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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

Caracterización patogénica, bioquímica y molecular del agente causal de la pudrición de tallo del maíz,

Variedad iniap-103 mishqui sara

Tesis de grado previo a la obtención del título de Ingeniera agrónoma

AUTOR: Caiza Imbaquingo Rosa Beatriz

TUTOR: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David M.Sc.

Quito, Junio 2019

ii

DERECHOS DE AUTOR

Yo, ROSA BEATRIZ CAIZA IMBAQUINGO, en calidad de autora y titular de los derechos morales y

patrimoniales del trabajo de titulación: CARACTERIZACIÓN PATOGÉNICA, BIOQUÍMICA

Y MOLECULAR DEL AGENTE CAUSAL DE LA PUDRICIÓN DE TALLO DEL MAÍZ,

VARIEDAD INIAP-103 Mishqui sara modalidad presencial, de conformidad con el Art.

114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD

E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita,

intransferible y exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente

académicos. Conservamos a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos

en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación

de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de

la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y

no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación

que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

_________________________________

Rosa Beatriz Caiza Imbaquingo

C.C.: 172360593

[email protected]

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR

En calidad de tutor del trabajo de Titulación, presentado por la señorita ROSA BEATRIZ CAIZA IMBAQUINGO para optar por el Grado de Ingeniera Agronoma; cuyo título es: CARACTERIZACIÓN PATOGÉNICA, BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DEL AGENTE CAUSAL DE LA PUDRICIÓN DE TALLO DEL MAÍZ, VARIEDAD INIAP-103 Mishqui sara, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe. En la ciudad de Quito, a los 21 días del mes de junio de 2019 ____________________________________ Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc. CC. 1719050682

DOCENTE-TUTOR

iv

CARACTERIZACIÓN PATOGÉNICA, BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DEL AGENTE

CAUSAL DE LA PUDRICIÓN DE TALLO DEL MAÍZ, VARIEDAD INIAP-103 Mishqui

sara

APROBADO POR:

Ing. Agr. Jorge Caicedo., M. Sc.

DIRECTOR DE TESIS

Ing. Agr. Clara Iza M. Sc.

TRIBUNAL LECTOR / EVALUADOR

Ing. Agr. Manuel Pumisacho

TRIBUNAL LECTOR / EVALUADOR

2019

v

DEDICATORIA

A:

A Dios y a la Virgen Del Quinche como una forma espiritual guiaron

cada paso de mi vida, y así pude conseguir este logro de la mejor

manera.

Lo dedico a mis queridos padres Miguel y María que con mucho

esfuerzo y ahínco supieron regalarme la dicha de continuar mis estudios

superiores, a mis queridos hermanos José, Mari, Mary Presic, Luis, Rober

y Pame que día a día me acompañaron y animaron a seguir en mi carrera

y a mi cuñada Roció y mi sobrinita Gaby que nos llenó de alegría.

En especial a mi mami María y mi hermano Luis que en este momento

se encuentra en un lugar sin dolor alguno. Mi mami linda me enseñó a

valorar cada momento único de su presencia, y mi hermano Luis que

con anhelo esperaba que culminaran mis estudios. .

vi

AGRADECIMIENTO

Agradezco a la Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario

especialmente a la Dirección De Diagnóstico Vegetal y por ende al

Laboratorio de Fitopatología, al Ing. Hernando Regalado como

responsable, al Ing. Alexander Toaza y al Ing. Jairo Guevara como

técnicos.

Agradezco a la Ing. Clara Iza y a la Ing. Nancy Nenger del Laboratorio

de Microbiología y Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrícolas.

Al Ing. Jorge Caicedo M.Sc, como tutor de mi investigación supo

darme guía e impartir sus conocimientos en cada etapa.

Al Ing. Alexander Toaza como cotutor me abrió las puertas de las

instalaciones del Laboratorio y me supo ayudar y brindarme su

confianza como técnico y amigo.

A mis amig@s Diana, Doris, Gaby, Miguel, Luis, Francisco, Mauricio y

Edison que con su amistad supimos compartir muy buenos momentos.

A mi familia que siempre me acompañó y me tuvo paciencia en mi

fase como estudiante.

vii

ÍNDICE DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1

2. REVISIÓN DE LITERATURA ........................................................................................................ 4

2.1 Maíz ................................................................................................................................... 4

2.1.1. Importancia del cultivo de maíz en el Ecuador .......................................................... 4

2.1.2. Origen y distribución geográfica ................................................................................ 4

2.1.3. Descripción botánica ................................................................................................. 4

2.1.4. Descripción de la variedad INIAP 103-Mishqui sara .................................................. 4

2.2. Principales plagas del cultivo de maíz................................................................................ 5

2.2.1. Spodoptera frugiperda............................................................................................... 5

2.2.2. Helicoverpa zea ......................................................................................................... 6

2.2.3. Exserohilum turcicum Pass......................................................................................... 7

2.2.4. Pantoea agglomerans (sin. Erwinia herbicola) .......................................................... 8

2.3. Pruebas de patogenicidad (Postulados de Koch) ............................................................. 12

2.4. Escala de McFarland usada en pruebas de patogenicidad .............................................. 12

3. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 14

3.1. Características del sitio experimental .............................................................................. 14

3.1.1. Ubicación geográfica ............................................................................................... 14

3.1.2. Condiciones climáticas............................................................................................. 14

3.2. MATERIALES .................................................................................................................... 14

3.2.1. Materiales de campo ............................................................................................... 14

3.2.2. Materiales de laboratorio ........................................................................................ 14

3.2.3. Equipos de laboratorio ............................................................................................ 15

3.2.4. Materiales de invernadero ...................................................................................... 15

3.3. MÉTODOS........................................................................................................................ 15

3.3.1. Estudios preliminares .............................................................................................. 15

3.3.1.3. Conservación de la bacteria ................................................................................. 17

3.3.1.4. Reactivación de la bacteria .................................................................................. 17

3.3.2. Pruebas de patogenicidad ....................................................................................... 18

Realización de la escala McFarland: ........................................................................................ 19

3.3.3. Evaluación de plantas inoculadas ............................................................................ 21

3.3.4. Re-aislamiento bacteriano ....................................................................................... 22

3.3.5. Identificación con BIOLOG ....................................................................................... 22

3.3.6. Capacidad enzimática .............................................................................................. 23

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................................... 26

viii

4.1. Aislamiento primario y purificación ...................................................................................... 26

4.2. Identificación bioquímica de Pantoea agglomerans ....................................................... 26

4.2.1. Características bioquímicas ..................................................................................... 27

4.3. Identificación bioquímica en BIOLOG .............................................................................. 27

4.4. Identificación molecular de la bacteria............................................................................ 28

Análisis Blast (Basic Local Alignment Search Tool) .................................................................. 29

Análisis filogenético ................................................................................................................. 29

4.5. Pruebas de patogenicidad ............................................................................................... 31

4.5.1. Germinación y viabilidad de las semillas de maíz .................................................... 31

4.3.4. Re-aislamiento bacteriano ....................................................................................... 34

4.3.5. Actividad enzimática ................................................................................................ 35

5. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 37

6. RECOMENDACIONES............................................................................................................... 38

7. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 39

8. ANEXOS ................................................................................................................................... 45

9. FOTOGRAFÍAS ......................................................................................................................... 64

ix

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXOS PAGS

1 Reacciones de las pruebas bioquímicas realizadas a la cepa Pantoea

agglomerans………………………………………………………………………………………….

45

2 Elaboración de la recta de calibración de la Escala Mcfarland……………….. 50

3 Gráfica de la recta de calibración de la Escala de Mcfarland usada para

cada inoculación…………………………………………………………………………………….

51

4 Turbidez para cada inoculación con los tubos 3 y 4……………………………….. 51

5 Concentración y pureza del ADN de las muestras Pantoea agglomerans. 52

6 Prueba bioquímica de identificación con Biolog para cepas originales de

Pantoea agglomerans 1…………………………………………………………………………

53

7 Prueba bioquímica de identificación con Biolog para cepas originales de

Pantoea agglomerans 2………………………………………………………………………….

54

8 Informe de análisis de semillas de la Variedad INIAP-103 Mishqui sara…. 55

9 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el

sistema Biolog para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla………….

56

10 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el

sistema Biolog para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla……………

57

11 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema

Biolog para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla………………………………..

58


Biolog para cepas re aisladas de la inoculación II……………………………………………...

59


Biolog para cepas re aisladas de la inoculación III………………………………………….

60


Biolog para cepas re aisladas de la inoculación IV…………………………………………

61


Biolog para cepas re aisladas de la inoculación V………………………………………….

62

16 Pureza y calidad de ADN de la muestra en estudio (Pantoea

agglomerans)…………………………………………………………………………………………

63

x

ÍNDICE DE CUADROS

CUADRO PAGS

1 Características agronómicas y morfológicas de la variedad INIAP 103-Mishqui sara…………………………………………………………………………………………

5

2 Concentración estimada de bacterias (células)/ml usadas como referencia en esta investigación……………………………………………………………

19

3 Primer usados para la identificación bacteriana en esta investigación…..

24

4 Pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de Pantoea agglomerans…………………………………………………………………………………………

27

5 Resultados del análisis de identificación mediante el sistema BIOLOG….

28

6 Porcentaje de semillas germinadas usadas para las pruebas de patogenicidad………………………………………………………………………………………

31

7 Porcentaje de semillas de maíz viables………………………………………………...

31

8 Probabilidad de acierto mediante el sistema de identificación bioquímica BIOLOG………………………………………………………………………………

35

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA PAGS 1 Síntomas en la hoja de maíz…………………………………………………………………………….. 7

2 Pudrición del tallo……………………………………………………………………………………………. 9

3 Marchitez del cogollo………………………………………………………………………………………. 9

4 Escala de Mcfarland para determinar densidad bacteriana……………………………… 13

5 A) Lesión temprana B) Cámara húmeda con avance de la pudrición………………… 16

6 A) Recolección de tallos en campo; B) Muestras de maíz llevadas al

laboratorio……………………………………………………………………………………………………….

16

7 Método de inoculación de la bacteria en la semilla…………………………………………. 20

8 Método de inoculación de la bacteria al tallo………………………………………………….. 21

9 A) Manchas acuosas B) Desprendimiento de las hojas…………………………………….. 22

10 A) Manchas acuosas B) Desprendimiento de las hojas…………………………………….. 22

11 Pasos para la identificación bioquímica con el sistema BIOLOG……………………….. 23

12 A) Marchitamiento de maíz observado en campo. B y C) Pudrición bacteriana

de tallo……………………………………………………………………………………………………………..

26

13 Colonias bacterianas con pigmentación amarilla en medio AN………………………… 26

14 Vista microscópica (100X) de Pantoea agglomerans........................................... 27

15 Perfil de amplificación de Pantoea agglomerans obtenidos de la secuencia

RNAr 16S; donde; 1 es el marcador de peso molecular, 2 es el control positivo,

3 es el aislamiento inicial FP-19-0071 AI, 4 es el aislamiento postulados FP-19-

0071 POST, y 5 es el control negativo del gel de agarosa (agua)……………………….

29

16 Árbol filogenético derivado de las secuencias del gen 16S-RNAr, construido

mediante el algoritmo “Maximun Likelihood” diseñado para la especie Pantoea

agglomerans. Los codones estuvieron basados en el alineamiento MUSCLE del

programa MEGA 10.0.5. Los valores de bootstrap con más de 50 % son fiables,

están mostrados frente a cada rama del árbol. Los números de accesiones de

referencia están indicadas entre paréntesis. Los puntos negros indican las

secuencias de los aislamientos estudiados en esta investigación……………………………

30

17 A) Plántula con sintomatología de pudrición bacteriana. B) Plántula extraída

para prueba de identificación BIOLOG; C) Testigos sin inoculación…………………..

32

18 Pudrición bacteriana en la panoja después de 60 días de inoculación……………… 32

19 A) Hojas con presencia de marchitamiento bacteriano; B) Tallo con presencia

de pudrición bacteriana; C) Manchas acuosas en plantas inoculadas……………….

33

20 Avance de la enfermedad manchas acuosas en 20 días después de la

inoculación……………………………………………………………………………………………………….

33

21 Colonias amarillas obtenidas en caja Petri de re aislamientos en AN……………….. 34

22 A) Testigo inoculado con agua (8 días después de la inoculación); B) Tubérculo

inoculado con P. agglomerans (8 días después de la inoculación)…………………….

35

23 A) y B) Segmentos de cebolla inoculada con P. agglomerans; C) Testigo absoluto

inoculado con agua destilada……………………………………………………………

36

xii

ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS

FOTOGRAFÍA PAGS 1 Tallos obtenidos con la sintomatología de Pantoea agglomerans en diferentes

Parroquias………………………………………………………………………………………………………...

64

2 Microplaca de Biolog usada en la prueba bioquímica……………………………………….. 64

3 Semillas de maíz Variedad Iniap-103 Mishqui sara……………………………………………. 64

4 Prueba de germinación y desarrollo radicular a los 14 días………………………………. 65

5 Semillas dañadas en la pruebas de germinación………………………………………………. 65

6 A. Semilla teñida todo el embrión viable. B. Semilla no viable………………………….. 65

7 Semillas viables y no viables variedad INIAP-103 Mishqui sara…………………………. 66

8 Reactivos en la escala de Mcfarland…………………………………………………………………. 66

9 Espectrofotómetro…………………………………………………………………………………………… 66

10 Cepas para inoculación…………………………………………………………………………………….. 66

11 Remojo de las semillas de maíz previo a la siembra………………………………………….. 66

12 A. Plántulas germinadas e inoculadas……………………………………………………………… 67

13 A. Plantas de la II inoculación B. Tallo extraído de plantas inoculadas………………. 67

14 Microplacas de Biolog realizadas al tallo II inoculación…………………………………….. 67

15 A. Plantas con síntomas, y B. Tallo extraído de la III inoculación………………………. 68

16 A. Plantas con síntomas, y B. Tallo extraído de la IV inoculación………………………. 68

17 A. Plantas con síntomas, y B. Tallo extraído de la V inoculación……………………….. 69

18 Microplacas de Biolog, inoculación IV y V…………………………………………………………. 69

19 A) Muestras conservadas en tubos effendort B) Caja para conservación de

muestras C) Ultracongelador (-80°C)……………………………………………………………….

70

xiii

Caracterización patogénica, bioquímica y molecular del agente causal de la pudrición de tallo del maíz, variedad Iniap-103 Mishqui sara

Autora: Caiza Imbaquingo Rosa Beatriz

Tutor: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David M.Sc.

RESUMEN

Los métodos de identificación de microrganismos fitopatógenos en cultivos de importancia

económica, constituyen una de las principales herramientas para solucionar problemas fitosanitarios

que afectan la producción de los mismos. Recientemente, el cultivo de maíz en el Ecuador se ha visto

afectado por microrganismos bacterianos que están mermando su producción y calidad; por lo que

esta investigación se planteó caracterizar patogénica, bioquímica y molecularmente al agente causal

de la pudrición de tallo del maíz, variedad INIAP-103 Mishqui sara en la provincia de Pichincha. En base

a los resultados bioquímicos (Biolog) y moleculares de los aislados bacterianos obtenidos de cuatro

localidades de la provincia de Pichincha, se identificó a Pantoea agglomerans como la bacteria

asociada a la pudrición de tallo y hojas del maíz. Adicionalmente, las pruebas de patogenicidad en maíz

bajo invernadero confirmaron que P. agglomerans es el agente causal de la enfermedad antes

mencionada; además, para nuestro conocimiento este es el primer reporte de P. agglomerans como

una bacteria fitopatógena de maíz en Pichincha-Ecuador.

PALABRAS CLAVE: PATOGENICIDAD, SISTEMA BIOLOG, 16S RNAr, Pantoea agglomerans, ARBOL

FILOGENÉTICO.

xiv

Pathogenic, biochemical and molecular characterization of the causal agent of the stalk rot of maize, variety Iniap-103 Mishqui sara

Autora: Caiza Imbaquingo Rosa Beatriz

Tutor: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David M.Sc.

ABSTRACT

The identification methods of phytopathogenic microorganisms in important economic crops,

constitute one of the main tools to solve phytosanitary problems that affect the production of these

crops. Recently, the corn in Ecuador has been affected by bacterial microorganisms that are

diminishing its production and quality; therefore, this research was proposed to characterize

biochemical, molecular and pathogenically, the causal agent of the stalk rot of maize, variety INIAP-

103 Mishqui sara, in the Pichincha province. Based on the biochemical (Biolog) and molecular results

of the bacterial isolates obtained from four localities in the Pichincha province, Pantoea agglomerans

was identified as the bacterium associated with stalk and leaf rot of maize of corn. Additionally,

pathogenicity tests in corn under greenhouse conditions confirmed that P. agglomerans is the causal

agent of the disease above mentioned; in addition, for our knowledge this is the first report of P.

agglomerans as a phytopathogenic bacteria of corn in Pichincha-Ecuador.

KEYWORDS: PATHOGENICITY, BIOLOGY SYSTEM, 16S RNAr, Pantoea agglomerans, PHILOGENETIC

TREE.

xv

CERTIFICACIÓN

En calidad de tutor del trabajo de graduación cuyo título es “Caracterización patogénica,

bioquímica y molecular del agente causal de la pudrición de tallo del maíz, variedad Iniap-103

Mishqui sara ”, presentado por la señorita Rosa Beatriz Caiza Imbaquingo, previo a la obtención del

Título de Ingeniero Agrónoma, certifico haber recibido y corregido el ABSTRACT para el trabajo de

grado, aprobado el mismo, después de realizadas las observaciones por los miembros del tribunal, por

lo que apruebo, para el empastado final.

____________________________________ Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc. CC. 1719050682 DOCENTE-TUTOR

1

1 INTRODUCCIÓN El maíz es el segundo cultivo más importante del mundo por su producción y demanda,

considerado como el primer cereal en rendimiento de grano por hectárea y en segundo lugar

después del trigo en la producción total. Los ambientes en los que se cultiva esta planta son

bastante amplios que van desde los 58° de latitud norte en Canadá y Rusia, y hasta los 40° de latitud

sur en Argentina y Chile. Su importancia económica se basa principalmente debido a los usos que

se le da como alimento humano, alimento para ganado en forraje o balanceado, siendo la base de

muchos productos industriales y materia prima para biocombustibles (FAO, 2009). El trigo junto al

maíz son los cereales más consumidos no solo en nuestro país sino en todo el mundo; además,

este cereal es rico en vitaminas del grupo B (B1 y B3), con minerales como fósforo y magnesio

(Pérez, 2018), y alto contenido de hidratos de carbono que están contenidos en el almidón del

grano considerado como alimento energético; sin embargo, el contenido de proteínas es limitado

y se encuentra en forma de zeína, pobre en lisina y triptófano (Ministerio Cultura y Patrimonio,

2016).

El cultivo de maíz en el Ecuador se encuentra distribuido en todo el país, por lo que en la sierra se

reconocen tres grandes zonas de producción: norte, que comprende las áreas maiceras de Carchi,

Imbabura, Pichincha; centro, conformada por las provincias de Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo

y Bolívar; y la zona sur que integra las provincias de Azuay, Cañar y Loja y en las provincias

costaneras de Manabí, Esmeraldas y Guayas principalmente y en la región amazónica la provincia

de Pastaza (Coral, 2017). El MAGAP (2017), afirma que desde el año 2000 al 2012, la producción

nacional de maíz en grano seco y limpio en el Ecuador, aumentó un 188 % debido principalmente

al uso de semillas de alto rendimiento, al incremento en los precios internacionales y a su alta

demanda por parte de la agroindustria.

De la misma forma, la generación de variedades mejoradas a partir de variedades nativas está a

cargo de entidades gubernamentales como INIAP1, o por entidades privadas como ECUAQUÍMICA,

AGRIPAC, PRONACA/INDIA, INTEROC, siendo estas generadoras de variedades que aumentan la

producción y el rendimiento de maíz en el país. Algunas de las variedades creadas para la región

costa por INIAP son H-551, H-601, H-553, H-602 con rendimientos de hasta 100 qq/ha en promedio

(Andrade, 2014), y para la región sierra variedades con granos blancos, blancos harinosos, y

variedades mejoradas como INIAP – 103 Mishqui sara entre otros (Yánez et al., 2013).

La variedad mejorada como INIAP-103 Mishqui sara fue liberada en Azuay y Loja, teniendo grandes

resultados en su adaptación y con excelentes características agronómicas, (INIAP Estación

Experimental del Austro, 2011). Esta variedad con alto rendimiento y alta calidad proteínica (ACP)

ofrece principalmente dos aminoácidos esenciales como lisina y triptófano en el que es deficiente

el maíz, siendo esto algo novedoso y creado con un fin para combatir la desnutrición humana

(Ministerio Cultura y Patrimonio, 2016). Adicionalmente, esta variedad muestra un grado de

resistencia para enfermedades como el tizón y la roya de la hoja.

En los últimos años, las plagas que afectan este cultivo se han incrementado considerablemente

debido a que las siembras se realizan en todo el año, además del uso intensivo de productos

químicos (insecticidas y fungicidas), que puede muchas veces causar problemas de resistencia

(Yánez et al., 2013). En Ecuador en el año 2000 se produjeron 423 mil toneladas y para el 2012 se

incrementó en 1.22 millones de toneladas, registrando una tasa de crecimiento promedio anual de

12.06 % (SINAGAP, 2013), existiendo una reducción de 54.697 hectáreas en el área sembrada.

1 Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias

2

Según los datos obtenidos, la principal causa de la reducción en el rendimiento del cultivo de maíz

fue entre otras, la presencia de plagas insectiles, donde las principales son el gusano cogollero

(Spodoptera frugiperda) y gusano elotero (Helicoverpa zea), y enfermedades como el tizón de la

hoja (Exserohilum turcicum), roya (Puccinia sorghi), y la pudrición de tallo (Pantoea agglomerans)

enfermedad recientemente identificada en México (Mezzalama, 2016).

Particularmente Pantoea agglomerans (sinónimo Erwinia herbicola), es una bacteria fitopatógena

del maíz reportada en todo el mundo, desde América del Norte hasta América del Sur, África, Asia

y Europa; sin embargo, los síntomas asociados a este tipo de pudrición están escasamente descritos

en la literatura. La presencia de esta enfermedad bacteriana se ha reportado en microambientes

significativamente diferentes en términos de temperatura y humedad con respecto a otras especies

de plantas; por este motivo existe una preocupación mundial por la pérdida de cultivos a causa de

esta bacteria fitopatógena que durante muchos años no fue considerada como tal (Ruíz et al.,

2018). La temperatura y humedad del suelo cumplen rol importante para la epidemiología de la

bacteria, haciendo que la misma sea persistente en varios cultivos, a pesar de que su ciclo de vida

es relativamente corto (Oyarzún et al., 2002).

El rango de hospedantes de P. agglomerans engloba una gran cantidad de cultivos como, banano

(Musa sp.), cebolla (Allium cepa), algodón (Gossypium herbaceum), arroz (Oriza sativa), piña

(Ananas comosus); palma aceitera (Elaeis guineensis) y maíz (Zea mays), además de algunas plantas

ornamentales como gloxinia (Gloxinia maculata) y gypsophila (Gypsophila paniculata) (plantwise,

2018). En Ecuador, este género bacteriano se ha reportado en palma aceitera (Elaeis guineensis)

asociado a la pudrición de cogollo observada en San Lorenzo, Esmeraldas (Vega, 2014),

presentándose como la segunda especie de bacterias con mayor cantidad de colonias a nivel in

vitro.

Los problemas con la identificación de agentes causales de enfermedades en plantas, han permitido

desarrollar métodos de identificación comunes, y así mismo formas de identificación más

específicas usando tecnologías de vanguardia, para hacer de esta una herramienta útil en la

creación de sistemas de control y manejo más eficientes. Con respecto a Pantoea agglomerans,

entre los métodos más específicos y comunes de identificación, están la tinción de Gram, y la

especificidad de género para la prueba del indol (Jiménez et al., 2007).

La prueba bioquímica de mayor precisión es el sistema de identificación BIOLOG, capaz de

identificar una bacteria hasta el nivel de género y especie; para ello, se utilizan 96 pocillos que

contienen una base de datos de más de 2900 especies de bacterias anaerobias, aerobias, levaduras

y hongos filamentosos. El sistema está basado en la utilización, oxidación, y la producción de

Nicotinamida Adenindinucleótido reducido (NADH), de sustratos de fuente de carbono cuya

utilización se mide por el colorante redox violeta de tetrazolio de bastante uso en la biología,

diseñado para identificación de bacterias ambientales y de alimentos pero menos relacionada con

problemas médicos y de gran utilidad en microbiología clínica (Gobernado & López-Hontangas,

2003).

Adicionalmente, la identificación genética de bacterias ofrece una alta especificidad en la

identificación de género y especie de cualquier bacteria cultivable, donde las herramientas más

usadas son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando la secuencia del gen 16S ARNr de

la bacteria usando para ello cebadores específicos que permiten la amplificación y la detección a

nivel de especie del microorganismo (Gobernado & López-Hontangas, 2003); dilucidando la

identidad de cualquier agente causal de enfermedades.

3

Con esta premisa, el presente estudio tuvo como objetivo caracterizar patogénica, bioquímica y

molecularmente la bacteria causante de pudrición del tallo del maíz en la variedad INIAP-103

Mishqui sara. Para el efecto, se usaron pruebas bioquímicas y del BIOLOG para comprobar la

presencia inicial de la bacteria Pantoea agglomerans en plantas afectadas con pudrición de tallo,

además se realizaron los postulados de Koch para comprobar su patogenicidad y virulencia, y por

último se caracterizó molecularmente mediante el uso de cebadores bacterianos específicos su

identidad genética. Para nuestro entendimiento, esta investigación sugiere por primera vez en

nuestro país, que Pantoea agglomerans es el agente causal de la pudrición de tallo del maíz.

4

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Maíz

2.1.1. Importancia del cultivo de maíz en el Ecuador

Para el año 2015, el cultivo de maíz representó un total de superficie sembrada de 7,086 ha

(MAGAP, 2017), donde los incrementos de la superficie cosechada se estimaron debido a su uso

para consumo humano, que representó el 14,2 % con una tasa promedio anual del 1,7 %. Además,

otro uso importante del maíz es para biocombustibles con un 15,2 %, mostrándose un incremento

del consumo en el país de 3,9 % en la demanda y en volumen alcanzaría 226 millones de toneladas

(FIRA, 2016).

El garantizar la soberanía alimentaria de la población hace posible la creación o mejoramiento de

variedades y así la adaptación en diferentes zonas como la variedad ECU-17-559 o actualmente

INIAP 103-Mishqui sara, es una variedad precoz que contiene altos niveles de proteína debido a la

presencia de un mayor contenido de triptófano y lisina (aminoácidos esenciales en la proteína), con

un cosecha estimada un mes antes de lo previsto en comparación de otras variedades (Jimbo,

2010).

2.1.2. Origen y distribución geográfica

El maíz apareció entre los años 8000 y 600 AC en Mesoamérica (México y Guatemala),

probablemente a lo largo del acantilado occidental de México Central o del Sur, a 500 Km de la

Ciudad de México, razón por la cual es el centro primario de diversidad genética y la zona Andina

el sector secundario, donde el cultivo ha tenido una rápida evolución (Acosta, 2009).

2.1.3. Descripción botánica

El maíz (Zea mays L.), es una gramínea anual, robusta, de crecimiento determinado, de 1 a 5 m de

altura, un solo tallo dominante, sus hojas alternas son pubescentes en la parte superior y glabra

(sin pelos o bellos, hojas lisas) en la parte inferior (INTA, 2010).

La constitución de la planta de maíz es por una raíz fibrosa, un tallo con entrenudos en forma de

caña, con hojas lanceoladas dispuestos y encajados al tallo, esta contiene una panoja que contiene

la flor masculina y la femenina, la flor femenina que se encuentra a un nivel inferior y la que da

origen a la mazorca (Eglenis, 2011).

2.1.4. Descripción de la variedad INIAP 103-Mishqui sara

En Ecuador, en el año 2006 se introdujo la variedad de maíz de grano blanco harinoso con alta

calidad de proteína (ACP) Aychazara 102, que es proveniente del Centro de Fitoecogenética

Pairumani de Bolivia (Eguez & Pintado , 2013). Para la creación de la variedad INIAP 103-Mishqui

sara, se realizó un ciclo de selección masal en el año 2006 y dos ciclos de selección familiar por

medios hermanos durante los años 2007 y 2008, las familias fueron seleccionadas para el programa

de Maíz de la Estación Experimental del Austro del INIAP por caracteres agronómicos como sanidad,

buena cobertura de mazorca y rendimiento sobre las 8 t/h (Egues & Yánez, 2008).

5

Cuadro 1. Características agronómicas y morfológicas de la variedad INIAP 103-Mishqui sara:

Características Rango Promedio

Días a floración femenina 64-80 72

Altura de la planta (m) 2,30-2,70 2,50

Altura de mazorca (m) 1,0-1,5 1,25

Porcentaje de mazorcas con mala cobertura 0-2 1

Días a la cosecha en choclo 100-120 110

Días a la cosecha en seco 230-270 250

Número de hileras de grano por mazorca 12-16 14

Rendimiento experimental en grano seco (t/ha) 4,5-10,9 7,7

Porcentaje de grano 76-80 78

Rendimiento comercial de choclos (sacos/ha) 300-400 350

Color de grano Blanco

Textura Harinoso

Fuente: Ficha técnica INIAP, 2013

El piso climático para esta variedad está mejor adaptado entre los 1700 a 2650 msnm, en zonas

como Guayas, Santa Elena, a 30 msnm hasta los 2650 msnm en Sigsig -Azuay (Eguez & Pintado ,

2013).

2.2. Principales plagas del cultivo de maíz

2.2.1. Spodoptera frugiperda

Importancia

La principal pérdida como plaga registrada en 2017 en el sector maicero del Ecuador, es causada

por el gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) mostrándose una afectación de 82 281 hectáreas

(Reyes & Paucar , 2017).

Según Ángulo (2000), este insecto está clasificado taxonómicamente de la siguiente manera:

Reino Animalia Filo Arthropoda Clase Insecta Orden Lepidóptera Suborden Glossata Infraorden Heteroneura Familia Noctuidae Género Spodoptera Nombre científico Spodoptera frugiperda Nombre común Gusano cogollero

Descripción

Es una plaga clave en las gramíneas como masticador del tejido vegetal, donde la larva posee un

aparato bucal raspador-masticador durante los tres primeros estadios, alimentándose de la

epidermis de las hojas (Lezaun, 2014). Esta larva se introduce en el cogollo causando daños a las

hojas tiernas que luego resulta agujeros de diferentes tamaños y forma irregular. Su ciclo de vida

es de un mes y puede tener hasta 12 generaciones por año (Alvarez & Sánchez, 2003). El gusano

cogollero es la larva de la mariposa nocturna Spodoptera frugiperda que ataca principalmente al

maíz (Angulo, 2000).

6

Métodos de control: la forma de controlar es el uso de labranza cero, ayudando a reducir las

poblaciones. El riego por aspersión en maíz y frijol reduce las larvas de primero y segundo estadio

(Alvarez & Sánchez, 2003). Además, el uso de nucleopoliedrovirus (Baculovirus) compuesto por una

proteína insecticida que engloba a las partículas infecciosas denominadas virones. La larva come la

hoja contaminada, ingiere el virus que cuando llega al tubo digestivo del insecto, se disuelve la

proteína que rodea a viriones y estos quedan libres, se unen a las células epiteliales y entran al

núcleo de ellas mismas, donde se multiplican y en cuestión de 3 o 4 días quedan convertidas en un

charco y así se liberan partículas virales que contaminaran otras hojas (Santos, 2008). Además, la

bacteria Bacillus thuringiensis, cuando esporula sintetiza unos cristales proteicos llamados delta-

endotoxinas a los cuales debe su actividad insecticida (Royano, 2009).

2.2.2. Helicoverpa zea

Una plaga conocida es también el gusano elotero causando graves pérdidas en provincias de

Guayas, Los Ríos, Santa Elena, y cantones como Santa Ana, Pajan y Chone de Manabí, esta es

conocida como una polilla nocturna (Reyes & Paucar , 2017).

Según Boddie (1850), este insecto está clasificado taxonómicamente de la siguiente manera:

Reino Animalia Filo Arthropoda Clase Insecta Orden Lepidóptera Suborden Glossata Infraorden Heteroneura Familia Noctuidae Género Helicoverpa Nombre científico Helicoverpa zea Nombre común Polilla nocturna

Descripción

El gusano elotero es una especie polífaga, donde el adulto es como una palomilla de color amarillo

rojizo con una mancha circular cerca del centro de las alas anteriores (Koppert, 2018). La

emergencia de las larvas se estima alrededor de cuatro días, y se presentan seis instares larvales

con una duración de 2 a 3 semanas. El daño lo ocasiona durante su estado larvario especialmente

en los granos de maíz lechoso de la mazorca desde la punta hasta la base (INTAGRI, 2017).

Métodos de control: el uso de herramientas como el rastreo y barbecho del terreno para exponer

las pupas a la intemperie (Morales, 2017). Mediante aceite comestible que se coloca en la flor

femenina, se recomienda aplicar de 3 a 4 litros por hectárea, el aceite mata a la larva por asfixia

debido a que el aceite tapona los espiráculos de la larva, el tiempo en el que muere la larva es de

30 segundos aproximadamente (Peñaherrera , 2011). Trichogramma sp. es un himenóptero

parasitoide que actúa como controlador biológico; parasitando a los huevos de los adultos haciendo

liberaciones sucesivas (una semanal) para así favorecer el establecimiento del parasitoide en el

campo (Moreno & Peréz , 2002). El ciclo es de 8 días, después de parasitar al huevo esta nace en 24

horas, luego emerge una larva y que en 5 días se convertirá en pupa, tan solo en dos días se

convertirá en adulto y habría cumplido su ciclo (Bertorelli & Rengifo, 2008).

7

2.2.3. Exserohilum turcicum Pass

El tizón foliar del maíz es una de las enfermedades más importantes del cultivo, esta enfermedad

provoca pérdidas del 91 % (Ramirez , 2014).

Según Leonard & Suggs (1974), este hongo está clasificado taxonómicamente de la siguiente

manera:

Reino Fungi División Ascomycota Clase Dothideomycetes Sub-clase Pleosporomycetidae Orden Pleosporales Familia Pleosporaceae Género Exserohilum Nombre científico Exserohilum turcicum Nombre común Tizón foliar

Síntomas

Aparición de manchas pequeñas, de forma ovalada y acuosa que se producen en las hojas (Ver

figura 1), esto produce inmediatamente zonas necróticas alargadas. Se encuentra distribuido en

zonas con mucha humedad y temperaturas de 17 a 22 °C durante el periodo de crecimiento

(CIMMYT, 2004).

Figura 1: Síntomas en la hoja de maíz

Fuente: Panorama, 2018 http://panorama-agro.com/?p=801

Dispersión

Como este es un hongo, la forma de dispersión es mediante las esporas por el golpe de agua de

lluvia y el aire, en la que el viento lleva las esporas hacia grandes distancias. La presencia de mucho

roció, lloviznas fuertes, con alta humedad y temperaturas templadas son condiciones que

favorecen el desarrollo de la enfermedad (Pioneer, 2014).

Métodos de Control: La rotación de cultivos, la eliminación de residuos de cosechas previos a la

siembra, la remoción del terreno que ayuda a la descomposición (Pioneer, 2014). La selección de

híbridos resistentes, tipo de labranza en la presencia de la enfermedad. Además, sembrar en fechas

indicadas para evitar las épocas de lluvias ya que este es fuente de dispersión (Pioneer, 2014). Las

mezclas de triazoles + estrobilurinas son eficientes en el control llegando al punto de disminuir las

pérdidas de rendimiento causadas por tizón foliar (Couretot et al., 2013). El modo de acción actúa

inhibiendo la biosíntesis de ergosterol de la membrana celular, esto hace que evite el desarrollo del

patógeno (Reyes, 2016).

8

2.2.4. Pantoea agglomerans (sin. Erwinia herbicola)

El género Pantoea fue descrito recientemente dentro de la familia Enterobacteriaceae; su génesis

fue el resultado de problemas taxonómicos asociados con miembros del complejo Enterobacter

agglomerans que se compone de siete especies: P. agglomerans, P. dispersa, P. stewartii, P.

punctata, P.citrea, P. terrea y P. ananas (Pérez-Terrón., 2008). El género Pantoea cuenta con 2

genes de patogenicidad y virulencia, el cps es el requerido para la producción del exopolisacárido

(EPS) y el hrp de secreción tipo III útil para la patogenicidad y en las lesiones en las hojas (Cha et al.,

1998).

Origen y distribución

En el año 2004-2005 al Noreste de Sud África la afectación a cultivos comerciales de maíz (Zea mays)

fue de 10 al 70 % por el patógeno Pantoea agglomerans. En Brasil se incluyen reportes en el taro

chino en 2007, en Estados Unidos en cebolla en 2006, y Sudáfrica en 1981 y el mijo perla en

Zimbawe en 1997 (Morales-Valenzuela et al., 2007). El principal hospedero es el maíz (Zea mays),

sin embargo, el maíz dulce es más susceptible colonizando al tejido vascular, encontrándose

también en raíces, tallos, hojas, vainas, mazorcas, cáscaras y granos (Pérez-Terrón., 2008).

Según Ewing & Fife (1972), esta bacteria está clasificada taxonómicamente de la siguiente manera:

Síntomas

Los síntomas iniciales se presentan como manchas acuosas dispersas entre blanco y café claro en

las hojas en su interior, presentándose contracciones y ondulaciones del tejido en el área afectada

con estrías cloróticas (Ruíz et al., 2018). La lesión foliar tiende a fusionarse y provocando un

secamiento y marchitamiento, la infección avanza desde las hojas hasta el tallo de la planta

provocando una coloración amarillenta-café claro. Las infecciones secundarias pudren el tejido

(Figura 2) y generan un olor característico de la enfermedad.

La presencia de manchas marrones en el interior del tallo, la ruptura del primer nudo interno con

pardeamiento interno del tallo en dirección al ápice evitando el desarrollo de la fructificación

(Goszczynska et al., 2007). Por otro lado, la presencia de estrías cloróticas son algunos de los

síntomas que aparecen en la planta, en estados avanzados necrosis y aflojamiento de la hoja.

Reino Bacteria Filo Proteobacteria Clase Gammaproteobacteria Orden Enterobacteriales Familia Enterobacteriaceae Género Pantoea Especie Pantoea agglomerans Nombre común Pudrición del tallo

9

Figura 2: Pudrición del tallo de maíz

Fuente: Caiza R, 2019

Además, esta bacteria es considerada como fitopatógena, debido a que existen estudios donde se

ha determinado como una bacteria asociada a la formación de síntomas iniciales de pudrición de

las inflorescencias y del cogollo, seguido de un secado y muerte repentina (Gijón, 2009) (Figura 3).

Figura 3: Marchitez del cogollo de maíz

Fuente: Gijón, 2009

Epidemiología

Pantoea agglomerans requiere temperaturas aproximadas de 25 °C y con la humedad relativa de

95 % para que la bacteria pueda progresar y continuar. También la infección se beneficia por las

lluvias y por sistemas de riego por aspersión (Gijón, 2009).

Dispersión

Pantoea agglomerans se transmite desde semilla y sobrevive en diferentes cultivos hospederos

como maíz, algodón, melón, piña, arroz, azúcar y caña. Además, puede sobrevivir en la maleza y

restos de cosecha causando infecciones recurrentes en cultivos posteriores. Por otro lado, las

salpicaduras de agua son la principal fuente de dispersión hacia otros lotes, que muchas veces son

favorecidas por fuertes corrientes de viento (Seminis, 2018).

10

2.2.4.1. Manejo integrado de la pudrición del tallo del maíz

Control cultural y métodos sanitarios

Para controlar la dispersión de la bacteria se recomienda el uso de semilla sana, controlar la maleza,

para así evitar hospederos como los trips, que pueden diseminar la bacteria. Es vital el uso de riego

por goteo evitando trabajar cuando el follaje este mojado (Seminis, 2018), además, cultivar con una

profundidad considerada para que los restos se logren descomponer, también hacer rotación de

cultivos y evitar cultivos hospederos de la enfermedad.

Control biológico

El control se realiza por tres sistemas vivos: el patógeno, el agente de control biológico y el huésped

que interactúan mutuamente, consiste en utilizar microorganismos de bajo impacto ambiental

capaces de controlar el crecimiento del patógeno, con base a principios de competencia,

antagonismo y/ o inducción de resistencia. Existen dos cepas de Pseudomonas fluorecens PfA506 y

Erwinia herbicola EhC9-1s resistente a la estreptomicina, presentándose mejores resultados con la

combinación de las dos cepas (Ordax, 2008).

Control químico

Los tratamientos químicos encaminados principalmente a disminuir la supervivencia del inóculo

bacteriano o inhibir su multiplicación, son productos cúpricos del que se han realizado diversas

formulaciones químicas, que tienen como ingrediente activo el catión de cobre solubilizado. Los

exudados bacterianos contienen compuestos capaces de solubilizar el cobre, causando la muerte

celular o al menos la inhibición de algunas actividades biológicas en la bacteria, al momento de usar

este método hay riesgos de causar fitotoxicidad dañando partes de las plantas y crear resistencia a

dicho compuesto (Ordax, 2008).

Para la prevención de la enfermedad se podría evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados,

y el uso de bactericidas con base de cobre (Cu) aplicado cuando hay riesgo moderado de presencia

de la enfermedad.

2.2.4.2. Métodos comunes de caracterización de Pantoea agglomerans

Morfología de colonias

La identificación morfológica de colonias de Pantoea agglomerans permite reconocer a la bacteria

por la presencia de pigmentación amarilla, y mediante microscopía óptica por su forma de bastón

no encapsulado, que produce colonias lisas y convexas. Se desarrolla bien en agar nutriente,

produce turbidez en caldo nutritivo, son Gram negativas y pertenecen a la familia

Enterobacteriaceae (Pérez-Terrón, Evaluación de la diversidad genética y bioquímica de Pantoea

sp. en maíz, 2008).

Caracterización fisiológica y bioquímica

La tinción de Gram es el primer paso para la identificación bacteriana, en 1884 fue creada por el

médico Hans Christian Gram, esta prueba permite separar a las bacterias en dos grupos, las Gram

positivas se tiñen de color violeta y las Gram negativas de color rosa (Microbitos, 2011). La tinción

de las bacterias Gram positivas se debe a la presencia de una capa gruesa de peptidoglicanos

responsable de la retención de los tintes violetas en la pared celular; pero en las bacterias Gram

negativas consta de tres estructuras y una de ella es una capa fina de peptidoglicano que es incapaz

de retener el color violeta por la decoloración con etanol durante la tinción, y además cuenta con

una capa externa de lipopolisacáridos confiriendo una carga negativa a la pared celular (Kunstmann,

2004).

11

La familia Enterobacteriaceae muestra características específicas: proliferan en medios aerobios y

anaerobios (son anaerobios facultativos) utiliza hidratos de carbono por dos vías como es la vía

oxidativa (presencia de oxígeno) o por la vía fermentativa (ausencia de oxígeno) utiliza una única

fuente de carbono como se usa en la prueba del citrato, al ser oxidativo la bacteria utiliza la enzima

catalasa para eliminar el peróxido de hidrógeno, este compuesto pertenece a la categoría de las

oxidorreductasas que catalizan la transferencia de electrones del peróxido de hidrógeno y a

menudo producen gas, estas características son necesarias para la identificación de P. agglomerans

debido a la familia a la que pertenece.

Las pruebas específicas para la identificación de P. agglomerans son la de oxidasa e indol, en la que

la prueba de oxidasa debe ser negativa (Kunstmann, 2004). Esta prueba busca la presencia de la

enzima citocromo C oxidasa, presentándose positiva (color púrpura) solo para organismos aerobios

(Coltran, 2014). La prueba del indol es específica para separar dos patovares de Erwinia herbicola

(pv. milletiae y pv. herbicola), dependiendo del resultado puede tratarse del primer o segundo

patovar (Jiménez et al., 2007). El resultado dará positivo si hay un halo de color rosado o violeta y

siendo específico para Pantoea ananatis, y el no cambio significa que es negativo y específico para

Pantoea agglomerans (Jiménez et al., 2007).

Caracterización mediante BIOLOG Gen III

Esta prueba bioquímica es un gran avance en la nueva química para óxido-reducción, que permite

la inspección de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en un mismo panel seco, mediante

microplacas de 96 pocillos, permitiendo un diagnóstico rápido y seguro (Biolink , 2011). En la

identificación de bacterias o de cualquier microorganismo se agrega una suspensión celular y el

patrón metabólico resultante o la huella dactilar generada por el microorganismo se registra y se

compara con cientos de perfiles de identificación en una base de datos de biología, la base de datos

se actualizan periódicamente para reflejar la taxonomía más reciente y las especies incorporadas

adicionales, y así ampliar las capacidades para satisfacer las crecientes necesidades al momento de

identificar agentes causales de enfermedades (Bou et al., 2011).

Caracterización mediante métodos moleculares

Los métodos moleculares están basados en la identificación o detección del genoma parcial o

completo de un organismo vivo, basándose en la interacción entre enzimas y ácidos nucleicos

(Arora, 2004). Las enzimas usadas son endonucleasas de restricción y ADN polimerasas, donde las

endonucleasas cortan secuencias especificas siendo empleadas en la técnica RFLP2 y las ADN

polimerasas catalizan la síntesis del ADN utilizadas para la amplificación de la PCR (Reacción en

Cadena de la Polimerasa).

La técnica de PCR es una de las más empleadas, a partir de una muestra de ADN, que contiene las

regiones específicas de ADN a través un ADN polimerasa y de dos cebadores que reconocen y se

unen a una región de una cadena de ADN iniciando la replicación del material genético (Arora,

2004), usando una amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN. Una de las ventajas de

la PCR es en los resultados con una amplificación más pequeña, de allí su principal ventaja

(Navarrete et al., 2014).

2 Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción

12

La secuencia del gen ARNr3 16S cuenta con ~1400 a 1500 pb, que puede ser copiado usando primers

o cebadores universales, con un tamaño ideal para proporcionar polimorfismos interespecíficos

para el análisis y así establecer medidas estadísticas validas (Germán et al., 2011). Esta información

provee una identificación bacteriana hasta el nivel de género, especie y permite establecer

relaciones filogenéticas con bacterias asociadas (Rezzonico et al., 2009).

Los primers (iniciadores) o cebadores universales más comunes para la identificación bacteriana se

los conoce como 27F (Bacteria) y 1492R (Universal); la secuencia 27F es 5´-

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´ y la secuencia 1492R es 5´- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3´, estas

son cadenas de ácidos nucleicos que ayudan como punto de partida para la replicación de ADN,

estos iniciadores contienen aproximadamente 20 bases de longitud generalmente secuencias

cortas y actuando como punto de partida con el fin de copiar la hebra molde (Miller et al., 2013).

2.3. Pruebas de patogenicidad (Postulados de Koch)

Los postulados tienen como primer eslabón recrear el ciclo de la enfermedad provocada por un

determinado patógeno. Para corroborar la presencia de una enfermedad y el agente causal en un

determinado cultivo, se debe correlacionar el brote de esta con un patógeno específico, por lo que

es preciso emplear los postulados de Koch y sus modificaciones, para determinar la etiología o

causa de la enfermedad. En esencia Koch postuló, que para comprobar que un patógeno causa

enfermedad debe demostrar que no solo están correlacionados, sino relacionados en cuanto la

causa verídica y directa de la enfermedad; esto depende de la separación del patógeno y su

reintroducción a un organismo, con la subsiguiente producción de síntomas, incluyendo la

reaparición del agente causal en el organismo enfermo (Cisneros, 2013).

El diagnóstico en caso de que sea probable que el patógeno represente la causa de la enfermedad,

pero que no existan registros anteriores que apoyen esa suposición, tendrán que considerarse los

siguientes puntos para comprobar la hipótesis de que el patógeno es la causa de esa enfermedad

(Peña & Páez, 2010).

Según Robert Koch, 1905 (Agrios, 2005):

1. El microorganismo debe encontrarse en todas las plantas con la enfermedad en cuestión y

su distribución debe corresponder a las lesiones observadas.

2. El microorganismo debe aislarse de las lesiones de la planta infectada y se debe obtener un

cultivo puro.

3. El cultivo puro inoculado en otras plantas inoculadas debe producir la enfermedad.

4. El microorganismo debe aislarse en un cultivo puro a partir de las plantas infectadas

intencionalmente.

2.4. Escala de McFarland usada en pruebas de patogenicidad

La escala de McFarland se trata de una serie numerada de 10 tubos, que se usa como patrones de

turbidez en la preparación de suspensiones de microorganismos, el patrón de 0,5 de McFarland

tiene una aplicación especial en la preparación de inóculos de bacterianos (BD, 2005). Se mezclan

soluciones de cloruro de bario al 0,048 M con ácido sulfúrico al 0,36 M con la finalidad de obtener

13

una relación entre una precipitación química y una suspensión bacteriana (Ulloa, 2015), la escala

determina la proliferación o la multiplicación de bacterias, produciendo turbidez o la opacidad en

el tubo (Figura 4).

En la inoculación de bacterias, la escala recomendada que menciona Jiménez et al. (2007) usa una

concentración de 10-8 células ml-1 usando los tubos 3 y 4 de la escala de McFarland generando una

cantidad de bacterias capaz de causar enfermedad en plantas sanas. La forma de detectar la

correcta concentración de las diluciones bacterianas es mediante un turbidímetro que mide la

turbidez y evita una inadecuada preparación del inóculo (Ulloa, 2015).

Figura 4. Escala de McFarland para determinar densidad bacteriana


0,5 1 2 3 4 5

14

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Características del sitio experimental

3.1.1. Ubicación geográfica

La identificación y caracterización de las muestras aisladas se las realizaron en el Laboratorio de

Fitopatología de La Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD), ubicados

en:

Parroquia: Tumbaco

Cantón: Quito

Provincia: Pichincha

La realización de los postulados de Koch se llevó a cabo en el Invernadero de Microbiología y

Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador, ubicados

en:

Parroquia: Tumbaco

Cantón: Quito

Provincia: Pichincha

Sector: La Morita

Altitud: 2480 msnm

Latitud: 00°13’46’’S

Longitud: 78° 22”00” O (INAMHI, 2015) .

3.1.2. Condiciones climáticas

Temperatura promedio: 15.4 °C

Precipitación mensual: 86,5 mm

3.2. MATERIALES

3.2.1. Materiales de campo

Muestras de diferentes tallos de maíz enfermos

Fundas de polietileno de 10*14 cm.

Bisturí.

Navaja.

3.2.2. Materiales de laboratorio

Asa de platino

Sacabocados

Mechero de vidrio

Erlemeyer (125 - 250 - 2000ml)

Micropipeta (100 – 1000 µl)

(Calibrado) y puntas estériles.

Vasos de precipitación (100-600

ml)

Tubos de ensayo con tapa rosca

Fundas polifán

Papel aluminio

Gradilla

Bisturí

Alcohol (96 %)

Hipoclorito de sodio (2%)

Agua destilada y esterilizada

15

Agua Tipo A1

Jeringas 5 ml

Tubos de agua peptonada (9ml)

Tubos de caldo nutritivo (5ml)

Agar nutriente (AN)

Morteros

Mondadientes

Hisopos

Cloruro de bario (BaCl2 0.048 M)

Ácido sulfúrico (H2SO4 0.36 M)

Triptona

Reactivo de Kovacs

Asa de siembra

3.2.3. Equipos de laboratorio

Cámara de flujo laminar BIOBASE

Refrigeradora MABE

Autoclave ALL AMERICAN

Agitador vórtex D LAB

Incubadora 28 ° C MEMMERT

Microscopio óptico OLYMPUS

Balanza de precisión RADWAG

Cámara fotográfica SONY

Espectrofotómetro SPECTRONIC (Calibrado)

Turbidímetro BIOLOG (Calibrado)

Centrifugadora 5804 R

Ultracongeladora So Low U85-25

Computadora LG

3.2.4. Materiales de invernadero

10 macetas plásticas (8 litros)

20 semillas de maíz INIAP 103 - Mishqui sara

22,5 lb de compost esterilizado

12 fundas plásticas de polifán

3.3. MÉTODOS

3.3.1. Estudios preliminares

A continuación, se describe lo que se realizó para la obtención, aislamiento e identificación de

la bacteria obtenida de muestras infectadas de plantas de maíz que fueron recolectadas en

campo en Tumbaco (CADET). Una vez aisladas las bacterias fue probada la patogenicidad en

cañas de maíz sanas y con un sacabocados se hizo un hoyo y se inoculo con colonias puras de las

bacterias aisladas e inmediatamente se colocaron en cámara húmeda en fundas de polifán y

llevadas a la incubadora de bacterias a 28°C (Figura 5). De esta inoculación, se realizó re-

aislamiento de la bacteria presente en la pudrición.

16

Figura 5. A) Lesión temprana B) Cámara húmeda con avance de la pudrición Fuente: Caiza R, 2019

3.3.1.1. Recolección de las muestras

En Tumbaco (CADET), Pifo, Puembo, y Checa, se seleccionaron plantas con los síntomas de

pudrición del tallo de maíz, que presentaron un olor representativo de la presencia de la

bacteria. Se recolectaron tallos de plantas de maíz de aproximadamente dos meses de edad, y

estas se las colocaron en fundas plásticas e inmediatamente fueron llevadas al laboratorio para

el aislamiento y cultivo de la bacteria (Figura 6).

Figura 6. A) Recolección de tallos en camp o; B) Muestras de maíz llevadas al laboratorio Fuente: Caiza R, 2019

3.3.1.2. Aislamiento primario en laboratorio

1. Las muestras recolectadas de la base del tallo de maíz enfermos, se cortaron

pequeños trozos de 0,5 cm con una parte enferma y una parte sana.

2. Los segmentos fueron lavados en hipoclorito de sodio al 2 % durante 1 minuto.

3. Se realizaron tres lavados con agua destilada estéril durante un minuto cada uno.

4. En la cámara de flujo laminar se agregaron los segmentos de caña infectados en el

mortero con agua peptonada (9ml) y se maceraron hasta que se tornó un líquido

turbio.

5. Se tomaron del mortero con la micropipeta 1000 µl de la suspensión y se

procedieron a colocar en tubos de 5ml con caldo nutritivo y se agitó con el vórtex.

6. Se tomaron 1000 µl y se hicieron diluciones hasta 10-3 para bajar la concentración

del aislamiento inicial.

7. Se tomaron de la última dilución 100 µl con la micropipeta y se agregaron a la caja

Petri con el medio de agar nutriente (AN).

8. Se incubo la bacteria por 12 horas a 30 °C.

9. Se tomaron diferentes colonias de la bacteria y se procedió a purificarlas en cajas

Petri con medio (AN).

A B

A B

17

10. Las muestras obtenidas se las conservaron en refrigeración (-80 °C) con 1 ml de

glicerol (Tovar, 2012).

3.3.1.3. Conservación de la bacteria

1. De las cajas Petri con las colonias de las bacterias aisladas y purificadas se tomó una

colonia con un mondadientes y se agregó en un tubo con caldo nutritivo (5ml) e

inmediatamente se agitaron en el vórtex, luego se la guardaron en la incubadora de

bacterias con la tapa semiabierta por 12 horas hasta observar turbidez.

2. Se agregaron 1 ml de glicerol al 87 % en el tubo con turbidez.

3. Con la micropipeta se tomaron 1 ml y se colocaron en 6 tubos de microcentrífuga y

se la conservó en refrigeración a -80 °C. (Vega, 2014).

3.3.1.4. Reactivación de la bacteria

1. La bacteria conservada fue reactivada al ambiente y luego agregada en caldo

nutritivo (5ml), por cada tubo de microcentrífuga de 1ml se agregaron en 5 ml de

caldo nutritivo.

2. Al tubo con caldo nutritivo y la bacteria se le agitaron en el vórtex hasta lograr una

mezcla homogénea, e incubar durante 12 a 24 horas, dependiendo de su turbidez.

3. Posteriormente, se sembraron 100 ml de la bacteria en cajas Petri con medio AN.

4. Se la incubaron a 28 ° C durante 12 horas.

3.3.1.5. Prueba de tinción de Gram

Según Isenberg (1992):

1. En una placa se colocó una gota del aislamiento de la bacteria de 18 horas de edad.

2. Se realizaron extendidos de la muestra sobre la placa porta objetos.

3. Se fijaron el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el

proceso de tinción, pasando el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama del mechero de

Bunsen.

4. Se agregó el cristal de violeta por un minuto y se lavaron con agua destilada.

5. Se cubrieron con Lugol por un minuto y se lavó nuevamente con agua destilada.

6. Se lavaron con etanol al 95 % y abundante agua.

7. Se usó la acetona como decolorante por 5 segundos.

8. Al final se agregaron la safranina por un minuto y se lavaron con agua destilada

9. Se colocó las placas al microscopio óptico en el lente de 100x con una gota de aceite

al lente y se observó la placa.

10. Se comprobó el color rosa para bacterias Gram (-).

3.3.1.6. Prueba del citrato

1. Se preparó el medio con citrato de sodio, cloruro de sodio, fosfato dipotásico,

fosfato monoamónico, sulfato de magnesio, agar y azul de bromotimol en agua

destilada ajustando un pH de 6,9 y se autoclavó a 121 °C por 15 minutos.

2. Los tubos se colocaron en forma horizontal hasta que se enfriaron.

3. Se tomó una colonia pura de 24 horas de edad.

4. Se sembraron en forma de estría se inocula en la superficie del agar inclinado con

una sola estría en forma ascendente desde el pico.

5. Se incubaron a 35 °C durante 24 a 48 horas.

18

6. La prueba será positiva si producen un color azul oscuro y negativo si no hay cambio

de color.

3.3.1.7. Prueba oxidativo-fermentativo medio HUGH & LEIFSON

1. Se preparó un medio con triptona, extracto de levadura, purpura de bromocresol,

agar y agua destilada y se autoclavó a 121 °C por 15 minutos.

2. Se tomó una colonia pura de 24 horas de incubación.

3. Se inoculó la colonia por punción en dos tubos en la superficie con un asa flameada.

4. A un tubo se le cubre con parafina estéril 2 ml (condiciones de anaerobiosis) y al

otro tubo sin la parafina.

5. Se incubaron los dos tubos a 24 °C, de 48 a 72 horas.

6. Los dos tubos cambian de color verde a amarillo si son oxido-fermentativo, caso

contrario se mantiene el color verde característico del medio.

3.3.1.8. Prueba con KOH 3%

1. Se colocó en el porta objetos flameado una o dos gotas de KOH al 3 %.

2. Con un asa flameada se tomó una colonia de 24 horas de incubación.

3. Se procedió a hacer una mezcla con la solución.

4. La reacción es positiva si al levantar el asa con la solución bacteriana se forma un

hilo y la reacción negativa si no forma el hilo.

3.3.1.9. Prueba de la catalasa

1. En un porta objeto se colocó una colonia bacteriana de 24 horas de incubación con

un asa flameada.

2. Se colocó una gota de agua oxigenada de 1 – 3%

3. La reacción es positiva si se observó efervescencia en 10 segundos y la reacción es

negativa si la efervescencia demora más de 10 segundos.

3.3.1.10. Prueba de la oxidasa

1. Se colocó en una caja Petri, una lámina de oxidasa y se agregó una colonia incubada

por 24 horas.

2. Se esperó el cambio de color a rosado como reacción positiva y sin cambio de color

como reacción negativa (Coltran, 2014).

3.3.1.11. Prueba del indol

1. Se sembraron a las bacterias en tubos (8ml) con caldo triptonado, en el que se

añadieron de dos o tres colonias/inóculos que provinieron de un cultivo puro

usando un asa de siembra.

2. Los tubos inoculados se incubaron a 37 °C por 40 a 48 horas.

3. Luego se añadieron dos a tres gotas del reactivo de Kovacs.

4. Se agitaron lentamente y se dejó reposar.

5. Se presentó un cambio de color rojo como anillo siendo un resultado positivo y como

un resultado negativo sin cambio de color (Rodriguez , 2018).

3.3.2. Pruebas de patogenicidad

Esta parte del estudio se realizó en macetas con compost esterilizado para probar la

patogenicidad del inóculo en diferentes edades de desarrollo de la planta, con la

finalidad de determinar la etapa en la que la bacteria puede afectar al cultivo de maíz,

y mediante pruebas de identificación bioquímicas y molecular, determinar el género y

especie de la bacteria causante de la pudrición del tallo en maíz.

19

3.3.2.1. Pruebas de germinación y viabilidad de semillas de maíz INIAP-103 Mishqui

sara

3.3.2.1.1. Prueba de germinación

1. Se tomaron 100 semillas de maíz.

2. Las semillas fueron envueltas en papel absorbente para promover la germinación. Se

repartieron 50 semillas en cada segmento de papel.

3. El papel humedecido con las semillas fue colocado en la incubadora durante 8 días.

4. Se calculó el porcentaje de germinación en base a las semillas germinadas. Las semillas

que no germinaron fueron eliminadas.

3.3.2.1.2. Viabilidad de la semilla

1. Se tomaron 100 semillas de maíz y se colocó en remojo durante 24 horas.

2. Se cortaron con bisturí a todas las semillas en dos partes para observar el embrión.

3. En un vaso de precipitación se colocaron las semillas cortadas con tetrazolio al 5%.

4. Se incubaron a 28 °C durante 4 horas. Durante este tiempo se tiñó todo el embrión.

5. Se consideró como viable a cada semilla, la que muestre un color violeta en toda la zona

de emergencia, y no viable las que muestren un color opaco en esta zona.

3.3.2.2. Inóculo con la escala de McFarland

Realización de la escala McFarland:

1. Se tomó agua estéril en un tubo con 10 ml para hacer el blanco en el

espectrofotómetro.

2. Se agregaron en los cuatro tubos restantes, primero ácido sulfúrico (H2SO4) a 0,36

M y luego cloruro de bario (BaCl2) a 0,046M.

Cuadro 2. Concentración estimada de bacterias (células)/ml usadas como referencia en

esta investigación.

N° tubo BaCl2 0,046M Ml

H2SO4 0,36 M Ml

Volumen final ml

N° Células

0 0,05 9,95 10 1,5.108

1 0,1 9,9 10 3.108

2 0,2 9,8 10 6.108

3 0,3 9,7 10 9.108

4 0,4 9,6 10 12.108


3. Se agregó cada volumen según los tubos hasta llegar a 10 ml.

4. Se midió la absorbancia en el espectrofotómetro de todos los tubos que se

prepararon para realizar la escala.

5. Se realizó la recta de calibración según la absorbancia de cada tubo.

6. Se usaron los tubos tres y cuatro para comparar la turbidez con el tubo a inocular

con la bacteria en agua A1 (Agua ultra pura) y se ajustaron a la turbidez deseada.

7. Se ajustó la turbidez en el turbidímetro de cada tubo con la bacteria (Ulloa, 2015).

Preparación del inóculo

Para la preparación del inoculo se usaron los tubos 3 y 4 (escala de McFarland), en los que se

realizó la curva de calibración, alcanzando una concentración de 10-8. Los tubos se prepararon

20

en 8 ml con agua A1 (Agua ultra pura) y mediante hisopos se agregaron colonias de bacterias de

24 horas de incubación, y mediante el turbidímetro se comprobó la turbidez exacta del inoculo

y además se comparó con los tubos de calibración, esta concentración produce patogenicidad a

la planta (Jiménez et al., 2007).

3.3.2.3. Tiempos de inoculación

La inoculación con los re-aislamientos obtenidos a partir del proceso de aislamiento primario e

identificación, se realizó bajo invernadero usando la variedad INIAP 103-Mishqui sara como

hospedero susceptible. Para el efecto, se usaron 10 macetas plásticas con un volumen de 8 litros;

con 2,25 lb de compost esterilizado en cada maceta; con 2 semillas de maíz por maceta (2

macetas para cada inoculación), y se procedió a inyectar 2 ml de la solución en agua A1 (Agua

ultra pura) (8ml) junto con la bacteria de acuerdo a los tubos en la escala Mcfarland 3 y 4 (10-8),

y se inocularon dos macetas a partir de la siembra y luego cada 15 días hasta los 60 días después

de la siembra (Anexo 4A y 4B), para un total de 5 inoculaciones.

3.3.2.3.1. Inoculación a la semilla

Material vegetal: Dos macetas, con 2,25 lb de compost esterilizado y dos semillas de maíz (sin

desinfectarlas) por maceta.

Sustrato: Compost esterilizado en vapor húmedo a 121 °C, 15 PSI de seis a ocho horas.

Procedimiento: se reactivó la bacteria en caldo nutritivo y a las 24 horas, se observó turbidez y

se procedió a sembrar en cajas Petri con medio AN, y se la incubó por 12 horas a temperatura

ambiente. Al observar colonias típicas del género estudiado se agregaron en agua A1 hasta llegar

a la absorbancia indicada mediante el turbidímetro. Para la inoculación se inyectaron 2 ml a la

semilla (2 semillas por maceta con compost estéril) de maíz previo al remojo por 12 horas.

3.3.2.3.2. Inoculación al tallo

Las siguientes inoculaciones se llevaron a cabo a los 15-30-45-60 días después de la siembra:

Material vegetal: plantas de maíz de edades con 15-30-45-60 días después de la siembra, con

1,2 kg de compost esterilizado y dos semillas de maíz (sin desinfectarlas) por maceta.

Sustrato: Compost esterilizado en vapor húmedo a 121 °C de seis a ocho horas.

Procedimiento: se reactivó la bacteria en caldo nutritivo y a las 24 horas, inmediatamente se

observó turbidez y se procedió a sembrar en cajas Petri con medio AN y se la incubó por 12

horas. Al observar colonias se tomaron y agregaron en agua A1 hasta llegar a la absorbancia

Figura 7. Método de inoculación de la bacteria en la semilla.


Las semillas usadas en la investigación contaron con una tasa de germinación del 100 %, la humedad y temperatura del compost son factores determinantes en la germinación, y el desarrollo en este caso en un invernadero las temperaturas mínimas son 10 – 12 °C y máximas de 30 °C, temperaturas de 12 a 28 °C y la humedad de 60 %, son ideales en la germinación de las semillas (NOVAGRIC, 2015), por esta razón a esta inoculación no estuvieron cubiertas con fundas de polifán como a los otros tratamientos.

3.3.2.3.3. Inoculación al tallo

Las siguientes inoculaciones se llevaron a cabo a los 15-30-45-60 días después de la siembra:

21

Material vegetal: plantas de maíz de 15-30-45-60 días después de la siembra, con 2,25 lb de

compost esterilizado y dos semillas de maíz (sin desinfectarlas) por maceta.

Sustrato: Compost esterilizado en vapor húmedo a 121 °C, 15 PSI de seis a ocho horas.

Procedimiento: se reactivó la bacteria en caldo nutritivo y a las 24 horas, inmediatamente se

observó turbidez y se procedió a sembrar en cajas Petri con medio AN y se la incubó por 12

horas. Al observar colonias se tomaron y agregaron en agua A1 hasta llegar a la absorbancia

indicada mediante el turbidímetro. Para la inoculación se inyectaron 2 ml a la base del tallo (2

plantas por maceta con compost estéril) y se cubrieron con una fundan de polifán para simular

una cámara húmeda.

Figura 8. Método de inoculación de la bacteria al tallo


3.3.3. Evaluación de plantas inoculadas

3.3.3.1. Presencia o ausencia de la enfermedad

Las plantas fueron consideradas sanas o enfermas de acuerdo a la presencia de la enfermedad

en los diferentes órganos vegetativos de la planta. En este caso se observaron los síntomas sobre

hojas de maíz y tallo principalmente, y esto dependerán de las distintas fechas de inoculación

en las plantas de maíz (0, 15, 30, 45 y 60 días después de la siembra).

3.3.3.2. Escala de la enfermedad

De acuerdo a Castaño & Del Rio (1993), la escala consistió en una descripción numérica y verbal

de las clases o categorías que se distinguen. Para enfermedades se ha descrito una escala

general, donde:

1= síntomas muy leves en hojas; afectando el 1 % del área foliar.

3= síntomas cubriendo el 10 % del área foliar.

7= síntoma cubriendo el 25 % del área foliar.

9= síntomas cubriendo 50 % del área foliar.

22

3.3.3.3. Descripción de síntomas

En las plantas de maíz el síntoma característico que permitieron identificar es la presencia de

hojas con manchas acuosas, donde generalmente las hojas del cogollo se marchitan y se

desprenden fácilmente (Figura 9).

Figura 9. A) Manchas acuosas B) Desprendimiento de las hojas


Al momento de hacer un corte longitudinal del tallo enfermo se observó una pudrición con un

borde pardo oscuro, y un olor característico de la presencia de la bacteria (Figura 10).

Figura 10. Pudrición bacteriana de tallo.


3.3.4. Re-aislamiento bacteriano

El re-aislamiento bacteriano a partir de la semilla y del tallo se realizaron bajo condiciones asépticas, en la que se extrajo a la plántula completa (Figura 17B), y se llevó la muestra al Laboratorio de Fitopatología de Agrocalidad en Tumbaco-Pichincha. El re-aislamiento se lo realizó en cajas Petri con agar nutriente incubado a 30 °C por 24 horas, siguiendo la misma metodología propuesta para el aislamiento primario. Inicialmente, para la identificación de la bacteria con un cultivo puro se realizó una tinción de Gram y la prueba del indol que es más específica para la identificación del género Pantoea. Adicionalmente, los aislamientos obtenidos fueron identificados mediante la prueba bioquímica BIOLOG.

3.3.5. Identificación con BIOLOG

La identificación bioquímica mediante el sistema BIOLOG, se la llevó a cabo siguiendo la metodología propuesta por BIOLOG (2011), misma que se describe a continuación:

A B

23

Aislar y obtener un cultivo puro de la bacteria en medio Agar Nutriente.

Preparar el inóculo con la bacteria a la densidad celular específica, mediante espectrofotometría (9 X 108).

Sembrar la bacteria en las microplacas de BIOLOG.

Incubar la placa, observar e ingresar el patrón de reacción para obtener el resultado de la identificación.

Figura 11. Pasos para la identificación bioquímica con el sistema BIOLOG. Fuente: Caiza R, 2019

3.3.6. Capacidad enzimática

La capacidad enzimática de las bacterias re-aisladas, se verificaron en rodajas de tubérculos de papa y cebolla a concentraciones de 10-8 (Huerta et al., 2016). Estos ensayos se realizaron en cámara húmeda 24 °C durante 14 días. Esta variable se evaluó mediante la presencia o ausencia de la pudrición en las rodajas.

3.3.7. Identificación molecular

Los análisis que se detallan a continuación, se llevaron a cabo en el laboratorio de Fitopatología

y en Biología Molecular de Agrocalidad en Tumbaco-Pichincha, a excepción de la secuenciación

que fue realizada en la empresa Macrogen en Corea del Sur.

1. Extracción de ADN

Se obtuvieron aislados bacterianos puros de Pantoea agglomerans tanto del aislamiento inicial,

como del aislamiento para las pruebas de patogenicidad de cada aislamiento. Los aislamientos

fueron reactivados en tubos de ensayo con 5 ml de caldo nutritivo (agua peptonada y extracto

de carne), y fueron colocados en tubos de microcentrífuga de 2 ml de volumen con un duplicado

por cada tubo. Posteriormente, cada tubo fue centrifugado a 14000 rpm durante 10 minutos, y

se eliminó el sobrenadante cuidadosamente hasta quedarse con el precipitado (pellet

bacteriano).

24

El pellet bacteriano, fue lavado con 0,5 ml de agua estéril, luego vuelto a centrifugar a 1,700 x g

(5000 rpm) por 3 minutos. Se procedieron a eliminar con cuidado y desechar el sobrenadante,

añadiendo 100 μl de QuickExtract Bacterial, solución de extracción de ADN al sedimento celular.

Se agregaron 1 μl de solución de lisozima Ready-Lyse a cada tubo, y se mezcló suavemente por

inversión. Se aseguró de que tanto la bacteria como la Lisozima Ready-Lyse estén dispersas en

la solución. Se incubó la suspensión a temperatura ambiente durante 15 minutos. La digestión

puede extenderse a varias horas si es necesario y el ADN ya está listo para la PCR.

2. Reacción de amplificación

Para la identificación molecular se ocuparon dos cebadores universales para bacterias

(F27/R1492), amplificando los fragmentos del gen 16S RNAr (Morales-Valenzuela et al., 2007).

Cuadro 3. Primer usados para la identificación bacteriana en esta investigación.

Primer Secuencia Temperatura (Tm*)

Especificidad

27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

55°C Bacteria

1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT Universal

Tm*(Temperatura de melting del cebador). Temperatura óptima PCR


La amplificación se realizó empleando 2 μl de ADN genómico + 48 μl PCR mix (primer 27F/1492R,

buffer PCR, MgCl2, dNTP´S, enzima Taq Platinum) con un volumen final 50 μl. El ciclo térmico

para la mezcla fue sometida a una desnaturalización inicial a 94 °C durante 3 min y 35 ciclos con

1 min de desnaturalización a 94 °C; 1 min de hibridización a 55 °C y extensión a 72 °C durante

1.30 min. Se realizó una extensión final a 72 °C durante 8 min. Los productos de PCR se dejaron

refrigerar a 4 °C durante 5 min.

Los productos de amplificación fueron observados mediante electroforesis en gel de agarosa al

2 % en buffer TBE 0.5X, al que se añadió 3 µL de Promega Diamond™ Nucleic Acid Dye para

colorear los amplicones y así observar el tiempo de corrida. Este gel se colocó en una cámara de

electroforesis BIO-RAD hasta su gelificación. Los marcadores de peso molecular fueron de 4 µL

de Invitrogen Low DNA Mass Ladder más 1 µL de buffer de carga Invitrogen™ BlueJuice™ Gel

Loading Buffer (10X). Inmediatamente se prepararon los controles con 4 µL del producto de PCR

o del control más 1 µL de buffer de carga y las muestras. La corrida del gel se programó a 100 V

durante 30 minutos, después las bandas resultantes se visualizaron en un transiluminador

modelo DR-46B.

3. Secuenciación y análisis bioinformático de secuencias

Los productos obtenidos de la PCR, se enviaron a secuenciar en la empresa Macrogen en Corea

del Sur mediante el método Sanger por electroforesis capilar. Las secuencias que se obtuvieron

fueron editadas en el programa BioEdit (Biological sequence alignment editor), en el cual se

eliminaron gaps y compararon con secuencias referencia para dar confiabilidad al alineamiento.

Las secuencias editadas se compararon contra secuencias obtenidas de la base de datos

GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information) mediante la herramienta

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), donde se seleccionaron las identificaciones con

porcentajes de identidad aproximados al 100 %.

25

Para las relaciones filogenéticas entre las secuencias de esta investigación y las secuencias

obtenidas de los aislamientos a partir de GenBank, se empleó el software MEGA versión 10.0.5,

utilizando para ello el método “Maximum Likelihood”. El árbol obtenido corresponde a una

comparación con el árbol de filogenia de especies de Pantoea (Brady et al., 2008).

26

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Aislamiento primario y purificación

En esta investigación se obtuvo un total de 10 aislamientos bacterianos, mismos que fueron

colectados de muestras de maíz que mostraban marchitamiento y pudrición bacteriana de tallo

(Figura 12) en Tumbaco, Pifo, Puembo y Checa. En Tumbaco se obtuvo 3 aislamientos, en Pifo

se obtuvo 2 aislamientos, en Puembo se obtuvo 3 aislamientos y en Checa se obtuvo 2

aislamientos. En el medio de cultivo agar nutritivo, las colonias bacterianas se seleccionaron con

base a su pigmentación (amarilla) y forma completa y redonda (Ruíz et al., 2018).

Figura 12. A) Marchitamiento de maíz observado en campo. B y C) Pudrición bacteriana de

tallo. Fuente: Caiza, 2019

En este estudio, las colonias con pigmentación amarilla (Figura 13) fueron seleccionadas como

un posible agente causal de la pudrición bacteriana del tallo y hojas del maíz. Según Mallaupoma

(2007) y Ruíz et al. (2018), mencionan que esta apariencia fenotípica de la bacteria podría estar

asociada al género Pantoea. Por esta razón, en esta investigación esta bacteria fue seleccionada

para ser sometida a pruebas patogénicas, bioquímicas y moleculares para probar su identidad y

patogenicidad.

Figura 13. Colonias bacterianas con pigmentación amarilla en medio AN.

Fuente: Caiza, 2019

4.2. Identificación bioquímica de Pantoea agglomerans

Una vez obtenidas colonias puras de la bacteria, se realizaron pruebas bioquímicas y fisiológicas para Pantoea agglomerans, los resultados se describen a continuación:

B

A C

27

4.2.1. Características bioquímicas

Los aislamientos bacterianos seleccionados resultaron ser Gram negativos (Figura 14), bacilares perítricos (Algoria, 2002) , hidróxido de potasio (KOH) positivo (+), catalasa positivo (+), citrato negativo (-), oxido fermentativo positivo (+), respiración aerobia positiva (+), y principalmente indol negativa (-), tal como lo menciona Jiménez et al. (2007) para Pantoea (Cuadro 4).

Figura 14: Vista microscópica (100X) de Pantoea agglomerans.

Fuente: Caiza, 2019

Pantoea agglomerans pertenece a la familia Enterobacteriaceae dando como resultado bacterias Gram negativas, catalasa con reacción positiva, citrato negativo, el hidróxido de potasio y oxidasa negativo (Algoria, 2002). La reacción fermentativa que produce la bacteria es un rápido cambio de color a amarillo que coincide con lo señalado para la bacteria por Jiménez et al. (2007), y a su metabolismo anaerobio facultativo. La prueba del indol genera una reacción negativa indicando una especificidad para la especie P. agglomerans y diferenciándolo de la especie Pantoea ananatis que muestra una reacción positiva (halo rosado), como lo menciona Gutierrez-Barranquero et al. (2011). Cuadro 4. Pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de Pantoea agglomerans.

Fuente: Caiza, 2019

4.3. Identificación bioquímica en BIOLOG

Las bacterias aisladas en medio agar nutriente y procesadas en el sistema de identificación de

bacterias BIOLOG son: Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Serratia, Hafnia alvei,

Enterobacter amnigenus, Pantoea dispersa y Pantoea agglomerans. Es importante mencionar

Prueba Bioquímica Medio o reactivo empleado

Reacción Observaciones Referencia

Tinción de Gram Cristal violeta, Lugol, alcohol 96% y safranina

- Gram negativa. Jiménez et al., 2007

Hidróxido de potasio

Agua oxigenada + Formación de hilo. Jiménez et al., 2007

Catalasa Peróxido de hidrogeno + Presencia de burbujas. Jiménez et al., 2007

Oxidasa Disco de papel en oxalato de para- aminodimetilanilina

- No presencia del citocromo C (Enterobacteriaceae).

Jiménez et al., 2007

Citrato Agar Citrato de Simmons - No cambio la coloración de verde a azul.

HUGH & LEIFSON Glucosa + Cambio de color a amarillo. (Anaerobio facultativo),


Indol Reactivo de Kovacs - No formación de anillo rojo en el caldo de triptona.


28

que las características bioquímicas de Klebsiella oxytoca, Serratia, Hafnia alvei, Enterobacter

amnigenus, y el género Pantoea son similares ya que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

siendo todas ellas Gram negativas (León & Sernaqué, 2014).

Sin embargo, consistentemente en todos los aislamientos el sistema BIOLOG detectó reducción de carbohidratos como la sacarosa, manosa, maltosa, arabinosa y glucosa, y negativo en melibiosa. Jiménez et al. (2007), mencionan que el género Pantoea tiene una alta capacidad enzimática para degradar los carbohidratos antes mencionados, sugiriendo una buena probabilidad de identificación de la bacteria cuando la probabilidad en BIOLOG supere el 0.5 (Cuadro 5). De acuerdo a BIOLOG (2011), para concluir sobre la identidad de una bacteria debe superar 0.5, por lo que se asume que la identidad bioquímica de la bacteria causante de la pudrición del tallo es Pantoea agglomerans. Entre todas las enterobacterias obtenidas, los géneros Klebsiella, Serratia, Hafnia y Enterobacter

son encontradas en la rizósfera del suelo de un cultivo de maíz actuando como promotores del

crecimiento y rendimiento en plantas; en este caso no son consideradas como fitopatógenas en

el cultivo de maíz (León & Sernaqué, 2014). Además, Pantoea dispersa está siendo usada como

agente en el control biológico de bacterias y hongos fitopatógenos de acuerdo a lo que

menciona Fernández et al., (2008); en este caso para el cultivo de maíz no se ha reportado como

fitopatógeno. Por otro lado, Ruiz, (2018) en contraposición con lo mencionado anteriormente,

indica que P. agglomerans actúa como un nuevo agente fitopatógeno en el cultivo de maíz en

México, sin embargo, no se han registrado pérdidas económicas sustanciales.

Cuadro 5. Resultados del análisis de identificación mediante el sistema BIOLOG.

Códigos Probabilidad Tipo de Organismo

Especie

FP-19-0070 0,653 GN- Ent* Pantoea agglomerans



*GN: Gram Negativa, Ent: enterobacteria Fuente: Caiza R, 2019

4.4. Identificación molecular de la bacteria

Una vez obtenido el resultado del análisis bioquímico mediante BIOLOG, los aislamientos

fueron sometidos a identificación molecular para confirmar su identidad molecular. Por ello,

el contenido total de material genético de los aislados bacterianos en el NanoDrop reportó

que el 100 % de las muestras de ADN presentaron altas concentraciones, obteniéndose

buena calidad del material genético con una longitud de onda de 280 nm y la pureza de las

muestras con una relación de absorbancias de A260/280, considerándose un ADN de pureza

óptima con los que arrojan resultados entre 1,9 (Anexo 5).

Los resultados de la PCR para amplificar el gen 16S-RNAr, sugirieron que los amplicones

obtenidos de los aislamientos identificados bioquímicamente por BIOLOG como Pantoea

agglomerans, generaron fragmentos con un tamaño de aproximadamente 1400 pb para la

secuencia del gen en estudio (Figura 15); lo que está de acuerdo con los resultados

obtenidos por Frank et al. (2008), quienes mencionan que el uso de estos cebadores

universales originó bandas de aproximadamente 1400 bp.

29

Figura 15. Perfil de amplificación de Pantoea agglomerans obtenidos de la secuencia RNAr

16S; donde; 1 es el marcador de peso molecular, 2 es el control positivo, 3 es el aislamiento

inicial FP-19-0071 AI, 4 es el aislamiento postulados FP-19-0071 POST, y 5 es el control

negativo del gel de agarosa (agua).

Análisis Blast (Basic Local Alignment Search Tool)

Una vez secuenciados los productos de PCR mediante la metodología de electroforesis

capilar, las secuencias del gen 16S RNAr fueron editadas y ensambladas para obtener una

secuencia consenso, misma que fue sometida a comparación genética con la base de datos

de GenBank. En este sentido, los aislamientos FP-19-0071 (425) AI y FP-19-0071 (426) POST,

tuvieron un alto porcentaje de homología del 97,97 % y 99,69 %, respectivamente con

Pantoea agglomerans (Número de accesión: NR_111998). Las muestras analizadas con

referencia a la información depositada en GenBank, tuvieron un alto porcentaje de identidad

correspondiente a la especie en estudio, por tal motivo con las pruebas de bioquímicas,

patogenicidad y moleculares, concuerdan que la identidad genética y bioquímica es Pantoea

agglomerans.

Análisis filogenético

La relación filogenética de las secuencias consenso de P. agglomerans obtenidas en esta

investigación, se realizó mediante la construcción de un árbol de filogenético mediante el

algoritmo “Maximum Likelihood”, incluyendo para ello las especies de Pantoea propuestas

por Brady et al. (2008).

Las relaciones filogenéticas agruparon consistentemente en un solo clado a los aislamientos

de P. agglomerans obtenidos en esta investigación, con los aislamientos de P. agglomerans

identificados y registrados en países como Venezuela (Número de accesión: KJ650323),

Colombia (Número de accesión: KY938144) y China (Número de accesión: DQ133596) (Figura

11). Adicionalmente, la topología del árbol propuesto por Brady et al. (2008), estuvo acorde

al árbol obtenido en este estudio donde el agrupamiento tomó en cuenta especies de

bacterias representativas de la familia Enterobacteriaceae, tomando a Escherichia coli como

el género fuera de grupo (outgroup); además, de géneros como Erwinia, Enterobacter,

Tatumella ptyseos y Enterobacter nimipressuralis, que se encontraron filogenéticamente

emparentados al género Pantoea. Brenner et al. (1986), indican que Enterobacter

nimipressuralis o Enterobacter agglomerans es la especie más cercana genéticamente a

Pantoea agglomerans, tal como se observó en esta investigación, con un porcentaje de

250 pb

2000 pb

30

relacionamiento del 66 % con respecto a los aislamientos de P. agglomerans identificados en

este estudio.

De acuerdo a los resultados obtenidos, para nuestro conocimiento este es el primer estudio

que identifica y describe bioquímica, patogénica y molecularmente a Pantoea agglomerans

como el agente causal de la pudrición de tallo del maíz en Pichincha-Ecuador.

Figura 16. Árbol filogenético derivado de las secuencias del gen 16S-RNAr, construido mediante el

algoritmo “Maximun Likelihood” diseñado para la especie Pantoea agglomerans. Los codones

estuvieron basados en el alineamiento MUSCLE del programa MEGA 10.0.5. Los valores de bootstrap

con más de 50 % son fiables, están mostrados frente a cada rama del árbol. Los números de

accesiones de referencia están indicadas entre paréntesis. Los puntos negros indican las secuencias

de los aislamientos estudiados en esta investigación.

31

4.5. Pruebas de patogenicidad

4.5.1. Germinación y viabilidad de las semillas de maíz

Para el desarrollo de la fase de invernadero con las inoculaciones se hizo necesario saber si la semilla a utilizar estaba sana, por ello el uso de pruebas de germinación fueron necesarias para garantizar la inoculación en semilla libre de patógenos. Los resultados indicaron un 89 % de germinación, y un 11 % que no germinó por problemas internos de la semilla (Cuadro 6). Es importante mencionar que no se observaron daños en la semilla por causa de algún patógeno que se transmita por semilla.

Cuadro 6. Porcentaje de semillas germinadas usadas para las pruebas de patogenicidad.

N° Semillas total

7 días

14 días % Total

N° Dañadas

N° Germinadas

N° Dañadas

N° Germinadas

% Germinación 100 7 93 4 89 89

Fuente: Caiza, 2019 Adicionalmente, las semillas fueron mantenidas en la incubadora por 14 días más, para observar a los 7 y 14 días la germinación el sistema radicular de la semilla y así asegurar la germinación y establecimiento de todas las semillas de maíz en estudio (Cuadro 7). El resultado indicó que el 87 % de las semillas fueron teñidas obteniendo un color rosado, asegurando que la radícula y el hipocotilo están bien formados, por lo que se espera un buen porcentaje de efectividad al momento de la siembra y el establecimiento de las semillas, previo a la inoculación de la bacteria. Cuadro 7. Porcentaje de semillas viables de maíz

N° Semillas total

Semillas teñidas Semillas no teñidas

% Total

% Viabilidad 100 87 13 87

Fuente: Caiza, 2019 Curva de calibración del inóculo En el Anexo 2 y 3, se observa la recta de calibración obtenida para ajustar la concentración del inóculo inicial a las escalas 3 (9 x 10-8) y 4 (12 x 10-8) de McFarland. En todos los tiempos de inoculación (0, 15, 30, 45 y 60 días después de la siembra), la concentración del inoculo estuvo ajustada a la función de regresión lineal con un coeficiente de determinación (R2) de 1. Cabeza (2013), menciona que, para asegurar una correcta inoculación de bacterias fitopatógenas en semilla y tallo, las concentraciones usadas del inóculo deben estar calibradas (R2>0,98) con la función lineal obtenidas en el espectrofotómetro. Adicionalmente, el mismo autor indica que Pantoea agglomerans puede estar presente en la semilla, siendo este un potencial agente de diseminación de la enfermedad. En nuestra investigación, las concentraciones obtenidas del inóculo fueron comparados con las concentraciones stock de la escala de McFarland, haciendo el uso del turbidímetro (Ulloa, 2015), donde se observó que la absorbancia entre ambas concentraciones fue muy similar, quedando dentro de los límites de la absorbancia 3 y 4.

Patogenicidad de Pantoea agglomerans en semilla

De manera general, de las 4 semillas sembradas (100 % germinación) e inoculadas con la bacteria, solo se presentó la sintomatología típica de la enfermedad (marchitamiento bacteriano en los primordios foliares) en una de ellas a los 14 días después de la siembra (Figura 17A). Por otro lado, en las 3 semillas restantes que llegaron a emerger y formar planta, en una de ellas se

32

mostró una pudrición bacteriana en la panoja a los 60 días después de la siembra(Figura 18), indicando que esta bacteria daña vascularmente a la planta afectando sus puntos de crecimiento, causando algún tipo de marchitamiento bacteriano (Figura 17B). Mezzalama (2016), menciona que P. agglomerans en la semilla de maíz es de menor importancia, sin embargo, Ruíz et al. (2018), mencionan que la misma bacteria puede causar síntomas iniciales en las hojas jóvenes en forma de manchas verdes acuosas inclusive marchitamiento. En nuestra investigación se evidenció que, la semilla germinada e inoculada en comparación de los testigos absolutos (sin inoculación) (Figura 17C), fue más pequeña y sin mucho vigor conforme pasaron los días, llegando a alcanzar un marchitamiento total a los 14 días después de la siembra. Las bacterias re-aisladas de las plántulas afectadas, fueron sometidas a identificación bioquímica mediante BIOLOG, para confirmar su asociación con la enfermedad.

Figura 17. A) Plántula con sintomatología de pudrición bacteriana. B) Plántula extraída para

prueba de identificación BIOLOG; C) Testigos sin inoculación. Fuente: Caiza, 2019

Figura 18. Pudrición bacteriana en la panoja después de 60 días de inoculación.

Fuente: Caiza, 2019

Patogenicidad de Pantoea agglomerans en tallo

La inoculación en tallo a los 15, 30, 45 y 60 días después de la siembra, indicó una alta patogenicidad de la bacteria, originando síntomas tales como manchas acuosas, marchitamiento de hojas (Figura 14A) y pudrición de tallo (Figura 14B), a los 8, 14 y 35 días en promedio después de la inoculación, respectivamente. Cabe mencionar que los síntomas antes descritos en esta investigación, están acorde con la descripción de la enfermedad en maíz propuesta por Ruíz et al. (2018), quienes sugieren que los síntomas iniciales de la enfermedad

A B C

33

provocadas por Pantoea agglomerans se presentan como manchas acuosas verdes (Figura 13C), seguida de un marchitamiento severo de hojas y por ende de la planta. Ruíz et al. (2018), en su estudio el desarrollo de los síntomas se presenta en hojas durante el crecimiento vegetativo (Figura 19A), mencionando que la etapa Vn (Desarrollo vegetativo) fue la más afectada, por lo tanto es necesario correlacionar el efecto de la enfermedad con el crecimiento de la planta y por lo tanto en el rendimiento del cultivo; con respecto a este estudio el desarrollo vegetativo se vio afectado en cada inoculación aproximadamente después de 8 días (Figura 20), demostrándose que lo sugerido es correcto con respecto a la investigación.

Figura 19. A) Hojas con presencia de marchitamiento bacteriano; B) Tallo con presencia de

pudrición bacteriana; C) Manchas acuosas en plantas inoculadas. Fuente: Caiza, 2019

Figura 20. Avance de la enfermedad manchas acuosas en 20 días después de la inoculación.

Fuente: Caiza, 2019

El marchitamiento vascular generado en todas las inoculaciones realizadas al tallo muestran un gran parecido a lo que mencionan, Morales-Valenzuela et al. (2007) en su primer reporte de Pantoea agglomerans, en una parcela de experimento donde se observaron síntomas de marchitamientos de hojas y marchitamiento vascular, generado por el agente causal de la familia Enterobacteriaceae que presentan un sistema de secreción tipo III con la capacidad de exportar proteínas involucradas en el proceso de colonización donde los espacios intercelulares de los tejidos vegetales causan la muerte. Según Barash & Manulis-Sasson (2007), reportan que los expolisacáridos (EPS) producidos por la bacteria en ambientes significativamente diferentes

A

B C

34

en términos de temperatura y humedad producen síntomas como putrescencia y esto es debido a enfermedades bacterianas del maíz generando una preocupación mundial.

4.3.4. Re-aislamiento bacteriano En medio de cultivo agar nutritivo (AN), se realizó el re-aislamiento bacteriano de los órganos de la planta que mostraron síntomas típicos de la enfermedad, provenientes de las pruebas de patogenicidad. En este sentido, en todos los aislamientos se obtuvieron colonias de color amarillo, de forma redonda tal como lo menciona Jiménez et al. (2007), quienes indican que esta fenología es típica del género Pantoea (Figura 21). Además, las colonias con pigmentación amarilla de 24 horas de incubación fueron identificados también en semillas mostrándonos algo específico de la bacteria en estudio ya sea por morfología y pigmentación como lo describe Membreño et al. (2016).

Figura 21. Colonias amarillas obtenidas en AN de re aislamientos en caja Petri. Fuente: Caiza, 2019

4.3.4.1. Identificación bioquímica de los re-aislamientos mediante BIOLOG

Para corroborar la identidad todos los re-aislamientos obtenidos de las pruebas de patogenicidad, estos fueron sometidos a identificación bioquímica mediante BIOLOG (Cuadro 8). De esta manera, la identidad bioquímica de todos aislamientos nuevamente fue Pantoea agglomerans con una probabilidad de acierto del género y especie identificado, que fluctuó desde 0.522 hasta 0.703. De acuerdo a BIOLOG (2011), para aceptar como positivo un resultado de identificación la probabilidad de acierto debe ser superior a 0.5; inclusive esta probabilidad puede incrementar si el período de incubación de la bacteria en las microplacas es mayor. Según Membreño et al. (2016), mencionan que la identificación con el sistema BIOLOG indica resultados de género y especie de los agentes causales de enfermedades con una alta especificidad, inclusive relacionándolo con los resultados encontrados por el análisis molecular mediante el estudio de la filogenia de las bacterias.

35

Cuadro 8. Probabilidad de acierto mediante el sistema de identificación bioquímica BIOLOG.

Inoculación Órgano afectado

Probabilidad de acierto

Tipo de organismo Especie

Semilla

Plántula A 0.660 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 9)

Plántula B 0.682 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 10)

Plántula C 0.653 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 11)

Tallo (15 días)

Tallo 0,522 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 12)

Tallo (30 días)


Tallo (45 días)


Tallo (60 días)


*GN-Ent= Gran Negativa- Enterobacter Fuente: Caiza R, (2019)

4.3.5. Actividad enzimática

4.3.5.1. En rodajas de papa (Solanum tuberosum)

Los resultados indicaron que Pantoea agglomerans no tiene la capacidad enzimática de producir

celulasas y pectinasas para degradar al tubérculo de papa (Figura 22). Estos resultados

concuerdan con los alcanzados por Jiménez et al. (2007), quienes indican que Pantoea

agglomerans (sin. Enterobacter agglomerans o Erwinia herbicola), no tiene la capacidad de

degradar tubérculos de papa. En este sentido, se podría enzimáticamente separar de Erwinia

carotovora ya que esta bacteria si tiene estas propiedades de lisis del tubérculo de papa,

produciendo enzimas pectolíticas y celulolíticas las cuales provocan maceración de los tejidos

conocido como podedumbre (Kunstmann, 2004).

Figura 22. A) Testigo inoculado con agua (8 días después de la inoculación); B) Tubérculo

inoculado con P. agglomerans (8 días después de la inoculación). Fuente: Caiza, 2019

A B

36

4.3.5.2. En cebolla (Allium cepa)

La actividad enzimática de Pantoea agglomerans fue positiva sobre los segmentos de cebolla, es decir, que se observó degradación de los tejidos en la zona de inoculación (Figura 23A y 23B). Por otro lado, en el testigo no se observó ningún tipo de pudrición. Esta bacteria produce proteínas nucleadoras de hielo con un factor de virulencia inusual, donde la formación de cristales de hielo en tejidos blandos a temperaturas superiores a las normales, facilitan la producción de heridas y la entrada del patógeno que induce la muerte celular (Cazorla, 1996).

La patogenicidad y desarrollo de la enfermedad se da por los genes presentes en el sistema de secreción tipo III generando susceptibilidad, activándose la hipersensibilidad que provoca una muerte celular programada, con un colapso celular masivo y una necrosis debido a la alta concentración del inóculo, donde esta reacción tiene un efecto de restringir la multiplicación del patógeno y así mostrarse un progreso de la enfermedad (Pérez-Terrón et al., 2012). Gutierrez-Barranquero et al. (2011), mencionan que la producción de síntomas se da a los 14

días a 28 °C tanto para aislamientos de P. agglomerans y P. ananatis, que producen síntomas

similares en cebolla y de acuerdo a lo observado la prueba de patogenicidad se tuvo un

resultado positivo en cebolla comprobándose la presencia de la bacteria.

Figura 23. A) y B) Segmentos de cebolla inoculada con P. agglomerans; C) Testigo absoluto

inoculado con agua destilada. Fuente: Caiza, 2019

A B C

37

5. CONCLUSIONES

La caracterización bioquímica permitió determinar que las bacterias asociadas a

la pudrición de tallo y marchitamiento de hojas del maíz pertenecen a la familia

Enterobacteriacea. Mediante la prueba negativa del Indol se identificó que el

género bacteriano con mayor presencia en este estudio fue Pantoea spp.

Además, mediante el sistema BIOLOG (prueba bioquímica de alta especificidad),

se confirmó la identidad bioquímica de la bacteria como Pantoea agglomerans.

Los análisis moleculares del gen 16S RNAr confirmaron que el género y especie

bacteriana asociada a la pudrición del tallo del maíz y marchitamiento de hojas

en maíz es causada por Pantoea agglomerans.

Las pruebas de patogenicidad con la bacteria Pantoea agglomerans en la

variedad INIAP 103 Mishqui sara, ayudaron a dilucidar la asociación vascular del

agente causal de la pudrición del tallo y marchitamiento de hojas del maíz.

Los resultados obtenidos en esta investigación sugieren por primera vez en

Ecuador, que el agente causal de la pudrición del tallo y marchitamiento de hojas

en la variedad de maíz INIAP 103 Mishqui sara, es causado por Pantoea

agglomerans.

38

6. RECOMENDACIONES

Ampliar la caracterización molecular del agente causal para definir la posible

existencia de razas especiales de Pantoea agglomerans.

Para las pruebas de patogenicidad en invernadero, realizar una curva de

calibración con concentraciones estándar que nos permita establecer en

concreto la concentración del inóculo que asegure la replicación de los síntomas

en las plantas.

Con el método de inoculación definido en esta investigación, realizar ensayos de eficacia a nivel de invernadero con posibles bactericidas de espectro específico para el control de Pantoea agglomerans en maíz y otros cultivos.

39

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45

8. ANEXOS

Anexo 1. Reacciones de las pruebas bioquímicas realizadas a la cepa Pantoea agglomerans

1. Prueba con KOH 3% Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3 %, después con el asa calibrada se recolecta muestra de las colonias bacterianas en estudio, se mezcla con la gota de KOH, con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos

Medios y reactivos

Acetona

Asa

Ilustración 2. Formación de hilo

Autor: Caiza R, 2019

Interpretación Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, la prueba es positiva e indica que se trata de bacterias Gram negativas. Si al separar el asa no se forma hebra, la prueba es negativa, e indica que las bacterias son Gram positivas El hidróxido de potasio es el causante del rompimiento de la pared de la bacteria lo cual forma una composición viscosa dando una reacción positiva al formar un hilo con el asa. 2. Prueba de catalasa El objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa en la bacteria. El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa.

H2O2 -> H2O + ½ O2

Medios y Reactivos

Peróxido de hidrogeno al 3% (H2O2).

46

Ilustración 3. Burbujas de oxígeno

Autor: Caiza R, 2019 Interpretación

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno que de desprenden de la bacteria, producto de la acción de la enzima catalasa sobre el peróxido de hidrogeno añadido.

Existe una reacción positiva, en este caso se observaran burbujas de oxigeno por acción de la enzima catalasa. 3. Prueba de la oxidasa

El objetivo de la prueba de “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa, en la bacteria.

Se trata de un enzima que oxida el Citocromo C de la cadena transportadora de electrones. Medios y reactivos

Lámina de oxidasa

Asa

Ilustración 4. Lamina con la bacteria

Autor: Caiza R, 2019 Interpretación

47

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color púrpura y negativo cuando no toma dicha coloración.

Reacción negativa no cambió de color, no existe presencia de citocromo C, especifico de Enterobacteriaceae. 4. Prueba del citrato

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de bacterias quimiorganotróficas. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromothimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Medios y reactivos

Medio de Simmons

Fosfato diácido de amonio: 1 g

Fosfato dipotásico: 1 g

Cloruro de sodio: 5 g

Citrato de sodio: 2 g

Sulfato de magnesio: 0,2 g

Agar: 15 g

Azul de bromotimol: 0,08 g

Agua destilada: 1000 ml

pH: 6,9

Ilustración 5. Citrato negativo Autor: Caiza R, 2019

Interpretación

48

El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Reacción negativa en la prueba, no cambia de color para la bacteria.

5. Prueba de oxidativo/fermentativo en medio HUGH & LEIFSON Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulación de ácidos con un indicador ácido-base (azul de bromotimol). Medios y reactivos

Triptona 10 g

Extracto de levadura 1,0 g

Purpura de bromocresol 0,04 g

Agar 2,0 g

Agua destilada 1000,0 ml

Esterilizar a 121° C (15 libras de presión) por 15 minutos

Ilustración 6. Prueba oxidativo/fermentativa Autor: Caiza R, 2019 Interpretación

Prueba para bacterias gram negativas, la reacción es positiva. La bacteria posee un metabolismo oxido fermentativo (anaerobia facultativo) cambio de color en ambos tubos,

6. Prueba del Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol

B A

A

49

es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano.

Medios y reactivos Caldo triptófano

Peptona o digerido pancreático de caseína: 2 g

Cloruro de sodio: 0,5 g

Agua destilada: 100 ml Reactivo de Kovacs

Alcohol amílico o isoamílico: 150 ml

p-dimetilaminobenzaldehído: 10 g

HCl concentrado (37%): 50 ml

Ilustración 6. Prueba del Indol Autor: Caiza, R. 2019

Interpretación

El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Reacción negativa, no cambió de color, medio realizado en caldo triptona, específica para el

género Pantoea

50

Anexo 2. Elaboración de la recta de calibración de la Escala Mcfarland. 1. Datos obtenidos en el espectrofotómetro: absorbancia y trasmitancia

2. Cuadro resumen con valores obtenidos para la obtención de la pendiente (m)

ABS4

N X Y X2 Y2 X*Y

0,5 1,5 0,120 2,25 0,0144 0,18

1 3 0,230 9 0,0529 0,69

2 6 0,475 36 0,225625 2,85

3 9 0,523 81 0,273529 4,707

4 12 0,642 144 0,412164 7,704

2. Resultados de suma, media, desviación, covarianza con todos los valores obtenidos de

las absorbancias

3. Datos de la pendiente de la recta: y=mx+b

Pendiente

X y m

0,78184898 0,12 0,09119512

1,98805385 0,23

4,67460105 0,475

5,20094499 0,523

6,50583935 0,642

4 Absorbancia obtenida para la curva de calibración

ABS

Y Anti-logaritmo

ABS %

Transmitancia

0,120 0,76 76

0,230 0,59 59

0,475 0,33 33

0,523 0,3 30

0,642 0,23 23

SUMA 31,5 1,99 272,25 0,978618 16,131

MEDIA 6,3 0,398 SX 3,841874542 14,76 SY 0,193182815 SXY 0,7188 R 0,968492807 B 0,048699187 M 0,091195122

51

Anexo 3. Gráfica de la recta de calibración de la Escala de Mcfarland usada para cada inoculación.


Anexo 4. Turbidez para cada inoculación con los tubos 3 y 4


0,12

0,23

0,475

0,523

0,642

y = 0,0912x + 0,0487R² = 1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 2 4 6 8

Series1

Lineal (Series1)

0,120

0,230

0,4750,523

0,642

0,5850,5850,602y = 0,0882x + 0,0522

R² = 1

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0 1 2 3 4 5 6 7 8Series1 Lineal (Series1)

1

23

0,5

4

52

1.1. Inoculación en semilla. Recta obtenida entre puntos de calibración y puntos obtenidos entre el punto 3 y 4 para la inoculación en semilla.


1.2. Inoculación en tallo. Recta obtenida entre puntos de calibración y puntos obtenidos entre

el punto 3 y 4 para las diferentes inoculaciones realizadas en la base del tallo.

Anexo 5. Concentración y pureza del ADN de las muestras Pantoea agglomerans

Código de muestra Relación

Rango Pureza

FP-19-0071 (425) A.I* 260/280 1.9 Óptima

FP-19-0071 (426) POST* 260/280 1.9 Óptima


*A.I= Aislamiento inicial

*Post= Postulados

0,120

0,230

0,475

0,523

0,642

0,5690,5690,602

0,5520,5370,537

0,5850,5850,602

0,5690,585

0,553

y = 0,5299x + 0,004R² = 1

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Series1 Lineal (Series1)

0,5

1

2

3

4

53

Anexo 6. Prueba bioquímica de identificación con el sistema Biolog para cepas originales de

Pantoea agglomerans 1

54

Anexo 7. Prueba bioquímica de identificación con el sistema Biolog para cepas originales de

Pantoea agglomerans 2

55

Anexo 8. Informe de análisis de semillas de la Variedad INIAP-103 Mishqui sara

56

Anexo 9. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog

para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla.

57


para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla.

58


para cepas re aisladas la inoculación a la semilla.

59


para cepas re aisladas de la inoculación II

60


para cepas re aisladas de la inoculación III

61


para cepas re aisladas de la inoculación IV

62


para cepas re aisladas de la inoculación V

63

Anexo 16. Pureza y calidad de ADN de la muestra en estudio (Pantoea agglomerans)

Relación Rango Pureza

260/280

1.8-2 Pureza óptima

1.6-1.8 Pureza aceptable

<1.6 Presencia de compuestos aromáticos y proteínas

>2.1 Contaminación con ARN

260/230

2.0-2.2 Rango óptimo

<2.0 Contaminación con sales, fenoles, hidratos de

carbono, etc.

64

9. FOTOGRAFÍAS

Fotografía 1. Tallos obtenidos con la sintomatología de Pantoea agglomerans en diferentes

Parroquias. Fuente: Caiza R, 2019

Fotografía 2. Microplaca de Biolog usada en la prueba bioquímica. Fuente: Caiza R, 2019

Fotografía 3. Semillas de maíz Variedad Iniap-103 Mishqui sara. Fuente: Caiza R, 2019

65

Fotografía 4. Prueba de germinación y desarrollo radicular a los 14 días. Fuente: Caiza R, 2019

Fotografía 5. Semillas dañadas en la pruebas de germinación. Fuente: Caiza R, 2019

Fotografía 6. A. Semilla teñida todo el embrión viable. B. Semilla no viable. Fuente: Caiza R,

2019

A B

66

Fotografía 7. Semillas viables y no viables variedad INIAP-103 Mishqui sara. Fuente: Caiza R,

2019

Fotografía 8. Reactivos en la escala de Mcfarland Fotografía 9. Espectrofotómetro.


Fotografía 10.Cepas para inoculación Fotografía 11. Remojo de las semillas de maíz previo a la

siembra. Fuente: Caiza R, 2019

H2SO4

0,36M BaCl2

0,048M

67

Fotografía 12. A. Plántulas germinadas e inoculadas. Fuente: Caiza R, 2019

Fotografía 13. A. Plantas de la II inoculación B. Tallo extraído de plantas inoculadas. Fuente:

Caiza R, 2019

Fotografía 14. Microplacas de Biolog realizadas al tallo II inoculación. Fuente: Caiza R, 2019

A B

68

Fotografía 15. A. Plantas con síntomas, y B. Tallos extraídos de la III inoculación. Fuente: Caiza

R, 2019

Fotografía 16. A. Plantas con síntomas, y B. Tallos extraídos de la IV inoculación. Fuente: Caiza

R, 2019

A B

69

Fotografía 17. A. Plantas con síntomas, y B. Tallos extraídos de la V inoculación. Fuente: Caiza

R, 2019

Fotografía 18. Microplacas de Biolog, inoculación IV y V. Fuente: Caiza R, 2019

70

Fotografía 19. A) Muestras conservadas en tubos effendort B) Caja para conservación de

muestras C) Ultracongelador (-80°C). Fuente: Caiza R, 2019

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