UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · iv AGRADECIMIENTOS Mi ... INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS PERFIL LIPÍDICO DE MICROALGAS ANTÁRTICAS RECOLECTADAS EN FEBRERO 2013 EN EL ARCHIPIÉLAGO SCHETLAND DEL SUR Tesis de Grado para optar por el Título Profesional de QUÍMICO DE ALIMENTOS AUTORA: Mónica Lucía Salas Cando e-mail: [email protected] Tutor: Dr. Flores Ortega Ronny Adrián e-mail: [email protected] Quito, 13 de Marzo, 2015
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
PERFIL LIPÍDICO DE MICROALGAS ANTÁRTICAS RECOLECTADAS EN FEBRERO
2013 EN EL ARCHIPIÉLAGO SCHETLAND DEL SUR
Tesis de Grado para optar por el Título Profesional de
QUÍMICO DE ALIMENTOS
AUTORA: Mónica Lucía Salas Cando
e-mail: [email protected]
Tutor: Dr. Flores Ortega Ronny Adrián
e-mail: [email protected]
Quito, 13 de Marzo, 2015
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Salas Cando Mónica Lucía (2015). Perfil lipídico de micro-
algas antárticas recolectadas en Febrero 2013 en el Ar-
chipiélago Schetland del Sur. Trabajo de investigación
para optar por el grado de Químico de Alimentos. Ca-
rrera de Química de Alimentos. Quito: UCE. p. 111
iii
DEDICATORIA
Con mucho cariño a mi madre, por haber sido el soporte en mi camino.
iv
AGRADECIMIENTOS
Mi más sincero agradecimiento a mi madre y a mi hermana que con su amor me dieron compresión
y apoyo durante mi vida. Me ayudaron a ser quien soy y a comprender el valor de la familia.
A mis abuelitos que siempre viven en mi recuerdo con el de mi padre; junto a sus sabias enseñanzas
comprendí el valor de la familia.
A mis compañeros y amigos, que sin ellos el paso por la Universidad no hubiese sido igual: Anita,
María, Nathy, Gaby, Jeanneth, Caro, Jhonny, gracias por su apoyo. A Inti gracias por su paciencia y
comprensión.
Mi gratitud especial y sincera al Quim. Ronny Flores PhD. Y al Dr. Iván Tapia por su ayuda, sus
valiosos consejos, y decidida colaboración en este proyecto, además a tres damas ejemplares las
doctoras Martha Suarez, Ana María Hidalgo y la Ing. Denisse Molina.
Al Instituto Antártico Ecuatoriano por su inmesurable soporte a las investigaciones antárticas, que
apoyó con la recolección de las muestras utilizadas en el presente trabajo y me permitió formar parte
de la XIX Expedición Ecuatoriana a la Antártida.
A los laboratorios de Análisis de Alimentos del OSP y de Química Orgánica de la Facultad de Cien-
cias Químicas por la ayuda incondicional para utilizar sus instalaciones y equipos durante la realiza-
ción de la parte experimental de mi investigación.
Y a Dios, que ha puesto en mi camino experiencias buenas y malas que me han formado mi carácter,
y que gracias a su generosidad me encuentro en esta etapa de mi vida.
v
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentada por el señorita Mónica Lucía Salas Cando para
optar por el título profesional de Químico de Alimentos cuyo tema es; “Perfil lipídico de microalgas an-
tárticas recolectadas en Febrero 2013 en el Archipiélago Schetland del Sur.” Considero que dicho Trabajo
reúne los requerimientos, y los méritos suficientes para ser sometida a evaluación por el tribunal califica-
dor.
En la ciudad de Quito, a los 13 días del mes de Marzo del 2014
Firma del Tutor
_____________________
Flores Ortega Ronny Adrián
1709556367
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AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo Mónica Lucía Salas Cando, en calidad de autora del trabajo de investigación realizado sobre
“Perfil lipídico de microalgas antárticas recolectadas en febrero 2013 en el Archipiélago Schetland
del Sur.”, autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los con-
tenidos que me pertenecen o de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán
vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 de la Ley de
Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Quito, a los 13 días del mes de marzo de 2015
Mónica Lucía Salas Cando
C.I. 171851615-4
vii
INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR DE LA TESIS
Quito, 13 de Marzo del 2015
Señora
Isabel Fierro
DECANA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Presente
Señora Decana:
El Tribunal encargado de calificar la Tesis: “Perfil Lipídico de microalgas antárticas recolectadas en
Febrero del 2013 en el Archipiélago Schetland del Sur” presentada por: Mónica Lucía Salas Cando,
estudiante de la Carrera de: Química de Alimentos, luego del estudio y revisión correspondiente,
resolvió:
viii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación se llevó a cabo en la Facultad de Ciencias Químicas con ayuda y colabo-
ración de los Laboratorios de Química Ambiental, Química Orgánica, Análisis Instrumental y Aná-
lisis de Alimentos del OSP. Las microalgas antárticas que se analizaron fueron tomadas durante la
XVI Expedición Ecuatoriana a la Antártida en los meses de febrero y marzo del año 2013.
Esta investigación forma parte del proyecto T-10-13: EVALUACIÓN DE ALGAS PSICRÓFILAS
ANTÁRTICAS COMO POSIBLE FUENTE DE ENERGÍA RENOVABLE, que se ejecuta con el
apoyo del Instituto Antártico Ecuatoriano.
ix
ÍNDICE CONTENIDO
pág.
1 INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1
1.1 Planteamiento del problema ............................................................................................... 1
1.2 Formulación del problema ................................................................................................. 3
1.3 Hipótesis de trabajo ............................................................................................................ 3
1.4 Objetivos de la investigación ............................................................................................. 3
1.4.1 Objetivo general ......................................................................................................... 3
1.4.2 Objetivos específicos .................................................................................................. 3
1.5 Importancia y justificación de la investigación .................................................................. 4
2 MARCO TEÓRICO ....................................................................................................................... 7
2.1 Antecedentes ............................................................................................................................ 7
2.2 Fundamento Teórico .......................................................................................................... 8
2.2.1 Microalgas .................................................................................................................. 8
2.2.2 Flora autóctona antártica .......................................................................................... 15
2.2.3 Lípidos ...................................................................................................................... 17
2.2.4 Métodos de extracción de lípidos ............................................................................. 20
2.2.5 Disrupción celular .................................................................................................... 25
2.2.6 Biocombustibles ....................................................................................................... 27
2.2.7 Análisis Cromatográfico .......................................................................................... 29
2.3 Fundamento legal ............................................................................................................. 30
3 METODOLOGÍA ........................................................................................................................ 33
3.1 Tipo de investigación ....................................................................................................... 33
3.2 Población y muestra .......................................................................................................... 33
3.3 Diseño experimental ......................................................................................................... 34
x
3.3.1 Análisis de Varianza ................................................................................................. 36
3.3.2 Prueba Tukey............................................................................................................ 36
3.3.3 Prueba Dunnett ......................................................................................................... 38
3.4 Materiales y métodos ....................................................................................................... 39
3.4.1 Producción de consorcio de microalgas ................................................................... 39
3.4.2 Cosecha de biomasa ................................................................................................. 39
3.4.3 Métodos de Disrupción ............................................................................................ 41
3.4.4 Métodos de extracción ............................................................................................. 43
3.4.5 Análisis gravimétrico ............................................................................................... 48
3.4.6 Método de Metilación .............................................................................................. 48
3.4.7 Método para el análisis cromatográfico ................................................................... 50
3.4.8 Tratamiento de microalgas ....................................................................................... 50
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................. 51
4.1 Evaluación de métodos de disrupción .............................................................................. 51
4.2 Análisis del porcentaje de lípidos extraídos ..................................................................... 52
4.3 Análisis Estadístico .......................................................................................................... 54
4.3.1 Análisis de varianza ................................................................................................. 54
4.3.2 Prueba Tukey............................................................................................................ 55
4.4 Análisis cualitativo de ácidos grasos ................................................................................ 57
4.5 Análisis cuantitativo de ácidos grasos .............................................................................. 60
4.6 Comparación de un aceite de cocina usado con aceite de microalgas.............................. 66
4.7 Perfil lipídico de microalgas antárticas ............................................................................ 69
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................... 75
5.1 Conclusiones .................................................................................................................... 75
5.2 Recomendaciones ............................................................................................................. 76
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 77
xi
ANEXOS.......................................................................................................................................... 81
Anexo 1. Tablas de requisitos para biocombustibles ................................................................... 81
Anexo 2. Sitios de muestreo ......................................................................................................... 84
Anexo 3. Medio de cultivo M1 modificado ................................................................................. 85
Anexo 4. Fotobioreactor para masificación de microalgas .......................................................... 86
Anexo 5. Metodología .................................................................................................................. 87
Anexo 6. Tratamiento de datos experimentales ........................................................................... 91
Anexo 7 Cromatograma del estándar FAME C4-C24 de ácidos grasos ...................................... 92
Anexo 8. Cromatogramas de microalgas antárticas por el método B&D .................................... 93
Anexo 9. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Bligh & Dyer ........................... 96
Anexo 10. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Söxhlet con solvente hexano.. 98
Anexo 11. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Bligh & Dyer modificado .... 100
Anexo 12. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Söxhlet con éter ................... 102
Anexo 13. Valores críticos para la prueba de Tukey ................................................................. 105
Anexo 14. Tabla de valores críticos para la prueba de Dunnett ................................................. 106
Anexo 15. Diferencias significativas Prueba Tukey .................................................................. 107
Anexo 16 Abreviaturas............................................................................................................... 109
Anexo 17 Certificado de Traducción del resumen por un experto en el idioma ........................ 110
xii
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 2.1 División de migroalgas y sus características .................................................................... 10
Tabla 2.2 Porcentaje de aceite presente en diferentes especies de microalgas................................. 11
Tabla 2.3 Composición lipídica de Chlorella sorokiniana en diferentes medios de cultivo............ 14
Tabla 2.4 Géneros encontrados en las muestras de microalgas antárticas ....................................... 15
Tabla 2.5 Ácidos grasos más comunes ............................................................................................. 18
Tabla 2.6 Propiedades físicas de algunos solventes ......................................................................... 21
Tabla 2.7 Solventes utilizados en el método Söxhlet ....................................................................... 22
Tabla 2.8 Comparación entre biocombustible de algas y diésel y valores estándar ASTM ............. 27
Tabla 2.9 Ácidos grasos y número de cetano ................................................................................... 28
Tabla 2.10 Requisitos biodiesel Norma de la Unión Europea y Norma Técnica Ecuatoriana ......... 32
Tabla 3.1 Código de las muestras y géneros de microalgas identificadas ........................................ 34
Tabla 3.2 Diseño experimental factorial AxB completamente al azar ............................................. 35
Tabla 3.3 ANOVA del diseño factorial de dos factores AxB con tres réplicas ............................... 37
Tabla 3.4 Adaptación de géneros del Consorcio 13IGa2 ................................................................. 39
Tabla 3.5 Materiales para la cosecha de microalgas ........................................................................ 40
Tabla 3.6 Condiciones del equipo microonda para el método de disrupción ................................... 41
Tabla 3.7 Materiales para los métodos de disrupción ...................................................................... 42
Tabla 3.8 Materiales para el método Bligh & Dyer ......................................................................... 45
Tabla 3.9 Materiales para el método Söxhlet ................................................................................... 46
Tabla 3.10 Materiales para el Método Bligh & Dyer modificado .................................................... 48
Tabla 3.11 Materiales para el método de metilación ........................................................................ 48
Tabla 4.1 Evaluación de métodos de disrupción .............................................................................. 51
Tabla 4.2 Análisis de varianza porcentaje de lípidos peso seco. ...................................................... 54
xiii
Tabla 4.3 Categorización de métodos de extracción y disrupción ................................................... 55
Tabla 4.4 Métodos de extracción con o sin calor ............................................................................. 57
Tabla 4.5 Análisis cualitativo de ácidos grasos del consorcio 13IGa2 ............................................ 58
Tabla 4.6 Comparación del porcentaje de ácidos grasos en perfil lipídico de Chlorella sp. ........... 60
Tabla 4.7 Perfil lipídico del consorcio 13IGa2 con diferentes métodos de extracción y disrupción,
datos promedio ................................................................................................................................. 62
Tabla 4.8 Diferencia de medias de % de ácido oleico entre aceite del consorcio de microalgas
13IGa2 y aceite vegetal usado .......................................................................................................... 69
Tabla 4.9 Perfil lipídico de los consorcios de microalgas antárticas ................................................ 70
LISTA DE FIGURAS
Figura 1-1 Balance de producción y consumo de combustibles líquidos en el mundo y proyección
para el 2014. Tomado de: (EIA, 2013) ............................................................................................... 2
Figura 1-2 Demanda de derivados de petróleo en Ecuador (2011- 2012). Tomado de: (Banco
Central del Ecuador, 2013)................................................................................................................. 2
Figura 2-1 Fotografía microscópica de diferentes especies de microalgas utilizadas para síntesis de
biodiesel. Tomado de: (Loera-Quezada & Olguín, 2010) .................................................................. 9
Figura 2-2 Lipogénesis. Tomado de: (Voet, Voet, & Pratt, 2007) ................................................... 12
Figura 2-3 Esquema de biosíntesis de lípidos en una célula eucariota. ............................................ 13
Figura 2-4 Producción de energía a partir de biomasa microalgal. Tomado de (Gouveia, 2011) .... 14
Figura 2-5 Microalgas antárticas en un ambiente natural de nieve. ................................................. 15
Figura 2-6 Moléculas de (a) ácido oleico y (b) glicerol ................................................................... 17
Figura 2-7 Palmitato de miricilo (cera de abeja) .............................................................................. 19
Figura 2-8 Molécula de isopreno ..................................................................................................... 19
Figura 2-9 Fosfatidilcolina A: grupo fosfato, B: colina, C y D son ácidos grasos enlazados a la
molécula de glicerol central. ............................................................................................................ 19
Figura 2-10 Fitoesterol B- sitoesterol ............................................................................................... 20
Figura 2-11 Equipo de extracción Söxhlet ....................................................................................... 23
Figura 2-12 Equipo de extracción de lípidos por arrastre de vapor. ................................................ 25
xiv
Figura 2-13 Efecto de agentes químicos en microalgas. a) Scenedesmus sp, b) Navícula sp, c)
Solución NaOH, d) Solución de HCl. Tomado de: (Sarmiento & Amaya, 2010)............................ 26
Figura 2-14 Cámara Neubauer ......................................................................................................... 27
Figura 2-15 Esquema de un cromatógrafo de gases ......................................................................... 29
Figura 2-16 Esquema de derivatización de Lípidos ......................................................................... 30
Figura 3-1 Esquema de bloques para la preparación de muestras………………………………….40
Figura 3-2 Esquema métodos de disrupción celular ........................ ¡Error! Marcador no definido.
Figura 3-3 Diagrama de Bloques para el método de extracción Bligh & Dyer................................ 44
Figura 3-4 Diagrama de Bloques para el Método Söxhlet ............................................................... 45
Figura 3-5 Diagrama de Bloques para el Método Bligh & Dyer modificado ................................. 47
Figura 3-6 Diagrama de Bloques del Método de metilación ............................................................ 49
Figura 4-1 Microalgas después del método de disrupción a) HCl 0,5M b) microonda, c) autoclave
.......................................................................................................................................................... 52
Figura 4-2 Porcentaje de lípidos obtenidos en biomasa seca con diferentes métodos de disrupción
celular y extracción. Barras de error corresponden a una desviación estándar de tres repeticiones. 53
Figura 4-3 Cromatogramas de lípidos del consorcio de microalgas 13IGa2 con disrupción por
autoclave y diferentes métodos de extracción. ................................................................................. 60
Figura 4-4 Cromatogramas de lípidos del consorcio de microalgas 13IGa2 extraídos con el método
Bligh & Dyer modificado y diferentes técnicas de disrupción......................................................... 61
Figura 4-5 Porcentaje, en peso seco, de grupos de ácidos grasos del consorcio 13IGa2 con
diferentes métodos de extracción y disrupción. ............................................................................... 63
Figura 4-6 Ácidos grasos más representativos presentes en el aceite del consorcio 13IGa2 según
métodos de extracción y disrupción ................................................................................................. 64
Figura 4-7 Ácidos grasos más representativos presentes en el aceite del consorcio 13IGa2, según
métodos de extracción y disrupción, en porcentaje del aceite extraído ........................................... 66
Figura 4-8 Perfil lipídico de aceite vegetal ...................................................................................... 67
Figura 4-9 Comparación de perfiles lipídicos entre aceite usado y el consorcio 13IGa2 cultivado en
laboratorio, con diferentes métodos de disrupción-extracción. ........................................................ 68
Figura 4-10 Ácidos grasos de las muestras de microalgas antárticas ............................................... 71
xv
Figura 4-11 Comparación de perfiles lipídicos entre aceite usado y aceite de microalgas antárticas
para los tres principales ácidos grasos. ............................................................................................. 73
Figura 5.1 Métodos de disrupción………………………………………………………………….87
Figura 5.2 Método de extracción Bligh & Dyer ............................................................................... 88
Figura 5.3 Método de extracción Söxhlet ........................................................................................ 89
Figura 5.4 Metilación ....................................................................................................................... 90
Figura 7.1 Cromatograma de estándar ............................................................................................. 92
Figura 7.2 Cromatograma de estándar proveedor ............................................................................ 92
Figura 8.1 Cromatograma de microalga antártica consorcio13IGf2 ................................................ 93
Figura 8.2 Cromatograma de microalga antártica consorcio13ITe1 ................................................ 93
Figura 8.3 Cromatograma de microalga antártica consorcio 13IDa1 ............................................... 94
Figura 8.4 Cromatograma de microalga antártica consorcio 13IBa2 ............................................... 94
Figura 8.5 Cromatogma de microalga antártica consorcio:13IDa2.................................................. 95
Figura 8.6 Cromatograma de microalga antártica consorcio13nIDa3 .............................................. 95
Figura 9.1 Cromatograma Método Bligh& Dyer sin disrupción ..................................................... 96
Figura 9.2 Cromatograma Método Bligh& Dyer junto a Solución de HCl 0,5M ........................... 96
Figura 9.3 Cromatograma Método Bligh& Dyer junto a Autoclave (método Organosólvico) ........ 97
Figura 9.4 Cromatograma Método Bligh& Dyer junto a Microonda ............................................... 97
Figura 10.1 Cromatograma Método Söxhlet con Hexano junto con Solución HCl 0,5M ............... 98
Figura 10.2 Cromatograma Método Söxhlet con Hexano sin disrupción ....................................... 98
Figura 10.3 Cromatograma Método Söxhlet con Hexano junto con autoclave ............................... 99
Figura 10.4 Cromatograma Método Söxhlet con Hexano junto con microonda .............................. 99
Figura 11.1 Cromatograma método Bligh & Dyer modificado junto con HCl 0,5 M ................... 100
Figura 11.2 Cromatograma método Bligh & Dyer modificado sin disrupción .............................. 100
Figura 11.3 Cromatograma método Bligh & Dyer modificado Autoclave (Organosólvico) ......... 101
Figura 11.4 Cromatograma método Bligh & Dyer modificado y microonda ............................... 101
Figura 12.1 Cromatograma método Söhlet con éter y solución de HCl 0,5 M .............................. 102
xvi
Figura 12.2 Cromatograma método Söhlet con éter sin disrupción ............................................... 102
Figura 12.3 Cromatograma método Söhlet con y Autoclave (Organosólvico) ............................. 103
Figura 12.4 Cromatograma método Söhlet con éter y microonda.................................................. 103
Figura 12.5 Cromatograma Aceite usado ....................................................................................... 104
xvii
RESUMEN DOCUMENTAL
En febrero de 2013 se recolectaron muestras de microalgas en diferentes islas del Archipiélago
Shetland del Sur en la Antártida con el propósito de evaluar su capacidad de producir lípidos ade-
cuados para la síntesis de biodiesel. Debido al clima adverso de la Antártida, las microalgas sintetizan
mayor cantidad de ácidos grasos para utilizarlos como reserva de energía. Para seleccionar el mejor
método de disrupción y extracción de lípidos se trabajó con el consorcio de microalgas antárticas
13IGa2, conformado por Chrorella sp., adaptado y masificado en el laboratorio. Como técnicas de
disrupción celular se probaron el uso de microondas, autoclave y una solución ácida de HCl 0,5 M.
Los métodos de extracción ensayados fueron dos con uso de calor externo: Söxhlet con los solventes
hexano y éter y dos sin uso de calor: Bligh &Dyer, que emplea una mezcla cloroformo/metanol, y
Bligh & Dyer modificado con isopropanol/hexano. Se encontró que la combinación del método de
disrupción con autoclave junto con Bligh & Dyer produjeron el mayor porcentaje de lípidos extraídos
(7.96% peso seco). Al aplicar juntos métodos de extracción con métodos de disrupción se optimiza
el porcentaje de lípidos producidos. El perfil lipídico del aceite obtenido se realizó por cromatografía
de gases. El mejor consorcio de microalgas para la extracción de aceite para la síntesis de biocom-
bustible, por su composición de ácidos grasos, fue 13IGf2, recolectado en Punta Figueroa de la Isla
Greenwich. El consorcio está conformado por los géneros Nitzchia, Navícula, Surirella, Pinnaluria,
Chlorococcum, Gomphonema, Chlorella y Haematococcus y sobresale la producción de los ácidos
palmítico, oléico, mirístico, linoléico, araquídico, esteárico, linoleico, palmitoléico, linoleaídico y
behémico. El porcentaje total de lípidos extraídos del consorcio fue de 8,89% en peso seco, con el
método de Bligh & Dyer. Pudo concluirse que la composición lipídica del aceite de las microalgas
antárticas depende de la especie y de las condiciones ambientales donde se desarrollaron, además de
los métodos de extracción utilizados.
PALABRAS CLAVES:
ACEITE, ANTÁRTIDA, BIODIESEL, MICROALGAS, PERFIL LIPÍDICO.
xviii
ABSTRACT
In February 2013 microalgae samples were collected from different places at the South Shetland
Islands archipelago in Antarctica with the purpose to assess their ability to produce suitable lipids
for biodiesel synthesis. Due to adverse climate of Antarctica, microalgae synthesize larger amount
of fatty acids to be used as energy reserve. In order to select the best disruption and extraction method
of lipids, it was necessary to work with the Antarctic Microalgae 13IGa2 consortium which is made
of Chrorella sp., adapted and crowded in the laboratory. Cell disruption techniques such as the use
of microwave, autoclave and an acidic solution of HCI 0.5 M were tested. The extraction methods
were tested using two external heat: Soxhlet with hexane and ether solvents and two unused heat:
Bligh & Dyer, employing a chloroform / methanol mixture, and Bligh & Dyer modified with isopro-
panol / hexane. It was found that the combination of autoclave disruption method along with Bligh
& Dyer produced the highest percentage of extracted lipids (7.96% dry weight). By applying extrac-
tion methods together with disruption methods the produced lipid percentage is optimized. The lipid
profile of the resulting oil was performed by gas chromatography. Due to its fatty acid composition
the best microalgae consortium for oil extraction for biofuel synthesis was 13IGf2, which was gath-
ered in Punta Figueroa of Greenwich Island. The consortium is formed with the genera: Nitzschia,
Navicula, Surirella, Pinnaluria, Chlorococcum, Gomphonema, Chlorella and Haematococcus stand-
ing out the production of the following acids: palmitic, oleic, myristic, linoleic, arachidic, stearic,
linoleic, palmitoleic, linoelaidic and behenic. The total percentage of extracted lipids from the con-
sortium was 8.89% by dry weight, with the Bligh & Dyer method. It could be concluded that the
lipid composition of Antarctic microalgae oil depends on the species and environmental conditions
where they were grew, as well as the extraction methods employed.
KEYWORDS:
OIL, ANTARCTICA, BIODIESEL, MICROALGAE, LIPID PROFILE.
1
CAPÍTULO I
1. INTRODUCCIÓN bbbbb
1.1 Planteamiento del problema
El consumo de combustibles fósiles a nivel mundial es muy elevado según los datos registrados en
las Estadísticas Oficiales del Gobierno de Estados Unidos por la Energy Information Administration
(EIA, 2013). En los últimos cinco años el consumo de crudo ha sido siete veces mayor que la pro-
ducción mundial, esto genera un grave problema para las economías emergentes, como la nuestra,
que dependen en gran medida de la producción y exportación de crudo y de sus derivados. Por con-
secuente la dependencia ha generado riqueza y crisis económica, el costo de un barril pasó de 91,66
US Dólares en enero de 2014, a 105,37 US Dólares, sin embargo desde junio 2014 el precio cayó
más de un 50% como resultado de un exceso de suministros, debido principalmente a un enorme
aumento en la producción de petróleo de esquisto estadounidense y una menor demanda global, sin
embargo los bajos precios pueden aumentar la demande y la variación de usos de los derivados.
(Zhdannikov, 2015).
La Organización de Países Exportadores de Petróleo (OPEP) en su informe “Previsiones Mundiales
del Petróleo” asegura que el incremento del consumo de petróleo aumentará en un 22% hasta el 2035,
debido principalmente al consumo de combustibles en China y la India para uso en medios de trans-
porte (EFE, 2013).El Banco Mundial ha realizado un estudio general sobre el balance de producción
y consumo mundial de petróleo y la proyección de la producción mundial que es necesaria para evitar
un desequilibrio en la economía mundial (Figura 1-1). En donde se muestra que para satisfacer la
demanda actual, la producción de combustibles debe aumentar, haciendo de esto un círculo vicioso
con graves consecuencias medioambientales.
En el Ecuador, según las cifras del Banco Mundial, en el 2010 el 87,9% de la energía provino de
combustibles fósiles, con una tendencia a elevarse (Banco Mundial 2013), la economía del país de-
pende mayoritariamente de la exportación de crudo y la demanda mensual de derivados supera los
7000 millones de barriles de petróleo según los datos del Banco Central del Ecuador en los años
2012y 2013 (Figura 1-2). El petróleo es un recurso no renovable, su extracción y uso están relacio-
nados con la invasión de áreas protegidas, derrames de crudo y contaminación ambiental. En los
últimos 200 años, la quema de combustibles fósiles, la deforestación y otras actividades humanas
han provocado un aumento considerable en la concentración del dióxido de carbono atmosférico
desde 280 ppm hasta 392 ppm, un incremento del 40%” (Serrano, 2012). Es importante disminuir
2
paulatinamente el uso de este recurso, para lo cual es necesario identificar alternativas amigables con
el planeta (Banco Mundial, 2013).
Figura 1-1 Balance de producción y consumo de combustibles líquidos en el mundo y pro-
yección para el 2014. Tomado de: (EIA, 2013)
Figura 1-2 Demanda de derivados de petróleo en Ecuador (2012- 2013). Tomado de: (Banco
Central del Ecuador, 2014)
3
Encontrar nuevas fuentes alternativas de petróleo es un reto para la humanidad, pues éstas deben
satisfacer la demanda del consumidor, ser altamente eficientes y eficaces para competir con el co-
mercio actual. Por tal motivo, deben sustentarse en continuos análisis y estudios para optimizar la
producción y obtener los mejores resultados posibles. El primer paso es la búsqueda y caracterización
de la materia prima adecuada y los métodos para obtener los combustibles alternativos, que algún
día podrán disminuir la dependencia del petróleo.
El proyecto emprendido entre la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecua-
dor y el Instituto Antártico Ecuatoriano con su Estación Pedro Vicente Maldonado en la Antártida,
brindará la oportunidad de analizar la micro flora antártica con expectativas hacia la obtención de
biocombustibles a partir de la fracción lipídica de las microalgas.
1.2 Formulación del problema
¿De cuál consorcio de microalgas antárticas recolectados en febrero del 2013 se obtiene mejor ren-
dimiento en la extracción de lípidos y cuál es la composición lipídica de los mismos?
1.3 Hipótesis de trabajo
Utilizando cromatografía de gases puede identificarse la composición lipídica de los consorcios de
microalgas antárticas recolectadas en febrero del 2013.
1.4 Objetivos de la investigación
1.4.1 Objetivo general
- Caracterizar el extracto lipídico de muestras de microalgas antárticas, recolectadas en febrero
de 2013 en el Archipiélago Shetland del Sur, mediante cromatografía de gases para obtener
los respectivos perfiles lipídicos.
1.4.2 Objetivos específicos
- Determinar cuál de los métodos de disrupción celular: radiación con microondas, alta presión
y temperatura y digestión ácida, es el mejor para facilitar la extracción de lípidos de micro-
algas.
- Determinar entre los métodos Söxhlet, con dos diferentes solventes y Bligh & Dyer y Bligh
& Dyer modificado, cuál es el más adecuado para la extracción de lípidos en microalgas y
para el análisis de la composición lipídica.
4
- Desarrollar la técnica instrumental para el análisis de perfil lipídico mediante cromatografía
de gases.
- Establecer cuál es el mejor consorcio de las microalgas recolectadas para la obtención de
biodiesel.
1.5 Importancia y justificación de la investigación
El uso de petróleo y sus derivados producen altas emanaciones de dióxido de carbono, uno de los
gases de efecto invernadero, que junto con el metano y otros gases contaminantes como óxidos de
nitrógeno y azufre atrapan la radiación infrarroja evitando que se libere el calor de la tierra, retenién-
dolo en la atmósfera y produciendo el calentamiento global. Por esto motivo existe una tendencia
mundial para la producción de energía alternativa, que provenga de nuevas fuentes, y ayuden a re-
ducir el consumo de petróleo; y por lo tanto, las emanaciones de contaminantes atmosféricos y resi-
duos.
Entre las alternativas está la obtención de biodiesel, biogás y bioetanol a partir de biomasa. La bio-
masa es toda materia orgánica proveniente de un proceso biológico, como los residuos de madera,
papel, basura y aceites, que pueden ser aprovechados como fuente renovable de energía.
Se llama biodiesel a los ésteres metílicos de ácidos grasos originados de aceites vegetales y grasas
animales. En la actualidad, se produce industrialmente de aceite vegetal, como soya o colza y de
desechos de aceites comestibles. El biodiesel no posee azufre y al quemarse reduce la producción de
cenizas, partículas, CO y óxidos de azufre en comparación con el diésel.
Los aceites de plantas y semillas, tales como la palma, usados para obtener biocombustibles pueden
llegar a reemplazar al diésel derivado del petróleo; sin embargo, las plantaciones necesarias para
satisfacer la producción serían muy extensas, pudiendo llegar a desalojar inclusive al sector alimen-
tario; además, el tiempo necesario para empezar la cosecha y recolección con resultados convenientes
varía entre cinco y seis años. La optimización del espacio para la producción de aceite para síntesis
de biodiesel ha inclinado el estudio hacia las microalgas, donde se puede obtener mayor materia
prima en menor tiempo y espacio.
Existen, además, otras ventajas del uso de biocombustibles a partir de microalgas como la elevada
fotoconversión (aproximadamente 3-8% contra 0,5% de las plantas terrestres) lo que representa más
biomasa por hectárea y una tasa de crecimiento de una a tres duplicaciones por día (Gouveia, 2011).
El rendimiento, según su metabolismo, puede ser optimizado de acuerdo al medio de cultivo, siendo
capaces de crecer durante todo el año y cultivarse en regiones áridas, pues no compiten por suelo o
5
agua. Uno de los gases responsables de la contaminación atmosférica, el CO2, es su principal nu-
triente.
La producción de algas no requiere pesticidas o herbicidas, lo que provoca menos desechos conta-
minantes, y se adaptan fácilmente a varios niveles de operación y tecnología. Además, la biomasa
residual puede ser utilizada para la producción de energía por gasificación con una mayor ventaja al
poder almacenar el gas producido o por combustión directa (Jaramillo, Ramírez, Cardona, & Gil-
Villegas, 2011).
Las microalgas son consideradas como una alternativa eficiente y eficaz para la obtención de aceite,
pues su producción no consume mucho espacio, necesitan un mínimo de energía para su crecimiento,
utilizan el CO2 atmosférico y una mínima cantidad de nutrientes en un medio de cultivo líquido. Las
microalgas se pueden cosechar en aproximadamente cada 21 días y el tiempo de extracción de aceites
se disminuye considerablemente proporcionando ventajas únicas para mejorar la industria de biodie-
sel. Estos organismos tienen un rendimiento de aceite mucho mayor que cualquier cultivo conven-
cional y pueden ser cultivadas en agua de mar, agua salobre o en agua residuales, disminuyendo así
la presión sobre el agua dulce requerida para la producción de alimentos (Figura 1-3) (Loera-Quezada
& Olguín, 2010).
Figura 1-3 Productividad de aceite de diferentes fuentes. Tomado de: (Loera-Quezada
& Olguín, 2010)
6
De las características del aceite empleado dependerá la calidad del biodiesel producido y el rendi-
miento frente a la combustión. La selección de la materia prima es un paso importante para la elabo-
ración de un producto de calidad que cumpla los estándares establecidos y satisfaga la demanda de
insumos amigables con el ambiente.
El aumento de la actividad científica y turística en la Antártida ha provocado un incremento en el
consumo de combustibles fósiles que contaminan su ambiente. Una alternativa ecológica para el
Continente Blanco es reemplazar el diésel en los generadores de corriente eléctrica o en la maquinaria
en general donde se lo emplea por un combustible ecológico renovable. Este combustible puede ser
biodiesel obtenido de algas. La ventaja de utilizar algas antárticas como fuente de aceite es su adap-
tación al medio lo que facilitaría su reproducción en el sitio. El estudio de algas antárticas como
fuente de aceite es escaso y se desconocen las condiciones de producción.
La sociedad actual va tomando conciencia de la problemática mundial sobre la contaminación am-
biental y entiende la importancia de la disminución del consumo de combustibles fósiles provenien-
tes de fuentes no renovables, por lo que es imprescindible brindar alternativas propias con estudios
realizados en el país.
El Gobierno ecuatoriano apoya el desarrollo de energías alternativas renovables a través del Minis-
terio de Energías Renovables y su Subsecretaría de Energía Renovable y Eficiencia Energética,
donde se encuentra la Dirección de Biomasa y Cogeneración. Esta Dirección desarrolla estudios y
proyectos que promueven el uso de la biomasa en los diferentes sectores del país, como el aprove-
chamiento de residuos orgánicos y residuos sólidos urbanos.
7
CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICObbbbb
2.1 Antecedentes
Serrano (2012), de la Universidad Nacional de Colombia, realizó un estudio de cuatro cepas nativas
de microalgas (Scenedesmus ovalternus, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis sp. y Isochysis sp.)
para evaluar su potencial uso en la producción de biodiesel. Optimizando las condiciones de creci-
miento se alcanzó un 32,7± 1,4% mg.L-1.día-1 de lípidos con el método de extracción de Bligh &
Dyer para la especie Chrolella sp. Se obtuvo la mejor cepa para la producción del biocombustible,
se analizó el contenido y composición de lípidos para evaluar su potencial en la producción de bio-
diesel, las condiciones de cultivo en el laboratorio y la rentabilidad. El experimento se realizó a
24±2°C y fotoperiodo de 18:6 con lámparas fluorescentes. La biomasa se rompió mediante sonica-
ción y se extrajo el material lipídico con el método de Bligh & Dyer a partir de los 12 días de cultivo.
El análisis cromatográfico del aceite extraído a partir de microalgas es una herramienta importante
para determinar el mejor perfil lipídico, el consorcio o medio de cultivo ideales para la producción
de aceite y la síntesis posterior de biocombustible. La investigación del “Crecimiento y perfil bio-
químico de Chaetoceros muelleri cultivada en sistemas discontinuos y semicontinuos” muestra una
comparación y evaluación entre distintas condiciones de crecimiento y el desarrollo microalgal (Le-
mus, Urbano, Arredondo-Vega, Guevara, Vásquez, Carreón-Palau, & Vallejo, 2006)
Por otro parte, la comparación entre especies de algas es otro punto a consideración, para esto los
cultivos deben utilizar la misma metodología, manteniendo condiciones óptimas para cada especie
como pH, concentración de nitrógeno, intensidad lumínica y temperatura, reduciendo así las varia-
bles para que los resultados puedan ser comparables, como en los estudios “Obtención y comparación
de los aceites obtenidos de las microalgas Dunaliella salina y Chrlorella nativa como materia prima
para la producción de biodiesel” (Castillo, Henao, & Tejada, 2011), y “Evaluación del pH y concen-
tración de nitrógeno en el cultivo de las microalgas Dunaliella salina y Chlorella nativa como fuente
de aceite vegetal para la producción de biodiesel” (Alvear, Castillo, & Henao, 2011).
Países como Argentina cuentan con legislación para el uso de un porcentaje de biocombustible en el
diésel de consumo. La ley 26.093, sancionada en el año 2006, estableció que a todo combustible que
se comercialice en territorio argentino debe incorporarse un porcentaje de biocombustible. En el ar-
tículo científico “Modelo de producción de biodiesel a partir de algas en Argentina” se analizan
distintos factores para la producción de biomasa y biodiesel y los costos que permiten seleccionar las
variedades de algas óptimas para llegar a posicionarse al nivel de otras fuentes de biodiesel explota-
das en ese país (Navarrete, Demarco, Maimbil & Romera, 2013).
8
Sin embargo, la tecnología para la producción de biodiesel a escala comercial y de manera rentable,
aún enfrenta grandes retos como la selección de cepas con mayores productividades de biomasa y de
lípidos, mejores perfiles lipídicos y mejor adaptabilidad a condiciones de cultivo a gran escala, una
característica importante para su uso bajo condiciones extremas (Loera-Quezada & Olguín, 2010).
El biodiesel producido por aceite de algas psicrófilas, rico en ácidos grasos poliinsaturados, se espera
que tenga un punto de gelificación bajo y que no aumente su viscosidad a bajas temperaturas (Cid-
Agüero, 2008).
En la región Austral de Chile, en la Universidad de Magallanes, se han realizado varias investigacio-
nes con respecto a la producción de biocombustibles, entre las que destaca la Tesis para obtener el
título de Ingeniero Civil en Química de Pamela Cárdenas, titulada “Biodiesel a partir de microalgas
antárticas: Estudio de parámetros de crecimiento de éstas.” Se evidenció que temperaturas menores
a 12° C, intensidad de luz de 250 Lux y un soporte de piedras blancas favorecen el crecimiento de
las microalgas estudiadas. Además, en la tesis se justifica la importancia de la ejecución de esta
alternativa para la economía chilena. A partir del 2010, la Corporación de Fomento a la Producción
de Chile (CORFO) entregó a tres consorcios, Desert Bioenergy, Alga Fuels y Bal Biofuels y algunas
universidades, el desarrollo de proyectos de biocombustibles de segunda generación con algas mari-
nas, con una inversión de 31,6 millones de dólares (Cárdenas, 2010).
Para que la obtención de biocombustible a partir de microalgas este adecuadamente sustentado, es
necesario un análisis económico. En el “Estudio técnico económico de la extracción de los lípidos
de microalgas para la producción de biodiesel”, se señala que el cultivo de microalgas presenta mu-
chas ventajas con respecto a los cultivos terrestres, ya que tiene tasas de crecimiento y producción
de aceite por área, mucho mayor que los grandes cultivos terrestres, no requiere grandes superficies
para su producción, y no compite con cultivos alimenticios (Monthieu, 2010).
2.2 Fundamento Teórico
2.2.1 Microalgas
Las microalgas son microorganismos unicelulares filamentosos que forman colonias y cadenas en
simbiosis con otros microorganismos. Las microalgas pueden habitar en todo tipo de ambientes con
agua dulce, salada o en aguas contaminadas, además, pueden vivir adheridas a superficies y en el
suelo. Realizan todas las funciones vitales de forma independiente mediante la fotosíntesis.
Existe diversidad de formas y estructuras en las microalgas, las mismas que son capaces de bioacu-
mular en sus membranas gran cantidad de contaminantes, así como de producir lípidos, grasas, acei-
tes y pigmentos que resultan de gran importancia en la industria ambiental y alimenticia (Gavilanez,
Morales, & Molina, 2013). Por ejemplo:
9
Carotenoides (Dunaliella)
Astaxantina (Haematococcus, Chlamydomonas)
Luteina (Clorofitas)
Peridina (Dinoflagelados)
Fucoxantina (Algas pardas y diatomeas)
Ficobilinas
Clorofila
Xantofila
Además, acumulan metabolitos de reserva como almidones y glicerol. Un gran porcentaje de la masa
seca de las microalgas es proteína, en Spirulina, por ejemplo, un 65% del peso está constituido por
proteínas, mayoritariamente ficobili-proteínas, que contienen buenos niveles de todos los aminoáci-
dos, esencialmente cisteína y metionina (Garbisu, Blanco, Alkorta, Llama, & Serra, 1999). Se ha
encontrado, en promedio, entre las especies de microalgas: Microspora sp., Diatoms, Lyngbya sp.,
Cladophora sp., Spirogyra sp., y Rhizoclonium sp., 26,17% de carbohidratos, 46,4% de proteína y
17,53% de lípidos (Ahmad, Khan, & Yasar, 2012).
Las algas pueden ser cultivadas en sistemas cerrados como fotobiorreactores que optimizan las con-
diciones naturales para su crecimiento, manteniendo ciertos parámetros constantes. En los fotobio-
rreactores se pueden modificar algunos factores que alteran y mejoran la producción de lípidos, ob-
teniéndose un mayor rendimiento de esos metabolitos. En la Figura 2-1 se presentan varias especies
de microalgas que han sido estudiadas como fuentes de lípidos para biodiesel.
Figura 2-1 Fotografía microscópica de diferentes especies de microalgas utilizadas para sín-
tesis de biodiesel. Tomado de: (Loera-Quezada & Olguín, 2010)
Existen varias divisiones para las algas, la Tabla 2.1 engloba sus características más sobresalientes.
10
Tomado de: (Santamaría, García, & Roselló, 2010)
2.2.1.1 Características de las microalgas
Las algas que viven en aguas continentales son organismos planctónicos, también, pueden ser orga-
nismos bentónicos cianofitas que viven en el fondo marino. Las microalgas son organismos fotosin-
téticos que requieren de luz, un medio acuoso, nutrientes como N y P, además de factores de creci-
miento como metales y vitaminas. Las microalgas, como la mayoría de microorganismos, son capa-
ces de adaptarse y sobrevivir a diferentes condiciones incluyendo las más adversas y en lugares tan
inhóspitos para la vida humana como el continente antártico. Por su gran capacidad para adaptarse
son parte de uno de los grupos que domina la Tierra (Chen, Min, & Wang, 2009).
Una característica importante de muchas especies de microalgas es la síntesis de ácidos grasos y
otros compuestos lipídicos como material de reserva. Las condiciones ambientales influyen en las
características de estos compuestos, por lo que la composición de ácidos grasos de microalgas antár-
ticas es particular.
2.2.1.2 Síntesis de lípidos y metabolismo
Se ha reportado la producción de grandes cantidades de lípidos intracelulares en levaduras y bacte-
rias, sin embargo, el costo de producción es alto debido al volumen de oxígeno que estos microorga-
nismos requieren para su desarrollo y las condiciones y medios de cultivos para su crecimiento.
Tabla 2.1 División de migroalgas y sus características
División Morfología Pigmentos Reservas Pared
celular
Algas verdes
(chlorophyta)
Uni o pluricelulares, algu-
nas microscópicas; con 2
o más flagelos iguales
apicales o subapicales
Clorofilas a y b;
Carotenoides
Almidón Celulosa y
pectina
Algas pardas (phaeophyta)
Multicelulares y macros-
cópicas; dos flagelos late-
rales en las zoósporas
Clorofilas a y c;
Carotenoides
Laminaria y grasa Celulosa y
ácidos al-
guínicos
Algas rojas (rhodophyta)
Multicelulares y macros-
cópicas sin flagelo
Clorofilas a y d
en algunas; ca-
rotenoides y fi-
cobilinas
Almidón Celulosa y
Pectina
Algas marrón
doradas, dia-
tomeas
(chrysopyta)
Unicelulares y microscó-
picas; uno o dos flagelos
apicales iguales o de-
siguales
Clorofilas a y c;
Carotenoides
Crisolaminarina y
aceites
Compuestos
pécticos con
materiales
silíceos
Dinoflagela-
dos (pyrrop-
hyta)
Unicelulares y microscó-
picas, dos flagelos latera-
les
Clorofilas a y c;
Carotenoides
Almidón y aceites Sin pared
celular
Euglenoides (euglenophyta)
Unicelulares y microscó-
picas, de 1 a 3 flagelos la-
terales
Clorofilas a y b;
Carotenoides
Paramilón y acei-
tes
Sin pared
celular
11
Las microalgas se destacan, pues son microorganismos fotosintéticos que usan la luz solar como
fuente de energía, además, son organismos quimiolitotrofos; su fuente de carbono es el dióxido de
carbono presente en la atmósfera. Existen varias especies de microalgas con notable rendimiento de
lípidos como puede verse en la Tabla 2.2.
Tabla 2.2 Porcentaje de aceite presente en diferentes especies de
microalgas
Microalga Contenido de aceite
(% peso seco)
Botriococcus braunii 25- 75
Chaetoceros calcitrans 4,6-39,8
Chlorella emersonii 1
Chlorella protothecoides 25-63
Chlorella vulgaris 14, 6-57,8
Chlorella sp 10-48
Chlorococcum sp. 19, 3
Dunaliella sp 17,5-67
Dunaliella tertiolecta 16,5-71
Hemmatococcus pluvialis 25
Isochrysis galbana 7
Nannochloris sp 20-56
Nannochloropsis oculata 22,7-29,7
Nannochloropsis sp 12-53
Neochloris oleabundans 29-65
Pavlova lutheri 35,5
Phaeodactylum tricornutum 18-57
Porphyridium cruentum 18,3-60,7
Scenedesmus obliquus 9
Spirulina maxima 11-55
Tomado de (Serrano, 2012)
El metabolismo de los organismos fotosintéticos varía predominantemente, según los cambios de
temperatura y en especial de luz. La fase lumínica es la productora de energía a través de la fotosín-
tesis y, la principal fuente de carbono, que actúa como donador de electrones en el metabolismo
celular, es el dióxido de carbono, aunque se pueden incorporar otras. La célula lo utiliza para la
síntesis de compuestos estructurales y de reserva como ácidos grasos y lípidos. La eficiencia foto-
sintética es la fracción de energía lumínica que se fija como energía química en los cultivos fotoau-
tróficos. Solamente se captura una parte de la energía luminosa (42,3%), que corresponde al intervalo
de 400 a 700 nm del espectro electromagnético, esta energía lumínica se transforma a energía quí-
mica en moléculas como NADH y ATP que serán usadas en la fase oscura (Cárdenas, 2010).
En ausencia de luz, las células realizan un proceso llamado Ciclo de Calvin o Ciclo de las pentosas
fosfato reductoras, que son una serie de reacciones localizadas en el estroma del cloroplasto, de
donde, a partir de los productos fotosintéticos, se obtiene 3-fosfoglicerato (3PG) y de la reacción de
carboxilación de la pentosa ribulosa 5-fosfato (Ru5P), finalmente, se llega hasta piruvato con la en-
zima piruvato quinasa (Voet, Voet, & Pratt, 2007).
12
A partir de acetil-CoA, que proviene de la descarboxilación del piruvato, se forma el malonil-CoA,
este es transferido a la proteína transportadora del acilo (ACP, acyl carrier protein), para dar inicio
al primer ciclo de biosíntesis de ácidos grasos con la remoción del grupo cetona del beta-cetoacil-
ACP formado. Se da inicio al segundo ciclo de biosíntesis donde se adicionan grupos acetilos (2C)
que proviene del malonil-ACP para formar ácidos grasos de 16C. En la última vuelta se escinde el
grupo ACP, finalizando la síntesis como se muestra en el esquema de la Figura 2-2.
En una segunda etapa, se agregan nuevos residuos de acetato al palmitato por medio de elongasas,
además de la formación de triglicéridos, este proceso ocurre en el retículo endoplasmático liso (Fi-
gura 2-3). Las insaturaciones se producen por varias desaturasas, la primera ocurre entre los carbonos
C9-C10, dando como resultado los ácidos grasos palmitoleico y oleico, que son sustancias de reserva
para la célula (Madigan, Martinko, & Parker, 2003).
La síntesis de compuestos orgánicos a partir de CO2, agua y luz solar se muestra a continuación:
6𝐶𝑂2 + 6𝐻2𝑂 + ℎ𝜆 → 𝐶6𝐻12𝑂6 + 6𝑂2
Figura 2-2 Lipogénesis. Tomado de: (Voet, Voet, & Pratt, 2007)
13
Un máximo de 8 fotones, que poseen una energía de 218kJ/mol, son necesarios para obtener un mol
de carbohidrato y seis de oxígeno, todos estos productos son importantes, pues los fotosistemas o
complejos proteicos altamente especializados que mantienen viva a la célula fotosintética son ali-
mentados con electrones que provienen de la lisis del agua (Cárdenas, 2010).
Cada organismo adapta su metabolismo según el ambiente donde se desarrolla, y la mayor o menor
producción de metabolitos estará íntimamente relacionada con las condiciones de crecimiento de los
organismos. A pesar de que los lípidos son naturalmente producidos por las algas, se puede estimular
su producción, especialmente, cuando se las exponen a condiciones anóxicas, a bajas densidades de
nutrientes, como nitrógeno y fósforo, a variaciones de temperaturas o niveles de incidencia de luz
extremos (INTA, 2008).
Se han realizados varios análisis sobre la composición lipídica de microalgas, entre las más estudia-
das se encuentra el género Chlorella sp. En la Tabla 2.3 se muestra la variación del perfil lipídico
con diferentes medios de cultivos. Destacan los ácidos grasos oleico, linoleico, palmítico y linoleaí-
dico.
Figura 2-3 Esquema de biosíntesis de lípidos en una célula eucariota. Tomado de: (Garibay, Vázquez-Duhalt, Sánchez, Serrano, & Martínez, 2009)
14
Tabla 2.3 Composición lipídica de Chlorella sorokiniana en diferentes medios de cultivo Porcentaje de Ácidos grasos en fracción lipídica
Ácido Graso Medio TAP Medio BG 11 Medio BG 11+N Medio BG 11–N
Palmítico C16:0 17,14 23,24 16,73 16,85
Esteárico C18:0 0,34 2,58 2,41 0,21
Oleico C18:1 17,40 30,99 28,74 17,30
Linoleico C18:2 24,66 23,72 20,82 17,67
Linoleaidico C18:2 0 0 16,78 6,99
Linolenico C18:3 26,63 12,85 10,21 30,34
Tomado de: (Chadler, Mahmah, Chetehouna, & Mignolet, 2011)
2.2.1.3 Aplicaciones energéticas de las Microalgas
La tendencia internacional se encuentra actualmente dirigida a la producción de combustibles limpios
y renovables que puedan ser utilizados como aditivos de los combustibles provenientes de fuentes
fósiles. Así se ha iniciado la producción de etanol, biodiesel y metano, a partir de fuentes renovables
como los desechos agrícolas junto con el cultivo de microalgas. Estas últimas son usadas como ma-
teria prima para la obtención de energía, pues pueden seguirse varias vías de producción como se
muestra en la Figura 2-4.
Figura 2-4 Producción de energía a partir de biomasa microalgal. Tomado de (Gouveia, 2011)
Biomasa
Conversión Bioquímica
FermentaciónEtanol,
Acetona, Metanol
Digestión Aeróbica
Metano, Hidrógeno
Conversión termoquímica
Gasificación Gas
Pyrolisis Bioaceite
Licuefacción Bioaceite
Reacción
química
Transesterificación
Biodiesel
Combustión
DirectaGeneración Electricidad
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2.2.2 Flora autóctona antártica
La Antártida, el continente blanco, presenta durante todo el año condiciones extremas y antagónicas
a la vida; posee una riqueza única en aves, mamíferos, peces y crustáceos; su principal vegetación
son líquenes y algas que han llegado a adaptarse a esas condiciones, el hábitat de estas microalgas
son las aguas dulces y marinas, también, se desarrollan sobre la nieve y en deshielos.gu
Los géneros de microalgas encontrados en las muestras recolectadas en la Antártida y utilizadas para
la presente investigación, forman parte de tres clases principales como se muestra en la Tabla 2.4.
Tabla 2.4 Géneros encontrados en las muestras de microalgas antárticas
Bacillariophyceae Chlorophyceae Cyanophyceae
Navícula
Chlorella Oscillatoria
Coconeis Niztchia Chlorella Leptolyngbya
Cymbella Pinnularia Haematococcus Pseudoanabaena
Diatoma Surirellya Chlorococcum Oscillatoria
Gomphonema Synedra Pandorina
Hantzschia Stichococcus
Navicula Chlamydomona
Las microalgas que viven en la nieve y el hielo de la Antártida son visibles durante los meses de
noviembre a febrero, que corresponden a la Primavera y Verano Austral, cuando crecen muy rápida-
mente debido a las cantidades altas de luz del Sol y suministro de nutrientes, observándose en forma
de manchas de coloraciones verdes, amarillas y rojas (ver Fig. 2-5) (ASOCAE, 2011).
Figura 2-5 Microalgas antárticas en un ambiente natural de nieve.
Foto: M. Salas (2014)
16
2.2.2.1 Cyanophyceae (cianoficias)
La célula no tiene un núcleo claramente definido, no presenta una membrana nuclear discreta o nu-
cléolos, y no tienen flagelos, debido a la ficocianina que es una ficobiliproteína presentan color verde
azulado junto con clorofila a, carotenoides y xantofilas. Se Reproducen por división simple, por
fragmentación o por esporas no móviles (Santamaría, García, & Roselló, 2010).
2.2.2.2 Chlorophyceae (clorofíceas)
Son células flageladas y no flageladas, se reproducen por zoosporas flageladas o por aplanosporas
no móviles. Poseen clorofila a, b y algunos carotenos como xantofilas, luteína y violaxantina. Pueden
vivir en aguas dulces como saladas y en suelos húmedos, son conocidas como algas verdes, presentan
un núcleo bien definido con su respectiva membrana nuclear y una pared celular de celulosa.
Se reproducen de forma asexual a través de la división celular o de la formación de esporas (mitos-
poras en el caso de las especies no móviles y zoosporas en el caso de las especies móviles); y de
forma sexual por la unión de gametos; existen tres tipos: isogamia, anisogamia y oogamia.
2.2.2.3 Bacillariophyceae (bacilarioficeas)
Las diatomeas están entre las algas microscopias que más fácilmente se encuentran y reconocen, su
distintivo es la pared celular que está conformada por celulosa impregnada de una mezcla silícilica
por lo que forma una especie de caparazón a la que se le conoce como "frústulo" o "teca". La sílice
les da rigidez a las semitecas y genera en ellas patrones estriados que ayuda a diferenciar a las diato-
meas. En general, las diatomeas son organismos del reino de los protistas que presentan membrana
celular, cromatóforos, vacúolos y otros elementos. En las diatomeas, la clorofila está contenida en el
citoplasma, pero también presenta xantofila, carotina y fucoxantina cuyos pigmentos se combinan y
le dan su característico color (pardo-dorado).
El hábitat de las diatomeas se ubica en charcas de agua dulce o en los océanos en zonas cercanas a
la superficie donde existen en grandes cantidades, suelen formar colonias ramificadas y abundan en
tal cantidad que conforman el principal componente del plancton marino (Santamaría, García, &
Roselló, 2010).
Entre los géneros más abundantes de microalgas antárticas se hallan las diatomeas, dinoflagelados,
cianófitas, clorófitas, feófitas y rodófitas. Se las encuentra sobre la nieve o en deshielos, con una
gran variedad de formas, tamaños y estados de crecimiento. La Figura 2-5 muestra un consorcio de
algas verdes, en su mayoría Chorella sp., que en comparación con la Chorella continental, es más
17
pequeña; y microalgas rojizas como Hemaetococcus, que se muestra como una célula grande redonda
bajo el microscopio.
Cuando las temperaturas polares ascienden a 1,5-3°C en los meses más cálidos, por efecto del des-
hielo las microalgas que llegan al mar se convierten en un importante alimento de la cadena Trófica
de la región junto con el plancton y fitoplancton, en particular para el krill, que es a su vez alimento
principal para muchas ballenas, focas y pingüinos
2.2.3 Lípidos
Los lípidos son sustancias de origen biológico, formadas básicamente por carbono (C), hidrógeno
(H), oxígeno (O), y, además, de átomos como fósforo (P), nitrógeno (N) y azufre (S). Son insolubles
o muy poco solubles en agua y dadas sus características moleculares y composición estructural son
solubles en los solventes orgánicos como etanol, éter, cloroformo, benceno, acetona, entre otros.
La mayoría de lípidos provenientes de fuentes vegetales están compuestos de triglicéridos que se
encuentran formados por una molécula de glicerol (Figura 2-6) y tres moléculas de ácidos grasos,
estos pueden ser iguales o diferentes. Las propiedades físicas y químicas provienen de los tipos de
enlaces entre esas moléculas, la longitud de la cadena hidrocarbonada y las insaturaciones presentes.
Así por ejemplo, sí se encuentran ácidos grasos de cadena corta estos son más volátiles y ligeros, con
punto de ebullición bajos, mientras que los lípidos de cadena larga, presentan puntos de ebullición
relativamente altos. Además, la presencia y el número de dobles enlaces los hacen más reactivos y
aumentan su punto de fusión, ayudando a que se mantengan en estado líquido a bajas temperaturas.
La Tabla 2.5 presenta los ácidos grasos más comunes con el número de dobles enlaces y su punto de
fusión como propiedad física.
Figura 2-6 Moléculas de (a) ácido oleico y (b) glicerol
18
2.2.3.1 Grasas
Son ésteres de ácidos grasos saturados (sólo tienen enlaces simples entre los átomos de carbono) con
glicerol. Son ejemplos de este tipo de ácidos el palmítico con 16 átomos de C y el esteárico con 18
átomos de C, suelen ser sólidos a temperatura ambiente. Las grasas se forman por la esterificación
de tres ácidos grasos saturados con una molécula de glicerol.
Tabla 2.5 Ácidos grasos más comunes
Ácido Fórmula Punto de
fusión °C
Número de
carbonos
Caproico CH3-(CH2)4-COOH -1,5 C6:0
Caprílico CH3-(CH2)6-COOH 16,3 C8:0
Cáprico CH3-(CH2)8-COOH 31,4 C10:0
Laúrico CH3-(CH2)10-CH3 43,9 C12:0
Mirístico CH3-(CH2)12-COOH 53,9 C14:0
Palmítico CH3-(CH2)14-COOH 62,9 C16:0
Esteárico CH3-(CH2)16-COOH 69,6 C18:0
Araquídico CH3-(CH2)18-COOH 76,3 C20:0
Lignocérico CH3-(CH2)22-COOH 86 C24:0
Palmitoleico CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-COOH 0,5 C16:1
Oleico CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH 16 C18:1n9c
Linolénico CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-
CH=CH (CH2)7-COOH -11
C18:3 (C18:3n3)
(𝜔6, 3 𝑦 9)
γ- Linolénico CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-
CH-CH=CH (CH2)4-COOH -11 C18:3 (C18:3n3)
(𝜔6, 9 𝑦 12)
Linoleaidico CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-
CH=CH(CH2)7-COOH 28 C18:2 (C18:2n6t)
(𝜔6 𝑦 3)
Linoleico CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-
CH=CH(CH2)7-COOH -5
C18:2 (C18:2n6c)
(𝜔6 𝑦 3)
Tomado de: (Monthieu, 2010)
2.2.3.2 Aceites
Son la unión esterificada de tres ácidos grasos insaturados (tienen uno o varios enlaces dobles) con
una molécula de glicerol. Son ejemplos de ácidos insaturados: el oléico con 18 átomos de C y un
doble enlace y el linoleíco de 18 átomos de C y dos dobles enlaces, suelen ser líquidos a temperatura
ambiente. La mayoría de aceites son de origen vegetal y se encuentran en estado líquido.
2.2.3.3 Ceras
Son esteres de ácidos grasos de alto peso molecular con alcoholes diferentes al glicerol. Están pre-
sentes como capas protectoras en animales y vegetales donde funcionan como impermeabilizantes
(ver Figura 2-7).
19
Figura 2-7 Palmitato de miricilo (cera de abeja)
2.2.3.4 Terpenos
Se forman con moléculas de isopreno (Figura 2-8). Son estructuras hidrófobas. Se pueden aislar de
los aceites esenciales de las plantas (pineno, mentol de la menta, limoneno, vitaminas, etc.).
Figura 2-8 Molécula de isopreno
2.2.3.5 Lípidos Complejos
Son lípidos saponificables en cuya estructura molecular, además, de carbono, hidrógeno y oxígeno,
hay también nitrógeno, fósforo, azufre o un glúcido. Forman parte de la doble capa lipídica de la
membrana celular, por lo que también se llaman lípidos de membrana. Son moléculas anfipáticas.
Los fosfolípidos, que pertenecen a este grupo, se caracterizan por una molécula central de glicerol
sustituido por dos ácidos grasos y un grupo fosfato (ver Figura 2-9).
Figura 2-9 Fosfatidilcolina A: grupo fosfato, B: colina, C y D son ácidos grasos enlazados a la
molécula de glicerol central.
20
2.2.3.6 Esteroides
Son derivados del núcleo de ciclo pentano perhidrofenantreno o esterano, que se compone de carbono
e hidrógeno formando cuatro anillos fusionados, tres hexagonales y uno pentagonal, en su mayoría
de origen eucarionte. Como el colesterol de origen animal y los fitoesteroles de origen vegetal (ver
Figura 2-10).
Figura 2-10 Fitoesterol B- sitoesterol
2.2.4 Métodos de extracción de lípidos
La grasa presente en la materia orgánica en general, y en las microalgas en particular, se encuentra
mayoritariamente como triglicéridos, gracias a la polaridad de la cadena hidrocarbonada de la molé-
cula, puede extraerse con un solvente apolar, sin embargo, también otros componentes apolares como
la clorofila, ficobilinas, ceras, carotenoides y colorantes pueden ser extraídos.
Además, en los métodos en que se emplea calor, es posible que se pierda una parte de grasa por
evaporación, como ácidos grasos muy volátiles de bajo peso molecular. También, otros lípidos, tales
como los di y monoacilgliceroles pueden solubilizarse en solventes relativamente polares pues, cuen-
tan con grupos hidrófilos e hidrófobos en la misma molécula.
Los disolventes que se usan suelen ser el éter de petróleo, el éter dietílico (más eficiente, pero extrae
sustancias no grasas), el cloroformo, el sulfuro de carbono, el tetracloruro de carbono y hexano. El
rendimiento y la composición de los extractos resultantes difieren según el disolvente empleado; por
eso, es necesario indicar siempre el disolvente o la técnica que se ha utilizado en la extracción. Otro
factor a tomar en cuenta, es el punto de ebullición de los solventes, que facilitará la extracción pro-
tegiendo de alguna manera los componentes termolábiles.
Una gran variedad de solventes orgánicos suelen ser utilizados en la extracción de aceite de micro-
algas, siendo el más popular una mezcla hexano-etanol, mediante esta combinación es posible extraer
más del 98% de los ácidos grasos presentes en la biomasa (González, Kafarov, & Guzmán, 2009),
sin embargo, al ser el etanol un buen solvente de extracción, su selectividad hacia los lípidos es
21
relativamente baja comparada con otros solventes, por lo que en extracciones con etanol, pueden
aparecer otros componentes de las microalgas como azucares, pigmentos o aminoácidos. Junto con
el hexano puede utilizarse otros solventes como el isopropanol. La selección del disolvente adecuado
depende mucho de su costo, volumen deseado de producción, toxicidad, índice de polaridad, punto
de fusión y ebullición. En especial del índice de polaridad que indica la capacidad de solubilizar un
soluto, mientras más cercano al agua, es mejor disolviendo compuestos polares. Así el mejor solvente
es el que tenga características más similares al compuesto que se requiere disolver. Algunas propie-
dades de los solventes más empleados se muestran en la Tabla 2.6.
Tabla 2.6 Propiedades físicas de algunos solventes
Índice de
Polaridad Disolvente Viscosidad, cP (20ºC)
Punto de ebullición
(en ºC, 1atm)
0,1 n-hexano 0,313 68,7
0,2 Ciclohexano 0,98 80,7
2,8 Éter dietílico 0,22 34,5
3,9 Isopropanol 2,35 117,7
4,0 Butanol 0,71 125,0
4,1 Cloroformo 0,56 61,0
5,1 Metanol 0,60 64,7
5,2 Etanol 1,20 78,3
9,0 Agua 1,00 100,0
Tomado de: (Guarnizo & Martínez, 2009)
Los métodos más generalizados de extracción, y que sirven de referencia, son los de extracción con-
tinua tipo Söxhlet o Bailey-Walker.
Siempre que se realice un método de extracción hay que indicar el solvente empleado, ya que los
distintos solventes no extraen los mismos componentes. Para facilitar la extracción hay que realizar
algunas etapas previas (Sarmiento & Amaya, 2010).
1. Desecación de la muestra: para que el solvente penetre mejor en las células. Algunos solventes
como el éter dietílico son higroscópicos y pueden captar algo de agua.
2. Troceado y molturación: se rompen físicamente las estructuras de la muestra. Al romper las
células, el solvente extrae mejor los lípidos. En microalgas se destacan los métodos de disrup-
ción celular (Ver 2.2.5).
3. Si la muestra tiene alto porcentaje de proteína en su composición es necesario realizar una hi-
drólisis con ácidos o álcalis o la proteína se precipita con alcohol y se disuelve en amoniaco.
4. En algún caso se emplean intermedios (como la arena) que se mezclan con la muestra evitando
aglomerados.
22
Después de estas etapas se realiza la extracción con el disolvente. A continuación se evapora el di-
solvente y se pesa el residuo; por diferencia de peso, se puede conocer la cantidad de grasa y calcular
el porcentaje de lípidos en la muestra. Y con la grasa obtenida se continúa con la caracterización de
la misma.
2.2.4.1 Extracción Söxhlet
Este método se basa en el uso del equipo del mismo nombre (Figura 2-11) y un solvente o mezcla de
solventes, los cuales se colocan en un balón que es calentado hasta que la mezcla alcance el punto de
ebullición. Sobre el balón se ajusta una cámara de extracción donde se coloca la muestra en un dedal
de celulosa, esta cámara posee dos conductos, el primero permite desfogar el solvente cuando ha
llenado la cámara y el segundo conduce los vapores del solvente a la cámara para que este condense
y refluje sobre la muestra.
La extracción se realiza con un disolvente orgánico, que se encuentra en reflujo constante, el mismo
que inicia cuando se alcanza el punto de ebullición del solvente seleccionado. Es una extracción
semicontínua; el solvente se calienta, se volatiliza y condensa sobre la muestra que se encuentra seca
y pulverizada, una y otra vez. Sobre la cámara se encuentra un refrigerante para condensar los vapo-
res del solvente. Se han estudiado varios solventes y mezclas como diclorometano:metanol 2:1
(Scarsella, Belotti, De Filippis, & Bravi, 2010), y la mezcla más destacada la de cloroformo:metanol
1:2 durante 8 horas de reflujo en equipo Söxhlet. Esta metodología emplea más energía externa y
proporciona una elevada temperatura durante toda la extracción. (Olivieri, Gargano, Andreozzi,
Marotta, Marzocchella, Pinto, & Pollio, 2012) Cada solvente tiene preferencia por determinada
sustancia química, en la Tabla 2.7 se muestran algunos ejemplos de solventes para ciertos productos
de extracción.
Tabla 2.7 Solventes utilizados en el método Söxhlet
Solvente Productos de extracción Observaciones
Éter de petróleo o éter etílico Especialmente lípidos no pola-
res (triglicéridos)
Los éteres son muy volátiles, y
existe mucha pérdida del sol-
vente
Hexano Selectividad a lípidos neutros Relativamente económico y fá-
cil de recuperar después de la
extracción
Isopropanol:Hexano Ácidos grasos Mezcla segura a escala indus-
trial, con baja toxicidad
Diclorometano:hexano Poca selectividad Aumenta la eficiencia
Diclorometano:metanol Lípidos neutros Muy eficiente
Tomado de: (Sarmiento & Amaya, 2010)
23
Se utilizan de 1 a 4 gramos de muestra, dependiendo de la composición del material a analizar. El
volumen de solvente necesario para la cámara del equipo Söxhlet debe ser el suficiente para mantener
con solvente un balón de aproximadamente 120 a 200mL, durante toda la extracción.
2.2.4.2 Método Bligh & Dyer original
Se usa una mezcla metanol-cloroformo (2:1), lo que proporciona esta mezcla es eficiencia en la ex-
tracción de lípidos neutros con la adición de solventes apolares y polares.
“El método de Bligh-Dyer proporciona un método rápido para la extracción de lípidos
de tejidos que contienen una cantidad significativa de agua. El método se basa en la
homogenización de la muestra con cloroformo, metanol y agua en proporciones tales
que se forme una sola fase miscible con el agua de la muestra. Al añadir alícuotas de
cloroformo y agua se logra la separación de fases. El material lipídico se encuentra en
la fase no acuosa, mientras que el material no lipídico se encuentra en la fase acuosa.
La ventaja de este procedimiento es que las etapas de filtrado y lavado son eliminadas.
Sin embargo, no es un método muy cuantitativo y tiene un elevado margen de error
para muestras secas de cereales” (UNAM, 2008).
Figura 2-11 Equipo de extracción Söxhlet
24
2.2.4.3 Método Bligh & Dyer modificado (Salazar, 2012)
Según la polaridad del compuesto que se quiera extraer, se puede usar una combinación de solventes
que faciliten la extracción del lípido, y que además resulte fácil, económico y rápido.
De la experiencia del curso de Biotecnología Algal 2010 en Lima, Perú, se propuso, para la extrac-
ción de lípidos en microalgas, el uso de una mezcla hexano:isopropanol 3:2 en ausencia de calor,
utilizando un procedimiento similar al método Blig & Dyer, nombrado en Salazar (2012) como Mé-
todo Ramos, 2010.
2.2.4.4 Método de Röse-Gottlieb
De acuerdo a este método, para la separación de la grasa se emplea amoniaco y etanol con una pos-
terior deshidratación de los fosfolípidos. La grasa se disuelve en éter recién destilado y se añade algo
de petróleo para que se separen algunos compuestos no lipídicos que puedan encontrarse en la fase
etérea. Esta mezcla es completamente inmiscible en agua de manera que mediante una extracción
adecuada es posible dejar la grasa en la fase etérea y pesar el residuo graso.
Este método es particular para leche fresca que no contiene ácidos grasos libres, los cuales en diso-
lución alcalina forman sales de amonio insolubles en éter. Por lo que no se aplica a quesos que tienen
ácidos grasos libres (UNAM, 2008).
2.2.4.5 Extracción por fluidos supercríticos
Un fluido supercrítico se considera de esta forma cuando se lo hace permanecer en condiciones de
presión y temperatura superiores a las críticas. En estas condiciones el fluido tiene características de
gas y de un líquido, adquiriendo propiedades como baja viscosidad y alta difusividad relativa que le
permite penetrar fácilmente en los sólidos y ofrecer una mejor y rápida extracción, los más usados
con dióxido de carbono y agua. El dióxido de carbono se puede eliminar fácilmente y tiene bajo costo
y toxicidad; sin embargo no es una buena opción para extraer compuestos polares. El agua entre 100
y 374°C, junto con presiones de 10 y 60 bares se han utilizado en microalgas en la extracción de
antioxidantes (González, Kafarov, & Guzmán, 2009).
2.2.4.6 Método de Mojonnier
La grasa se extrae con una mezcla de éter etílico y éter de petróleo en un matraz de Mojonnier, la
grasa extraída se pone a peso constante y se expresa en porcentaje de grasa por peso. La prueba de
Mojonnier es un ejemplo de extracción discontinua con disolvente. Esta extracción no requiere re-
mover previamente la humedad de la muestra (UNAM, 2008).
25
2.2.4.7 Método por arrastre de vapor
Por efecto de la temperatura que alcanza el vapor de agua (100°C) aumenta la presión de vapor y el
tejido vegetal, que es expuesto a estas condiciones, se rompe liberando el aceite de su interior, al
final se formarán dos fases una de aceite y otra de agua como se muestra en la Figura 2-12 (Olivares,
2010).
2.2.5 Disrupción celular
Para facilitar la extracción previamente debe romperse físicamente las células para que el solvente
disuelva mejor los lípidos. Existen varios métodos para disrupción celular:
2.2.5.1 Microondas
La radiación de microondas crea fricción y a su vez calor, que conjuntamente con la polaridad de las
moléculas que componen la estructura de la muestra como lípidos y proteínas y el agua que escapa,
debilitan la pared celular. Esta técnica es eficiente y disminuye el tiempo de análisis por muestra, se
combina con un procedimiento de extracción con solventes. Esta metodología alcanza el doble de
lípidos extraídos con respecto a los mismos solventes pero sin método de disrupción (Sarmiento &
Amaya, 2010).
2.2.5.2 Ultrasonido
Consiste en la exposición a la muestra de ondas acústicas para la destrucción de la pared celular, esta
técnica se acopla perfectamente el método de Bligh y Dyer, el cual no usa ninguna fuente de calor.
Figura 2-12 Equipo de extracción de lípidos por arrastre de vapor.
Tomado de: (Olivares, 2010)
26
Se usa una combinación de solventes en donde no se quiere influenciar el cambio de la composición
del perfil lipídico.
2.2.5.3 Método organosólvico (Autoclavado)
Esta técnica de pretratamiento usa condiciones de 300°C y 100MPa con tiempos de entre 5 y 60
minutos con biomasa húmeda. La técnica se puede comparar con la extracción con fluidos supercrí-
ticos. Sarmiento & Amaya (2010), proponen una mejora del método autoclavando la biomasa seca
con una solución que ayuda a la disrupción celular que consiste en una mezcla metanol al 3,32% y
ácido sulfúrico 0,6M, durante 4 horas.
2.2.5.4 Disrupción química
La disrupción química consiste en el debilitamiento y rompimiento de la pared celular mediante el
uso de compuestos químicos. Sarmiento & Amaya (2010) realizaron ensayos de disrupción con mi-
croalgas basados en hidrólisis ácida con diferentes soluciones de ácido clorhídrico (0,1, 0,5, 1 y 3
M), durante un tiempo de 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación mecánica y la posterior
extracción con solventes. Obteniéndose los mejores resultados con la solución 0,5M. En la Figura 2-
13 se observa cómo actúan los reactivos NaOH y HCl sobre las microalgas.
2.2.5.5 Evaluación de los métodos de disrupción celular
Para la evaluación de la disrupción celular puede utilizarse una Cámara Neubauer que permite deter-
minar el grado de ruptura celular. La Cámara Neubauer es una cuadrícula de recuento formada por 9
cuadrados grandes, cada uno de ellos con una superficie de 1mm2 (ver Figura 2-14).
La casilla grande central está dividida en 25 cuadrados medianos cada uno de ellos con 16 cuadrados
pequeños en su interior. Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas están formados por 16 cua-
drados medianos. El recuento celular puede realizarse en ambos tipos de cuadrados, dependiendo del
tamaño de las células en estudio.
Figura 2-13 Efecto de agentes químicos en microalgas. a) Scenedesmus sp, b) Navícula
sp, c) Solución NaOH, d) Solución de HCl. Tomado de: (Sarmiento & Amaya, 2010)
a b c d
27
Cuando se coloca la muestra bajo el cubreobjetos, la suspensión celular alcanza una altura de 0,1 mm
así, el volumen analizado es de: 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 = 10-4
mL, por lo que puede expresarse el
resultado en concentración de células por un volumen determinado (células/mL).
2.2.6 Biocombustibles
Un biocombustible líquido se obtiene de aceites de especies vegetales, especialmente de semillas y
frutos, por métodos de compresión y extracción. El biodiesel es un combustible renovable derivado
de aceites vegetales transformados en ésteres monoalquilo, que se puede usar en motores a diésel sin
necesidad de modificarlos o como mezcla junto con el diésel convencional producto de derivados
fósiles. Con su uso se logra la disminución de emisiones de CO, sulfuros, humo visible y olores. El
punto de inflamación del biodiesel es superior al diésel por lo que su almacenamiento y transporte
son más seguros (Cárdenas, 2010). En la Tabla 2.8 se comparan algunas propiedades físicas entre
biodiesel a partir de microalgas y diésel común.
Tabla 2.8 Comparación entre biocombustible de algas y diésel y valores estándar ASTM
Propiedad Biocombustible
a partir de algas Diésel
ASTM biodiesel
estándar
Densidad kg/L 0,864 0,838 0,86 -0,90
Viscosidad (Pa/s) a 40°C 5,2x10-4 (1,9 - 4,1)x10-4 (3,5 - 5,0)x10-4
Punto de inflamación (°C) 115 75 100 °C (min)
Punto de solidificación (°C) -12 -(50 - 10) -
Acidez titulable
(mg KOH/kg)
0,374 0,5 0,5 (máx)
Calor especifico de combus-
tión (MJ/kg)
41 40-45 -
Azufre (ppm) 10 (máx.) 350 (máx.) -
Agua (ppm) 500 (máx.) 200(máx.) -
Contaminación total (ppm) - 24 (máx.) -
Tomado de: (Xu, Miao, & Wu, 2006)
Figura 2-14 Cámara Neubauer
28
La propiedad más importante es la cantidad de energía que puede obtenerse. El poder calórico del
diésel a base de petróleo es de 42,7 MJ/kg y el del biodiesel, dependiendo de la fuente de biomasa
involucrada, de colza o soja tiene un poder calórico de 37 MJ/kg y el derivado de algas alcanza los
41MJ/kg (INTA, 2008).
La densidad y la viscosidad del biodiesel son mayores con respecto al diésel, lo que influye en el
transporte y almacenamiento del combustible; si la densidad es mayor, aumenta la energía térmica,
mientras que la viscosidad debe ser menor para evitar fugas en el motor (Barraza, Collao, Espinoza,
Moya, & Thun, 2009).
Otras características que deben considerarse en un biocombustible son:
2.2.6.1 Punto de inflamación
El punto de inflamación es la temperatura más baja a la que se puede vaporizar una sustancia para
formar una mezcla inflamable con el aire y que requiere de una fuente de ignición, se considera
combustible cuando el compuesto o sustancia tiene un punto de inflamación superior a 60,5 °C.
2.2.6.2 Número de cetano
El número de cetano caracteriza la volatilidad y facilidad de inflamación del combustible, se compara
la facilidad de inflamación con la de un combustible de referencia formado por una mezcla de cetano
puro (hexadecano) con α-metilnaftaleno en un motor de prueba.
El cetano puro es un hidrocarburo con óptima facilidad de inflamación y se le asigna convencional-
mente el número 100, mientras que el α-metilnaftaleno es de muy escasa facilidad de inflamación y
se le asigna el número 0.
Ácidos grasos con valores próximos a 100 se consideran mejores para la síntesis de biocombustibles
(ver Tabla 2.9).
Tabla 2.9 Ácidos grasos y número de cetano
Ácido graso Número de cetano
Esteárico 85,9
Palmítico 76,6
Mirístico 69,9
Laúrico 61,1
Oleico 56,9
Linoleico 39,2
Linolénico 28,0
Tomado de: (Sánchez-Borroto, Piloto-Rodríguez, Goyos-Pérez, &
Ferrer-Frontela, 2012)
29
2.2.7 Análisis Cromatográfico
Uno de los análisis más utilizados para caracterizar al material lipídico de una muestra es la croma-
tografía de gases. Se basa en la técnica de separación por elución en solventes y en el principio de
que las moléculas, según sus características, como peso molecular y polaridad, varían el tiempo en
el que llegan a un detector (López, 2008).
La muestra se volatiliza y se inyecta en una columna cromatográfica y la elución es generada por el
flujo de una fase móvil de un gas inerte que no interacciona con el analito, la muestra se distribuye
entre una fase móvil gaseosa y una fase móvil líquida inmovilizada en la superficie de un sólido
inerte (Skoog, Holler, & Niemand, 2001). La comparación de los picos obtenidos en un cromato-
grama de un estándar y de la muestra de estudio ayuda a identificar los compuestos que se tenga en
el analito. La identificación de los ácidos grasos se realiza contrastando sus tiempos de retención con
los de un estándar previamente corrido. El esquema del equipo se presenta a continuación (Figura 2-
15).
Figura 2-15 Esquema de un cromatógrafo de gases
El detector más usado en cromatografía de gases es el de ionización de llama abreviado FID. Este
detecta la diferencia de potencial al aplicar un voltaje entre dos placas de un quemador que piroliza
el analito produciendo iones y electrones los cuales conducen la electricidad. En los compuestos
orgánicos se relaciona el número de carbonos con el número de iones producidos. Esto sucede gracias
a una llama producida por la combustión de dos gases, hidrógeno y oxígeno.
Para el perfil lipídico de grasas y aceites la muestra debe contener únicamente la fracción lipídica y
esta debe ser tratada previamente de tal manera que todos los ácidos grasos puedan ser identificados.
Esto se consigue con la derivatización, que consiste en una transesterificación o alcohólisis donde
30
los ácidos grasos rompen el enlace éster con la molécula de glicerol que los reemplaza con un grupo
metilo proveniente del metanol (ver Figura 2-16). Se producen ésteres de ácidos, los cuales son co-
nocidos como biodiesel. Los principales factores que influyen en el proceso son la relación molar
alcohol: glicéridos, el tipo de catalizador (álcali, ácido, lipasa), la temperatura, el tiempo de reacción
y el contenido de agua junto con los ácidos grasos libres en la materia prima (Garibay, Vázquez-
Duhalt, Sánchez, Serrano, & Martínez, 2009).
Figura 2-16 Esquema de derivatización de Lípidos
2.3 Fundamento legal
El Ecuador es un país que se ha esforzado por cambiar su Constitución, para mejorar la calidad de
vida de los ciudadanos y garantizar sus derechos, y mejorar el entorno en que viven sus ciudadanos.
En la Constitución del Ecuador de 2008 en el Régimen del Buen Vivir. (Asamblea Constituyente,
2008) La Sección primera de Naturaleza y Ambiente dice:
“Art. 395.- La Constitución reconoce los siguientes principios ambientales:
1. El Estado garantizará un modelo sustentable de desarrollo, ambientalmente equilibrado y
respetuoso de la diversidad cultural, que conserve la biodiversidad y la capacidad de rege-
neración natural de los ecosistemas, y asegure la satisfacción de las necesidades de las ge-
neraciones presentes y futuras.
2. Las políticas de gestión ambiental se aplicarán de manera transversal y serán de obligatorio
cumplimiento por parte del Estado en todos sus niveles y por todas las personas naturales
o jurídicas en el territorio nacional.
3. El Estado garantizará la participación activa y permanente de las personas, comunidades,
pueblos y nacionalidades afectadas, en la planificación, ejecución y control de toda activi-
dad que genere impactos ambientales.
4. En caso de duda sobre el alcance de las disposiciones legales en materia ambiental, éstas se
aplicarán en el sentido más favorable a la protección de la naturaleza" (Asamblea
Constituyente, 2008).
31
Además, en el Título VII, Sección Séptima que habla de Biósfera, ecología urbana y energías alter-
nativas señala:
“Art.413.- El Estado promoverá la eficiencia energética, el desarrollo y uso de prácticas y tecnolo-
gías ambientales limpias y sanas, así como de energías renovables, diversificadas, de bajo
impacto y que no pongan en riesgo la soberanía alimentaria, el equilibrio ecológico de los
ecosistemas ni el derecho al agua” (Asamblea Constituyente, 2008).
El 9 de julio de 2007 se creó el Ministerio de Electricidad con el objetivo de satisfacer las necesidades
energéticas del país con ayuda de normativa pertinente, planes de desarrollo, políticas sectoriales y
proyectos innovadores. Un aspecto destacable sobre la política de este ministerio es el apoyo indis-
cutible a la innovación y la calidad energética con responsabilidad social y ambiental.
El Gobierno ecuatoriano apoya el desarrollo de energías alternativas renovables a través del Minis-
terio de Energías Renovables y su Subsecretaría de Energía Renovable y Eficiencia Energética,
donde se encuentra la Dirección de Biomasa y Cogeneración. Esta Dirección desarrolla estudios y
proyectos que promueven el uso de la biomasa en los diferentes sectores del país, como el aprove-
chamiento de residuos orgánicos y residuos sólidos urbanos. En el 2012 fue creado el Instituto Na-
cional de Eficiencia Energética y Energías Renovables (INER), uno de sus ejes estratégicos es el
desarrollo del uso de prácticas tecnológicas no contaminantes de bajo impacto.
El Ecuador tiene normalizadas las características técnicas del biodiesel en la Norma Técnica Ecua-
toriana: Biodiesel: Requisitos. NTE INEN 2 482:2009, Primera Edición, Norma Voluntaria, Marzo
2009 (Tabla 2-10) y su uso en: Productos derivados del Petróleo: Requisitos. NTE INEN 1 489:2012,
Séptima Revisión Abril 2012, Norma Técnica Obligatoria (ver Anexo 1).
La segunda norma técnica indica que el Diésel No. 2, un combustible utilizado en los sectores indus-
trial, pesquero, eléctrico, naviero, entre otros; excepto para uso automotriz, puede contener hasta un
5% de biodiesel. El Diésel No. 2 es el utilizado en los generadores eléctricos de la estación Pedro
Vicente Maldonado en la Antártida. El Diésel Premium, utilizado en motores de autoignición para la
propulsión de vehículos del sector automotriz también puede contener hasta un 5% de biodiesel
(INEN, 2012).
En la Tabla 2.10 se compara la norma ecuatoriana con la de la Unión Europea. La ISO, también, ha
normalizado los requisitos para el biodiesel, junto con los respectivos métodos de ensayo para su
evaluación como se indica en el Anexo 1.
32
Tabla 2.10 Requisitos biodiesel Norma de la Unión Europea y Norma Técnica Ecuatoriana
Criterios Biodiesel (EN 14214) Biodiesel (NTE INEN
2482:2009)
Densidad 15°C (g/cm3) 0,86-0,9 0,86-0,9
Viscosidad 40°C (cP) 3,5-5,0 3,5-5,0
Punto de inflamación °C >101 >120
Punto de Turbidez Reportar
Azufre (% masa) <0,01 10mg/Kg
Ceniza de azufre (% masa) 0,02 0,02
Agua (mg/kg) <500 <500
Residuo de carbono (% peso) <0,03 <0,05
Contaminación total (mg/kg) <24
Corrosión de cobre 3h/50°C Clase 1 <Clase 3
Número de cetano >51 >49
Metanol (% masa) <0,2 <0,2
Contenido de éster (% masa) >96,5 >96,5
Monoglicéridos (%masa) <0,8
Diglicéridos (%masa) <0,2
Triglicéridos (%masa) <0,4
Glicerol libre (%masa) <0,02 <0,02
Glicerol total (%masa) <0,25 <0,25
Número de yodo 120 120
Fósforo (mg/kg) <10 <10
Número de acidez (mg KOH/g) <5 <5
Metales alcalinos Ca, Mg (mg/kg) <5 <5
Metales alcalinos Na, K (mg/kg) <5 <5
Tomado de: (Calvo, 2006)
33
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍAbbbbb
3.1 Tipo de investigación
La investigación fue de tipo experimental, donde se realizó la manipulación de variables en condi-
ciones controladas de laboratorio para desarrollar una interpretación correcta del fenómeno estu-
diado. Se trabajó con un modelo inductivo, donde, a partir de datos obtenidos con técnicas experi-
mentales aplicadas se formó el conocimiento científico.
3.2 Población y muestra
La población que fundamentó la investigación del presente trabajo fue el conjunto de microalgas
presentes en el Archipiélago Shetland del Sur en la Antártida, en las inmediaciones de la Estación
Científica Ecuatoriana Pedro Vicente Maldonado. La muestra correspondió al extracto graso de cada
consorcio de microalgas reunidas en febrero del 2013 durante la XVI Expedición Ecuatoriana a la
Antártica, organizada por Instituto Nacional Antártico Ecuatoriano.
Durante la XVI expedición se recolectaron seis consorcios de microalgas en diferentes puntos de la
Antártida que fueron georeferenciados con ayuda de un equipo de GPS. En la Tabla 3.1 se presentan
los datos de las muestras recogidas, indicando los géneros identificados y el lugar de muestreo en el
Archipiélago Shetland del Sur. Con la aplicación Google Earth, en el Anexo 2, cada punto de mues-
treo se ubicó sobre el mapa de una fotografía satelital.
Para la identificación de las microalgas las muestras se almacenaron en formol al 1%, y para la ma-
sificación se conservaron vivas en el mismo medio donde fueron tomadas, que en la mayoría de casos
fue nieve, y se transportaron al Ecuador en coolers. Los consorcios de microalgas fueron identifica-
dos y codificados por la Ing. en Biotecnología Denisse Molina a partir de muestras vivas y conser-
vadas en formol.
Los dos primeros dígitos del código de las muestras hacen referencia al año de recolección 2013, las
dos iniciales siguientes indican el lugar de recolección: Isla Torre (IT), Isla Barrientos (IB), Isla
Greenwich (IG), Isla Dee (ID); la letra minúscula, a continuación, indica el sector donde fue tomada
la muestra y el dígito al final es el número de la réplica.
34
Tabla 3.1 Código de las muestras y géneros de microalgas identificadas
Código
Microalgas
identificadas en
el consorcio
Ambiente Ubicación
Latitud Longitud
13IDa1 Chlorella
Haematococcus
Nieve 62°25`20.64’’S 59°47`02.06’’O
13IDa2 Navicula
Synedra
Hantzschia
Gomphonema
Leptolyngbya
Pseudoanabaena
Chlorella
Dulceacuícola 62°25`22.51’’S 59°47`01.24’’O
13IDa3 Gomphonema
Oscillatoria
Synedra
Niztchia
Pinnularia
Surirellya
Diatoma
Navicula
Leptolyngbya
Chlorella
Dulceacuícola 62°25`23.10’’S 59°46`59.37’’O
13IGf2 Niztchia
Navicula
Surirella
Pinnularia
Chlorococcum
Gomphonema
Chlorella
Haematococcus
Dulceacuícola 62°27`22.51’’S 59°43`45.36’’O
13ITe1 Gomphonema
Navicula
Haematococcus
Diatoma
Dulceacuícola 62°24`35.92’’S 59°43`49.02’’O
13IBa2 Coconeis
Chlorella
Navicula
Cymbella
Gomphonema
Oscillatoria
Dulceacuícola 62°24`22.65”S 59°44`39.23”O
3.3 Diseño experimental
En este trabajo se estudió la influencia de diferentes métodos de extracción junto con distintos mé-
todos de disrupción celular y la interacción entre ellos en la extracción de lípidos de un consorcio de
microalgas antárticas cultivado a las condiciones de laboratorio. En una segunda parte, se compara-
ron los perfiles lipídicos de microalgas antárticas recolectadas en febrero - marzo de 2013 en el Ar-
chipiélago Schetland del Sur, orientado hacia la posible producción de biocombustibles. El tipo de
35
diseño experimental fue un diseño factorial AxB, completamente al azar, con tres réplicas que per-
mite establecer la existencia de efectos en las variables elegidas.
Variable dependiente en este estudio fue el porcentaje de lípidos obtenidos.
Factores a variar. Las variables independientes se designaron con las letras A y B y fueron: Métodos
de Disrupción (A) y Métodos de Extracción (B)
Niveles de los factores.
- Métodos de Disrupción: Esta variable tiene cuatro niveles:
1. Control (ningún método de disrupción)
2. Método de disrupción microonda
3. Método de disrupción con solución de HCl 0,5 M
4. Método de disrupción con autoclave y solución 3,2% metanol y 0,6M H2SO4
- Métodos de Extracción: Esta variable tiene cuatro niveles:
1. Método de Bligh & Dyer
2. Método de Söxhlet con solvente éter
3. Método de Söxhlet con solvente hexano
4. Método de Bligh & Dyer modificado
Réplicas. Tres réplicas (n=3), ver Tabla 3.2. Los datos se analizaron con la herramienta de Análisis
de Datos de Microsoft Excel. Los subíndices representan el orden aleatorio en que fueron realizados
los ensayos.
Tabla 3.2 Diseño experimental factorial AxB completamente al azar
FACTOR B
Métodos de extracción
FACTOR A
Métodos de disrupción
1 Control 2 Microondas 3 HCl 0,5M 4 Autoclave
1 Bligh & Dyer 1.12
1.13
1.116
1.28
1.212
1.223
1.313
1.39
1.320
1.45
1.417
1.421
2 Söxlet éter 2.122
2.110
2.115
2.211
2.224
2.219
2.318
2.34
2.314
2.41
2.46
2.47
3 Söxlet hexano 3.131
3.136
3.141
3.235
3.239
3.233
3.3 45
3.347
3.348
3.427
3.430
3.425
4 Bligh & Dyer
modificado
4.140
4.134
4.138
4.232
4.242
4.237
4.346
4.344
4.343
4.429
4.428
4.426
36
3.3.1 Análisis de Varianza
El análisis de varianza sirve para determinar las diferencias significativas entre las variables consi-
deradas, en este estudio se realizó un diseño factorial completamente al azar de dos factores y cada
uno con tres replicas, así se plantearon las siguientes hipótesis:
Ho: A1=A2=A3=A4, los métodos de disrupción son iguales
H1: Ai≠Aj para algún i≠j, los métodos de disrupción no son iguales
Ho: B1=B2=B3=B4, los métodos de extracción son iguales
H1: Bi≠Bj para algún i≠j, los métodos de extracción no son iguales
Ho: AB=0, no hay interacción entre las variables
H1: AB≠0 hay interacción entre las variables
En la Tabla 3.3 se muestra, en detalle, la metodología para el análisis de datos, donde:
��: Es la media de todos los ensayos realizados de los porcentajes obtenidos con los métodos de
extracción.
𝑌𝑎: Son los promedios conseguidos con los métodos de disrupción.
𝑌��: Son los promedios obtenidos con los métodos de extracción.
𝑌𝑎𝑏 : Son los promedios entre réplicas.
𝑌𝑎𝑏𝑛: Son cada uno de los datos obtenidos del porcentaje de extracción de lípidos, se realizaron tres
réplicas, y
𝑆𝐶𝑠𝑢𝑏 =𝑛 ∑ ∑ (𝑌𝑎𝑏
− ��)2𝑟𝑏=1
𝑠𝑎=1
𝑟
3.3.2 Prueba Tukey
Una vez que se realiza el análisis de varianza, si se acepta la hipótesis alternativa, deben jerarquizarse
los métodos utilizados. Se emplea una prueba de significancia que establece en categorías los trata-
mientos realizados. Ordenando los métodos de extracción, según las medias de los porcentajes de
lípidos extraídos, del más al menos óptimo, de acuerdo a los requerimientos especificados en el aná-
lisis estadístico. Para ejecutar la prueba de Tukey debe obtenerse la Diferencia Significativamente
Honesta de Tukey (DSH) con la Ecuación 3.1.
37
Tabla 3.3 ANOVA del diseño factorial de dos factores AxB con tres réplicas
Fuente de
Variación (FV) Suma de Cuadrados (SC)
Grados de
Libertad
(GL)
Cuadrado Medio
(CM)
Razón de
Varianzas
Fo
Valor
Crítico
P valuea
Métodos de dis-
rupción
celular (A)
𝑆𝐶𝐴 = 𝑛𝑏 ∑(𝑌�� − ��)2
𝑎
𝑖=1
a-1
𝐶𝑀𝐴 =𝑆𝐶𝐴
a − 1
𝐶𝑀𝐴
𝐶𝑀𝐸
P(F≥FAo)
Métodos de ex-
tracción de lípi-
dos (B) 𝑆𝐶𝐵 = 𝑛𝑎 ∑(𝑌�� − ��)2
𝑏
𝑗=1
b-1 𝐶𝑀𝐵 =
𝑆𝐶𝐵
b − 1
𝐶𝑀𝐵
𝐶𝑀𝐸
P(F≥FBo)
Interacciones
(AxB) 𝑆𝐶𝐴𝐵 = 𝑆𝐶𝑠𝑢𝑏 − 𝑆𝐶𝐴 − 𝑆𝐶𝐵 (a-1)(b-1)
𝐶𝑀𝐴𝐵 =𝑆𝐶𝐴𝐵
(a − 1)(b − 1)
𝐶𝑀𝐴𝐵
𝐶𝑀𝐸
P(F≥FABo)
Error 𝑆𝐶𝐸 = 𝑆𝐶𝑇 − 𝑆𝐶𝐴 − 𝑆𝐶𝐵 − 𝑆𝐶𝐴𝐵 (ab-1)(n-1) 𝐶𝑀𝐸 =
𝑆𝐶𝐸
𝑎𝑏(n − 1)
Total
𝑆𝐶𝑇 = ∑ ∑ ∑(𝑌𝑖𝑗𝑘 − ��)2
𝑛
𝑘=1
𝑏
𝑗=1
𝑎
𝑖=1
(abn-1)
a Cuando la probabilidad P es mayor que el Valor crítico, se identifica con * o **, para el 95% ó 99% de confianza, respectivamente.
Tomado de: (Miller & Miller, 2002).
38
𝐷𝑆𝐻 = (𝑞𝑎,𝑘,𝑔/𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟) ∗ √𝐶𝑀𝐸
𝑟 Ecuación 3.1
(𝑞𝑎,𝑘,𝑔/𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟) es el valor tomado a partir de tablas según los grados de libertad establecidos para el
análisis, CME es el cuadrado medio del error y r las repeticiones realizadas. Finalmente, el valor
obtenido se compara con la diferencia entre las medias de los métodos y se estructuran las categorías.
En este procedimiento se prueba la hipótesis H0: uj=uk (j≠k): No existe diferencia significativa entre
las combinaciones de métodos de disrupción y extracción aplicados. Los tratamientos formaran parte
de la misma categoría cuando se comprueba la Ho. Cuando la H0 se rechaza, la H1: uj≠uk (j≠k), se
acepta porque la diferencia de las medias es mayor a DSH y se establece la formación de una nueva
categoría hasta que cada tratamiento se ha ordenado en categorías.
3.3.3 Prueba Dunnett
La presente investigación requirió la comparación de las medias experimentales con un valor de
referencia. Es decir, se compararon los valores experimentales que se obtuvieron del perfil lipídico
de los consorcios de microalgas, con diferentes métodos de extracción y disrupción, con el porcentaje
de ácido oleico analizado de un aceite de fritura industrial usado, para encontrar el tratamiento que
extraiga un aceite parecido al aceite de fritura usado. El análisis estadístico utilizado fue la prueba de
Dunnett que compara los ensayos realizados contra un tratamiento control. Las hipótesis son:
H0: �� = 𝜇, no hay diferencia entre la media calculada y el porcentaje de ácido oleico del aceite usado.
H1: �� ≠ 𝜇, hay diferencia entre la media calculada y el porcentaje de ácido oleico del aceite usado.
El procedimiento de Dunnett es una modificación de la prueba t, para cada combinación se calcula
el valor absoluto de la diferencia de medias observadas. Si la diferencia de medias es mayor al valor
de la expresión de la derecha en la Ecuación 3.2 se acepta la hipótesis H1. Se espera que los perfiles
de microalgas sean semejantes, en el porcentaje de ácido oleico, con el del aceite usado.
|��𝑖 − ��𝑎| > (𝑞𝑎,𝑘−1,𝑓) ∗ √𝐶𝑀𝐸 (1
𝑛𝑖+
1
𝑛𝑎) Ecuación 3.2
39
La constante (𝑞𝑎,𝑘−1,𝑓) se ubica en Tabla de valores críticos para la prueba de Dunnett del Anexo 14
(a=0,05). Donde f que es el número de grados de libertad del error y es el nivel de significación
asociado con todos los k 1 tratamientos que se utilizaron para el análisis.
3.4 Materiales y métodos
3.4.1 Producción de consorcio de microalgas
Muestras vivas de microalgas antárticas se transportaron al Ecuador almacenadas en tubos de ensayo
con tapa rosca en el mismo medio donde fueron recolectadas. Con la biomasa de los consorcios que
se encontraba viable se procedió a la propagación. El consorcio 13IGa2, tomado en el punto geore-
ferenciado 62°25’30.53’’S y 59°44’ 43.75’’O, presentó la mejor adaptación a las condiciones artifi-
ciales de crecimiento en el laboratorio, pues su masificación, en los fotobiorreactores, se realizó en
menor tiempo y produjo mayor volumen de cultivo, comparado con el resto de cultivos. El consorcio
13IGa2 se inoculó en el medio de cultivo M1 modificado (ver Anexo 3) y se masificó a 21°C, con
fotoperiodos 12:12 h, junto con una aireación de 0,44L/min con ayuda de una Bomba Power 5000
de 110V, 60HZ y 5W, hasta un volumen de 80 litros de cultivo (Anexo 4). Cuando se alcanzó este
volumen de cultivo el consorcio 13IGa2 se componía únicamente de microalgas del género Chrorella
sp. El día 13 de crecimiento del cultivo se realizó la cosecha. La biomasa recolectada se usó en los
ensayos de la selección del mejor método de disrupción y extracción.
El proceso de adaptación del consorcio y sobrevivencia de los géneros identificados en la muestra se
presentan en la Tabla 3.4.
Tabla 3.4 Adaptación de géneros del Consorcio 13IGa2
Muestra Inicial Adaptación 0°C Adaptación 𝑻𝑨𝒎𝒃
Chlorella Chlorella Chlorella
Stichococcus Stichoccoccus
Chlamydomona Chlamydomona
Chlorococcum
Pandorina
3.4.2 Cosecha de biomasa
Para la cosecha de microalgas se han ensayado varios procedimientos, destacándose la floculación
son sulfato de aluminio (Barajas, Garzón, González, Guzmán, & Kafarov, 2012). El cultivo del paso
anterior (80 L) se floculó con sulfato de aluminio 0,01g/L de cultivo, previamente se alcalinizó el
medio de pH 6 a pH 9,5 con 4-5 perlas de hidróxido de sodio. Al tercer día de iniciado el proceso, se
40
retiró el agua sobrenadante, se lavó la biomasa tres veces con agua desmineralizada para laboratorio
Tipo II y se deshidrató a 50°C por 72 horas en una estufa de calentamiento.
La biomasa seca se pulverizó y se pesó, obteniéndose 97,2915g, esta se almacenó en un frasco ámbar
a 4°C. Los materiales necesarios se muestran en la Tabla 3.5. Para cada ensayo del diseño factorial
se utilizaron 2,00g de esta biomasa seca.
Tabla 3.5 Materiales para la cosecha de microalgas
Equipos Materiales Reactivos
Estufa
Balanza
Refrigerador
Papel aluminio
Espátula de metal
Tiras de papel indicador para
medir pH
Al2(SO4) 99,5%
Agua desmineralizada para laboratorio Tipo
II (Conductividad eléctrica a 25 ºC 0,056
μS/cm)
De forma global se muestra en la Figura 3-1 el proceso de preparación de las muestras antárticas
(izquierda) y el consorcio masificado (derecha).
Figura 3-1 Esquema de bloques para la preparación de muestras
41
3.4.3 Métodos de Disrupción
Se aplicaron tres métodos de disrupción celular y como control se realizó la extracción con los dife-
rentes métodos, pero sin aplicación de ningún método de disrupción.
Después de realizados los ensayos con los diferentes métodos de disrupción, se secó la biomasa en
una estufa a 50° C durante 3 horas, se homogenizó en un mortero, y posteriormente, se trituró en
licuadora. Las células se observaron y se contaron en cámara de Neubauer.
3.4.3.1 Solución de HCl 0,5 M (Sarmiento & Amaya, 2010)
1. Se preparó una solución 0,5M de HCl a partir del reactivo HCl al 37%, con densidad 1,19
g/cm3.
2. En un vaso de precipitación se adicionó 2g de biomasa seca junto con 10mL de la solución
de HCl 0,5M por cada gramo de biomasa.
3. Se agitó la muestra durante 30 minutos con ayuda de un agitador magnético a velocidad media
a temperatura ambiental de 19°C.
4. Luego del tiempo transcurrido la biomasa se secó, homogenizó y trituró para la posterior
extracción con solventes.
3.4.3.2 Microonda (Batista, Vetter, & Luckas, 2001)
Se utilizó el sistema de digestión por microonda, con control de temperatura y presión, Speedwave
four de 1450 W de potencia, marca BERGHOF), con las condiciones señaladas en la Tabla 3.6.
Tabla 3.6 Condiciones del equipo microonda para el método de disrupción
Paso Temperatura
(°C)
Presión
(Torr)
Rampa de
tiempo
(min)
Tiempo de di-
gestión (min)
Potencia Watts
1 50 1 2 5 2% 29,0
2 50 1 2 5 3% 43,5
3 50 1 5 30 5% 72,5
1. Se colocaron 2g de biomasa en tubos de teflón de 20cm, con 10 mL de agua por cada gramo
de biomasa, se introdujeron en el microondas y se procedió a la digestión según el manual
del equipo.
2. Luego del proceso de digestión, se secó, homogenizó y trituró la biomasa para la posterior
extracción con disolventes.
42
3.4.3.3 Autoclave (Sarmiento & Amaya, 2010)
El método organosólvico requirió la preparación de una solución 0,6M de H2SO4 con 3,32% de me-
tanol. Se utilizó metanol del 98% y H2SO4 al 96% y 1,84 g/cm3 de densidad.
1. En un frasco de vidrio de 400mL autoclavable se pesaron 2g de biomasa, junto con una
proporción de 10mL de la solución ácida por cada gramo de biomasa. Se colocó el frasco
semicerrado en la autoclave marca Geared Gauge de 25L de capacidad y se autoclavó du-
rante 4 horas a 121°C y 1,15 atm.
2. Luego del tiempo transcurrido, la biomasa se secó, homogenizó y trituró para la posterior
extracción con solventes.
A continuación, en la Tabla 3.7, se señalan los materiales utilizados y en la Figura 3-2 un esquema
general de los métodos de disrupción celular probados.
Tabla 3.7 Materiales para los métodos de disrupción
Equipos Materiales Reactivos
Agitador magnético
Equipo de microonda
Autoclave
Estufa
Potenciómetro
Microscopio óptico
Vasos de precipitación
Balones aforados 1L y 0,5L
Envases autoclavables
Papel aluminio
Papel film
HCl 36% p-p y 1,19g/cm3
H2SO4 96% y 1,84 g/cm3
Metanol 98%
Agua desmineralizada para labo-
ratorio Tipo II (Conductividad
eléctrica a 25 ºC 0,056 μS/cm)
Figura 3-2 Esquema métodos de disrupción celular
Métodos de disrupción celular
Solución ácida
Biomasa 2g +20mL HCl 0,5M
Agitación 30min
Microonda
Biomasa 2g+20mL agua
Condiciones según el método del
equipo
Autoclave (organosólvico)
Biomasa 2g+20mL 3,32% metanol y
0,6M H2SO4
Autoclavar 4 horas 121 C y 1,15atm
Biomasa seca 13IGa2
43
3.4.3.4 Evaluación de métodos de disrupción
La evaluación de los métodos de disrupción empleados se llevó a cabo con la observación y contaje
de células en cámara de Neubauer.
1. Se pesó en un tubo de ensayo, aproximadamente, 0,1g de biomasa seca y homogenizada
después de aplicado el método de disrupción.
2. Se agregó 1mL de agua destilada y se agitó vigorosamente.
3. Se llenó la cámara de Neubauer con la suspensión de células y se observó bajo el microsco-
pio.
3.4.4 Métodos de extracción
Se aplicaron cuatro métodos de extracción que incluyeron dos con aplicación de una fuente externa
de calor, método Söxhlet con solvente hexano y con solvente éter dietílico (Ver Anexo 5). Y dos
métodos de extracción con mezcla de solventes utilizando ciclos de ultrasonido y centrifugación, el
primero con cloroformo-metanol proporción 1:2, y el segundo con hexano-isopropanol proporción
3:2.
3.4.4.1 Método Bligh & Dyer (1959) adaptado para la extracción de lípidos de microalgas
(Arredondo & Voltolina, 2007).
Este método fue diseñado para una cantidad mínima de microalgas liofilizadas, los materiales se
detallan en la Tabla 3.8 y el procedimiento en el diagrama de bloques de la Figura 3-3.
1. Se pesaron, aproximadamente, dos gramos de microalgas secas y se colocaron en un Winkler
color ámbar para protegerlas de la luz.
2. Se preparó una mezcla anhidra de solventes cloroformo-metanol (1:2) volumen–volumen y
se colocó en el frasco ámbar. Por cada gramo de biomasa 60 mL de solvente.
3. Se sonificó el Winkler durante 15 minutos en un baño de hielo.
4. Esta suspensión se refrigeró durante 24 horas a 4ºC.
5. Se sonificó el Winkler por 3 ciclos de 15 minutos cada uno.
6. Se centrifugó a 2000 rpm por 20 minutos, y se recuperó el extracto.
7. A la biomasa residual se le agregó la mitad del primer volumen de mezcla cloroformo-me-
tanol (1:2) y se volvió a centrifugar a 2000 rpm por 20 minutos. Se recuperó el extracto y se
repitió por una vez más.
8. Todos los extractos se combinaron en un solo recipiente y se agregó un volumen de agua
destilada en una relación 40:1 con respecto al peso de microalgas inicial.
44
9. Se agitó en un vortex por 2 minutos, se colocó la solución en un embudo de separación y se
esperó que la emulsión se separe.
10. La fase clorofórmica se evaporó en una campana extractora de gases a temperatura ambiente
en cajas Petri taradas.
Figura 3-3 Diagrama de Bloques para el método de extracción Bligh & Dyer
45
Tabla 3.8 Materiales para el método Bligh & Dyer
Equipos Materiales de
laboratorio
Reactivos y
soluciones
Balanza analítica Papel aluminio Agua destilada
Refrigerador Vidrio reloj Hielo
Sonificador Recipientes Winkler ámbar Cloroformo 98%
Centrífuga con tubos de 100 mL Probeta 100 mL Metanol 98%
Vortex Pipetas
Pera de succión
Cajas de Petri
Embudo de separación
3.4.4.2 Método Söxhlet (UNAM, 2008)
Los materiales se describen en la Tabla 3.9 y el diagrama de bloques en la Figura 3-4.
Figura 3-4 Diagrama de Bloques para el Método Söxhlet
46
1. Se pesaron, aproximadamente, 2g de muestra seca.
2. Se colocó en el interior de un dedal de celulosa o papel filtro la biomasa, y éste a su vez en
la cámara del equipo Söxhlet.
3. Se añadió de 200mL a 300mL de solvente, dependiendo del tamaño del equipo.
4. Se armó el equipo como en la Figura 2.10.
5. Se brindó calor con ayuda de una cocineta eléctrica.
6. Desde que empezó la primera condensación y reflujo se esperó 4 horas.
7. Se destiló el exceso de solvente dejando, aproximadamente, 30-50ml en el balón.
8. Se enfrió y evaporó el solvente en cajas taradas.
9. Por diferencia de peso se calculó el material extraído
Tabla 3.9 Materiales para el método Söxhlet
Equipos Materiales de
Laboratorio
Reactivos y
soluciones
Balanza analítica Papel aluminio Agua destilada
Equipo Söxhlet Papel filtro Hexano 99%
Sonicador Mangueras Éter 99%
Estufa
3.4.4.3 Método Bligh & Dyer modificado (Salazar, 2012)
1. Se preparó una solución 3:2 de hexano – isopropanol.
2. Se pesaron, aproximadamente, dos gramos de microalgas secas y se colocaron en un Winkler
color ámbar para proteger a las microalgas de la luz.
3. Se colocó en el frasco ámbar por cada gramo de biomasa 10 mL de solvente.
4. Se sonificó el Winkler durante 15 minutos en un baño de hielo y se homogenizó en vortex a
velocidad baja por 5 minutos.
5. Esta suspensión se refrigeró durante 24 horas a 4ºC.
6. Se sonificó el Winkler por 3 ciclos de 15 minutos.
7. Se centrifugó a 2000 rpm por 20 minutos, y se recuperó el extracto.
8. A la biomasa residual se agregó la mitad del primer volumen de mezcla hexano-isopropanol
(3:2), se volvió a centrifugar a 2000 rpm por 20 minutos y se recuperó el extracto. Este
proceso se repitió por una vez más.
9. Todos los extractos se combinaron en un solo recipiente y se agregó un volumen de agua
destilada en una relación 40:1 con respecto al peso de microalgas inicial.
10. Se agitó en un vortex por 2 minutos, se colocó la solución en un embudo de separación y se
esperó que la emulsión se separe.
47
11. La fase hexánica se colocó en cajas Petri taradas y el hexano se evaporó en una campana
extractora de gases a temperatura ambiente.
A continuación se describe en la Tabla 3.10 los materiales, y en la Figura 3-5 el diagrama de bloques,
del Método Bligh & Dyer modificado.
Figura 3-5 Diagrama de Bloques para el Método Bligh & Dyer modificado
48
Adicionalmente, se realizó la extracción sin método de disrupción previo como tratamiento control
con cada uno de los métodos de extracción.
Tabla 3.10 Materiales para el Método Bligh & Dyer modificado
Equipos Materiales de
laboratorio
Reactivos y
soluciones
Balanza analítica Papel aluminio Agua destilada
Refrigerador Vidrio reloj Hielo
Sonificador Recipientes Winkler ámbar Hexano 98%
Centrífuga con tubos de 100 mL Probeta 100 mL Isopropanol 98%
Vortex Pipetas
Pera de Succión
Cajas de Petri
Embudo de separación
3.4.5 Análisis gravimétrico
Se evaluó el porcentaje de lípidos extraídos en peso seco de biomasa gravimétricamente. Se dejó
evaporar, en sorbona de seguridad, hasta sequedad el solvente de la caja Petri y se calculó según la
siguiente ecuación:
%𝐿í𝑝𝑖𝑑𝑜𝑠 =𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑐𝑎𝑗𝑎 𝑦 𝑙í𝑝𝑖𝑑𝑜𝑠 − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑐𝑎𝑗𝑎 𝑡𝑎𝑟𝑎𝑑𝑎
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎∗ 100%
3.4.6 Método de Metilación
El método utilizado para la metilación de ácidos grasos, previo al análisis cromatográfico, se realizó
de acuerdo a la técnica: Preparación de metil ésteres de ácidos grasos de la AOCS Official Method
Ce 2-66 que se encuentra resumida en la Figura 3-6 y los materiales en la Tabla 3.11.
Tabla 3.11 Materiales para el método de metilación
Equipos Materiales de laboratorio Reactivos y soluciones
Cocineta Erlenmeyer 125 mL Metanol 5% NaOH
Equipo de reflujo Pipetas graduadas BF3 20% en metanol
Pipeta automática Viales para cromatografía Hexano grado cromatográfico
Balanza analítica Tubos de ensayo Solución saturada de NaCl
(±0,0001g) Gradilla
Pera de succión
1. Se pesaron, aproximadamente, 100 mg de la grasa obtenida a partir de los métodos de ex-
tracción.
2. Se colocó en un Erlenmeyer esmerilado de 125 mL y se adicionaron 4 mL de una solución
de metanol grado cromatográfico al 5% de NaOH.
3. Se reflujó durante 10 minutos, aproximadamente, hasta que la solución en el balón fue total-
mente homogénea.
49
4. Se colocó 5 mL de BF3 en metanol y se continuó el reflujo por 5 minutos más. Se agregó 5
mL de hexano, grado cromatográfico, se agitó por 30 segundos y se continuó reflujando, a
temperatura baja, por 5 min más.
5. Se dejó enfriar y se colocó el contenido del Erlenmeyer en un tubo de ensayo.
6. Se agregaron 10 mL de una solución saturada de NaCl, para que la emulsión se separe. Se
tomó con una pipeta la fase apolar, ubicada por su densidad sobre la fase polar, que se intro-
dujo en un vial para su lectura en el cromatógrafo de gases.
Figura 3-6 Diagrama de Bloques del Método de metilación
50
3.4.7 Método para el análisis cromatográfico
Para el análisis de la composición de los aceites extraídos se utilizó un equipo de Cromatografía de
Gases YL Instrument 6500GC System, acoplado a un detector de ionización de llama, con una co-
lumna capilar de Fase reversa.
Se utilizó una columna de 60m de longitud x 0,25mm de diámetro interno SELECTA FAME y 0,2
µm de espesor de fase. La técnica utilizada fue de flujo completo (splitless), con un volumen de 2µm.
La velocidad en la columna fue de 27,7cm/seg, 2,0ml/min. Y un flujo de hidrógeno de 30,0mL/min.
La temperatura del inyector fue de 100° C y la temperatura del detector de 240° C. Se utilizó como
gas de arrastre aire a 300,0mL/min. La temperatura del horno inicial fue de 100° C. Se incrementó a
razón de 4° C/min hasta llegar a la temperatura final de 250° C la cual se mantuvo por 50 minutos.
Se realizó una línea base con hexano grado cromatográfico, que se detectó en el cromatograma como
un pico alto a los 4 minutos. La identificación de los ésteres metílicos de ácidos grasos de las muestras
lípidicas de las microalgas antárticas se realizó por comparación con los tiempos de retención del
estándar FAME C4-C24, que es una mezcla de ácidos grasos que va del ácido butírico hasta el ácido
tetracosanoico, analizado a las mismas condiciones. Con las áreas de los picos del cromatograma se
determinó la concentración de cada ácido extraído.
3.4.8 Tratamiento de microalgas
Microalgas recolectadas en diferentes puntos de la Antártida se filtraron y luego se secaron in situ
sobre papel aluminio en estufa a 80°C durante una hora. Se guardaron en fundas portamuestras con
cierre hermético, y se transportaron en cooler a Ecuador, donde se las almacenó en refrigeración a
4°C hasta el análisis.
En la Facultad de Ciencias Químicas se procedió a disminuir el tamaño de partícula de las muestras
hasta conseguir un polvo fino homogéneo con la ayuda de un molino de bolas, aproximadamente,
durante 15 minutos a velocidad media.
Se realizó la extracción del aceite de las muestras de microalgas utilizando el mejor método de dis-
rupción y extracción encontrados, posteriormente, se analizó el perfil lipídico por cromatografía de
gases.
51
CAPÍTULO IV
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓNbbbbb
En este capítulo se detallan los resultados de los porcentajes de lípidos obtenidos de las muestras de
microalgas antárticas, así como, también, la composición cualitativa y cuantitativa de los ácidos gra-
sos determinados por cromatografía de gases en función de la combinación de métodos de disrupción
celular y extracción de lípidos.
4.1 Evaluación de métodos de disrupción
Luego de aplicados los diferentes métodos de disrupción a las microalgas del consorcio 13IGa2 se
procedió a realizar el contaje de células en la cámara Neubauer, se registró las que estaban en buen
estado, así como la presencia de aglomerados, deformaciones, células sin membrana y el color (Tabla
4.1). En la Figura 4.1 puede apreciarse la apariencia macroscópica de las muestras después de apli-
cado el método de disrupción.
Tabla 4.1 Evaluación de métodos de disrupción
Método de
disrupción
Células to-
tales/
mL
% células
afectadas Color Observaciones
Control 1,7x105 0% Verde brillante Células completamente turgen-
tes.
HCl 0,5 M 1,9x105 45% Verde opaco
amarillento
Las células se ven disminuidas.
No se observaron membranas en
el contorno celular.
Microonda 1,2x105 63% Verde brillante Células deformadas y aglomera-
das.
Organosólvico
(Autoclave)
0,9x105 87% Café verdoso Células aglomeradas, deforma-
das y sin turgencia.
Después de la aplicación de los métodos de disrupción, pudo observarse células deformadas, aglo-
meradas, sin membrana celular. El porcentaje de células afectadas aumentó según la agresividad del
método empleado, de la siguiente manera y en orden ascendente: HCl 0.5, microonda y organosó-
lvico, con este último se obtuvieron mejores resultados debido a las condiciones de presión (1,1 atm),
temperatura (121°C) y tiempo (4 horas).
Con el método de microonda no se observó decoloración de clorofila, pero bajo el microscopio se
apreciaron las células destruidas y aparentemente sin membrana. Los métodos con HCl al 0,5 M y el
organosólvico autoclave, al ser métodos químicos, se semejan. La clorofila se deterioró obscure-
ciendo a la muestra con una coloración verde oscura-café. El método ácido utilizó una solución de
HCl 0,5 M y 30 minutos de agitación mecánica, siendo el método menos costoso y con menor gasto
52
energético, sin embargo, solo produjo un 45% de células afectadas. La concentración de HCl ha sido
evaluada por Sarmiento & Amaya (2010) estableciéndose que 0,5 M es la óptima para la extracción,
sin embargo, el tiempo de agitación y temperatura mayor a la ambiental no han sido estudiados y
podrían ser optimizados.
El método de microonda utiliza un equipo electrónico sofisticado y requiere un gasto energético
mayor que el método ácido. En la presente investigación se evaluó el método de disrupción con
microonda separado del método de extracción, sin embargo, ambos pueden conjugarse en un único
paso, inclusive hasta llegar a la síntesis del biocombustible como lo establecieron Batista, Vetter, &
Luckas (2001), que obtuvieron los parámetros para programar el equipo microonda. En este caso, el
método de disrupción con microonda del presente estudio, que produjo un 63% de células afectadas,
podría resultar más eficiente, económico y rápido.
El método organosólvico consume mucha energía, reactivos y tiempo lo que lo convierte en un mé-
todo costoso. Sin embargo, es el mejor método de disrupción debido al alto porcentaje de células
afectadas (87%). Mientras más células se ven dañadas por el método de disrupción, se deduce que la
extracción de lípidos será más eficaz.
4.2 Análisis del porcentaje de lípidos extraídos
Puede observarse en la Figura 4-2 la media del porcentaje de lípidos obtenidos del consorcio de
microalgas 13IGa2 con cada método de disrupción celular y extracción. Los datos de los porcentajes
de lípidos extraídos se detallan en el Anexo 6.
Figura 4-1 Microalgas después del método de disrupción a) HCl 0,5M b) mi-
croonda, c) autoclave
53
Para todos los métodos de extracción, la producción de lípidos mejoró conforme el método de dis-
rupción fue más intenso. El mayor porcentaje de lípidos extraídos (7,96±0,17% en peso seco) se
estableció con el método Bligh & Dyer que utiliza cloroformo y metanol como disolventes y auto-
clave como método de disrupción. Este resultado es menor al encontrado en la bibliografía (Serrano,
2012) de 32,7%, que utiliza el método Bligh & Dyer con disrupción celular por sonicación.
Las dos curvas que sobresalen por su proximidad y semejanza pertenecen a los métodos de Bligh &
Dyer y Söxhlet con solvente hexano, ambos métodos han sido utilizados ampliamente para la extrac-
ción de lípidos en microalgas, pues proporcionan resultados repetibles y reproducibles (Monthieu,
2010). El método de Bligh & Dyer es considerado un método oficial que no usa calor y que permite
extraer la mayor cantidad de ácidos grasos diferentes, incluyendo los de cadena corta (C<8). El mé-
todo Söxhlet, en cambio, utiliza hexano como solvente, que es menos tóxico, además, facilita la
recuperación del solvente (Sarmiento & Amaya, 2010). Así, este método puede considerarse el más
amigable con el ambiente.
Figura 4-2 Porcentaje de lípidos obtenidos en biomasa seca con diferentes métodos de
disrupción celular y extracción. Barras de error corresponden a una desviación están-
dar de tres repeticiones.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Control HCl Microonda Autoclave
Po
rcen
taje
de
Líp
ido
s E
xtr
aíd
os
Métodos de disrupción
Bligh & Dyer
Söxhlet Hexano
Bligh&Dyer
mod
Söxhlet Eter
54
Cuando no se utilizan técnicas de disrupción el método Bligh & Dyer modificado se asemeja al
método Söxhlet con solvente éter. Fueron los porcentajes más bajos obtenidos en todos los ensayos.
Con HCl la extracción mejora para el método Söxhlet con solvente éter, pero B&D modificado me-
jora muy poco. El éter utilizado como disolvente no consigue extraer todo el material lipídico de las
muestras de microalgas y son necesarios métodos de disrupción más agresivos apara aumentar el
porcentaje de aceite. Cuando el material lipídico es extraído con una mezcla de solventes, como en
el método Bligh & Dyer, se obtiene mejor resultado cuantitativo que con un único solvente apolar
como el hexano. La disrupción es la que propicia un mejor resultado en la extracción. El método de
autoclave es muy severo y con él se obtienen los más altos porcentajes en todas las técnicas de ex-
tracción probadas.
4.3 Análisis Estadístico
4.3.1 Análisis de varianza
En la Tabla 4.2 se describe el análisis estadístico realizado para el diseño experimental propuesto,
que ayudó a determinar los mejores métodos de extracción y de disrupción celular.
Para la prueba de homogeneidad de varianzas, en el caso de los métodos de extracción aplicados, el
valor de F calculado fue de 759,166, y los valores críticos a 95% y 99% fueron 2,901 y 4,460, res-
pectivamente; esto indica que la varianza de los métodos de extracción con respecto a la varianza del
error experimental muestra una diferencia altamente significativa, que se denota con (**). De igual
manera, la diferencia entre varianzas es significativa para el caso de los métodos de disrupción, en
donde la F calculada fue de 1567,351 y los valores críticos a 95% y 99% fueron 2,901 y 4,460,
respectivamente. Para la interacción de factores, el valor F calculado fue de 47,947 y sus valores
críticos fueron 2,189 y 3,021 a 95% y 99%, respectivamente, existiendo una diferencia altamente
significativa entre las varianzas y el error experimental.
Tabla 4.2 Análisis de varianza porcentaje de lípidos peso seco.
Origen
de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Promedio
de los
cuadrados
F Probabilidad Valor crítico
para F
95% 99%
Método de
Extracción 67,329 3 22,443 759,166** 8,46739E-30 2,901 4,460
Método de
Disrupción 139,004 3 46,335 1567,351** 8,74521E-35 2,901 4,460
Interacción 12,757 9 1,4174 47,947** 4,67451E-16 2,189 3,021
Error 0,946 32 0,0295
Total 220,036 47
La F calculada tanto para los métodos de extracción, los métodos de disrupción y para la interacción
entre ambas técnicas fue mayor que la F tabulada al 95 y 99% de confianza. Se acepta, entonces, la
55
hipótesis alternativa de que existe diferencia significativa entre los métodos de extracción, los mé-
todos de disrupción y la interacción entre ellos. Se categorizaron los resultados para comprobar si
existen semejanzas entre tratamientos con la ayuda de la prueba de Tukey.
4.3.2 Prueba Tukey
Ya que el objetivo de la presente investigación era establecer el mejor método con el que se obtenga
el mayor rendimiento de lípidos extraídos se procedió a realizar la prueba Tukey al 95% de confianza
El método de Tukey o Método de la Diferencia Significativa Honesta de Tukey (DSH) es una prueba
estadística que clasifica en orden los tratamientos efectuados y los posiciona en categorías de acuerdo
al valor Tukey. El número total de tratamientos fueron 16, y los grados de libertad del error fueron
32. El valor crítico (𝑞𝑎,𝑘,𝑔/𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟) fue de 5,25, que se obtuvo de la tabla de rangos estudentizados al
95% del Anexo 13. El DSH calculado según la Ecuación 3.1 fue de 0,52 al 95%, contra el cual se
compararon las diferencias de las medias (Anexo 15).
En la Tabla 4.3, se presentan las categorías encontradas, después de las comparaciones múltiples
correspondientes. Métodos con letras iguales pertenecen a la misma categoría.
Tabla 4.3 Categorización de métodos de extracción y disrupción
Extracción Disrupción Codificación Media Categorías
Bigh&Dyer Autoclave 3.4 7,96 a
Söxhlet Hexano Autoclave 2.4 7,29 b
Bigh&Dyer Microonda 3.3 6,32 c
Bigh&Dyer mod Autoclave 4.4 6,21 c
Söxhlet Hexano Microonda 2.3 5,77 c
Bigh&Dyer mod Microonda 4.3 5,28 c
Bigh&Dyer HCl 3.2 4,54 d
Söxhlet Hexano HCl 2.2 4,32 d
Söxhlet Éter Autoclave 1.4 3,90 d
Bigh&Dyer Control 3.1 3,24 e
Söxhlet Éter Microonda 1.3 3,08 e
Söxhlet Hexano Control 2.1 2,56 f
Söxhlet Éter HCl 1.2 2,12 f
Bigh&Dyer mod HCl 4.2 1,36 g
Bigh&Dyer mod Control 4.1 1,06 g
Söxhlet Éter Control 1.1 1,04 g
Del ordenamiento de las medias de los 16 tratamientos empleados para extracción de lípidos de mi-
croalgas antárticas se definieron siete categorías. La categoría a que pertenece al método Bligh &
Dyer (B&D) con autoclave presentó el mayor porcentaje de lípidos extraídos. Combina el método
clásico de extracción de lípidos para microalgas con el método más agresivo de disrupción. Le sigue
la categoría b con el método Söxhlet con hexano y autoclave. Ambos métodos de extracción están
56
combinados con la disrupción con autoclave, que sobresale de entre los métodos de disrupción. El
método Bligh & Dyer no requiere una fuente externa de calor y trabaja con una mezcla cloroformo -
metanol, mientras que el método Söxhlet requiere un reflujo de 4 horas y utiliza hexano como sol-
vente. Aunque los dos métodos son diferentes se asemejan en los resultados de extracción al combi-
narse con el método de disrupción por autoclave, que mejoró la extracción.
La categoría c se encuentra formada, mayoritariamente, por los procedimientos que utilizaron mi-
croonda como método de disrupción. El método se posiciona en una categoría inferior a la disrupción
con autoclave que se encuentra en las categorías a y b. Para la misma técnica de disrupción con
autoclave, B&D modificado que se encuentra en la categoría c, es inferior a B&D que se encuentra
en la categoría a. El método de disrupción con microonda, tomando en cuenta las categorías a y b,
es el segundo método de disrupción de importancia.
En la categoría c destacan los método de extracción Bligh & Dyer y Bligh & Dyer modificado que
no utilizan fuente de calor. El método Bligh & Dyer modificado, que trabaja con una mezcla isopro-
panol-hexano, es el tercer método de extracción en importancia, considerando el porcentaje de lípi-
dos extraídos.
En la cuarta categoría d, aparecen por primera vez el método de extracción con éter y el método de
disrupción con HCl. Puede observarse que, en general, los métodos de extracción Bligh & Dyer y
Söxhlet con hexano aparecen juntos, siempre que el método para el rompimiento celular sea el
mismo. A partir de la cuarta categoría no se presentan resultados aceptables de extracción.
En la quinta categoría e, aparece el primer método sin disrupción, Bligh & Dyer, que es, sin duda, el
mejor método de extracción, ya que sin ayuda de un método de disrupción, se encuentra en la misma
categoría de un método de disrupción con microonda. El siguiente método sin disrupción es Söxhlet
hexano pero se encuentra en la categoría f. A partir de la categoría e pueden analizarse los procedi-
mientos que se realizaron sin aplicar ningún método de disrupción, que fueron nombrados como
control. Ordenados del mejor al peor se encuentran: Bligh & Dyer, Söxhlet con hexano y, en la última
categoría, B&D modificado y Söxhlet con éter.
En las categorías f y g están los métodos sin disrupción faltantes, que presentan los porcentajes más
bajos de extracción obtenidos, comprobándose que utilizar una técnica de disrupción previa sí mejora
la extracción de lípidos. El método de disrupción con HCl es de los menos eficientes entre los apli-
cados para la extracción de material lipídico en microalgas. Se ubica en la misma categoría, g, de los
procedimientos que no utilizaron método de disrupción. La disrupción con HCl es muy pobre com-
parada con autoclave o microonda. Sin métodos de disrupción, B&D modificado es similar a Söxhlet
con éter.
57
El solvente menos eficaz resultó ser éter dietílico, con índice de polaridad 2,8, uno de los solventes
más apolares probados. Sin embargo, el hexano, con índice de polaridad de cero, proporcionó mejo-
res resultados. La combinación de solventes con diferentes índices de polaridad como el cloroformo
(4,1) con metanol (5,1) en el método B&D, permitió extraer mayor cantidad de lípidos, ya que com-
bina propiedades de solventes apolares con polares. El método B&D fue uno de los más eficaces,
pues el material lipídico que fue extraído conjuntamente con otros componentes, se recupera durante
el procedimiento de la última etapa en el solvente más apolar.
En la Tabla 4.4 se puede diferenciar, después de la categorización de los resultados, cuáles son los
métodos de extracción que utilizan una fuente externa de calor y cuáles no. No utilizan calor los
métodos B&D y B&D modificado y emplean calor los métodos Söxhlet con éter o hexano. El calor
no mejora la extracción. Es más preponderante el uso del solvente adecuado.
Tabla 4.4 Métodos de extracción con o sin calor
Extracción Disrupción Categoría Calor
Bigh&Dyer Autoclave a NO
Söxhlet Hexano Autoclave b SI
Bigh&Dyer Microonda c NO
Bigh&Dyer mod Autoclave c NO
Söxhlet Hexano Microonda c SI
Bigh&Dyer mod Microonda c NO
Bigh&Dyer HCl d NO
Söxhlet Hexano HCl d SI
Söxhlet Éter Autoclave d SI
Bigh&Dyer Control e NO
Söxhlet Éter Microonda e SI
Söxhlet Hexano Control f SI
Söxhlet Éter HCl f SI
Bigh&Dyer mod HCl g NO
Bigh&Dyer mod Control g NO
Söxhlet Éter Control g SI
En las primeras tres categorías, a, b y c, destacan los métodos que no aplican calor. Solamente el
método Söxhlet con hexano, que utiliza calor, está en las mismas categorías. En las categoría infe-
riores puede encontrarse al método Bligh & Dyer, que no aplica calor, pero combinado con los mé-
todos de disrupción de más bajo rendimiento que fueron HCl y el método control.
4.4 Análisis cualitativo de ácidos grasos
En la Tabla 4.5 se detallan los ácidos grasos identificados mediante cromatografía gaseosa en el
aceite obtenido del consorcio de microalgas 13IGa2 para cada proceso de extracción. Se observa la
58
diferencia de los perfiles lipídicos de acuerdo al método de extracción utilizado. En el extremo su-
perior de la tabla se encuentran los ácidos saturados, seguidos de los insaturados y poliinsaturados y
al final el ácido linoleaidico, isómero trans del ácido poliinsaturado linolénico (ver cromatogramas
en los Anexos 9 al 12).
Tabla 4.5 Análisis cualitativo de ácidos grasos del consorcio 13IGa2
Métodos Control HCl Microonda Autoclave
Ácido graso identificado
Sö
xh
let
éter
Sö
xh
let
hex
ano
Bli
gh&
Dy
er
Bli
gh&
Dy
er m
od
Sö
xh
let
éter
Sö
xh
let
hex
ano
Bli
gh&
Dy
er
Bli
gh&
Dy
er m
od
Sö
xh
let
éter
Sö
xh
let
hex
ano
Bli
gh&
Dy
er
Bli
gh&
Dy
er m
od
Sö
xh
let
éter
Sö
xh
let
hex
ano
Bli
gh&
Dy
er
Bli
gh&
Dy
er m
od
Cáprico C10:0
Laurico C12:0
Mirístico C14:0
Palmítico C16:0
Esteárico C18:0
Araquidico C20:0
Miristoléico C14:1
Palmitoleico C16:1
Oleico C18:1n9c
Linoleico C18:2n6c
γ-Linolenico C18:3n6
Linolénico C18:3n3
Linoleaidico C18:3n6T
El ácido cáprico es el ácido graso de cadena corta más pequeño identificable en el consorcio 13IGa2.
El mismo se detecta únicamente usando el método B&D modificado sin disrupción, que emplea una
mezcla hexano y 2-propanol relación 3:2 y no requiere una fuente externa de calor para la extracción.
Con los otros métodos de extracción, el ácido cáprico no es detectable; inclusive, con el método B&D
modificado, con solución de HCl 0,5 M como método de disrupción, este ácido ya no se detecta,
debido a la intensidad del método de disrupción. El método B&D modificado muestra que la combi-
nación de solventes junto con las polaridades de los mismo ayuda a que una mayor diversidad de
ácidos grasos sean extraídos.
El ácido linoleaidico, un ácido trans, fue detectado utilizando Söxhlet-éter y B&D, con microondas
o autoclave. La formación de éste ácido puede deberse al empleo de calor durante la disrupción o
extracción, pero, también puede ser detectado en forma natural, en cantidades bajas, utilizando úni-
camente el método de Bligh & Dyer (ver Tabla 4.6) (Rubio, Chica, & Parra, 2013).
59
El ácido linolénico es un ácido de cadena larga y tres instauraciones. El método B&D modificado es
capaz de extraerlo en combinación con todos los procesos de disrupción evaluados, incluido el con-
trol. Con el método Söxhlet con hexano, este ácido es detectado cuando se emplea disrupción de
microonda y autoclave; lo que indica que la combinación de métodos de disrupción y extracción
afecta el perfil lipídico de microalgas que se obtiene.
El ácido miristoleico, debido a su polaridad media proveniente de una cadena C14 y un doble enlace,
únicamente fue extraído con el método Söxhlet con solvente hexano y sin ningún método de disrup-
ción. El ácido tiene un doble enlace reactivo químicamente y es posible que reaccione durante los
tratamientos de disrupción. Además, el largo de la cadena puede facilitar la reactividad del ácido, a
diferencia de los ácidos grasos de cadena larga que no presentan insaturaciones que son más estables
y casi no se ven alterados. El ácido palmitoleico y oleico, monoinsaturados pero con cadena hidro-
carbonada más larga, son más apolares y fueron extraídos por todos los métodos probados.
El resto de ácidos grasos identificados: laurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquidico y linoleico,
están presentes en todos los métodos de extracción y disrupción ensayados. El ácido γ-linolenico no
fue detectado por el método B&D control.
El género Chrolella sp., debido a su fácil adaptabilidad, es muy utilizado para evaluar el crecimiento
en distintos medios de cultivos (Montero-Sánchez, Gallo, & Gómez, 2012). El perfil lipídico del
consocio 13IGa2, obtenido por B&D sin disrupción, se comparó con el perfil de dos estudios que
igualmente emplearon Bligh & Dyer (Tabla 4.6).
Los perfiles lipídicos no coinciden en su totalidad entre las tres fuentes, a pesar de que usaron el
mismo método de extracción. Probablemente a que los estándares utilizados para el análisis croma-
tográfico no contenían los mismos ácidos grasos. En el presente trabajo no se contó con estándares
del ácido eicosapentaenoico, pentadecanoico y margánico. En el ensayo de Rubio, Chica, & Parra
(2013) no se detectaron ácidos grasos de cadena media (<C15), pero se detectaron ácidos de cadena
larga (>C18).
En el ensayo de Ugalde (2011) se detectaron los ácidos eicosapentaenoico, pentadecanoico y margá-
nico. Existen seis ácidos grasos que son comunes a los tres ensayos: esteárico, araquidico, palmito-
leico, oleico, linoleico y palmítico; de los cuales, los tres últimos son necesarios para la síntesis de
biocombustibles.
60
Tabla 4.6 Comparación del porcentaje de ácidos grasos en perfil lipídico de Chlorella sp.
Ácidos grasos identificados Consorcio
13IGa2 (Ugalde,
2011)
(Rubio, Chica, & Parra,
2013)
Cáprico C10:0 --- --- ---
Laurico C12:0 0,02 0,3 ---
Mirístico C14:0 0,01 5,8 ---
Pentadecanoico C15:0 --- 0,6 ---
Palmítico C16:0 0,21 30,9 23,13
Margánico C17:0 --- 0,2 ---
Esteárico C18:0 0,03 0,6 4,76
Araquidico C20:0 0,13 3,7 6,34
Miristoléico C14:1 --- ---
Palmitoleico C16:1 0,07 31,2 0,40
Oleico C18:1n9c 0,38 4,7 26,33
Linoleico C18:2n6c 0,18 5,5 14,09
γ-Linolenico C18:3n6 0,02 --- ---
Linolénico C18:3n3 --- --- 9,03
Eicosapentaenoico C20:5n3 --- 16,4 0,52
Linoleaidico C18:3n6T --- --- 0,39
4.5 Análisis cuantitativo de ácidos grasos
La determinación de la concentración de ácidos grasos presentes en el consorcio de microalgas
13IGa2 se realizó por CG, comparando el área del pico encontrado con la de un estándar de ésteres
de ácidos grasos. Por ejemplo, disrupción con autoclave y cuatro métodos de extracción (Fig. 4-3)
Figura 4-3 Cromatogramas de lípidos del consorcio de microalgas 13IGa2
con disrupción por autoclave y diferentes métodos de extracción.
61
En los cromatogramas puede observarse la variación del perfil lipídico dependiendo de los distintos
métodos de disrupción y extracción utilizados para la misma biomasa. También la extracción con
B&D modificado con varios métodos de disrupción (Fig. 4-4).
En los cromatogramas se observa que la intensidad y el número de picos identificados varían según
la combinación de métodos empleados.
En la Tabla 4.7 se presentan los porcentajes de ácido grasos, en peso seco de biomasa, obtenidos con
los distintos tratamientos. Los grupos de ácidos grasos más representativos del aceite de microalgas
antárticas, consistentes en la mayoría de métodos de extracción, son los ácidos grasos saturados:
palmítico y araquídico; los insaturados como oleico, linoleico y linolénico (Figura 4-5). Estos dos
últimos ácidos, con dos y tres instauraciones, respectivamente, son los ácidos omega 6 y 3, funda-
mentales en la dieta humana.
Figura 4-4 Cromatogramas de lípidos del consorcio de microalgas 13IGa2 extraídos
con el método Bligh & Dyer modificado y diferentes técnicas de disrupción.
62
Tabla 4.7 Perfil lipídico del consorcio 13IGa2 con diferentes métodos de extracción y disrupción, datos promedio
Control HCl Microonda Autoclave
Ácido
graso
(% peso seco)
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Cáprico C10:0 --- --- --- 0,01 --- --- --- --- --- --- --- 0,02 --- --- --- 0,03
Laurico C12:0 0,02 0,27 0,02 0,01 0,02 0,26 0,03 0,01 0,00 0,41 0,06 0,08 0,00 0,05 0,04 0,04
Mirístico C14:0 0,01 0,04 0,02 0,01 0,02 0,11 0,05 0,01 0,04 0,06 0,06 0,03 0,04 0,05 0,04 0,05
Palmítico C16:0 0,21 0,36 0,82 0,31 0,71 1,32 1,78 0,50 0,67 1,26 1,47 2,21 1,09 2,11 1,69 1,54
Esteárico C18:0 0,03 0,09 0,11 0,03 0,13 0,33 0,22 0,03 0,10 0,49 0,23 0,16 0,09 0,62 0,12 0,13
Araquídico C20:0 0,13 0,41 0,46 0,09 0,13 0,45 0,22 0,11 0,42 0,30 0,85 0,33 0,43 0,71 1,22 0,81
% ácidos saturados 0,40 1,18 1,43 0,46 1,01 2,48 2,30 0,66 1,22 2,51 2,66 2,82 1,66 3,56 3,12 2,60
Miristoléico C14:1 --- 0,08 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
Palmitoleíco C16:1 0,07 0,25 0,15 0,03 0,18 0,10 0,08 0,02 0,27 0,70 0,46 0,12 0,39 0,16 0,94 0,15
Oleico C18:1n9c 0,38 0,74 0,93 0,32 0,63 1,04 1,05 0,35 0,80 1,65 1,70 1,01 0,82 1,67 1,70 1,58
% ácidos
monoinsaturados 0,45 1,07 1,08 0,35 0,82 1,14 1,13 0,37 1,07 2,35 2,16 1,13 1,20 1,83 2,64 1,73
Linoleico C18:2n6c 0,18 0,23 0,69 0,19 0,22 0,51 0,39 0,19 0,55 0,78 1,19 0,49 0,72 1,34 1,69 1,46
γ-Linolénico C18:3n6 0,02 0,09 0,00 0,03 0,07 0,12 0,23 0,08 0,11 0,08 0,22 0,24 0,17 0,29 0,35 0,29
Linolénico C18:3n3 --- --- 0,04 0,03 --- --- 0,50 0,05 --- 0,04 --- 0,60 --- 0,27 --- 0,12
% ácidos
poliinsaturados 0,20 0,32 0,73 0,25 0,29 0,63 1,12 0,32 0,66 0,90 1,41 1,33 0,89 1,90 2,04 1,87
Linoleaidico C18:3n6T --- --- --- --- --- --- --- --- 0,04 --- 0,09 --- 0,08 --- 0,16 ---
% Total 1,05 2,56 3,24 1,06 2,12 4,25 4,54 1,36 3,00 5,77 6,32 5,28 3,83 7,29 7,96 6,21
63
A continuación, en la Figura 4-6, se muestran los perfiles lipídicos del aceite de microalgas antárticas
con los ácidos grasos más representativos obtenidos y en la Figura 4-7 se comparan los ácidos grasos
con respecto al total de aceite extraído.
Para el análisis de los lípidos extraídos por los diferentes métodos se utilizó el mismo consorcio de
microalgas antárticas 13IGa2, sin embargo, puede observarse en las Figuras 4-5 y 4-6 que el perfil
lipídico varía según el método empleado.
Figura 4-5 Porcentaje, en peso seco, de grupos de ácidos grasos del consorcio 13IGa2 con
diferentes métodos de extracción y disrupción.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00S
öxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
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Dyer
mod
Söxhle
t ét
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Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Control HCl Microonda Autoclave
Porc
enta
je d
e Á
cid
os
gra
sos
en p
eso
seco
Combinación de métodos de disrupción y extracción
Ácidos Saturados Ácidos monoinsaturados Ácidos poliinsaturados Ácidos trans
64
Figura 4-6 Ácidos grasos más representativos presentes en el aceite del consorcio 13IGa2 según métodos de extracción y disrupción
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Sö
xh
let
éter
Sö
xh
let
hex
ano
Bli
gh
&D
yer
Bli
gh
&D
yer
mo
d
Sö
xh
let
éter
Sö
xh
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hex
ano
Bli
gh
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Bli
gh
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yer
mo
d
Sö
xh
let
éter
Sö
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let
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ano
Bli
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Bli
gh
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mo
d
Sö
xh
let
éter
Sö
xh
let
hex
ano
Bli
gh
&D
yer
Bli
gh
&D
yer
mo
d
Control HCL Microonda Autoclave
Porc
enta
de
áci
dos
gra
sos
en p
eso s
eco
Combinación de métodos de extracción y disrupción
Oleico Palmítico Linoleico Araquidico Linolenico Otros
65
En las Figuras 4-5 y 4-6 destacan los ácidos grasos saturados, que son menos reactivos, y se ven poco
afectados por las condiciones de disrupción y extracción empleadas. El mayor porcentaje extraído,
con respecto a los otros grupos de ácidos, fue con los métodos que utilizaron solventes más apolares,
como Bligh & Dyer y Söxhlet con hexano. Con el método Söxhlet con solvente éter y sin método de
disrupción, la cantidad de ácidos grasos monoinsaturados fue mayor que los saturados. La disrupción
ayuda a extraer mayor cantidad de ácidos saturados de cadena larga, como el araquidico. Por el mé-
todo Bligh & Dyer modificado sin disrupción se extrae 0,09% y con autoclave 0.81%.
Los ácidos grasos monoinsaturados, miristoleico C14:1, palmitoleico C16:1 y oleico C18:1n9c, se
cuantificaron en menor proporción que los saturados. Estos ácidos proporcionan al biodiesel un me-
nor punto de solidificación, una propiedad necesaria si se va a usar en las bajas temperaturas de la
Antártida. Sin embargo, excederse en la concentración de ácidos insaturados puede reducir la efi-
ciencia del biocombustible. Según Serrano (2012) un alto contenido de ácidos grasos insaturados
disminuye la estabilidad oxidativa, el calor de combustión e índice de cetano del biodiesel, disminu-
yendo a la par el punto de nube.
Se puede apreciar en la Figura 4-7 que el porcentaje de ácido oleico varía según el método de dis-
rupción aplicado. Con los métodos HCl y autoclave se detecta una cantidad inferior, debida, proba-
blemente, a que ambos métodos utilizan ácidos para la disrupción celular. El menor porcentaje de-
tectable de ácido oleico fue de 0,32% con el método de B&D modificado sin disrupción. Sin em-
bargo, analizando la Figura 4.6, que presenta el porcentaje de ácido oleico con respecto al peso seco,
se aprecia que los métodos Söxhlet con hexano y Bligh & Dyer con métodos de disrupción de mi-
croonda y autoclave, respectivamente, son los mejores para la extracción de este ácido. Sobresale
entonces, de entre todos los métodos, la combinación de Bligh & Dyer con autoclave que presenta el
mayor porcentaje de lípidos extraídos.
Los ácidos grasos poliinsaturados que se extraen del aceite de las microalgas podrían ser utilizados
para la alimentación humana y animal. Según la Figura 4.5, los métodos con los que se extrae mayor
cantidad de ácidos poliinsaturados son los de Bligh &Dyer y Bligh &Dyer modificado junto con
disrupción por autoclave. La combinación de los solventes cloroformo – metanol y hexano-isopro-
panol, sin aplicación externa de calor, les hace los mejores métodos de extracción para los ácidos
poliinsaturados como: linoleico C18:2n6c, γ-linolenico C18:3n6 y linolénico C18:3n3.
El ácido linolénico (C18:3n3), al tener tres dobles enlaces es inestable y reactivo. Se extrae en can-
tidad apreciable (0,50-0,60% en peso seco), con la combinación B&D y HCl y B&D modificado con
microondas, respectivamente. Este ácido omega 3 es muy valioso en la dieta alimenticia. El Comité
Científico para la Alimentación Humana de la Comisión Europea estableció la ingesta de referencia
66
diaria de ácidos grasos poliinsaturados para la población en 500mg para los omega 3; debiendo,
aproximadamente, consumirse en una relación de 1:5 con respecto a los omega 6, que se recomienda
ingerir diariamente una cantidad de 2,5g.
El ácido linoleico, C18:2n6c, otro ácido graso poliinsaturado, está presente en todos los métodos de
extracción con buen rendimiento. Por lo que otra opción de uso de las microalgas es que podrían
emplearse como suplemento alimenticio sí se consumen secas, luego de las evaluaciones de inocui-
dad necesarias.
4.6 Comparación de un aceite de cocina usado con aceite de microalgas
Para seleccionar el método más adecuado para la obtención de aceite de microalgas debe considerarse
la cantidad y composición del aceite producido. Los ensayos realizados evidenciaron que estos pa-
rámetros pueden variar dependiendo de los métodos de disrupción y extracción empleados.
Figura 4-7 Ácidos grasos más representativos presentes en el aceite del consorcio
13IGa2, según métodos de extracción y disrupción, en porcentaje del aceite extraído
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Söxhle
t ét
er
Söxhle
t hex
ano
Bli
gh&
Dyer
Bli
gh&
Dyer
mod
Control HCL Microonda Autoclave
Porc
enta
je d
e áci
do g
raso
en
el
ace
ite
extr
aíd
o
Combinación de métodos de extracción y metodos de disrupción
Oleico Palmítico Linoleico Araquidico Linolenico Otros
67
Se procedió a comparar los diferentes perfiles producidos con uno obtenido de un aceite de cocina
usado, que suele ser empleado como materia prima para la síntesis de biodiesel. Los ácidos grasos
más importantes para producir biodiesel son palmítico, oleíco y linoleíco, que están presentes en el
aceite de cocina usado; éstos ácidos, también, se encontraron en el aceite de microalgas con todos
los métodos de disrupción-extracción probados.
En la Figura 4-8 se muestra el perfil lipídico de un aceite vegetal usado que está formado, principal-
mente, por tres ácidos grasos: palmítico (C16:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2n6c).
Se realizó la comparación del perfil lipídico del aceite usado con el perfil del consorcio 13IGa2 con
diferente métodos de disrupción y extracción (ver Figura 4-9). Se destaca en el perfil del consorcio
13IGa2 la presencia de ácidos grasos saturados y monoinsaturados de cadena larga como palmítico
(C16:0) y oleico (C18:1); aunque, también, hay una considerable producción de ácido linoléico
C18:2n6c.Los perfiles lipídicos, varían según la combinación de métodos de disrupción y de extrac-
ción empleados; por lo que cada método puede ser evaluado por separado y validado según las ne-
cesidades de producción. Los métodos más agresivos obtuvieron mayor cantidad de material lipídico
y por lo tanto de ácidos grasos. Aunque el perfil lipídico del consorcio de microalgas no es semejante
por completo al perfil del aceite usado, sí es parecida la proporción de ácidos con los métodos Bligh
& Dyer, Söxhlet con solvente hexano y B&D modificado, todos usando la técnica de disrupción
organosolvica con autoclave.
El porcentaje de ácido oleico del aceite usado, que se encuentra en mayor proporción, se comparó
estadísticamente con los diferentes perfiles de microalgas para establecer cuál se asemeja al aceite
Figura 4-8 Perfil lipídico de aceite vegetal
0,21 0,53
23,17
48,04
25,50
0,21 0,42 0,320,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
Po
rcen
taje
de
ácid
os
en e
l ac
eite
Ácidos grasos identificados
68
vegetal usado. El aceite de cocina industrial usado para frituras posee 48,04±0,47 % de ácido oleico,
cuantificado con el mismo método utilizado para el aceite de microalgas. Para la comparación se
empleó la prueba de Dunnett con un 95% de confianza. En la Tabla 4.8 se muestran los resultados
de comparar cada tratamiento con el control.
.
Las diferencias de las medias se compararon con el valor 8,19 de la diferencia crítica de la Ecuación
3.2. La expresión (𝒒𝒂,𝒌−𝟏,𝒇) = 2.97 se obtuvo de los valores críticos del Anexo 14, para 34 grados
de libertad, 16 k-1 tratamientos y a = 0,05. 𝑪𝑴𝑬 es 11,399 y ni = na = 3. Las diferencias de las
medias son mayores a la diferencia crítica por lo que se acepta la hipótesis alternativa de que el
porcentaje de ácido oleico de todos los ensayos realizados es significativamente diferente a la canti-
dad de ácido oleico presente en la muestra de aceite usado control.
El porcentaje de ácido oleico obtenido de microalgas antárticas es menor al del aceite usado, con el
que se acostumbra sintetizar biodiesel; sin embargo, el aceite de microalgas del consorcio 13IGa2
posee todos los ácidos grasos necesarios para sintetizar biodiesel de buena calidad.
Figura 4-9 Comparación de perfiles lipídicos entre aceite usado y el consorcio 13IGa2 culti-
vado en laboratorio, con diferentes métodos de disrupción-extracción.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Söxhle
t É
ter
Söxhle
t H
exan
o
Bli
gh &
Dyer
Bli
gh &
Dyer
mod
Söxhle
t É
ter
Söxhle
t H
exan
o
Bli
gh &
Dyer
Bli
gh &
Dyer
mod
Söxhle
t É
ter
Söxhle
t H
exan
o
Bli
gh &
Dyer
Bli
gh &
Dyer
mod
Söxhle
t É
ter
Söxhle
t H
exan
o
Bli
gh &
Dyer
Bli
gh &
Dyer
mod
Usa
do
Control HCl Microonda Autoclave Aceite
Porc
enta
je d
e áci
do
s g
raso
s en
ace
ite
extr
aíd
o
Métodos de Extracción
Ácido Palmítico Ácido Oleico Ácido linoleico Otros
69
Tabla 4.8 Diferencia de medias de % de ácido oleico entre aceite del consorcio de microalgas
13IGa2 y aceite vegetal usado
Método
de extracción
% ácido oleico
Método de disrupción
Control HCl Microonda Autoclave
Söxhlet éter 37,60 31,70 20,90 20,90
37,20 26,30 24,80 21,70
34,90 31,10 30,90 21,40
�� 36,57 29,70 25,53 21,33
��𝑀 − ��𝑀𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜 -11,47 -18,34 -22,51 -26,71
Bligh &Dyer 22,50 30,60 32,30 21,20
32,60 23,00 23,90 22,00
28,10 15,90 23,30 20,70
�� 27,73 23,17 26,50 21,30
��𝑀 − ��𝑀𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜 -20,31 -24,87 -21,54 -26,74
Söxhlet hexano 31,10 24,30 30,90 24,60
30,10 21,40 29,30 23,10
25,60 24,30 25,80 21,10
�� 28,93 23,33 28,67 22,93
��𝑀 − ��𝑀𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜 -19,11 -24,71 -19,37 -25,11
B&D modificado 29,50 22,50 23,70 23,70
31,10 27,40 17,30 24,90
29,00 27,00 16,60 28,60
�� 29,87 25,63 19,20 25,73
��𝑀 − ��𝑀𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜 -18,17 -22,41 -28,84 -22,31
4.7 Perfil lipídico de microalgas antárticas
Las muestras de microalgas antárticas recolectadas en febrero – marzo 2013 (ver Tabla 3.1) se seca-
ron in situ a 80°C previo su transporte a Ecuador, donde se procedió a la extracción de lípidos por el
método de Bligh & Dyer, que fue el método que dio los mejores resultados en los estudios previos;
además, es el más utilizado en la bibliografía especializada lo que permite poder comparar los resul-
tados con otros autores. No se aplicó ningún método de disrupción celular, pues como ya se demostró,
los métodos de extracción alteran el perfil lipídico y no se deseaba tener un factor externo de varia-
ción. Las muestras de microalgas antárticas con que se contó fueron escasas lo que no permitió rea-
lizar el análisis por triplicado.
La Tabla 4.9 presenta el porcentaje total de lípidos extraídos, en peso seco, así como el correspon-
diente perfil lipídico (ver los cromatogramas en los Anexos del 7 al 12). En la Figura 4-10 se destaca
la relación entre ácidos grasos saturados, monoinsaturados, poliinsaturados y trans que fueron iden-
tificados.
70
Tabla 4.9 Perfil lipídico de los consorcios de microalgas antárticas
Consorcio de microalgas
13
IGf2
13
ITe2
13
IDa
2
13
IDa
1
13
IDa
3
13
IBa
2
Ácido graso # C % peso-seco
Ácido butírico C4:0 --- --- --- 0,02 --- ---
Ácido caproíco C6:0 0,01 0,38 0,01 0,01 --- ---
Ácido caprílico C8:0 --- 0,01 0,01 0,01 0,02 ---
Ácido cáprico C10:0 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 ---
Ácido laurico C12:0 --- 0,03 0,05 0,09 0,40 1,88
Ácido mirístico C14:0 1,20 0,12 0,14 0,31 0,13 0,20
Ácido palmítico C16:0 3,31 0,83 1,27 1,47 0,85 0,16
Ácido esteárico C18:0 0,22 0,11 0,13 0,18 0,30 0,20
Ácido araquídico C20:0 0,38 0,91 0,80 0,06 0,06 1,06
Ácido behénico C22:0 0,03 --- 0,04 0,04 0,04 ---
Ácido lignocérico C24:0 --- --- 0,05 --- 0,09 ---
Saturados 5,16 2,39 2,48 2,20 1,93 3,51
Ácido palmitoléico C16:1 0,14 0,57 0,34 0,03 0,03 0,40
Ácido oléico C18:1n9c 2,55 0,09 0,50 1,34 0,16 0,42
Mono insaturados 2,69 0,66 0,83 1,36 0,19 0,82
Ácido linoleico C18:2n6c 0,28 0,19 0,33 0,11 0,07 0,14
Ácido γ-linoleico C18:3n6 0,08 0,01 0,04 0,04 0,03 ---
Ácido linolénico C18:3n3 0,65 0,01 --- 1,48 0,08 ---
Poli insaturados 1,01 0,21 0,37 1,63 0,17 0,14
Ácido linoleaídico C18:2n6T 0,04 --- 0,02 0,18 0,04 1,30
Trans 0,04 --- 0,02 0,18 0,04 1,30
Total 8,89 3,26 3,71 5,38 2,33 5,77
En las muestras pudieron identificarse ácidos grasos de cadena corta como el ácido butírico (C4:0)
hasta de cadena larga como el ácido lignocérico (C24:0). También, se determinaron ácidos insatura-
dos como palmitoléico (C16:1), oléico (C18:1), linoléico (C18:2n6c) y linolénico (C18:3n3). Gracias
a que no se empleó un método de disrupción celular o un método de extracción intenso con uso de
calor, pudo identificarse el ácido graso trans-linoleaídico en cinco de las seis muestras.
13IGf2 es la muestra recolectada en la isla Greenwich, en el punto 62º25`20.64’’S, 59º47`02.06’’O,
conformada por los géneros Nitzchia, Navícula, Surirella, Pinnaluri, Chlorococcum, Gompho-
nema, Chlorella y Haematococcus, con un porcentaje total de lípidos de 8,89% peso seco. Debido
a las condiciones ambientales en las que sobreviven estas microalgas, la producción de ácidos satu-
rados de cadena media sobresale, como el ácido palmítico. Para permitir la movilidad de la membrana
71
celular a temperaturas muy bajas es importante, también, la producción de ácidos grasos monoinsa-
turados y poliinsaturados, como el ácido oleico y linoleico, respectivamente debido a sus bajos pun-
tos de fusión. Estos dos ácidos son una buena materia prima para la producción de biocombustible,
y considerando que este consorcio tiene la mayor producción de ácidos grasos, estas microalgas se-
rían adecuadas para la síntesis de biocombustibles. Aunque no fue objetivo de esta investigación,
también, se analizó el perfil lipídico del aceite de microalgas para un posible uso en alimentación. El
consorcio 13IGf2 no tiene una buena producción de ácidos palmitoléico y linolénico, indispensables
en la dieta humana, en especial este último ácido graso, es un ácido esencial que el organismo no lo
puede sintetizar y debe ser ingerido, una vez ingerido el cuerpo lo convierte en ácido eicosapentae-
noico (EPA) y en ácido docosahexaenoico (DHA), pertenecientes a la familia de los Omega 3
(Moore, 2000).
El consorcio que se destaca por la producción de ácido linolénico es el 13IDa1, recolectado en la isla
Dee, en el punto 62º27`22.51’’S, 59º43`45.36’’O conformado por los géneros Navícula, Synedra,
Hantzschia, Gomphonema, Leptolyngbya, Pseudoanabaena y Chlorella, con un contenido de áci-
dos grasos de 5,38% en peso seco. Es el único consorcio donde los ácidos linolénico, oléico, lino-
leaídico y linoleico, ácidos insaturados representan un 2,99%, es decir, 55,58% del total de ácidos
del consorcio son ácidos insaturados. Así, éste consorcio, además, de ser una fuente apropiada para
la síntesis de biocombustibles, por la proporción de ácidos oleico, linoleico y palmítico, es una fuente
importante de ácidos grasos esenciales para la dieta humana. También, presenta una combinación
interesante de ácidos grasos, pues se identificó únicamente en éste consorcio, un ácido de cadena
Figura 4-10 Ácidos grasos de las muestras de microalgas antárticas
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
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8,00
9,00
10,00
13IGf2 13ITe2 13IDa2 13IDa1 13IDa3 13IBa2
Porc
enta
je d
e lí
pid
os
en P
eso s
eco
Codificación de microalgas antárticas
Saturados Monoinsaturados Poliinsaturados Trans
72
corta como el ácido butírico (C4:0), pero no ácido lignocérico (C24:0), es decir, la producción de
ácidos de este consorcio está orientada hacia la biosíntesis de dobles enlaces antes que de cadenas
largas.
El consorcio 13ITe2 fue recolectado en la isla Torre, en el punto 62º25`22.51’’S, 59º47`01.24’’O,
está conformado por los géneros Nitzchia, Navícula, Gomphonema, Fragilaria y Diatomea, es uno
de los consorcios con escaza producción de lípidos, 3,26% en peso seco. En éste consorcio la mayor
proporción de ácidos grasos se encuentra centrada en el araquídico, un ácido graso de cadena larga
sin dobles enlaces. No se identificaron ácidos de cadena más larga. Fue el único consorcio en el que
no se encontró ácido linoleaídico, C18:2n6T.
El consorcio 13IDa2 fue una muestra recolectada en la Isla Dee, en el punto 62º25`23.10’’S,
59º46`59.37’’O, conformada por los géneros Navícula, Synedra, Hantzschia, Gomphonema, Lep-
tolyngbya, Pseudoanabaena y Chlorella, con un porcentaje de lípidos total de 3,71% en peso seco.
Este consorcio no contiene ácido linolénico (C18:3n3) y puede representar el mejor perfil lipídico
para la síntesis de biodiesel, por la poca interferencia de ácidos poliinsaturados y por la adecuada
proporción de ácidos oleico, palmítico y linoleico. Los ácidos de cadena corta se producen en poca
proporción, mientras que los de cadena saturada media y larga se biosintetizan mayoritariamente.
Con el aceite de este consorcio podría sintetizarse un biodiesel que se apegue a los requerimientos
de la Norma NTE INEN 2 482:2009 (Anexo 1).
13IDa3 fue una muestra recolectada en la isla Dee (62º24`35.92’’S, 59º43`49.02’’O) conformada
por los géneros Navícula, Nitzchia, Gomphonema, Oscillatoria, Synedra, Pinnularia, Surirellya y
Diatoma, con 2,33% de lípidos en peso seco. Los ácidos identificados no son los más adecuados para
la producción de biocombustibles. Uno de los ácidos más importantes para la síntesis de biodiesel es
el ácido oleico, que no representa una cantidad significativa en este consorcio. Es el consorcio con
menor producción de lípidos y la biosíntesis está orientada hacia los ácidos grasos saturados. En este
consorcio no se encuentra presente la microalga Chlorella sp, que es una de las microalgas más
estudiadas por su adaptabilidad y producción de lípidos.
El consorcio 13IBa2 fue recolectado en la isla Barrientos, en el punto 62º24`22.65”S,
59º44`39.23”O, está conformado por los géneros Navícula, Coconeis, Cymbella, Eunotia, Gomp-
honema, Oscillatoria y Chlorella y contiene 5,77% de lípidos en peso seco. Esta muestra presentó
el menor número de ácidos grasos identificados, a pesar de ser el segundo consorcio con mayor
porcentaje de lípidos extraídos de las muestras analizadas. Los ácidos grasos de cadena larga no se
biosintetizan en este consorcio, tampoco los ácidos con tres insaturaciones, lo que puede deberse a
que el consorcio se encontraba en una etapa temprana de su desarrollo al momento del muestreo,
73
pues los ácidos de cadena más larga se biosintetizan a partir de los ácidos mono y diinsaturados
(Hinzpeter, Shene, & Masson, 2006). Este es el consorcio con más alto contenido de ácido trans.
De manera general, los consorcios 13IDa1, 13IDa2, 13IDa3, 13IGf2, 13ITe1 y 13IBa2 presentaron
una producción apreciable de ácidos grasos poliinsaturados Omega 3 y 6, debido a las condiciones
climáticas donde se desarrollaron, la Antártida, que exige el almacenamiento de este tipo de material
lipídico para protección celular y almacenamiento de energía (Madigan, Martinko, & Parker, 2003).
Los ácidos que se encontraron en todas las muestras de microalgas antárticas, incluido el consorcio
13IGa2, cultivado bajo condiciones de laboratorio, fueron: palmítico, esteárico, araquídico, palmito-
léico, oléico y linoleico. Los ácidos butírico, caproíco, caprílico, behémico y lignocérico no se iden-
tificaron en el consorcio 13IGa2, con ningún método de extracción, debido a que se desarrolló en
diferentes condiciones ambientales a las de su medio natural, la Antártida. Bajo condiciones extremas
de baja temperatura y elevada presión, como las profundidades marinas, la biosíntesis de ácidos gra-
sos esta direccionada al alargamiento de la cadena hidrocarbonada, para el almacenamiento de ener-
gía (Madigan, Martinko, & Parker, 2003).
El ácido palmitoleico C16:1, que fue identificado en los consorcios de microalgas antárticas, no se
encontró en el estudio de Serrano (2012), en cambio se hallaron otros ácidos como elaídico C18:1n9t
y Cis-vaccénico C18:1n7c. Serrano determinó ácidos de hasta de 20 carbonos, en cambio, en los
consorcios de algas antárticas se identificaron ácidos de cadena larga como behémico C22:0 y lig-
nocérico C24:0, cuya presencia se atribuye a las condiciones extremas de la Antártida. Los estudios
de Ugalde (2011) y Rubio, Chica, & Parra (2013) fueron los únicos que identificaron en la microalga
Chlorella sp. el ácido EPA eicosapentanoide C20:5n3.
Figura 4-11 Comparación de perfiles lipídicos entre aceite usado y aceite de microalgas
antárticas para los tres principales ácidos grasos.
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10
20
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40
50
60
70
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100
Aceite
Usado
13IGf2 13ITe2 13IDa2 13IDa1 13IDa3 13IBa2Porc
enta
je d
e áci
dos
gra
sos
en a
ceit
e
extr
aíd
o
Muestras
Palmitico Oleico Linoleico Otros
74
En muchos casos el aceite comestible usado, especialmente el utilizado en frituras en la industria de
comida rápida, es decir, que ya ha cumplido su vida útil en la cocina; es la materia prima para obtener
biocombustibles de manera rentable. Para determinar cuál aceite, de los consorcio de microalgas
antárticas, se asemeja a un aceite vegetal quemado se compararon gráficamente sus perfiles lipídicos
(Figura 4-11).
Destacan los consorcios 13IGf2 y 13IDa1, pues presentan una cantidad alta de ácidos palmítico y
oleico y se diferencian del consorcio 13Ba2 pues este último contiene bajos porcentajes de ácidos
palmítico, oleico y linoleico.
75
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONESbbbbbb
5.1 Conclusiones
- El mejor proceso para la extracción de aceite de microalgas fue la combinación del método
de extracción Bligh & Dyer, que no utiliza una fuente externa de calor, junto con disrupción
organosólvica o uso de autoclave, que fue el método más enérgico probado (7,96% peso
seco). El proceso combina, a la vez, factores físicos (presión y temperatura) y químicos (so-
lución de metanol 3,32% y H2SO4 0,6M). El método Söxhlet con solvente éter fue el menos
eficiente.
- Al aplicar juntos los métodos de extracción con métodos de disrupción optimizó notable-
mente el porcentaje de lípidos obtenidos. La extracción aumenta según la intensidad de las
condiciones usadas para romper las células.
- El empleo de la cromatografía de gases, para determinar el perfil lipídico del aceite de mi-
croalgas, permitió una separación efectiva de sus componentes y pudo identificarse ácidos
grasos de C4 hasta C24, saturados, mono y poliinsaturados de manera eficiente. Gracias al
método analítico pudo concluirse que la composición lipídica del aceite de las microalgas
depende de la especie y de las condiciones ambientales donde se desarrollaron, además de
los métodos de extracción utilizados.
- Debido a las condiciones climáticas de la Antártida, donde crecieron las microalgas recolec-
tadas, pudo identificarse los ácidos grasos como butírico, caproico, caprílico, behémico y
lignocérico que no fueron encontrados en el consorcio 13IGa2, adaptado y desarrollado a
condiciones de laboratorio. También, la producción de ácidos grasos poliinsaturados varió,
como el linolénico u Omega 3 que fue alta (27%) en el consorcio 13IDa1, mientras que en
el aceite extraído en la muestra 13IGa2 fue de 11,7%.
- Todas las muestras de microalgas antárticas presentaron un mayor porcentaje de ácidos gra-
sos saturados, sin embargo cada consorcio presentó un perfil lipídico propio el cual cambió
cuando fueron cultivadas en condiciones de laboratorio. Así la composición lipídica de las
microalgas depende de la especie y de las condiciones ambientales donde se desarrollan,
además de los métodos de extracción aplicados.
- Los consorcios 13IGf2 y 13IDa1 debido a su contenido de ácidos palmítico y oleico que
indica que pueden llegar a convertirse en una adecuada materia prima para la síntesis de
biodiesel. El consorcio menos apropiado sería 13Ba2 por su bajo contenido de ácidos palmí-
tico, oleico y linoleico.
76
- El mejor consorcio para la obtención de aceite para la síntesis de biocombustible es13IGf2,
recolectado en Punta Figueroa de la Isla Greenwich, donde se localiza la Estación Científica
Pedro Vicente Maldonado. El consorcio está conformado por los géneros Nitzchia, Naví-
cula, Surirella, Pinnaluria, Chlorococcum, Gomphonema, Chlorella y Haematococcus.
Sobresale la producción de los ácidos palmítico, oléico, mirístico, linoléico, araquídico, es-
teárico, linoleico, palmitoléico, linoleaídico y behémico, con un porcentaje total de lípidos
extraídos de 8,89% en peso seco con el método de Bligh & Dyer. El porcentaje fue mayor al
que se extrajo del consorcio 13IGa2, adaptado a condiciones de laboratorio, que fue de
7,96% por el método Bligh &Dyer junto con autoclave.
- La técnica utilizada para la extracción de lípidos puede seleccionarse según los requerimien-
tos posteriores del aceite, por ejemplo para alimentación; pues a pesar que el método de
Bligh & Dyer modificado no fue el más eficiente para la extracción de lípidos de la biomasa,
fue con el que más porcentaje de ácidos Omega 3 y 6 se obtuvo del consorcio 13IGa2.
5.2 Recomendaciones
- Deben evaluarse diferentes medios de cultivos y condiciones ambientales orientados a la
producción de ácido oleico, linoleíco y palmítico que permitan la obtención de aceites con
características óptimas para la síntesis de biodiesel.
- Para optimizar la síntesis del biocombustible se recomienda desarrollar un método combi-
nado de disrupción celular-extracción que permita además la formación in situ de los me-
tilésteres, haciendo así más eficiente la producción.
- Deben realizarse estudios nutricionales a las microalgas para ver la posibilidad de ser consi-
deradas como complemento alimenticio seguro para humanos. Se recomienda utilizar el con-
sorcio 13IDa1 para la producción de Omega 3 para suplemento alimenticio. Debe buscarse
una aplicación a los residuos de biomasa de microalgas que quedan después de la extracción
del aceite.
77
6. BIBLIOGRAFÍAbbbb
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81
7. ANEXOS
Anexo 1. Tablas de requisitos para biocombustibles
Norma ISO
Límites
Propiedad Unidad Mínimo Máximo Método de
ensayo
Contenido de éster %(m/m) 96,5 EN 14103
Densidad a 15°C kg/m2 860 900 ISO 3675 y
12185
Viscosidad a 40°C cP 3,50 5,00 ISO 3104
Punto de inflamación °C 120 - ISO 3679
Contenido de azufre mg/kg - 10,0 ISO 20846 y
20884
Residuo de carbón (en
10% de residuo destilado)
%(m/m) - 0,30 ISO 10370
Índice de cetano 51,0 ISO 5165
Contenido de cenizas
sulfatadas
%(m/m) - 0,02 ISO3987
Contenido en agua mg/kg - 500 ISO 12937
Contaminación total mg/kg - 24 EN 12662
Corrosión de la tira de
cobre (3h a 50°C)
Clasificación Clase 1 ISO 2160
Estabilidad a la oxidación
110°C
Horas 6,0 - EN 14112
Índice de ácido mg KOH/g 0,5 EN 14104
Índice de yodo g yodo/100g 120 EN 14111
Éster de metilo de ácido
linolénico
%(m/m) 12,0 EN 14103
Éster de metilos
poli-insaturados
%(m/m) 1 EN14214
Contenido de metanol %(m/m) 0,20 EN 14110
Contenido de
monoglicéridos
%(m/m) 0,80 EN 14105
Contenido de diglicéridos %(m/m) 0,20 EN 14105
Contenido de triglicéridos %(m/m) 0,20 EN 14105
Glicerol libre %(m/m) 0,02 EN 14105
Glicerol total %(m/m) 0,25 EN 14105
Metales grupo I (Na+K) mg/kg 5,0 EN 14108 y
14109
Metales grupo II (Ca+Mg) mg/kg 5,0 EN 14538
Contenido de fósforo mg/kg 10,0 EN 14107
Tomado de (Milarium, 2008)
82
NTE INEN 2 482:2009 Primera Edición, Marzo 2009. Biodiesel Requisitos, Norma Técnica
Voluntaria
REQUISITOS UNIDAD Mínimo Máximo Métodos de
ensayo
Densidad a 15° C kg/m3 860 900 ASTM D 1298
Punto de Inflamación °C 120 -- ASTM D 93
Punto de Turbidez °C Reportar1 Reportar
Agua y sedimento % --- 0,05 ASTM D 1796
Contenido de Agua mg/kg --- 500 ASTM D 95
Viscosidad Cinemática a 40° C mm2/S 3,5 5 ASTM D 445
Cenizas Sulfatadas % (m/m) --- 0,02 ASTM D 874
Contenido de Azufre mg/kg --- 10 ASTM D 1552
Carbón Residual2 % --- 0,05 ASTM D 4530
Corrosión lámina de cobre Clasificación --- 3 ASTM D 130
Número de cetano --- 49 --- ASTM D 613
Temperatura de destilación
recuperado al90%
°C --- 360 ASTM D 1160
Glicerina libre % --- 0,02 ASTM D 6584
Glicerina total % --- 0,25 ASTM D 6584
Contenido de ésteres % 96,5 --- EN 14103
Índice de yodo g yodo/100 g --- 120 EN 14111
Contenido de metanol % --- 0,20 ASTM D 4815
EN 14110
Contenido de fósforo mg/kg --- 10 ASTM D 4951
Contenido de metales alcalinos (Na + K) mg/kg --- 5 EN 14108
Contenido de metales alcalinos (Ca + Mg) mg/kg --- 5 prEN 14538
Número de acidez mg KOH/g --- 0,5 ASTM D 664
1 El punto de turbidez del biodiesel generalmente es mayor que el diesel de origen fósil y debe ser to-
mado en consideración para los procesos de mezcla
2 Debe ser determinado en el 100% de la muestra
83
NTE INEN 1 489:2012 Sexta Revisión, Abril 2012. Productos derivados del Petróleo Requisi-
tos, Norma Técnica Obligatoria
Requisitos Unidad
Diésel N °2 Diésel
Premium
Método de
ensayo
Mín
imo
Má
xim
o
Mín
imo
Má
xim
o
Punto de
inflamación °C 51 - 51 -
NTE INEN 1493
Procedimiento A
Contenido de agua
y sedimento % - 0,05 - 0,05 NTE INEN 1494
Contenido de resi-
duo carbonoso so-
bre el 10% del re-
siduo de la
destilación
% - 0,15 - 0,15 NTE INEN 1491
Contenido de ce-
nizas % - 0,01 - 0,01 NTE INEN 1492
Temperatura de
destilación del
90%
°C - 360 - 360 NTE INEN 926
Viscosidad cine-
mática a 40°C mm2/s 2,0 5,0 2,0 6,0 NTE INEN 810
Contenido de azu-
fre % - 0,7 - 0,05
ASTM D4294
NTE INEN 1490
Corrosión a la
lámina de cobre
Clasifi-
cación - No.3 - No.3 NTE INEN 927
Índice de cetano
calculado - 45 - 45 - NTE INEN 1495
Contendido de bio-
diésel % Nota 5 Nota 5 EN 14078
NOTA: De no contener biodiesel, no es necesario la realización de este ensayo.
84
Anexo 2. Sitios de muestreo
Punto 1: Isla Barrientos, muestra 13IBa2; Punto 2: Isla Torre, muestra 13ITe1; Punto 3 y Punto 4: Isla
Greenwich, muestras 13IGa2 y 13IGf2, respectivamente; Punto 5: Laguna Mariscal Sucre en la Isla Dee,
muestras 13IDa(1,2 y 3).
85
Anexo 3. Medio de cultivo M1 modificado
Nutrientes
KH2PO4 ZnSO4
K2HPO4 H3BO3
NaCl EDTA
CaCl2 MnSO4
MgSO4 CoCl2.6H2O
FeSO4 CuSO4.5H2O
FeCl3.6H2O Na2MoO4.2H2O
KNO3 KCl
Tiamina
86
Anexo 4. Fotobioreactor para masificación de microalgas
87
Anexo 5. Metodología
Figura 5.1 Métodos de disrupción
Autoclavado: 1) Envases autoclavables con microalgas. 2) Biomasa autocla-
vada. Microondas: 3) Condiciones para el método de microonda. 4) Equipo
de microonda utilizado. Solución ácida: 5) Solución de HCl 0,5 M con mi-
croalgas.
88
Figura 5.2 Método de extracción Bligh & Dyer
1) Muestra de microalga antártica seca pulverizada. 2) Pesada de microalga. 3) Centri-
fuga para la separación de fases. 4) Microalga en cloroformo/metanol (24 horas en con-
gelación y después de sonicar). 5) Tubos de centrifuga con biomasa y solvente. 6) Sepa-
ración de fase clorofórmica con contenido lipídico. 7) Secado de solvente en cajas de
petri taradas con los consorcios: a) 13ITe2, b) 13IDa1, c) 13IGf2, d) 13IDa2, e) 13IDa3,
f) 13IGa2.
89
Figura 5.3 Método de extracción Söxhlet
1) Extracción Sóxhlet hexano. 2) Extracción Sóxhlet éter. 3) Recuperación de solvente.
4) Lípidos extraídos: izq. hexano; der. éter.
1
4
3
2
90
Figura 5.4 Metilación
1) Recolección de lípidos extraídos para metilación. 2)
Preparación del reactivo NaOH en metanol. 3) Equipo
de reflujo para metilación. 4) Fase hexánica con lípidos.
5) Viales listos para medir en CG después de la separa-
ción de fases.
91
Anexo 6. Tratamiento de datos experimentales
% lípidos extraídos en peso seco
Métodos
de
Extracción
Métodos de disrupción
Control HCl Micro-
onda
Auto-
clave
1 2 3 4
1 Éter 1,09 2,00 2,91 3,95
0,98 2,15 3,13 4,06
1,06 2,21 3,21 3,70
µ 1,04 2,12 3,08 3,90
σ 0,06 0,11 0,16 0,18
CV 5,45 5,10 5,04 4,73
2 Hexano 2,71 4,32 5,94 7,44
2,42 4,36 5,78 7,38
2,55 4,27 5,59 7,05
µ 2,56 4,32 5,77 7,29
σ 0,15 0,05 0,18 0,21
CV 5,67 1,04 3,04 2,88
3 B&D 3,19 4,77 6,20 8,08
3,45 4,31 6,43 7,77
3,07 4,55 6,33 8,03
µ 3,24 4,54 6,32 7,96
σ 0,19 0,23 0,12 0,17
CV 6,00 5,06 1,82 2,09
4 B&D
modificado 1,11 1,32 4,99 6,44
0,98 1,28 5,61 6,21
1,09 1,49 5,23 5,97
µ 1,06 1,36 5,28 6,21
σ 0,07 0,11 0,31 0,24
CV 6,60 8,18 5,92 3,79
92
Anexo 7 Cromatograma del estándar FAME C4-C24 de ácidos grasos
Figura 7.1 Cromograma de estándar
Figura 7.2 Cromatograma de estándar proveedor
93
Anexo 8. Cromatogramas de microalgas antárticas por el método B&D
Figura 8.2 Cromatograma de microalga antártica consor-
cio13IGf2
Figura 8.1 Cromatograma de microalga antártica consor-
cio13ITe1
94
Figura 8.3 Cromatograma de microalga antártica consorcio
13IBa2
Figura 8.4 Cromatograma de microalga antártica consorcio
13IDa1
95
Figura 8.5 Cromatograma de microalga antártica consorcio
13IDa2
Figura 8.6 Cromatograma de microalga antártica consorcio
13IDa3
96
Anexo 9. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Bligh & Dyer
Figura 9.2 Cromatograma método Bligh& Dyer junto a so-
lución de HCl 0,5M
Figura 9.1 Cromatograma método Bligh& Dyer sin disrup-
ción
97
Figura 9.3 Cromatograma método Bligh& Dyer junto a mi-
croonda
Figura 9.4 Cromatograma método Bligh& Dyer junto a auto-
clave (método organosólvico)
98
Anexo 10. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Söxhlet con solvente hexano
Figura 10.1 Cromatograma método Söxhlet con hexano sin
disrupción
Figura 10.2 Cromatograma método Söxhlet con hexano
junto con solución HCl 0,5M
99
Figura 10.3 Cromatograma método Söxhlet con hexano junto
con microonda
Figura 10.4 Cromatograma método Söxhlet con hexano
junto con autoclave
100
Anexo 11. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Bligh & Dyer modificado
Figura 11.1 Cromatograma método Bligh & Dyer modificado
sin disrupción
Figura 11.2 Cromatograma método Bligh & Dyer modifi-
cado junto con HCl 0,5 M
101
Figura 11.3 Cromatograma método Bligh & Dyer modifi-
cado y microonda
Figura 11.4 Cromatograma método Bligh & Dyer modifi-
cado autoclave (organosólvico)
102
Anexo 12. Cromatogramas del consorcio 13IGa2 por el método Söxhlet con éter
Figura 12.1 Cromatograma método Söhlet con éter sin dis-
rupción
Figura 12.2 Cromatograma método Söhlet con éter y solu-
ción de HCl 0,5 M
103
Figura 12.3 Cromatograma método Söhlet con éter y mi-
croonda
Figura 12.4 Cromatograma método Söhlet con éter y auto-
clave (organosólvico)
104
Figura 12.5 Cromatograma aceite usado
105
Anexo 13. Valores críticos para la prueba de Tukey
Tomado de (Espejo & Fernándes, 2006)
106
Anexo 14. Tabla de valores críticos para la prueba de Dunnett
a= 0.05. Prueba de dos colas
V p= 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 16
5 2.57 3.03 3.29 3.48 3.62 3.73 3.82 3.90 3.97 4.03 4.09 4.14 4.23
6 2.45 2.86 3.10 3.26 3.39 3.49 3.57 3.64 3.71 3.76 3.81 3.86 3.95
7 2.36 2.75 2.97 3.12 3.24 3.33 3.41 3.47 3.53 3.58 3.63 3.67 3.74
8 2.31 2.67 2.88 3.02 3.13 3.22 3.29 3.35 3.41 3.46 3.50 3.54 3.61
9 2.26 2.61 2.81 2.95 3.05 3.14 3.20 3.26 3.32 3.36 3.40 3.44 3.51
10 2.23 2.57 2.76 2.89 2.99 3.07 3.14 3.19 3.24 3.29 3.33 3.36 3.39
11 2.20 2.53 2.72 2.84 2.94 3.02 3.08 3.14 3.19 3.23 3.27 3.30 3.33
12 2.18 2.50 2.68 2.81 2.90 2.98 3.04 3.09 3.14 3.18 3.22 3.25 3.28
13 2.16 2.48 2.65 2.78 2.87 2.94 3.00 3.06 3.10 3.14 3.18 3.21 3.24
14 2.14 2.46 2.63 2.75 2.84 2.91 2.97 3.02 3.07 3.11 3.14 3.18 3.21
15 2.13 2.44 2.61 2.73 2.82 2.89 2.95 3.00 3.04 3.08 3.12 3.15 3.19
16 2.12 2.42 2.59 2.71 2.80 2.87 2.92 2.97 3.02 3.06 3.09 3.12 3.16
17 2.11 2.41 2.58 2.69 2.78 2.85 2.90 2.95 3.00 3.03 3.07 3.10 3.14
18 2.10 2.40 2.56 2.68 2.76 2.83 2.89 2.94 2.98 3.01 3.05 3.08 3.12
19 2.09 2.39 2.55 2.66 2.75 2.81 2.87 2.92 2.96 3.00 3.03 3.06 3.10
20 2.09 2.38 2.54 2.65 2.73 2.80 2.86 2.90 2.95 2.98 3.02 3.05 3.09
24 2.06 2.35 2.51 2.61 2.70 2.76 2.81 2.86 2.90 2.94 2.97 3.00 3.04
30 2.04 2.32 2.47 2.58 2.66 2.72 2.77 2.82 2.86 2.89 2.92 2.95 2.99
40 2.02 2.29 2.44 2.54 2.62 2.68 2.73 2.77 2.81 2.85 2.87 2.90 2.94
60 2.00 2.27 2.41 2.51 2.58 2.64 2.69 2.73 2.77 2.80 2.83 2.86 2.90
120 1.98 2.24 2.38 2.47 2.55 2.60 2.65 2.69 2.73 2.76 2.79 2.81 2.85
¥ 1.96 2.21 2.35 2.44 2.51 2.57 2.61 2.65 2.69 2.72 2.74 2.77 2.81
Tomado de: (Espejo & Fernándes, 2006)
107
Anexo 15. Diferencias significativas Prueba Tukey
Resta de
medias
Med
ia 1
Med
ia 2
Dif
eren
cia
95% 99%
Sig
nif
ican
cia
Resta de
medias
Med
ia 1
Med
ia 2
Dif
eren
cia
95% 99%
Sig
nif
ican
cia
3.4-2.4 7,96 7,29 0,67 0,52 0,58 ** 3.3-2.1 6,32 2,56 3,76 0,52 0,58 **
3.4-3.3 7,96 6,32 1,64 0,52 0,58 ** 3.3-1.2 6,32 2,12 4,20 0,52 0,58 **
3.4-4.4 7,96 6,21 1,75 0,52 0,58 ** 3.3-4.2 6,32 1,36 4,96 0,52 0,58 **
3.4-2.3 7,96 5,77 2,19 0,52 0,58 ** 3.3-4.1 6,32 1,06 5,26 0,52 0,58 **
3.4-4.3 7,96 5,28 2,68 0,52 0,58 ** 3.3-1.1 6,32 1,04 5,28 0,52 0,58 **
3.4-3.2 7,96 4,54 3,42 0,52 0,58 ** 4.4-2.3 6,21 5,77 0,44 0,52 0,58 ns
3.4-2.2 7,96 4,32 3,64 0,52 0,58 ** 4.4-4.3 6,21 5,28 0,93 0,52 0,58 *
3.4-1.4 7,96 3,90 4,06 0,52 0,58 ** 4.4-3.2 6,21 4,54 1,66 0,52 0,58 **
3.4-3.1 7,96 3,24 4,72 0,52 0,58 ** 4.4-2.2 6,21 4,32 1,89 0,52 0,58 **
3.4-1.3 7,96 3,08 4,88 0,52 0,58 ** 4.4-1.4 6,21 3,90 2,30 0,52 0,58 **
3.4-2.1 7,96 2,56 5,40 0,52 0,58 ** 4.4-3.1 6,21 3,24 2,97 0,52 0,58 **
3.4-1.2 7,96 2,12 5,84 0,52 0,58 ** 4.4-1.3 6,21 3,08 3,12 0,52 0,58 **
3.4-4.2 7,96 1,36 6,60 0,52 0,58 ** 4.4-2.1 6,21 2,56 3,65 0,52 0,58 **
3.4-4.1 7,96 1,06 6,90 0,52 0,58 ** 4.4-1.2 6,21 2,12 4,09 0,52 0,58 **
3.4-1.1 7,96 1,04 6,92 0,52 0,58 ** 4.4-4.2 6,21 1,36 4,84 0,52 0,58 **
2.4-3.3 7,29 6,32 0,97 0,52 0,58 ** 4.4-4.1 6,21 1,06 5,15 0,52 0,58 **
2.4-4.4 7,29 6,21 1,08 0,52 0,58 ** 4.4-1.1 6,21 1,04 5,16 0,52 0,58 **
2.4-2.3 7,29 5,77 1,52 0,52 0,58 ** 2.3-4.3 5,77 5,28 0,49 0,52 0,58 ns
2.4-4.3 7,29 5,28 2,01 0,52 0,58 ** 2,3-3.2 5,77 4,54 1,23 0,52 0,58 **
2.4-3.2 7,29 4,54 2,75 0,52 0,58 ** 2,3-2.2 5,77 4,32 1,45 0,52 0,58 **
2.4-2.2 7,29 4,32 2,97 0,52 0,58 ** 2,3-1.4 5,77 3,90 1,87 0,52 0,58 **
2.4-1.4 7,29 3,90 3,39 0,52 0,58 ** 2,3-3.1 5,77 3,24 2,53 0,52 0,58 **
2.4-3.1 7,29 3,24 4,05 0,52 0,58 ** 2,3-1.3 5,77 3,08 2,69 0,52 0,58 **
2.4-1.3 7,29 3,08 4,21 0,52 0,58 ** 2,3-2.1 5,77 2,56 3,21 0,52 0,58 **
2.4-2.1 7,29 2,56 4,73 0,52 0,58 ** 2,3-1.2 5,77 2,12 3,65 0,52 0,58 **
2.4-1.2 7,29 2,12 5,17 0,52 0,58 ** 2,3-4.2 5,77 1,36 4,41 0,52 0,58 **
2.4-4.2 7,29 1,36 5,93 0,52 0,58 ** 2,3-4.1 5,77 1,06 4,71 0,52 0,58 **
2.4-4.1 7,29 1,06 6,23 0,52 0,58 ** 2,3-1.1 5,77 1,04 4,73 0,52 0,58 **
2.4-1.1 7,29 1,04 6,25 0,52 0,58 ** 4,3-3.2 5,28 4,54 0,74 0,52 0,58 **
3.3-4.4 6,32 6,21 0,11 0,52 0,58 ns 4,3-2.2 5,28 4,32 0,96 0,52 0,58 **
3.3-2.3 6,32 5,77 0,55 0,52 0,58 * 4,3-1.4 5,28 3,90 1,38 0,52 0,58 **
3.3-4.3 6,32 5,28 1,04 0,52 0,58 ** 4,3-3.1 5,28 3,24 2,04 0,52 0,58 **
3.3-3.2 6,32 4,54 1,78 0,52 0,58 ** 4,3-1.3 5,28 3,08 2,20 0,52 0,58 **
3.3-2.2 6,32 4,32 2,00 0,52 0,58 ** 4,3-2.1 5,28 2,56 2,72 0,52 0,58 **
3.3-1.4 6,32 3,90 2,42 0,52 0,58 ** 4,3-1.2 5,28 2,12 3,16 0,52 0,58 **
3.3-3.1 6,32 3,24 3,08 0,52 0,58 ** 4,3-4.2 5,28 1,36 3,92 0,52 0,58 **
3.3-1.3 6,32 3,08 3,24 0,52 0,58 ** 4,3-4.1 5,28 1,06 4,22 0,52 0,58 **
108
Resta de
medias
Med
ia 1
Med
ia 2
Dif
eren
cia
95% 99%
Sig
nif
ican
cia
Resta de
medias
Med
ia 1
Med
ia 2
Dif
eren
cia
95% 99%
Sig
nif
ican
-
cia
4,3-1.1 5,28 1,04 4,24 0,52 0,58 ** 2.1-4.1 2,56 1,06 1,50 0,52 0,58 **
3.2-2.2 4,54 4,32 0,23 0,52 0,58 ns 2.1-1.1 2,56 1,04 1,52 0,52 0,58 **
3.2-1.4 4,54 3,90 0,64 0,52 0,58 ** 2.1-1.2 2,56 2,12 0,44 0,52 0,58 ns
3.2-3.1 4,54 3,24 1,31 0,52 0,58 ** 2.1-4.2 2,56 1,36 1,20 0,52 0,58 **
3.2-1.3 4,54 3,08 1,46 0,52 0,58 ** 2.1-4.1 2,56 1,06 1,50 0,52 0,58 **
3.2-2.1 4,54 2,56 1,98 0,52 0,58 ** 2.1-1.1 2,56 1,04 1,52 0,52 0,58 **
3.2-1.2 4,54 2,12 2,42 0,52 0,58 ** 1.2-4.2 2,12 1,36 0,76 0,52 0,58 **
3.2-4.2 4,54 1,36 3,18 0,52 0,58 ** 1.2-4.1 2,12 1,06 1,06 0,52 0,58 **
3.2-4.1 4,54 1,06 3,48 0,52 0,58 ** 1.2-1.1 2,12 1,04 1,08 0,52 0,58 **
3.2-1.1 4,54 1,04 3,50 0,52 0,58 ** 4.2-4.1 1,36 1,06 0,30 0,52 0,58 ns
2.2-1.4 4,32 3,90 0,41 0,52 0,58 ns 4.2-1.1 1,36 1,04 0,32 0,52 0,58 ns
2.2-3.1 4,32 3,24 1,08 0,52 0,58 ** 4.1-1.1 1,06 1,04 0,02 0,52 0,58 ns
2.2-1.3 4,32 3,08 1,23 0,52 0,58 ** 3.1-1.3 3,24 3,08 0,15 0,52 0,58 ns
2.2-2.1 4,32 2,56 1,76 0,52 0,58 ** 3.1-2.1 3,24 2,56 0,68 0,52 0,58 **
2.2-1.2 4,32 2,12 2,20 0,52 0,58 ** 3.1-1.2 3,24 2,12 1,12 0,52 0,58 **
2.2-4.2 4,32 1,36 2,95 0,52 0,58 ** 3.1-4.2 3,24 1,36 1,87 0,52 0,58 **
2.2-4.1 4,32 1,06 3,26 0,52 0,58 ** 3.1-4.1 3,24 1,06 2,18 0,52 0,58 **
2.2-1.1 4,32 1,04 3,27 0,52 0,58 ** 3.1-1.1 3,24 1,04 2,19 0,52 0,58 **
1.4-3.1 3,90 3,24 0,67 0,52 0,58 ** 1.3-2.1 3,08 2,56 0,52 0,52 0,58 *
1.4-1.3 3,90 3,08 0,82 0,52 0,58 ** 1.3-1.2 3,08 2,12 0,96 0,52 0,58 *
1.4-2.1 3,90 2,56 1,34 0,52 0,58 ** 1.3-4.2 3,08 1,36 1,72 0,52 0,58 **
1.4-1.2 3,90 2,12 1,78 0,52 0,58 ** 1.3-4.1 3,08 1,06 2,02 0,52 0,58 **
1.4-4.2 3,90 1,36 2,54 0,52 0,58 ** 1.3-1.1 3,08 1,04 2,04 0,52 0,58 **
1.4-4.1 3,90 1,06 2,84 0,52 0,58 ** 2.1-1.2 2,56 2,12 0,44 0,52 0,58 ns
1.4-1.1 3,90 1,04 2,86 0,52 0,58 ** 2.1-4.2 2,56 1,36 1,20 0,52 0,58 **
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Anexo 16 Abreviaturas
ACP: Acyl Carrier Protein, Proteína transportadora del acilo
ASTM: American Society for Testing and Materials, Sociedad Americana para pruebas y materiales
CO: Monóxido de carbono
CO2: Dióxido de carbono
FID: Flame Ionization Detector, Detector de ionización de llama
M: concentración molar (moles de sustancia/L de solución)
pH: Potencial hidrógeno
Ru5P: Ribulose 5-phosphate, Pentosa ribulosa 5-fosfato
sp: Sin especie
TAP: Medio de cultivo para clamydomonas
+N, -N: concentración de nitrógeno aumentada o disminuida en medio de cultivo original.
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Anexo 17 Certificado de Traducción del resumen por un experto en el idioma
111
