptomicina está catalogado como antibiótico de 3ra
prioridad (Antibiótico de Reserva). En este grupo se encuentran
antimicrobianos deben tratarse como de “último recurso”, deben ser
accesibles, pero cuyo uso debe adaptarse a pacientes en entornos
específicos cuando todas las alternativas han fallado (FAO, OMS, & OIE,
2007; WHO, 2017)
Por otro lado, también se ha observado una alta resistencia a
nitrofurantoína y cefotaxima en enterobacterias aisladas de vegetales
vendidos en supermercados (Schwaiger et al., 2011). Las cepas de este
estudio presentaron susceptibilidad a cefepime, ceftazidima,
kanamicina, ertapenem, cefoxitin, fosfomicina, ciprofloxacina,
azitromicina y amoxicilina + acido clavulánico.
A pesar de que las cepas de Salmonella en este estudio fueron
resistentes a cefotaxima, presentaron sensibilidad a Amoxicilina + Acido
Clavulánico. Esta observación se puede explicar con el efecto sinérgico
31
que un inhibidor de β-lactamasas como el ácido clavulánico pueda tener
(Pérez Fernández, 2010). En este caso las cepas de Salmonella aisladas
tendrían un fenotipo con la presencia de β-lactamasas de espectro
extendido (BLEE) y no AmpC (Fenotipos resistentes a inhibidores de β-
lactamasas) (Álvarez, 2010; Martínez, 2009).
La resistencia a nitrofurantoina encontrada en este estudio, también ha
sido reportada en animales de granja (Alvarez et al., 2012; Fierro-
Amature, Osorio - Amortegui, Fandiño de Rubio, & Rondón - Barragán,
2011; Oliveira et al., 2010). Es importante recalcar que la nitrofurantoina
es un antimicrobiano usado en el tratamiento de infecciones del tracto
genitourinario y muy difundida en veterinaria en varias especies
destinadas a consumo humano (Oliveira, Lúzio de Paula, De Melo,
Souza, & Lopes, 2010). Esto nos hace pensar en la importancia de
realizar monitoreos extensivos sobre la resistencia a este antibiótico para
determinar su evolución.
Las falencias en la limpieza de utensilios, superficies y equipos tras la
manipulación de productos cárnicos, permitirían la contaminación
cruzada entre alimentos y distintas superficies (Abraham et al., 2012).
Esto podría determinar que Salmonella se transfiera a los manubrios de
los coches de supermercado, lo que podría suponer un riesgo para la
salud de los consumidores. Por lo tanto, la adecuada limpieza de los
coches es una práctica que deberían aplicar los supermercados para
disminuir el riesgo asociado a la presencia de patógenos de estas
superficies (FAO, 2017; OMS, 2012).
32
CAPITULO V
Conclusiones y recomendaciones
Conclusiones
➢ El aislamiento de Salmonella obtenido en este estudio sugiere una
baja prevalencia de la cepa encontrada en el manubrio de los coches de
supermercados.
➢ Las cepas obtenidas en el estudio fueron 100% resistentes a los
grupos antibióticos cefalosporinas, aminoglucósidos, fenicoles,
nitrofuranos, antagonistas del folato y tetraciclinas, demostrando así la
presencia de patrones multirresistentes de los aislados provenientes de
los coches de supermercados.
➢ Se aisló e identificó S. Infantis, el cual es un serotipo comúnmente
encontrado en alimentos de origen cárnico.
33
Recomendaciones
➢ Realizar estudios afines a esta investigación en supermercados,
en los cuales se evalúe los factores que intervengan en la diseminación
del microorganismo.
➢ Concluir con la serotipificación de la cepa de Salmonella que no
se pudo serotipificar, así como realizar estudios de tipificación molecular
para valorar su importancia en salud pública.
➢ Socializar los resultados de este estudio a los directivos de los
supermercados para incentivar la optimización de los protocolos de
limpieza y desinfección de los coches de compras.
34
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43
Anexos
44
Anexo 1. Esquema del Aislamiento de Salmonella (Cepas Móviles)
Tubo de ensayo con hisopo estéril sumergido en 2 ml de agua peptonada.
Adicionar relación 1/10 de Agua Peptonada Tamponada, en cada tubo aprox. se añade 3,4 ml.
Sembrar 3 gotas de la muestra incubada en el agar MSRV
POSITIVA Formación de un halo blanco alrededor
del inóculo)
NEGATIVA
Tomar una asada del extremo del halo y sembrar en agar XLD
POSITIVA (Presencia de colonias
transparentes con centro negro)
NEGATIVA
Incubar por 24 a 48 horas a 42°C
Incubar de 24 - 48h a 37°C
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
TSI Urea Indol Lisina
Incubar a 37°C por 24 horas
NEGATIVA
POSITIVA
AUTOCLAVAR
Tomar dos asadas desde TSI y colocarlos en un
tubo epperdorff con 300 µl de TSB
Incubar a 37°C por 24
horas
Adicionar 600 µl de glicerol y guardar los
tubos a -80°C
TSI K/A+G
Urea (-)
Indol
(-)
Lisina (+)
Una vez más
Incubar a 37°C por 24 horas
Homogenizar la muestra (vortex) aprox. 10 segundos
Fuente formato: Nataly Larco
45
Anexo 2. Flujograma Serotipificación de S. Enteritidis, Typhimurium e Infantis
4646
Anexo 2. Flujograma Serotipificación de S. Enteritidis, Typhimurium e Infantis
4747
Anexo 3: Fotografías de proceso de muestreo y trabajo en
laboratorio
Hisopo con medida para muestreo
de coche de supermercado
Tubos e hisopos estériles para
muestreo
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Elemento
que se
desecha en
el muestreo
4848
Paso 1: Pre- enriquecimiento selectivo
Adición de agua peptonada, medio de enriquecimiento nutritivo para
la muestra obtenida.
Fuente: La Autora
Paso 2: Enriquecimiento selectivo
Medio de cultivo MSRV Siembra en MSRV
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
4949
Muestra positiva (halo blanco
alrededor del inóculo)
Muestra negativa (sin crecimiento)
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Paso 3: Siembra en medio selectivo diferencial
Medio selectivo XLD Resultado positivo (crecimiento
colonias con centro negro y halo
rojizo)
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
5050
Paso 4: Confirmación con batería bioquímica
Resultado positivo a Salmonella:
TSI: Fermentación glucosa, formación de H2S, presencia de gas.
SIM: Negativo, se revela con reactivo de Kovacs, formación de anillo
amarillo.
Lisina: Positivo, mantiene su color original (morado).
Urea: Negativo, mantiene su color original (amarillo), no cambia de color.
TSI SIM
LISINA
UREA
5151
ESTUDIO DE PERFIL DE RESISTENCIA
Método de difusión en disco (antibiograma)
1.- Preparación de escala de McFarland 0,5
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
2.- Siembra en medio específico para antibiograma (Agar
Müeller Hinton)
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
5252
3.- Aplicación de antibióticos
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
4.- Incubación por 24 horas a 37 oC
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
5353
5.- Resultado a las 24 horas de incubación a 37 oC
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
