UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - … · la realización de los estudios de biología molecular....

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA

Departamento de Ciruga

TESIS DOCTORAL

Clulas cebadas mucosas y de tejido conectivo esplcnicas en la

colestasis extraheptica microquirrgica experimental

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Ana Arias Milla

Directores

Jaime Arias Prez Valentn Cuervas-Mons Martnez

Mara ngeles Aller Reyero

Madrid, 2014

Ana Arias Milla, 2014

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRUGIA

CLULAS CEBADAS MUCOSAS Y DE TEJIDO

CONECTIVO ESPLCNICAS EN LA COLESTASIS

EXTRAHEPTICA MICROQUIRRGICA

EXPERIMENTAL

Memoria para optar al Grado de Doctor

presentada por

ANA ARIAS MILLA

Directores:

Prof. Jaime Arias Prez

Prof. Valentin Cuervas-Mons Martinez

Prof. Mara Angeles Aller Reyero

TESIS DOCTORAL

MADRID, 2013

A mi padrino

Agradecimientos

- Al profesor Valentin Cuervas-Mons Martinez cuyas enseanzas tanto en el campo

clnico como experimental, han sido fundamentales para elaborar este trabajo y

constituirn una indispensable gua en mi carrera profesional.

- A la profesora doctora Mara Angeles Aller Reyero, por acogerme con tanto cario y

aportar su inteligencia creadora y primorosa sensibilidad.

- Al profesor doctor Jaime Arias por su amor a la verdad, generosidad y humildad, sin

lmite. Por tan precioso y delicado legado, gracias.

- A Patri Vergara, y Vicente Martnez, Profesores del Departamento de Biologa Celular,

Fisiologa e Inmunologa, de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autnoma de

Barcelona, as como al resto de su grupo de Investigacin por su colaboracin

fundamental en la realizacin de este trabajo experimental.

- A las Profesoras Elena Vara y Cruz Garca Martn por su inestimable colaboracin en

la realizacin de los estudios de biologa molecular.

- A Pedro Cuesta y Santiago Cano, expertos en el tratamiento estadstico de los

resultados por su inmejorable ayuda.

- A los investigadores y doctorandos que me han antecedido en el estudio de este

modelo experimental, ya que me han permitido disponer de numerosa y valiosa

informacin en la elaboracin de este trabajo.

- A la Directora del animalario del Hospital Universitario La Paz, de la Universidad

Autnoma de Madrid, as como a los tcnicos y al personal auxiliar de su equipo.

- A Paula Pinilla, secretaria del departamento de ciruga de la universidad complutense

de Madrid, por su gentil disponibilidad e inestimable colaboracin administrativa.

- A Matilde Martinez Diaz y Consuelo Garca Pascual por su continuo inters y ayuda en

la realizacin de los trmites administrativos.

- A Mara Elena Vicente por la excelente transcripcin mecanogrfica del manuscrito.

- A Carlos Gilsanz por su infinita paciencia a la hora de ensearme la tcnica quirrgica

y por hacer de aquellas horas un entraable nucleo de trabajo.

- Al Doctor Manuel Losada por su incondicional disponibilidad y amabilidad

- A Carlos Nieto y Zoe de Julin por haber compartido las tardes de colestasis y formar

un gran equipo coordinado.

- A mis padres y hermanos, por su apoyo incondicional en todos los proyectos de mi

vida y por compartir mi ilusin en aquello por lo que lucho.

- A Santiago Mercader por comprender y compartir de cerca mi esfuerzo como nadie

habra sabido hacerlo. Por su enseanza de actitud ante la adversidad y continua

esperanza.

- A mi amiga Adela Martinez por su colaboracin en la traduccin a la lengua inglesa y

su amistad verdadera independiente de la localizacin geogrfica de ambas y del

momento vital de nuestros caminos.

- A mi tutora Susana Mellor por su constante inters en mi mejora laboral y por su

ejemplo de sacrificio vital y de calidad humana.

ndice de abreviaturas y acrnimos

A

AB: cidos biliares

ANOVA: nalisis de la varianza

ALP: Fosfatasa alcalina

B

B: Bazo

BD: Bilirrubina directa

BT: Bilirrubina total

C

CCl4: Tetracloruro de carbn

CCR2: Chemokine receptor 2

CGRP: Pptido relacionado con el gen de la Calcitonina (Calcitonin gen related

peptide)

CM: Ratas con colestasis microquirrgica

CMK: Ratas con colestasis microquirrgica tratadas con ketotifn

CMQ: Ratas con colestasis microquirrgica

CMQ+K: Ratas con colestasis microquirrgica tratadas con ketotifn

CO: Monxido de carbono

CTGF: Factor de crecimiento de tejido conectivo (connective tissue growth factot)

D

D: Duodeno

DE: Desviacin estndar

DMSO: Dimetil silfxido

DNA: Acido desoxirribonucleico

E

EGF: Factor de crecimiento epitelial (epithelial growth factor)

ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay

eNOS: xido Ntrico sintasa endotelial

ER: Espleno-renal

Eri: Colaterales portosistmicas esplenorenales inferiores o caudales

Ers: Colaterales portosistmicas esplenorenales superiores o craneales

ES: Estadsticamente significativo

ETs: Redes extracelulares, extracelular traps.

F

FA: Fosfatasa alcalina

G

GAGs: Glicosaminoglicanos

GGT: Gammaglutamil transferasa

GLM: Ganglios linfticos mesentricos

GM-CSF: Factor estimulante de colonias macrfago-granulocito

H

HDL: Lipoproteinas de alta densidad (High Density Lipoprotein)

HGF: Factor de crecimiento hepatocitario

HIF: Factor inducible de hipoxia

HMGB1: High-mobility group box protein 1

H2S: Sulfuro de hidrgeno

I

ICAM-1: Molecula de adhesin leucocitaria 1

IFCC: International Federation for Clinical Chemistry

IFN-: Interfern Gamma

IGF: Insuline-like growth factor

IL: Interleuquinas

iNOS: Ox ido ntrico sintasa inducible

PC: Incremento de peso corporal

IP-10 / CXCL10: Proteina 10 inducible por interfern

L

LBP: Lypopolisacaride-blinding-protein

LC: Lobulo caudado

LDH: Lactato Deshidrogenasa

LDL: Lipoproteinas de baja densidad (Light Density Lipoprotein)

LK: Rin izquierdo

LLD: Lobulo lateral derecho

LLI: Lobulo lateral izquierdo

LM: Lobulo medio

LPS: Lipopolisacrido

LRV: Vena renal izquierda

LSR: Glndula suprarrenal izquierda

M

MAPK: ERK-mitogen-activated protein kinase

MCP-1: Proteina quimioatrayente de macrofagos 1 (Monocyte chemoatractant protein

1)

MDC: Quimioquina derivada de los macrfagos (macrophage-derived chemokine)

MIF: Factor inductor de macrfagos

MIG/CXCL9: Monoquina inducida por interfern (monokine induced by IFN-)

MMP: Metaloproteasas de la matriz tisular

mRNA: Acido ribonucleico mensajero

N

Na: Sodio

NAD+ y NADH: Nicotinamida adenina dinucletido

NF-alfaB/IkBalfa: Complejo regulador transcripcional de NFalfaB.

NF-B: Factor de transcripcin

Nuclear kappa B

NFkB/IkB: Complejo regulador transcripcional de

NF-B

NO: Oxido ntrico

NK cells: Clulas asesinas naturales

P

P: Pancreas

PAF: Factor de activacin plaquetario

PAR: Receptores activados de proteinasas

PC: Peso corporal

PE: Peso esplnico

PH: Peso heptico

PDGF: Factor de crecimiento derivado de las plaquetas

PGI2: Prostaciclina

P.O: Post-operatorio

PP: Presin portal

PR: Colaterales pararrectales

PSO: Ratas pseudo-operadas

PSO+ K: Ratas pseudo-operadas con Ketotifen

PT: Peso testicular

S

S: Bazo

SCF: Stem cell factor

SO: Ratas Pseudoperadas

SO+K: Ratas Pseudoperadas tratadas con ketotifn

R

RANTES: Regulated on activation of normal T cells-expressed and secreted protein

RMCP-I: Rat mast cell proteinase I

RMCP-II: Rat mast cell proteinase II

ROS: Especies reactivas de oxgeno

T

TGF-1: Factor de crecimiento transformador 1 (Transforming growth factor)

TIMP-1: Inhibidores tisulares de las MMPs

TLR: receptores Toll-like

TNF: Factor de necrosis tumoral alfa

V

VCAM: Molecula de adhesin celular vascular

VE: Vena esplnica

VEGF: Vascular endothelial Growth factor

VLDL: Lipoproteinas de muy baja densidad (Very Light Density Lipoprotein)

VVM: Vasculopata venosa mesentrica

NDICE GENERAL

NDICE GENERAL

RESUMEN/ABSTRACT..

SUMMARY.

I. INTRODUCCIN .......................................................................................... 1

1.COLESTASIS EXTRAHEPTICA Y RESPUESTA INFLAMATORIA .............................. 2

2.MODELOS EXPERIMENTALES PARA EL ESTUDIO DE LA COLESTASIS

EXTRAHEPTICA ................................................................................................. 7

3.ALTERACIONES FISIOPATOLGICAS EN LA COLESTASIS EXTRAHEPTICA

EXPERIMENTAL ................................................................................................. 14

4.LAS CLULAS CEBADAS COMO MEDIADORAS DE INFLAMACIN Y FIBROSIS ....... 22

5.KETOTIFN: UN FRMACO ESTABILIZADOR DE LAS CLULAS CEBADAS ............. 34

II. HIPTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................ 40

III. MATERIAL Y METODOS .......................................................................... 43

1.MATERIAL ...................................................................................................... 44

1.A.ANIMALES ................................................................................................. 44

1.B.INSTALACIONES ........................................................................................ 44

1.B.1.Animalario ............................................................................................ 44

1.B.2.Unidad de microciruga .......................................................................... 45

1.B.3.Sala de sacrificio y procesado de muestras .............................................. 45

1.B.4.rea de conservacin de muestras .......................................................... 46

1.B.5.Eliminacin de residuos biolgicos .......................................................... 46

1.C.FRMACOS ................................................................................................ 46

1.C.1.Anestsicos ........................................................................................... 46

1.C.2.Ketotifn .............................................................................................. 47

1.C.3.Otros frmacos ..................................................................................... 47

1.D.MATERIAL ................................................................................................. 47

1.D.1.Instrumental quirrgico ......................................................................... 47

1.D.1.A.Pinzas ............................................................................................. 47

1.D.1.B.Porta agujas Mayo-Hegar de 12,7 cms ............................................... 48

1.D.1.C.Tijeras ............................................................................................ 48

1.D.2.Material de sutura y ligadura .................................................................. 48

1.D.3.Material quirrgico complementario ........................................................ 48

1.D.4.Otros materiales para el procedimiento operatorio y la extraccin de

muestras ....................................................................................................... 49

1.D.5.Material de laboratorio .......................................................................... 49

1.E.EQUIPOS DE LABORATORIO ....................................................................... 50

1.E.1.Procesado de muestras .......................................................................... 50

1.E.2.Estudios bioqumicos en suero y lquido asctico ....................................... 50

1.E.3.Determinacin de niveles de mediadores inflamatorios en hgado, leon y

gnglios linfticos mesentricos ...................................................................... 50

1.E.4.Estudio del recuento de clulas cebadas mucosas y conectivas esplcnicas 50

1.F.REACTIVOS DE LABORATORIO .................................................................... 51

1.F.1.Estudios bioqumicos en suero ................................................................ 51

- Bilirrubina total y directa ............................................................................ 51

- cidos biliares ........................................................................................... 51

- Fosfatasa alcalina ...................................................................................... 51

- Protenas totales ........................................................................................ 51

1.F.2.Niveles de pptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) e

interleuquina (IL-13) en lquido asctico ........................................................... 52

- Pptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) ............................... 52

- Interleuquina 13 (IL-13) ............................................................................. 52

1.F.3.Niveles de citoquinas en tejidos esplcnicos ............................................. 52

1.F.4.Valoracin de clulas cebadas mucosas y conectivas esplcnicas ............... 53

1.F.4.A.Valoracin de clulas cebadas mucosas (RMCP-II)............................... 53

1.F.4.B.Valoracin de clulas cebadas conectivas (RMCP-I) ............................. 53

2.MTODOS ...................................................................................................... 54

2.A.CONDICIONES DE UTILIZACIN Y ESTABULACIN DE LOS ANIMALES .......... 54

2.B.DISEO EXPERIMENTAL ............................................................................. 54

2.C.TCNICA ANESTSICA ................................................................................ 56

2.D.TCNICA QUIRRGICA DE PSEUDO-OPERACIN .......................................... 57

2.E.TCNICA DE COLESTASIS EXTRAHEPTICA MICROQUIRRGICA ................... 58

2.F.MANTENIMIENTO Y TRATAMIENTO POSTOPERATORIO ................................ 63

2.G.SACRIFICIO DE LOS ANIMALES ................................................................... 65

2.H.DESARROLLO DE ASCITIS Y CIRCULACIN COLATERAL ESPLENORRENAL ..... 66

2.I.VASCULOPATA VENOSA MESENTRICA ....................................................... 67

2.J.BIOQUMICA SANGUNEA ........................................................................... 69


- cidos biliares ........................................................................................... 71



2.K.MARCADORES INFLAMATORIOS EN LQUIDO ASCTICO ............................... 72

- Pptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) ............................... 72

- IL-13 ........................................................................................................ 72

2.L.DETERMINACIN DE MEDIADORES INFLAMATORIOS ESPLCNICOS .............. 72

2.L.1.Homogeneizacin de los tejidos .............................................................. 72

2.L.2.Valoracin de protena quimiotctica de macrfagos, TNF alfa, IL-10 e IL-13

.................................................................................................................... 73

2.L.3.Determinacin de los niveles tisulares de protenas .................................. 73

2.M.ESTUDIO DEL RECUENTO DE CLULAS CEBADAS MUCOSAS Y CONECTIVAS

ESPLCNICAS .................................................................................................. 74

2.M.1.Clulas cebadas mucosas ...................................................................... 74

2.M.2.Clulas cebadas de tejido conectivo ........................................................ 75

2.N.ANLISIS ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS ............................................ 76

IV. RESULTADOS .......................................................................................... 77

1.SUPERVIVENCIA Y COMPLICACIONES POSTOPERATORIAS ................................. 78

2.HALLAZGOS MACROSCPICOS EN LA NECROPSIA ............................................. 79

3.EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL ................................................................... 81

4.PESO HEPTICO ............................................................................................. 82

5.PESO ESPLNICO ............................................................................................ 84

6.PESO TESTICULAR .......................................................................................... 85

7.CIRCULACIN COLATERAL ESPLENORRENAL .................................................... 87

8.VASCULOPATA VENOSA MESENTRICA ........................................................... 87

9.ASCITIS ......................................................................................................... 89

10.BIOQUMICA SANGUNEA .............................................................................. 92


- cidos biliares ........................................................................................... 93



11.ESTUDIO DE MEDIADORES INFLAMATORIOS ESPLCNICOS ............................. 96

- MCP-I ....................................................................................................... 96

- TNF alfa ................................................................................................... 98

- IL-10 ...................................................................................................... 100

- IL-13 ...................................................................................................... 102

12.ESTUDIO DEL RECUENTO DE CLULAS CEBADAS MUCOSAS Y CONECTIVAS

ESPLCNICAS .................................................................................................. 104

- Hgado ................................................................................................... 104

- Bazo ....................................................................................................... 106

- Ganglios linfticos mesentricos ................................................................ 108

- leon ...................................................................................................... 110

V. DISCUSIN ............................................................................................ 113

VI. CONCLUSIONES .................................................................................... 133

VII. BIBLIOGRAFIA .................................................................................... 135

RESUMEN

Introduccin: La colestasis extraheptica se manifiesta clnicamente por

ictericia, coluria, acolia y prurito. Desde el punto de vista bioqumico cursa con niveles

sricos elevados de bilirrubina, cidos biliares, fosfatasa alcalina, gamma-glutamil

transferasa e hipercolesterolemia. En el parnquima heptico la colestasis produce

fibrosis/cirrosis biliar, que causa insuficiencia heptica crnica e hipertensin portal.

Para el estudio de esta patologa se utiliza principalmente, el modelo experimental de

ligadura y seccin del coldoco, en la rata. Sin embargo, este modelo experimental

evoluciona con complicaciones secundarias a la formacin de un pseudoquiste biliar,

con colangitis, abscesos hepticos, pulmonares y sepsis. Para reducir estas

complicaciones se ha propuesto como modelo alternativo la reseccin microquirrgica

de la va biliar extraheptica en la rata, que causa fibrosis biliar, insuficiencia heptica

crnica e hipertensin portal con circulacin colateral portosistmica.

Hiptesis y Objetivos: La patologa esplcnica secundaria a la ictericia obstructiva,

se considera que posee naturaleza inflamatoria y, en particular, se sospecha que las

clulas cebadas participan en su patogenia. Por esta razn, en el presente trabajo

experimental, se ha utilizado el modelo experimental de colestasis extraheptica

microquirrgica en la rata para estudiar la implicacin de las clulas cebadas de tipo

mucoso y de tejido conectivo en la patologa esplcnica, as como su respuesta al

tratamiento con el frmaco estabilizador de clulas cebadas, Ketotifen.

Material y Mtodos: En ste trabajo se han utilizado ratas Wistar macho con pesos

corporales oscilantes entre 215 y 335 gramos. Los animales se han distribuido

aleatoriamente para su estudio en 4 grupos: 1.-Ratas pseudooperadas (SO) a las que

se realiza laparotoma media y diseccin de la via biliar extraheptica.; 2.-Ratas a las

que se les ha realizado colestasis extrahepatica microquirrgica (CMQ), consistente en

la reseccin de la via biliar extraheptica; 3.-Ratas pseudooperadas a las que se les ha

administrado ketotifen (SO + K) desde las 24 h antes de la intervencin hasta el

sacrificio a las 8-9 semanas del postoperatorio y ;4.-Ratas con colestasis

microquirrgica a las que se les administra ketotifen en el mismo periodo ( CMQ + K).

En estas series se han realizado las siguientes determinaciones sricas: bilirrubina,

acidos biliares, fosfatasa alcalina y protenas totales. En lquido asctico se han

determinado IL-13 y de pptido regulador del gen calcitonina (CGRP). Se han

determinado en tejidos esplcnicos la protena quimiotctica de macrfagos (MCP-1),

TNF-alfa, IL-10 e IL-13. Asi mismo, se han determinado las poblaciones de clulas

cebadas mucosas y de tejido conectivo en hgado, bazo, ganglios linfticos

mesentricos e ileon.

Resultados: Las ratas con colestasis extraheptica microquirrgica a las 8-9 semanas

de evolucin postoperatoria presentan ictericia, hepato-esplenomegalia, ascitis,

circulacin colateral portosistmica, vasculopata venosa mesentrica e hipogonadismo.

Asimismo, sufren incremento de las concentraciones sricas de bilirrubina (p

tratados con Ketotifen, respecto a los animales colestsicos sin tratamiento. Sin

embargo, las ratas colestsicas tratadas con Ketotifen sufrieron un significativo

incremento del nmero de clulas cebadas tanto de tipo mucoso como de tejido

conectivo en los ganglios linfticos mesentricos (p

la colestasis extraheptica, permitira su inclusin entre los sndromes de activacin de

clulas cebadas.

ABSTRACT

Introduction: Extrahepatic cholestasis is a condition whose clinical manifestations are

icterus, choluria, acholia and pruritus. Biochemically, it is characterised by high levels

of serum bilirubin, biliary acids, alkaline phosphatase and gamma-glutamyltransferase,

as well as hypercholesterolemia. In the hepatic parenchyma, cholestasis causes biliary

fibrosis/cirrhosis, which leads to chronic liver failure and portal hypertension. For the

study of this condition, the experimental model of common bile duct ligation and

sectioning in rats is most commonly used. However, this experimental model leads to

the development of complications secondary to the formation of a biliary pseudocyst,

with cholangitis, liver and lung abscesses, and sepsis. An alternative model proposed in

order to reduce these complications is microsurgical resection of the extrahepatic

biliary tract in rats, which causes biliary fibrosis, chronic liver failure and portal

hypertension with portosystemic collateral circulation.

Hypothesis and objectives: Splenic disease secondary to obstructive icterus is

considered to be of an inflammatory nature; in particular, mast cells are suspected to

play a role in its pathogenesis. For this reason, the experimental model of

microsurgical extrahepatic cholestasis in rats has been used in this experimental paper

in order to study the involvement of mucosal and connective-tissue mast cells in

splenic disease, as well as the response to treatment with the mast-cell-stabilising drug

ketotifen.

Material and methods: Male Wistar rats were used in this study, theri weight

ranging between 215 and 335 grames. The animals wew distributed randomly in 4

defined groups:1.-Pseudo-operated rats which underwent only a medium laparotomy

(SO) and dissection of the extrahepatic bile duct, 2.-The second group consists of rats

that underwent cholestasis surgery (CMQ), resecting the biliary branches,3.-a third

group is formed by rats in which pseudosurgery was performed and afterwards

ketotifen was administred (SO+K), from 24h before the intervention to the sacrifice of

the animals at 8-9 weeks postsurgery, and finally a fourth group 4.-which underwent

cholestasis surgery and were administered ketotifen following the same time scale

mentioned above. (CMQ+K) The following determinations of serum were

drawn:bilirrubin, bile acids, alkaline phosphatase and total proteins of serum. IL-13 and

peptide gene regulator calcitonine (CGRP) was identified in ascitic fluid, macrophages

chemotactic protein (MCP-1), TNF-alpha,IL-10 and IL-13 were determined in spleenic

tissues. The populations of mucosal mast cells and connective tissue were determined

in mesenteric lymph nodes, liver spleen, and ileum.

Results: Rats with microsurgical extrahepatic cholestasis at 8-9 weeks of the

postoperative course present with icterus, hepatosplenomegaly, ascites, portosystemic

collateral circulation, mesenteric venous vasculopathy and hypogonadism. They also

suffer an increase in the concentrations of serum bilirubin (p

in the number of both mucosal and connective-tissue mast cells in the mesenteric

lymph nodes (p

cells in splenic disease secondary to extrahepatic cholestasis, it would be possible to

include this disease among mast-cell-activation syndromes.

SUMMARY

INTRODUCTION: The total or partial lack of biliary drainage in the duodenum

produces cholestasis. Obstruction of the drainage can be established at any level from

the hepatocyte to the duodenum and so depending on their anatomical location, they

can be classified as intrahepatic cholestasis or extrahepatic. Cholestasis is a clinical and

biochemical syndrome characterized by jaundice, pruritus, acolia, dark urine, and

malabsorption as well as increased serum levels of bilirubin, bile acids, alkaline

phosphatase, and gamma glutamyl transferase. In the liver parenchyma, cholestasis

causes an inflammatory response that produces long-term with hepatic fibrosis and

portal hypertension. In turn, the clinically significant complications of portal

hypertension, are considered to occur when the hepatic venous pressure gradient is

above 10 mmHg. These complications include hepatic encephalopathy, ascites,

hepatorenal syndrome and gastroesophageal varices that cause bleeding, as well as

increased mortality with each bleeding episode.

To study extrahepatic cholestasis, there have been various experimental models used

in the rats. In particular, they can be classified into macroquirrgicos, ie essentially by

bile duct ligation and section, and those that are based on microsurgical resection of

the extrahepatic bile duct. The section of the bile duct ligation in the rat, occurs with

the establishment of a biliary pseudocyst which can be infected with gram-negative

bacteria from the gastrointestinal tract by the mechanism of bacterial translocation.

This problem, is associated with the subsequent formation of abscesses in the liver and

in the lung which lead the rats to death. However, using microsurgical techniques, you

can avoid pseudocyst formation, decrease the incidence of hepatocellular lung

abscesses and therefore prevents sepsis and increases the rat survival. One could

conclude that the experimental model of microsurgical cholestasis, reduces infectious

complications and for this reason, it constitutes an alternative model for studying both

extrahepatic cholestasis and portal hypertension.

Extrahepatic cholestasis, causes bladder fibrosis and portal hypertension. In both

diseases, the pathophysiological mechanisms involved have an inflammatory nature.

Liver inflammation is an important feature of extrahepatic cholestasis. Among the

hepatic inflammatory disorders, we should highlight obstructive cholestasis, edema

leukocyte infiltration of portal tracts and proliferation of biliary epithelial cells with

portal fibrosis. In particular, the term biliary fibrosis in the liver defines a consistent

pattern in the association of biliary ductular proliferation of myofibroblasts that are

around the ducts between areas Portal and parenchymal hepatocytes or cause the

development of porto-portal fibrous septa. Finally, chronic liver inflammation secondary

to extrahepatic process, predisposes to the formation of tumors.

The cholangiocytes are the biliary epithelium and represent a defense system against

foreign substances. In response to aggression, cholangiocytes release inflammatory

mediators and adhesion molecules that facilitate the recruitment, localization and

modulation of the immune response in the biliary tract and liver. In turn, the

inflammatory mediators modulate the function and survival of cholangiocytes,

promoting both proliferation and differentiation of portal fibroblasts and hepatic stellate

cells into myofibroblasts, which would explain the concomitant fibrosing proliferative

response in biliary fibrosis / biliary cirrhosis .

Epithelial-mesenchymal interactions play an important influence on the evolution of

chronic Cholangiopathies. Its even been suggested, that cholangiocytes as

hepatocytes, can be transformed into mesenchymal cells by a process of epithelial-

mesenchymal transition in which case this process could also contribute to the

generation of myofibroblasts and therefore the production of biliary fibrosis. One could

conclude that extrahepatic cholestasis, shares with other types of Cholangiopathies:

biliary proliferation, ductopenia by inhibiting proliferation or by apoptosis, biliary

fibrosis and carcinogenesis.

Bacterial infections are common in patients with chronic liver failure no matter of its

etiology. The most common infections are spontaneous bacterial peritonitis, urinary

tract infections and pneumonia which in 80% of cases are caused by gram-negative

and, in particular, Escherichia coli, suggesting that these infectious episodes suffered

by patients with chronic liver disease, are of enteric origin. The passage of viable

bacteria from the intestinal lumen through the wall to the mesenteric lymph nodes and

other tissues or organs of the economy, is an accepted pathogenic mechanism that

explains the development of bacterial infections in patients with chronic liver failure

and therefore, patients with extrahepatic cholestasis.

However, the most representative alteration of chronic liver impairment, including

secondary extrahepatic cholestasis, is the existence of both splanchnic and systemic

hyperdynamic circulation. Hyperdynamic circulation is attributed to increased

circulating vasodilators such as a reduced response to vasoconstrictors.

In turn, hepatic fibrosis that occurs in rodents after bile duct ligation and division, is

the result of an inflammatory process biliary studying, therefore, the changes

characteristic of inflammation: oxidative and nitrosative stress and impairment

antioxidant activity of portal tracts edema, hepatic macrophage activation and

recruitment of inflammatory cells, in particular neutrophilic infiltration of the liver

ductular spaces and mast cells in the portal tracts and septa portals in the vicinity of

the capillary biliar arterial plexus. In this regard, biliary fibrosis is similar to the tissue

repair process that occurs in wound healing and is characterized by accumulation of

extracellular matrix proteins, particularly collagen .

They are especially abundant in the anatomical sites that are directly exposed to the

environment, such as the gastrointestinal tract, skin and airways. It has been shown

that mast cells are present in the liver, both in normal and pathological conditions in

humans and in rats. Multiple studies have shown that mast cells are involved in various

liver diseases, thus demonstrating that these immune cells have a larger role than

originally thought.

Mast cells contain histamine, heparin, serine proteases such as tryptase and chymase,

and multifunctional cytokines, which are important mediators of wound healing

processes. Thus, mast cells play a key role in tissue remodeling and fibrosis. Various

mediators synthesized by these cells, as tryptase, TGF- and TNF-, can induce

proliferation of fibroblasts and hepatic stellate cells, and collagen synthesis by different

cell types. Mast cells also produce matrix metalloproteinase (MMP-1, MMP-2 and MMP-

9), as well as tissue inhibitors of MMPs (TIMP-1) which indicates that folks are also

involved in the degradation of extracellular matrix, contributing therefore to an

imbalance between synthesis and degradation.

Activated mast cells produce large amounts of fibrogenic and chemotactic factors that

induce proliferation of fibroblasts and collagen synthesis. Mast cells, thus increase

fibrosis, help tissue remodeling and repair and accumulate in inflammatory bowel

disease in humans, including ulcerative colitis, irritable bowel syndrome and Crohn's

disease as well as in portal hypertensive enteropathy of the rat. Furthermore, mast

cells are involved in the development of fibrosis in diseases of articular cartilage, skin,

lung, kidney and liver.

In the liver, mast cells accumulate in many diseases such as alcoholic liver disease,

primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, biliary atresia, hepatolithiasis,

chronic graft rejection in liver and biliary cholestasis. As in other organs and tissues,

liver mast cells must be involved in the local immune response in the maintenance and

repair of connective tissue. In the liver, mast cells secrete several mediators that

promote growth and proliferation of fibroblasts and stimulates the production of

extracellular matrix proteins by fibroblasts and stellate cells. In fact, there is a positive

correlation between the degree of accumulation of mast cells and the extent of matrix

deposition in patients with chronic liver disease. Even today it is considered that bile

ductular proliferation, coupled with hepatic fibrosis and mast cell infiltration are

characteristic changes of cholestatic liver disease.

It has been shown that degranulation of mast cells is involved in the disruption of

cellular motor complexes secondary to the action of cholecystokinin, therefore, the

mast cells are actively involved in physiological and pathological control of intestinal

motility and in the permeability of the intestinal mucosa, in bacterial adherence to the

mucosa and in the onset of intestinal inflammation. In cholestatic liver occurs

infiltration by inflammatory cells (monocytes, neutrophils, mast cells), partly as a result

of intestinal bacterial translocation.

However, the origin of the inflammatory response may be located at the very

cholangiocytes, who suffer from both bladder and the hyper toxic effect of bile acids,

as the possible secondary ischaemia of the biliar arterial plexus compression. In this

sense, the initial inflammatory response, stimulates proliferation cholangiocytes,

activates liver cells possessing inflammatory capability (Kupffer cells and

macrophages), induces angiogenesis secondary to arterial ischemia portal favor

leukocyte infiltration and finally promotes fibrogenesis.

Mast cells are involved in the development of hepatic fibrosis in both rodents and

humans. Since mast cells, usually have wide distribution in the spleen, one might

suspect their involvement in splanchnic inflammatory response secondary to

extrahepatic cholestasis, as well as their response to treatment with Ketotifen, a drug

stabilizing their membrane. To test this hypothesis, it has been used an experimental

model of cholestasis extrahepatic microsurgery in rat, and there have been studied

both inflammatory mediators that can produce mast cells, such as alterations in

splanchnic distribution of mucosal and connective mast cells. It has also been studied

their response to treatment with ketotifen.

HYPOTHESIS AND OBJECTIVES:

1. HYPOTHESIS. Splanchnic pathology and hepato-biliary fibrosis secondary to

obstructive cholestasis, are considered to have an inflammatory nature, and in

particular, it is suspected that mast cells are involved in its pathogenesis. For this

reason, at the present experimental work, it has been used the experimental model of

microsurgical extrahepatic cholestasis in rats, to study the involvement of the mucosal-

type mast cells and connective tissue mast cells in this disease and its response to

treatment with the antiH1 mast cell stabilizer, Ketotifen. This drug is an

antiinflammatory substance so that it inhibits the release of mediators of inflammation,

both stored as synthesized de novo from mast cells , consequently, it decreases

splanchnic disturbances secondary to extrahepatic cholestasis.

2. OBJECTIVES: In this work, the main purpose is to demonstrate, in an experimental

model of microsurgical extrahepatic cholestasis, the existence of an alteration in the

distribution of the splanchnic mucosal and connective mast cells. Confirmatory manner

above, when administering Ketotifen, a drug mast cell membrane stabilizer, it modifies

splanchnic redistribution of mast cells and reduces alterations associated whith

inflammatory mediators. Ketotifen treatment, can therefore determine the

pathogenetic inflammatory mechanisms

that take place in an experimental obstructive jaundice cholestasis , typical from the

mucosal and connective mast cells.

MATERIAL AND METHODS: Male Wistar rats were used in this study, their weight

ranging between 215 and 335 grames. The animals were distributed randomly in 4

defined groups: 1.-Pseudo-operated rats which underwent only a medium laparotomy

(SO) and dissection of the extrahepatic bile duct, 2.-The second group consists of rats

that underwent cholestasis surgery (CMQ), resecting the biliary branches, 3.-a third

group is formed by rats in which pseudosurgery was performed and afterwards

ketotifen was administred (SO+K), from 24h before the intervention to the sacrifice of

the animals at 8-9 weeks postsurgery, and finally a fourth group, 4.-which underwent

cholestasis surgery and were administered ketotifen following the same time scale

mentioned above (CMQ+K). The following determinations of serum were drawn:

bilirrubin, bile acids, alkaline phosphatase and total proteins of serum (by colorimetric

studies). IL-13 and peptide gene regulator calcitonine (CGRP) were identified in ascitic

fluid through enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Macrophages chemotactic

protein (MCP-1), TNF-alpha,IL-10 and IL-13 were determined in spleenic tissues also

by ELISA method.

Likewise, the populations of mucosal mast cells and connective tissue were determined

in mesenteric lymph nodes, liver, spleen, and ileum. These latter data were obtained

by ELISA assessment (RMCP-II) and toluidine blue staining in the case of RMCP-I. The

degrees of mesenteric venous vasculopathy, splenorenal collateral circulation and body

weights, liver, testis and spleen, have also been determined.

The experimental microsurgical technique, involves several steps. First, it comes the

rat sedation by an intraperitoneal infusion of a mixture of xylazine and ketamine. Once

asleep, one have to proceed to make a xifopubian incision and exposure of liver tissue

after removal, from a gauze soaked in serum, the bowel properly preserved loops.

Then, triangular and falciform ligaments are sectioned and a dissection is started from

the distal intrapancreatic common bile duct up into each lobe of the liver. It should be

added at this point, some data from the rat liver anatomy, as it has 4 separate

drainage lobes and the vascularization is as well independent. They have a lack of

gallbladder, a fact that does not occur in the mouse. It is important to note that, while

the common bile duct is being dissected, one must be careful not to cut the hepatic

artery and portal vein, that are closely related to the extrahepatic biliary duct, because

this may lead to the rat death instantly. Once the bile duct is dissected, it can be

bound in its more distal part so that ingurgite, leaving easier the resection of the

independent bile ducts that go to each lobe individually. The bile duct resection should

be performed flush to the parenchyma, in the order described, firstly the caudate lobe,

right side, middle and finally the left side. Once the bile duct is resected, the intestinal

bowel loops should be replaced into the abdominal space and the closure of the

abdominal wall is performed. Throughout the postoperative period, analgesics are

administered, as well as vitamin K and antibiotic (ceftazidime) to prevent pain,

bleeding and infection, respectively. From 24 hours before cholestasis and all

throughout the postoperative period, ketotifen is administered in drinking water so that

the rat that did not drink the minimum amount, it might be excluded from the study.

The sacrifice of animals was carried out at the 8-9 th week of surgery. After obtaining

the blood samples from the inferior vena cava, ascites fluid and tissues (liver, spleen,

mesenteric lymph nodes and spleen limph nodes),the results have been analyzed using

the SPSS statistic programme .

RESULTS: A total of 80 rats have been studied, 65 survivors, which represents a 20%

of mortality in relation to anesthesia and surgical technique (8.7%) and 11.3% in

relation to gastrointestinal bleeding. As postoperative complications include abdominal

wall hernias, trophic skin changes, drowsiness, and decreased level of consciousness

as well as decreased response to painful stimuli. All rats had obvious jaundice in

conjunctiva, ear, and tail, acolia and coluria as well. A decrease of all these

postoperative complications described was evident in all cases with the administration

of ketotifen. In macroscopic histological findings, the liver was enlarged and yellowish

congestioned but with some focus of necrosis, a figure that is reduced when

administrating ketotifen. Also evidenced ascites with ketotifen was lower in all series.

At thoracic level, the existence of pulmonary infarction and pleuro-pericardial effusion

was proven.

Body weight, liver, spleen and testis changes have also been analyzed. Body weight

increases in postoperative in all series and ketotifen administration decreases this

weight increase. Both hepatomegaly ans splenomegaly ocurr in CMQ rats, and with the

administration of ketotifen it is evidenced a significant decrease of both parenchyma

weights (p

concentrations of MCP-1 (p

the density of mast cells, nor mucosal nor connective, respect to untreated cholestatic

animals. Therefore, one could conclude that extrahepatic cholestasis causes increased

density intestinal mast cells, which does not change significantly when administering

Ketotifen.

Regarding the mast cell subpopulations in cholestatic animals, an increase in both

hepatic and splenic intestinal mast cells both mucous-like and connective tissue mast

cells was noted. In the mesenteric lymph nodes an increase in connective tissue mast

cells (p

decrease in IL-10. However, ketotifen does not alter the number of hepatic and

intestinal mast cells, which remain increased.

On the other hand, ketotifen might have a harmful effect in relation to the alterations

that are characteristic of chronic liver failure in the splenic area and, in particular,

angiogenesis, which plays a role in the development of portal hypertensive

enteropathy, mesenteric venous vasculopathy and portosystemic collateral circulation.

This would be a possible explanation for the fact that these complications grow more

serious in rats treated with ketotifen. Associated with these harmful effects, the finding

of an increase in mucosal and connective-tissue mast cells in the mesenteric lymph

nodes is an argument for its pathogenic involvement in the exacerbated angiogenic

response triggered by this mast cell stabiliser. Lastly, in view of role played by mast

cells in splenic disease secondary to extrahepatic cholestasis, it would be possible to

include this disease among mast-cell-activation syndromes.

I. INTRODUCCIN

INTRODUCCIN

2

1. COLESTASIS EXTRAHEPTICA Y RESPUESTA INFLAMATORIA

La colestasis se define como la obstruccin al flujo biliar . El dficit total

o parcial de drenaje biliar hacia el duodeno produce colestasis (Attar 1982;

Gossard 2013) y se clasifica en extraheptica e intraheptica (Sherlock 1989).

La causa de la colestasis intraheptica reside en el hgado en tanto que el

trmino extrahepatico implica la obstruccin de la va biliar fuera del

parnquima heptico (Sherlock 1989; Li y Crawford 2004). Los principales

sntomas y signos de las colestasis intrahepticas y extrahepticas son

similares. En particular la ictericia y el prurito son caractersticas clnicas de

ambos tipos de colestasis, si bien es frecuente que las alteraciones bioqumicas

plasmticas precedan su instauracin (Gossard 2013). Para realizar el

diagnstico diferencial entre las colestasis intra- y extra-hepticas es precisa

una cuidadosa evaluacin de sus caractersticas clnicas, serolgicas e

histopatolgicas (Sherlock 1989; Li y Crawford 2004; Gossard 2013).

Respecto a las colestasis extrahepticas su causa es la obstruccin

mecnica de los grandes conductos biliares, como son en el humano, los

conductos biliares derecho e izquierdo, el conducto heptico y el conducto

coldoco (Schaffner y Popper 1979; Sherlock 1989). Dicha obstruccin puede

ser causada a su vez por malformaciones biliares (Nakamura y Tanoue 2013),

litiasis (Li y Crawford 2004; Hirschfield et al, 2010), tumores biliares (Hirschfield

et al, 2010) o compresin extrnseca de la va biliar (Suarez et al, 2013) (Tabla

1). Con independencia de su etiologa, la colestasis extraheptica se manifiesta

clnicamente por ictericia, coluria, acola y prurito (Schaffner y Popper 1979;

Sherlock 1989; Gossard 2013). Las alteraciones bioqumicas se relacionan

principalmente con la retencin sangunea de todas las sustancias normalmente

excretadas en la bilis (Sherlock 1989). Al incremento srico de bilirrubina y

cidos biliares se asocian elevadas concentraciones sricas de fosfatasa

alcalina, -glutamil transferasa y colesterol (Li y Crawford 2004).

INTRODUCCIN

3

TABLA 1: ETIOLOGIA DE LA COLESTASIS EXTRAHEPATICA

- Atresia biliar extraheptica

- Litiasis biliar

- Lesiones inflamatorias.

* Colangitis esclerosante primaria y secundaria

* Estenosis postoperatorias

^ Coldoco

^ Esfnter de Oddi

* Biliopata hipertensiva portal por obstruccin extraheptica de

la vena porta.

* Pancreatitis

^ Aguda

^ Crnica

* Pseudoquistes pancreticos

- Tumores

* Intrnsecos

^ Benignos Papilomas

^ Malignos Colangiocarcinomas

- Extrnsecos

^ Pancreticos

^ Gstricos

^ Metstasis ganglionares hiliares hepticas

INTRODUCCIN

4

^ Lifomas: Enfermedad de Hodgkin

- Causas inusuales

* Quistes del coldoco

* Abscesos amebianos

* Divertculos duodenales

* Infecciones parasitarias: Ascariasis, fascioliasis

* Hemobilia

La inflamacin heptica es una caracterstica importante de la colestasis

extraheptica. Entre las alteraciones inflamatorias hepticas de la colestasis

obstructiva destaca el edema con infiltracin leucocitaria de los tractos portales

y la proliferacin de las clulas epiteliales biliares con fibrosis portal (Schaffner

y Popper 1979; Saito y Maher 2000; Tacke et al, 2009). En particular, el

trmino fibrosis biliar, define un patrn heptico consistente en la asociacin de

proliferacin ductular biliar y de los miofibroblastos periductulares entre las

reas portal y hepatocitaria o parenquimatosa que causa el desarrollo de septos

fibrosos porto-portales (Parola y Pinzani 2009). Por ltimo, la inflamacin

heptica crnica secundaria a la colestasis extraheptica predispone a la

tumorognesis (Aller et al, 2010; Pinzani et al, 2011).

Los colangiocitos constituyen el epitelio biliar y representan un sistema

defensivo contra sustancias extraas (Chuang et al 2009). En respuesta a la

agresin, los colangiocitos liberan mediadores inflamatorios y expresan

molculas de adhesin que facilitan el reclutamiento, localizacin y modulacin

de la respuesta inmunitaria en el tracto biliar y el hgado (Syal et al, 2012). A su

vez, los mediadores inflamatorios modulan la funcin y supervivencia de los

colangiocitos, favoreciendo tanto su proliferacin como la diferenciacin de los

fibroblastos portales y clulas estrelladas hepticas en miofibroblastos, lo que

explicara la concomitante respuesta proliferativa biliar y fibrosante en la

fibrosis/cirrosis biliar (Reynoso-Paz et al, 1999; Syal et al, 2012).

INTRODUCCIN

5

Las interacciones epitelio-mesenquimales desempean una importante

influencia en la evolucin de las colangiopatas crnicas. Incluso se ha sugerido

que los colangiocitos como los hepatocitos, pueden transformarse en clulas

mesenquimales mediante un proceso de transicin epitelio-mesenquimal en

cuyo caso este proceso podra tambin contribuir a la generacin de

miofibroblastos y, por tanto, a la produccin de fibrosis biliar (Park, 2012).

Se podra concluir que la colestasis extraheptica, comparte con otros

tipos de colangiopatas la existencia de proliferacin biliar, ductopenia por

inhibicin de la proliferacin o por apoptosis, fibrosis biliar y carcinognesis

(Park, 2012; Syal et al, 2012).

Una complicacin frecuente de la colestasis extraheptica es la infeccin

bacteriana con colangitis y posterior formacin de abscesos. Charcot describi

en 1877 la triada clnica de fiebre, ictericia y dolor en el hipocondrio derecho

que se asocia a la colangitis secundaria a litiasis o estenosis del coldoco

(Lipsett y Pitt 1990). En 1959 Reynolds y Dargan describen una grave evolucin

de colangitis que cursa con shock sptico y obnubilacin (Reynolds y Dargan,

1959). Aunque se ha utilizado tambin el trmino colangitis supurativa, no

todos los pacientes con bilis purulenta presentan shock sptico, ni todos los

pacientes con los tipos evolutivos ms graves de colangitis presentan pus en los

conductos biliares (Lipsett y Pitt 1990).

Otra grave consecuencia de la colestasis extraheptica en particular

cuando se cronifica, es la hipertensin portal. Las complicaciones clnicamente

significativas de la hipertensin portal, se considera que se producen cuando el

gradiente de presin venosa heptica es superior a 10 mmHg (Miano y Garca-

Tsao 2010). Entre estas complicaciones destacan la encefalopata heptica, la

ascitis, el sndrome hepatorrenal y las varices gastroesofgicas que son causa

de hemorragia, as como de una creciente mortalidad con cada episodio

hemorrgico ( Rahimi y Rockey 2011).

Las infecciones bacterianas son frecuentes en los pacientes con

insuficiencia heptica crnica con independencia de su etiologa. Las

infecciones ms frecuentes son la peritonitis bacteriana espontnea, las

infecciones urinarias y la neumona, que en el 80% de los casos son

causadas por bacilos gram-negativos y, en particular, por Escherichia

INTRODUCCIN

6

coli, lo que sugiere que estos episodios infecciosos que sufren los

pacientes con insuficiencia heptica crnica son de origen entrico

(Bellot et al, 2013). El paso de bacterias viables desde la luz intestinal, a

travs de su pared, hasta los ganglios linfticos mesentricos y otros

tejidos y rganos de la economa, es un mecanismo patognico

aceptado para explicar el desarrollo de las infecciones bacterianas en el

paciente con insuficiencia heptica crnica y, por tanto, en los pacientes

con colestasis extraheptica. Este fenmeno ha sido originalmente

descrito por Berg y Garlington en 1979 (Berg y Garlington, 1979). Los

mecanismos que favorecen la traslocacin bacteriana intestinal son, al

menos, tres: el excesivo crecimiento de las bacterias intestinales, ya

sean normales o anormales, el incremento de la permeabilidad intestinal

y las alteraciones inmunolgicas que se asocian a la insuficiencia

heptica crnica, las cuales incluyen el deficitario sistema inmunolgico

intestinal constituido por el tejido linfoide asociado al intestino que est

compuesto por las placas de Peyer, los linfocitos y clulas dendrticas de

la lmina propia, los linfocitos intraepiteliales y los ganglios linfticos

mesentricos (Bellot et al, 2013). Por ltimo, la insuficiencia heptica

crnica se asocia con una significativa disminucin de la actividad del

sistema retculo endoplsmico heptico, tanto por la existencia de

circulacin colateral portosistmica, que evita el trnsito del flujo portal

por el hgado, como por la reducida capacidad para la fagocitosis de las

clulas de Kupffer (Rimola et al, 1984).

Sin embargo, la alteracin ms representativa de la afectacin heptica

crnica, incluyendo la secundaria a colestasis extraheptica, es la existencia de

circulacin hiperdinmica tanto esplcnica como sistmica. La circulacin

hiperdinmica se atribuye tanto al incremento de sustancias vasodilatadoras

circulantes como a una reducida respuesta a sustancias vasoconstrictoras

(Newby y Hayes 2002; Iwakiri y Groszmann 2006). En esencia, las alteraciones

hemodinmicas asociadas a la insuficiencia heptica crnica, hipertensin portal

y traslocacin bacteriana, sugieren la existencia de un sndrome de respuesta

inflamatoria sistmica de origen multifactorial (Aller et al, 2007; Thabut et al,

2007; Tandon y Garca-Tsao 2008; Cazzaniga et al, 2009; Abdel-Khalek et al,

2011). En este caso las complicaciones propias de la colestasis extraheptica,

INTRODUCCIN

7

tanto locales o hepticas (fibrosis/cirrosis biliar), regionales o esplcnicas

(hipertensin portal, circulacin colateral portosistmica, traslocacin bacteriana

intestinal, ascitis) y generales o sistmicas (encefalopata heptica, sndrome

hepatorrenal) por su naturaleza inflamatoria, podran ser integradas para su

estudio etiopatognico y, por tanto, en la investigacin de nuevas y ms

eficaces tratamientos.

2. MODELOS EXPERIMENTALES PARA EL ESTUDIO DE LA COLESTASIS

EXTRAHEPTICA

La colestasis extraheptica cursa con una elevada incidencia de

morbilidad y mortalidad (Poupon et al, 2000). Las graves alteraciones

hepticas, esplcnicas y sistmicas que produce la ictericia obstructiva, justifica

la creacin de modelos experimentales que permitan el estudio de sus

mecanismos patognicos con el objetivo de instaurar eficaces medidas

profilcticas y teraputicas (Aller et al, 2008).

El modelo experimental ms frecuentemente utilizado de ictericia

obstructiva es el resultante de la ligadura y seccin del coldoco en la rata,

aunque tambin se ha desarrollado en conejos y ratones (Katsuta et al, 2005;

Abraldes et al, 2006). Este modelo se considera que cursa con hipertensin

portal sinusoidal (Abraldes et al, 2006). La rata es el animal de eleccin ya que

no posee vescula biliar, en tanto que en el ratn, la oclusin del coldoco

produce una gran dilatacin de la vescula biliar que puede causar su

perforacin y coleperitoneo (Abraldes et al, 2006), lo que exige ligadura del

conducto cstico o bien colecistectoma previa a la colestasis (Aller et al, 2008)

(Figura 1). La tcnica quirrgica de ligadura y seccin del coldoco es sencilla.

Se trata de una tcnica macroquirrgica, ya que no requiere medios de

magnificacin para su realizacin. En esencia, y tras laparotoma media o

subcostal derecha, se diseca el coldoco y se reseca entre dos ligaduras. Sin

embargo, las ratas con colestasis extraheptica macroquirrgica desarrollan un

pseudoquiste biliar hiliar por dilatacin del extremo proximal ligado del

INTRODUCCIN

8

coldoco, que se infecta por microorganismos Gram-negativos y los animales

fallecen durante las dos primeras semanas de evolucin postoperatoria por

sepsis secundaria a la existencia de mltiples abscesos intraperitoneales,

hepticos y pulmonares (Aller et al, 1993; Aller et al, 2004; Aller et al, 2009a).

En este modelo experimental tambin se ha descrito el desarrollo de fibrosis

biliar por lo que ha sido considerado apropiado para el estudio de la patologa

humana secundaria a la atresia biliar extraheptica y la colangitis esclerosante

primaria (Hayashi y Sakai 2011; Petersen 2012).

FIGURA 1. Representacin esquemtica del hgado multilobulado de la rata. LLD:

Lbulo lateral derecho; LM: Lbulo Medio; LLI: Lbulo Lateral Izquierdo; LC: Lbulo

Caudado.

En el ratn, la transeccin del conducto coldoco entre ligaduras,

asociado a colecistectoma, tambin permite conseguir un modelo para el

estudio de la fibrosis biliar, aunque coexiste una extensa necrosis heptica

INTRODUCCIN

9

(Heinrich et al, 2011). Para evitar la grave lesin heptica se ha propuesto la

realizacin de una ligadura parcial del coldoco. Esta tcnica consiste en la

ligadura conjunta del coldoco y una aguja quirrgica de 7-0. Posteriormente,

se retira la aguja y as persiste una estenosis graduada del coldoco que

produce a los 14 das de evolucin, proliferacin biliar pero evita la necrosis del

parnquima heptico (Heinrich et al, 2011).

La tcnica microquirrgica de colestasis extraheptica en la rata permite

la reseccin de la va biliar extraheptica que incluye el coldoco, hasta el inicio

de su porcin intrapancretica, en continuidad con los conductos biliares que

drenan cada uno de los lbulos hepticos (Aller et al, 1993; Lorente et al, 1995;

Aller et al, 2009a; Aller et al, 2009b; Aller et al, 2010) (Figura 2). Con sta

tcnica microquirrgica la inexistencia de va biliar extraheptica residual

previene la formacin de pseudoquistes biliares hiliares, as como de abscesos

abdomino-torcicos y reduce la mortalidad respecto al modelo clsico de

ligadura y seccin del coldoco (Aller et al, 1993; Aller et al, 2004; Aller et al,

2009a; Aller et al, 2009b; Aller et al, 2010).

FIGURA 2. Tcnica de la colestasis extraheptica microquirrgica en la rata. En el

dibujo de la izquierda se representa la va biliar extraheptica del hgado de la rata (a).

En el dibujo de la derecha (b), tras la reseccin microquirrgica de la va biliar

INTRODUCCIN

10

extraheptica, se observan los conductos lobulares hepticos ligados a ras del

parnquima heptico.

Este modelo de colestasis extraheptica microquirrgica, al conseguir

mayor supervivencia, tambin permite obtener a ms largo plazo un nuevo

modelo de fibrosis heptica que puede ser de gran utilidad para el estudio de

nuevas terapias antifibrognicas. A este respecto, se debe considerar que

durante la evolucin de la colestasis extraheptica en la rata existen dos fases.

La fase evolutiva precoz que se extiende hasta la 4 semana del periodo

postoperatorio, y la fase evolutiva tarda que comprende las posteriores

semanas de supervivencia (Assimakopoulos y Vagianos 2009). As, cuando la

ictericia obstructiva es aguda, la colemia predomina sobre la lesin del

parnquima heptico y no existe an hipertensin portal ni cirrosis, si bien se

producen efectos inotrpicos y cronotrpicos negativos cardacos (Joubert

1978; Liu et al, 2000; Nahavandi et al, 2001; Hajrasouliha et al, 2004), altera la

respuesta vasoconstrictora simptica (Bomzon et al, 1985; Jacob et al, 1993) y

causa una intensa diuresis y natriuresis que pueden incluso producir grave

hipovolemia (Green y Better 1995; Kramer 1997). Como consecuencia, se

producen hipotensin arterial y disfuncin renal prerrenal que es agravada por

la endotoxemia que acompaa a ste modelo experimental. A su vez, durante

la fase evolutiva considerada crnica, esto es, superior a las cuatro semanas del

postoperatorio, no solo existe colemia, endotoxemia y traslocacin bacteriana

intestinal (Deitch et al, 1990; Clements et al, 1996; Clement et al, 1998) sino

tambin una significativa patologa heptica con fibrosis/cirrosis biliar,

hipertensin portal y ascitis (Green y Better 1985; Geerts et al, 2008) que se

asocia con una lesin renal similar fisiopatolgicamente al sndrome

hepatorrenal de los enfermos cirrticos. Tanto las alteraciones en la fase precoz

como en la fase tarda o a largo plazo, de este modelo experimental, validan su

empleo para el estudio de los mecanismos fisiopatolgicos de la colestasis

extraheptica as como para la investigacin de nuevos y ms eficaces

tratamientos (Assimakopoulos y Vagianos 2009).

Para la puesta a punto de la tcnica microquirrgica de la colestasis

extraheptica en la rata, se ha estudiado previamente la anatoma de la va

INTRODUCCIN

11

biliar extraheptica, descrito sus variaciones anatmicas (Lorente et al, 1995),

la incidencia de infecciones postoperatorias (Aller et al, 1993) as como se ha

estandarizado una microtcnica de fcil aprendizaje y mnima mortalidad

atribuible a su ejecucin. El estudio del modelo experimental se ha

fundamentado en la valoracin de la patologa hepatobiliar, con el grado de

fibrosis y proliferacin biliar de los hgados colestasis (Aller et al, 2004) y de las

alteraciones bioqumicas plasmticas propias de la lesin hepatobiliar (Aller et

al, 2008), as como de las alteraciones del metabolismo oxidativo hepato-

intestinal (Lpez et al, 1999) y cerebral (Garca-Moreno et al, 2002) y, por

ltimo, la respuesta inflamatoria esplcnica mediante la determinacin de las

concentraciones de citoquinas pro y anti-inflamatorias en hgado, bazo,

ganglios linfticos mesentricos e leon (Garca-Domnguez et al, 2010). La

utilizacin profilctica de antibiticos de amplio espectro (Ceftazidima 50

mg/kg) y la administracin semanal de vitamina K1 (8 mg/kg i.m.) reduce la

mortalidad precoz de las ratas con colestasis extraheptica (Beck y Lee 1995;

Huang et al, 2003; Akimoto et al, 2005; Abraldes et al, 2006). En particular, en

las ratas con colestasis obstructiva microquirrgica la supervivencia es superior

a las ocho semanas y, por tanto, los resultados pueden ser ms fcilmente

extrapolados a la clnica humana, que se suele caracterizar por la evolucin

crnica de la colestasis extraheptica.

Los modelos de colestasis extraheptica, tanto macroquirrgicos, por

ligadura del coldoco, como microquirrgicos por reseccin de la va biliar

extraheptica, cursan a largo plazo (4 a 6 semana del postoperatorio) con

hepatomegalia, fibrosis biliar, infiltracin leucocitaria de los espacios portales

hepticos y muerte de los hepatocitos por necrosis y apoptosis, aunque rara

vez se observa la prdida de la estructura normal heptica y, por esta razn, no

es apropiado conceptuar estos modelos experimentales como productores de

cirrosis en esta fase evolutiva (Kountouras et al, 1984; Aller et al, 1993; Aller et

al, 2004).

Las alteraciones extrahepticas son mltiples en la colestasis

extraheptica experimental en la rata, con independencia de la tcnica

quirrgica empleada. Destacan la ictericia, la coluria (Huang et al, 2003; Aller et

al, 2004), la hipertensin portal con esplenomegalia y circulacin colateral

portosistmica (Aller et al, 1993; Huang et al, 2003; Aller et al, 2004; Chan et

INTRODUCCIN

12

al, 2004; Katsuta et al, 2005), la insuficiencia renal (Assimakopoulos y Vagianos

2009), la encefalopata heptica (Garca-Moreno et al, 2002; Huang et al, 2010;

Magen et al, 2010; Assimakopoulos et al, 2009; Eslimi et al, 2011) y al final de

este periodo considerado crnico, 6 semana del postoperatorio, la ascitis

(Huang et al, 2003; Aller et al, 2010a; Aller et al, 2010b). Por lo tanto, la

colestasis extraheptica experimental no solo es un modelo apropiado para el

estudio de la patologa heptica secundaria a la obstruccin biliar, sino que

tambin reproduce las alteraciones esplcnicas y sistmicas que son propias de

la ictericia obstructiva crnica en la clnica humana.

Un modelo experimental quirrgico de ictericia obstructiva parcial, ha

sido descrito por Polimeno et al En 1995 (Polimeno et al, 1995). La tcnica

quirrgica consiste en la seccin entre ligaduras de los conductos biliares

propios de los lbulos hepticos medio, lateral derecho y caudado. Ya que no

existe conexin entre los lbulos hepticos sometidos a colestasis y el lbulo

lateral izquierdo que no sufre obstruccin biliar, se puede considerar este

modelo experimental para el estudio de la evolucin crnica de la colestasis

extraheptica en los lbulos lateral derecho, medio y caudado. La colestasis

selectiva lobular permite la supervivencia a largo plazo de los animales, aunque

no evita que los lbulos hepticos colestsicos sufran proliferacin biliar,

discreta proliferacin hepatocitaria e infiltracin por clulas inflamatorias. Sin

embargo, un hallazgo inesperado en ste modelo de colestasis selectiva ha sido

la existencia de proliferacin biliar en el lbulo lateral izquierdo que no sufra

colestasis obstructiva. Este inopinado resultado sugiere a sus autores la

existencia de estimulacin humoral transmitida por los lbulos colestsicos a

travs de mediadores inflamatorios liberados (Polimeno et al, 1995).

La colestasis experimental, en particular de localizacin extraheptica, se

ha considerado un modelo apropiado para el estudio de los mecanismos

implicados en la produccin de atresia biliar en la clnica humana (Aller et al,

2008). Sin embargo, otros modelos experimentales no quirrgicos, se han

propuesto como alternativas vlidas. Entre estos ltimos modelos destacan los

modelos de atresia biliar de etiologa vrica en ratones, mediante la inoculacin

intraperitoneal de varios serotipos de reovirus que inducen inflamacin del

hgado y de los conductos biliares con ictericia (Phillips et al, 1969; Bangaru et

al, 1980). Asimismo, se han descrito modelos de colestasis en ratones tras

INTRODUCCIN

13

inoculacin de rotavirus de monos Rhesus, que causan acumulo de clulas

asesinas naturales (NK cells) alrededor de los conductos biliares y respuesta

mediada por clulas T, con colestasis evidente a la semana de la inoculacin

(Leonhardt et al, 2010). Estos modelos de colestasis vricas tienen resultados

variables dependientes del tipo de cepa animal, la dosis viral y el tiempo de

infeccin. Un hallazgo de inters en el estudio de los mecanismos productores

de colestadis vricas, ha sido la produccin de ictericia a receptores

inmunodeficientes por transferencia de clulas T procedentes de ratones con

colestasis inducida por rotavirus (Lu y Mack 2009; Lu et al, 2010).

Todos los modelos experimentales de colestasis previamente citados son

realizados durante el periodo postnatal y, por esta razn, se considera que

aunque permiten estudiar las consecuencias metablicas de la colestasis y la

patogenia de la colangitis, no aportan conocimiento al mecanismo productor de

la atresia biliar. Por esta razn, se han desarrollado modelos prenatales, ya

ligando el conducto coldoco en corderos a los 80 das de gestacin (Spitz

1980) o por ligadura de la arteria heptica en conejos fetales, que produce

isquemia selectiva de la va biliar intraheptica (Morgan et al, 1966). Tambin

se ha ensayado la administracin de drogas, por ejemplo derivados de setas

amanita phalloides, y frmacos, as antihelmnticos as 1,4-

fenilendiisotiacianato, a ratas Wistar gestantes que producen ictericia en las

ratas recin nacidas (Ogawa et al, 1983; Hosoda et al, 1997). En estos modelos

postnatales se consigue la produccin de ictericia con inflamacin de las vas

biliares intrahepticas aunque las alteraciones propias de la atresia biliar, como

son la obstruccin biliar completa, tan solo se obtienen tras la administracin a

los animales gestantes de txicos o frmacos (Ogawa et al, 1983; Hosoda et al,

1997). Sin embargo, los animales y en particular los ratones, no cursan con

fibrosis heptica ni con hipertensin portal, por lo que no es posible considerar

a la atresia biliar en humanos. Se podra concluir que respecto de esta

patologa congnita, los modelos experimentales son apropiados para el estudio

de las consecuencias hepticas y extrahepticas de la colestasis, aunque no

para el estudio de los mecanismos productores de atresia biliar (Petersen

2012).

INTRODUCCIN

14

3. ALTERACIONES FISIOPATOLOGICAS EN LA COLESTASIS

EXTRAHEPATICA EXPERIMENTAL.

La fisiopatologia heptica en la colestasis extraheptica ha sido comparada a la que

protagoniza la curacin de las heridas,ya que estaria constituida por la asociacin de

proliferacin epitelial y fibrognesis (Bissell, 2004; Aller et al, 2008; Meran y

Steadman; 2011). Las alteraciones fisiopatolgicas que se producen en la fibrosis

heptica tienen por consecuencia el depsito excesivo de colageno fibrilar y otras

proteinas de la matriz extracelular que distorsionan la arquitectura heptica e inducen

capilarizacin sinusoidal e hipertensin portal. En esencia, la fibrosis heptica es un

proceso dinmico de reparacin tisular aberrante en el que los fenmenos claves son

la activacin y transformacin de las clulas estrelladas hepticas quiescentes en

clulas similares a miofibroblastos, por un proceso de transicin epitelio-mesenquimal

de tipo 2, con el subsiguiente incremento en la sntesis de proteinas, como actina de

musculo liso-, de colageno, metaloproteasas de la matriz, inhibidores tisulares de

metaloproteasas y proteoglicanos (Zitka et al 2010; Mormone et al, 2011; Meran y

Steadman, 2011; Fragiadaki y Mason, 2011)

En el periodo inmediato a la obstruccin completa de la va biliar extraheptica en la

rata se produce un intenso incremento de la presin biliar intraductal (Slott et al 1990;

Woolf et al 1993; Azmaiparashvili et al 2009) seguida por alteraciones patolgicas de

la matriz extracelular (Desmouliere et al 1997). Por el contrario, la descompresin

biliar, al suprimir el estrs mecnico, revierte las lesiones hepticas inducidas por la

ligadura del coldoco (Ramm et al 2000; Matsumoto et al, 2002; Costa et al 2003;

Kirkland et al 2010). Estos estudios demuestran la relevancia de la energa mecnica

en la etiopatogenia de la patologa heptica secundaria a la obstruccin de la va biliar.

La respuesta del hgado de los roedores a la lesin obstructiva biliar implica su

reprogramacin transcripcional, favoreciendo la activacin de genes reguladores del

metabolismo, de la proliferacin celular y de la remodelacin de la matriz de forma

secuencial y limitada en el tiempo (Campbell et al 2004; Wang et al 2008). Aunque se

produce una activacin predominante de genes metablicos en todas las fases

posteriores a la ligadura del coldoco, desde una fase inmediata (1 da) hasta una fase

tarda (21 das), la afectacin de vas metablicas especficas es diferente dependiendo

INTRODUCCIN

15

de la duracin de la obstruccin (Campbell et al 2004). En tanto que algunos genes

son activados en el periodo precoz de la colestasis, por ejemplo genes implicados en la

disrupcin del metabolismo lipdico y en la fibrosis, otros genes, como son los

implicados en mecanismos de proteccin celular frente a la agresin por acumulacin

txica de cidos biliares, son inhibidos (Kojima et al 2004).

Despus de la ligadura del coldoco, el hgado de la rata sufre severas

alteraciones hemodinmicas, portales y arteriales, que pueden comportar

lesiones por isquemia-reperfusin y estrs oxidativo (Huang et al 2010; Yang

et al 2011; Oguz et al, 2012). El aumento de la resistencia vascular en el

sistema portal heptico secundario a colestasis extraheptica produce

hipertensin portal (Ohara et al 1993; Li y Yang, 2005; Van Steenkiste et al

2010) e isquemia heptica, asociadas a una sntesis deficitaria del enzima Oxido

Ntrico Sntasa-inducible (iNOS) y de oxido ntrico (NO) (Barn et al 2000; Lee

et al, 2011).

La va biliar es vascularizada por el plexo peribiliar (Gaudio et al 1996; Li et al

2007; Toki et al 2011), localizado alrededor de los conductos biliares de menor

calibre, hacindose as progresivamente ms estrecho y ms simple (Gaudio et

al 1996). Estas caractersticas del plexo peribiliar, permiten asumir que el

aumento de presin intraductal con dilatacin de la va biliar en la colestasis

extraheptica, podra comprimir el plexo peribiliar con la consiguiente isquemia

de la va biliar. Sin embargo, se ha descrito que despus de la disminucin del

flujo sanguneo a travs de la vena porta se produce un aumento del flujo

arterial heptico o hepatic arterial buffer response (Lautt, 1983). Adems, dos

semanas despus de ligadura del coldoco en la rata se produce una

proliferacin significativa del plexo peribiliar, que drena por pequeas vnulas

en ramas de la vena porta y en los sinusoides hepticos (Gaudio et al 2006). A

su vez, la lesin por isquemia-reperfusin ha sido implicada en la patognesis

de la colestasis intraheptica (Tanaka et al 2006; Toki et al, 2011). Las ratas

con ligadura del coldoco sufren una excesiva acumulacin de cidos biliares

hidrofbicos que son considerados la causa principal de hepatotoxicidad

(Gartung et al, 1996; Poli, 2000). Adems, se produce un deterioro parcial de

las funciones de la cadena transportadora de electrones mitocondriales y estrs

INTRODUCCIN

16

oxidativo (Poli, 2000; Huang et al 2003). La retencin y el acmulo de sales

biliares hidrofbicas (tauro- y glicoquenodesoxicolato) puede inhibir la actividad

antioxidante heptica de catalasa, glutation peroxidasa, glutation reducido y

superxido dismutasa, as como inducir necrosis hepatocitaria al activar la

permeabilidad de la membrana mitocondrial (Orellana et al 1997; Mani et al

2002; Wang et al 2007; Portincasa et al 2007; Assimakopoulos, 2007; Arduini

et al 2011). Existe por tanto una estrecha relacin entre la ictericia obstructiva

experimental y el estrs oxidativo (Orellana et al 1997; Assimakopoulos et al

2004; Wang et al 2007). As, se ha demostrado que el tratamiento con

antioxidantes mejora el estado redox celular heptico (Assimakopoulos et al

2004; Soylu et al 2006), y las funciones hepticas al inhibir la formacin de

especies reactivas del oxgeno (ROS) (Soylu et al 2006; Assimakopoulos et al

2007; Portincasa et al 2007; Tahan et al 2007).

Por consiguiente, en la fase precoz tras ligadura del coldoco en la rata el

insuficiente aporte de oxgeno que sufre el hgado, como consecuencia de las

alteraciones hemodinmicas, as como a la incorrecta utilizacin del oxgeno por

la hepatotoxicidad de las sales biliares, constituiran factores etiolgicos

esenciales de la inhibicin del metabolismo energtico heptico. Como

consecuencia, el hgado reduce su capacidad funcional para poder satisfacer las

necesidades metablicas tisulares. La lesin oxidativa heptica podra disminuir

el contenido intracelular de protenas que participan en la sntesis energtica y

en las funciones de membrana, como son las protenas reguladoras del

transporte de H2O e iones (Portincasa et al 2007), lo cual inducira edema

intersticial y celular. Adems, el aumento de peroxidacin lipdica heptica, un

marcador de estrs oxidativo (Portincasa et al 2007), puede relacionarse con el

aumento de la permeabilidad de membrana, el aumento de la degradacin de

los componentes de la matriz extracelular y el edema (Kenett y Davies, 2007).

La acumulacin intersticial de fragmentos de Glicosaminoglicanos (GAGs) sera

un importante mecanismo de la formacin del edema debido a las propiedades

hidroflicas de GAGs, en particular de hialuronan (Day y de la Motte, 2005;

Cantor y Nadkarni, 2006; Stern et al 2006; Kennett y Davies, 2007; Yung y

Chan 2007; Bartlett et al 2007; Jiang et al 2007). GAGs son largas cadenas de

polisacridos no ramificadas compuestas de unidades repetidas de disacridos

que tienden a adoptar conformaciones en espiral, muy extendidas y que

INTRODUCCIN

17

ocupan un gran volumen en relacin con su masa. Estos polisacridos atraen y

atrapan agua e iones, con lo cual forman geles hidratados, aunque permiten el

flujo a su travs de nutrientes para las clulas (Alberts et al 1983; Rhodes y

Simons, 2007; Jiang et al 2007). En situaciones de inflamacin hialuronan es

ms polidisperso y tiende a formas de menor peso molecular, favoreciendo as

la infiltracin edematosa de los tejidos (Jiang et al 2007), el flujo del lquido

intersticial y el gradiente de presin del sistema linftico (Chen y Fu, 2005).

Adems, la tensin mecnica producida por la ligadura del coldoco puede

alterar por mecanotransduccin la remodelacin de los proteoglicanos y de

GAGs en el intersticio (Evanko et al 2007). Virtualmente todos los rganos y

tejidos estn organizados en jerarquas estructurales y poseen una capacidad

de respuesta mecnica inmediata aumentando su rigidez en proporcin directa

al estrs mecnico aplicado. La rigidez de la matriz extracelular y la tensin

mecnica que resulta de la adhesin celular a sustratos rgidos, es fundamental

para determinar el fenotipo expresado por muchas clulas en cultivo (Bischofs y

Schwarz, 2003).

En el modelo de fibrosis biliar por CCl4

en la rata se ha descrito la induccin

precoz de rigidez heptica. Este aumento de la consistencia y/o rigidez heptica

parece ser el resultado del aumento de la cantidad de matriz neoformada, de la

reticulacin de la matriz y, posiblemente de otras variables desconocidas

(Georges et al 2007). Asimismo, el aumento precoz en la rigidez heptica

podra ser la causa de la diferenciacin de los miofibroblastos en las patologas

hepticas (Georges et al 2007; Muddu et al 2007). La expresin de la funcin

miofibroblasto aporta a las clulas estrelladas hepticas activadas la capacidad

para comportarse como clulas musculares lisas y, por consiguiente, responden

a las sustancias vasoactivas contrayndose (Lee y Friedman, 2011). Adems, la

contraccin de las clulas estrelladas activadas regula el dimetro de la

vascularizacin heptica y altera el flujo sanguneo y la presin heptica (Winau

et al 2008).

La adquisicin posterior en la evolucin del hgado colestsico de un fenotipo

inmune afecta a las clulas parenquimatosas (hepatocitos y colangiocitos), a las

no parenquimatosas (clulas endoteliales sinusoidales, clulas de Kupffer y

INTRODUCCIN

18

miofibloblastos) y a las clulas sanguneas que migran al intersticio heptico

(Azouz et al 2004; Morwood y Nicholson, 2006; Szab et al 2007; Muddu et al

2007; Winaw et al 2008). Sin embargo, el espacio intersticial parece ser el que

modula la actividad inflamatoria de las clulas inmunes tras la ligadura del

coldoco en la rata (Aller et al, 2008). En particular, los fragmentos de matriz

extracelular y sus receptores ejercen importantes efectos sobre las clulas

inflamatorias y, por ello, se considera que estn claramente implicados en la

evolucin de la respuesta inmune intersticial (Morwood y Nicholson, 2006;

Adair-Kirk y Senior, 2008; Yung y Chan 2007). Las Metaloproteasas de la matriz

(MMPs) son una familia de enzimas que degradan componentes de la matriz

extracelular que son expresadas en los tejidos inflamados (Cuenca et al 2006;

Malemud , 2006; Zitka et al, 2010; Lffek et al, 2011) y, en particular, en el

hgado colestsico (Roeb et al 1997; Harty et al 2005; Bergheim et al 2006). La

destruccin enzimtica de la matriz extracelular cursa con la liberacin

inmediata de los mediadores secuestrados en dicha matriz (Stern et al 2006;

Yung y Chan, 2007).

Los fragmentos de la matriz extracelular estn constituidos por molculas con

funciones proinflamatorias que pueden potenciar la respuesta inmune activando

la respuesta inmune innata y la adquirida (Morwood y Nicholson, 2006). As, las

proteinas de la matriz extracelular y el hialuronan ejercen una funcin

proinflamatoria unindose a los receptores Toll-like (TLR)-4 y TLR-2 (Szabo et

al 2007), con activacin del complejo regulador transcripcional NFB/IB y la

produccin de citoquinas proinflamatorias, como TNF- e IL-1, y de

quimioquinas que inducen la activacin y el reclutamiento intersticial de

leucocitos (Miyoshi et al 2001; Morwood y Nicholson 2006). Los linfocitos T,

una vez activados, se polarizan hacia la produccin de distintos perfiles de

citoquinas (Zhu et al, 2010; Yagi et al, 2011). El tipo 1 (Th1) sintetiza Interferon

(IFN-) e IL-2 y, los de tipo 2 (Th2) producen IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13.

Las citoquinas Th2

estn implicadas fundamentalmente en la mediacin de la

inflamacin alrgica y los trastornos fibroproliferativos crnicos (Azouz et al

2004).

Los macrfagos residentes en el hgado, o clulas de Kupffer, se localizan

fundamentalmente en el rea periportal del lobulillo y, debido a su localizacin,

INTRODUCCIN

19

podran desempear un papel fundamental en la lesin secundaria a isquemia-

reperfusin (Kolios et al 2006; Abu-Amara et al, 2010). Pero las clulas de

Kupffer estn tambin implicadas en la inflamacin heptica que produce la

colestasis mediante la liberacin de sustancias biolgicamente activas que

inducen un proceso inmunopatognico (Minter et al 2005; Abrahm et al, 2008;

Zandieh et al, 2011; Cheng et al, 2011).

Las clulas de Kupffer estn claramente afectadas en la obstruccin biliar

(Minter et al 2005; Abrahm et al, 2008; Zandieh et al, 2011; Cheng et al,

2011) y muestran una activacin de la fagocitosis y una marcada respuesta

proinflamatoria frente a endotoxina y a la protena de unin a lipopolisacrido

(lypopolysacharide-binding protein, LBP), ambas aumentadas en colestasis

extraheptica (ONeil et al 1997; Minter et al 2005; Kolios et al 2006; Isayama

et al 2006; Minter et al, 2009; Kassel et al, 2012). La hipersensibilidad a

endotoxina en colestasis es la causa de la sntesis aumentada de citoquinas

proinflamatorias y del aumento de la peroxidacin lipdica (Harry et al 1999;

Isayama et al 2006; Abrahm et al, 2008), con agravamiento de la apoptosis

que, finalmente progresa a necrosis (Moazzam et al 2002; Iida et al, 2010). Sin

embargo, la depleccin de clulas de Kupffer agrava la inflamacin y la necrosis

hepatocelular en ratones con colestasis (Gehring et al 2006). La respuesta

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - … · la realización de los estudios de biología molecular....

Documents

Transcript of UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - … · la realización de los estudios de biología molecular....