UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I

QUITOSANTO, UN BIOPOLMERO CON APLICACIONES EN SISTEMAS DE LIBERACIN

CONTROLADA DE FRMACOS.

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Ruth Expsito Harris

Bajo la direccin de los doctores

ngeles Mara Heras Caballero Niuris Acosta Contreras

Madrid, 2010

ISBN: 978-84-693-5983-9 Ruth Expsito Harris, 2010

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I

QUITOSANO, UN BIOPOLMERO CON APLICACIONES

EN SISTEMAS DE LIBERACIN CONTROLADA DE

FRMACOS

MEMORIA DE TESIS DOCTORAL

PRESENTADA POR:

Da. Ruth Expsito Harris

DIRECTORES DE TESIS:

ngeles Mara Heras Caballero

Niuris Acosta Contreras

Madrid, 2009

1

Agradecimientos

Durante estos aos he recibido el apoyo de muchas personas a las que quiero mostrar mi

ms sincero agradecimiento.

Agradezco a mis directoras de Tesis, las Dras. ngeles Heras y Niuris Acosta el apoyo

y el nimo que me han brindado durante este tiempo y, sobre todo, el haberme dado la

oportunidad de trabajar con ellas. A ngeles tengo que agradecerle el nimo que me ha

dado da tras da para que todo el trabajo realizado durante estos aos tuviese su fruto en

esta memoria de tesis. A Niuris, agradecerle el esfuerzo por ayudarme aun trabajando en

otro centro.

Expreso mi agradecimiento al Instituto de Estudios Biofuncionales y al Departamento

de Fsico-Qumica II de la Facultad de Farmacia, en las personas que ocupan su

direccin, el Dr. Jos Gonzlez y el Dr. Pedro Antonio Galera, respectivamente. Gracias

tambin a la Dra. Begoa Elorza, investigadora principal de los proyectos MAT 2004-

03982 y MAT2007-63757 del Ministerio de Ciencia e Innovacin, durante los aos que

la Dra. ngeles Heras estuvo en comisin de servicios en el Ministerio de Sanidad y

Consumo.

El agradecimiento ms grande de todos va dirigido a mi familia, sobre todo a Sergio, a

David y a mi madre, porque esta Tesis es una realidad gracias a ellos, a su apoyo

incondicional, desde el principio. Mencin especial para Sergio, por su ayuda y su

paciencia y por estar ah en los momentos buenos y malos. Gracias tambin a los que

estn lejos y a los que ya no estn, sobre todo a Paquita, porque s que le hubiese

gustado estar aqu y ver mi Tesis terminada.

He tenido la suerte de conocer a gente maravillosa en el Instituto de Estudios

Biofuncionales. Gracias a mis nias, Marian, Carol, Ana y Alba, que han estado

conmigo desde el principio de esta andadura y con quienes he compartido tantos

momentos. A las que llegaron despus, Inma, Susana y Elena, por sus consejos, su

ayuda en estos ltimos meses y su amistad. Y por supuesto, a Bea, Inma y Gemma, por

ayudarme en mis inicios. No me olvido de Ins, probablemente a quien le debo que el

tema de mi tesis sea el que es y quien me ayud y apoy durante los primeros aos. Al

resto de compaeros del Instituto y del CAI de RMN, gracias por los consejos, las risas

y todos los buenos momentos.

2

He disfrutado de una estancia en la Universidad de Nottingham. Quiero mostrar mi

agradecimiento a las Prof. Lisbeth Illum y Snow Stolnik el haberme dado la

oportunidad de realizar parte del trabajo experimental de la Tesis en su grupo de

investigacin. Gracias a mis compaeros all, a Driton y Emilia, por dedicar su tiempo a

ensearme y ayudarme en el laboratorio.

Gracias a la Red Alfa II 0259 de la Unin Europea disfrut del curso Biopolymers in

materials and life sciences en la Universidad de Potsdam (Alemania), una de las

mejores experiencias que he vivido.

En la Universidad Complutense tambin debo mostrar mi agradecimiento a Eugenio y

Alfonso, del CAI de Microscopa y a Fernando, del CAI de Rayos X.

Quiero agradecer a la empresa Vegal Farmacutica S.L., con la que el Instituto de

Estudios Biofuncionales mantuvo un contrato artculo 83, el financiar esta tesis durante

el primer ao.

Esta tesis se ha realizado con la financiacin de dos contratos asociados a los proyectos

MAT 2004-03982 y MAT 2007-63757 del Ministerio de Ciencia e Innovacin.

Muchas gracias a todos, de corazn.

3

FRUTO DE ESTA TESIS HAN SIDO:

Publicaciones:

I. Paos, R. Harris, N. Acosta, B. Miralles, A. Heras Study of the amount of

chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexes. Advances in Quitin

Science, Vol IX (2006). Eds. A. Domard, E. Guibal, K. M. Vrum. Pags 637-

644.

R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Preparation and characterization of

chitosan microspheres for controlled release of tramadol. Journal of

Controlled Release (2008), 132 (3), e76-e77.

Inmaculada Aranaz, Marian Mengbar, Ruth Harris, Ins Paos, Beatriz

Miralles, Niuris Acosta, Gemma Galed, ngeles Heras. Functional

characterization of chitin and chitosan. Current Chemical Biology (2009), 3,

203-230.

B. Miralles, M. Mengbar, R. Harris and A. Heras. Suitability of a colorimetric

method for the selective determination of chitosan in dietary supplements.

Food Chemistry. Aceptado Julio de 2009. Ref: FOODCHEM-D-09-01275R1.

Inmaculada Aranaz, Ruth Harris and Angeles Heras. Chitosan Amphiphilic

Derivatives. Chemistry and Applications. Current Organic Chemistry.

Aceptado 2009.

R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar, A. Heras.

Chitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation of natural

antioxidants and their application in cosmetics. Carbohydrate Polymers (En

revisin: CARBPOL-D-09-00950).

R. Harris, N. Acosta, A. Heras. Novel chitosan hydrochloride - genipin

microspheres for controlled release of tramadol hydrochloride. Journal of

Microencapsulation (Enviado: TMNC-2009-0197).

E. Lecumberri, R. Harris, A. Heras. Chitosan microspheres crosslinked with

genipin for controlled release of drugs. En elaboracin para enviar a la revista

Marine Drugs.

R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. New chitosan films for controlled

release of ciprofloxacin hydrochloride. En elaboracin para enviar a la revista

Drug Delivery.

4

D. Vllasaliu, R. Harris, L. Casettari, A. Heras, L. Illum, S. Stolnik. Tight

junction modulation of chitosan solution and chitosan nanoparticles. En

elaboracin para enviar a la revista Journal of Controlled Release.

Contribuciones a congresos internacionales:

I. Paos, R. Harris, I. Aranaz, G. Galed, N. Acosta, A. Heras. Chitosan films

for the controlled release of ciprofloxacin HCl. IV Congreso Internacional de

Biomateriales, BIOMAT, La Habana, Cuba, 2006. (Pster).

I. Paos, R. Harris, B. Miralles, N. Acosta, A. Heras. Study of amount of

chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexes. 10th

International

Conference on Chitin and Chitosan. 7th

International Conference of the

European Chitin Society. Montpellier, Francia, 2006. (Pster).

I. Paos, R. Harris, B. Miralles, N. Acosta, A. Heras. Chitosan films for

controlled release of ciprofloxacin. IV Simposio Iberoamericano de quitina,

SIAQ. Natal, Brasil, 2007. (Pster).

I. Paos, R. Harris, N. Acosta, A. Heras. Sustained release chitosan

microspheres prepared by a w/o/w emulsion-spray drying method. 34rd

Controlled Release Society Meeting. Long Beach, California, EE.UU., 2007.

(Pster).

R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Preparation and characterization of

chitosan microspheres for controlled release of tramadol. 10th

European

Symposium of Controlled Drug Delivery. Noordwijk aan Zee (Holanda), 2008.

(Pster).

R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Chitosan-genipin microspheres

prepared by spray-drying: characterization. World Meeting in Pharmaceutics,

Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, 2008. (Pster).

R. Harris, N. Acosta, E. Lecumberri, A. Heras. Novel chitosan hydrochloride-

genipin microspheres for controlled release of tramadol hydrochloride.

Controlled Release Society. Copenhague (Dinamarca), 2009. (Pster).

E. Lecumberri, R. Harris, A. Heras. Chitosan microspheres crosslinked with

genipin for controlled release of drugs. European Quitin Society. Venecia

(Italia), 2009. (Pster).

R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar, S.Iglesias, A.

Heras. Chitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation of

natural antioxidants and their application in cosmetics.11th

Internacional

Conference on Chitin and Chitosan. Taipei (Taiwan), 2009. (Pster).

5

A. Heras, R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar.

Chitosan and co-passengers. Functional applications. 11th

Internacional

Conference on Chitin and Chitosan. Taipei (Taiwan), 2009. Keynote lecture.

A. Heras, R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar.

Quitosano, biopolmero creador de sinergias. V Iberoamerican chitin

symposium. Chile, 2010. Plenary conference.

Congresos nacionales:

R. Harris Pelculas de quitosano para la liberacin controlada de frmacos.

II Jornadas Complutenses y I Congreso Nacional de Investigacin para alumnos

de pregrado en Ciencias de la Salud. Facultad de Farmacia, Madrid, Espaa,

2007. Comunicacin oral.

Estancias en centros extranjeros

Estancia de cuatro meses en la Universidad de Nottingham (Reino Unido). Drug

delivery and tissue engineering department. Febrero-Mayo 2008.

Actividades de transferencia de tecnologa:

Integrante del equipo promotor de la empresa de base tecnolgica (EBT) InFiQuS.

Fecha: 2009

Informes a empresas:

1. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano: aplicaciones a la

claritromicina y a la venlafaxina. Vegal Farmacutica S.L. Marzo 2007.

2. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano: aplicaciones a la

claritromicina y a la venlafaxina. Vegal Farmacutica S.L. Junio 2007.

3. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano y genipina. Laboratorios ROVI

S.A. Junio 2008.

7

Abreviaturas

ANOVA: anlisis de la varianza de una va

CS: quitosano

DRX: difraccin de rayos X

EE: eficiencia de encapsulacin

FFLM: formas farmacuticas de liberacin modificada

FT-IR: espectroscopa de infrarrojos por transformada de Fourier

FD: dextrano marcado con isotiocianato de fluorescena (del ingls FITC-Dextran)

GD: grado de desacetilacin

Gnp: genipina

HBSS: solucin salina equilibrada de Hank (del ingls Hanks balanced salt solution)

HCS: hidrocloruro de quitosano

LD 50: dosis letal para el 50% de un conjunto de animales de prueba (del ingls lethal

dosis)

LDH test de citotoxicidad en el que se determina la liberacin de lactato

deshidrogenasa de las clulas

MTS ensayo de citotoxicidad en el que se utiliza una sal del tetrazolio (3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazolio)

PBS tampn fosfato salino (del ingles phosphate buffered saline)

RA: rendimiento de atomizacin

SD: desviacin estndar (del ingls standard deviation)

SEM: microscopa electrnica de barrido (del ingls scanning electron microscopy)

SGF: fluido gstrico simulado (del ingls simulated gastric fluid)

SIF: fluido intestinal simulado (del ingls simulated intestinal fluid)

TPP: tripolifosfato sdico

UV: ultravioleta

UV-Vis: ultravioleta-visible

ndice

9

ndice

I. INTRODUCCIN .................................................................................................... 15

1 Sistemas de liberacin modificada ............................................................................. 17

2 Polmeros utilizados en sistemas de liberacin de frmacos...................................... 18

3 Quitosano: Caractersticas, propiedades y aplicaciones ............................................. 19

4 Microesferas y nanopartculas de quitosano .............................................................. 22

5 Pelculas de quitosano ................................................................................................ 25

5.1 Hinchamiento de las pelculas de quitosano ....................................................... 26

6 El quitosano como promotor de la absorcin de frmacos ........................................ 28

7 Cultivos celulares como modelo epitelial .................................................................. 32

8 Agentes entrecruzantes ............................................................................................... 34

9 Frmacos empleados .................................................................................................. 38

10 Modelos matemticos ................................................................................................. 42

II. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................ 49

1 Materiales ................................................................................................................... 51

2 Obtencin de microesferas de hidrocloruro de quitosano .......................................... 52

3 Obtencin de pelculas de quitosano .......................................................................... 53

4 Obtencin de nanopartculas de hidrocloruro de quitosano ....................................... 54

5 Caracterizacin ........................................................................................................... 54

5.1 Estudios de morfologa ....................................................................................... 54

5.2 Determinacin de la caraga elctrica superficial de microesferas y

nanopartculas ................................................................................................................ 55

5.3 Estudios de interaccin frmaco-polmero ......................................................... 56

5.3.1 Difraccin de rayos X ..................................................................................... 56

5.3.2 Espectroscopia de infrarrojo............................................................................ 56

5.4 Reaccin de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y la genipina ...... 57

ndice

10

5.5 Determinacin del grado de entrecruzamiento con genipina .............................. 57

5.6 Estudios de hinchamiento de las pelculas de quitosano .................................... 58

5.7 Determinacin de la cantidad de quitosano unido a las nanopartculas.............. 58

6 Estudios de liberacin in vitro .................................................................................... 59

6.1 Microesferas de claritromicina ........................................................................... 59

6.2 Microesferas de hidrocloruro de tramadol .......................................................... 60

6.3 Pelculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino ................................ 61

7 Cultivos celulares ....................................................................................................... 61

7.1 Clulas Calu-3 ..................................................................................................... 61

7.2 Ensayo de toxicidad MTS ................................................................................... 62

7.3 Ensayo de liberacin de LDH ............................................................................. 63

7.4 Determinacin de la resistencia transepitelial..................................................... 63

7.5 Ensayos de permeabilidad celular ....................................................................... 64

III. RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................................... 69

1 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina obtenidas por

atomizacin ........................................................................................................................ 71

1.1 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina entrecruzadas

con tripolifosfato sdico ................................................................................................ 71

1.1.1 Obtencin de las microesferas......................................................................... 71

1.1.2 Estudios de morfologa.................................................................................... 74

1.1.3 Determinacin de la carga superficial de las microesferas ............................. 75

1.1.4 Interaccin frmaco-polmero ......................................................................... 77

1.1.5 Estudios de liberacin in vitro ......................................................................... 78

1.2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina entrecruzadas

con genipina ................................................................................................................... 90

1.2.1 Obtencin de las microesferas......................................................................... 90

1.2.2 Estudios de morfologa.................................................................................... 90

1.2.3 Determinacin de la carga superficial de las microesferas ............................. 91

1.2.4 Interaccin frmaco-polmero ......................................................................... 91

1.2.5 Estudios de liberacin in vitro ......................................................................... 92

1.3 Conclusiones parciales del captulo .................................................................... 95

2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con hidrocloruro de tramadol obtenidas

por atomizacin ................................................................................................................. 97

2.1 Reaccin de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y la genipina ...... 97

2.2 Determinacin del grado de entrecruzamiento ................................................. 101

2.3 Obtencin de las microesferas .......................................................................... 103

2.4 Estudios de morfologa ..................................................................................... 104

2.5 Determinacin de la carga superficial de las microesferas ............................... 105

ndice

11

2.6 Interaccin frmaco-polmero ........................................................................... 106

2.7 Estudios de liberacin in vitro .......................................................................... 108

2.8 Conclusiones parciales del captulo .................................................................. 117

3 Pelculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino ..................................... 119

3.1 Obtencin de las pelculas ................................................................................ 119

3.2 Estudios de morfologa ..................................................................................... 120

3.3 Grado de hinchamiento de las pelculas ........................................................... 121

3.4 Estudios de interaccin frmaco-polmero ....................................................... 124

3.4.1 Difraccin de rayos X ................................................................................... 124

3.4.2 Espectroscopa de infrarrojo.......................................................................... 128

3.5 Ensayos de liberacin in vitro ........................................................................... 131

3.6 Conclusiones parciales del captulo .................................................................. 136

4 Estudio del efecto del quitosano sobre las uniones estrechas de clulas Calu-3 ...... 139

4.1 Obtencin y caracterizacin de nanopartculas de hidrocloruro de quitosano . 140

4.2 Estudios de citotoxicidad .................................................................................. 142

4.2.1 Ensayo de MTS ............................................................................................. 142

4.2.2 Ensayo LDH .................................................................................................. 144

4.3 Estudio de la resistencia transepitelial .............................................................. 146

4.4 Ensayos de permeabilidad celular ..................................................................... 150

4.5 Conclusiones parciales del captulo .................................................................. 151

IV. CONCLUSIONES .................................................................................................... 153

V. BIBLIOGRAFA ........................................................................................................ 157

Objetivos

13

OBJETIVOS

Siguiendo la lnea de investigacin del grupo Investigaciones en el Sistema Quitina-

Quitosano y dentro del rea de sistemas de liberacin controlada de frmacos basados

en quitosano, en esta Tesis se ha dado un paso ms en el conocimiento del quitosano y

las potenciales aplicaciones de este biopolmero en el campo de la tecnologa

farmacutica.

As, el objetivo general de esta Tesis ha sido, por una parte obtener microesferas,

pelculas y nanopartculas de quitosano para la encapsulacin de frmacos y, por otra

parte, estudiar la citotoxicidad del quitosano y su capacidad como promotor de

absorcin de macromolculas en monocapas de clulas Calu-3.

Este objetivo general podra desglosarse en los siguientes objetivos especficos:

Obtencin, caracterizacin y estudio de la liberacin in vitro de microesferas de

hidrocloruro de quitosano como sistemas de liberacin controlada de

claritromicina e hidrocloruro de tramadol para administracin oral.

Obtencin, caracterizacin y estudio de la liberacin in vitro de pelculas de

quitosano como sistemas de liberacin controlada de hidrocloruro de

ciprofloxacino para uso tpico.

Estudio del efecto del quitosano, en solucin o en nanopartculas sobre una lnea

celular de epitelio respiratorio: citotoxicidad, apertura de uniones estrechas y

permeabilidad celular de macromolculas.

Introduccin

15

I. INTRODUCCIN

Introduccin

17

1 Sistemas de liberacin modificada

En las ltimas dcadas, el desarrollo de nuevas formas farmacuticas de liberacin

modificada (FFLM), tambin llamadas de liberacin controlada, ha suscitado gran

inters en la industria farmacutica. Se trata de dispositivos que aportan mejores pautas

posolgicas, mejor perfil farmacocintico e incluso reduccin de efectos adversos. De

acuerdo con la Real Farmacopea Espaola [1], las FFLM son aqullas en las que la

velocidad y el lugar de liberacin de la sustancia o sustancias activas es diferente del de

la forma farmacutica de liberacin convencional, administrada por la misma va. En

ellas se introducen modificaciones en la formulacin o en el proceso de produccin con

el fin de alterar la velocidad, el tiempo o el lugar de liberacin del frmaco [2]. De esta

forma se pueden alcanzar los niveles teraputicos del frmaco en el lugar de accin y

mantenerlos a lo largo del tiempo. Como consecuencia, las FFLM presentan numerosas

ventajas con respecto a las formas farmacuticas convencionales [3]:

Disminucin de la frecuencia de administracin del medicamento, mejorando de

esta forma el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente.

Reduccin de los efectos secundarios relacionados con dosis elevadas.

Disminucin de la fluctuacin de niveles plasmticos.

Efecto teraputico ms uniforme.

Sin embargo, tambin existen algunos inconvenientes, entre los que hay que destacar

[3]:

Coste elevado.

Correlaciones in vitro/in vivo difciles de predecir.

Posible sobredosificacin por liberacin inmediata e incontrolada de la dosis.

Dificultad en el ajuste de la dosificacin.

Dependencia del tiempo de trnsito intestinal en las formas de administracin

oral.

Riesgo de acumulacin del frmaco y necesidad de ajuste de pautas posolgicas.

Introduccin

18

En la Tabla I.1 se resumen los principales tipos de liberacin modificada [4, 5]:

Tabla I.1. Caractersticas y ejemplos de los diferentes tipos de liberacin modificada.

Tipo de liberacin Caractersticas

principales Ejemplos

Prolongada o controlada

Diseadas para garantizar

una liberacin ms lenta del

frmaco.

Comprimidos o parches

lipdicos, hidroflicos o de

polmeros insolubles.

Retardada

Retrasan la liberacin del

principio activo.

No prolongan el efecto

teraputico.

Sistemas de cubierta

entrica o formas

farmacuticas

gastrorresistentes.

Pulstil

Modificadas para garantizar

una liberacin secuencial

del frmaco.

Normalmente presentan dos

fases: una inmediata y otra

al cabo de un tiempo.

Sistemas que pretenden

hacer coincidir la liberacin

del frmaco con ciclos

circadianos hormonales.

De control espacial

Liberan el principio activo

cuando la forma

farmacutica alcanza su

lugar de accin.

Sistemas bioadhesivos.

Los sistemas de liberacin modificada tambin se pueden clasificar en funcin del

mecanismo por el cual se libera el principio activo. La liberacin puede ocurrir por

difusin, disolucin, presin osmtica, fuerza mecnica, hinchamiento, erosin o

activacin [2].

2 Polmeros utilizados en sistemas de liberacin de frmacos

Actualmente, en la elaboracin de sistemas de liberacin controlada, se utilizan un gran

nmero de polmeros. Existen dos grandes grupos de polmeros:

Polmeros naturales, como el colgeno, la albmina o el quitosano.

Polmeros sintticos, entre los que se distinguen:

o Polmeros biodegradables, como los cidos polilctico y poligliclico.

o Polmeros no biodegradables, como los cidos poliacrlicos.

Introduccin

19

Tanto los materiales empleados en el desarrollo de los sistemas de liberacin as como

sus productos de degradacin han de ser biocompatibles.

La liberacin del frmaco desde una matriz polimrica puede deberse a tres tipos de

mecanismos: liberacin desde la superficie de las partculas, difusin a travs de la

matriz hinchada y liberacin debido a la erosin del polmero. En la mayora de los

casos, la liberacin se debe a ms de uno de estos mecanismos [6].

En el caso de la liberacin desde la superficie, el frmaco atrapado en la capa superficial

de las partculas se disuelve instantneamente al entrar en contacto con el medio. Esto

provoca el llamado efecto estallido, del ingls burst effect, que puede evitarse

utilizando agentes entrecruzantes o lavando las partculas con solventes apropiados, lo

cual puede conducir a una baja eficiencia de encapsulacin.

La liberacin por difusin implica tres etapas. En la primera, el agua penetra en el

sistema, lo que hace que la matriz se hinche; en la segunda, el polmero cristalino se

convierte en una matriz hidratada; y en la tercera, se produce una difusin del frmaco a

travs de dicha matriz hidratada. La velocidad global del proceso vendr determinada

por la velocidad de cada etapa. Ajustando experimentalmente las variables adecuadas se

puede conseguir la velocidad de liberacin del frmaco idnea. Este tipo de liberacin

es tpico en hidrogeles.

En el caso de polmeros biodegradables, el principio activo puede liberarse por erosin

de la matriz en la que est encapsulado.

3 Quitosano: Caractersticas, propiedades y aplicaciones

El quitosano es un polmero natural que se obtiene a partir de la quitina, uno de los

biopolmeros ms abundantes en la naturaleza. La quitina forma parte de la estructura de

soporte de numerosos organismos vivos, tales como artrpodos (crustceos e insectos),

moluscos y hongos. Se trata adems de un subproducto importante de varias industrias

como la pesquera y la cervecera. La quitina y el quitosano son biopolmeros que en los

ltimos aos han encontrado gran cantidad de aplicaciones, especialmente en la

industria alimentaria y en la biotecnolgica [7].

La quitina est formada por unidades de 2-acetamido-2-deoxy--D-glucosa unidas por

enlaces -(14). La obtencin de quitosano a partir de quitina se realiza por

desacetilacin de la misma, dejando libre el grupo amino del carbono 2, si bien este

Introduccin

20

proceso nunca llega al 100% [8]. Es por ello que el quitosano es un copolmero de 2-

acetamido-2-deoxy--D-glucosa y 2-amino-2-deoxy--D-glucosa (Figura I.1).

Figura I.1. Estructura de la quitina (a) y del quitosano (b).

La fuente y el mtodo de obtencin determinan la composicin de las cadenas de

quitosano y su tamao. Por este motivo, el grado de desacetilacin y el peso molecular

promedio son dos parmetros de obligado conocimiento para la caracterizacin de este

polmero.

Las principales propiedades fsico-qumicas del quitosano que determinan sus

propiedades funcionales son su grado de desacetilacin y su peso molecular promedio,

aunque la cristalinidad, el contenido de agua, cenizas y protenas tambin son

caractersticas fsico-qumicas a considerar para la aplicacin de un quitosano

especfico.

El porcentaje de grupos amino que quedan libres en la molcula de quitosano es lo que

se denomina grado de desacetilacin y est estrechamente vinculado con su solubilidad.

Como consecuencia de la hidrlisis del grupo N-acetilo, aumenta la capacidad

hidroflica del quitosano y pasa a ser soluble en soluciones cidas diludas (actico,

(b)

(a)

Introduccin

21

frmico, clorhdrico, entre otros) ya que el pKa del gupo amino del quitosano es de 6,5

[9]. La protonacin de los grupos amino del quitosano en medio cido le confiere un

carcter altamente reactivo.

El quitosano es un polmero formado por unidades repetidas de D-glucosamina, por lo

que la longitud de la cadena y, por tanto, su peso molecular, es una caracterstica

importante de la molcula.

Algunas de las propiedades funcionales del quitosano son: biodegradabilidad,

biocompatibilidad, mucoadhesin, capacidad filmognica, hemosttico, promotor de

absorcin, actividad antimicrobiana, anticolesterolmica y antioxidante [10]. Estas

propiedades funcionales han promovido su utilizacin en varios campos distintos como

son agricultura, industria y medicina. En agricultura, el quitosano se ha descrito como

antivirus en plantas y como aditivo en fertilizantes. As mismo se ha investigado como

agente quelante de metales en agricultura e industria y como agente filmognico en

cosmtica [11]. Tambin ha sido utilizado en la industria papelera, en la textil y en el

tratamiento de aguas residuales [12]. En la industria alimentaria se puede utilizar como

ingrediente funcional y como fibra alimentaria. Adems, tiene la capacidad de unirse a

grasas, por lo que se utiliza como agente hipocolesterolmico en productos dietticos

[10]. Ha sido altamente utilizado en el campo de la biomedicina debido a su actividad

inmunoestimuladora, propiedades anticoagulates, accin antibacteriana y antifngica

[13] y por su accin como promotor de la cicatrizacin de heridas [14].

Debido a su carcter catinico y a sus propiedades gelificantes y filmognicas, el

quitosano ha sido estudiado en la industria farmacutica por su potencial en el

desarrollo de sistemas de liberacin de frmacos [15, 16]. En este sentido, hay que

destacar que el hidrocloruro de quitosano fue aprobado por las autoridades e incluido en

la cuarta edicin de la Farmacopea Europea (2002) [17].

Constituye un vehculo para la encapsulacin del frmaco, protegindolo y liberndolo

de forma controlada, adems de promover su absorcin a travs del epitelio. As mismo,

el quitosano presenta propiedades necesarias para su uso en dicha industria, como son

su biodegradabilidad, biocompatibilidad y no toxicidad. La toxicidad del quitosano por

va oral es baja; se ha descrito una LD50 (dosis letal para el 50% de un conjunto de

animales de prueba) de 16g/Kg en ratas [18]. El grado de desacetilacin y el peso

molecular promedio del quitosano son dos caractersticas fsico-qumicas

Introduccin

22

fundamentales, ya que afectan a las propiedades de las formulaciones farmacuticas

basadas en este polmero [10].

En los ltimos aos, el estudio del quitosano se ha centrado sobre todo en mejorar la

liberacin y la absorcin de las llamadas biomolculas teraputicas, como son los

frmacos proteicos [19]. Existen resultados contradictorios sobre la mayor eficiencia del

quitosano en solucin, en polvo o en forma de nanopartculas en la liberacin in vivo.

En general, se ha visto que la eficiencia de la absorcin de macromolculas en mucosas

utilizando nanopartculas de quitosano como vehculo de encapsulacin es inferior a la

obtenida con formulaciones de quitosano en solucin o en polvo [20].

4 Microesferas y nanopartculas de quitosano

El uso de sistemas micro y nanoparticulados para la encapsulacin de frmacos permite

el transporte de stos al lugar de accin teraputica, el incremento de su vida media y su

liberacin controlada en el tiempo. Adems, al ser partculas pequeas, presentan una

relacin superficie-volumen alta [21].

La liberacin de un principio activo a partir de sistemas particulados a base de quitosano

depende de la densidad de la matriz polimrica. As, mediante la variacin de la

concentracin y del peso molecular del polmero e incorporando copolmeros y agentes

entrecruzantes se pueden obtener sistemas de encapsulacin con los perfiles de

liberacin adecuados en cada caso.

Las microesferas son sistemas homogneos en los que el frmaco est disperso en una

matriz polimrica, a diferencia de las microcpsulas, en las que el principio activo se

encuentra rodeado por una capa de polmero.

Las microesferas de quitosano constituyen uno de los sistemas de liberacin controlada

de frmacos ms estudiados, tanto para su administracin parenteral como por va oral.

Adems de controlar la liberacin de principios activos, mejoran la biodisponibilidad de

sustancias degradables como las protenas y promueven la absorcin de frmacos

hidrosolubles a travs de las membranas epiteliales.

Introduccin

23

Existen varios mtodos para la obtencin de microesferas, como son [22]:

Gelificacin ionotrpica

Precipitacin

Atomizacin o spray-drying

Coacervacin simple

Coacervacin compleja

Entrecruzamiento qumico

Entrecruzamiento trmico

Emulsin

La atomizacin o spray-drying es un proceso de evaporacin de solvente que se ha

empleado extensamente en la industria farmacutica para producir polvos secos,

grnulos y aglomerados a partir de soluciones y suspensiones. Esta tcnica se puede

utilizar tanto para frmacos resistentes al calor como para frmacos sensibles, para

frmacos solubles o insolubles en agua y para polmeros hidroflicos o hidrofbicos

[23]. Se trata de un proceso de una sola etapa que se puede escalar fcilmente, es de

bajo coste, produce partculas de pequeo tamao y permite reformular las partculas en

forma de suspensiones, cpsulas o comprimidos [24]. Las microesferas obtenidas tienen

un tamao de una micra a varias decenas de micras y son adecuadas para su

administracin por las vas oral, nasal o parenteral [25-28]. Los parmetros del proceso

de atomizacin, como son el tipo de aguja, la velocidad de la bomba y el flujo de air

comprimido, permiten modular el tamao de partcula.

Las nanopartculas han suscitado un gran inters en los ltimos aos como sistemas de

liberacin de frmacos, sobre todo para vas de administracin alternativas a la oral,

como aquellas que requieren inyeccin o deposicin en superficies mucosas como la

nasal. Las nanopartculas se definen como aquellas partculas cuyo tamao es inferior a

1m [29].

Ohya et al. (1994) [30] presentaron los primeros resultados de nanopartculas de

quitosano para aplicaciones en liberacin de frmacos. Obtuvieron nanopartculas

cargadas con 5-fluoroacilo por emulsin (w/o) y entrecruzadas con glutaraldehido. Este

Introduccin

24

agente entrecuzante es txico, por lo que no es adecuado para la encapsulacin de

frmacos.

Posteriormente, Calvo et al. (1997) [31] describieron la preparacin de nanopartculas

de quitosano por gelificacin ionotrpica del quitosano y el tripolifosfato sdico (de

ahora en adelante TPP), nanopartculas biodegradables y biocompatibles preparadas por

un proceso ms suave, sin altas temperaturas ni solventes orgnicos.

Las nanopartculas de quitosano y TPP presentan una serie de interesantes

caractersticas que las hacen ser vehculos prometedores para la liberacin de

macromolculas, tales como protenas y ADN. Algunas de estas propiedades son: su

obtencin por un proceso suave, su tamao ajustable dependiendo de los parmetros de

obtencin y la modulacin de su carga positiva y su capacidad de asociacin a pptidos,

protenas, oligonucletidos y plsmidos [16, 32].

La gelificacin inica entre el quitosano y el TPP ha sido utilizada en diversos estudios.

Por ejemplo, Urrusuno et al. (1999) [33] estudiaron el efecto de nanopartculas de

quitosano y TPP cargadas con insulina sobre la absorcin de insulina en conejos.

Observaron que las nanopartculas liberaron el frmaco en su forma activa y que

promovieron su absorcin. Tambin se ha estudiado en ratones el efecto sobre los

niveles de inmunoglobulina G en suero e inmunoglobulina A en mucosa de

formulaciones preparadas por este mtodo con el toxoide del ttanos, propiciando su

aumento tras la administracin nasal [34]. Pan et al. (2002) [35] estudiaron la capacidad

de nanopartculas de quitosano-TPP para promover la absorcin intestinal y la

biodisponibilidad farmacolgica de insulina tras su administracin oral. Las

nanopartculas as formadas mejoraron la absorcin de insulina en relacin con una

solucin de quitosano.

El tamao de las nanopartculas es uno de los factores que ms afectan y determinan la

internalizacin de las mismas en mucosas y tejidos epiteliales y su transporte dentro de

las clulas. La carga superficial de las nanopartculas determina sus propiedades

mucoadhesivas y se ha descrito en la bibliografa que la habilidad de las nanopartculas

para escapar a la accin de los endolisosomas y liberar el principio activo depende as

mismo de dicha carga superficial [32]. Ambas caractersticas pueden ser controladas

variando ciertas condiciones y variables del proceso de obtencin, como la

concentracin de quitosano, la proporcin quitosano: TPP y el pH de la solucin. La

Introduccin

25

proporcin de quitosano:TPP es, adems, la responsable de la formacin de las

nanopartculas [36].

5 Pelculas de quitosano

El carcter filmognico del quitosano dio lugar a una de las primeras aplicaciones

investigadas de este polmero natural. Es posible formar pelculas de quitosano con

buenas propiedades fsicas y mecnicas a partir de sus disoluciones en cidos diluidos

[37], tales como frmico, actico o propinico [38]. Las propiedades filmognicas del

quitosano se deben a la formacin de enlaces de hidrgeno intermoleculares entre los

grupos amino e hidroxilo de sus cadenas. A pH cido estos enlaces de hidrgeno se

disocian debido a la protonacin de los grupos amino y se produce un rpido

hinchamiento de la pelcula.

Muzzarelli plante por primera vez en 1974 dos metodologas generales de trabajo para

obtener pelculas de quitosano; la primera es mediante la evaporacin del cido

empleado en la solucin de quitosano (mtodo de evaporacin de solvente), y la

segunda se basa en la preparacin directa de quitosano a partir de la pelcula quitinosa

de la jibia (molusco cefalpodo). Este ltimo mtodo [39] no result eficiente, pues las

propiedades mecnicas de las pelculas obtenidas no fueron las idneas, por lo cual no

es utilizado en la actualidad.

Las posibles aplicaciones de las pelculas de quitosano se extienden a la medicina, la

industria fotogrfica, la alimentacin y la cosmtica [40, 41]. En el campo de la

farmacia, las pelculas de quitosano se han empleado para el recubrimiento de

comprimidos [42] y como sistemas de liberacin controlada de frmacos

[43].

El uso de pelculas de quitosano para el tratamiento de heridas cutneas presenta un

gran inters puesto que se puede administrar el frmaco de forma localizada y sostenida

en el sitio de accin. Se trata de un sistema ventajoso con respecto al uso de cremas, ya

que stas deben ser aplicadas continuamente y son eliminadas con facilidad. Se ha

descrito en la bibliografa el uso de pelculas de quitosano para el vendaje de heridas

cutneas y pelculas con minociclina para el tratamiento de quemaduras en ratas [44].

Las pelculas de quitosano resultan efectivas porque protegen la herida, absorben el

exudado, tienen accin antibacteriana [45, 46]y favorecen la cicatrizacin de heridas al

estimular la proliferacin de fibroblastos [47, 48]. Por otro lado, tambin se han

realizado estudios de citotoxicidad del quitosano en clulas cutneas como

Introduccin

26

queratinocitos y fibroblastos, estudios importantes para este tipo de aplicacin, y se ha

comprobado que no presenta citotoxicidad in vitro [49].

El carcter hemosttico del quitosano ha promovido su utilizacin en parches y vendajes

hemostticos [50]. Prueba de ellos es la comercializacin de varios productos de este

tipo a base de quitosano por parte de la empresa HemCon Medical Technologies INC

(Oregon, EEUU).

5.1 Hinchamiento de las pelculas de quitosano

La hidratacin de los polmeros es uno de los factores que influyen en la liberacin de

principios activos a travs de matrices polimricas. La hidrofilicidad en los polmeros

est dada por el grado de hinchamiento, el cual se calcula a partir de la relacin entre el

volumen de gel hinchado y el volumen de gel seco. Durante el proceso de hinchamiento

se produce la incorporacin del lquido en el interior de la matriz, producto de la

diferencia de potencial qumico del disolvente dentro y fuera de ella, provocando una

dilatacin de la misma. Al proceso de dilatacin se opone una fuerza elstica-retrctil, la

cual se opone a la penetracin del solvente [51]. El equilibrio de hinchamiento se

alcanza cuando se igualan la fuerza de hinchamiento y la fuerza elstica-retrctil.

En los hidrogeles inicos, la presencia de grupos cargados confiere caractersticas

nicas al hinchamiento. Dichas caractersticas dependen del pH y la fuerza inica del

medio. Peppas y Khare [52] determinaron como factores clave que afectan el

hinchamiento:

Grado de ionizacin.

Equilibrio de ionizacin.

Naturaleza de los contraiones.

El modelo ms comn para estudiar la difusin es el propuesto en las leyes de Fick. En

la primera ley se define que, en estado de equilibrio, el flujo del penetrante es

proporcional al gradiente de concentracin [51]:

J = - D (dc/dx) (I.1)

donde J representa el nmero de molculas de sustancia por segundo y por unidad de

superficie perpendicular a la direccin de flujo, D es el coeficiente de difusin, y dc/dx

es el gradiente de concentracin.

Introduccin

27

Existen otros modelos de cinticas que describen el comportamiento del hinchamiento

en los polmeros. Un ejemplo de los mismos es el planteado por Schott [53], donde se

estudia la cintica de hinchamiento en pelculas de gelatina y celulosa. El autor llega a

una ecuacin emprica que ajusta los valores obtenidos para todo el proceso de

hinchamiento. Dicha ecuacin es:

t

A BtW

(I.2)

donde W representa el hinchamiento a un tiempo t, A es la ordenada en el origen y B es

el inverso del hinchamiento mximo. El hinchamiento se calcula por la ecuacin [54]:

0

0

M MW

M (I.3)

donde M es el peso de la pelcula a un tiempo t y M0 es el peso de la pelcula antes del

proceso de hinchamiento.

Para tiempos grandes Bt >>A, la pendiente B se define como el inverso del

hinchamiento mximo1

W, mientras que para tiempos cortos Bt se puede despreciar y

en este caso A es el recproco de la velocidad inicial de hinchamiento

0

1A

dW

dt

.

A diferencia del comportamiento Fickiano, en que el hinchamiento est controlado por

la difusin, en el modelo de Schott el hinchamiento esta controlado por la relajacin de

las cadenas.

Al representar los valores de t

W en funcin de t, Schott demostr que el proceso de

hinchamiento de estos materiales responda a una cintica de segundo orden respecto al

hinchamiento remanente, representada por la siguiente ecuacin:

2dW

K W Wdt

(I.4)

donde W es el hinchamiento a tiempo infinito, W el hinchamiento a tiempo t y K la

constante del sistema. El proceso completo de transporte en una matriz polimrica

depende principalmente de dos factores, los cuales estn gobernados por una amplia

variedad de elementos relacionados con la composicin y las condiciones

Introduccin

28

experimentales. Uno de ellos es la movilidad segmental de las cadenas polimricas y el

otro est relacionado con la estructura y morfologa del polmero. En cuanto al primer

factor, el movimiento difusivo depende de la movilidad relativa de las molculas del

penetrante y de los segmentos de la cadena polimrica, su tamao, concentracin, la

interaccin de los componentes, la temperatura y otros factores que afectan la movilidad

segmental del polmero[51]. La estructura de la red polimrica es un parmetro

determinante cuando se describe el transporte a travs de las pelculas, ya que la

magnitud del espacio entre las cadenas polimricas va a determinar cmo se produce

dicho transporte.

6 El quitosano como promotor de la absorcin de frmacos

El uso de promotores de absorcin de frmacos en las formulaciones farmacuticas est

siendo objeto de estudio actualmente para mejorar la liberacin de frmacos a travs de

las mucosas. Los promotores empleados suelen ser polmeros multifuncionales con

propiedades mucoadhesivas, capaces de abrir transitoriamente las uniones intercelulares

en el epitelio, que no muestren toxicidad y que no se absorban, siendo el quitosano uno

de los polmeros ms estudiados [55].

Illum et al. (1994) [27] estudiaron el efecto de una solucin de quitosano de alto peso

molecular sobre el transporte de insulina a travs de la mucosa nasal en ratas y ovejas.

Sus resultados fueron prometedores y desde entonces se han realizado muchos estudios

sobre el potencial del quitosano para mejorar la absorcin de frmacos peptdicos a

travs de las mucosas. Por otro lado tambin se ha estudiado la administracin nasal de

antgenos en soluciones de quitosano y quitosano en polvo y se ha visto que promueven

la respuesta inmune del organismo. Illum et al. (2001) [56] evaluaron en humanos una

vacuna nasal de la gripe basada en una solucin de quitosano. Ms del 70% de los

voluntarios presentaron niveles protectores tras la administracin intranasal.

El efecto positivo del quitosano sobre la liberacin de frmacos a travs de los epitelios

se debe a una combinacin entre sus propiedades mucoadhesivas y su capacidad para

abrir las uniones estrechas (del ingls tight junctions) entre clulas epiteliales,

facilitando as el transporte de frmacos, sobre todo frmacos macromoleculares, a

travs del epitelio.

Introduccin

29

Mucoadhesin

La mucoadhesin aumenta el tiempo de permanencia y el contacto entre la membrana y

la formulacin, lo cual permite una liberacin del principio activo de forma sostenida en

el tiempo, reduciendo as la necesidad de varias dosis. Se ha descrito en la bibliografa

que la administracin de principios activos combinados con el quitosano prolonga el

tiempo de contacto entre el frmaco y la superficie de absorcin de las mucosas en

general [57].

Las propiedades mucoadhesivas del quitosano se deben a la interaccin entre sus grupos

amino protonados y la capa de mucus. ste est compuesto por una glicoprotena, la

mucina, que tiene cargas negativas debido a la presencia de residuos de cido silico. La

unin depende de la cantidad de cido silico presente en la mucina y del grado de

desacetilacin del quitosano o grupos amino libres. He et al. (1998) [58] estudiaron la

mucoadhesin de microesferas de quitosano en epitelio intestinal de rata y vieron que

sta aument con el nmero de grupos amino libres debido a los monmeros de

glucosamina del quitosano. EL pH tambin influye en las propiedades mucoadhesivas

del quitosano ya que a pH cido el quitosano se encuentra cargado positivamente (pKa

6,5). Tambin se ha descrito que los quitosanos con cadenas polimricas ms largas

penetran ms en la capa de mucina, por lo que un alto peso molecular del quitosano

tambin puede favorecer la mucoadhesin [59, 60]. En definitiva, un quitosano de peso

molecular alto y grado de desacetilacin alto favorece la mucoadhesin.

Apertura de uniones estrechas entre clulas epiteliales

Los epitelios actan como barreras que separan al organismo del medio externo, de

forma que incluso el movimiento de iones a travs del epitelio est retringido, dando

lugar a diferencias de potencial elctrico. Las molculas pueden atravesar el epitelio de

varias formas:

Por transporte pasivo o difusin, que se produce a favor de gradiente de

concentracin o gradiente de carga elctrica y que, por lo tanto, no supone un

gasto de energa para las clulas. La difusin pasiva puede producirse a travs de

la membrana celular (transporte transcelular) o entre clulas adyacentes

(transporte paracelular).

Introduccin

30

Por transporte activo, mecanismo que permite a la clula transportar sustancias a

travs de su membrana desde regiones menos concentradas a otras ms

concentradas. Es un proceso que requiere energa.

Las molculas lipoflicas atraviesan fcilmente la membrana celular por difusin pasiva.

Sin embargo, las molculas hidroflicas no pueden atravesar la membrana hidrofbica,

por lo que tienen que atravesar el epitelio por la va paracelular. Esta va est restringida

por la presencia de las uniones estrechas, estructuras multiproteicas dinmicas y

complejas que constituyen una barrera semipermeable, que restringe la difusin

dependiendo de la carga y el tamao del soluto. En el epitelio, las uniones estrechas se

encuentran en la membrana plasmtica en clulas adyacentes (Figura I.2) y forman una

estructura continua que rodea a las clulas completamente. Las uniones estrechas del

epitelio forman una barrera funcional y morfolgica entre las superficies apical y

basolateral de las clulas y regulan la difusin a travs de la va paracelular[61].

Complejo de protenas de unin estrecha

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Transporte paracelular

Unin estrecha

Transporte paracelular

Membranaapical

Membranabasolateral

Figura I.2. Representacin esquemtica de las uniones estrechas entre clulas epiteliales y el transporte

paracelular.

La unin estrecha est formada por un grupo de protenas transmembrana y citoslicas

que no slo interactan entre ellas, sino tambin con la membrana celular y el

citoesqueleto de actina, de modo que forman un sistema que une a los componentes de

las uniones estrechas con el citoesqueleto. Existen varios tipos de protenas distintas

dentro del grupo que forma parte de las uniones estrechas[61]:

Introduccin

31

La ocludina es una de las protenas integrales de membrana que forma parte de las

uniones estrechas. Por un lado proporciona la integridad estructural de la unin y por

otro regula su funcin de barrera. Hay estudios que asocian las ocludinas a la regulacin

de la difusin de pequeos marcadores hidroflicos, por lo que estn implicadas en la

regulacin de la dinmica de las uniones.

Las claudinas son las principales responsables del ensamblaje de las bandas formadas

por las uniones estrechas y de la formacin de rutas selectivas de difusin paracelular de

iones, ya que diferentes protenas de la familia de las claudinas permiten el paso de

distintos tipos de iones.

Se conocen tres protenas citoslicas, ZO-1, ZO-2 y ZO-3 (del latn Znula

occludens, que significa unin estrecha), denominadas protenas asociadas a uniones

estrechas, que interactan entre ellas y ponen en contacto la unin estrecha con el

citoesqueleto. Adems se ha descrito que regulan la funcin de la unin estrecha junto

con la ocludina. El estado de fosforilacin de estas protenas reguladoras se ha asociado

con diferencias en la permeabilidad en modelos in vitro. Las mismas rutas de

sealizacin cuyo efecto final es la fosforilacin de dichas protenas pueden tambin

afectar al citoesqueleto de actina, asociado a la membrana plasmtica por un grupo de

filamentos de actina situado debajo de la unin estrecha y por un anillo de filamentos a

nivel de la unin de adhesin que tambin contiene miosina II. La disrupcin del

citoesqueleto est asociada con la apertura de las uniones estrechas y, por tanto, al

aumento de la permeabilidad paracelular [62].

Smith et al. (2005) [63] describieron que la habilidad del quitosano en solucin y en

forma de nanopartculas para modular las uniones estrechas se puede explicar por las

posibles interacciones del quitosano con receptores especficos de la superficie celular

que conlleva la activacin de la transduccin de seales dependiente de la protena

kinasa C (PKC). La activacin de la PKC adems induce la prdida de asociacin de las

protenas de las uniones estrechas, la ZO-1 y la ocludina, en la membrana plasmtica y,

por tanto, la prdida de las uniones estrechas. Ranaldi et al. (2002) [64] tambin

demostraron que el tratamiento con quitosano alteraba la distribucin de F-actina en

clulas Caco-2.

Introduccin

32

7 Cultivos celulares como modelo epitelial

Los estudios con cultivos de clulas epiteliales permiten una fcil evaluacin de las

propiedades de las uniones entre clulas y constituyen un mtodo muy utilizado en

experimentos de transporte de principios activos a travs de monocapas celulares.

Para llevar a cabo este tipo de experimentos, las clulas epiteliales se suelen sembrar en

soportes permeables (transwells) (Figura I.3), que estn constitudos por una membrana

y una cmara basal y otra apical. Sobre estos soportes, las clulas sembradas forman

monocapas.

Compartimento apical

Monocapa de clulas

Filtro microporosoCompartimento basolateral

Figura I.3. Esquema de una monocapa celular en un soporte permeable.

Se realizan dos tipos de estudios en relacin con las uniones estrechas: la medida de

corrientes elctricas y el estudio del flujo de compuestos marcados a travs de las

monocapas. Como se ha comentado en el apartado anterior, las uniones estrechas

limitan la difusin paracelular de molculas hidroflicas de forma selectiva, por carga y

tamao. Cuando el movimiento de iones a travs de la monocapa est restringido debido

al correcto funcionamiento de la unin estrecha, existe un gradiente de potencial

elctrico a ambos lados de la misma. Por ello, la integridad y la madurez de las uniones

estrechas se suele determinar midiendo la resistencia elctrica transepitelial (TEER),

que es inversamente proporcional a la permeabilidad, empleando para ello un voltmetro

cuyos electrodos pueden aplicarse directamente sobre los soportes permeables. Este

estudio se realiza en medio de cultivo, por lo que refleja principalmente la

permeabilidad al sodio.

Las medidas de TEER se suelen realizar para hacer un seguimiento del crecimiento

celular tras la siembra, ya que su valor aumenta a medida que se va formando la

monocapa de clulas. As mismo, se realizan medidas de TEER durante los

Introduccin

33

experimentos de permeabilidad de sustancias problema para observar cualquier cambio

en la integridad de la monocapa. Los experimentos de permeabilidad paracelular se

llevan a cabo con compuestos marcados con fluorescencia como dextranos, o bien con

protenas que se pueden cuantificar con ensayos enzimticos. De esta forma es posible

cuantificar la cantidad de compuesto que pasa de la parte apical a la basal en un perodo

de tiempo concreto. Se pueden emplear marcadores de distintos pesos moleculares para

evaluar la eficiencia de un determinado promotor de permeabilidad celular.

Existen distintas lneas de clulas epiteliales que se utilizan como modelos para

experimentos de permeabilidad y de evaluacin de la apertura de uniones estrechas.

Clulas Calu-3

Los modelos celulares in vitro son muy utilizados con el fin de estudiar la deposicin y

absorcin de frmacos tras su administracin por la va respiratoria, aunque existen

otros mtodos como son estudios con modelos de perfusin en pulmn aislado y anlisis

frmaco-cinticos in vivo.

La lnea celular Calu-3 procede de adenocarcinoma de pulmn humano y se utiliza

como modelo del epitelio de las vas respiratorias [65]. El lumen y el tejido submucoso

de los conductos respiratorios constituyen el lugar de accin de una gran cantidad de

frmacos, pero tambin constituye una barrera frente a la absorcin de dichos frmacos.

Por tanto, el epitelio respiratorio es una membrana clave a estudiar, tanto por ser una

barrera para el transporte de frmacos, como por ser un lugar donde los frmacos

pueden ejercer su toxicidad. El epitelio vara entre un epitelio pseudo-estratificado en

columnas, con tres tipos principales de clulas (ciliadas, basales y secretoras)

interconectadas por uniones estrechas en los bronquios proximales, hasta un epitelio

progresivamente ms cuboidal, no cicliado y localizado en los bronquiolos distales [65].

Una caracterstica importante del epitelio respiratorio es su diferenciacin en capas de

clulas interconectadas por uniones estrechas intercelulares, que limitan el transporte

paracelular de solutos, por lo que afecta a la absorcin y el metabolismo de frmacos.

Otras caractersticas propias de este epitelio incluyen la produccin de mucus, la

presencia de cilios apicales y la expresin de transportadores y sistemas metablicos. Se

ha demostrado en varios estudios que algunas de estas caractersticas estn presentes en

las clulas Calu-3, lo que sugiere la utilidad de esta lnea celular como modelo del

epitelio respiratorio [66, 67].

Introduccin

34

Las condiciones de cultivo tienen un efecto importante sobre la diferenciacin de las

clulas epiteliales respiratorias y deben ser optimizadas para cada modelo celular

individualmente. Se han descrito tanto cultivos sumergidos como cultivos con una

interfase aire-lquido para clulas Calu-3 [68, 69]. La formacin de cilios est

influenciada por el mtodo de incubacin, siendo ms cortos y gruesos en cultivos

sumergidos[70].

Uno de los primeros trabajos sobre transporte de frmacos en clulas Calu-3 fue

realizado por Cavet et al. (1997) [71]. Estudiaron el transporte de ciprofloxacino a

travs de monocapas constituidas por estas clulas y observaron que el antibitico era

transportado principalmente por va transcelular por difusin pasiva. Este resultado

concidi con los resultados de estudios frmaco-cinticos en humanos.

8 Agentes entrecruzantes

Los sistemas de liberacin a base polmeros biodegradables necesitan ser entrecruzados

para modular sus propiedades y mantener la estabilidad de la matriz y as cumplir el

objetivo de liberar el frmaco a lo largo del tiempo deseado. El quitosano, como se ha

comentado, se disuelve en condiciones cidas, lo que limita su aplicacin como sistema

de liberacin. El entrecruzamiento puede reducir la solubilidad del quitosano en

solventes acuosos, aumentar su resistencia a la degradacin qumica o biolgica y

ayudar a controlar la liberacin de principios activos desde la matriz formada. El

glutaraldehido es un agente entrecruzante muy utilizado, pero su capacidad de

transformacin en especies reactivas txicas ha promovido la bsqueda de otros agentes

y procedimientos de entrecruzamiento ms seguros, como son el tripolifosfato sdico y

la genipina [72].

Tripolifosfato sdico

El tripolifosfato sdico (TPP) es un agente entrecruzante no txico (reconocido como

GRAS por la FDA) que es capaz de formar geles al unirse con el quitosano por

interaccin inica.

Desde que Bodmeier et al. (1989) [73] describiesen la preparacin de complejos

quitosano/TPP, la formacin de complejos entre estas molculas con cargas opuestas

para obtener formulaciones que controlan la liberacin de frmacos ha ganado inters

puesto que se trata de un proceso muy simple. Concretamente, la formulacin de micro

Introduccin

35

y nanopartculas por interaccin inica entre el quitosano y el tripolifosfato sdico es

muy comn porque implica la mezcla de dos fases acuosas a temperatura ambiente sin

el uso de solventes orgnicos.

La reaccin que se produce entre el quitosano y el TPP ha sido descrita en la

bibliografa [74, 75]. El TPP (Na5P3O10) disuelto en agua se disocia en iones

tripolifosfricos y en OH

y la solucin resultante tiene pH 9. Los pKa del TPP son:

pK1=1, pK2=2, pK3=2,79, pK4=6,47 y pK5=9,24 [76]. Los aniones procedentes del TPP

(P3O105-

, HP3O104-

y H2P3O103-

) coexisten en solucin acuosa en funcin del pH.

Dependiendo del valor de ste, predominarn unos u otros y de ello depender el tipo de

interaccin que ocurra entre el TPP y el quitosano. Cuando el TPP se disuelve en agua,

con pH 9, se disocia en iones P3O105-

y, ste a su vez en HP3O104-

y en iones OH-. Al

aadir la solucin de este agente entrecruzante (pH 9) a una solucin de quitosano (pH

cido), los iones P3O105-

y HP3O104-

compiten con los OH- por reaccionar con los grupos

NH3+ del quitosano por entrecruzamiento inico, en el caso de los iones tripolifosfricos

o por desprotonacin, en el caso de los OH- (Figura I.4).

A pH 9 de la disolucin de TPP, por tanto, habr grupos amino neutralizados por los

grupos hidroxilo y grupos amino entrecruzados inicamente.

Sin embargo, si el pH del TPP es ajustado a un pH cido, slo existirn iones

tripolifosfricos. El tipo de iones tripolifosfricos y su proporcin vendrn dados por el

pH de la solucin. En este caso, el complejo quitosano-TPP se forma exclusivamente

por entrecruzamiento inico entre los grupos NH3+ y los aniones de TPP.

Introduccin

36

a) neutralizacin de los grupos amino

b) entrecruzamiento inico

Figura I.4. Esquema de la reaccin entre el quitosano en solucin cida y los iones de TPP: A-

neutralizacn de los grupos amino, B- entrecruzamiento inico[75].

Genipina

La genipina (Figura I.5) es un compuesto de origen natural que se obtiene a partir del

genipsido procedente del fruto de Genipa americana y Gardenia jasminoides. Estos

frutos tienen propiedades antiinflamatorias, diurticas, colerticas y hemostticas[77].

Una propiedad destacable de la genipina es su capacidad de reaccionar espontneamente

con aminas primarias, dando lugar a pigmentos azules. Se ha descrito su reaccin con

materiales que contienen grupos amino, como el quitosano y algunos pptidos y

protenas, dando lugar a estructuras entrecruzadas qumicamente. Dicha propiedad

permite su utilizacin como agente entrecruzante en sistemas de liberacin de frmacos.

Introduccin

37

Se ha comprobado que la genipina presenta una toxicidad 5000-10000 veces ms baja

con respecto al glutaraldehido[78].

O

CH2OH

O OCH3

OH

Figura I.5. Estructura qumica de la genipina.

Durante la reaccin de entrecruzamiento entre la genipina y el quitosano se producen

dos reacciones separadas. La primera reaccin consiste en un ataque nucleoflico por

parte de los grupos amino del quitosano sobre el carbono 3 de la genipina, que da lugar

a la formacin de un compuesto heterocclico de la genipina unida al residuo de

glucosamina en el quitosano. La segunda reaccin, ms lenta, consiste en una

sustitucin nucleoflica del grupo ester de la genipina, liberando metanol y formndose

un enlace amida con el quitosano. En la Figura I.6 se muestra un esquema del

entrecruzamiento del quitosano con genipina. Simultneamente, se puede producir una

polimerizacin entre molculas de genipina que ya estn unidas a los grupos amino del

quitosano, lo cual puede dar lugar al entrecruzamiento del quitosano a travs de

copolmeros de genipina [77].

O

H

O

O

H

H

CH2OH

H

OH

H

H

NH

H

OH

NH2

H

HOH

CH2OH

N

CH2OH

O

OH

O

H

O

O

H

OH

HOH2C

H

H

H

H

H

H

HOH

CH2OH NH2

H

Figura I.6. Esquema del entrecruzamiento del quitosano con la genipina.

Introduccin

38

La genipina ha sido utilizada en la obtencin de diversos sistemas de liberacin de

frmacos tales como microcpsulas e hidrogeles. Mi et al. prepararon complejos

polielectrolitos con la membrana formada por alginato y quitosano y el interior de la

cpsula compuesto por quitosano entrecruzado con genipina [79], as como cpsulas de

quitosano entrecruzadas simultneamente por entrecruzamiento inico con TPP y

qumico con genipina[80]. Barck & Butler (2005) emplearon distintos polmeros

polianinicos, entre ellos el alginato, para formar complejos polielectrolitos con

quitosano y entrecruzados con genipina[81]. Por otro lado, microcpsulas de alginato-

quitosano con el interior compuesto de alginato y la membrana de quitosano con

genipina fueron preparadas por Chen et al. (2006) para la encapsulacin de clulas vivas

y otras aplicaciones en liberacin [82]. Hidrogeles de quitosano entrecruzados con

genipina han sido preparados y caracterizados en diversos trabajos [83, 84]. Slo se han

descrito en la biliografa algunos estudios sobre la preparacin, caracterizacin y

liberacin in vitro de frmacos a partir de microesferas de quitosano entrecruzadas con

genipina. Mi et al. (2001) prepararon microesferas de quitosano por un mtodo de

dispersin agua en aceite, utilizando genipina como agente entrecruzante[85]. Yuan et

al. (2007) obtuvieron microesferas de quitosano, albmina bovina y genipina[86].

9 Frmacos empleados

Claritromicina

La claritromicina es un antibitico perteneciente al grupo de los macrlidos, que ejerce

su accin antibacteriana por interferir en la sntesis de protenas de las bacterias

sensibles ligndose a la subunidad ribosomal 50S. Se trata de una sustancia bsica de

carcter cristalino, de color blanco. Su masa molecular es 747 g/mol. En la Figura I.7 se

presenta la estructura molecular de la claritromicina.

Introduccin

39

Figura I.7. Estructura molecular de Claritromicina.

La claritromicina es bactericida para Helicobacter pylori, presente en la mucosa gstrica

de la mayora de los pacientes con lcera duodenal o gastritis. La infeccin por

Helicobacter pylori se considera uno de los principales factores patognicos

responsables de la lcera gstrica.

La terapia con antibiticos presenta ciertos inconvenientes, como la necesidad de una

dosis frecuente para mantener la concentracin de frmaco en plasma al nivel

teraputico, el bajo cumplimiento por parte del paciente, infecciones causadas por

microorganismos resistentes y efectos secundarios en el tracto gastrointestinal [87]. La

ineficacia descrita en el tratamiento de la infeccin por H. pylori puede ser debida a la

baja estabilidad de los antibiticos en el medio cido del estmago, a la baja absorcin a

travs de la capa de mucus, o a la administracin de una dosis sub-teraputica[60].

La liberacin especfica de claritromicina en el estmago a travs de un sistema de

encapsulacin basado en quitosano podra ser un tratamiento adecuado frente a

H.pylori. El quitosano se hincha en medio cido, es un sistema adecuado para la

liberacin controlada de frmacos, presenta propiedades anticidas, disminuye la

irritacin en el estmago causada por la administracin de frmacos[60] y ejerce

actividad antibacteriana debido a la unin de los grupos catinicos del quitosano a las

molculas aninicas de la superficie externa de la membrana bacteriana [88]. Adems,

como se ha explicado anteriormente, es bioadhesivo y acta sobre las uniones estrechas

entre clulas epiteliales, por lo que aumenta el tiempo de residencia en el tejido y

promueve la absorcin del frmaco a travs de las mucosas. Por otro lado, la

Introduccin

40

microencapsulacin de claritromicina en una matriz polimrica la protegera frente a la

degradacin a pH cido.

La claritromicina es soluble a pH cido y su solubilidad disminuye al aumentar el pH,

por lo que es ms soluble y se absorbe mejor en el estmago que en el intestino.

Se han descrito en la bibliografa otros estudios de encapsulacin de claritromicina.

Majithiya y Murthy (2005) [60]obtuvieron microesferas de quitosano con claritromicina

por emulsificacin y entrecruzamiento con glutaraldehido. Zgoulli et al. (1999) [24]

prepararon microesferas cargadas con eritromicina y claritromicina por atomizacin

para enmascarar su sabor, aumentar la biodisponibilidad de estos antibiticos y mejorar

su estabilidad.

Hidrocloruro de tramadol

El hidrocloruro de tramadol (Figura I.8) es un opiceo sinttico del grupo de los

aminociclohexanoles (clorhidrato de () cis-2- [(dimetillamino)metil]-1-(3-metoxifenil)

ciclohexanol) con accin analgsica a nivel central. El tramadol es un anlogo sinttico

de la codena, con una menor afinidad que sta hacia los receptores opiceos. Su vida

media es de 5,5 horas, y la dosis adecuada suele ser de 50-100mg cada 4-6 horas. La

frmula emprica es C16H25NO2 y su masa molecular 263g/mol.

Figura I.8. Estructura molecular del hidrocloruro de tramadol.

El tramadol es un analgsico opiceo con un mecanismo dual de accin. Es una mezcla

racmica de los ismeros trans, observndose importantes diferencias desde el punto de

vista bioqumico, farmacolgico y metablico entre ambos enantimeros. El tramadol

tiene un potencial mucho menor que otros opiceos para inducir depresin respiratoria y

dependencia, pero ambos efectos adversos pueden tener lugar. Para disminuir la

frecuencia de administracin, sera deseable administrarlo a travs de una forma

farmacutica de accin retardada.

Introduccin

41

Hidrocloruro de ciprofloxacino

El hidrocloruro de ciprofloxacino (Figura I.9) es un antibitico del grupo de las

fluoroquinolonas. Se utiliza en casos de pneumona, infecciones cutneas y es uno de

los antibiticos ms utlizados en oftalmologa [89]. Su peso molecular es de

331,35g/mol. Es activo frente a un amplio espectro de bacterias Gram-negativas

aerobias, incluyendo patgenos entricos, Pseudomonas y Serratia marcescens, aunque

ya han empezado a aparecer cepas resistentes. Igualmente es activo frente a bacterias

Gram-positivas, aunque tambin se han detectado resistencias en algunas cepas de

Staphyloccocus aureus y Pneumococos. No es activo frente a microorganismos

anaerobios. Se utiliza ocasionalmente, en combinacin con otros antibacterianos, en el

tratamiento de las infecciones por micobacterias.

Los efectos antibacterianos del hidrocloruro de ciprofloxacino se deben a la inhibicin

de la topoisomerasa IV y la DNA-girasa bacterianas. Estas topoisomerasas alteran el

DNA introduciendo pliegues superhelicoidales en el DNA de doble cadena, facilitando

el desenrollado de las cadenas. La DNA-girasa tiene dos subunidades codificadas por el

gen gyrA, y actuan rompiendo las cadenas del cromosoma bacteriano y luego

pegndolas una vez que se ha formado la superhlice. Las quinolonas inhiben estas

subunidades impidiendo la replicacin y la transcripcin del DNA bacteriano. Las

clulas humanas y de los mamferos contienen una topoisomerasa que acta de una

forma parecida a la DNA-girasa bacteriana, pero esta enzima no es afectada por las

concentraciones bactericidas del hidrocloruro de ciprofloxacino.

Este principio activo puede producir efectos secundarios cuando se administra por va

oral, como dolor abdominal, nauseas, dolor de cabeza, entre otros. Una forma

alternativa de administracin, como la va tpica podra minimizar estos efectos

secundarios [90].

N

NH

N

F

O

OH

O

Figura I.9. Estructura molecular del hidrocloruro de ciprofloxacino

Introduccin

42

10 Modelos matemticos

Los estudios de disolucin/liberacin in vitro constituyen un eslabn importante dentro

de la cadena del desarrollo de un nuevo medicamento. Bajo ciertas condiciones puede

servir para aportar criterios de biodisponibilidad y bioequivalencia.

Un objetivo fundamental a la hora de desarrollar nuevos sistemas de liberacin

controlada, es poder predecir los niveles plasmticos que alcanzar el frmaco una vez

administrado. De esa forma, el desarrollo de los procesos de obtencin de nuevos

medicamentos puede ser acelerado, de modo que stos pueden ponerse en el mercado

con mayor brevedad y a menor precio. Por este motivo se han desarrollado numerosos

modelos matemticos que permiten predecir las cinticas de disolucin- liberacin de

los principios activos incluidos en los sistemas de liberacin controlada, y por tanto su

biodisponibilidad in vivo. Estos modelos permiten interpretar los resultados

cuantitativos de un ensayo de liberacin in vitro a travs de una ecuacin que relaciona

varios parmetros [91]. Para comparar diferentes perfiles de liberacin se pueden

emplear mtodos matemticos (mtodos modelo dependiente) y mtodos estadsticos

(mtodos modelo independiente), que incluyen el anlisis de la varianza, de una o dos

vas (ANOVA).

Los modelos matemticos facilitan el anlisis cuantitativo de los resultados obtenidos en

los ensayos de liberacin/disolucin, y describen los resultados de liberacin en funcin

de alguna de las caractersticas o variables de la formulacin empleada [91].

Cintica de orden cero

Las formas farmacuticas que presentan esta cintica liberan la misma cantidad de

frmaco por unidad de tiempo. Es el mecanismo de liberacin ideal cuando se quiere

conseguir una accin farmacolgica prolongada.

La liberacin del frmaco desde formas farmacuticas que no se disgregan y que liberan

el principio activo lentamente (asumiendo que el rea no cambia y que no se alcanzan

condiciones de equilibrio), puede ser representada por la siguiente ecuacin:

W0-Wt = Kt (I.5)

donde W0 es la cantidad inicial de frmaco en la forma farmacutica, Wt es la cantidad

de frmaco presente en la misma a tiempo t y K la constante de proporcionalidad.

Introduccin

43

Si esta ecuacin se divide entre W0 y se simplifica, se obtiene:

ft = K0 t (I.6)

donde )/(1 0WWf tt y tf representa la fraccin de frmaco liberado a tiempo t y K0

la constante de liberacin aparente o constante de orden cero. De esta forma, una grfica

de la fraccin de frmaco liberado en funcin del tiempo ser lineal si se cumplen las

condiciones anteriores.

Otra forma de expresar este modelo se refleja en la siguiente ecuacin:

Qt = Q0 + K0t (I.7)

donde Qt es la cantidad de frmaco liberado a tiempo t, Q0 es la cantidad inicial de

frmaco en solucin, que generalmente es cero y K0 es la constante de velocidad en la

cintica de orden cero.

Cintica de primer orden

La aplicacin de este modelo al estudio de la liberacin de frmacos fue propuesto por

primera vez por Gibaldi y Feldman en 1967 [92]. La cintica de orden uno presenta la

siguiente ecuacin de velocidad:

Qt = Q0 e -K1t

(I.8)

ln Qt= -K1t+ ln Q0 (I.9)

o en logaritmos decimales:

log Qt = -(K1t/2,303) +log Q0 (I.10)

donde Qt es la cantidad de frmaco liberado a tiempo t, Q0 es la cantidad inicial de

frmaco en la solucin y K1 es la constante de primer orden.

De esta forma, la representacin del logaritmo de la cantidad de frmaco disuelto frente

al tiempo transcurrido da lugar a una recta en los procesos con cintica de primer orden.

Las formas farmacuticas que siguen este perfil de disolucin suelen ser matrices

porosas que contienen principios activos hidrosolubles.

Modelo de Higuchi

Higuchi (1963) desarroll varios modelos tericos para estudiar la liberacin de

frmacos solubles y poco solubles incorporados en matrices slidas o semi-slidas[93].

Introduccin

44

Este modelo describe la liberacin del frmaco como un proceso de difusin a travs de

la matriz de polmero, siempre y cuando se mantengan las condiciones sumidero (del

ingls sink conditions), es decir, que se garantice la solubilidad del frmaco en todo

momento durante la liberacin. Esta difusin est basada en la ley de Fick, que depende

de la raz cuadrada del tiempo. Generalmente se emplea lo que se conoce como

ecuacin simplificada de Higuchi:

Q = KH t1/2

(I.11)

donde Q es la cantidad de frmaco liberado y KH es la constante de disolucin de

Higuchi.

Modelo de Hixson- Crowell o de la raz cbica

Hixson and Crowell (1931) [94], partiendo de la base de que el rea regular de la

partcula es proporcional a la raz cbica de su volumen propusieron la siguiente

ecuacin para describir este modelo:

W01/3

- Wt1/3

= Kst (I.12)

donde W0 es la cantidad inicial de frmaco en la forma farmacutica, Wt es la cantidad

de frmaco que queda en la forma farmacutica a tiempo t y Ks es una constante que

incorpora la relacin superficie-volumen.

Dividiendo la ecuacin anterior entre W01/3

y simplificando:

(1 f t) 1/3

= 1- K t (I.13)

donde )/(1 0WWf tt y representa la fraccin de frmaco disuelto a tiempo t y K es la

constante de liberacin.

La grfica de la raz cbica de la fraccin de frmaco no liberada en funcin del tiempo

ser lineal si la forma farmacutica disminuye de tamao proporcionalmente en el

tiempo. Cuando se utiliza este modelo, se asume que la velocidad de liberacin est

condicionada por la velocidad de disolucin de las partculas de frmaco y no por la

difusin que pueda ocurrir a travs de la matriz polimrica.

Modelo de Korsmeyer-Peppas

Korsmeyer et al. (1983) [95] desarrollaron un modelo semiemprico sencillo que

relaciona la liberacin de frmaco con el tiempo a travs de una ecuacin exponencial.

Estos autores plantearon que, en ocasiones, el mecanismo de difusin se desva de la

Introduccin

45

difusin Fickiana, siguiendo un comportamiento anmalo o no Fickiano. Es un modelo

especialmente til cuando se desconoce el mecanismo de liberacin o cuando sta

ocurre por ms de un mecanismo.

Mt/M= Ktn (I.14)

Log Mt/M= Log K+ n Log t (I.15)

donde Mt es cantidad de frmaco liberado a tiempo t, M es la cantidad de frmaco que

se liberara a tiempo infinito (por tanto, Mt/M es la fraccin de frmaco liberado a

tiempo t), K es la constante del sistema y n es el exponente difusional. La representacin

del Log Mt/M en funcin del Log t dar lugar a una lnea recta si el sistema se ajusta a

este modelo.

Segn los valores que tome n se pueden definir distintos mecanismos de transporte [96].

En la Tabla I.2 se muestran los posibles mecanismos que se pueden observar en la

liberacin controlada de un principio activo utilizando una pelcula polimrica como

sistema regulador. Cuando n = 0,5 se trata de una difusin Fickiana y la constante k

puede expresarse como:

1/ 2

24

iDk (I.16)

donde Di es el coeficiente de difusin del frmaco desde el polmero y el espesor de la

matriz de polmero.

Valores de n > 0,5 se asocian a un mecanismo de difusin anmalo (no Fickiano). En

particular, cuando n = 1, se trata de la cintica de orden cero, que Peppas considera un

caso lmite de transporte no Fickiano, denominndolo Transporte Caso II. En este

caso, el transporte del soluto se realiza a velocidad constante debido a que el frente de

hinchamiento del polmero avanza de forma constante. Este tipo de transporte est

controlado por la relajacin de las cadenas del polmero.

Cuando n < 0,5 < 1, el proceso est dominado por procesos de difusin y relajacin de

las cadenas polimricas. Valores de n > 1 aparecen usualmente cuando los tiempos de

liberacin son muy elevados y a este tipo de transporte lo denominan Transporte

Supercaso II. Por ltimo, valores de n < 0,5 se asocian a la presencia de poros en la

matriz polimrica y a la consiguiente difusin simultnea a travs de la matriz hinchada

y a travs de los poros llenos de medio de disolucin.

Introduccin

46

Tabla I.2. Resumen de los mecanismos de transporte de solutos dependiendo del exponente difusional n.

Exponente de liberacin

(n)

Mecanismo de

transporte del frmaco

0,5 Difusin Fickiana

0,5 n 1 Transporte anmalo

1 Transporte Caso II

n>1 Transporte Supercaso II

En la Tabla I.3 se muestran los valores del exponente difusional (n) para matrices de

liberacin con diferentes geometras y mecanismos de liberacin.

Tabla I.3. Valores del exponente difusional en el modelo emprico de Korsmeyer-Peppas para sistemas de

distinta geometra.

Geometra de

la matriz

Sistema controlado

por difusin (Caso I)

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Lmina n = 0,5 n = 1

Cilindro n = 0,45 n = 0,89

Esfera n = 0,43 n = 0,85

Cuando el hidrogel est inicialmente hinchado y contiene un frmaco soluble, las

ecuaciones que se utilizan en la cintica de liberacin son las mostradas en la Tabla I.4,

las cuales dependen de la geometra del hidrogel [97].

Tabla I.4. Soluciones aproximadas para la liberacin difusional de frmacos a partir de matrices

polimricas [97].

Geometra Estados iniciales Estados finales

Pelculas

r = espesor

2/1

24

r

Dt

M

M t

2

2

2exp

81

r

Dt

M

M t

Cilindros

r = radio 2

2/1

24

r

Dt

r

Dt

M

M t

2

2

2

405.2exp

405.2

41

r

Dt

M

M t

Esferas

r = radio 2

2/1

236

r

Dt

r

Dt

M

M t

2

2

2exp

61

r

Dt

M

M t

Introduccin

47

Modelo de Baker- Lonsdale

Este modelo fue desarrollado por Baker and Lonsdale (1974) [98] a partir del modelo de

Higuchi. Describe la liberacin de frmaco desde una matriz esfrica y viene dado por

la siguiente expresin:

ktM

M

M

Mf ttt

3/2

112

3 (I.17)

donde Mt es la cantidad de frmaco liberada a tiempo t, M es la cantidad de frmaco

que se liberara a tiempo infinito (por tanto, Mt/M es la fraccin de frmaco liberado a

tiempo t) y k la constante de liberacin y pendiente de la recta.

Esta ecuacin se ha empleado para la linealizacin de perfiles de liberacin de

microcpsulas y microesferas[99].

Materiales y Mtodos

49

II. MATERIALES Y MTODOS

Materiales y Mtodos

51

1 Materiales

En este trabajo se han empleado los siguientes reactivos:

Polmeros

Hidrocloruro de quitosano (HCS) (Protasan UP Cl 113 y 213), suministrado por

Novamatrix (Noruega), de 150 y 400 kDa de peso molecular respectivamente y un

grado de desacetilacin del 86% en ambos casos.