UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE … · Yo, RENÉ OSWALDO SILVA CASTILLO en calidad de...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN

DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN

CAUTIVERIO”

Trabajo de Grado presentando como requisito para optar por el Título de

Médico Veterinario Zootecnista.

RENÉ OSWALDO SILVA CASTILLO

TUTOR: Dra. MARÍA INÉS BAQUERO MSc.

Quito, Agosto 2015

ii

DEDICATORIA

Este trabajo se lo dedico a mis más fieles compañeros, aquellos que no hablan con

su voz, sino con su mirada. A mis queridos Zeus, Cuca, Mimí y Robert, ellos nunca

fueron mascotas, fueron mis amigos y a pesar de que ya no están lo seguirán siendo.

A Julia, Dulce y Caramelo que espero estén conmigo muchos años más. Cuando

me he sentido triste han sido mi sonrisa, mi consuelo.

René

iii

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, el agradecimiento mayor es para mi familia: a mis padres porque

con ellos empezó todo, por haberme apoyado en todas mis decisiones sin hacer

preguntas, porque siempre confiaron en mí, aunque yo no lo hiciera, gracias a los

dos por haber sacrificado tantas cosas por hacer lo posible para que yo siguiera el

camino que un día elegí. A mi hermano Jorge y Juan Dieguito, que los quiero mucho

aunque a veces no esté para decírselos.

A la doctora María Inés Baquero, tutora de esta tesis, quien ha corregido

minuciosamente este trabajo tengo que agradecerle sus comentarios, sugerencias y

las correcciones con las que he podido elaborar una adecuada memoria de todo el

trabajo realizado durante este año.

Al Dr. Eduardo Aragón, le agradezco sinceramente su confianza y apoyo

económico permitiendo la continuación del proyecto.

A la Dra. Nivia Luzuriaga, le agradezco las lecturas y sus comentarios tanto

científicos como literarios, sus correcciones y su infinita paciencia. Además, su

amistad.

A mis compañeros del laboratorio, quienes me enseñaron a tener confianza, desde

el primer día gracias por escucharme y echarme una mano cuando lo necesitaba.

Al personal administrativo, la señora Saskya, a Cristinita y a Karen, que han estado

siempre pendientes de mi ayudándome a resolver esos trámites que a veces

resultaban ser tan confusos.

A don Leo, dueño del acuario-serpentario por su importante ayuda cada vez que fui

a tomar las muestras.

A mis amigos, aquellos que han estado en todo momento, los cuales no hace falta

mencionarlos pues saben que los llevo en mi corazón, tienen mi más sincera gratitud

por todo.

iv

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, RENÉ OSWALDO SILVA CASTILLO en calidad de autor de la tesis

“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN DE

RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN CAUTIVERIO”,

por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer

uso de todos los contenidos que nos pertenecen o de parte de los que contienen esta

obra, con los fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con el establecimiento

en los artículos 5, 6, 8,19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y

su reglamento.

v

INFORME DE TUTOR

En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor:

RENÉ OSWALDO SILVA CASTILLO, para optar por el Título o Grado de

Médico Veterinario Zootecnista, cuyo título es “AISLAMIENTO E

IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN DE RESISTENCIA A

ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN CAUTIVERIO”. Considero que dicho

trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación

pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.

vi

APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL

“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN


CAUTIVERIO”

El tribunal constituido por:

Dr. Christian Vinueza Presidente del Tribunal, Dra. Nivia Luzuriaga Vocal

Principal, Dr. Gustavo Salgado Vocal Principal, y Dr. César Guanoluisa Vocal

Suplente.

Luego de receptar la presentación del trabajo de grado, previo a la obtención del

título o grado de Médico Veterinario Zootecnista, presentado por el señor René

Oswaldo Silva Castillo.

Con el título “AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y

PATRÓN DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN

CAUTIVERIO”.

Ha emitido el siguiente veredicto: cumplidos los requisitos reglamentarios y una

vez efectuada la defensa de Tesis, se concluye con la Aprobación de la defensa de

la tesis, presentada por el señor René Oswaldo Silva Castillo.

vii

ÍNDICE DE CONTENIDO

DEDICATORIA ..................................................................................................... ii

AGRADECIMIENTOS ......................................................................................... iii

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ..................................... iv

INFORME DE TUTOR .......................................................................................... v

APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL .................................................... vi

ÍNDICE DE CONTENIDO................................................................................... vii

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................... ix

ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................... x

RESUMEN ............................................................................................................. xi

ABSTRACT .......................................................................................................... xii

CAPÍTULO I ......................................................................................................... 1

INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1

CAPÍTULO II ....................................................................................................... 4

REVISIÓN DE LITERATURA .............................................................................. 4

Antecedentes ................................................................................................................... 4

Generalidades .................................................................................................................. 5

Fisiología y estructura ..................................................................................................... 5

Patogénesis y patogenicidad ........................................................................................... 6

Resistencia a los antibióticos .......................................................................................... 7

Bombas de expulsión ...................................................................................................... 8

Porinas de membrana ...................................................................................................... 9

Otros mecanismos de resistencia .................................................................................... 9

Enfermedades clínicas .................................................................................................... 9

Enfermedad de Blíster ..................................................................................................... 9

Estomatitis .................................................................................................................... 10

Septicemia y úlceras cutáneas ....................................................................................... 10

Conjuntivitis .................................................................................................................. 11

Otitis .............................................................................................................................. 11

Diagnóstico de laboratorio. ........................................................................................... 11

Microscopia................................................................................................................... 11

Cultivo .......................................................................................................................... 11

Identificación ................................................................................................................ 11

Tratamiento, prevención y control ................................................................................ 13

viii

CAPÍTULO III .................................................................................................... 14

METODOLOGÍA ................................................................................................. 14

Población objeto de estudio .......................................................................................... 14

Toma de muestras ......................................................................................................... 14

Fase de campo ............................................................................................................... 14

Aislamiento e identificación bacteriana ........................................................................ 15

Api 20 NE ..................................................................................................................... 15

Lectura de API .............................................................................................................. 15

Determinación del patrón de resistencia a antimicrobianos. ......................................... 16

Método Difusión de discos de Kirby Bauer .................................................................. 16

Preparación de la placa de Mueller-Hinton ................................................................... 16

Preparación del inóculo ................................................................................................. 16

Inoculación de placas .................................................................................................... 16

Aplicación de los discos. ............................................................................................... 17

Informe de los resultados. ............................................................................................. 17

Medición de tamaño de la zona..................................................................................... 17

CAPÍTULO IV .................................................................................................... 18

RESULTADOS ..................................................................................................... 18

Aislamiento e identificación de microorganismos ........................................................ 18

Patrones de resistencia a antimicrobianos ..................................................................... 20

Chi cuadrado ................................................................................................................. 26

DISCUSIÓN ......................................................................................................... 27

CAPÍTULO V ...................................................................................................... 34

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................... 34

CONCLUSIONES ........................................................................................................ 34

RECOMENDACIONES ............................................................................................... 35

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 36

ANEXOS .............................................................................................................. 42

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.- Patrones de resistencia a los antibióticos ............................................ 21

Figura 2.- Chi cuadrado. Grupo de antibióticos vs patrón de resistencia ........... 26

x

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.- Listado de animales muestreados del acuario serpentario San Martín De

Baños ..................................................................................................................... 18

Tabla 2.- Aislamiento e identificación de muestras obtenidas de reptiles en

cautiverio ............................................................................................................... 19

Tabla 3.- Especie animal, tipo de muestra y especie de Pseudomonas aislada.... 20

Tabla 4.- Patrones de resistencia de Pseudomonas spp. a antibióticos ................ 21

xi

“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp .Y PATRÓN


CAUTIVERIO”.

Autor: René Oswaldo Silva Castillo

Tutor: Dra. María Inés Baquero MSc.

Fecha: Julio, 2015

RESUMEN

El género Pseudomonas comprende bacilos Gram negativos pertenecientes a un

grupo de patógenos oportunistas; en los últimos años han constituido un modelo

por su resistencia natural a la mayoría de antibióticos. Además de su extraordinaria

capacidad para permanecer por tiempos prolongados en reservorios, se caracterizan

por producir infecciones oportunistas en individuos con enfermedades crónicas y

sistema inmune deprimido. Con este enfoque, se llevó a cabo la presente

investigación, cuyo principal objetivo fue identificar los patrones de resistencia a

antimicrobianos en aislamientos de Pseudomonas spp. obtenidos de muestras de

hisopado oral y cloacal (n=110) de toda la población de reptiles (n=55) del

Acuario– Serpentario San Martín de Baños mantenidos en cautiverio. Las muestras

fueron sometidas a pruebas de identificación incluyendo Tinción Gram (bacilos

Gram-) oxidasa (+) y API 20NE. Se aislaron 25 Pseudomonas spp. de las cuales se

identificaron 6 especies diferentes: P. alcaligenes, P. fluorescens, P. mendocina, P.

putida, P. luteola, y P. aeruginosa. En cuanto a los patrones de resistencia se

identificó que Pseudomonas spp. mostró una alta sensibilidad para el grupo de

aminoglucósidos (17%), seguido de fluoroquinolonas (14%) y tetraciclinas (5,7%).

Por el contrario, presentó un patrón de resistencia para el grupo de antibióticos

pertenecientes a los beta lactámicos (31%), seguido de sulfas (6,3%) y finalmente

mostraron un patrón intermedio principalmente para el grupo de los fenicoles (4%).

Los antibióticos que mostraron mayor grado de sensibilidad se encuentran

asociados con los de menor uso en el tratamiento y profilaxis de reptiles, mientras

que los que mostraron mayor grado de resistencia, son aquellos en los que su uso

en reptiles es indiscriminado así como aquellos antibióticos de amplio uso en

producción animal y en humanos; en ese sentido se podría inferir una posible

colonización cruzada entre animales y humanos.

Palabras clave: Pseudomonas spp., REPTILES, AISLAMIENTO,

IDENTIFICACIÓN, PATRÓN, ANTIMICROBIANO

xii

"ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Pseudomonas spp. AND

RESISTANCE PATTERN TO ANTIMICROBIALS IN CAPTIVE

REPTILES."

Author: René Oswaldo Silva Castillo

Tutor: Dra. María Inés Baquero MSc.

Date: July, 2015

ABSTRACT

The Pseudomonas genus includes Gram negative bacilli belonging to a group of

opportunistic pathogens; in recent years they have become a model due to its natural

resistance to most antibiotics. In addition to its extraordinary ability to remain for

long time in reservoirs. They are characterized by producing opportunistic

infections in individuals with chronic diseases and weakened immune system. This

investigation was conducted with this approach, which main objective was to

identify resistance patterns to antimicrobial in isolation of Pseudomonas spp.

obtained from oral and cloacal swabs (n=110) of all reptiles, (n = 55) of the Aquarium

- Serpentarium San Martin de Baños. These samples were subjected for

identification test including Gram stain (Gram- bacillus) oxidase (+) and API 20NE.

25 Pseudomonas spp. were isolated, of wich 6 different species were identified. P.

alcaligenes P. fluorescens, P. mendocina, P. putida, P. luteola, and P. aeruginosa.

Regarding the resistance patterns it was identified that Pseudomonas spp. showed

high sensitivity for the group of aminoglycosides (17 %), followed by

fluoroquinolones (14%) and tetracycline (5.7 %). On the contrary, it presented a

pattern of resistance to the antibiotic group belonging to the beta-lactam (31%),

followed by sulfa drugs (6.3%) and finally showed an intermediate pattern mainly

for phenicols group (4%). The antibiotics that showed greater sensitivity are

associated with those of less use in the treatment and prophylaxis of reptiles,

whereas those that showed greater resistance are those the use of which is

indiscriminate in reptiles, as well as those antibiotics of wide use in animal

production and humans; with these data we could infer an possible cross

colonization between animals and humans.

Keywords: Pseudomonas spp., REPTILES, ISOLATION, IDENTIFICATION,

ANTIMICROBIAL, PATTERN.

1

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

Las Pseudomonas spp. son bacilos Gram negativos que pertenecen a un complejo

grupo de patógenos oportunistas de plantas, animales y el ser humano (Murray et

al.,2014). Estas bacterias son aerobias estrictas, no formadores de esporas, oxidasa

y catalasa positivas, y muchas de ellas son móviles, debido a la presencia de uno o

varios flagelos polares (Bryan et al., 2013); entre sus características principales se

destaca la producción de pigmentos solubles fluorescentes, como la pioverdina,

piocianina y con menor frecuencia piorrubina y piomelanina; igualmente, la

mayoría de cepas presentan un olor característico a fruta madura (Montero, 2012).

Este género posee requerimientos nutricionales mínimos para su crecimiento y

desarrollo, con frecuencia se observa que crecen inclusive en agua destilada, a

temperaturas entre los 37ºC y los 42ºC (Murray et al, 2014). Estas propiedades

naturales mencionadas, contribuyen a su éxito ecológico como patógenos

oportunistas (Murray et al., 2014).

En los últimos años han constituido un paradigma por su resistencia natural a la

mayoría de antibióticos (Martínez et al., 2013). Además de su extraordinaria

capacidad para permanecer por tiempos prolongados en reservorios húmedos,

líquidos y superficies, es excepcional encontrarla como parte de la microflora

normal de los individuos sanos (Martínez et al., 2013). Se caracterizan por producir

infecciones oportunistas en pacientes con enfermedades crónicas y sistema inmune

deprimido; en seres humanos es causante principalmente de infecciones

nosocomiales (Ochoa et al., 2013), mientras que en los animales, puede ser causante

de un sinnúmero de afecciones tales como mastitis en vacas, endometritis en

yeguas, ha sido aislada a partir de aves silvestres las cuales funcionan como

reservorios (Mona et al., 2014), y también es parte muy importante en patología

aviar, donde se ha aislado a partir de pollos Broiler con pododermatitis y artritis

(Dinev et al., 2013) .

2

En el caso de reptiles se destacan condiciones clínicas tales como: enfermedad de

Blíster (Cohen, 2014), estomatitis (Álvarez & Bedia, 2005), conjuntivitis (İşler et

al., 2015) y otitis (Jiménez et al., 2009).

En el Ecuador la población de reptiles es una de las más diversas en el mundo,

contando con aproximadamente tres especies por cada 2.000 Km2 y registrándose

hasta la fecha al menos 440 especies de reptiles (Pazmiño, 2014), esta diversidad

está siendo amenazada por factores de caza, comercialización, tráfico de fauna

silvestre y/o usos medicinales, sumándole a esto, la pérdida de su hábitat por

procesos de desarrollo económico y físicos que han reducido las poblaciones de

reptiles silvestres (Pazmiño, 2014).

En los últimos años han aumentado el número de centros de manejo con fines

educativos, así como también para la reproducción y reintroducción de especies

reptiles amenazadas; es importante destacar, que el inadecuado manejo de ciertas

condiciones de cautiverio, tales como suministro de agua y luz, cambios bruscos

de temperatura y malas prácticas de higiene, provocan procesos de estrés en estos

animales (Martínez et al.,1994). Dentro de los centros de manejo se tratan

frecuentemente a los reptiles de forma general y superficial con antibióticos de

amplio espectro, lo cual conlleva al desarrollo de cepas resistentes a diversos

antimicrobianos y niegan la posibilidad de futuros tratamientos efectivos (Foti et

el.,2013). Estos factores comprometen su estado inmunitario e incrementan la

posibilidad de contraer enfermedades ocasionadas por patógenos oportunistas,

tales como Pseudomonas spp. (Foti et el., 2013).

El género Pseudomonas presenta diversos mecanismos de resistencia natural hacia

una gama de agentes terapéuticos, incluyendo la mayoría de las penicilinas,

cefalosporinas, tetraciclinas, sulfas (Murray et al., 2014). Además, posee la

capacidad de mutar a cepas aún más resistentes durante el tratamiento, debido a que

desarrollan con extrema facilidad cambios a nivel cromosómico donde adquieren

material genético del medio ambiente que le confiere resistencia a los antibióticos

(Martínez et al.,2013). Se han identificado tres mecanismos principales de

resistencia en este género: producción de β-lactamasas (García, 2012), alteraciones

de la permeabilidad de membrana por la presencia de bombas de expulsión y

mutaciones de porinas transmembranales (Gómez et al.,2005).

3

La resistencia a los antibióticos resulta del uso y abuso de los distintos tipos de

antimicrobianos, lo cual acarrea como consecuencia, el fracaso de los tratamientos

y un incremento en los costos del mismo (Martínez et al., 2013). Por esta razón,

ha sido considerado como un problema de salud pública mundial (Rivera et

al.,2008), y la OMS describe a este fenómeno, como la quinta amenaza del siglo

XXI para la salud, haciendo aún más relevante la importancia de su estudio.

Debido a estas razones, se planteó como principal objetivo de esta investigación el

aislar e identificar Pseudomonas spp. a partir de muestras de hisopado oral y cloacal

de reptiles mantenidos en cautiverio, a fin de determinar su patrón de resistencia a

antimicrobianos.

Los datos obtenidos en esta investigación permitirán no solo la orientación hacia

un mejor uso de los antibióticos, sino también será la base para nuevos estudios

sobre esta temática, la cual ha sido poco desarrollada en el Ecuador.

4

CAPÍTULO II

REVISIÓN DE LITERATURA

Antecedentes

La OMS describe a la multirresistencia a antibióticos, como la quinta amenaza del

siglo XXI para la salud, siendo esto de gran importancia a nivel mundial.

Pseudomonas spp. presenta patrones de multirresistencia a diversos antibióticos

como las cefalosporinas, tetraciclinas, quinolonas y macrólidos (Gómez et al.,

2005).Además, tiene una alta capacidad de adquirir nuevos mecanismos de

resistencia, generalmente mediante mutaciones (Manzur., et al 2007).

Con el fin de establecer los patrones de resistencia y sensibilidad que muestra

Pseudomonas spp. a diversos antibióticos, se han realizado investigaciones en

varios (Foti, Giacopello, Fisichella, & Giuseppe, 2013) lugares tales como Japón

(Harda et al.,2012), Italia (Foti et al., 2013), Buenos Aires (Santella et al., 2011),

Venezuela (Martínez et al., 2013) y Perú (Castillo et al.,2012), en los cuales se ha

demostrado que la bacteria es resistente a un amplio grupo de antimicrobianos

debido a la adquisición de múltiples mecanismos de resistencia de origen

cromosomal o mutación simple (Harda et al.,2012).

El Ecuador cuenta con poca información acerca de la resistencia a antibióticos que

presenta Pseudomonas principalmente a nivel veterinario, siendo necesario

investigaciones que permitan tener una base de datos. Es así que los únicos datos

reportados corresponden a estudios realizados por La Red Nacional de Resistencia

Bacteriana creada en el año 1999, la cual ha sido la encargada de presentar datos

de resistencia bacteriana tanto a nivel comunitario como hospitalario, los últimos

datos disponibles presentados en el año 2008 reportaron que Pseudomonas

aeruginosa fue resistente a gentamicina en un 55% y a ciprofloxacina en un 54%

(Quizhpe et al, 2011).

5

Generalidades

El género Pseudomonas y otros como Burkholderia y Stenotrophomonas se

encuentran estrechamente relacionados y constituyen un grupo que a menudo se

denominan pseudomonadales (Murray et al., 2014). La mayoría de las cepas de este

género son móviles gracias a la presencia de uno o más flagelos polares y suelen

ser citocromo oxidasa positivos (Koneman & Stephen, 2008) .El microorganismo

más importante es Pseudomonas aeruginosa. Los miembros de este género se

encuentran en el agua, suelos y plantas. Comúnmente ha sido encontrada en el entorno

de granjas, particularmente en los suministros de agua y especialmente en la usada para el

lavado de la ubre en el pre ordeño (Hossain et al., 2013). En los centros de manejo de fauna

silvestre ha sido aislada con frecuencia a partir de los recipientes de agua (Lucak et al.,

2013) y en los hospitales puede ser encontrada en respiradores, humidificadores,

vertederos, duchas, piscinas de hidroterapia, ocasionalmente en las manos de los

trabajadores de la salud o incluso en los desinfectantes (Roca, 2014).

El género Pseudomonas se distribuye ampliamente en el ambiente, debido a sus

sencillas exigencias para crecer y su vasto recurso nutricional (Murray et al., 2014).

Pueden emplear muchos compuestos orgánicos como fuente de carbono y

nitrógeno, y algunas cepas consiguen incluso crecer en agua destilada empleando

oligonutrientes (Murray et al., 2014). Estos microorganismos presentan factores

estructurales, toxinas y enzimas que potencian su virulencia y los hacen resistentes

a la mayor parte de los antibióticos de uso común (Murray et al., 2014).

Fisiología y estructura

El género Pseudomonas comprende bacilos Gram negativos no formadores de

esporas (Romero, 2007) rectos o ligeramente curvos, generalmente móviles, con

una longitud que varía de 0,5-1,0µm por 1,5-5,0 µm y un espesor de 0,5 a 1µm. Son

aerobios y anaerobios facultativos (Romero, 2007), y se disponen normalmente en

parejas. Estos microorganismos utilizan los carbohidratos como fuente de energía

mediante la respiración aerobia, de modo que el oxígeno es el aceptor terminal de

los electrones; aunque se describen como aerobios obligados pueden en ocasiones

6

crecer de forma anaerobia utilizando nitratos o arginina como aceptor alternativo

para los electrones (Forbes, 2009).

El rango de temperatura óptima para el desarrollo de la mayoría de estas especies

es de 30 a 37 °C, a pesar de ello algunas especies pueden desarrollarse a 4° C

(Romero, 2007). La presencia de citocromo oxidasa en Pseudomonas spp. se

emplea para distinguirla de la familia Enterobacteriaceae y del género

Stenotrophomonas (Murray et al., 2014).

Patogénesis y patogenicidad

La invasión al organismo por parte de Pseudomonas spp.es precedida por una

ruptura en las defensas del hospedador, tales como lesiones en la piel debido a un

trauma, humedad prolongada, pudrición de lana en las ovejas o por la presencia de

catéteres urinarios o intravenosos tanto a nivel hospitalario humano como

veterinario (Quinn et al., 2011). La adherencia a las células hospedadoras resulta

indispensable para ocasionar la infección en el individuo. Al menos cuatro

componentes de la superficie bacteriana de las Pseudomonas spp. facilitan este

proceso (Murray et al.,2014); la primera etapa de la infección está mediada por

apéndices en la superficie de la bacteria conocidos como el pili y fimbrias

(Koneman & Stephen, 2008).

Los flagelos y el alginato, juegan un papel importante en la adherencia,

colonización y replicación de la bacteria; debido a las propiedades antifagocíticas

de la exoenzima S, la sustancia mucoide extracelular y la membrana externa de

lipopolisacáridos (Quinn et al., 2011; Koneman & Stephen, 2008).

El daño tisular es causado por una variedad de toxinas extracelulares y enzimas,

tales como la exotoxina A, Fosfolipasa C y proteasas (Quinn et al., 2011). La

exotoxina A inhibe la síntesis protéica, ejerce una acción dermonecrótica, provoca

lesión de los tejidos pulmonares y tiene acción inmunosupresora (Ausina &

Moreno, 2006). La fosfolipasa C es una hemolisina, la cual destruye la membrana

citoplasmática, la sustancia tenso activa pulmonar e inactiva las opsoninas

(Koneman & Stephen, 2008). Las Proteasas, incluyendo elastasas, destruyen las

inmunoglobulinas y sustancias del complemento, además interrumpen la actividad

de los neutrófilos (Koneman & Stephen, 2008).

7

La infección puede ser localizada o diseminarse, propagándose a todo el organismo

ayudado por la exoenzima S, la toxicidad sistémica se atribuye a la exotoxina A y

endotoxinas. Los mecanismos de defensa del hospedador contra Pseudomonas spp.

incluyen anticuerpos opsonizantes y fagocitosis por parte de neutrófilos y

macrófagos (Quinn, y otros, 2011).

La producción de la sustancia mucoide extracelular y la formación de biofilm son

particularmente importantes en la patogénesis de las infecciones asociadas al uso

de dispositivos permanentes como catéteres (Quinn et al., 2011). La resistencia al

daño mediado por las células del complemento y la capacidad de obtener hierro a

partir de los tejidos del hospedador, son factores de virulencia adicionales (Quinn

et al., 2011).

Los pigmentos producidos por algunas cepas de Pseudomonas spp. funcionan

como sideróforos (Quinn et al., 2011) y otros como las piocianinas, alteran la

integridad principalmente de tejidos oxigenados tales como el pulmón, y además,

disminuyen la actividad de los cilios respiratorios (Palamthodi et al., 2011).

Resistencia a los antibióticos

El género Pseudomonas spp. presenta diversos mecanismos de resistencia hacia

los agentes terapéuticos, además posee la capacidad de mutar a cepas aún más

resistentes durante el tratamiento (Murray et al., 2014). Se han identificado tres

mecanismos principales de resistencia en este género, tales como producción de β-

lactamasas (García, 2012), alteraciones de la permeabilidad de membrana por la

presencia de bombas de expulsión, y mutaciones de porinas transmembranales

(Gómez et al., 2005). Los genes que codifican para la síntesis de las β-Lactamasas

de espectro extendido (BLEE), pueden estar ubicadas a nivel cromosomal, en

plásmidos o integrones, los cuales participan en la acumulación y la diseminación

de los genes de resistencia o en elementos genéticos móviles como los transposones

(Gónzales et al., 2012).

8

β-Lactamasas

Las β-lactamasas son enzimas que hidrolizan el anillo β-lactámico de los

antibióticos, destruyen el sitio activo del antibiótico e impiden su actividad. Existen

algunas sub clasificaciones como, penicilinasas, cefalosporinasas o

carbapenemasas, dependiendo de la familia de β - lactámicos que tenga mayor

susceptibilidad a ser afectada por la enzima (Gómez et al., 2005). De la misma

manera, estas enzimas son susceptibles de ser inhibidas por los inhibidores de β -

lactamasas como el clavulanato, el sulbactam y el tazobactam (Gómez et al., 2005).

P. aeruginosa posee dos clases de β - lactamasas: Amp-C y las β-lactamasas de

espectro extendido (BLEE) (Ranzola et al., 2010). Amp-C, tiene la capacidad de

ser inducida en cuestión de días por los propios β - lactámicos, especialmente

cefalotina y ampicilina. Cuando esto ocurre, hay resistencia a penicilinas y

cefalosporinas (ceftazidime, cefepime) (Ranzola et al., 2010; Gómez et al, 2005)

La resistencia mediada por este mecanismo se debe sospechar ante un antibiograma

que revele resistencia a todas las penicilinas y cefalosporinas anti-Pseudomonas

(Gómez et al., 2005). La opción terapéutica en este caso son los carbapenémicos,

siempre que no se trate de una carbapenemasa (Gómez et al., 2005).

Bombas de expulsión

Las bombas de expulsión son complejos enzimáticos de membrana, que expulsan

detergentes y sustancias anfipáticas de la célula que de otra manera destruirían la

bacteria (Ranzola et al., 2010) .Este sistema de expulsión se compone de una

bomba protéica ubicada en la membrana citoplasmática, una proteína ligadora

ubicada en el espacio periplásmico y un canal de salida en la membrana externa

(Gómez et al, 2005). El complejo tiene la capacidad de expulsar al exterior de la

bacteria y contra un gradiente de concentración, β-lactámicos, cloranfenicol,

quinolonas, macrólidos, novobiocina, sulfonamidas, tetraciclinas y trimetoprim

(Gómez et al, 2005).

9

Porinas de membrana

Son proteínas transmembranales que se ubican en la membrana externa de las

bacterias y cumplen diversas funciones como permitir la captación pasiva de

aminoácidos básicos a través de la membrana externa. Además, son capaces de

permitir la entrada de carbapenémicos, aunque no de otros β-lactámicos (Gómez et

al., 2005).

Otros mecanismos de resistencia

Se presentan también, resistencia a aminoglucósidos debido a la ausencia de

permeabilidad de la membrana externa y por enzimas modificadoras de

aminoglucósidos y resistencia a fluoroquinolonas gracias a impermeabilidad,

bombas de eflujo o mutaciones de las enzimas de girasa y topoisomerasa (Ramirez,

2014).

Enfermedades clínicas

El género Pseudomonas spp. ha sido asociado a un sin número de enfermedades

tanto en animales como en el hombre (Dégi et al., 2014). En el caso de reptiles se

destacan condiciones clínicas tales como:

Enfermedad de Blíster

Las boas pueden presentar un sin número de problemas de salud, una de las razones

más comunes por las cuales los reptiles son llevados a la consulta veterinaria es por

problemas dermatológicos (Dégi et al., 2014). La causa más importante de tales

problemas es un inadecuado manejo, especialmente los relacionados a cambios

inapropiados de temperatura y humedad (Silvestre, 2000) . La enfermedad de

Blíster conocida también como dermatitis vesicular o dermatitis necrotizante se

presenta al mantener reptiles con demasiada humedad o reducidas condiciones

higiénicas (Cohen, 2014). Cuando el animal se ve obligado a permanecer sobre el

sustrato húmedo, saturado de alimento en descomposición o con las heces y uratos,

la piel se infecta (Dégi et al., 2014). La presencia de ampollas es la primera señal,

más tarde las escamas aparecen inflamadas. La infección puede permanecer en el

cuerpo del animal desapercibida causando septicemia (Cohen, 2014). Los pequeños

10

reptiles o los que se encuentran inmunodeprimidos mueren rápidamente, las

lesiones en la piel se pueden presentar en lugares distantes a la ampolla inicial,

dejando al cuerpo susceptible a la invasión de bacterias y hongos (Dégi et al.,

2014).

Estomatitis

Las alteraciones del tracto digestivo de los reptiles responden a múltiples causas y

presentan cuadros clínicos inespecíficos (Álvarez & Bedia, 2005). La estomatitis

vesicular es el nombre común para describir a las infecciones en la boca (cavidad

oral) de los reptiles (Cohen, 2014); estas infecciones pueden ser bacterianas, virales,

fúngicas, o de origen parasitario. Otras posibilidades son: cáncer, cuerpos extraños

y fracturas mandibulares (Dégi et al., 2014). Frecuentemente están asociadas con

las infecciones de la boca de los reptiles los traumatismos en la región del rostro a

causa de la fricción sobre las paredes de la caja o mordidas por parte de la presa

(Anderson, 2015).

Las tortugas son más propensas a las infecciones virales y parasitarias, las cuales

resultan en infecciones orales y pulmonares, incluso cuando las condiciones

ambientales y de manejo son ideales (Dégi et al., 2014). El pronóstico es reservado

en los casos donde existe material caseoso de manera significativa, y grave para los

pacientes con afectación ósea significativa (Anderson, 2015).

Septicemia y úlceras cutáneas

Generalmente, esta enfermedad tiene un curso agudo con úlceras cutáneas,

anorexia, letargia, septicemia y muerte. La enfermedad se asocia con varias

bacterias, principalmente Gram negativas (Granados et al., 2013). Se ha reportado

la enfermedad ocasionalmente en tortugas marinas y terrestres, y se caracteriza por

llevar un curso crónico con erosión y descamación del caparazón (Jimenez et al.,

2009).

11

Conjuntivitis

La conjuntivitis es vista con frecuencia en las tortugas de orejas rojas, si la

enfermedad no es tratada puede discurrir rápidamente en inanición y muerte (İşler

et al., 2015).

Otitis

En las tortugas suele asociarse a situaciones por falta de higiene o deficiencias de

vitamina A. La hipovitaminosis produce metaplasia escamosa de los epitelios de

conductos auditivos e infección secundaria del oído interno (Jiménes et al., 2009).

Diagnóstico de laboratorio.

Microscopia

La observación de bacilos Gram negativos largos y delgados, sueltos o en pares a

partir de un cultivo sugiere la presencia de Pseudomonas spp; Burkholderia,

Stenotrophomonas y otros microorganismos que comparten una morfología similar

(Murray et al., 2014).

Cultivo

Dado que Pseudomonas spp. tiene exigencias nutricionales muy sencillas, es fácil

recuperar esta bacteria en medios de aislamiento no selectivos tales como agar

sangre o selectivos diferenciales para bacilos Gram negativos como agar Mac-

Conkey (Kumar & Shaker, 2014). El aislamiento puede ser realizado también

directamente en medios selectivos para esta especie tales como Agar Pseudomonas

(Ebani et al., 2008) o agar Cetrimide, el cual puede ser suplementado con ácido

nalidíxico para incrementar su selectividad (Colinon et al., 2009). Para su desarrollo

se somete a incubación aerobia, a 37°C por 24 a 48 horas (Foti et al., 2013).

Identificación

Las cepas aisladas de Pseudomonas spp. pueden identificarse observando

características primarias como el tamaño y forma de las colonias, la presencia de

un olor similar al de uvas maduras y la producción de pigmentos (Koneman &

12

Stephen, 2008). Las colonias son generalmente grandes, mucoides o secas, y a

menudo se propagan (Koneman & Stephen, 2008). La mayoría de las cepas

producen piocianina; pigmento verde hidrosoluble fácilmente identificado al

diseminarse en el medio, la presencia de este pigmento puede ser la única

característica necesaria para identificar al microorganismo (Murray et al., 2014).

Algunas cepas de características mucoides no producen pigmentos y, por lo tanto,

pueden ser mal interpretadas si la producción de este es el único criterio utilizado

para la identificación (Koneman & Stephen, 2008). Existen cepas de Pseudomonas

spp. que pueden producir pigmentos con otros colores tales como piorrubina (rojo),

piomelanina (pardo a negro) y pioverdina (amarillo verdoso) (Murray et al., 2014).

Los medios que contienen peptona 3 y cationes como magnesio o manganeso,

aumentan la síntesis de fluoresceína (Koneman & Stephen, 2008). EL medio de

King B, el medio de Sellers y el agar de Muller-Hinton también son apropiados para

demostrar la fluorescencia, lo cual se evidencia ante una fuente de luz ultravioleta

de longitud de onda larga. La fluorescencia puede aumentar si se incuban los

cultivos a 20 a 30 °C en lugar de hacerlo a 35 a 37 °C (Koneman & Stephen, 2008).

La presencia de un olor similar al de uvas maduras es un indicio útil cuando se

examina el crecimiento en los medios de cultivo (Murray et al, 2014).

Existen otras características que son útiles para identificar cepas de Pseudomonas

aeruginosa. que no producen pigmento como, crecimiento a 42°C, alcalinización

de acetamida, desnitrificación de nitratos y nitritos o puede confirmarse su

presencia con la pruebas de identificación rápida como la reacción positiva a

oxidasa (Lukac et al., 2013).

Pueden hallarse variantes que producen colonias mucoides o enanas con reacciones

bioquímicas atípicas y en estos casos es necesario utilizar una batería bioquímica

completa como la galería API 20 NE que es un sistema estandarizado para la

identificación de los bacilos Gram negativos no pertenecientes al grupo de las

enterobacterias (Lukac et al, 2013). También se utilizan técnicas moleculares, a fin

de identificar aislamientos por PCR; amplificación y secuenciación del gen rARN

(Quinn et al., 2011).

13

Tratamiento, prevención y control

Se requiere de una combinación de antibióticos de amplio espectro para el éxito en

el tratamiento de las infecciones graves (Murray et al., 2014). Elegir el

antimicrobiano apropiado para iniciar el tratamiento es fundamental cuando se trata

de optimizar los resultados y reducir tanto la morbilidad como la mortalidad; sin

embargo, esa selección no es sencilla por la capacidad de la bacteria para extender

todos sus mecanismos de resistencia y suprimir a un gran número de antibióticos

(Santella et al., 2011). La amikacina, gentamicina, trimetoprim sulfametaxol, y

meropenem han mostrado un mayor espectro de acción frente a las infecciones por

Pseudomonas spp. y resultan efectivos para el tratamiento (Iclal et al.,2014). A

pesar de ello, no existe un fármaco de elevada efectividad contra este

microorganismo, por esa razón, en algunos casos, la utilización de vacunas pueden

ser necesarias en crías de visones y chinchillas a modo de prevención (Quinn et al.,

2011), en otros, se mantiene una terapia con inmunoglobulinas polivalentes

comerciales que de forma combinada con los antimicrobianos contribuyen a

eliminar la infección (Cedré et al., 2007).

Los intentos para eliminar Pseudomonas spp. son inútiles en la práctica dada la alta

distribución de los microorganismos en los reservorios de agua. Las continuas

actividades para el control de la infección se deben concentrar en prevenir la

contaminación de los equipos estériles y la contaminación cruzada de los pacientes

por el personal sanitario. También, es importante eludir el uso inapropiado de los

antibióticos de amplio espectro, debido a que este uso puede diezmar la flora

microbiana normal y permitir el crecimiento excesivo de cepas resistentes de

Pseudomonas (Murray et al., 2014).

Resulta de vital importancia corregir a tiempo las deficiencias con respecto al

manejo de los animales mantenidos en cautiverio. Las buenas prácticas de higiene

aseguran el éxito en el tratamiento, estas deben ser realizadas a diario. Al tratarse

de reptiles que usualmente son mantenidos en pequeños contenedores, ligeros

cambios en el ambiente como reducir la humedad del sustrato colocando toallas de

papel, ajustar la temperatura y humedad, mejorar la ventilación y proporcionar una

alimentación adecuada, mantienen un sistema inmunitario elevado. Cuando el

manejo es inapropiado la recuperación es temporal (Maas, 2013).

14

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA

Población objeto de estudio

La población objeto de ésta investigación fueron los reptiles mantenidos en

cautividad del Centro de Manejo de Fauna Silvestre Acuario – Serpentario San

Martín, propiedad del Sr. Leonardo Vega, con la patente N° 01-14-SAU/NA. El

Centro está localizado en el Barrio San Martín, Parroquia Lligua, Cantón Baños,

Provincia de Tungurahua.

Las especies animales de las cuales se tomaron las muestras fueron:

boa arcoíris, anaconda, boa constrictor, boa de jardín, caimán, charapa, falsa coral,

iguana verde, tortuga mordedora, tortuga taparrabo, tortuga motelo, y tortuga de

orejas rojas.

Toma de muestras

Fase de campo

Serpientes:

Los ofidios deben ser manejados con sistemas de protección como guantes

adecuados a la mordedura del animal, así como utensilios destinados al manejo a

distancia del ofidio (Silvestre, 2000).

Saurios:

Los saurios serán sujetados a nivel de la cintura escapular con una mano, con el fin

de dominar la cabeza y las patas anteriores, en los animales grandes se sujetarán

también a nivel de la cintura pélvica con la otra mano, de manera que controlaremos

la cola y las extremidades posteriores (Silvestre, 2000).

15

Luego de realizar una sujeción correcta, se procedió al hisopado de la cavidad oral

y cloacal de los especímenes. Las muestras fueron conservadas en el medio Stuart

y se transportaron en frío (4°C) al laboratorio de Bacteriología de la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.

Aislamiento e identificación bacteriana

Las muestras fueron cultivadas en el medio selectivo Agar Pseudomonas, y

posteriormente fueron incubadas a 37ºC durante 24-48 horas. A las 48 horas de

incubación, se procedió a escoger una colonia al azar, con las características

morfológicas correspondientes a Pseudomonas spp; después se realizó la

confirmación mediante tinción Gram con la que se rectificó la presencia de bacilos

Gram negativos. Se realizó la prueba de oxidasa en discos, tomando en cuenta para

el estudio solamente los valores positivos. Finalmente se realizó el aislamiento de

la cepa bacteriana en agar Tripticasa de Soya, a fin de realizar a las 24 horas

posteriores de la incubación, la identificación de la cepa por medio de la prueba

API20 NE.

Api 20 NE

Con un hisopo estéril se tomó una colonia del cultivo puro en Tripticasa de Soya y

se realizó una dilución a 0.5 Mc Farland en solución salina al 0,9%. Siguiendo las

instrucciones de la casa comercial se procedió a colocar la dilución bacteriana con

una jeringuilla evitando la formación de burbujas. Se llevó a incubación a 37°C por

24 horas.

Lectura de API

Las reacciones en NO3 y TRP fueron revelados con los reactivos NIT 1, NIT 2 y

JAMES respectivamente de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Los datos se

anotaron en la hoja de resultados del kit, y se procedió a sumar los valores positivos

obteniendo así un código numérico, el cual fue analizado en el programa API WEB.

16

Determinación del patrón de resistencia a antimicrobianos.

Luego de haber identificado a las especies de Pseudomonas spp., se realizó el

antibiograma con la técnica de difusión de discos de Kirby Bauer en Agar Mueller-

Hinton con los antibióticos: penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido

clavulánico, cefalotina, gentamicina, trimetoprim sulfametaxol, enrofloxacina,

ciprofloxacina, cloranfenicol, tetraciclina, cefotaxime y estreptomicina.

Método Difusión de discos de Kirby Bauer

Preparación de la placa de Mueller-Hinton

De acuerdo a las indicaciones del fabricante se preparó la placa de Mueller-Hinton

y se conservó en refrigeración hasta su uso. Las placas pueden ser también

colocadas en una incubadora de 35°C o en una campana de flujo laminar a

temperatura ambiente hasta que sequen (normalmente de 10 a 30 minutos)

(Hudzicki, 2009).

Preparación del inóculo

Usando un hisopo estéril se tomó una pequeña muestra del cultivo puro en

Tripticasa de soya, se realizó una dilución de la colonia en 2 ml de solución salina

estéril al 0,9%, se agitó para crear una suspensión uniforme, y finalmente se ajustó

la turbidez de la suspensión a un patrón 0,5 de McFarland (Hudzicki, 2009).

Inoculación de placas

En el tubo de inóculo se sumergió y giró un hisopo estéril contra el lado del tubo

(por encima del nivel de líquido) ejerciendo una presión firme, para eliminar el

exceso de líquido. La superficie seca de una placa de agar Mueller-Hinton fue

inoculada, rayando el hisopo tres veces más de la totalidad de la superficie del agar;

girando a 60 grados para asegurar una distribución uniforme del inóculo en la placa

(Hudzicki, 2009).

17

Aplicación de los discos.

Los discos antimicrobianos fueron colocados de manera anti horaria en la superficie

del agar, utilizando pinzas para dispensar cada uno de los discos en el siguiente

orden: 1 GM (gentamicina), 2 CTX (cefotaxime), 3 CF (cefalotina), 4 P

(penicilina), 5 AM (ampicilina), 6 SXT (trimetoprim sulfametaxol), 7 AMC

(amoxicilina más ácido clavulánico), 8 S (estreptomicina), 9 C (cloranfenicol), 10

ENO (enrofloxacina), 11 TE (tetraciclina) y 12 CIP (ciprofloxacina).

Las placas fueron invertidas y colocadas a 37°C en la incubadora durante 24 horas.

Informe de los resultados.

Medición de tamaño de la zona

Después de la incubación, se midió el diámetro del halo de zona de inhibición por

medio de un calibrador y se registraron los datos.

Los tamaños de las zonas de inhibición fueron interpretados en las tablas del

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), para ser calificados como

Sensible, Intermedio, o Resistente (Hudzicki J. , 2009). Las cepas aisladas en el

estudio fueron conservadas en Brain Heart Infusion (BHI) más glicerol al 10%.a -

80ºC.

18

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

Aislamiento e identificación de microorganismos

De acuerdo al diseño experimental de este estudio se colectaron 110 muestras de

hisopado oral y cloacal respectivamente, correspondientes a 55 reptiles mantenidos

en cautiverio en el Centro de Manejo de Fauna Silvestre Acuario – Serpentario San

Martín (Tabla 1).

Tabla 1. Listado de animales muestreados del acuario serpentario San Martín De

Baños

Nombre común Nombre Científico N°

Boa Arcoíris Epicrates cenchria-cenchria 5

Anaconda Eunectes murinus 1

Boa Constrictor Boa constrictor spp. 20

Boa de jardín Corallus hortulanus 1

Caimán Caiman crocodilus 1

Charapa Podecnemis unifilis 2

Falsa coral Lampropeltis triangulum 1

Iguana verde Iguana iguana 6

Tortuga mordedora Chelydra serpentina 10

Tortuga taparrabo Kinosternon spp. 2

Tortuga motelo Chelonoides denticulata 3

Tortuga de orejas rojas Trachemis scripta elegans 3

Total 55

De cada aislamiento se tomó una colonia al azar, cuyas características morfológicas

y bioquímicas coincidían con Pseudomonas spp., identificándose 4 géneros

bacterianos: Pseudomonas, Aeromonas, Burkholderias y Shewanellas (Tabla 2).

Los géneros de Pseudomonas aislados fueron: P. alcaligenes (n=1), P. aeruginosa

(n=10), P. fluorescens (n=3), P. luteola (n=1), P. mendocina (n=3) y P. putida

(n=7). En Boa constrictor spp. se encontró a P. aeruginosa (n=9),

19

P. mendocina (n=3) y P. putida (n=4); en Epicrates spp. se observó únicamente a

P. fluorescens (n=1); en Eunectes murinus se aisló a P. alcaligenes (n=1) y

P. aeruginosa (n=1); en Lampropeltis. Triangulum se encontró a P. fluorescens

(n=2) y finalmente en Podocnemis unifilis se aisló a P. luteola (n=1) y P. putida

(n=3) (Tabla 2).

Tabla 2. Aislamiento e identificación de muestras obtenidas de reptiles en

cautiverio

En la cavidad oral de los reptiles muestreados, se encontraron las 6 especies de

Pseudomonas ya mencionadas, sin embargo P. putida (n=5) fue aislada en mayor

cantidad seguida por P. aeruginosa (n=4), P. fluorescens (n=2) y finalmente P.

mendocina, P. luteola y P. alcaligens con un aislamiento (n=1). A partir del

hisopado cloacal se aislaron, únicamente 4 especies, de las cuales la más numerosa

fue: P. aeruginosa (n=6), seguida por P. mendocina (n=2) y P. putida (n=2) en igual

cantidad, y finalmente P. fluorescens (n=1). En la Tabla 3 se indica los resultados

de acuerdo a la especie animal tipo de muestra y las especies de Pseudomonas.

Especie animalB

. co

nst

ricto

r

C. cro

co

dil

us

Ch

. d

en

ticu

lata

Ch

. a

cu

tiro

stri

s

C. h

ort

ula

nu

s

Ep

icra

tes

sp

E. m

uri

nu

s

I. i

gu

an

a

Kin

ost

ern

on

sp

L. tr

ian

gu

lum

P. u

nif

ilis

T. sc

rip

ta e

leg

an

s

Tota

l g

ener

al

Po

rcen

taje

Aeromonas hydrophila 13 2 4 12 - 2 - 3 4 - - 4 44 40

Aeromonas sobria - - - 4 - - - - - - - - 4 3,64

Burkholderia cepacia 3 - - 1 2 4 - - - - - - 10 9,09

Burkholderia gladioli 2 - - 2 - 1 - - - - - - 5 4,55

Burkholderia pseudomallei - - - - - 1 - - - - - - 1 0,91

Psesudomonas alcaligenes - - - - - - 1 - - - - - 1 0,91

Pseudomonas aeruginosa 9 - - - - - 1 - - - - - 10 9,09

Pseudomonas fluorescens - - - - - 1 - - - 2 - - 3 2,73

Pseudomonas luteola - - - - - - - - - - 1 - 1 0,91

Pseudomonas mendocina 3 - - - - - - - - - - - 3 2,73

Pseudomonas putida 4 - - - - - - - - - 3 - 7 6,36

Shewanella putrefaciens - - - 1 - 1 - - - - - - 2 1,82

Otras bacterias - Oxidasa (-) 6 - 2 - - - - 9 - - - 2 19 17,27

Total general 40 2 6 20 2 10 2 12 4 2 4 6 110 100

Especie

bacteriana

20

Tabla 3. Especie animal, tipo de muestra y especie de Pseudomonas aislada.

N° Especie animal Especie

bacteriana

Muestra

oral

Muestra

cloacal Total

1 Podocnemis. unifilis P. luteola 1 0 1

2 Podocnemis. unifilis P. putida 1 2 3

6 Boa constrictor spp P. aeruginosa 4 5 9

4 Boa constrictor spp P. putida 4 0 4

2 Boa constrictor spp P. mendocina 1 2 3

1 Eunectes murinus P. alcaligenes 1 0 1

1 Eunectes murinus P. aeruginosa 0 1 1

1 Epicrates spp P. fluorescens 1 0 1

1 Lampropeltis triangulum P. fluorescens 1 1 2

Total 14 11 25

Patrones de resistencia a antimicrobianos

Los antibióticos utilizados fueron P (penicilina), AM (ampicilina), AMC

(amoxicilina más ácido clavulánico), CTX (cefotaxime), CF (cefalotina), ENO

(enrofloxacina), CIP (ciprofloxacina), GM (gentamicina), S (estreptomicina), SXT

(trimetoprim sulfametaxol), C (cloranfenicol), TE (tetraciclina). Los antibióticos

mencionados pertenecen a las principales familias de antimicrobianos con las

cuales se trata comúnmente a especies animales mantenidas en cautividad. En

general, las cepas sometidas al experimento demostraron una variedad de

resultados, los antibióticos más eficaces, es decir aquellos que presentaron un alto

grado de sensibilidad (S) fueron: ciprofloxacina (100%), gentamicina (100%),

estreptomicina (100%), siguiéndole en menor grado, enrofloxacina (68%),

tetraciclina (68%) y cefotaxima (64%). Se determinó un alto grado de resistencia

(R) para los siguientes antimicrobianos: ampicilina (100%), cefalotina (100%),

penicilina (100%) trimetoprim sulfametaxol (76%) y amoxicilina más ácido

clavulánico (72%), el único antimicrobiano que mostró un patrón intermedio en

mayor porcentaje fue cloranfenicol (48%) (Tabla 4) (Figura1).

21

Tabla 4. Patrones de resistencia de Pseudomonas spp. a antibióticos

Antibiótico Patrón Sensible Patrón Intermedio Patrón Resistente

AM 0 0 25

% 0 0 100

AMC 1 6 18

% 4 24 72

C 6 12 7

% 24 48 28

CF 0 0 25

% 0 0 100

CIP 25 0 0

% 100 0 0

CTX 16 8 1

% 64 32 4

ENO 17 8 0

% 68 32 0

GM 25 0 0

% 100 0 0

P 0 0 25

% 0 0 100

EST 25 0 0

% 100 0 0

SXT 1 5 19

% 4 20 76

TE 17 6 2

% 68 24 8

P (penicilina), AM (ampicilina), AMC (amoxicilina más ácido clavulánico), CTX (cefotaxime), CF (cefalotina), ENO

(enrofloxacina), CIP (ciprofloxacina), GM (gentamicina), S (estreptomicina), SXT (trimetoprim sulfametaxol), C (cloranfenicol), TE (tetraciclina)

P (penicilina), AM (ampicilina), AMC (amoxicilina más ácido clavulánico), CTX (cefotaxime), CF (cefalotina), ENO (enrofloxacina), CIP (ciprofloxacina), GM (gentamicina), S (estreptomicina), SXT (trimetoprim sulfametaxol), C

(cloranfenicol), TE (tetraciclina)

Figura 1. Patrones de resistencia a los antibióticos

0

5

10

15

20

25

30

AM AMC C CF CIP CTX ENO GM P EST SXT TE

Antibiótico

N°

de

ce

pas

ais

lad

as

Patrones de resistencia

Patrón Sensible

Patrón Intermedio

Patrón Resistente

22

Finalmente se realizó la clasificación por especie animal y el patrón de resistencia

a los antimicrobianos que presentan las cepas de Pseudomonas spp. (Ver Tablas en

la sección de anexos)

En Lampropeltis triangulum se observó un patrón de resistencia para los

antibióticos penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina,

y trimetoprim sulfametaxol, mientras que un patrón intermedio se determinó para

los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, cloranfenicol y tetraciclina, finalmente

se encontró un patrón sensible para los antibióticos ciprofloxacina, gentamicina y

estreptomicina. Éste patrón fue observado en ambas muestras, es decir oral y

cloacal.

Para Epicrates spp. se aisló Pseudomonas spp. solamente de la muestra oral, se

observó un patrón resistente para los antibióticos penicilina, ampicilina,

cefotaxima, cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y cloranfenicol, el patrón

intermedio fue observado en amoxicilina más ácido clavulánico y tetraciclina,

finalmente el patrón sensible fue establecido para los antibióticos ciprofloxacina,

gentamicina y estreptomicina.

En Eunectes murinus se aisló a Pseudomonas spp. de ambas muestras, el patrón de

resistencia se observó en los antibióticos penicilina, ampicilina, cefalotina y

trimetoprim sulfametaxol, mientras que los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,

ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina, mostraron

un patrón de sensibilidad, finalmente, amoxicilina más ácido clavulánico fue el

único en mostrar un patrón intermedio.

Para el animal identificado como “Boa 19”, Boa constrictor spp. se aisló

Pseudomonas spp. solamente de la muestra de hisopado cloacal. Se observó un

patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, amoxicilina más ácido

clavulánico, ampicilina, cefalotina y trimetoprim sulfametaxol. El patrón

intermedio fue identificado para los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, y

cloranfenicol, finalmente se estableció un patrón de sensibilidad para

ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y tetraciclina.

Para el individuo identificado como “Boa 18”, Boa constrictor spp. se aisló

Pseudomonas spp., únicamente de la muestra oral. Se observó un patrón de

23

resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina, cefalotina y trimetoprim

sulfametaxol, el patrón intermedio se identificó en amoxicilina más ácido

clavulánico y cloranfenicol, finalmente el patrón de sensibilidad se determinó en

los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina y

tetraciclina.



resistencia para penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico,

cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y cloranfenicol, mientras que el patrón de

sensibilidad fue observado en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,

ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y tetraciclina.



resistencia para penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico,

cefalotina y trimetoprim sulfametaxol. El patrón de sensibilidad se observó en

cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y

tetraciclina. Solamente cloranfenicol mostró un patrón intermedio.


Pseudomonas spp., únicamente de la muestra oral. El patrón resistente se observó

en penicilina, ampicilina, cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y cloranfenicol. El

patrón de sensibilidad se determinó en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,

ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina. Solamente amoxicilina más ácido

clavulánico mostró un patrón intermedio.


Pseudomonas spp. únicamente de la muestra cloacal. Los antibióticos que

mostraron un patrón de resistencia fueron penicilina, ampicilina, amoxicilina más

ácido clavulánico, cefalotina y trimetoprim sulfametaxol. El patrón de sensibilidad

se observó en cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina,

estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina.


Pseudomonas spp. de ambas muestras, es decir, de hisopado oral y cloacal. Con

24

respecto a la muestra oral se observó un patrón de resistencia para penicilina,

amoxicilina, ampicilina más ácido clavulánico, y cefalotina. El patrón de

sensibilidad se observó en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,

ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina. Finalmente el patrón intermedio se

observó en trimetoprim sulfametaxol, cloranfenicol y tetraciclina. Con respecto a

la muestra cloacal se observó un patrón de resistencia para los antibióticos

penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina y trimetoprim

sulfametaxol, mientras que se observó un patrón intermedio solamente para

cefotaxima, y finalmente se observó un patrón de sensibilidad para los antibióticos

enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol y

tetraciclina.


Pseudomonas spp. de ambas muestras, es decir, oral y cloacal. En cuanto a los

patrones de la muestra oral, se observó un patrón de resistencia para penicilina,

ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico y cefalotina. El patrón intermedio se

observó en trimetoprim sulfametaxol, cloranfenicol y tetraciclina. El patrón de

sensibilidad se determinó en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,

ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina. Para la muestra cloacal, se observó

un patrón resistente para penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico,

cefalotina. El patrón de sensibilidad fue observado en enrofloxacina,

ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y trimetoprim sulfametaxol.

Solamente cefotaxima mostró un patrón intermedio.


Pseudomonas spp. de ambas muestras, tanto de hisopado oral como cloacal. Se

observó un patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina,

amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y

cloranfenicol. Enrofloxacina mostró un patrón intermedio. Finalmente se determinó

un patrón sensible para ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y tetraciclina.

El antibiótico cefotaxima, mostró un patrón de sensibilidad para la muestra oral,

mientras que indicó un patrón intermedio para la muestra cloacal.


Pseudomonas spp. de ambas muestras. En cuanto a la muestra oral, se observó un

25

patrón resistente para los antibióticos penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido

clavulánico y cefalotina. El patrón intermedio se identificó en trimetoprim

sulfametaxol, cloranfenicol. Finalmente, el patrón de sensibilidad se observó en los

antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina y

estreptomicina. Para la muestra cloacal se observó un patrón de resistencia para los

antibióticos, penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina

y trimetoprim sulfametaxol, mientras que el patrón intermedio se observó en

cefotaxima y enrofloxacina. Finalmente el patrón de sensibilidad se observó en

ciprofloxacina y gentamicina.


Pseudomonas spp. de ambas muestras, en cuanto a la muestra oral, se observó un

patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina, amoxicilina más

ácido clavulánico, cefalotina y trimetoprim. En cuanto al patrón intermedio, este se

observó en cloranfenicol. Finalmente, se observó un patrón de sensibilidad para

cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y

tetraciclina. Para la muestra cloacal el patrón resistente se observó en penicilina,

ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina, trimetoprim

sulfametaxol, y cloranfenicol. Cefotaxima y enrofloxacina, mostraron un patrón

intermedio. Finalmente el patrón de sensibilidad se observó en los antibióticos

ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina.

Para el animal identificado como “Pod 1”, Podocnemis unifilis, se aisló

Pseudomonas spp. de ambas muestras, en cuanto a la muestra oral, se observó un

patrón resistente para los antibióticos penicilina, ampicilina, cefalotina y

trimetoprim sulfametaxol. El patrón intermedio fue observado en cloranfenicol.

Finalmente el patrón de sensibilidad se observó en los antibióticos cefotaxima,

enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, y estreptomicina. Para la muestra

cloacal se observó el patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, y

ampicilina, mientras que el patrón intermedio fue observado en amoxicilina más

ácido clavulánico y trimetoprim sulfametaxol. Finalmente el patrón de sensibilidad

fue observado en cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina,

estreptomicina y cloranfenicol.

26

Para el animal identificado como “Pod 2”, Podocnemis unifilis, se aisló

Pseudomonas spp. de ambas muestras; en cuanto a la muestra oral, se observó el

patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina y cefalotina,

mientras que el patrón de sensibilidad se observó en los antibióticos amoxicilina

más ácido clavulánico, cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina,

estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina. Finalmente el patrón intermedio se

observó únicamente en trimetoprim sulfametaxol. En cuanto a los resultados para

la muestra cloacal, se observó el patrón de resistencia para los antibióticos

penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina, y trimetoprim

sulfametaxol, mientras que el patrón de sensibilidad fue observado en cefotaxima,

enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol y

tetraciclina.

Chi cuadrado

Se realizó el test de Chi cuadrado en el cual se observó la asociación entre el patrón

de resistencia y la familia de antibióticos, en los resultados se obtuvo un valor de P

menor a 0.05 (P valor < 2.2e-16), lo cual es estadísticamente significativo entre las

variables. Se determinó el porcentaje de resistencia y sensibilidad de cada grupo de

antimicrobianos utilizados en la prueba. Se identificó un patrón de sensibilidad

para la familia de aminoglucósidos del 17%, fluoroquinolonas del 14 %,

tetraciclinas y betalactámicos del 6% y fenicoles del 2%. En lo que respecta al

patrón resistente, este fue del 31% para la familia de los betalactámicos, del 6%

para sulfas, 2% para fenicoles y finalmente 1% para tetraciclinas. (Ver figura 2)

P valor < 2.2e-16 Altamente significativo

Figura 2.- Chi cuadrado. Grupo de antibióticos vs patrón de resistencia

0%

5% 4% 3% 1,7% 2%0%

31%

2%0%

6,3%

1%

17%

6%2%

14%

0,3%

5,7%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

AminG BetL Fenicol FlrQ Sulfa Tetra

Intermedio Resitente Sensible

27

DISCUSIÓN

Los estudios realizados acerca de Pseudomonas spp. en reptiles en cautiverio son

escasos, a pesar de ello, los investigadores destacan la gran adaptabilidad genética

y metabólica de la bacteria, para vivir en ambientes acuáticos, terrestres, y diversos

tejidos de animales (Ruíz, 2007).

Los reptiles en cautiverio suelen presentar una amplia variedad de infecciones

bacterianas a causa de lesiones traumáticas por heridas por mordedura, y una mala

calidad del medio ambiente; en este sentido, Pseudomonas spp. es uno de los

patógenos más comúnmente aislados (Yeon et al., 2001). En cuanto a los resultados

de esta investigación, se aislaron cuatro cepas bacterianas fenotípicamente similares

en cuanto al perfil bioquímico inicial realizado en el laboratorio; los géneros

identificados fueron: Pseudomonas, Aeromonas, Burkholderia y Shewanella.

Dichas especies bacterianas, se encuentran generalmente extendidas en ambientes

terrestres y acuáticos, y a menudo son responsables de diferentes patologías en

reptiles (Ebani et al., 2006). Tales microorganismos son capaces de causar

dermatitis en las serpientes y lagartos, otitis de las tortugas galápagos, infecciones

respiratorias, cloacitis y abscesos de manera sistémica, subcutánea o visceral (Ebani

et al., 2008).

Varios estudios mencionan que es frecuente encontrar este microorganismo como

parte de la flora bacteriana normal de individuos sanos (Ruíz 2007), siendo el tracto

gastrointestinal el lugar más habitual de colonización, con lo que respecta a esta

investigación las muestras fueron tomadas a partir de individuos aparentemente

sanos y se aislaron tanto de cavidad oral como cloacal.

El total de cepas aisladas fue 25, de las cuales, 14 fueron aislados de cavidad oral

y 11 en cavidad cloacal. Se observó un mayor número de aislados de

Pseudomonas spp. en cavidad oral, siendo estos resultados congruentes con los

obtenidos por Jho et al.,(2011), quienes a partir de la toma de muestra de 10

serpientes mantenidas en cautividad en un zoológico, obtuvieron una tasa de

aislamiento de Pseudomonas spp del 50% en muestras orales, y tan solo de un 5%

en muestras cloacales.

28

Se identificaron seis especies de Pseudomonas spp. tanto en cavidad oral como en

cloacal respectivamente, de las cuales P. aeruginosa estuvo presente en mayor

número, con 10 aislados, pertenecientes a Boa constrictor spp. (n=9) y a

Eunectes murinus (n=1); se obtuvo 7 aislados de P. putida provenientes de

Boa constrictor spp. (n=4) y Podocnemis unifilis (n=3). Se identificaron 3 aislados

de Pseudomonas fluorescens y mendocina a partir de muestras provenientes de las

especies de reptiles Epicrates spp. y Boa constrictor spp. respectivamente; y un

aislado (n=1) de P. alcaligenes y P. luteola respectivamente, pertenecientes a

Eunectes murinus y Podocnemis unifilis.

Es difícil correlacionar los resultados obtenidos entre las diferentes especies de

Pseudomonas aisladas y la especie de reptil en cautiverio muestreado, debido a que

los estudios existentes en humanos y animales se enfocan solamente en el

aislamiento de Pseudomonas spp, o en su defecto en P. aeruginosa y fluorescens;

no se registran investigaciones en el aislamiento de otras especies de este género,

y son pocos los estudios realizados en reptiles. Es así que, autores como János et

al.,(2012) mencionan en su estudio la presencia de Pseudomonas spp. en un caso

de dermatitis vesicular en Boa constrictor, otros como Chaprazov et al., (2013),

describen el caso de una iguana con un absceso oral y pérdida de piezas dentales,

causado por P. aeruginosa. Así también el estudio de Lukac et al., (2013),

describen el caso de un asilamiento de Pseudomonas aeruginosa en una serpiente

de cascabel que presentó un absceso subcutáneo. En otros estudios realizados, tales

como los de Martínez et al en el año 1994 y López et al.,( 2012 ) describen el

hallazgo de Pseudomonas del grupo fluorescens en un caso de septicemia en una

iguana común, y peces lenguadillo (Dicologlossa cuneata) respectivamente.

El género Pseudomonas spp. ha sido estudiado por presentar diversos mecanismos

de resistencia a antimicrobianos, además de poseer una gran capacidad de mutar a

cepas aún más resistentes durante el tratamiento (Murray et al., 2014). Se han

identificado tres mecanismos principales de resistencia en este género, tales como

producción de β-lactamasas (García, 2012) alteraciones de la permeabilidad de

membrana por la presencia de bombas de expulsión, y mutaciones de porinas

transmembranales (Gómez et al., 2005). Los antibióticos utilizados en esta

investigación fueron escogidos tomando en cuenta el uso indicado en el tratamiento

de reptiles en general (Carpenter, 2006). Se encontró una multirresistencia a varios

29

grupos de antimicrobianos, sin embargo esta resistencia no fue total. Se realizó el

test de Chi cuadrado en el cual se observó la asociación entre el patrón de resistencia

y la familia de antibióticos, en los resultados se obtuvo un valor de P menor a 0.05

(P valor < 2.2e-16), lo cual es estadísticamente significativo entre las variables,

esto, gracias a que se logró cumplir un parámetro de distribución normal.

Los genes que codifican para la síntesis de las β-Lactamasas de espectro extendido

(BLEE), pueden estar ubicados a nivel cromosómico, en plásmidos, integrones o en

elementos genéticos móviles como transposones, los cuales participan en la

acumulación y transferencia de genes de resistencia (Gónzales et al., 2012).

En este estudio, el grupo de los betalactámicos mostró el mayor patrón de

resistencia (31%) en relación al resto de antimicrobianos utilizados. Es así que, el

género Pseudomonas spp., presentó el 100% de resistencia para los β-lactámicos:

ampicilina, cefalotina y penicilina, 72% para amoxicilina más ácido clavulánico, y

4% para cefotaxime. Los resultados obtenidos en esta investigación son similares a

los encontrados por Foti et al., (2013) donde también se reportó una tendencia a la

resistencia para éste grupo de antimicrobianos, encontrando un patrón resistente de

71,7% para ampicilina, 73,9% para cefalotina 95,6%, para penicilina y 50% para

cefotaxime. La resistencia a los betalactámicos en nuestro estudio podría estar

relacionado con el uso indiscriminado de estos antimicrobianos en el tratamiento

de los reptiles mantenidos en cautividad, que le confieren resistencia principalmente

a penicilinas y cefalosporinas (Murillo et al., 2009).

La resistencia al grupo de antimicrobianos pertenecientes a las sulfas puede

aparecer por mutaciones, presencia de plásmidos que codifican formas de

dihidroreductasa y en otros casos es mediada por los genes de los cromosomas

(Camacho, 2003).

En este estudio las sulfas mostraron una resistencia del 6,3% en relación al resto de

grupos de antimicrobianos utilizados. El género Pseudomonas spp. presentó el 76%

de resistencia a trimetoprim sulfametaxol. Los resultados obtenidos en este estudio

son similares a los encontrados por Foti et al., (2013) dónde también reportó una

tendencia a la resistencia en sulfas, encontrando para trimetoprim sulfametaxol un

patrón resistente del 93,5%. Del mismo modo, Vargas et al., (2010) realizaron

aislamientos de Pseudomonas spp.(n=9) a partir de la cavidad rectal de animales

30

mantenidos en cautiverio y obtuvieron un patrón de resistencia del 100% para este

antibiótico.

El antibiótico trimetoprim sulfametaxol ha sido utilizado por décadas en la

producción animal, ya sea como profilaxis o con fines terapéuticos, y en tratamiento

de infecciones humanas, por lo que su resistencia está ampliamente difundida

(Junod et al., 2013). La razón, por la cual en nuestro estudio, Pseudomonas spp.

alcanzó el 76% de resistencia a este antimicrobiano se pueda deber al contacto

estrecho que tiene esta población de reptiles en cautiverio con los humanos, en la

cual podríamos suponer que existe una colonización cruzada de estas cepas.

El mecanismo más común de resistencia a cloranfenicol es la inactivación

enzimática por acetilación principalmente a través de acetiltransferasas o, en

algunos casos, por fosfotransferasas (Fernández et al.,2011). La resistencia a

cloranfenicol también puede ser debido a la mutación en el sitio diana, disminución

de la permeabilidad de la membrana externa, y la presencia de bombas de eflujo

que a menudo actúan como transportadores de extrusión de múltiples fármacos,

reduciendo así la concentración intracelular eficaz del antibiótico (Fernández et

al.,2011).

En este estudio, el grupo de los fenicoles mostro una resistencia del 2%, en relación

al resto de antimicrobianos utilizados. Es así que en esta investigación el género

Pseudomonas spp. mostró el 28% de resistencia a cloranfenicol, un patrón

intermedio del 50% y un patrón sensible del 24%. Los resultados obtenidos en este

estudio difieren a los encontrados por Vargas et al.,(2010) donde indican que el

género Pseudomonas spp. alcanzó un patrón resistente del 55% para para

cloranfenicol. El mantenimiento y diseminación de cepas resistentes dentro de una

población animal , podría deberse a una falta de control en el manejo de sistemas

de producción, tratamientos antibióticos, reservorios, entre otros (Junod et al.,

2013). Este tipo de antibióticos han sido utilizados por décadas en dichos animales,

ya sea como profiláctico o con fines terapéuticos ( Nollet et al., 2005). También es

utilizado en el tratamiento de infecciones humanas, por lo que su resistencia esta

ampliamente difundida, haciendo que los tratamientos con dicho antibiótico en la

actualidad sen poco efectivos ( Nollet et al., 2005).

31

Los aminoglucósidos constituyen un grupo de antimicrobianos de gran importancia

en el tratamiento de las enfermedades infecciosas, principalmente por su actividad

sobre enterobacterias y otras bacterias Gram negativas, especialmente

Pseudomonas, que son con frecuencia resistentes a otros antibióticos (Flóres., et al

2014). La resistencia bacteriana a los aminoglucósidos puede producirse por varios

mecanismos, tales como alteraciones en los puntos de unión en el ribosoma

bacteriano, reducción en el acceso de los aminoglucósidos al citoplasma bacteriano

y finalmente el más importante, al menos desde un punto de vista clínico, es la

síntesis de enzimas bacterinas que, al modificar la estructura química de los

diferentes aminoglucósidos, reducen su actividad antibacteriana (Flóres.,et al

2014).

En este estudio, el grupo de los aminoglucósidos mostró el mayor patrón de

sensibilidad en relación al resto de antimicrobianos utilizados (17%). Es así que, el

género Pseudomonas spp, presentó el 100% de sensibilidad para los

aminoglucósidos: gentamicina y estreptomicina. Los resultados obtenidos en esta

investigación son similares a los encontrados por Foti et al., (2013) donde también

reportaron una tendencia a la sensibilidad en éste grupo de antimicrobianos,

encontrando en gentamicina un patrón de sensibilidad del 85,3%, a diferencia de

los resultados encontrados por Salazar et al., (2001) donde indican un patrón

altamente resistente para estreptomicina. Después de analizar estos resultados, es

necesario destacar la importancia de realizar estudios de los patrones de resistencia

de Pseudomonas spp. en cada zona, y periódicamente, para poder valorar las

diferentes pautas terapéuticas, pues no es posible extrapolar los datos de las

diferentes regiones en dónde se han realizado los estudios. Las diferencias

encontradas se pueden explicar por el distinto uso de los antibióticos en cada centro,

así mismo, por la variación geográfica, lo cual podría ocacionar una modificación

en los mecanismos de resistencia de Pseudomonas spp (Delgado et al, 2007).

Las fluoroquinolonas son antibióticos que bloquean las síntesis de los ácidos

nucleicos mediante la inhibición de enzimas Topoisomerasas de tipo II (en bacterias

Gram negativas) y tipo IV (en bacterias Gram positivas), las cuales son necesarias

para la replicación, recombinación y reparación del ADN de las bacterias

(Contreras et al. 2011). Frente a Gram negativos la fluoroquinolona más potente

es la ciprofloxacina, sin embargo, Pseudomonas, Staphylococcus y Enterococcus

32

pueden desarrollar resistencia, originada por mutaciones en el sitio diana de acción

de estos antibióticos o por la presencia de bombas de eflujo (Contreras., et al 2011).

En este estudio, las fluoroquinolonas mostraron un patrón de sensibilidad del 14%

en relación a los otros grupos de antimicrobianos utilizados. Es así que, el género

Pseudomonas spp, presentó el 100% de sensibilidad para la ciprofloxacina a

diferencia de la enrofloxacina que mostró un patrón de sensibilidad del 68%. Los

resultados obtenidos en esta investigación son similares a los encontrados por

Hossain et al., (2013) y Foti et al., (2013) donde también reportaron una tendencia

a la sensibilidad en éste grupo de antimicrobianos, encontrando en ciprofloxacina

un patrón de sensibilidad del 93,5% y en enrofloxacina un patrón de sensibilidad

del 52,2%. Por otro lado, los estudios realizados por Ebani et al., 2008 indicaron

un patrón de sensibilidad de la enrofloxacina del 22,72%. El alto porcentaje de

sensibilidad que presenta Pseudomonas spp. frente a la ciprofloxacina podría

deberse a que su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas en reptiles en

cautiverio no es común (Arias, 2015), lo cual sugiere que la ciprofloxacina es la

mejor opción ante una infección ocasionada por microorganismos de éste género,

tal como lo mencionan Hossain et al., (2013) en sus estudios.

Cabe mencionar que la creciente disminución de la susceptibilidad observada a la

enrofloxacina, podría deberse a su uso generalizado en el tratamiento de diversos

procesos infecciosos (Calva et al, 2004). Es posible que la resistencia aumente de

manera importante, de tal modo que llegue a comprometer su eficacia clínica en el

futuro. Lo mencionado anteriormente, obliga al uso prudente de las

fluoroquinolonas en la actual práctica médica, así como a la vigilancia periódica de

la susceptibilidad en nuestro medio (Calva et al, 2004).

Las tetraciclinas son antimicrobianos de amplio espectro, con actividad contra una

amplia gama de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, aerobios y anaerobios.

Se han descrito tres mecanismos principales de resistencia a tetraciclinas tales como

eflujo activo, protección ribosomal, e inactivación enzimática (Jara, 2007).

En este estudio, el grupo de las tetraciclinas presentó una sensibilidad del 5,7% en

relación al resto de grupos de antimicrobianos utilizados. Es así que en esta

investigación el género Pseudomonas spp. presentó el 68% de sensibilidad al

33

antibiótico tetraciclina. Los resultados obtenidos en este estudio difieren de los

resultados encontrados por Foti et al., (2013) quienes indican un patrón sensible

del 15,2 %, del mismo modo que estudios realizados por Ebani et al., (2008)

quienes muestran un patrón sensible del 27,28%.

Esta variabilidad de datos podría deberse a que en nuestro medio no se ha

generalizado el uso de este antibiótico en el tratamiento de enfermedades

infecciosas en reptiles, ya que el de preferencia a nivel veterinario es la

oxitetraciclina (Gómez et al., 2009), y ante el surgimiento de nuevos

antimicrobianos de amplio espectro, la tetraciclina ha sido reemplazada antes de

alcanzar mayores niveles de resistencia.

En relación al patrón de sensibiliad hallado en los diferentes grupos de

antimicrobianos la tetraciclina fue la que mostró el menor porcentaje, esto se puede

deber a que en las últimas décadas se han reportado casos de cepas resistentes a este

antimicrobiano (Requelme et al., 2014) debido su uso prolongado en la terapia de

enfermedades infecciosas en animales, empleo de dosis subterapéuticas

profilácticas o como promotores del crecimiento; factores que ejercen una

permanente presión de selección sobre la flora bacteriana lo cual conlleva a la

presentación del fenómeno de resistencia (Jara, 2007).

Durante esta investigación se demostró la presencia de altos niveles de resistencia

a los antibióticos utilizados contra Pseudomonas spp. en este centro de manejo.

Las diferencias encontradas con los otros estudios pueden atribuirse al distinto uso

de los antibióticos en los centros de manejo de fauna silvestre. Por este motivo, se

considera apropiado vigilar los perfiles de resistencia en cada laboratrio

microbiológico, proporcionando la información necesaria para evitar el uso

empírico de los antibióticos.

34

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

En este estudio se lograron identificar seis especies de Pseudomonas a partir

de hisopado oral y cloacal de reptiles mantenidos en cautiverio en el Acuario

Serpentario San Martín de Baños, Provincia de Tungurahua.

Se determinaron los patrones de resistencia a antimicrobianos en cepas de

Pseudomonas spp. aisladas. En este sentido, se identificó un 100 % de

resistencia a los antibióticos ampicilina, cefalotina y penicilina, mientras

que los antibióticos que mostraron el mayor porcentaje de sensibilidad

fueron gentamicina, ciprofloxacina y estreptomicina.

Mediante el análisis estadístico se determinó que el grupo de antibióticos

que mostró un mayor grado de resistencia fueron los betalactámicos

mientras que para el grupo de los aminoglucósidos y las fluoroquinolonas

se observó un mayor grado de sensibilidad.

En este estudio los antibióticos que mostraron mayor grado de sensibilidad

se encuentran asociados con los de menor uso en el tratamiento y profilaxis

de reptiles, mientras que los que mostraron mayor grado de resistencia

fueron aquellos en los que su uso en reptiles es indiscriminado así como

aquellos antibióticos de amplio uso en producción animal y en humanos; en

ese sentido se podría inferir una posible colonización cruzada entre animales

y humanos.

35

RECOMENDACIONES

Realizar estudios de caracterización de la flora bacteriana bucal de los

reptiles mantenidos en cautiverio, así mismo, de las heces de las presas con

las que se las alimenta con el fin de correlacionar los datos y determinar la

flora bacteriana normal de los reptiles.

Actualizar e instaurar habitualmente investigaciones acerca de los patrones

de sensibilidad y resistencia bacteriana, a fin de conocer datos reales de

forma que el personal médico los conozca al momento de prescribir los

fármacos.

Realizar una próxima investigación acerca de la variabilidad fenotípica y

genotípica de los aislados mediante metodologías moleculares para poder

estudiar las mutaciones y su relación con la resistencia a los antibióticos en

las cepas estudiadas.

36

BIBLIOGRAFÍA

Álvarez, B., & Bedia, M. (2005). Alteraciones digestivas en ofidios. AVEPA, 249-254.

Anderson, N. (1 de Mayo de 2015). Pet place. Obtenido de

http://www.petplace.com/article/reptiles/general/illnesses-conditions-of-

reptiles/mouth-rot-infectious-stomatitis-ulcerative-stomatitis

Arias, L. (14 de julio de 2015). Antibióticos de uso frecuente en fauna silvestre. (R. Silva,

Entrevistador)

Ausina, R. V., & Moreno, G. (2006). Tratado SEIMC de enfermedades infecciosas y

microbiología clínica. Buenos Aires: Médica Panamericana.

Bryan, M., Finola, L., Marie, A., Ann, C., & Dores, M. (2013). Clinical Veterinary

Microbiology. China: Mosby.

Calva, M. J., Castillo, G., & López, Y. (2004). Actividad de las fluoroquinolonas en

aislamientos clínicos de Streptococcus pneumoniae con diferente susceptibilidad

a la penicilina: Estudio epidemiológico en cinco ciudades de la República

Mexicana. Gac Méd Mex, 253-258.

Camacho, V. (2003). Los antimicrobianos en la práctica médica.

Carpenter, J. (2006). Formulario de animales exóticos. Buenos Aires: Inter-Médica.

Castillo, M., Lachira, A., Cardoza, K., & Ramos, Y. (2012). Aislamiento de cepas de

Pseudomonas spp. en neonatos: serie de casos*. Rev.cuerpo méd. , 18-21.

Cedré, B., Mildrey, F., Adriana, C., Moya, A., Días, D., Parajón, E., & Valdes, Y. (2007).

Evaluación en animales del efecto protector de una inmunoglobulina.

VacciMONITOR, 13-16.

Cohen, H.-Y. (7 de Abril de 2014). Reptile expert. Obtenido de

http://www.reptileexpert.co.uk/blisterdisease.html

Colinon, C., Jocktane, D., Brothier, E., Rossolini, & María, G. (2009). Genetic analyses

of Pseudomonas aeruginosa isolated from healthy captive snakes: evidence of

high inter-and intrasite dissemination and occurrence of antibiotic resistance

genes. Environmental Microbiology,, 716-729.

Contreras, A., Durán, A., Sibrian, B., & Méndez, M. (2011). Resisntencia a

fluoroquinolonas en Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus aislados

de tejidos blandos en pacientes con diabetes mellitus, Estado Aragua. Comunidad

y salud, 44-53.

Contreras, A., Durán, A., Sibrian, B., & Méndez, M. (2011). Resistencia a

fluoroquinolonas en Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus aislados

de tejidos blandos en pacientes con diabetes mellitus, estado Aragua. Comunidad

y Salud, 44-53.

Dégi, J., Kálmán , I., Viorel , H., & Cătană , N. (2014). A case of blister disease to Boa

constrictor. Scientific Works. C Series. Veterinary Medicine, LVIII ISSUE 4, 88-

91.

37

Delgado, G., García, M., Rodríguez, F., Ibarra, A., & Casal, M. (2007). Sensibilidad y

resistencia de Pseudomonas aeruginosa a los antimicrobianos . Rev Esp

Quimioterap, 230-233.

Dinev, I., Dinev, S., & Beev, G. (2013). Clinical and Morphological Studies on

Spontaneous Cases of Pseudomonas aeruginosa. Pakistan Veterinary Journal,

398-400.

Ebani, Fratini, Ampola, & Rizzo. (2008). Pseudomonas and Aeromonas isolates from

domestic reptiles and study of their antimicrobial in vitro sensitivity. Vet Res

Commun, S195–S198.

Fernández, M., Conde, S., De la Torre, J., Molina, C., Ramos, J., & Duque, E. (2011).

Mechanisms of Resistance to Chloramphenicol in Pseudomonas putida KT2440.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1001–1009.

Flóres, J., Armijo, J., & Mediavilla, Á. (2014). Farmacología Humana. Barcelona: Gea

Consultora Editorial., S.L.

Forbes, A. B. (2009). Diagnostico Microbiologico. Buenos Aires: Ed. Médica

Panamericana.

Foti, M., Giacopello, C., Fisichella, V., & Giuseppe, L. (2013). Multidrug-resistant

Pseudomonas aeruginosa isolates from captive reptiles. Journal of Exotic Pet

Medicine, 270-274.

García, A. (2012). Antimicrobial resistance in Peru and Latin America. Acta médica

peruana, 99-103.

García, C., Carvajal, A., Collazós, j., & Rubio, P. (2009). Herd-level risk factor for faecal

sheeding of Salmonella enterica in Spanish fattenig pigs. Preventive Veterinary

Medicine, 4065-70.

Gómez, C., Dölz, H., & Millano, A. (2009). Estudio cualitativo y cuntitativo de las

tetraciclinas y fenicoles importados y autorizados para uso y disposición en

medicina humana y en veterinaria en Chile, en el período 2000-2007.

Consideraciones sobre su impacto para la salud pública y el medio. Valdivia.

Gómez, C., Leal, A., Pérez, M., & Navarrete, M. (2005). Mecanismos de resistencia en

Pseudomonas aeruginosa: entediendo a un peligroso enemigo. Rev Fac Med

Univ Nac, 53(1), 28-29.

Gónzales, M., Ribas, R., Coria, J., Donis, R., & Aparicio, G. (2012). Elsevier, 535-541.

Granados, L., Moreno, G., & Brieva, I. (2013). Lesiones ulcerativas cutáneas en tortugas

dulceacuícolas. Rev Med Vet Zoot, 61-70.

Harda, K., Arima, S., Niina, A., Kataoka, Y., & Takahashi, T. (2012). Characterizacion of

Pseudomonas aeruginosa isolates from dogs and cats in Japan: current status of

antimicrobial resistance and prevailing resistance mechanims. Microbiol

Immunol, 123-127.

Hossain, M., Saha, S., Rahman, M., J.K., S., & Mamun, A. (2013). Isolation,

Identification and Antibiogram Study of Pseudomonas Aeruginosa from Cattle in

Bangladesh. Journal of Veterinary Advances, 180-185.

38

Hudzicki, J. (2009). Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol. Obtenido

de ASMMicrobelLibrary: http://www.microbelibrary.org

Iclal, B., Senel, S., Tanir, G., & Ozkan, S. (2014). Bacteremia Caused by Pseudomonas

luteola in Pediatric Patients. Japanese journal of infectious diseases., 50-54.

İşler, C. T., Altuğ, M. E., Seçer, F. S., & Cantekin, Z. (2015). Treatment of Bath with

Enrofloxacin in Red-Eared Sliders (Trachemys scripta elegans) Suffer from

Conjunctivitis. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 429-431.

János, D., Imre, K., Herman, V., & Nicolae, C. (2012). A case of blister disease to boa

constrictor. Veterinary Medicine, 88-91.

Jara, M. (2007). Tetraciclinas: un modelo de resistencia antimicrobiana. Avances en

Ciencias Veterinarias , 49-55.

Jho, Y.-S., Park, D.-H., Lee, J.-H., & Lyoo, Y. (2011). Aerobic bacteria from oral cavities

and cloaca of snakes in a petting zoo. Korean J Vet Res, 243-247.

Jiménes, S., Domingo, O., Crosta, L., & Martínes-Silvestre, A. (2009). Manual clínico de

animales exóticos. Barcelona: Multimédica Ediciones Veterinarias.

Jimenez, J., Domingo, R., Crosta, L., & Martínez, A. (2009). Manual Clínico de

Animales Exóticos. Barcelona: Multimedica Ediciones Veterinarias.

Junod, T., López, J., & Gädicke, P. (2013). Antimicrobial susceptibility of animal and

food isolates of Salmonella enterica. Rev. méd. Chile, 298-304.

Junod, T., López, J., & Gadicke, P. (2013). Estudio de susceptibilidad antimicrobiana de

Salmonella enterica en muestras de origen animal y alimentario. Rev Med Chile,

298-304.

Koneman, E. W., & Stephen, A. (2008). Koneman. Diagnostico Microbiologico/

Microbiological diagnosis. Buenos Aires: Ed. Médica Panamericana,.

Kumar, S., & Shaker, R. (2014). Isolation identification and antibiotic susceptibility test

of non-fermenters from different clinical specimens. Journal of Advances in

Applied Sciences and Technology, 48-52.

Lavilla, L., Benomar, N., Casado, M. d., Gálvez, A., & Abriouel, H. (2014). Antibiotic

Multiresistance Analysis of Mesophilic and Psychrotrophic Pseudomonas spp.

Isolated from Goat and Lamb Slaughterhouse Surfaces throughout the Meat

Production Process. American Society for Microbiólogy, 6792-6806.

López, J., Diégues, A., Doce, A., De la Roca, E., De la Herra, R., Navas, J., . . . Romalde,

J. (2012). Pseudomonas baetica sp. nov., a fish pathogen isolated from wedge

sole, Dicologlossa cuneata (Moreau). International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology, 874–882.

Lucak, M., Matanovic, K., & Barbic, B. (30 de 11 de 2013). Combination treatment of a

pseudomonadant abscess in western black-tailed rattlesnake Crotalus molossus

molossus: case report. Zagreb.

Lukac, M., Matanovic, K., Barbic, L., & Seol, B. (2013). Combination treatment of a

pseudomonad abscess in a western black-tailed rattlesnake Crotalus molossus

molossus: a case report. Veterinarni Medicina,, 637-640.

39

Maas, A. (2013). Vesicular, Ulcerative, and Necrotic. Elsevier, 738-755.

Manzur Soria, M. d., Bustamante, Z., & Gonzales, G. (2007). Presencia de integrones y

su relación con la resistencia a antimicrobianos en cepas de Pseudomonas

aeruginosa. Gaceta Médica Boliviana, 30(1), 5-12.

Martínez, A., Marco, A., & Mateu, E. (1994). Septicemia por Pseudomonas fluorescens

en iguana común. 27-30.

Martínez, A., Marcov, A., & Mateu, E. (1994). Septicemia por Pseudomonas fluorescens

en una iguana común. Centre de Recuperació de Rèprils i Amfibis. COMAM.,

Departament d'Anatomia Patológica., Barcelona.

Martínez, E., Liendo, E., Véliz, H., Herrera, W., & Brett, A. (2013). Resistencia y

sensibilidad de Pseudomonas aeruginosa en el Hospital Central Universitario,

Barquisimieto Edo.LAra. Revista Venezolana de Salud Plública, 35-42.

Molina, L., Zulema, U., Duque, E., Fernandez, M., & Molina, C. (2014). Antibiotic

Resistance Determinants in a Pseudomonas putida strain isolated from a hospital.

Plos One.

Mona, I., El-Enbaawy, Nagwa, A. S., & Gamal, A. O. (2014). Risk of Free Living Birds

(Pigeons, Iibises, Hoopoes and Crows) in Transmission of Multidrug Resistant

Pseudomonas aerouginosa in Sohag Governorate. Global Veterinaria, 725-730.

Montero, M. M. (2012). Pseudomonas aeruginosa multiresistente: aspectos

epidemiológicos, clínicos y terapéuticos. Barcelona.

Morales, S., Silva, W., & Rojas, G. (2012). Flora bacteriana normal de la cavidad oral de

boas mantenidas en cautiverio en Lima-Perú. Científica 9, 220-224.

Murillo, L., Sosa, Q., & López, C. (2009). Patrón de Resistencia Antimicrobiana de

Pseudomonas aeruginosa en el Hospital genera de Culiacán. Latindex, 6-11.

Murray, P. R., Rosental, K. S., & Pfaller, M. A. (2014). Microbiología Médica (7 ed.).

Madrid: Elsevier.

Nollet, N., Houf, K., Dewulf, J., De Kruif, A., & De Zutter, L. (2005). Salmonella in

sows: a longitudinal study in farrow-to-finish pig herds. Vet Res, 645-56.

Ochoa, S., López-Montiel, F., Escalona, G., Cruz-Córdova, F., Dávila, L., López-

Martínez, B., & Jiménez-Tapia, Y. (2013). Características patogénicas de cepas

de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos, asociadas con la

formación de biopelículas. Bol Med Hosp Infant, 138-150.

Palamthodi, S. M., Gaikwad, V. J., Ghasghase, N. V., & Patil, S. S. (2011). Antibacterial

targets in Pseudomonas aeruginosa. International Journal of Pharmaceutical

Applications, 2, 159-164. Obtenido de http://www.bipublication.com

Pazmiño-Otamendi. (2014). Reptilia Web Ecuador. Obtenido de

<http://zoologia.puce.edu.ec/vertebrados/reptiles/FichaEspecie.aspx?Id=3061>

Pérez, R. (2010). Farmacología Veterinaria . Chile.

Public Health England. (2015). Identification of Pseudomonas species and other Non-

glucose fermenters. UK Standars for Microbiology investigation, 7-41. Obtenido

40

de https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-

quality-and-consistency-in-clinical-laboratories

Quinn, P., Markey, B., Leonard, F., Patrick, F., Fanning, S., & HArtigan, P. (2011).

Veterinaryan Microbiology and Microbial Disease (Second ed.). Blackwell

Publishing Ltd.

Quizhpe, A., Murray, M., Muños, G., Peralta, J., & Calle, K. (2011). Recuperar la salud

integral y la armonía de los ecosistemas, para contener la resistencia bacteriana a

los antibióticos. ReAct latinoamérica, 4-28.

Ramirez, J. (28 de Agosto de 2014). Perlas clínicasen medicina interna, Tips de la

medicina clínica por excelencia. . Obtenido de

http://jrminterna.blogspot.com/2014/08/el-micro-organismo-del-mes-

pseudomonas.html

Ranzola, R., Pérez, T., & Montoya, R. (2010). Interpretación del antibiograma:

inferencias a nivel molecular de mecanismos de resistencia en Pseudomonas

aeruginosa. Medicentro, 295-298.

Requelme, S., Chávez, M., Javes, N., Ramirez, R., Sauceda, E., & Villanueva, J. (2014).

Identificación y evaluación de la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias

causantes de infección en pacientes con órganos trasplantados. Ciencia y

tencnología, 151-165.

Rivera-Jacinto, M., Rodríguez-Ulloa, C., Huayán-Dávila, & Gladys. (2008).

Pseudomonas aeruginosa productora de betalactamasa clásica y de espectro

extendido en reservorios de un servicio de neonatología. Rev Perú Med Exp

Salud Pública, 250-252.

Roca, L. (10 de Mayo de 2014). Pseudomonas aeruginosa: un adversario. Obtenido de

Redalyc.org: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=53535594009

Rodriguez, M., Gundián, J., Barreto, J., Lim, N., Areu, A., & Pardo, A. (1998).

Tetraciclinas., (págs. 75-9). La Habana.

Romero, C. R. (2007). Microbiologia y parasitologia humana/Bases etiologicas de las

enfermedades infecciosas y parasitarias. Mexico: Editorial Médica Panamericana.

Rui, S., Ferreira, J., Amanda, K. S., Campagner, M. V., Salerno, T., Soares, T. C., . . .

Paes, A. C. (2009). Comparison of wildlife and captivity rattlesnakes (Crotalus

durissus terrificus) microbiota1. Pesq. Vet. Bras., 999-1003.

Sacsaquispe, R., & Ventura, G. (2001). Manual de Procedimientos Bacteriológicos en

Infecciones Intrahospitalarias. Lima.

Saha, H., Singha, R., & Mamun, J. (2013). Isolation, Identification and Antibiogram

Study of Pseudomonas Aeruginosa from Cattle in Bangladesh. J Vet Adv, 180-

185.

Salazar, D., Hernández, Y., Palma, S., González, A., & Reyes, T. (2001). Actividad

antimicrobiana de doce fármacos frente a cepas de Pseudomonas aeruginosa de

origen clínico. Bioquimia, 79-84.

Sandoval, C., Moreno, C., & Abarca, K. (2011). Sepsis por Pseudomonas aeruginosa en

un lactante previamente sano. Revista chilena de infectología, 592-596.

41

Santella, G., Pollini, S., Docquier, J., Almuzara, M., & Gutkind, G. (2011). Resistencia a

carbapenemes en aislamientos de Pseudomonas aeruginosa: un ejemplo de

interacción entre distintos mecanismos. Rev Panam Salud Pública, 545-548.

Silvestre, A. M. (2000). Manual Clínico de Reptiles. Barcelona: Grass-Iatros.

Sura, R., Creden, A., & Van, K. (2008). Pseudomonas-associated discospondylitis in a

two-month-old llama. J Vet Diagn Invest, 349–352.

Vargas, J., Mattar, S., & Monsalve, S. (2010). Bacterias patógenas con alta resistencia a

antibióticos: estudio sobre reservorios bacterianos en animales cautivos en el

zoológico de Barranquilla. Infectio, 6-19.

42

ANEXOS



Hoja de campo diseñada para anotar datos

FICHA CLÍNICA

Centro de manejo:

Fecha:

Especie: Sexo:

Edad:

Tiempo de Tenencia: Procedencia:

Alimentación: Frecuencia:

Suplementos:

Tratamientos/Medicinas:

Lesiones:

Observaciones:

Terrario:

Tamaño: Nº habitantes

Especies:

Temperatura: Humedad: Luz:

43



Esquema de trabajo

Esta figura muestra la estrategia experimental que se abordó para cumplir los

objetivos de esta investigación.

Hisopado

oral/cloacal

Stuart (transporte)

Frio 4ºC

Pseudomonas agar

37ºC/24-48h

Selección morfológica de 1

colonia

Tinción Gram

(bacilos Gram -)

Oxidasa

(positivo)

Cultivo Tripticasa de Soya

API 20 NE

Pseudomona spp.

Patrón de resistencia antimicrobiana

Técnica de Kirby Bauer

lectura

patrones de resistencia

cepario (BHI + 10% glicerol)

44

Tablas por cada individuo, aislamientos de Pseudomonas spp. y patrones de

resistencia. Epicrates spp. (5-epi)

Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal

P Resistente (-)

AM Resistente (-)

AMC Intermedio (-)

CTX Resistente (-)

CF Resistente (-)

ENO Intermedio (-)

CIP Sensible (-)

GM Sensible (-)

S Sensible (-)

SXT Resistente (-)

C Resistente (-)

TE Intermedio (-)

E. murinus (Ana)


P Resistente Resistente

AM Resistente Resistente

AMC Intermedio Intermedio

CTX Sensible Sensible

CF Resistente Resistente

ENO Sensible Sensible

CIP Sensible Sensible

GM Sensible Sensible

S Sensible Sensible

SXT Resistente Resistente

C Sensible Sensible

TE Sensible Sensible

Boa constrictor spp. (Boa 19)


P (-) Resistente

AM (-) Resistente

AMC (-) Resistente

CTX (-) Intermedio

CF (-) Resistente

ENO (-) Intermedio

CIP (-) Sensible

GM (-) Sensible

S (-) Sensible

SXT (-) Resistente

C (-) Intermedio

TE (-) Sensible

45



P Resistente (-)

AM Resistente (-)

AMC Intermedio (-)

CTX Sensible (-)

CF Resistente (-)

ENO Sensible (-)

CIP Sensible (-)

GM Sensible (-)

S Sensible (-)

SXT Resistente (-)

C Intermedio (-)

TE Sensible (-)



P Resistente (-)

AM Resistente (-)

AMC Resistente (-)

CTX Sensible (-)

CF Resistente (-)

ENO Sensible (-)

CIP Sensible (-)

GM Sensible (-)

S Sensible (-)

SXT Resistente (-)

C Resistente (-)

TE Sensible (-)



P Resistente (-)

AM Resistente (-)

AMC Resistente (-)

CTX Sensible (-)

CF Resistente (-)

ENO Sensible (-)

CIP Sensible (-)

GM Sensible (-)

S Sensible (-)

SXT Resistente (-)

C Intermedio (-)

TE Sensible (-)

46



P Resistente (-)

AM Resistente (-)

AMC Intermedio (-)

CTX Sensible (-)

CF Resistente (-)

ENO Sensible (-)

CIP Sensible (-)

GM Sensible (-)

S Sensible (-)

SXT Resistente (-)

C Resistente (-)

TE Sensible (-)



P (-) Resistente

AM (-) Resistente

AMC (-) Resistente

CTX (-) Sensible

CF (-) Resistente

ENO (-) Sensible

CIP (-) Sensible

GM (-) Sensible

S (-) Sensible

SXT (-) Resistente

C (-) Sensible

TE (-) Sensible





AMC Resistente Resistente

CTX Sensible Intermedio





S Sensible Sensible

SXT Intermedio Resistente

C Intermedio Sensible

TE Intermedio Sensible

47











S Sensible Sensible

SXT Intermedio Sensible

C Intermedio Resistente

TE Intermedio Sensible








ENO Intermedio Intermedio



S Sensible Sensible


C Resistente Resistente









ENO Sensible Intermedio



S Sensible Sensible


C Intermedio Intermedio

TE Intermedio Intermedio

48








ENO Sensible Intermedio



S Sensible Sensible


C Intermedio Resistente

TE Sensible Resistente

P. unifilis (Pod 1)




AMC Intermedio Intermedio






S Sensible Sensible

SXT Resistente Intermedio

C Intermedio Sensible


P. unifilis (Pod 2)




AMC Sensible Resistente






S Sensible Sensible


C Sensible Sensible


49

Fotos del trabajo de campo y laboratorio.

Sujeción caimán Sujeción boa

Muestra cloacal en iguana Muestra oral en iguana

Control de viales, P. aeruginosa Control de viales, E coli

ATCC 27853 ATCC 25922

50

Control de viales, S. aureus Siembra en el laboratorio

ATCC 25923

Identificación de colonias Pigmento, Pseudomonas aeruginosa

Fluorescencia bajo luz negra, Pseudomonas aeruginosa

51

Coloración Gram, objetivo de inmersión Identificación de bacilos

Disco de oxidasa (positivo)

Lectura pruebas API 20 NE Lectura pruebas API 20 NE

Antibiograma, colocación de discos Antibiogramas, patrones de resistencia

https://www.google.com.ec/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRw&url=https://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/pruebas-bioquimicas-primarias/&ei=f4tsVanMMcOjNtPtgegK&bvm=bv.94455598,d.eXY&psig=AFQjCNG6eegiqQ1pc5Omurgk2Sq_2ZR-1g&ust=1433263314776629

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