1

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE VETERINARIA

PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA

CURSO 2009-2010 En este Curso Académico se llevaran a cabo las siguientes prácticas de laboratorio:

I. Detección de anticuerpos frente al virus de la enfermedad de Aujeszky mediante un ELISA de competición y un ELISA indirecto.

II. Determinación mediante la técnica de aglutinación rápida de grupos sanguíneos y factor Rh humano.

III. Detección de anticuerpos frente a Listeria sp. y frente a Salmonella sp. mediante microaglutinación lenta en placa.

IV. Determinación de los anticuerpos calostrales en sueros de terneros.

V. Resolución de supuestos prácticos.

I. MÉTODO ELISA

La técnica inmunoenzimática ELISA (Enzyme-Llinked Immunosorbent Assay) forma parte de aquellas reacciones serológicas que utilizan conjugados para poder visualizar la reacción ANTIGENO-ANTICUERPO . El ELISA se basa en el uso de anticuerpos marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa), de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo ) insolubilizados sobre la placa, la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmo vilizada y por tanto, podrá ser revelada fácilmente mediante la adición del conjugado y del sustrato, generando un color observable a simple vista y cuantificable mediante un colorímetro.

En la actualidad el ELISA es uno de los métodos más utilizados para el diagnóstico serológico de distintas enfermedades infecciosas, y es la técnica más recomendada para el estudio de poblaciones.

Se han adaptado diferentes tipos de ELISA tanto para la detección de antígenos como de anticuerpos . En esta práctica utilizaremos dos tipos de ELISA para la detección de anticuerpos fente al virus de la Enfer medad de Aujeszky (ADV) en sueros de cerdo .

2

I. 1. PRINCIPIO DEL TEST de la Enfermedad de Aujesz ky (ADV)

La glucoproteína E (gE) no se encuentra en las cepas vacunales del virus de la enfermedad de Aujeszky utilizadas en España. Por lo tanto, la detección de anticuerpos específicos frente a gE en muestras de sueros de cerdos permite la diferenciación entre animales vacunados, sanos e infectados por este virus. En estas prácticas vamos a emplear dos kits comerciales basados en:

- ELISA de competición (o de bloqueo): detecta sólo Ac frente a gE. Los pocillos están tapizados con la proteína gE del virus.

- ELISA indirecto: detecta Ac totales frente a ADV. Los pocillos están tapizados con antígeno inactivado de ADV completo.

En ambos casos si en la muestra de suero a analizar hay anticuerpos específicos éstos se fijan sobre el Ag fijado a la placa, por lo que la reacción de ELISA será positiva. La forma de evidenciar esta unión Ag-Ac es diferente en función de la metodología empleada:

- En el ELISA de competición a continuación se incorpora a los pocillos un anticuerpo monoclonal anti-gE del ADV conjugado con una enzima. En los casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-gE, este conjugado no puede unirse a la gE (Figura 1), por lo que se eliminará en los siguientes lavados.

- En el ELISA indirecto a continuación se incorpora a los pocillos un anticuerpo monoclonal anti-Ig de cerdo conjugado con una enzima. En los casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-ADV, este conjugado se unirá a los Ac específicos del suero, unidos a su vez al Ag fijado al pocillo (Figura 2).

En ambos casos el revelado se realiza por la adición de un sustrato cromógeno. La presencia o ausencia de color indica diferentes resultados en función de la prueba:

- En el ELISA de competición la ausencia de color indica la presencia de Ac anti-gE en el suero problema, que será positivo .

- En el ELISA indirecto el desarrollo de color indica la presencia de Ac anti-ADV en el suero problema, que será positivo .

La intensidad de color se mide con un lector de ELISA con un filtro de 450nm, y los sueros a ensayar se comparan con los sueros controles que se incluyen en el kit.

1.2. MUESTRAS Y REACTIVOS

Muestras : Sueros porcinos en refrigeración (máximo 8 días) o congelación. Reactivos : Las placas tapizadas con el antígeno, los sueros controles, las soluciones de diluyente de muestras, de los conjugados, del sustrato y frenado se suministran con cada kit.

La solución de lavado se suministra concentrada (10x), y se debe diluir en agua destilada antes de su uso.

La solución diluyente de muestras para el ELISA indirecto también se debe diluir previamente a 1/3 en agua destilada.

3

I. 3. ELISA DE COMPETICIÓN. Procedimiento

Muestras : Se usa una dilución del suero problema al 50% (1/2) en solución diluyente

1. Estabilizar los reactivos a 18-25ºC antes de empezar la prueba.

2. Distribución de 50µµµµl de solución diluyente de sueros en cada pocillo a usar.

3. Distribución de 50µµµµl de sueros controles (negativo, positivo; por duplicado) y muestra en cada pocillo (por duplicado). Usar una punta de micropipeta por cada muestra.

4. Incubación de las muestras durante 1 hora a 37ºC. Tapar las placas o incubar en cámara húmeda para que no se evaporen los reactivos.

5. Lavado (lavador de placas o multicanal): Se vacía la placa, se añaden 300µµµµl de solución de lavado por pocillo, se agita suavemente y se vacía placa. Realizar un total de 3 lavados.

6. Distribución del conjugado. Dispensar 100µµµµl de conjugado anti-gE . Incubar 40 minutos a 37ºC .

7. Realizar 3 lavados como en el caso anterior.

8. Dispensar 100µµµµl de solución del sustrato . Incubar a temperatura ambiente (18-25ºC) y en oscuridad durante 15 minutos .

9. Frenado de la reacción. Dispensar 100µµµµl de solución de frenado . Agitar suavemente la microplaca.

10. Lectura inmediata en un lector de ELISA con un filtro de 450nm .

Cerdo infectado o vacunado con

ADV gE+

Añadir sustrato de la enzima

Color

Cerdo vacunado con ADV gE-

Cerdo sano no vacunado

Sí No Sí

Añadir conjugado anti -gE marcado con enzima

Proteína gE de ADV Anticuerpo anti-gE

Conjugado anti-gE Sustrato

Figura 1. ELISA de competición

4

Cálculo de resultados : El porcentaje de inhibición de color (% PI) de cada muestra y del control positivo (DO: densidad óptica)

%PI = (DO media del control negativo – DO de la muestra) x 100

(DO media del control negativo)

La prueba es válida si se cumplen estos dos criterios:

* DO media del control negativo – DO media del control positivo > 0,6

* El suero control positivo tiene un %PI superior a 60

(DO control negativo – DO control positivo) x 100 > 60

(DO media del control negativo)

Interpretación de los resultados :

MUESTRA SUEROS INDIVIDUALES

Positiva % PI > 45

Negativa % PI< 40

Dudosa 40 ≤ %PI ≤ 45

5

I. 4. ELISA INDIRECTO. Procedimiento

Muestras : Se usa una dilución del suero problema a 1/200 en solución diluyente de muestras.

1. Estabilizar los reactivos a 18-25ºC antes de empezar la prueba.

2. Distribución de 50µµµµl de controles por duplicado y 50 µµµµl de las muestras diluidas 1/200 a los pocillos de la placa (por duplicado). Usar una punta de micropipeta por cada muestra.

3. Incubación de las muestras durante 1 hora a 37ºC. Tapar las placas con papel adhesivo o incubar en cámara húmeda para que no se evaporen los reactivos.

4. Lavado (lavador de placas o multicanal): Se vacía la placa, se añaden 300µµµµl de solución de lavado por pocillo, se agita suavemente y se vacía placa. Realizar un total de 3 lavados.

5. Distribución del conjugado. Dispensar 50µµµµl de conjugado anti-Ig de cerdo . Incubar 40 minutos a 37ºC .

6. Realizar 3 lavados como en el caso anterior.

7. Dispensar 50µµµµl de solución del sustrato . Incubar a temperatura ambiente (18-25ºC) y en oscuridad durante 15 minutos .

8. Frenado de la reacción. Dispensar 50µµµµl de solución de frenado . Agitar suavemente la microplaca.

9. Lectura inmediata en un lector de ELISA con un filtro de 405 nm .

Cerdo infectado o vacunado

Color

Cerdo sano no vacunado

ADV inactivado Anticuerpo anti-ADV

Sí

Conjugado anti-Ig de cerdo Sustrato

Añadir sustrato de la enzima

Añadir conjugado anti -Ig de cerdo marcado con enzima

No

Figura 2. ELISA indirecto

6

Cálculo de resultados : Es preciso obtener el valor de IRPC (índice relativo x 100) de cada muestra. Para ello hay que aplicar la siguiente relación:

IRPC = (DO de la muestra - DO media del control negativo) x 100

(DO media del control positivo – DO media del control negativo)

La prueba es válida si se cumplen estos dos criterios:

* La DO media del control positivo es > 0,6

* La relación DO media del control positivo > 7,0 DO media del control negativo

Interpretación de los resultados :

VALOR DE IRPC INTERPRETACIÓN

> 12,0 Muestra POSITIVA

≤ 12,0 Muestra NEGATIVA

I.5. PRECAUCIONES

- Leer atentamente y seguir las instrucciones del manual.

- Conservar los reactivos en refrigeración (4ºC). Equilibrarlos a temperatura ambiente (atemperarlos) antes de su uso.

- Manejar los reactivos con cuidado como si fueran potencialmente infecciosos. Evitar la contaminación de los reactivos y no usarlos fuera de la fecha de caducidad.

- Guardar las normas de trabajo habituales en un laboratorio, tales como no pipetear con la boca, rotular el material, etc.

- Utilizar una punta de pipeta por muestra.

- Incluir sistemáticamente los controles positivo y negativo en cada estudio.

- Manejar con especial cuidado la solución de frenado, ya que contiene ácido sulfúrico y es corrosiva.

7

II. TEST DEL Rh y GRUPOS SANGUÍNEOS

Se trata de una prueba de aglutinación rápida en porta para la detección del antígeno D Rhesus (Rh D) y los antígenos A y B humanos en eritrocitos.

II.1 Información general

Los antígenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos reciben el nombre de antígenos de grupo sanguíneo . En algunas especies animales, como el gato, existen tres grupos sanguíneos A, B y AB. En el hombre, además de los antígenos A, B y O, uno de los antígenos eritrocitarios más importantes es el factor Rh. La expresión e inmunogenicidad del antígeno que determina el grupo de Rh humano puede variar entre individuos como resultado de diferencias cuantitativas o cualitativas antigénicas. En general, este antígeno es fuertemente inmunógeno, y puede suponer un factor de riesgo en transfusiones y en algunos embarazos, donde no hay compatibilidad entre donante/receptor o madre/feto, pudiendo dar lugar a la aparición de reacciones de hipersensibilidad de tipo II.

II.2 Reactivos:

Los reactivos utilizados son una mezcla de anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG (anti-A, anti-B y anti-D (Rh)).

II.3. Procedimiento del test en porta:

1. Colocar una gota de sangre en un porta limpio y templado.

2. Añadir una gota del reactivo correspondiente.

3. Mezclar completamente con movimientos circulares.

4. Observar la aglutinación en un tiempo no mayor de 2 minutos.

II.4. Interpretación:

Una reacción positiva (con aglutinación) indica la presencia del antígeno correspondiente.

Una reacción negativa (sin aglutinación) indica la ausencia del antígeno analizado.

- +

8

III. MICROAGLUTINACIÓN EN PLACA (MAT)

La técnica de microaglutinación en placa creada por Martín y Petit, permite detectar anticuerpos aglutinantes del tipo IgM e IgG, que aparecen en el suero al cabo de varios días post-infección, requiriendo varias semanas para llegar a su nivel de microaglutinación más elevado.

La técnica consiste en enfrentar diluciones sucesivas del suero del animal sospechoso, a un serovar o grupo de serovares seleccionados de la bacteria inactivada. Las ventajas de esta técnica es que es muy sensible y fiable permitiendo la determinación cualitativa y cuantitativa de los ant icuerpos en el suero . El único inconveniente es el tiempo requerido para la resolución de la misma (24 horas).

III.1. Fundamento de la técnica MAT aplicada a: Listeriosis:

La listeriosis es una enfermedad zoonósica grave, que afecta a animales y personas, que está producida por bacterias del género Listeria. En el hombre, la listeriosis está causada principalmente por Listeria monocytogenes y está considerada como la infección de origen alimentario con mayor tasa de letalidad (20 a 30% de los casos). Aunque L. monocytogenes se ha aislado de variadas especies de mamíferos, aves, peces y crustáceos, su principal hábitat es el suelo y la materia vegetal en descomposición, en la cual sobrevive y crece como saprofito. Si bien parece existir gran diversidad de serovariedades (16 serovariedades de L. monocytogenes), en los casos de listeriosis humana sólo hay 3 serovares implicados: 1/2a, 1/2b, 4b.

En esta práctica se va a determinar la presencia de anticuerpos frente a Listeria monocytogenes en distintos sueros de animales.

Salmonelosis:

La salmonelosis es una enfermedad zoonósica grave, que afecta a animales y personas, que está producida por bacterias del género Salmonella. En el hombre, la salmonelosis está causada por numerosos serovares de Salmonella, siendo los más frecuentes Enteritidis y Typhimurium. Está considerada como la 2ª infección de origen alimentario con mayor tasa de prevalencia en la UE, ligeramente por debajo de la campilobacteriosis.

En esta práctica se va a determinar la presencia de anticuerpos frente a dos serovares diferentes de Salmonella en distintos sueros de animales.

III.2. Procedimiento de la técnica:

Listeriosis

Se dispone de dos tipos de antígenos, correspondientes a los serovares 4c y 4b. Los sueros problema corresponden a estos mismos serovares. Se utilizan placas de 96 pocillos con fondo en V.

9

Salmonelosis

Se dispone de dos tipos de antígenos, correspondientes a los serovares Typhimurium y Choleraesuis . Los sueros problema pueden corresponder a estos mismos serovares o no. Se utilizan placas de 96 pocillos con fondo en V.

PROTOCOLO EN AMBOS CASOS

1. Se añaden 100µl del suero problema diluido al 1/10 en el primer pocillo de cada fila de la placa.

2. En los pocillos restantes añadimos 50µl de PBS-safranina (Tampón fosfato salino con colorante, que favorece la visualización de la reacción).

3. A continuación, diluir al doble el suero en los pocillos siguientes de la fila, excepto en el último pocillo que servirá como testigo del Ag.

4. Añadir a todos los pocillos 50µl de la suspensión de antígeno (bacterias de L. monocytogenes hervidas y tripsinizadas).

5. Incubar toda la noche a 37ºC y una o dos horas a 4ºC, antes de leer el resultado.

III.3. Interpretación de resultados:

En caso de reacción negativa se apreciará un “botón rojo de sedimentación ” en el centro del pocillo debido a la acumulación de las células bacterianas que no han reaccionado (sedimentación del Ag). Así, en el pocillo control (donde sólo hay antígeno), siempre deberá de aparecer botón debido a la ausencia de anticuerpos.

En caso de reacción positiva , se observará una falta de depósito del Ag (ausencia de botón rojo), ya que se ha producido la aglutinación.

Suero diluido

100µl 50µl 50µl 50µl Control

...

...

50µl de PBS-safranina

1 2 3 11 12

50µl de la suspensión de antígeno

1 2 3 4 ........ 10 11 12

10

El título sérico del individuo corresponderá a la dilución más alta del suero problema a la que se produce aglutinación .

• Una reacción negativa en una sola muestra no descarta una posible infección, y el resultado puede ser debido a distintas razones:

a) La muestra de suero puede haber sido tomada prematuramente, antes de cumplirse al menos una semana de evolución desde el inicio de la enfermedad.

b) Más raramente, el paciente puede estar infectado por un serovar ausente en el antígeno utilizado y la respuesta inmune no ser suficientemente intensa todavía como para producir reacciones cruzadas detectables con otros serovares.

• En el caso de que en el pocillo control de Ag no hubiese botón de sedimentación la prueba se invalidaría debido a que indicaría una reacción de autoaglutinación espontánea del antígeno.

SUEROS C-

1

2

3

4

5

6

7

8

11

IV. EVALUACIÓN DE LA TRANSFERENCIA PASIVA DE ANTICU ERPOS

El animal neonato es dependiente de la madre para proveerse pasivamente de anticuerpos para su protección durante los primeros meses de vida. La ruta por la cual el neonato adquiere estos anticuerpos varía según el tipo de placenta de la especie animal:

Durante las últimas semanas de gestación en la glándula mamaria hay una acumulación de secreciones que contienen proteínas trasferidas desde el torrente sanguíneo. Éstas son ricas en IgG e IgA. La mayor parte de los Ac en el calostro son de tipo IgG. A medida que pasa el tiempo tras el parto, la secreción mamaria cambia de calostro a leche. En rumiantes, la IgG (IgG1) es el principal isotipo de Ac en leche, mientras que en mamíferos no rumiantes lo que predominan es IgA.

La absorción del calostro es un proceso muy importante, principalmente en animales no primates, ya que en ocasiones, es la única fuente de Ac para el neonato. Los Ac van a ser absorbidos en las células del intestino delgado mediante pinocitosis, pasando seguidamente a la sangre. Este fenómeno va a durar sólo un periodo limitado de tiempo (24-36 horas), tras el cual no se podrán absorber más Ac, pues el intestino deja de se permeable. Tras el nacimiento el mayor nivel de Ac se halla en el suero; sin embargo, algunas IgA permanecen en la luz del intestino para proteger la mucosa directamente.

Los Ac adquiridos de modo pasivo se degradan con el tiempo dependiendo de la vida media característica del isotipo de Ig. La vida media de la IgG es larga (varias semanas en la mayoría de las especies), mientras que la IgE sólo dura unos días. En el animal neonato normal, la producción activa de Ac ocurre antes de la degradación de los Ac trasferidos por la madre, de forma que hay Ac presentes continuamente.

Tipo de placenta

Nº de capas

Contacto materno-fetal

Especies animales

Transferencia de Ig

Epiteliocorial 6 Epitelio uterino

intacto- epitelio del corion fetal

Cerda Yegua Burra

No

Sindesmocorial 5 Tejido conjuntivo –epitelio del corion fetal

Vaca Oveja Cabra

No

Endoteliocorial 4 Endotelio de vasos

maternos-epitelio del corion fetal

Perra Gata

Parcial (5-10% de IgG)

Hemocorial 3 Sangre materna-epitelio del corion fetal

Mujer Primates Roedores

Casi total (90-100% de

IgG)

12

IV.1. Fundamento de la práctica:

En especies dependientes del calostro, para su protección durante los primeros meses de vida, pueden existir fallos en la transferencia pasiva de las Ig debido a que la madre a veces rehúsa al neonato, o a que puede haber una cantidad insuficiente de Ig en el calostro, o a que el recién nacido es incapaz de mamar. En estos casos, el nivel sanguíneo de Ac es muy bajo para protegerlo de los patógenos ambientales con los que entra en contacto habitualmente en las primeras semanas de vida. Estos animales generalmente desarrollarán procesos diarreicos graves y/o septicemia, que puede ser fatal. Por tanto, es necesario determinar que el neonato ha recibido el calostro adecuado que asegure su protección. Si en una muestra de sangre se detecta una insuficiente cantidad de Ac, y todavía puede haber absorción de Ig vía intestinal, es posible administrar calostro al recién nacido por vía oral. Si, por el contrario, ya ha pasado el periodo de absorción de las Ig, los Ac necesarios se deben administrar vía intravenosa.

Por tanto, es importante que el veterinario disponga de métodos rápidos y eficaces para la determinación de los niveles de Ig en el neonato. Una de las técnicas más sencillas, rápidas y baratas es la prueba de la turbidez con sulfato de zinc . IV. 2. Procedimiento de la técnica:

Se trata de una técnica sencilla basada en la mezcla del suero problema con una solución de sulfato de zinc. Este compuesto se utiliza para precipitar proteínas, por lo que hace que las globulinas del suero se vuelvan insolubles, observándose precipitado cuando hay presencia de Ig.

Se dispone de una serie de muestras de suero de terneros recién nacidos, en las cuales se pretende determinar el nivel de anticuerpos que han adquirido a través del calostro.

1. La técnica se lleva a cabo en tubos de vidrio, en cada uno de los cuales se mezcla: 1ml de agua destilada y 0,1ml del suero problema. Mezclar vigorosamente.

2. Se añaden 5ml de la solución de sulfato de zinc (ZnSO4, a una concentración de 250mg/l).

3. Esperar 1 hora a temperatura ambiente y después leer la turbidez del tubo según la siguiente escala:

13

1500mg/dl 500mg/dl 200mg/dl 100mg/dl precalostral

IV.3. Interpretación de resultados:

El sulfato de zinc hace que las globulinas se tornen insolubles, por lo que se observará un precipitado de intensidad variable, en función de l a concentración de Ig en el suero .

En la falta total de transferencia (o en un suero precalostral), la mezcla de reacción permanece clara. Cuando el suero presenta más de 400 mg/dl de Ig, la mezcla se torna turbia. Como alternativa a la inspección visual, es posible leer la densidad óptica de la mezclas en una curva estándar.

Teniendo en cuenta la siguiente tabla, se puede saber si el ternero está suficientemente protegido por los anticuerpos calostrales. En caso negativo, el ternero necesitaría un suplemento inmunológico para asegurar su protección.

< 200 mg/dl Falta de transferencia pasiva

200-400 mg/dl Falta parcial de transferencia pasiva

400-800 mg/dl Probables niveles adecuados de Ig

> 800 mg/dl Niveles adecuados de Ig

14

AUTOEVALUACIÓN Señala la opción correcta en cada una de las siguientes preguntas y razona la respuesta:

Microaglutinación ELISA

En porta En placa

Evaluación. transferencia

pasiva Ac

1 ¿Cuál/es de las técnicas desarrolladas emplea anticuerpos?

2 ¿Cuál/es de las técnicas desarrolladas mide la inmunidad de base celular?

3 ¿Con cuál/es de las técnicas se puede determinar el título de un suero?

4 ¿Cómo lo determinarías?

5 ¿Cuál/es de las técnicas determina la presencia de anticuerpos específicos?

6 ¿Cuál/es de las técnicas es/son primaria/s?

7 ¿Cuál/es de las técnicas es/son secundarias?

8 ¿En cuál de las técnicas se ve precipitación?

9 ¿En qué técnica/s se emplean Ac monoclonales?

10 A tu juicio ¿qué técnica tiene mayor sensibilidad?

11 A tu juicio ¿qué técnica tiene mayor especificidad?

12 ¿Qué técnica emplea controles?

13 ¿Qué técnica se puede emplear para el diagnóstico de infecciones?

14 ¿Con qué técnica podrías diferenciar animales vacunados de animales infectados?

15 ¿Qué técnica es cuantificable?

16 ¿Cómo se te ocurre que podrías determinar si se trata de IgG o de IgM?

15

VI. RESOLUCIÓN DE SUPUESTOS PRÁCTICOS

SUPUESTO PRÁCTICO Nº 1

Para diagnosticar si un animal tiene una inmunodeficiencia secundaria a una infección vírica se puede determinar el cociente entre el número de linfocitos colaboradores (Th) y citotóxicos (Tc), ya que es un buen indicio del funcionamiento del sistema inmune tanto humoral como celular. Estas subpoblaciones de linfocitos se identifican mediante las distintas moléculas de superficie que expresan (CD). Los CD se pueden analizar mediante una doble fluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos empleando la citometría de flujo .

PROTOCOLO

Muestras: tres tubos de sangre-EDTA de tres gatos con sospecha de inmunodeficiencia (infecciones frecuentes, cansancio injustificado, etc.)

Se añade a cada tubo de sangre una solución salina para lisar los hematíes. Tras centrifugar, el sedimento con los leucocitos se lava con una solución de PBS y se pasa a otro tubo especial para citometría.

Se añaden a cada tubo de citometría los siguientes anticuerpos monoclonales:

- AntiCD3-APC - AntiCD4-RD - AntiCD8-FITC

Se mezcla cuidadosamente, se incuba en oscuridad durante 15 minutos y se analizan las muestras en el citómetro de flujo, que determina el número y porcentaje de células marcadas con cada uno de los anticuerpos monoclonales. RESULTADOS

Los datos obtenidos se suelen representar en gráficos de puntos, en los que se representan en ordenadas y en abscisas la intensidad de la señal para cada uno de los marcadores empleados. En este caso se analizan dos parámetros para cada célula: CD3+CD4+ ó CD3+CD8+. Se muestra un ejemplo de los resultados para uno de los tubos de muestra:

B2 y C2: células doblemente positivas B3 y C3: células doblemente negativas B1, B4: células positivas para un solo marcador C1, C4: células positivas para un solo marcador

APC: aloficocianina RD: rodamina FITC: isotiocianato de fluoresceína

CD

8

CD3

CD

4

CD3

16

El citométro además cuenta el número de células marcadas y determina su porcentaje en el total de células analizadas. Los resultados que se obtienen en los tres tubos de sangre son los siguientes:

Nº Células (x109/l) MUESTRAS

CD3+ CD4+ CD8+ Cociente CD4/CD8

TUBO 1 1,43 0,89 0,36

TUBO 2 0,77 0,44 0,23 TUBO 3 1,09 0,23 0,51 PREGUNTAS

1- Explicar resumidamente la citometría de flujo

2- ¿Qué población de linfocitos vamos a identificar empleando estos anticuerpos monoclonales conjugados con un fluorocromo?

i. CD3+CD4+:

ii. CD3+CD8+:

3- ¿Por qué se emplea el Ac monoclonal anti CD3?

4- Calcula e interpreta el cociente CD4/CD8. Un valor de CD4/CD8 ≤ 1 indica una

cierta alteración del sistema inmune ¿Qué muestra podríamos considerar que corresponde a una inmunodeficiencia?

5- Explica cuál sería el resultado si la citometría de flujo se hiciera sobre un tubo de:

a) Sangre entera sin EDTA después de 48 horas de su obtención b) Sangre entera desuerada a 4ºC durante una noche: c) Plasma sanguíneo obtenido por centrifugación de la sangre entera: d) Capa blanca de la sangre separada en un gradiente de Ficoll:

6- Para identificar células NK en una mezcla de linfocitos se emplean como

marcadores anticuerpos monoclonales anti CD3 y anti CD16 (lo expresan todas las NK aunque aparecen en otros linfocitos), con el resultado que expresa la gráfica.

¿En qué cuadrante se encuentran las células NK?

17

SUPUESTO PRÁCTICO Nº 2.-

La figura de la siguiente hoja representa los resultados obtenidos en ELISA y Western blot (WB) en el suero de 5 vacas que han sido inoculadas con 5 variantes de BLV (Virus de la Leucosis Bovina). Todos son inóculos se han realizado con extractos de células infectadas por BLV.

El ELISA se realizó tapizando los pocillos con extractos de células infectadas por el virus. En las gráficas de ELISA se aprecian dos curvas de resultados: línea continua, realizada con los sueros de las vacas tal cual; en la línea discontinua, los sueros han sido adsorbidos con las células sin infectar. Las líneas verticales de puntos representan los momentos en los que se ha aplicado una inoculación de recuerdo a las vacas.

En los 5 WB se han enfrentado los sueros tomados periódicamente (en el sentido de la flecha horizontal) a tiras en las que se han separado las proteínas del mismo extracto celular de BLV que el ELISA. La flecha vertical representa el primer suero tras la inmunización, “c” el control positivo. Los números verticales son los pesos moleculares (kDa) de las distintas proteínas víricas. ELISA

1. ¿Para qué crees que se adsorben los sueros antes del ELISA?

2. ¿Qué diferencias ves entre los sueros adsorbidos y los no adsorbidos?

3. Describe qué pasos seguirías en la realización del ELISA presentado en este experimento.

4. A la vista de los resultados de ELISA, ¿crees que todos los animales han reaccionado igual?

5. A la vista de los resultados de ELISA, ¿qué inóculo consideras que es el más inmunógeno?

WESTERN BLOT

6. Describe qué pasos seguirías en la realización del Western Blot presentado en este experimento.

7. La flecha vertical está colocada en la segunda tira de la izquierda. ¿Qué crees que hay en la primera tira de la izquierda?

8. A la vista de los resultados de WB, ¿qué proteínas son las más inmunógenas?

9. ¿Qué preparado antigénico crees que es el más inmunógeno?

AMBAS TÉCNICAS

10. ¿Crees que hay una correspondencia entre los resultados de ELISA y los de WB en cada animal? Si hay diferencias ¿por qué crees que se dan? ¿Cuál es más sensible? ¿Cuál es más específico?

11. ¿Con cuál de estas técnicas podemos ver la evolución secuencial de diferentes anticuerpos frente a distintos antígenos de un microorganismo durante el curso de una infección?

18

BLV-1 BLV-2 BLV-3 BLV-4 BLV-5

C C C C C