UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE … · con mis estudios universitarios, quienes con su...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA

HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO.

TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA

QUÍMICA

AUTORA: JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO

TUTORA: ING. LORENA ELIZABETH VILLARREAL VILLOTA

QUITO

2015

ii

APROBACIÓN DEL TUTOR

En calidad de Tutora del Trabajo de Grado titulado, “ESTUDIO DEL ADECUADO

CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA

HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO”, me permito certificar que el mismo es original y ha

sido desarrollado por la señorita JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO, bajo mi

dirección y conforme a todas las observaciones realizadas, considero que el trabajo reúne los

requisitos necesarios.

En la ciudad de Quito, a los 30 días del mes de Abril del 2015

Ing. Lorena Elizabeth Villareal Villota MSc.

PROFESORA TUTORA

iii

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO en calidad de autora del trabajo de

grado realizado sobre el ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO

TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO,

por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos

los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines

estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,

seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y

demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.

Quito, 30 de Abril del 2015

Juana Maricela Poalacin Cabascango

C.C. 1804267977

[email protected]

iv

A mis queridos padres Manuel y Carmen

por su amor, comprensión y

sacrificio.

v

AGRADECIMIENTO

A Dios mi guía, y mi fortaleza quien con su amor infinito me dirigió por el camino correcto,

quien me alivió en mis momentos de tristeza y me ayudó a superar los obstáculos que se me

presentaron.

A mis padres Manuel y Carme quienes con esfuerzo y sacrificio permitieron que yo culminara

con mis estudios universitarios, quienes con su cariño y amor forjaron en mí una persona de

bien.

A mi hermana querida Myrian Poalacin quien estuvo alentándome día tras día para seguir

adelante y no renunciar a mis sueños, gracias por entenderme, por tus consejos y especialmente

gracias por ser el instrumento que Dios utilizó para que Él llegara a mi corazón y encontrara el

lado alegre de la vida.

A mis amigos Luis Asero, Melissa Enríquez, Glenda Andrade, Naty Velasco, Johanna Bonilla y

Anita Peralta que siempre estuvieron cuando los necesitaba brindándome su apoyo y amistad

desinteresada, también a mis amigos Diego Pullas, Victoria Ballagán y Margoth Quillupangui

quienes siempre encontraban la forma para hacernos olvidar de los momentos de tristeza.

A la Lic. Celia Velasteguí quien siempre confió en mis capacidades, quien me alentó y ayudó a

que este trabajo se desarrollara.

A mi directora de tesis la Ing. Lorena Villareal quien con sus conocimientos me guio durante

todo el desarrollo de esta investigación.

Mary.

vi

CONTENIDO

pág

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... x

LISTA DE GRÁFICOS ...........................................................................................................xi

LISTA DE TABLAS ..............................................................................................................xii

LISTA DE ANEXOS ............................................................................................................. xiv

SIMBOLOGÍA ....................................................................................................................... xv

RESUMEN ............................................................................................................................ xvi

ABSTRACT ......................................................................................................................... xvii

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1

1. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 3

1.1 Los hongos .......................................................................................................................... 3

1.2 Trichoderma spp. ................................................................................................................ 4

1.2.1 Clasificación Taxonómica. ............................................................................................... 5

1.2.2 Reproducción.. ................................................................................................................. 6

1.2.3 Morfología. ...................................................................................................................... 6

1.2.3.1 Características macroscópicas. ..................................................................................... 6

1.2.3.2 Características microscópicas. ...................................................................................... 6

1.3 Trichoderma harzianum. ..................................................................................................... 7

1.4 Trichoderma hamatum ........................................................................................................ 8

1.5 Mecanismos de Acción ....................................................................................................... 9

1.5.1 Competencia. .................................................................................................................. 9

1.5.2 Micoparasitismo. .............................................................................................................. 9

1.5.3 Antibiosis.. ....................................................................................................................... 9

1.6 Factores que influyen en el crecimiento ............................................................................. 10

1.6.1 Temperatura................................................................................................................... 10

1.6.2 Humedad.. ...................................................................................................................... 10

1.6.3 Aireación. ...................................................................................................................... 10

1.6.4 pH. ................................................................................................................................. 11

vii

1.6.5 Tamaño de partícula del sustrato.................................................................................... 11

1.6.6 Exposición de luz............................................................................................................ 11

1.7 Los hongos en el control biológico .................................................................................... 11

1.8 Sustratos en la producción de Trichoderma spp. ................................................................ 12

1.9 Fermentación .................................................................................................................... 13

1.9.1 Fermentación en medio líquido. ..................................................................................... 13

1.9.2 Fermentación en medio sólido. ....................................................................................... 14

1.9.3 Comparación entre la fermentación en medio sólido y en medio líquido.. ....................... 14

1.10 Curva de crecimiento microbiano .................................................................................... 16

1.11 Aplicaciones de Trichoderma spp. ................................................................................... 17

2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................. 19

2.1 Pruebas preliminares ......................................................................................................... 19

2.2 Diseño experimental .......................................................................................................... 20

2.3 Aplicación del hongo Trichoderma en plantas ................................................................... 24

2.4 Materiales y equipos ......................................................................................................... 24

2.5 Sustancias y reactivos ........................................................................................................ 25

2.6 Procedimientos.................................................................................................................. 25

2.6.1 Producción de Trichoderma spp. . .................................................................................. 25

2.6.2 Preparación del medio de cultivo a base de agar patata dextrosa (PDA) ........................ 27

2.6.3 Procedimiento de resiembra en el medio de cultivo PDA ................................................ 27

2.6.4 Preparación del sustrato en botellas de vidrio y en fundas de polietileno ........................ 27

2.6.5 Siembra del inóculo de Trichoderma spp. en botellas y en fundas.. ................................. 28

2.6.5.1 Recuento celular.. ........................................................................................................ 28

2.6.5.2 Diluciones seriadas. .................................................................................................... 28

2.6.5.3 Cámara de Neubauer................................................................................................... 29

2.6.5.4 Cálculo matemático de la concentración. .................................................................... 31

2.6.6 Procedimiento de contaje de esporas del sustrato sólido ................................................. 32

3. DATOS .............................................................................................................................. 33

3.1 Datos preliminares ............................................................................................................ 33

3.1.1 Datos de las sustancias utilizadas. .................................................................................. 33

3.1.2 Preparación del sustrato en camineras.. ......................................................................... 33

3.1.3 Concentración del inóculo para siembra en camineras. .................................................. 34

3.1.4 Concentración de esporas producidas en camineras.. ..................................................... 34

3.2 Datos del diseño experimental ........................................................................................... 35

viii

3.2.1 Preparación del sustrato en fundas. ................................................................................ 35

3.2.2 Concentración del inóculo para siembra en fundas.. ....................................................... 36

3.2.3 Contaje de esporas producidas en fundas.. ..................................................................... 36

4. CÁLCULOS ....................................................................................................................... 39

4.1 Cálculos de las pruebas preliminares ................................................................................. 39

4.1.1 Cálculo para determinar la cantidad de agua absorbida por el sustrato.. ....................... 39

4.1.2 Cálculo del volumen total de agua adicionada en la preparación del sustrato. ............... 39

4.1.3 Cálculo de la cantidad de agua total............................................................................... 40

4.1.4 Cálculo de la masa del sustrato seco. ............................................................................. 40

4.1.5 Cálculo del porcentaje de humedad. ............................................................................... 41

4.1.6 Cálculo para determinar la concentración de esporas. ................................................... 41

4.2 Cálculos del diseño experimental....................................................................................... 42

4.2.1 Porcentaje de humedad óptimo.. ..................................................................................... 42

4.2.2 Cálculo de la cantidad de agua total. ............................................................................. 42

4.2.3 Construcción de las curvas de crecimiento ..................................................................... 43

4.3 Cálculo estadístico ............................................................................................................ 43

4.3.1 Corrección de logaritmo base 10 a logaritmo natural. .................................................... 43

4.3.2 Cálculo de la velocidad de crecimiento de las curvas...................................................... 44

4.3.3 Cálculo del Coeficiente de variación.. ............................................................................ 45

5. RESULTADOS .................................................................................................................. 46

5.1 Resultados de las pruebas preliminares .............................................................................. 46

5.1.1 Cantidad de agua presente en la preparación del sustrato en camineras.. ....................... 46

5.1.2 Resultados de porcentaje de humedad del sustrato.......................................................... 46

5.1.3 Concentración de esporas obtenida de la propagación en botellas.................................. 47

5.1.4 Curvas de concentración versus volumen de agua adicionado al sustrato. ...................... 48

5.1.5 Curvas de concentración versus porcentaje de humedad.. ............................................... 49

5.2 Resultados del diseño experimental ................................................................................... 50

5.2.1 Volumen de agua óptimo.. .............................................................................................. 50

5.2.2 Resultados de la masa de agua total.. ............................................................................. 51

5.2.3 Resultados de temperatura y % de humedad para propagar Trichoderma. ...................... 51

5.2.4 Construcción de la curva de crecimiento.. ...................................................................... 52

5.3 Curvas de crecimiento obtenidas ....................................................................................... 57

5.4 Resultados estadísticos ...................................................................................................... 60

5.4.1 Resultados de %CV.. ...................................................................................................... 62

5.4.2 Velocidad específica de crecimiento microbiano.. ........................................................... 63

ix

5.5 Selección de las mejores condiciones para producir Trichoderma spp. ............................... 63

5.5.1 Análisis comparativo del % de humedad.. ....................................................................... 63

5.5.2 Análisis comparativo de la concentración.. ..................................................................... 64

5.5.3 Análisis comparativo del coeficiente de variación (%CV).. ............................................. 65

5.5.4 Selección de las mejores condiciones.. ............................................................................ 66

5.6 Resultados de aplicación del hongo Trichoderma spp. ....................................................... 66

6. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 68

7. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 70

8. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 72

CITAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................... 73

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 77

ANEXOS................................................................................................................................ 79

x

LISTA DE FIGURAS

pág

Figura 1. Hifa mostrando los principales organelos celulares. .................................................... 3

Figura 2. Estructura del 6-pentil-α-pirona .................................................................................. 5

Figura 3. Características macroscópicas de Trichoderma spp. .................................................... 6

Figura 4. Características microscópicas de Trichoderma spp. .................................................... 7

Figura 5. Trichoderma harzianum ............................................................................................. 8

Figura 6. Trichoderma hamatum ............................................................................................... 8

Figura 7. Tipos de sustratos ..................................................................................................... 12

Figura 8. Curva de crecimiento microbiano ............................................................................. 16

Figura 9. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la

curva de crecimiento del hongo Trichoderma harzianum (TH) ................................................ 22

Figura 10. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la

curva de crecimiento del hongo Trichoderma hamatum (THa). ................................................ 23

Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de producción de Trichoderma spp. ......................... 26

Figura 12. Diluciones seriadas ................................................................................................. 29

Figura 13. Cámara de Neubauer .............................................................................................. 30

Figura 14. Divisiones de la zona de conteo .............................................................................. 30

Figura 15. Recuento con alta concentración celular ................................................................. 31

Figura 16. Aplicación en plantas de fresas ............................................................................... 66

Figura 17. Resultados luego de un mes de aplicación en plantas de fresa ................................. 67

Figura 18. Aplicación de los microorganismos en plantas de mora........................................... 67

Figura 19. Resultados luego de 50 días de aplicación en plantas de moras ............................... 67

xi

LISTA DE GRÁFICOS

pág

Gráfico 1. logC = f (Va) para Trichoderma harzianum ............................................................. 48

Gráfico 2. logC = f (Va) para Trichoderma hamatum ............................................................... 49

Gráfico 3. logC = f (%H) para Trichoderma harzianum ........................................................... 49

Gráfico 4. logC = f (%H) para Trichoderma hamatum ............................................................. 50

Gráfico 5. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condición 1................................. 57



Gráfico 8. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condición 1 ................................... 58

Gráfico 9. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condición 2 ................................... 59

Gráfico 10. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condición 3 ................................. 59

Gráfico 11. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condición 1 ..................... 60



Gráfico 14. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condición 1 ....................... 61



Gráfico 17. Análisis comparativo de la humedad ..................................................................... 64

Gráfico 18. Análisis comparativo de la concentración de esporas............................................. 65

Gráfico 19. Análisis comparativo del coeficiente de variación ................................................. 65

xii

LISTA DE TABLAS

pág

Tabla 1. Comparación entre la fermentación líquida y sólida ................................................... 15

Tabla 2. Volumen de agua adicionada en la preparación del sustrato ....................................... 19

Tabla 3. Número de repeticiones realizadas ............................................................................. 21

Tabla 4. Datos de las sustancias utilizadas ............................................................................... 33

Tabla 5. Datos de preparación del sustrato para TH en camineras ............................................ 33

Tabla 6. Datos de preparación del sustrato para THa en camineras .......................................... 33

Tabla 7. Datos de concentración del inóculo para siembra en camineras .................................. 34

Tabla 8. Datos del recuento celular de TH en camineras .......................................................... 34

Tabla 9. Datos del recuento celular de THa en camineras ........................................................ 35

Tabla 10. Datos de preparación del sustrato para TH en fundas ............................................... 35

Tabla 11. Datos de preparación del sustrato para THa en fundas .............................................. 36

Tabla 12. Datos de concentración del inóculo para siembra en fundas...................................... 36

Tabla 13. Datos de contaje de esporas para Trichoderma harzianum........................................ 37

Tabla 14. Datos de contaje de esporas para Trichoderma hamatum .......................................... 38

Tabla 15. Función estimación lineal para los dos microorganismos.......................................... 43

Tabla 16. Resultados de preparación del sustrato para TH en camineras .................................. 46

Tabla 17. Resultados de preparación del sustrato para THa en camineras ................................. 46

Tabla 18. Resultados de humedad del sustrato para TH ........................................................... 47

Tabla 19. Resultados de humedad del sustrato para THa .......................................................... 47

Tabla 20. Resultados de la concentración obtenida de TH en camineras................................... 47

Tabla 21. Resultados de la concentración obtenida de THa en camineras ................................. 48

Tabla 22. Resultados de volumen de agua óptima para TH ...................................................... 50

Tabla 23. Resultados de volumen de agua óptima para THa..................................................... 51

Tabla 24. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de TH ........................................ 51

Tabla 25. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de THa....................................... 51

Tabla 26. Resultados del %H a las diferentes condiciones ....................................................... 52

Tabla 27. Resultados de concentración de TH ......................................................................... 53

Tabla 28. Resultados de concentración de THa ........................................................................ 54

xiii

Tabla 29. Resultados del logaritmo de la concentración para TH ............................................. 55

Tabla 30. Resultados del logaritmo de la concentración para THa............................................ 56

Tabla 31. Resultados estadísticos corregidos ........................................................................... 63

Tabla 32. Resultados de velocidad específica de crecimiento ................................................... 63

Tabla 33. Promedio de la Concentración ................................................................................. 64

Tabla 34. Mejores condiciones de crecimiento ........................................................................ 66

xiv

LISTA DE ANEXOS

pág

ANEXO A. Taxonomía de Trichoderma spp. .......................................................................... 80

ANEXO B. Biograma Microbiano .......................................................................................... 81

ANEXO C. Norma INEN 1690 ............................................................................................... 82

ANEXO D. Materiales necesarios ........................................................................................... 83

ANEXO E. Propagación de Trichoderma en cajas Petri ........................................................... 84

ANEXO F. Preparación del sustrato ........................................................................................ 85

ANEXO G. Esterilización del sustrato ..................................................................................... 86

ANEXO H. Preparación del inóculo ........................................................................................ 87

ANEXO I. Inoculación del sustrato ......................................................................................... 88

ANEXO J. Determinación de la concentración de esporas ....................................................... 89

ANEXO K. Incubación de las especies .................................................................................... 90

xv

SIMBOLOGÍA

TH Trichoderma harzianum

THa Trichoderma hamatum

mab masa de agua absorbida por el sustrato

mH+c masa húmeda más cedazo

mc masa del cedazo

ms masa del sustrato (arrocillo)

Va volumen de agua adicionado

Vab volumen de agua absorbido

Vad volumen de agua adicionado

ma masa de agua para preparar el sustrato

mat masa de agua total

mas masa de agua en el arrocillo

mss masa del sustrato seco

%H humedad expresado en porcentaje

C concentración de esporas

Ne Número de esporas contadas

D Dilución

T Temperatura

t tiempo

μ velocidad de crecimiento

Sμ Desviación de la pendiente

%CV Coeficiente de variación

logC logaritmo base 10 de la concentración

Concentración promedio

Vop Volumen óptimo

UFC Unidades formadoras de colonias

xvi

ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA

HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO

RESUMEN

Se establecieron las mejores condiciones de crecimiento de los hongos Trichoderma harzianum

y Trichoderma hamatum, en arrocillo usado como sustrato sólido. Para ello, se utilizaron cepas

nativas del cantón Ambato, aisladas del suelo por el MAGAP-Tungurahua y purificadas por la

empresa “Plantsphere Laboratories (PSL)”. Se trabajó experimentalmente con cuatro

humedades de sustrato, para la primera especie: 39,6%; 37,7%; 35,7% y 33,2%, para la

segunda: 41,3%; 38,2%; 34,8% y 31%. Las esporas se incubaron a tres temperaturas: ambiente

(21°C), 25°C y 28°C, con exposición natural de luz. Con las mejores humedades obtenidas para

cada especie y temperatura, a partir de las curvas de concentración de esporas versus humedad,

se procedió a una nueva inoculación, que permitió determinar la velocidad de desarrollo de

estos microorganismos, mediante las curvas de crecimiento.

Se concluye que a 25°C y 41,3% de humedad, se reduce el tiempo de producción de estos

hongos, obteniendo para las dos especies un valor máximo de 1,5x107 UFC/mL a los 12 días de

incubación.

PALABRAS CLAVES: / CRECIMIENTO / HONGOS / TRICHODERMA HARZIANUM /

TRICHODERMA HAMATUM / SUSTRATO SÓLIDO / TEMPERATURA DE INCUBACIÓN/

xvii

STUDY OF THE APPROPRIATE GROWTH OF THE FUNGI TRICHODERMA

HARZIANUM AND TRICHODERMA HAMATUM IN A SOLID SUBSTRATE

ABSTRACT

The best conditions were established for the growth of the Trichoderma harzianum and

Trichoderma hamatum fungi, in jungle-rice used as a solid substrate. To achieve this, native

strains from the area of Ambato were used, isolated in the ground by the MAGAP-Tungurahua

(Ministry of Agriculture, Livestock, Aquaculture and Fishing – Tungurahua branch) and

purified by the company “Plantsphere Laboratories (PSL)”. The work was done experimentally

using four levels of substrate moisture, for the first specie: 39,6%; 37,7%; 35,7% and 33,2%; for

the second one: 41,3%; 38,2%; 34,8% and 31%. The spores were incubated at three different

temperatures: environment (21°C), 25°C and 28°C, with natural exposure to light. With the best

moisture for each specie and temperature, and using the curves of spore concentration versus

moisture level, a new inoculation was performed, which allowed the determination of the

growth rate presented by these microorganisms, with the application of growth curves.

The conclusion is that at 25°C and 41,3% moisture level, the production rate presented by these

fungi is reduced, obtaining in both species a maximum value of 1,5x107 UFC/mL after 12 days

of incubation.

KEYWORDS: / GROWTH / FUNGI / TRICHODERMA HARZIANUM / TRICHODERMA

HAMATUM / SOLID SUBSTRATE / INCUBATION TEMPERATURE /

1

INTRODUCCIÓN

El Ecuador es considerado un país netamente agrícola. Grandes extensiones de tierras son

cultivadas para satisfacer la demanda de los consumidores, que día tras día se incrementa por el

constante crecimiento de la población. Los agricultores elevan la productividad del campo,

garantizan sus cosechas utilizando elevadas cantidades de plaguicidas, para controlar las

enfermedades de las plantas, siendo perjudiciales para los consumidores y el medio ambiente.

Además con el paso del tiempo este uso indiscriminado de productos tóxicos se ha vuelto

ineficaz, induciendo a la generación de plagas resistentes y difíciles de controlar.

La conciencia social que se ha generado en los últimos años ante el enorme deterioro

medioambiental por el uso abusivo de compuestos contaminantes, ha generado un gran interés

en la búsqueda de nuevas estrategias de producción, que sean ambientalmente sostenibles para

el control de plagas y enfermedades.

Una de las alternativas más innovadoras para garantizar la seguridad alimentaria, para disminuir

los residuos tóxicos, los contaminantes del suelo y los recursos hídricos que alteran el equilibrio

ecológico es la utilización del control biológico, un método que recurre a la ayuda de

microorganismos antagonistas de los agentes infecciosos para controlarlos de forma natural.

En el suelo se encuentran una gran cantidad de microorganismos benéficos, entre estos el hongo

Trichoderma. Constituyen un grupo de microorganismos filamentosos, que producen sustancias

antibióticas, metabolitos antifúngicos, son competidores por espacio y nutrientes frente a otros

microorganismos. Protegen las raíces de las plantas, desdoblan la materia orgánica facilitando la

asimilación de nutrientes, son fáciles de aislar, crecen en una amplia gama de sustratos siendo

factible su propagación masiva. También tiene capacidad de adaptación y supervivencia en

cultivos de alta contaminación producida por fungicidas.

El interés actual de disminuir el impacto ambiental con producciones más limpias para proteger

los recursos naturales ha generado que hace poco tiempo estas especies adquieran un valor

comercial importante. Aunque en el mercado mundial ya se cuentan con formulados a base de

Trichoderma para el control de microorganismos, en el país existe muy poca información. Por

2

tal razón este proyecto consiste en el estudio de la adecuada producción masiva de dos especies

endémicas del cantón Ambato, Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum en sustrato

sólido, con ayuda de curvas de crecimiento desarrolladas a condiciones controladas.

En el crecimiento de estos hongos se estudiaron dos variables esenciales que son; la cantidad de

agua para la preparación del sustrato y la temperatura de incubación, permitiendo generar mayor

producción de esporas en un menor tiempo. Como primer punto se replicó las especies en cajas

Petri, luego se multiplicó en botellas de vidrio “camineras” y finalmente en fundas de

polietileno.

Se realizó ensayos de humedad del sustrato para determinar el mejor valor, además para generar

comparaciones las especies fueron sometidas a tres temperaturas: al ambiente (21°C), 25°C y

28°C, dando como resultado una máxima concentración de esporas a la humedad del 41,3% y

temperatura de 25°C a los doce días de tratamiento.

Como etapa final los biofungicidas obtenidos, fueron aplicados en plantas de moras y fresas

dando como resultado mayor rapidez de desarrollo, mejor intensidad del color y brillo,

indicativos de que plantas se encuentran sanas y que los microorganismos estudiados si ejercen

un efecto positivo en ellas.

Este análisis además de generar información propia y vital para el laboratorio, permitió conocer

el comportamiento de los microorganismos frente a los tratamientos realizados y optimizar dos

variables del proceso productivo, obteniendo un bio fungicida que ejercerá una acción efectiva

en los diferentes cultivos donde sean aplicados, logrando cosechas más sanas.

3

1. MARCO TEÓRICO

1.1 Los hongos

Son microorganismos eucarióticos, heterótrofos, que requieren de compuestos orgánicos para su

nutrición. Secretan enzimas hidrolíticas, como lipasas, pectinasas y proteinasas que ayudan a

descomponer una gran variedad de sustratos, para absorber los nutrientes que hay en las hojas

muertas y otros materiales orgánicos del suelo.

Se alimentan de materia orgánica muerta, por lo que se les conoce como saprofitos, estos

generalmente no causan enfermedades. Solo descomponen restos complejos de vegetales y

animales, degradándolos a sustancias químicas más sencillas que son devueltas al suelo,

aumentando así su fertilidad. [1]

Algunos hongos pueden prosperar como parásitos invadiendo a sus hospedadores vivos

causando enfermedades (hongos patógenos) en plantas, animales y seres humanos. Los hongos

fitopatógenos ejercen un gran impacto económico en la industria agrícola debido a las

enfermedades que les pueden causar a los cultivos.

Poseen una pared celular que contiene quitina, están formados por largas fibras ramificadas,

llamadas hifas, las cuales forman el cuerpo principal del hongo o micelio. En la figura 1 se

indica una hifa con los principales organelos celulares.[2]

Figura 1. Hifa mostrando los principales organelos celulares.

4

Las hifas están rodeadas de una pared celular en forma de tubo que rodea una cavidad central o

lumen, donde se encuentra el protoplasma. La pared es de consistencia rígida y está compuesta,

principalmente, de hemicelulosa y quitina (dos polímeros fibrilares, el primero de N-

acetilglucosamina y el segundo de glucosa). [3]

La reproducción puede ser: [4]

1) Asexual, por fisión binaria, gemación o formación de esporas

2) Sexual, por fusión de los núcleos de dos células afines.

Se desarrollan prácticamente sobre cualquier sustrato pero necesitan de humedad, la cual la

obtienen de la atmósfera o del medio sobre el cual están creciendo. Si las condiciones son

adversas y el hábitat se vuelve muy seco, estos sobreviven entrando en una fase latente o

produciendo esporas resistentes a la deshidratación.

Los hongos alcanzan un óptimo desarrollo en ambientes oscuros y húmedos con temperaturas

entre 22 y 30°C aunque algunos pueden crecer a temperaturas tan altas como 62 °C, tan bajas

como 0 °C o menos y toleran amplios rangos de pH de 2 a 9 pero casi todos crecen mejor en un

pH ácido. [5]

Son importantes porque permiten la elaboración de pan, cerveza, quesos maduros, bebidas

espirituosas (vinos, champañas), son la base de medicinas como la penicilina, se utilizan en la

biorremediación, en la agricultura, la horticultura y la silvicultura. Pero pueden ser dañinos

cuando pudren madera, textiles, papel, alimentos, etc. [6]

1.2 Trichoderma spp.

Las especies de este género se encuentran ampliamente distribuidas por todas las latitudes, y se

presentan naturalmente en diferentes ambientes, especialmente en aquellos que contienen

materia orgánica o desechos vegetales en descomposición. [7]

Este beneficioso hongo es filamentoso, heterótrofo, aerobio, su pared celular está compuesta de

quitina, coloniza fácilmente las raíces de las plantas, las mejora e impide que nuevos hongos

colonicen la zona donde éste se desarrolla. Son los antagonistas más utilizados para el control

biológico debido a su facilidad para ser aisladas y cultivadas en un gran número de sustratos.

Además no son patógenos de plantas, ni peligrosos para los humanos o animales.

5

Su presencia puede ser detectada por un ligero olor a coco en el sustrato, así como por su color

verde y blanquecino. Producen enzimas y vitaminas, “antibióticos” que al ser absorbidos por las

raíces de las plantas generan un crecimiento más rápido. En ciertos casos el antibiótico formado

es específico contra el patógeno de las plantas, garantizando así su eficacia.

La población de Trichoderma decrece especialmente cuando la humedad del ambiente

desciende por largos períodos de tiempo. Otros estudios han determinado que el pH, la

concentración de CO2, HCO3, sales y el contenido de materia orgánica son factores físicos y

químicos determinantes para la variación de la cantidad de estas especies, además de la

presencia o ausencia de otros microorganismos en el ambiente. [8]

Trichoderma spp. durante su proceso de producción genera metabolitos volátiles antifúngicos

como la lactona 6-pentil -α-pirona (6PAP) con aroma a coco, que es un líquido de color amarillo

a naranja, tiene la fórmula molecular C10H14O2. La figura 2 presenta la estructura del 6PAP. [9]

CH3(CH2)3CH2 O O

Figura 2. Estructura del 6-pentil-α-pirona

1.2.1 Clasificación Taxonómica. Las especies del género Trichoderma spp. pertenecen a un

grupo de hongos filamentosos que han sido caracterizados por sus aplicaciones en el sector

agrícola como controladores biológicos de una amplia gama de organismos patógenos.

La clasificación taxonómica del género Trichoderma es: [10]

Reino: Fungi

División Ascomycota

Subdivisión: Pezizomycota

Clase: Sordariomycetes

Orden: Hypocreales

Familia: Hypocreaceae

Género: Trichoderma

6

1.2.2 Reproducción. Las especies Trichoderma spp. se reproduce asexualmente, pueden utilizar

una gran variedad de sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidón como fuente

de carbono. Muchas cepas crecen eficientemente en medios sólidos o líquidos y en un amplio

rango de temperaturas, son relativamente tolerantes a humedades bajas y crecen en suelos

ligeramente ácidos.

1.2.3 Morfología.

1.2.3.1 Características macroscópicas. Las colonias se reconocen fácilmente por su rápido

crecimiento y sus coloraciones son: blancas – verdes o amarillo – verdosas; las áreas con

colonias se presentan con anillos concéntricos. El revés de las colonias son usualmente de

colores, amarillo, ámbar o amarillo – verde. En la figura 3 se observan las características que

presenta Trichoderma. [11]

Figura 3. Características macroscópicas de Trichoderma spp.

1.2.3.2 Características microscópicas.

Conidióforos. Son erectos, hialinos, no verticilados, en su mayoría ramificados, parecen un

árbol pequeño con un sistema de ramas irregulares de manera piramidal y pueden estar

solitarios o en grupos (figura 4). [12]

Fiálides. Son en forma de botella, pueden estar solas o en grupos, hinchada en la región

central pero delgada hacia el ápice: son hialinas y en ángulo recto con respecto a los

7

conidióforos. Es donde se forman las esporas asexuales o conidios, de gran importancia para

la identificación taxonómica a nivel de especies. [13]

Conidios. Son esporas asexuales de color verde – amarillo – blanco, con esporulación densa

que aseguran la generación del hongo durante gran parte del período vegetativo de las

plantas. Su pared está compuesta por quitina y glucanos. Su función es la reproducción

rápida, dispersión y supervivencia. [14]

Figura 4. Características microscópicas de Trichoderma spp.

La mayoría de las especies de Trichoderma tienen la capacidad de producir clamidosporas en

sustratos naturales, estructuras de vital importancia para la sobrevivencia del género en el suelo

ya que soportan condiciones ambientales adversas.

1.3 Trichoderma harzianum.

Sus colonias son de color amarillo verdoso (Figura 5). Interviene como digestor del nitrógeno

orgánico. Es tolerante a la tensión impuesta por escasez de nutrientes, se utiliza en el control

biológico como fungicida, en aplicación foliar, tratamiento de semillas y el tratamiento del suelo

para la supresión de diversos patógenos que provocan enfermedades fúngicas. También controla

el marchitamiento (una enfermedad que mata las plantas jóvenes, ennegreciendo y encogiendo

los tallos). [15]

8

Figura 5. Trichoderma harzianum

Penetra las raíces de las plantas sin causar daños, provocando cambios bioquímicos y formación

de barreras físicas. Los metabolitos que produce esta especie se encuentran relacionados con la

composición del medio en el que se encuentra, es decir los nutrientes que tiene disponible.

Disminuye su población conforme aumenta la altura sobre el nivel del mar. Su ambiente óptimo

son climas templados. [16]

1.4 Trichoderma hamatum

Al ser incorporada en el suelo adquiere un potencial como agente de biocontrol, regulando

poblaciones de nemátodos que generan un especie de marchitamiento de las plantas dañando las

raíces e impidiendo la absorción de los nutrientes. Por tal motivo mejora la supervivencia de las

plantas de caña de azúcar, de tomate de árbol, de plátano, de papa, etc. En la figura 6 se observa

a esta especie. [17]

Figura 6. Trichoderma hamatum

9

1.5 Mecanismos de Acción

El hongo Trichoderma presenta distintos mecanismos de acción para ejercer su antagonismo,

dependiendo de las características de la cepa de Trichoderma, del patógeno y las condiciones

ambientales, entre estos tenemos competencia, parasitismo y antibiosis.

1.5.1 Competencia. Para que exista competencia es necesario la escasez o limitación de un

requerimiento (espacio y/o nutrientes), por lo que la competencia puede definirse como el

comportamiento desigual de dos o más organismos ante un mismo requerimiento, siempre y

cuando la utilización por uno de ellos, reduzca la cantidad necesaria para los demás. [18]

La presencia natural de Trichoderma en diferentes ambientes demuestra que son excelentes

competidores por espacio y recursos nutricionales. Este modo de acción se ve favorecido por la

velocidad de crecimiento que presentan la mayoría de estas especies que frenan el desarrollo a

los competidores.

1.5.2 Micoparasitismo. Se refiere al hecho de que un microorganismo parasita a otro, en este

caso a un patógeno de plantas. Consiste en la utilización del patógeno como alimento por su

antagonista. [19]

Trichoderma es un hongo muy favorable porque no ataca a los seres vivos. Producen enzimas

como la β-1,3-glucanasa que ayudan a degradar las paredes celulares de las hifas del hongo a

destruir (huésped), consiguiendo así absorber los nutrientes del interior del hongo atacado.

En Biocontrol (2004) se indica que el proceso micoparasítico incluye las siguientes etapas: [20]

Crecimiento de Trichoderma.

Reconocimiento superficial del huésped.

Secreción de enzimas.

Penetración de las hifas.

Lisis del huésped.

1.5.3 Antibiosis. Se define como la inhibición del crecimiento de un microorganismo por

sustancias producidas y liberadas por otro microorganismo.

10

“Los metabolitos con actividad antifúngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de

compuestos volátiles y no volátiles, muy diverso en cuanto a estructura y función. Muchas cepas

de Trichoderma producen estos metabolitos secundarios, algunos de los cuales inhiben otros

microorganismos, con los que no se establece contacto físico, estas sustancias inhibitorias son

consideradas como antibióticos”. [21]

1.6 Factores que influyen en el crecimiento

1.6.1 Temperatura. La temperatura influye notablemente en el crecimiento fúngico y en la

formación y germinación de conidios. El rango de temperatura para el crecimiento de

Trichoderma se encuentra entre 10 - 40°C y tiene su óptimo de crecimiento alrededor de los 25

y 30°C. Pueden soportar temperaturas extremas y, aunque no pueden crecer, sus conidios se

mantienen viables y germinarán cuando recuperen las condiciones apropiadas. El descenso de la

temperatura provoca una ralentización del metabolismo, y es una medida que se utiliza para

frenar, en general, el deterioro de productos almacenados. [22]

1.6.2 Humedad. La actividad metabólica del hongo depende estrechamente de la humedad del

medio (sustrato), ya que esta variable influye significativamente en el crecimiento microbiano,

en la biosíntesis y la secreción de diferentes metabolitos.

Un bajo contenido de humedad limita la difusión de los nutrientes y la degradación del sustrato,

dando como resultado un bajo crecimiento microbiano. Mientras que, altos valores de humedad

en la matriz sólida disminuye la porosidad del sustrato dificultando la transferencia de oxígeno.

Por este motivo, es conveniente buscar el nivel óptimo de humedad con el objeto de optimizar el

crecimiento del microorganismo o, en su caso, obtener una mayor producción de metabolitos

(enzimas, ácidos orgánicos, etc.). [23]

En general, los contenidos de humedad encontrados en los procesos de fermentación sólida se

encuentran entre el 30% y 85%. Para cultivos bacterianos, la humedad del sustrato debe ser

superior al 70%, mientras que en el caso de los hongos filamentosos, ésta podría encontrarse en

un rango que oscila entre el 20% y el 70%. [24]

1.6.3 Aireación. Dos componentes del aire son esenciales para los hongos: el oxígeno y el

dióxido de carbono, sin embargo es necesario tener en cuenta que altas concentraciones de CO2

11

como resultado de la respiración celular se puede acumular en ambientes cerrados, inhibiendo el

crecimiento de este microorganismo. [25]

1.6.4 pH. El hongo Trichoderma soporta un rango de pH relativamente amplio para su

crecimiento. Presenta crecimiento a valores de pH comprendidos entre 2.0 y 9.0, con un

intervalo de pH óptimo que se encuentra entre 4.0 y 7.0. A pH ácido, la asimilación de

nutrientes como glucosa ejerce una influencia importante sobre el crecimiento del hongo y su

posterior esporulación. Además, procesos como la germinación, se ven afectados por la escasez

de nutrientes y por niveles de pH por encima de 9.0. [26]

1.6.5 Tamaño de partícula del sustrato. El tamaño de partícula es un factor importante a tener

en cuenta. Los sustratos de partículas pequeñas proporcionan una gran área específica, lo que

afecta de manera positiva al desarrollo del microorganismo. Sin embargo, un tamaño de

partícula demasiado pequeño, que genere a su vez un espacio interarticular reducido, disminuye

la eficiencia de la respiración/aireación dificultando el crecimiento microbiano. [27]

1.6.6 Exposición de luz. La mayoría de especies del género Trichoderma son fotosensibles,

puesto que se presentan una mayor esporulación al ser expuestas a la luz. Sin embargo, cuando

se someten a períodos alternados de luz y oscuridad, se favorece la colonización del hongo

sobre diferentes sustratos sólidos. [28]

1.7 Los hongos en el control biológico

El control biológico puede definirse como un método de control de plagas, enfermedades y

malezas que consiste en utilizar organismos vivos con objeto de controlar las poblaciones de

otros organismos. Tienen una serie de ventajas como: son más seguros, pueden persistir durante

más tiempo, producen un balance ecológico.

El control biológico se produce de forma natural sin intervención del hombre, permite modificar

el equilibrio entre las poblaciones microbianas gracias a los mecanismos de acción entre los

patógenos y los microorganismos antagonistas. Los hongos poseen un conjunto de

características que los hacen agentes de biocontrol potencialmente ideales. [29]

1. Muchas de las especies saprofitas antagonizan a la mayoría de los organismos de las plagas.

12

2. Se desarrollan fácilmente en medios de cultivo pudiendo producirse en grandes cantidades y

ser liberados al medio ambiente como esporas o fragmentos de micelio.

3. Los inóculos liberados crecerán y producirán un nuevo micelio que parasitará o inhibirá la

plaga sin causar daño a las plantas.

4. Tienen la facilidad de sobrevivir durante períodos de tiempo relativamente largos.

5. Los compuestos biológicamente activos no causan daño al medio ambiente.

1.8 Sustratos en la producción de Trichoderma spp.

Los sustratos empleados para la producción de microorganismos, en lo posible deben contener

todos los elementos necesarios para una adecuada síntesis del material celular y para la

producción de metabolitos, cuando son requeridos. [30]

En el proceso de esporulación de Trichoderma spp. la fuente de carbono (C) presente en el

sustrato es el reactivo en exceso, mientras que el contenido de nitrógeno (N) es el factor

limitante de crecimiento. La relación carbono: nitrógeno es esencial ya que de este balance

dependerá la formación de las esporas deseadas. [31]

Generalmente se utilizan compuestos procedentes de la agricultura, subproductos de la

agroindustria aunque se prefiere el desecho de compuestos orgánicos debido a que suplen la

demanda de nutrientes requeridos por los microorganismos a un bajo costo. En la figura 7 se

indican algunos tipos de sustratos. [32]

Figura 7. Tipos de sustratos

13

Arroz. Es el cereal más rico en almidón y la estructura química de este es relativamente

sencillo comparado con otros sustratos.

Esencialmente el almidón está compuesto de dos polímeros relacionados en diferentes

proporciones: amilosa (16 – 30%) y amilopectina (68 – 85%). La amilosa es un polímero de

glucosa unido por enlaces α-1,4 glucosídicos principalmente cadenas lineales. La

amilopectina es un polímero de glucosa altamente ramificado incluyendo también enlaces

α-1,6 glucosídicos en los puntos de ramificación. De esta manera el hongo Trichoderma

spp., hidroliza el polímero del almidón mediante enzimas como glucoamilasas, α –

amilasas, β – amilasas, [33]

permitiendo el crecimiento micelial y la producción de esporas.

1.9 Fermentación

Desde el punto de vista microbiológico, se entiende por fermentación aquel proceso en el que

los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilización de sustancias

orgánicas, en ausencia o presencia de oxígeno. La descomposición de los sustratos se lleva a

cabo por enzimas producidas por los microorganismos. [34]

Los microorganismos implicados en los procesos fermentativos pueden obtener su energía y su

fuente de carbono por la degradación de los compuestos orgánicos. La producción comercial de

productos de fermentación ha empleado principalmente diversas especies de bacterias,

levaduras y hongos. En general, la producción masiva de microorganismos biocontroladores

puede llevarse a cabo mediante dos técnicas: fermentación líquida o sumergida y fermentación

sólida o en superficie. [35]

1.9.1 Fermentación en medio líquido. También es conocida como fermentación sumergida. En

este proceso se da la producción de microorganismos en medio líquido donde todos los

nutrientes están disueltos en el medio de cultivo y se desarrolla por medio de condiciones

fisicoquímicas. [36]

Este método es el más usado por la industria biotecnológica gracias a las siguientes ventajas: se

obtiene un producto más homogéneo, es más sencillo el control de la temperatura, aireación,

agitación, y pH, además se puede llevar a cabo la medición directa de la biomasa. [37]

14

1.9.2 Fermentación en medio sólido. Las fermentaciones en sustratos sólidos, utilizadas para el

cultivo de microorganismos en materiales sólidos que contienen o no una cantidad limitada de

agua libre, se emplea en la obtención de enzimas fúngicos por cultivo en superficie. En este

proceso el sustrato sirve como soporte para que los microorganismos crezcan sobre él. Presenta

algunas ventajas como un menor costo de inversión, la reducción del costo energético y un

menor volumen de aguas residuales producidas. [38]

La técnica de fermentación en medio sólido consiste de las siguientes etapas: [39]

1. Preparación de la mezcla sólida

2. Reducción de la carga microbiana del sustrato mediante la inyección directa de vapor de

agua o por esterilización en autoclave

3. Inoculación de la matriz sólida con un inóculo líquido

4. Ajuste de la humedad y pH

5. Puesta del medio en el fermentador

6. Inyección continua o intermitente de aire a temperatura y humedad controladas

7. Secado hasta obtener la humedad residual

8. Molienda o adecuación de tamaño de partícula

9. Obtención del ingrediente activo.

Los hongos filamentosos son los microorganismos más adaptados para crecer en sustratos

sólidos con un bajo contenido de agua libre, reduciendo la probabilidad de contaminación por

bacterias o levaduras: además tienen la capacidad de utilizar polisacáridos como fuentes de

carbono.

1.9.3 Comparación entre la fermentación en medio sólido y en medio líquido. En la tabla 1 se

observan las diferencias que presenta estas fermentaciones. [40]

15

Tabla 1. Comparación entre la fermentación líquida y sólida

Factor Fermentación líquida Fermentación sólida

Sustratos Sustratos solubles (azúcares)

Sustratos económicos de carácter

agroindustrial y biopolímeros

insolubles (almidón, celulosa,

pectina, lignina)

Agua Elevado consumo de agua Consumo limitado de agua y baja

actividad de agua

Temperatura Fácil control de la temperatura,

alta transferencia de calor

Capacidad de transferencia de calor

bajo

Aireación

Se requiere la inyección de altos

volúmenes de aire, el oxígeno

soluble es limitado

Fácil aireación y elevada superficie

de intercambio de aire / sustrato

Control de pH Fácil control de pH por la

homogeneidad del sistema

Difícil control de pH. Se deben

emplear sustancias o sustratos con

propiedades amortiguadoras

Agitación

Mecánica

Se requiere para lograr una buena

homogenización Se opera bajo condiciones estáticas

Escalamiento Disponibilidad de equipos a nivel

industrial

Necesita el diseño de nuevos equipos

y de un desarrollo ingenieril

Inoculación Fácil inoculación, proceso

continuo La inoculación de esporas es por lote

Contaminación Alto riesgo de contaminación

bacteriana

El bajo contenido de humedad hace

menos probable la contaminación por

bacterias

Gasto Energético Genera un elevado consumo

energético

Los requerimientos de energía son

bajos

Tamaño y volumen

del equipo

Se manejan altos volúmenes y la

inversión en equipos y tecnología

es elevada

Se manejan volúmenes más bajos y

el costo de los equipos es menor

Efluentes y

contaminación

Altos volúmenes de efluentes y

contaminación

Bajos volúmenes de efluentes y

contaminantes

Concentración del

producto

Dependiendo del producto de

interés

Fácil producción de propágulos y

esporas fúngicas

16

1.10 Curva de crecimiento microbiano

Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del microorganismo a través del

tiempo. En la figura 8, se muestran las fases de crecimiento de los microorganismos. [41]

Figura 8. Curva de crecimiento microbiano

En la curva de crecimiento se diferencian cuatro fases, la fase de latencia, la fase de crecimiento

exponencial o logarítmico, la fase estacionaria y la fase de muerte celular. Aunque el tiempo de

duración de cada una de estas etapas, puede variar según el tipo de microorganismo, la familia a

la cual pertenece, entre otras características.

A) Fase de latencia.

También es conocida como fase lag; coincide con el período de adaptación del microorganismo

a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. Se presenta inmediatamente después de la

inoculación y su duración depende del estado fisiológico de la célula inoculada y de las

condiciones ambientales. Durante este periodo, el número de células no se incrementa, pues el

microorganismo utiliza la energía disponible con el fin de sintetizar las enzimas que requiere

para su desarrollo en el nuevo medio.

B) Fase logarítmica.

Esta fase presenta mayor interés por ser la etapa donde las células se multiplican a la máxima

velocidad, su crecimiento puede ser cuantificado con base en el número de células que se

producen por unidad de tiempo (para levaduras y bacterias) o por el aumento en la biomasa por

17

unidad de tiempo (para hongos filamentosos). La velocidad de crecimiento durante este periodo

permanece constante y es independiente de la concentración del sustrato, siempre y cuando esta

sustancia se encuentre en exceso.

C) Fase estacionaria.

En esta etapa, la velocidad de crecimiento (reproducción) del microorganismo es igual a la

velocidad de mortalidad. Si la población no se reproduce ni muere, el número de células

permanece constante y la longitud de la fase varía y depende del balance que logren las células

con el medio ambiente. Se llega a un período de equilibrio celular.

La fase estacionaria termina cuando se produce alguna de estas tres situaciones: los nutrientes se

agotan, las condiciones ambientales indispensables para la célula se modifican o cuando las

células produce metabolitos tóxicos que inhiben su reproducción.

D) Fase de muerte.

Se inicia cuando los nutrientes que están en el medio de cultivo no son suficientes para que el

microorganismo pueda producirse y aunque quedan células vivas, su número es superado por el

de las células muertas. También se debe a la acumulación de sustancias tóxicas generadas por el

metabolismo del microorganismo.

1.11 Aplicaciones de Trichoderma spp.

El hongo Trichoderma es utilizado en la industria alimenticia ya que produce enzimas

hidrolíticas tales como glucanasas, quitinasas, proteasas, y xilanasas, que son usadas como

aditivos en la elaboración de alimentos para el ganado, aves y mascotas.

El hongo Trichoderma spp. también se usa ampliamente en la producción de aditivos

alimentarios y productos relacionados. Actualmente varias enzimas de este género son utilizadas

para mejorar el proceso de elaboración de la cerveza (β-glucanasa), y en la producción de zumos

de frutas (pectinasas, celulasas, hemicelulasas). Las celulasas son aplicadas principalmente en la

cocción, el malteado, y la producción de alcohol de grano. [42]

Las celulasas producidas por el hongo Trichoderma son utilizadas en la industria textil para

suavizar y acondicionar los textiles, así como para producir polvos de lavado de alta calidad.

18

Las enzimas obtenidas a partir de estos microorganismos también son usadas en la industria del

papel para modificar las propiedades de la fibra y para reducir el contenido de lignina. [43]

Se ha demostrado que algunas especies de Trichoderma tienen potencial para ser aplicadas en la

biorremediación de sitios contaminados con sustancias de origen orgánico (hidrocarburos del

petróleo, explosivos y plaguicidas) e inorgánico (metales pesados y cianuro). [44]

También existen reportes de T. polysporum, T.koningii, T. pseudokoningii y T. harzianum con

la capacidad para degradar hidrocarburos saturados y aromáticos presentes en aceites

combustibles. Así mismo, Trichoderma sp. se ha empleado para la detoxificación de cianuro

usando dos enzimas (rodanasa y cianuro hidratasa) capaces de degradarlo. [45]

La lanctona 6PAP con aroma a coco es considerada como un agente saborizante no tóxico

utilizado para la aromatización de artículos alimenticios, lo que le confiere importante interés

comercial en la industria de alimentos y aroma. Además tiene función antifúngica.

19

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Pruebas preliminares

Para el desarrollo de esta investigación se utilizaron cepas nativas de la provincia de

Tungurahua Cantón Ambato, aisladas del suelo por el Ministerio de Agricultura Ganadería

Acuacultura y Pesca (MAGAP), identificadas y purificadas por Plantsphere Laboratories. Las

especies a estudiar fueron: Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum. (Ver anexo A y

B).

Como medios de propagación se emplearon: Agar Patata Dextrosa (PDA) y arrocillo, El

primero usado para reproducir las especies en cajas Petri, como respaldo de la materia prima y

el segundo empleado en la producción masiva de estos microorganismos, esta etapa fue

enfocada en la preparación de sustrato (arrocillo).

El arrocillo fue sometido a cuatro tratamientos diferentes durante la preparación (Ver tabla 2),

los criterios considerados fueron: la baja cantidad de agua en el sustrato limita la accesibilidad

de nutrientes obteniéndose un mínimo crecimiento y el exceso de humedad disminuye la

porosidad del sustrato dificultando la oxigenación.

Tabla 2. Volumen de agua adicionada en la preparación del sustrato

Especie Volumen de agua adicionado (Va), mL

1 2 3 4

Trichoderma harzianum (TH) 367 330 295 255

Trichoderma hamatum (THa) 400 340 280 220

Primero se trabajó con Trichoderma harzianum para observar cómo se desarrolla a las

condiciones planteadas y finalmente se procedió con Trichoderma hamatum, incrementándose

el rango de volumen de agua adicionado al sustrato es su preparación, para determinar hasta qué

punto es fácilmente manipulable.

20

La siembra de los microorganismos en esta fase se realizó en botellas de vidrio (camineras)

conteniendo 80 gramos de sustrato cada una, con una concentración inicial de esporas (Ci). En

la tabla 3 se muestra un resumen de las repeticiones realizadas en esta etapa.

La etapa de prueba inicial es indispensable en este proyecto. A partir de los datos obtenidos se

elaboraron curvas de concentración de esporas (logC) versus cantidad de agua adicionada al

arrocillo (Va) (Ver gráfico 1 y 2) para cada temperatura de incubación (T), importante en la

obtención de la mayor cantidad de esporas de los hongos a estudiar.

La incubación de los microorganismos se efectuó en vitrinas de vidrio, con la finalidad de

proveer luz natural al cultivo, en su base se acondicionó un foco para generar calor, este lugar se

cubrió con papel aluminio, creando un ambiente de periodos alternados de luz y obscuridad,

también se adecuó un sensor de temperatura para fijar esta variable de 25°C, 28°C y para la

temperatura a condición ambiental 21°C no se le suministró calor.

2.2 Diseño experimental

La investigación experimental está orientada al estudio del adecuado crecimiento de los

microorganismos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum, en la cual se propone

modificar variables fundamentales como: cantidad de agua presente en la preparación del

sustrato y temperatura.

Las curvas obtenidas en las pruebas preliminares proporcionan datos óptimos de agua (Vop), los

cuales permitieron preparar el sustrato a una humedad establecida y generar un excelente

crecimiento las dos especies de Trichoderma. En la determinación del porcentaje de humedad

(%H), se incluyó también la humedad del arrocillo que establece la Norma INEN 1690 para su

comercialización.

En esta etapa se elaboraron las curvas de crecimiento para cada microorganismo, a las distintas

temperaturas planteadas, el proceso de propagación se efectuó en fundas de polietileno con 160g

de sustrato cada una, realizando varias repeticiones por precaución ante la contaminación de

microrganismos del ambiente y para verificar la repetibilidad del proceso. (Ver tabla 3).

21

Tabla 3. Número de repeticiones realizadas

Especie Temperatura,

°C

Volumen de

agua,

mL

Pruebas

preliminares

Diseño

experimental

# botellas #fundas

21

1

36 10 2

Trichoderma 3

harzianum 4

25

1

36 10 y 2

3

4

Trichoderma

28

1

36 10 hamatum 2

3

4

Total 96 30

En las figuras 9 y 10 para Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum respectivamente, se

muestra el diseño experimental utilizado en la producción de la mayor cantidad de esporas

(logC) de los microorganismos en un menor tiempo (t).

22

TH

T1

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

T2

T3

VoplogC = f(Va) logC = f(t)

VoplogC = f(Va)

Curva de crecimiento

logC = f(t)

VoplogC = f(Va)


logC = f(t)


Figura 9. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la curva de crecimiento del hongo Trichoderma harzianum (TH)

23

THa

T1

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

T2

T3

Vop

Vop


logC = f(t)



logC = f(t)

logC = f(Va)

logC = f(Va)

logC = f(Va)

Vop

logC = f(t)

logC = f(t)

Figura 10. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la curva de crecimiento del hongo Trichoderma hamatum

(THa).

24

2.3 Aplicación del hongo Trichoderma en plantas

Los mejores productos obtenidos de cada especie fueron aplicados en matas de fresas y moras,

teniendo en cuenta un testigo para observar las diferencias que presentan luego de un tiempo de

aplicación, proceso necesario para verificar que los microorganismos generados, sí, mantienen

sus características esenciales, de protección e inducción a un rápido crecimiento de las plantas.

Se utilizaron cinco plantas de fresas del mismo tamaño. A tres de ellas se aplicaron una mezcla

de las especies estudiadas, las dos restantes se las estableció como testigos. Para la aplicación en

plantas de moras se usaron tres plantas las cuales no fueron del mismo tamaño (Ver figura 18).

Sin embargo se consideró escoger a la planta más grande como testigo y a las restantes

adicionarles las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum individualmente.

A las plantas utilizadas no se les adicionó ningún componente extra, a parte de los

microorganismos y tierra que contenía abono orgánico al momento de ser trasplantadas.

2.4 Materiales y equipos

Balanza R;(0 - 500)g Ap±0,1g

Vasos de precipitación V = 500mL Ap±100mL

Vasos de precipitación V = 100mL Ap±10mL

Frascos con tapa rosca V = 500mL Ap±100mL

Probeta graduada V = 100mL Ap±1mL

Pipeta graduada V = 25mL Ap±1mL

Pipeta Pasteur V = 3mL Ap±0,5mL

Pera de succión

Pisetas V = 500mL Ap±100mL

Cintas de pH R;(0 - 14) Ap±0,5mL

Autoclave R;(100 - 133) °C Ap± 2,4 °C

R;(0 - 30)psi Ap±0,5psi

Termohigrometro R;( 0 - 50 ) °C Ap±0,1°C

R;(30 - 90) %HR Ap±1%

Tubos de ensayo

Atomizadores V = 500mL

Gradilla de plástico

Porta y cubre objetos

Microscopio óptico Aumento: 40X

25

Cámara de Neubauer

Cámara de Siembra

Asa bacteriológica

Equipo de disección

Cajas Petri

Botellas de vidrio (camineras) V = 375mL

Mecheros de alcohol

Olla arrocera V = 1800mL

Embudo plástico mediano

Colador de cocina

Fundas de polietileno, 15 x 25 cm

Tapones de gasa y algodón

Incubadoras de vidrio (Ver anexo K)

Guantes de nitrilo

Guantes de cuero

Grapadora

Marcador para vidrio

Papel parafilm “M”

Papel toalla

2.5 Sustancias y reactivos

Agua destilada H2O(l)

Alcohol industrial (Metanol) 99,9% CH3OH

Alcohol antiséptico 70% C2H5OH

Hidróxido de sodio 0.1N NaOH(sol)

Ácido clorhídrico 0.1N HCl(sol)

Hipoclorito de sodio 4,5 p/v NaClO (sol)

Cepa de Trichoderma harzianum

Cepa de Trichoderma hamatum

Agar Patata Dextrosa (PDA)

Arrocillo

2.6 Procedimientos

2.6.1 Producción de Trichoderma spp. En la figura 11 se muestra el proceso de producción de

esporas de los hongos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum planteados en esta

26

investigación. Consta de algunos subprocesos como: preparación del medio de cultivo a

condiciones donde los microorganismos puedan desarrollarse con facilidad, la esterilización que

permite disminuir la carga microbiana contaminante, la inoculación donde se provee del

material genético al medio de crecimiento, y en la incubación se condiciona al microorganismo

para observar cómo se desarrolla al tratamiento dado. Si estos se adaptan se tendrá un buen

crecimiento caso contrario no propagarán. Luego de un tiempo prudente se tiene la cosecha,

proceso en el cual se determinar la concentración con la técnica de contaje de esporas,

finalmente se almacena a temperaturas bajas para preservan el bioformulado.

También se debe tener presente la inspección constante para observar si existe contaminación.

De así serlo se esteriliza en autoclave a 1 atm y 121°C por un tiempo de 20 min para garantizar

la muerte del o los agentes contaminantes presente y así proceder a su descarte.

INCUBACIÓN

INOCULACIÓN

COSECHA

ALMACENAMIENTO

PREPARACIÓN DEL SUSTRATO

ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN DEL

SUSTRATO

CONTAMINACIÓN ESTERILIZACIÓN

DILUCIONES SERIADAS

DESCARTE

TRICHODERMA SPP.

Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de producción de Trichoderma spp.

27

2.6.2 Preparación del medio de cultivo a base de agar patata dextrosa (PDA)

Pesar una cantidad determinada de PDA y diluirlo en agua según las especificaciones del

fabricante que son: 39 g del medio en 1000 mL de agua destilada

Ajustar el pH a 7 adicionando hidróxido de sodio 0.1 N cuando la mezcla es ácida o con

ácido clorhídrico 0.1 N si la mezcla es básica.

Calentar la mezcla hasta el punto de ebullición para que se disuelva por completo, agitar

levemente para evitar que el medio se queme o se chorree.

Esterilizar por 20 min a 121°C y 1 atm de presión

Esperar a que el envase contenedor del medio de cultivo se enfríe hasta que sea manipulable

para evitar quemaduras

Dispensar el medio en cajas Petri evitando la formación de burbujas de aire.

Esperar a que el medio se solidifique.

Nota: Evitar que el medio de cultivo en el envase alcance la temperatura ambiente, porque se

solidificará e impedirá la dosificación en las cajas Petri.

2.6.3 Procedimiento de resiembra en el medio de cultivo PDA

Tomar una caja con medio y otra con la cepa a utilizar

Coger una pequeña parte del microorganismo con el asa bacteriológica y colocarlo en el

nuevo medio donde se propagará

Rotular y sellar con papel parafilm para evitar que se contamine con microorganismos del

ambiente.

Esperar hasta que el microorganismo se desarrolle en toda la caja Petri antes de utilizarlo.

2.6.4 Preparación del sustrato en botellas de vidrio y en fundas de polietileno

Pesar 800 g de arrocillo y lavarlo hasta que el agua salga transparente, durante 5 min

aproximadamente. Escurrir el agua por el alrededor de 1 min.

Pesar el arrocillo mojado para determinar la cantidad de agua absorbida por este.

Poner el arrocillo lavado en la arrocera luego añadir la cantidad de agua necesaria para la

cocción.

Mezclar continuamente para que toda la cocción sea uniforme.

Depositar la preparación en un recipiente limpio y seco hasta que se enfríe.

Colocar una cantidad fija de sustrato en las camineras con la ayuda de un embudo.

Sellar con un tapón de algodón, previamente esterilizado.

28

Adicionar 160 g de sustrato en cada una de las fundas y sellar con dos dobleces pequeños

para evitar la contaminación con microorganismos del ambiente.

Grapar las esquinas de la funda para evitar que se riegue en el proceso de esterilización

Esterilizar en autoclave a 121°C y 1 atm de presión por un período de 20 min.

Agitar efusivamente las botellas esterilizadas para que el sustrato quede lo más suelto

posible.

2.6.5 Siembra del inóculo de Trichoderma spp. en botellas y en fundas. En este proceso es

necesario recurrir a la ayuda del recuento celular con la cámara de Neubauer para determinar la

concentración de esporas presente en un volumen determinado.

Procedimiento

Tomar la cepa a utilizar y añadir una pequeña cantidad de agua destilada esterilizada.

Separar las esporas con una asa bacteriológica y diluirlo a 100 mL

Determinar la concentración de UFC/mL con la técnica del recuento celular y la cámara de

Neubauer, realizando varias repeticiones para tener un valor más exacto.

Colocar las botellas de vidrio con el sustrato previamente esterilizadas en la cámara de

siembra

Rotular para evitar confusiones de cepa, humedad y temperatura.

Poner 2 mL de la solución madre en cada caminera y agitarlo suavemente para que las

esporas se dispersen por el sustrato.

Finalmente colocarlas en las incubadoras que se encuentran a temperatura fija.

2.6.5.1 Recuento celular. El recuento celular es una técnica que tiene por objeto determinar el

número de células que están comprendidos en una unidad de volumen de muestra.

Todos los recuentos celulares constan de 3 fases que son:

1. Dilución de la muestra (Diluciones seriadas)

2. Determinación del número de células

3. Cálculo matemático del número de células presentes en 1 mL de muestra

2.6.5.2 Diluciones seriadas. Es la dilución repetida de una solución para reducir la

concentración de una sustancia de una solución original. Frecuentemente se realiza en

experimentos que requieran soluciones altamente diluidas con gran exactitud, tales como

aquellas que impliquen curvas de concentración en una escala logarítmica. (Ver figura 12)

29

Figura 12. Diluciones seriadas

Procedimiento

Poner 9 mL de agua destilada en cada uno de los tubos de ensayo y rotularlos de la siguiente

manera 10-1, 10

-2, 10

-3, 10

-4 ,10

-5, etc.

Coger 1 ml de la solución madre y colocarlo en el primer tubo, agitarlo para que la mezcla

se homogenice. La dilución será de 10-1

.

Tomar 1 ml del tubo 10-1

y colocar en el segundo tubo de dilución 10-2

y así sucesivamente

hasta que los microorganismos puedan ser contados.

Determinar la concentración en Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mL con la

ayuda de la cámara de Neubauer.

2.6.5.3 Cámara de Neubauer. También conocida como hematocitómetro, es una cámara de

contaje, se utiliza para contar células u otras partículas en suspensión bajo el microscopio.

Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de portaobjetos de unos 30 x 70 mm y unos 4

mm de grosor y un cubre objetos que suele ser un poco más grueso que los normalmente

utilizados.

30

Las más comunes son las cámaras dobles, donde existen 2 zonas de conteo, una superior y la

otra inferior, (hemisferio superior e inferior) en su parte central se encuentra grabada una

retícula cuadrangular (figura 13).

Figura 13. Cámara de Neubauer

Cada zona de conteo es un cuadrado de 3 x 3 mm como se observa en la figura 14. La depresión

central del cubreobjetos está hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se

cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0,1 milímetro.

Figura 14. Divisiones de la zona de conteo

El cuadrado central se divide en 25 cuadros medianos de 0,2 mm dando un área individual de

0,04mm2, si se considera los dos hemisferios se obtiene un área total de 2mm

2. También se

Hemisferio

inferior

Hemisferio

superior

31

especifica que los cuadros medianos se subdividen en 16 cuadros pequeños, dando un total de

400 cuadrados en cada hemisferio.

En el caso que la concentración celular sea muy alta, y sea fácil perderse en el recuento se debe

utilizar un orden de conteo en forma de zig - zag. En la figura 15 se muestra el proceso de

contaje de esporas en forma de zig - zag. [46]

Figura 15. Recuento con alta concentración celular

2.6.5.4 Cálculo matemático de la concentración. El cálculo de la concentración celular permite

determinar el número de células viables presentes en 1 mL de muestra, para ello aplicamos la

siguiente ecuación:

DAS

NC

t

e

(1)

Dónde: C es la concentración de esporas, Ne es el número de esporas contadas, St es la

superficie recontada de la cámara, A es la profundidad de la cámara y D es la dilución.

32

2.6.6 Procedimiento de contaje de esporas del sustrato sólido

Pesar 1 gramo de sustrato poblado por Trichoderma spp. y colocarlo en 100 mL de agua

destilada esterilizada.

Agitar efusivamente para que la mayor cantidad de esporas se desprendan del arrocillo, esta

será la solución madre.

Realizar diluciones sucesivas para cuantificar las esporas en cámara de Neubauer.

Efectuar varios contajes para obtener un resultado más confiable.

Utilizar la ecuación respectiva para determinar la concentración de conidios (UFC/ml).

33

3. DATOS

3.1 Datos preliminares

3.1.1 Datos de las sustancias utilizadas.

Tabla 4. Datos de las sustancias utilizadas

Sustancia Variable Valor

H2O Densidad, g/ml

T = 21°C 0,9980

Arrocillo % Humedad 12

Fuente: Perry John, “Manual del Ingeniero Químico”. McGraw-Hill. pág 3-98

Norma INEN 1690

3.1.2 Preparación del sustrato en camineras. En las tabla 5 y 6 se muestra el tratamiento dado

al arrocillo con cuatro valores diferentes de agua adicionada para cada una de las especies,

Trichoderma harzianum (TH) y Trichoderma hamatum (THa).

Tabla 5. Datos de preparación del sustrato para TH en camineras

N ms, (g) mH+c, (g) mc, (g) Vad, (mL)

1 800 969 60 258

2 800 970 60 220

3 800 970 60 185

4 800 969 59 145

Tabla 6. Datos de preparación del sustrato para THa en camineras

N ms, (g) mH+c, (g) mc, (g) Vad, (mL)

1 800 970 60 290

2 800 963 59 236

3 800 971 60 169

4 800 966 60 114

34

3.1.3 Concentración del inóculo para siembra en camineras. La tabla 7 muestra la

concentración de TH y THa generadas de la liberación de esporas del PDA con la cual se

sembró cada botella para generar la producción de esporas en el nuevo sustrato (arrocillo).

Tabla 7. Datos de concentración del inóculo para siembra en camineras

Especie Concentración,

(UFC/mL)

Trichoderma harzianum

(TH) 2,1E+06

Trichoderma hamatum

(THa) 3,1E+06

3.1.4 Concentración de esporas producidas en camineras. Las tablas 8 y 9, muestran la

cantidad de esporas contadas (Ne), luego del darle cuatro tratamientos al sustrato y 15 días de

incubación a diferentes temperaturas, para cada dilución se realizaron 2 lecturas.

Tabla 8. Datos del recuento celular de TH en camineras

Temperatura,

°C N° Dilución

Ne, UFC

Lectura 1 Lectura 2

21

1 1:100 16 15

2 1:100 14 13

3 1:100 11 10

4 1:100 7 7

25

1 1:100 31 31

2 1:100 26 25

3 1:100 22 20

4 1:100 11 16

28

1 1:100 22 21

2 1:100 17 16

3 1:100 11 12

4 1:100 7 9

35

Tabla 9. Datos del recuento celular de THa en camineras

Temperatura,

°C N° Dilución

Ne, UFC

Lectura 1 Lectura 2

21

1 1:100 13 15

2 1:100 7 8

3 1:10 42 34

4 1:10 9 10

25

1 1:100 33 26

2 1:100 22 24

3 1:10 173 165

4 1:10 92 83

28

1 1:100 13 14

2 1:100 15 13

3 1:10 135 130

4 1:10 110 101

3.2 Datos del diseño experimental

Con ayuda de las tablas 5, 6, 8 y 9 se construyen curvas de logC = f (Va) que permiten obtener

los punto máximos de concentración según el volumen de agua añadido al arrocillo, estos

valores son necesarios para preparar un nuevo sustrato que será propagado en fundas de

polietileno y cuyos resultados permitirán construir curvas de crecimiento de las especies del

hongo Trichoderma estudiadas en esta investigación.

3.2.1 Preparación del sustrato en fundas. Las tablas 10 y 11 exponen los valores de masa del

sustrato utilizados y el volumen de agua adicionado a la preparación del sustrato.

Tabla 10. Datos de preparación del sustrato para TH en fundas

T, (°C) ms, (g) mH+c, (g) mc, (g) Vad, mL

21 800 1005 59 244

25 800 989 57 268

28 800 996 59 248

36

Tabla 11. Datos de preparación del sustrato para THa en fundas

T, (°C) ms, (g) mH+c, (g) mc, (g) Vad, mL

21 800 981 58 277

25 800 993 58 265

28 800 988 58 230

3.2.2 Concentración del inóculo para siembra en fundas. La tabla 12 muestra la cantidad de

esporas por mL, obtenidas de la cosecha de los mejores resultados de concentración de las

pruebas preliminares y utilizadas para inocular el nuevo sustrato.

Tabla 12. Datos de concentración del inóculo para siembra en fundas

Especie Concentración,

(UFC/ml)

Trichoderma harzianum (TH) 6,31E+05

Trichoderma hamatum (THa) 2,50E+05

3.2.3 Contaje de esporas producidas en fundas. En las tablas 13 y 14 se muestran las

cantidades de esporas producidas luego de 15 días de incubación. En cada día establecido se

realizaron cuatro lecturas para obtener datos más confiables.

37

Tabla 13. Datos de contaje de esporas para Trichoderma harzianum

Tiempo,

Días

T1 = 21°C T2 = 25°C T3 = 28°C

Dilución Lectura, UFC



1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

3 1:10 17 19 21 24 1:10 22 24 26 18 1:10 22 26 28 22

5 1:10 113 101 82 122 1:10 122 122 101 92 1:100 16 15 11 13

7 1:100 18 14 9 14 1:100 12 16 17 24 1:100 24 16 15 20

9 1:100 22 25 23 19 1:100 35 23 22 27 1:100 20 22 21 27

12 1:100 20 27 24 34 1:100 32 30 27 30 1:100 30 23 24 26

14 1:100 38 24 19 29 1:100 27 32 26 30 1:100 23 31 25 27

17 1:100 27 28 26 30 1:100 26 29 28 32 1:100 26 27 26 28

20 1:100 21 24 31 27 1:100 22 21 25 23 1:100 24 28 26 26

24 1:100 24 22 19 20 1:100 20 23 18 17 1:100 16 14 18 15

27 1:100 17 15 16 15 1:100 15 18 17 15 1:100 14 13 12 13

30 1:100 13 10 14 13 1:100 12 12 13 11 1:100 9 9 8 10

38

Tabla 14. Datos de contaje de esporas para Trichoderma hamatum

Tiempo,

Días

T1 = 21°C T2 = 25°C T3 = 28°C




1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

3 1:10 11 9 10 12 1:10 13 16 14 15 1:10 15 15 14 9

5 1:10 94 121 119 109 1:10 129 117 109 124 1:10 59 71 68 68

7 1:100 11 13 15 15 1:10 18 16 19 18 1:100 11 13 10 12

9 1:100 15 16 23 15 1:100 25 23 24 23 1:100 18 25 16 16

12 1:100 25 23 26 24 1:100 22 37 30 28 1:100 21 22 20 27

14 1:100 25 23 28 24 1:100 27 30 27 33 1:100 21 18 25 25

17 1:100 23 28 27 22 1:100 30 29 28 31 1:100 22 25 19 24

20 1:100 22 25 27 27 1:100 25 27 25 35 1:100 18 23 20 22

24 1:100 24 23 27 25 1:100 27 28 27 26 1:100 12 14 13 12

27 1:100 17 19 20 19 1:100 19 23 21 21 1:100 11 8 9 10

30 1:100 10 11 12 12 1:100 11 13 9 10 1:10 56 48 51 52

39

4. CÁLCULOS

4.1 Cálculos de las pruebas preliminares

4.1.1 Cálculo para determinar la cantidad de agua absorbida por el sustrato. El sustrato

(arrocillo) debe ser lavado para eliminar residuos no deseados y suciedad, pero durante este

proceso absorbe agua debido a su porosidad. Por tal razón se debe determinar la cantidad de

agua retenida.

(2)

Donde:

mab = masa absorbida

mH+c = masa del sustrato húmedo + cedazo

mc = masa del cedazo

ms = masa del sustrato

4.1.2 Cálculo del volumen total de agua adicionada en la preparación del sustrato.

(3)

Donde:

Va = Volumen de agua para preparar el sustrato

Vab = Volumen de agua absorbido

Vad = Volumen de agua adicionado

40

4.1.3 Cálculo de la cantidad de agua total. Es la cantidad de agua presente al momento de

preparar el sustrato. Para este cálculo se necesita la humedad que contiene el arrocillo, la cual

fue tomada de la norma INEN 1690 (Ver tabla 6).

(4)

Donde:

mat = masa de agua total

ma = masa de agua para preparar el sustrato

mas = masa de agua en el arrocillo seco

4.1.4 Cálculo de la masa del sustrato seco. Es la masa del arrocillo utilizado restándole el 12 %

de agua que contiene el sustrato.

(5)

41

Donde:

mss = masa del sustrato seco

ms = masa del sustrato

mas = masa de agua presente en el arrocillo

4.1.5 Cálculo del porcentaje de humedad. Este cálculo determina la cantidad de agua que

contiene el medio de propagación expresado en porcentaje.

atss

at

mm

mH

% (6)

Donde

%H = porcentaje de humedad

mat = masa de agua total

maa = masa del sustrato seco

4.1.6 Cálculo para determinar la concentración de esporas. Para determinar la concentración

de esporas se utilizó la ecuación (1).

Donde:

Nc = Número de células contadas

42

St = Superficie recontada de la cámara

A = Profundidad de la cámara

D = Dilución

4.2 Cálculos del diseño experimental

4.2.1 Porcentaje de humedad óptimo. Con los datos obtenidos de las pruebas preliminares se

construye los gráficos 1 y 2 las cuales mediante interpolación y extrapolación permiten conocer

la cantidad de agua necesaria para preparar el sustrato, según el microorganismo y la

temperatura utilizada en el proceso de propagación.

4.2.2 Cálculo de la cantidad de agua total.

(7)

43

4.2.3 Construcción de las curvas de crecimiento

Las curvas de crecimiento de los microorganismos se construyeron a las diferentes temperaturas

y gracias a las pruebas preliminares, ya que en estas se determinan la mejor cantidad de agua

adicionada al sustrato para producir las especies. Los datos para los gráficos 5, 6, 7, 8, 9 y 10 se

generaron con la técnica del recuento celular en tiempos establecidos.

4.3 Cálculo estadístico

Los cálculos estadísticos se realizaron con los resultados generados para construir las curvas de

crecimiento, específicamente se utilizó la fase de latencia y la fase logarítmica de cada una de

las gráficas de las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

Uso de Microsoft Excel

Con la ayuda de la función Estimación lineal de la hoja de cálculo Excel, se calcula la

pendiente (m), el intercepto (b), el coeficiente de determinación (R2) y sus respectivas

desviaciones o errores típicos (Ver tabla 15). La pendiente, el intercepto y el ajuste también

pueden calcularse con la función regresión lineal realizándolo en cada una de las curvas.

Tabla 15. Función estimación lineal para los dos microorganismos

TH THa

T1 = 21°C T2 = 25°C T3 = 28°C T1 = 21°C T2 = 25°C T3 = 28°C

m 0,1557 0,1644 0,1523 0,1877 0,1968 0,1850

Sm 0,0160 0,0152 0,0182 0,0252 0,0209 0,0145

b 5,7171 5,7238 5,8179 5,4252 5,4788 5,4037

Sb 0,0993 0,0947 0,1130 0,1565 0,1296 0,0903

R2 0,8635 0,8858 0,8238 0,7873 0,8556 0,9151

SLc 0,1706 0,1627 0,1941 0,2689 0,2227 0,1552

4.3.1 Corrección de logaritmo base 10 a logaritmo natural. Se requiere una corrección, puesto

que los resultados obtenidos para la construcción de las curvas de crecimiento están trabajados

44

con log(x) pero deben ser expresados en función de ln(x), Por tal motivo los resultados de la

tabla 17 deben ser corregidos, a excepción del ajuste de las curvas ya que éste es independiente.

Cálculo modelo para la curva de Trichoderma hamatum a 21°C

Para esta corrección se utilizan valores de pendiente e intercepto presentes en la tabla 15 o

directamente de la linealización, en los gráficos estadísticos (Ver gráficos 11, 12, 13, 14, 15 y

16)

(8)

( )

(9)

4.3.2 Cálculo de la velocidad de crecimiento de las curvas. Las ecuaciones exponenciales son

difíciles de manejar. Por tal motivo se las debe modificar en otras más sencillas como una recta.

La transformación se realiza aplicando logaritmos en los dos términos a la ecuación 10.

(10)

Donde:

X = número de células

Xo = número de células iniciales

μ = velocidad de crecimiento

t = tiempo de incubación

(11)

45

Comparando la ecuación 9 y 11 se aprecia que la pendiente es igual a la velocidad de

crecimiento

4.3.3 Cálculo del Coeficiente de variación. Permite comprobar la variabilidad de los datos,

utilizando la pendiente y su desviación.

100*%

SCV (12)

Donde:

%CV = coeficiente de variación

Sμ = desviación de la pendiente

μ = pendiente

( )

46

5. RESULTADOS

5.1 Resultados de las pruebas preliminares

5.1.1 Cantidad de agua presente en la preparación del sustrato en camineras. Las tablas 16 y

17 muestra la cantidad de agua total utilizada en la preparación del sustrato de los dos

microorganismos propagados en las camineras.

Tabla 16. Resultados de preparación del sustrato para TH en camineras

N ms,

(g)

mH+c,

(g)

mc,

(g)

mab,

(g)

Vab,

(g)

Vad,

(mL)

Va,

(mL)

1 800 969 60 109 109,2 258 367

2 800 970 60 110 110,2 220 330

3 800 970 60 110 110,2 185 295

4 800 969 59 110 110,2 145 255

Tabla 17. Resultados de preparación del sustrato para THa en camineras

N ms,

(g)

mH+c,

(g)

mc,

(g)

mab,

(g)

Vab,

(g)

Vad,

(mL)

Va,

(mL)

1 800 970 60 110 110,2 290 400

2 800 963 59 104 104,1 236 340

3 800 971 60 111 111,2 169 280

4 800 966 60 106 106,1 114 220

5.1.2 Resultados de porcentaje de humedad del sustrato. Las tablas 18 y 19 muestran las

humedades con las que se trabajó en la preparación del medio de cultivo para estas especies.

47

Tabla 18. Resultados de humedad del sustrato para TH

N ma, (g) mas, (g) mat, (g) mss,(g) %H

1 366,4 96 462,4 704 39,6

2 329,5 96 425,5 704 37,7

3 294,6 96 390,6 704 35,7

4 254,6 96 350,6 704 33,2

Tabla 19. Resultados de humedad del sustrato para THa

N ma, (g) mas, (g) mat, (g) mss,(g) %H

1 399,4 96 495,4 704 41,3

2 339,5 96 435,5 704 38,2

3 279,6 96 375,6 704 34,8

4 219,7 96 315,7 704 31,0

5.1.3 Concentración de esporas obtenida de la propagación en botellas. Las tablas 20 y 21

muestran la cantidad de UFC por mL obtenidas a las diferentes temperaturas de incubación y a

la cantidad de agua total utilizada en la preparación del sustrato.

Tabla 20. Resultados de la concentración obtenida de TH en camineras

T, °C Va, mL Dilución C, UFC/ml ,

UFC/mL log

C1 C2

21

367 1:100 8,00E+06 7,50E+06 7,75E+06 6,89

330 1:100 7,00E+06 6,50E+06 6,75E+06 6,83

295 1:100 5,50E+06 5,00E+06 5,25E+06 6,72

255 1:100 3,50E+06 3,50E+06 3,50E+06 6,54

25

367 1:100 1,55E+07 1,55E+07 1,55E+07 7,19

330 1:100 1,30E+07 1,25E+07 1,28E+07 7,11

295 1:100 1,10E+07 1,00E+07 1,05E+07 7,02

255 1:100 5,50E+06 8,00E+06 6,75E+06 6,83

28

367 1:100 1,10E+07 1,05E+07 1,08E+07 7,03

330 1:100 8,50E+06 8,00E+06 8,25E+06 6,92

295 1:100 5,50E+06 6,00E+06 5,75E+06 6,76

255 1:100 3,50E+06 4,50E+06 4,00E+06 6,60

48

Tabla 21. Resultados de la concentración obtenida de THa en camineras

T, °C Va, ml Dilución C, UFC/ml ,

UFC/mL log

C1 C2

21

400 1:100 6,50E+06 7,50E+06 7,00E+06 6,85

340 1:100 3,50E+06 4,00E+06 3,75E+06 6,57

280 1:10 2,10E+06 1,70E+06 1,90E+06 6,28

220 1:10 4,50E+05 5,00E+05 4,75E+05 5,68

25

400 1:100 1,65E+07 1,30E+07 1,48E+07 7,17

340 1:100 1,10E+07 1,20E+07 1,15E+07 7,06

280 1:10 8,65E+06 8,25E+06 8,45E+06 6,93

220 1:10 4,60E+06 4,15E+06 4,38E+06 6,64

28

400 1:100 6,50E+06 7,00E+06 6,75E+06 6,83

340 1:100 7,50E+06 6,50E+06 7,00E+06 6,85

280 1:10 6,75E+06 6,50E+06 6,63E+06 6,82

220 1:10 5,50E+06 5,05E+06 5,28E+06 6,72

5.1.4 Curvas de concentración versus volumen de agua adicionado al sustrato. Los gráficos 1

y 2 indican la cantidad de agua que se adiciona al sustrato en su preparación, para obtener una

máxima concentración de esporas a las diferentes temperaturas de incubación.

Gráfico 1. logC = f (Va) para Trichoderma harzianum

logC = -2E-05Va2 + 0,0148Va + 3,9895

R² = 0,9999

logC = -2E-05Va2 + 0,014Va + 4,3981

R² = 0,9955

logC = -2E-07Va3 + 0,0002Va

2 - 0,0602Va + 11,958 R² = 1

6,50

6,60

6,70

6,80

6,90

7,00

7,10

7,20

7,30

250 300 350 400

logC

Va, mL

T1 = 21°C

T2 = 25°C

T3 = 28°C

49

Gráfico 2. logC = f (Va) para Trichoderma hamatum

5.1.5 Curvas de concentración versus porcentaje de humedad. En los gráficos 3 y 4 se aprecia

la concentración y el volumen de agua que contiene el sustrato expresado en porcentaje.

Gráfico 3. logC = f (%H) para Trichoderma harzianum

logc = -5E-05Va2 + 0,0435Va - 1,937

R² = 0,9975

logC = -3E-05Va2 + 0,0228Va + 2,7338

R² = 0,9977

logC = -2E-05Va2 + 0,0133Va + 4,6275

R² = 0,9973 5,60

5,80

6,00

6,20

6,40

6,60

6,80

7,00

7,20

7,40

200 250 300 350 400

logC

Va, mL

T1 = 21°C

T2 = 25°C

T3 = 28°C

6,50

6,60

6,70

6,80

6,90

7,00

7,10

7,20

7,30

32 34 36 38 40 42

logC

%H

T1 = 21°C

T2 = 25°C

T3 = 28°C

50

Gráfico 4. logC = f (%H) para Trichoderma hamatum

5.2 Resultados del diseño experimental

5.2.1 Volumen de agua óptimo. En las tablas 22 y 23, se muestran los resultados obtenidos por

extrapolación e interpolación de las curvas de concentración versus el volumen total de agua

(Ver gráficos 1 y 2), los valores representan las mejores condiciones para preparar el sustrato de

las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum a las tres temperaturas.

Tabla 22. Resultados de volumen de agua óptima para TH

Temperatura,

(°C)

logC,

(UFC/mL)

Vop,

mL

21 6,90 390

25 7,20 400

28 7,04 385

5,60

5,80

6,00

6,20

6,40

6,60

6,80

7,00

7,20

7,40

30,0 32,0 34,0 36,0 38,0 40,0 42,0

logC

%H

T1 = 21°C

T2 = 25°C

T3 = 28°C

51

Tabla 23. Resultados de volumen de agua óptima para THa

Temperatura,

(°C)

logC,

(UFC/mL)

Vop,

mL

21 6,80 400

25 7,16 400

28 6,83 360

5.2.2 Resultados de la masa de agua total. Las tablas 24 y 25 indican la cantidad de agua total

utilizada para preparar el sustrato de los microorganismos.

Tabla 24. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de TH

Temperatura,

°C

ms,

(g)

mH+c,

(g)

mc,

(g)

Vad,

(mL)

mad,

g)

mat,

(g)

21 800 1005 59 244 243,7 485,7

25 800 989 57 268 267,6 495,6

28 800 996 59 248 247,7 480,7

Tabla 25. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de THa

Temperatura,

°C

ms,

(g)

mH+c,

(g)

mc,

(g)

Vad,

(mL)

mad,

g)

mat,

(g)

21 800 981 58 277 276,6 495,6

25 800 993 58 265 264,6 495,6

28 800 988 58 230 229,7 455,7

5.2.3 Resultados de temperatura y % de humedad para propagar Trichoderma. En la tabla 26

se muestra el porcentaje de humedad en la preparación del sustrato a las diferentes temperaturas

y el nombre que se designó para englobar a los resultados finales de las variables utilizadas en la

propagación de Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

52

Tabla 26. Resultados del %H a las diferentes condiciones

Condición Temperatura,

°C

% Humedad

Trichoderma

harzianum

Trichoderma

hamatum

1 21 40,82 41,31

2 25 41,31 41,32

3 28 40,57 39,29

5.2.4 Construcción de la curva de crecimiento. En las tablas 27 y 28 se expone la

concentración obtenida en los diferentes días de incubación a las temperaturas establecidas,

mientras que en las tablas 29 y 30 se muestran los datos para construir las curvas de crecimiento

de los microorganismos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

53

Tabla 27. Resultados de concentración de TH

Tiempo,

Días

Condición 1 Condición 2 Condición 3

Concentración, UFC/mL Concentración, UFC/mL Concentración, UFC/mL

C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4

0 6,31E+05 6,31E+05 6,31E+05

3 8,50E+05 9,50E+05 1,05E+06 1,20E+06 1,10E+06 1,20E+06 1,30E+06 9,00E+05 1,10E+06 1,30E+06 1,40E+06 1,10E+06

5 5,65E+06 5,05E+06 4,10E+06 6,10E+06 6,10E+06 6,10E+06 5,05E+06 4,60E+06 8,00E+06 7,50E+06 5,50E+06 6,50E+06

7 9,00E+06 7,00E+06 4,50E+06 7,00E+06 6,00E+06 8,00E+06 8,50E+06 1,20E+07 1,20E+07 8,00E+06 7,50E+06 1,00E+07

9 1,10E+07 1,25E+07 1,15E+07 9,50E+06 1,75E+07 1,15E+07 1,10E+07 1,35E+07 1,00E+07 1,10E+07 1,05E+07 1,35E+07

12 1,00E+07 1,35E+07 1,20E+07 1,70E+07 1,60E+07 1,50E+07 1,35E+07 1,50E+07 1,50E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,30E+07

14 1,90E+07 1,20E+07 9,50E+06 1,45E+07 1,35E+07 1,60E+07 1,30E+07 1,50E+07 1,15E+07 1,55E+07 1,25E+07 1,35E+07

17 1,35E+07 1,40E+07 1,30E+07 1,50E+07 1,30E+07 1,45E+07 1,40E+07 1,60E+07 1,30E+07 1,35E+07 1,30E+07 1,40E+07

20 1,05E+07 1,20E+07 1,55E+07 1,35E+07 1,10E+07 1,05E+07 1,25E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,40E+07 1,30E+07 1,30E+07

24 1,20E+07 1,10E+07 9,50E+06 1,00E+07 1,00E+07 1,15E+07 9,00E+06 8,50E+06 8,00E+06 7,00E+06 9,00E+06 7,50E+06

27 8,50E+06 7,50E+06 8,00E+06 7,50E+06 7,50E+06 9,00E+06 8,50E+06 7,50E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06 6,50E+06

30 6,50E+06 5,00E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06 6,00E+06 6,50E+06 5,50E+06 4,50E+06 4,50E+06 4,00E+06 5,00E+06

54

Tabla 28. Resultados de concentración de THa

Tiempo,

Días


Concentración, UFC/mL Concentración, UFC/mL Concentración, UFC/mL

C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4

0 2,50E+05 2,50E+05 2,50E+05

3 5,50E+05 4,50E+05 5,00E+05 6,00E+05 6,50E+05 8,00E+05 7,00E+05 7,50E+05 7,50E+05 7,50E+05 7,00E+05 4,50E+05

5 4,70E+06 6,05E+06 5,95E+06 5,45E+06 6,45E+06 5,85E+06 5,45E+06 6,20E+06 2,95E+06 3,55E+06 3,40E+06 3,40E+06

7 5,50E+06 6,50E+06 7,50E+06 7,50E+06 9,00E+06 8,00E+06 9,50E+06 9,00E+06 5,50E+06 6,50E+06 5,00E+06 6,00E+06

9 7,50E+06 8,00E+06 1,15E+07 7,50E+06 1,25E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,15E+07 9,00E+06 1,25E+07 8,00E+06 8,00E+06

12 1,25E+07 1,15E+07 1,30E+07 1,20E+07 1,10E+07 1,85E+07 1,50E+07 1,40E+07 1,05E+07 1,10E+07 1,00E+07 1,35E+07

14 1,25E+07 1,15E+07 1,40E+07 1,20E+07 1,35E+07 1,50E+07 1,35E+07 1,65E+07 1,05E+07 9,00E+06 1,25E+07 1,25E+07

17 1,15E+07 1,40E+07 1,35E+07 1,10E+07 1,50E+07 1,45E+07 1,40E+07 1,55E+07 1,10E+07 1,25E+07 9,50E+06 1,20E+07

20 1,10E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,75E+07 9,00E+06 1,15E+07 1,00E+07 1,10E+07

24 1,20E+07 1,15E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,40E+07 1,35E+07 1,30E+07 6,00E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06

27 8,50E+06 9,50E+06 1,00E+07 9,50E+06 9,50E+06 1,15E+07 1,05E+07 1,05E+07 5,50E+06 4,00E+06 4,50E+06 5,00E+06

30 5,00E+06 5,50E+06 6,00E+06 6,00E+06 5,50E+06 6,50E+06 4,50E+06 5,00E+06 2,80E+06 2,40E+06 2,55E+06 2,60E+06

55

Tabla 29. Resultados del logaritmo de la concentración para TH

Tiempo,

Días


logC1 logC2 logC3 logC4 logC1 logC2 logC3 logC4 logC1 logC2 logC3 logC4

0 5,80 5,80 5,80

3 5,93 5,98 6,02 6,08 6,04 6,08 6,11 5,95 6,04 6,11 6,15 6,04

5 6,75 6,70 6,61 6,79 6,79 6,79 6,70 6,66 6,90 6,88 6,74 6,81

7 6,95 6,85 6,65 6,85 6,78 6,90 6,93 7,08 7,08 6,90 6,88 7,00

9 7,04 7,10 7,06 6,98 7,24 7,06 7,04 7,13 7,00 7,04 7,02 7,13

12 7,00 7,13 7,08 7,23 7,20 7,18 7,13 7,18 7,18 7,06 7,08 7,11

14 7,28 7,08 6,98 7,16 7,13 7,20 7,11 7,18 7,06 7,19 7,10 7,13

17 7,13 7,15 7,11 7,18 7,11 7,16 7,15 7,20 7,11 7,13 7,11 7,15

20 7,02 7,08 7,19 7,13 7,04 7,02 7,10 7,06 7,08 7,15 7,11 7,11

24 7,08 7,04 6,98 7,00 7,00 7,06 6,95 6,93 6,90 6,85 6,95 6,88

27 6,93 6,88 6,90 6,88 6,88 6,95 6,93 6,88 6,85 6,81 6,78 6,81

30 6,81 6,70 6,85 6,81 6,78 6,78 6,81 6,74 6,65 6,65 6,60 6,70

56

Tabla 30. Resultados del logaritmo de la concentración para THa

Tiempo,

Días


logC1 logC2 logC3 logC4 logC1 logC2 logC3 logC4 logC1 logC2 logC3 logC4

0 5,40 5,40 5,40

3 5,74 5,65 5,70 5,78 5,81 5,90 5,85 5,88 5,88 5,88 5,85 5,65

5 6,67 6,78 6,77 6,74 6,81 6,77 6,74 6,79 6,47 6,55 6,53 6,53

7 6,74 6,81 6,88 6,88 6,95 6,90 6,98 6,95 6,74 6,81 6,70 6,78

9 6,88 6,90 7,06 6,88 7,10 7,06 7,08 7,06 6,95 7,10 6,90 6,90

12 7,10 7,06 7,11 7,08 7,04 7,27 7,18 7,15 7,02 7,04 7,00 7,13

14 7,10 7,06 7,15 7,08 7,13 7,18 7,13 7,22 7,02 6,95 7,10 7,10

17 7,06 7,15 7,13 7,04 7,18 7,16 7,15 7,19 7,04 7,10 6,98 7,08

20 7,04 7,10 7,13 7,13 7,10 7,13 7,10 7,24 6,95 7,06 7,00 7,04

24 7,08 7,06 7,13 7,10 7,13 7,15 7,13 7,11 6,78 6,85 6,81 6,78

27 6,93 6,98 7,00 6,98 6,98 7,06 7,02 7,02 6,74 6,60 6,65 6,70

30 6,70 6,74 6,78 6,78 6,74 6,81 6,65 6,70 6,45 6,38 6,41 6,41

57

5.3 Curvas de crecimiento obtenidas

Los gráficos 5, 6, 7, 8, 9 y 10 indican las curvas de crecimiento construidas a las diferentes

condiciones de temperatura y humedad para las especies Trichoderma harzianum y

Trichoderma hamatum.

Gráfico 5. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condición 1


5,50

5,75

6,00

6,25

6,50

6,75

7,00

7,25

7,50

0 5 10 15 20 25 30 35

logC

(U

FC/m

l)

Tiempo, días

5,50

5,75

6,00

6,25

6,50

6,75

7,00

7,25

7,50

0 5 10 15 20 25 30 35

logC

(U

FC/m

l)

Tiempo, días

58


Gráfico 8. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condición 1

5,50

5,75

6,00

6,25

6,50

6,75

7,00

7,25

7,50

0 5 10 15 20 25 30 35

logC

(U

FC/m

l)

Tiempo, días

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

0 5 10 15 20 25 30 35

logC

(U

FC/m

l)

Tiempo, días

59



5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

0 5 10 15 20 25 30 35

logC

(U

FC/m

l)

Tiempo, días

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

0 5 10 15 20 25 30 35

logC

(U

FC/m

l)

Tiempo, días

60

5.4 Resultados estadísticos

Los gráficos 11, 12, 13, 14, 15 y 16 muestran la velocidad de crecimiento obtenidas a las

diferentes condiciones para los dos microorganismos las cuales coinciden con los valores de la

tabla 15.

Gráfico 11. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condición 1


logC = 0,1557 t + 5,7171 R² = 0,8635

5,40

5,70

6,00

6,30

6,60

6,90

7,20

7,50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

logC

(U

FC/m

l)

tiempo, días

logC = 0,1644 t + 5,7238 R² = 0,8858

5,50

5,80

6,10

6,40

6,70

7,00

7,30

7,60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

logC

(U

FC/m

l)

tiempo, días

61


Gráfico 14. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condición 1

logC = 0,1523 t + 5,8179 R² = 0,8238

5,50

5,80

6,10

6,40

6,70

7,00

7,30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

logC

(U

FC/m

l)

tiempo, días

logC = 0,1877 t + 5,4252 R² = 0,7873

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

logC

(U

FC/m

l)

tiempo, días

62



5.4.1 Resultados de %CV. La tabla 31 muestra los resultados corregidos y el coeficiente de

variación a las diferentes temperaturas para Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

logC = 0,1968 t + 5,4788 R² = 0,8556

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

logC

(U

FC/m

l)

tiempo, días

logC = 0,185 t + 5,4037 R² = 0,9151

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

logC

(U

FC/m

l)

tiempo, días

63

Tabla 31. Resultados estadísticos corregidos

Trichoderma harzianum Trichoderma hamatum

Condición 1 Condición 2 Condición 3 Condición 1 Condición 2 Condición 3

μ 0,3585 0,3787 0,3507 0,4324 0,4531 0,4260

Sμ 0,0368 0,0351 0,0419 0,0580 0,0481 0,0335

b 13,166 13,182 13,399 12,494 12,618 12,445

Sb 0,2286 0,2181 0,2602 0,3605 0,2986 0,2081

r2 0,8635 0,8858 0,8238 0,7873 0,8556 0,9151

SLc 0,3928 0,3747 0,4470 0,6192 0,5129 0,3574

%CV 10,27 9,27 11,94 13,42 10,61 7,86

5.4.2 Velocidad específica de crecimiento microbiano. La tabla 32 muestra la velocidad

específica de crecimiento para cada microorganismo.

Tabla 32. Resultados de velocidad específica de crecimiento


Condición μ μ

1 0,3585

0,3627

0,4324

0,4372 2 0,3787 0,4531

3 0,3507 0,4260

5.5 Selección de las mejores condiciones para producir Trichoderma spp.

De acuerdo con los resultados obtenidos en las gráficas de preparación del sustrato, en las

curvas de crecimiento y en el análisis estadístico se seleccionan las mejores condiciones para

propagar las dos especies nativas de Trichoderma spp.

5.5.1 Análisis comparativo del % de humedad. El grafico 17 muestra el porcentaje de humedad

requerido por el sustrato versus la temperatura utilizada en la propagación de los

microorganismos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

64

Gráfico 17. Análisis comparativo de la humedad

5.5.2 Análisis comparativo de la concentración. En la tabla 33 se observa la concentración

promedio, valores obtenidos gracias a la repetibilidad de contaje de esporas, observándose que

en las condiciones 1 y 2 se tiene la máxima concentración en un menor tiempo (12 días).

Tabla 33. Promedio de la Concentración

Trichoderma hamatum Trichoderma harzianum

Dia Condición 1 Condición 2 Condición 3 Condición 1 Condición 2 Condición 3

0 6,3E+05 6,3E+05 6,3E+05 2,5E+05 2,5E+05 2,5E+05

3 1,0E+06 1,1E+06 1,2E+06 5,3E+05 7,3E+05 6,6E+05

5 5,2E+06 5,5E+06 6,9E+06 5,5E+06 6,0E+06 3,3E+06

7 6,9E+06 8,6E+06 9,4E+06 6,8E+06 8,9E+06 5,8E+06

9 1,1E+07 1,3E+07 1,1E+07 8,6E+06 1,2E+07 9,4E+06

12 1,3E+07 1,5E+07 1,3E+07 1,2E+07 1,5E+07 1,1E+07

14 1,4E+07 1,4E+07 1,3E+07 1,3E+07 1,5E+07 1,1E+07

17 1,4E+07 1,4E+07 1,3E+07 1,3E+07 1,5E+07 1,1E+07

20 1,3E+07 1,1E+07 1,3E+07 1,3E+07 1,4E+07 1,0E+07

24 1,1E+07 9,8E+06 7,9E+06 1,2E+07 1,4E+07 6,4E+06

27 7,9E+06 8,1E+06 6,5E+06 9,4E+06 1,1E+07 4,8E+06

30 6,3E+06 6,0E+06 4,5E+06 5,6E+06 5,4E+06 2,6E+06


40,82 41,31

41,31 41,32

40,57 39,29

% H

um

ed

ad

T = 21°C T = 25°C T = 28°C

65

Gráfico 18. Análisis comparativo de la concentración de esporas

5.5.3 Análisis comparativo del coeficiente de variación (%CV). En el gráfico 19 se observa el

porcentaje de la desviación de los datos obtenidos en las lecturas del recuento celular, versus las

condiciones de tratamiento realizadas para las dos especies.

Gráfico 19. Análisis comparativo del coeficiente de variación

1,3E+07 1,2E+07

1,5E+07 1,5E+07

1,3E+07 1,1E+07


con

cen

tra

ció

n U

FC/m

L

T = 21°C T = 25°C T = 28°C

10,27

13,42

9,27

10,61

11,94

7,86

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00


Co

efic

ien

te d

e v

aria

ció

n

%

Condición 1

Condición 2

Condición 3

66

5.5.4 Selección de las mejores condiciones. En la tabla 34 se resumen las condiciones que

aprobaron el criterio de mayor producción de esporas de los hongos Trichoderma harzianum y

Trichoderma hamatum.

Tabla 34. Mejores condiciones de crecimiento

Especie %H Concentración

UFC/mL %CV Condición

Trichoderma harzianum 41,31 1,5E+07 9, 27 2

Trichoderma hamatum 41,32 1,5E+07 10, 61 2

5.6 Resultados de aplicación del hongo Trichoderma spp.

Las figuras 16, 17, 18 y 19 muestran plantas de fresa y moras antes y luego de ser aplicado

Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum. En las fresas se aplicó una mezcla de los dos

microorganismos, mientas que en las moras la aplicación de las especies fue individual. En los

dos tratamientos se dejaron plantas como testigo para poder comparar su desarrollo.

Figura 16. Aplicación en plantas de fresas

67

Figura 17. Resultados luego de un mes de aplicación en plantas de fresa

Figura 18. Aplicación de los microorganismos en plantas de mora

Figura 19. Resultados luego de 50 días de aplicación en plantas de moras

68

6. DISCUSIÓN


Durante la preparación del sustrato, se establecieron rangos de humedad amplios, para

observar la influencia que esta variable presenta en el crecimiento de los dos hongos

filamentosos. Luego de varios días de incubación se apreció que la tonalidad del color verde

característico del género Trichoderma variaba según la cantidad de agua utilizada. Esta

relación se comprobó durante el contaje de esporas, ya que la muestra de color verde más

intenso dio como resultado una mayor concentración de esporas que la de menor coloración.

De las gráficas logC en función del volumen de agua adicionado al sustrato (Ver gráficos 1

y 2) se observa que la interpolación y extrapolación de la curvas permite determinar el

punto óptimo de crecimiento a cada temperatura de incubación, sin embargo para 21°C y

25°C de Trichoderma hamatum se observa cantidades altas para llegar al óptimo Vop,

produciendo desconfianza de los resultados obtenidos. Motivo por el cual fue necesario

recurrir a la práctica donde se estableció que 400 mL de agua es el valor máximo para

obtener una moderada manipulación del sustrato.

6.2 Diseño experimental

En el proceso de inoculación las concentraciones de esporas utilizadas son diferentes (Ver

tablas 7 y 12), lo cual llevaría a pensar que la producción desarrollada en botellas y fundas

sería desigual, pero luego de unos días de crecimiento de los hongos se observa que esto no

influye significativamente ya que se obtuvo valores similares, pudiéndose evidenciar en las

tablas 20, 21, 27 y 28.

Los resultados de porcentaje de humedad obtenidos (Ver tabla 26) se encuentran alrededor

del 40%, valores que se están dentro del rango (20 - 70%) establecido en la teoría (Ver cita

24). Sin embargo en esta tabla se puede observar que a 28°C se requiere una menor

humedad; este fenómeno se justifica que a mayor temperatura existe un mayor riesgo de

contaminación con microorganismos del ambiente.

69

En el análisis comparativo de la concentración de esporas (Ver tabla 33) se aprecia que el

máximo crecimiento se obtiene a los 12 días de incubación para las condiciones 2 y 3,

mientras que cuando se trabaja a temperatura ambiente (condición 1) se requiere de mayor

tiempo (14 días). Lo cual indica que cuando se modifica las variables humedad del sustrato

y temperatura se reduce el tiempo de producción de esporas Trichoderma.

Las velocidades específicas de crecimiento microbiano obtenidas (Ver tabla 32) muestran

valores similares entre las mismas especies, pero si se compara entre las dos especies

estudiadas se observa que estas difieren, pudiéndose evidenciar que la especie Trichoderma

hamatum que se desarrolla con mayor rapidez.

Para Trichoderma hamatum se acepta el %CV = 10,6 (Ver tabla 31 y gráfico 17) a pesar de

tener un valor menor a 28°C. Para esta decisión se basó en la concentración (Ver tabla 33) y

en la curva obtenida de las pruebas preliminares (Ver gráfico 2), donde a 25°C se obtiene la

mayor concentración de esporas y se justifica que pudo existir contaminación lo que generó

que el %CV sea un poco alto. No obstante son valores aceptables para los microorganismos.

6.3 Aplicación de Trichoderma spp. en plantas

Las especies aplicadas en las plantas de fresas ejercen un efecto positivo pues generan un

desarrollo y producción de frutos más rápido en comparación con las que no fueron

aplicadas. Además se observa un tamaño de hojas más grande, las plantas se tornan más

verdes y brillosas siendo estos indicativos de que se encuentran sanas (Ver figuras 16 y 17)

En las plantas de moras se observa que luego de un tiempo de aplicación estas se

desarrollan con mayor rapidez en comparación con la testigo que a pesar de haber sido la

más grande, transcurrido los 2 meses la planta que contiene Trichoderma Hamatum supero

en tamaño. Estas observaciones indican que el microorganismo ejerce todas sus

características de protección en las raíces de las plantas (Ver figuras 18 y 19).

70

7. CONCLUSIONES


La tonalidad del color verde que presenta Trichoderma es un indicativo de la concentración

de esporas, mientras más verde se presente la muestra, mayor será la cantidad de unidades

formadoras de colonias, existiendo una relación directa entre la intensidad del color y la

manifestación de conidios.

El sustrato utilizado y la cantidad de agua adicionada es una relación 2:1, pues se comprobó

que un valor superior dificulta la manipulación del sustrato, reduce el crecimiento, limita la

adecuada oxigenación de la matriz sólida y el crecimiento solo se realiza en la superficie.

7.2 Diseño Experimental

La concentración de inoculo utilizado para sembrar los microorganismos no influye

significativamente en la producción de esporas, viéndose reflejado en la similitud que existe

entre las dos propagaciones.

En la producción Trichoderma una temperatura de 28°C incrementa la formación de gotas

de agua, limitando el crecimiento de estos hongos filamentosos, presentando un mayor

riesgo de contaminación con microorganismos del ambiente.

Modificando las variables humedad del sustrato y temperatura se generan resultados

positivos en la experimentación, pues reduce el tiempo de producción de los hongos

Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

La velocidad específica de crecimiento es independiente para cada microorganismo, según

los resultados obtenidos la especie Trichoderma hamatum se adapta más rápido al medio,

desarrollándose con mayor velocidad en comparación con Trichoderma harzianum.

71

Los resultados del coeficiente de variación obtenidos son aceptables, considerando que se

trabajó con microorganismos donde los errores producidos pueden ser altos, debido a la

contaminación con microorganismos del ambiente y al equipo utilizado en el contaje de

esporas.

Se concluye que la temperatura de 25°C y 41,3 % de humedad son las condiciones más

adecuadas para producir estos biofungicidas, en un menor tiempo, obteniéndose como

máximo, 1,5x107 UFC/mL para Trichoderma harzianum y 1,5x10

7 UFC/mL de

Trichoderma hamatum a los 12 días de tratamiento.

7.3 Aplicación de Trichoderma spp. en plantas

Los microorganismos aplicados independientes o en mezcla, ejercen aspectos positivos a las

plantas de fresas y moras, generando un mayor desarrollo, además de producir frutos de

muy buena calidad en el caso de las fresas. Los frutos de las moras no se pudo calificar

porque requerían mayor tiempo.

72

8. RECOMENDACIONES

Implementar un mechero bunsen en el laboratorio, con el propósito de incrementar el área

de esterilización al momento de toma de muestras para el recuento celular.

Elaborar un manual propio del laboratorio de recopilación de experiencias obtenidas durante

el proceso de propagación de Trichoderma spp. teniendo en cuenta aspectos como: normas

de bioseguridad y focos de contaminación.

Realizar un estudio de propagación de Trichoderma spp. utilizando diferentes sustratos para

determinar crecimiento versus costo.

Implementar una cámara de flujo laminar para reducir la contaminación causada por

microorganismo del ambiente al momento de las inoculaciones.

Aplicar el producto obtenido en diferentes especies de plantas para determinar su

efectividad.

Difundir a la colectividad agrícola los beneficios que brinda Trichoderma en los diferentes

cultivos con la finalidad de obtener productos orgánicos de calidad.

73

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VILLEGAS Arenas, Marco. Trichoderma pers. CARACTERISTICAS GENERALES Y SU

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en:<http://www.oriusbiotecnologia.com/trichoderma-pers-caracteristicas-generales-y-su-

potencial-biologico-en-la-agricultura-sostenible>.

79

ANEXOS

80

ANEXO A. Taxonomía de Trichoderma spp.

81

ANEXO B. Biograma Microbiano

82

ANEXO C. Norma INEN 1690

Fuente: Norma Norma INEN 1690

83

ANEXO D. Materiales necesarios

Figura D.1. Materia prima

Figura D.2. Material de limpieza

Figura D.3. Autoclave

Figura D.4. Tapones limpios y secos

84

ANEXO E. Propagación de Trichoderma en cajas Petri

Figura E.1. Preparación del medio de cultivo PDA

Figura E.2. Inoculación del microorganismo en cajas Petri

85

ANEXO F. Preparación del sustrato

Figura F.1. Lavado del arrocillo

Figura F.2. Escurrido del arrocillo

Figura F.3. Adición del agua para la

cocción del arrocillo

Figura F.4. Sustrato de arrocillo

86

ANEXO G. Esterilización del sustrato

Figura G.1. Llenado de botellas

Figura G.2. Sustrato en botellas selladas con

tapones

Figura G.3. Sustrato en fundas

Figura G.4. Esterilización en autoclave

87

ANEXO H. Preparación del inóculo

Figura H.1. Peso de sustrato propagado

Figura H.2. Liberación de esporas en agua

estéril

Figura H.3. Solución madre de Trichoderma spp.

88

ANEXO I. Inoculación del sustrato

Figura I.1. Material listo para ser inoculado en la cámara de siembra

Figura I.2. Inoculación en botellas

Figura I.3. Inoculación en fundas

89

ANEXO J. Determinación de la concentración de esporas

Figura J.1. Diluciones seriadas

Figura J.2. Contaje de esporas

90

ANEXO K. Incubación de las especies

Figura K.1.Incubación a 21°C



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