UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA - FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS - 2015-I

MICROBIOLOGIA VETERINARIA PRÁCTICA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIBIOTICA

Objetivo general: Determinar la importancia clínica y microbiológica de las pruebas de susceptibilidad antibiótica.

Objetivos específicos

• Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al método de difusión del disco. • Conocer los criterios que permiten la escogencia adecuada de los discos de antibióticos a probar en

un antibiograma. • Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.

Introducción

El aislamiento e identificación de un agente infeccioso a partir de una muestra clínica proveniente de un paciente, no es suficiente para impartir una terapia anti-infecciosa adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han desarrollado múltiples mecanismos que les permiten resistir a la acción de los más nuevos y potentes agentes antimicrobianos. Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antimicrobianos, en la actualidad se dispone de varios métodos para determinar el patrón de susceptibilidad de una bacteria a los antibióticos. Entre los métodos más utilizados podemos mencionar:!

1. Método de difusión del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer).

2. Antibiograma ATB rapid (bioMérieux).

3. Método de dilución en caldo o en agar (Concentración Inhibitoria Mínima [CIM]).

4. Método de la cinta o Epsilómetro Etestr (AB BIoDISK).

El método utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacterias a los agentes antimicrobianos es el denominado prueba de difusión del disco. Esta técnica fue estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de allí que dicho método también se le conozca con el nombre de “prueba de Kirby-Bauer”. Es un método sencillo y fácil de realizar en los laboratorios de rutina que sólo brinda información cualitativa o semicuantitativa sobre la sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico determinado. Sin embargo, los resultados obtenidos son de gran valor clínico para iniciar, mantener o modificar una antibiótico-terapia.

La resistencia a los antimicrobianos

La base del desarrollo de la resistencia bacteriana está en la presión de selección que constituye la presencia de un abtibiótico. Donde antes se seleccionaban las bacterias más aptas para la supervivencia en el sitio del organismo de que se trate, en presencia del antibacteriano, sobrevivirán solamente aquellas variantes capaces de resistir a las concentraciones de antibiótico presentes. El antibiótico se convierte en el primer factor de selección. Es casi inevitable que al cabo de un plazo variable de tiempo aparezcan variantes resistentes de la bacteria contra la que se pretende luchar con una nueva droga. Esto se ha ido cumpliendo inexorablemente con la mayoría de los agentes antimicrobianos. Esto no implica que con el uso conciente y racional de los antimicrobianos, no se pueda minimizar la emergencia de resistencias.!

Las denominadas resistencias intrínsecas son aquellas constitutivas de la bacteria. Por ejemplo las diferencias de membrana entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, hacen que ciertos antibióticos beta-lactámicos no encuentren el receptor adecuado para fijarse y ejercer su efecto en las últimas. Sin embargo, es la resistencia adquirida la que nos interesa. El origen de la resistencia adquirida es genético, bien basado en mutaciones que modifiquen el blanco del antibiótico y eliminar su

susceptibilidad; ó basado en la adquisición horizontal de elementos genéticos que confieran funciones que neutralicen o eliminen el antibiótico.!

La transmisibilidad de los factores de resistencia puede dar lugar a un problema aún mayor: la multi-resistencia. Estos microorganismos no solamente son resistentes a una serie de drogas, sino que esa multi-resistencia sigue siendo transferible, por lo que se transforman en reservorios de resistencia. De todas maneras, ante el uso de antibióticos, las bacterias desarrollarán, indefectiblemente resistencias. Es muy difícil interpretar de donde viene la resistencia, algunos genes pudieron estar esperando evolucionar. Otros genes pudieran haber existido en bacterias no patógenas y haber sido transferidos a especies de interés médico (O’Brien, 1997). Sabemos que existían plásmidos codificados para resistencia en la era preantibiótica. Seguramente la resistencia es tan antigua como la síntesis de antibióticos por bacterias. Por ejemplo, en el caso de actinomicetos, es frecuente hallar resistencias a los agentes que esos mismos microorganismos producen (Burns, 1995). Heinemann y col (2000) argumentan que no hay coevolución entre resistencia y susceptibilidad, ellos dicen que la disminución en el uso de antimicrobianos tanto en medicina como en agricultura no reemplazará un cambio fundamental en el diseño de medicamentos para frenar la evolución de las resistencias y favorecer la evolución de cepas susceptibles.

1. Las resistencias cromosómicas: Este tipo de resistencias dan lugar, en general, a cambios estructurales. Son cambios, en general, graduales. Se producen por mutaciones que son errores, que se producen en el proceso de replicación del ADN. Estas mutaciones pueden generar muy profundos (y algunas veces rápidos) cambios en el nivel de resistencia, como es el caso de la estreptomicina cuya CIM puede aumentar mil veces a través de una sola mutación. Clásicamente, antes de conocerse los mecanismos que la producían, el desarrollo de resistencias rápidas fue definido como resistencia tipo estreptomicina. En el caso de resistencias más lentas, se las conocía como resistencias tipo penicilina. Esto indudablemente habla a las claras de que había una comprensión intuitiva del fenómeno, pero seguramente no de su gravedad (se desconocía en ese entonces la existencia de las resistencias transmisibles). La mayoría de las veces, las mutaciones son escalonadas, lentas, como en el caso de las quinolonas. Esto requiere una mutación a nivel del gen que codifica la producción de una enzima (girasa de ADN) que ayuda en el proceso de transcripción de ADN. Sin embargo, el desarrollo de resistencia a quinolonas es más rápido, como en el caso de las enterobacteriáceas en que una sola mutación da lugar a un nivel bajo de resistencia, requiriendo una segunda mutación para adquirir un nivel elevado. Por su parte, en Campylobacter, una sola mutación es capaz de generar un elevado grado de resistencia a quinolonas. En este caso en particular, el desarrollo de resistencia no requiere de ADN externo, solamente la droga y la bacteria.!

2. Las resistencias transferibles: En este caso, la bacteria obtiene la información genética que codifica resistencia de otra bacteria que es resistente.¿De dónde proviene el material genético original? Se piensa que los genes que codifican la resistencia pueden provenir de las mismas bacterias productoras de antibióticos. La resistencia en este caso está codificada en ADN extracromosómico que se autoduplica dentro de la bacteria y es transferido a otras por mecanismos varios. La primera descripción de resistencia transferible fue hecha en Japón en los años 50 (Davies, 1997). Sin embargo se ignoraba la magnitud e importancia que ese fenómeno iba a tener en el tratamiento de las enfermedades infecciosas humanas y animales. Los genes que codifican resistencia a antibióticos fluyen desde y hacia bacterias Gram positivas y Gram negativas y bacterias que habitan nichos extremadamente diferentes (Levy, 1997). Las transferencias entre géneros bacterianos diferentes son lamentablemente frecuentes. Es muy importante (Prescott, 2002), considerar al enfocar las prioridades científicas sobre las bacterias patógenas, se desestimó lo que podría ocurrir con las saprófitas. Mientras tanto, esta porción “inofensiva” de la población bacteriana de los organismos animales y humanos siguió actuando como reservorio de resistencias. Esta hipótesis conocida como “hipótesis del reservorio” asume que cierta concentración umbral de antibiótico es necesaria para seleccionar y luego mantener resistencias, asumiendo también que los genes mutados y responsables de la resistencia, no son fenotípicamente neutrales, sino que implicarían una cierta incompetitividad por parte de la bacteria en ausencia de la droga. La concentración umbral sería aquella capaz de seleccionar bacterias, aún saprófitas. La droga debería ser utilizada en una escala tal que las bacterias resistentes, aunque inicialmente excasas, prosperarían hasta hacerse cargo de todo aquello dejado libre por las bacterias susceptibles. Según esta hipótesis, la supresión del uso de antibióticos debería generar un fenómeno inverso a través del cual, la población resistente, lentamente

dejaría lugar a cepas susceptibles. Pese a ser una explicación muy razonable del fenómeno de diseminación de la resistencia, esta hipótesis es fuertemente cuestionada por algunos autores.!

El tracto gastrointestinal animal y humano ha sido considerado como el lugar de elección de las transferencias de resistencias. Otros nichos, sin embargo, comienzan a ser considerados como de gran importancia. Así, el intestino de animales salvajes (especialmente roedores), animales de compañía, y, esencialmente peces, en especial considerando explotaciones comerciales para producción de éstos, representan lugares en que el fenómeno se produciría en gran escala. El medio ambiente representa, en ciertas circunstancias especiales, un lugar de intensa actividad microbiana, donde los intercambios podrían tener lugar en forma extensa. Así, ciertos lugares como la tierra, especialmente en zonas en que se produzcan descargas de materia fecal, producto, por ejemplo de limpieza de corrales, podría funcionar de esta manera. Cursos de agua vinculados al vertido de desechos cloacales sin tratamiento serían lugares ideales de intercambio. Como fue presentado en el Documento de Base de la Consulta de Expertos en Uso No-humano de Antimicrobianos y Resistencia Antimicrobiana organizada en conjunto por Organización Mundial de la Salud, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y la Organización Mundial de la Salud Animal (FAO/OIE/WHO, 2003), hay un conjunto de factores que deben ser considerados en la diseminación exitosa de clones resistentes en humanos y animales, los cuales incluirían:!

• Capacidad de la bacteria de sobrevivir y competir con otros clones en el mismo nicho u otros. • El potencial de adaptarse a nuevos ambientes. • La resistencia a las condiciones del medio, incluyendo factores físicos y químicos. • La capacidad de colonizar hospedadores animales y humanos y reproducirse luego de colonizar. • La habilidad para superar la respuesta inmune del hospedador. • La estructura de la industria animal: Infecciones arriba en la pirámide, en animales de élite

genética pueden generar diseminación hacia abajo en la descendencia. • El manejo de las explotaciones, esto incluye disposición de materia fecal y movimientos de

animales. • La resistencia (esencial) a otros antimicrobianos usados para otros propósitos.

Los mecanismos de transferencia de resistencias pueden clasificarse en: Plásmidos, Transposones, Integrones y casetes genéticos

Los plásmidos son porciones circulares de ADN extracromosómico que puede estar codificado para resistencia a un determinado antibiótico. Cuando codifican resistencias se los denomina plásmidos R. Los plásmidos son autorreplicantes, independientemente del ADN cromosómico. En general codifican características que mejoran los rasgos de supervivencia de las bacterias, sin ser imprescindibles para la misma. Pueden ser transferidos entre bacterias del mismo, o diferentes géneros. La adquisición de resistencia por parte de la bacteria receptora, por lo tanto, es en un paso. Un plásmido puede ser incorporado por un virus y transferido a otra bacteria. En general se cita como ejemplos a los bacteriófagos. También puede pasar de una célula a otra por conjugación.!

Transposones: Son los ya clásicamente conocidos como genes saltarines. Son cadenas cortas de ADN que saltan de cromosoma a plásmido, en uno u otro sentido, entre plásmidos o entre plásmidos y bacteriófagos. La característica más saliente de este tipo de material es la de integrarse con facilidad a cadenas de ADN diferente del original. A diferencia de los plásmidos, los genes saltarines no son autorreplicantes, deben mantenerse dentro de una estructura autorreplicante para replicarse. Un rasgo central y peligroso de los transposones es la posibilidad de que varios de ellos, codificando resistencias a múltiples drogas, estén incluidos dentro de un mismo plásmido, lo que permite, por transferencia de este último, la adquisición de multirresistencia por parte de la bacteria receptora.

Integrones y casetes genéticos: Diferentes de los transposones pero de mecanismos algo parecidos. Se recombinan en un sitio específico y codifican resistencia a un solo antibiótico. Junto con los transposones, son los sistemas que más actúan en la adquisición de resistencias por parte de los plásmidos. Constan de tres regiones, dos invariables y una central variable, que es la que porta el casete. El denominado casete es un elemento que incluye un gene y un sitio recombinante. Se han identificado más de cuarenta casetes y la mayoría porta genes de resistencia (Hall, 1997).!

Mecanismos de resistencia: Las bacterias pueden volverse resistentes a los antimicrobianos, pero, ¿por qué mecanismos?:

• Inactivación enzimática de los antibióticos!• Impermeabilidad de la membrana o pared celular!• Expulsión por mecanismos activos del antibiótico!• Modificación del sitio blanco del antibiótico en la bacteria!

Existen otras denominaciones de resistencia como son:

• Resistencia relativa o intermedia: ocurre un incremento gradual de la MIC a través del tiempo. Para obtener un efecto terapéutico es necesario alcanzar niveles séricos y tisulares adecuados. La susceptibilidad o resistencia del germen es en este caso dependiente de concentración.

• Resistencia absoluta: sucede un incremento súbito en la MIC de un cultivo durante o después de la terapia. Es inefectivo el incremento de la dosis clínica usual. Ejemplo de ello es la Pseudomonas spp. resistente a gentamicina y el Streptococcus pneumoniae altamente resistente a penicilina y uso de levofloxacina.

• Seudorresistencia: ocurre una resistencia in vitro pero una gran efectividad in vivo.

Los antibióticos originan residuos y pueden causar problemas para el medio ambiente: Los antibióticos se metabolizan por distintos mecanismos y persisten en diferentes tejidos hasta su correcta eliminación, situación que genera dos nuevos problemas que es necesario conocer y solucionar. El primero es la persistencia de residuos en los alimentos de origen animal (leche, carne, vísceras, huevo, miel), que pueden desencadenar procesos alérgicos en las personas que consuman dichos alimentos y contribuir a la selección de bacterias resistentes en el intestino humano, y el segundo, la bioacumulación en los residuos ganaderos (estiércol, gallinaza), con los problemas de contaminación ambiental de suelos y aguas que potencialmente pueden derivarse. Para combatir el primer problema se han establecido los tiempos de espera, destinados a garantizar niveles técnicamente seguros de residuos de antibióticos en alimentos, mientras que para minimizar los problemas medioambientales es necesario conocer las peculiaridades de adsorción y de degradación de cada antibiótico.!

Bacterias resistentes en medicina veterinaria: La resistencia de Escherichia coli a los antibióticos es un fenómeno descrito hace tiempo y la vinculación entre la aplicación de antibióticos y su emergencia estaría demostrada según Linton. La manutención de animales en condiciones de crianza intensiva, bajo presión quimioterápica, es la forma “ideal” de generar resistencias. Este hecho fue demostrado por primera vez en 1957 por Smith, en cerdos tratados con tetraciclinas en la dieta. Debemos tener presente que fue en esa época cuando la actividad promotora del crecimiento de los antibióticos fue descubierta y utilizada en forma extensiva. Con el paso del tiempo, esas cepas resistentes de E. coli compitieron con éxito con las susceptibles en el contenido intestinal. Uno de los problemas actuales es que incluso la suspensión de los tratamientos con tetraciclinas puede no resolver el problema dado que por acción de los transposones, la codificación de la resistencia radica, en muchos casos, en los cromosomas. En general, y cuando un tratamiento es corto, hay una eliminación de cepas saprófitas sensibles de E. coli y una enorme predominancia de cepas resistentes. Sin embargo, no se trata de un fenómeno permanente. Las bacterias persistirán, si el antibiótico continúa siendo administrado. Si no, pierden su defensa, y las bacterias susceptibles vuelven a predominar. Cuando, por el contrario, el uso del antibiótico es por tiempos prolongados, aquí los organismos resistentes pueden persistir, incluso sin el antibiótico que los proteja. El caso de la Salmonella Thyphimurium es interesante, dado que la multirresistencia en aislamientos animales ha sido descrita extensivamente. Hay ciertos bacteriófagos que toman plásmidos codificadores de resistencia de E. coli y los pueden transferir a S. Typhimurium. Los casos de resistencia de S. Typhimurium son comunes en aislamientos de terneros. Algunas variantes resistentes de Salmonella tienen la característica de emerger y, un tiempo variable después declinar en prevalencia. Históricamente, aislamientos de serotipos multirresistentes de S. Typhimurium, fagotipo 29, fueron hechos en 1965. En esa época el microorganismo comenzó a presentarse en la población humana. En la década del 70, el fagotipo 29 se había transformado en raro, pero emergieron cepas multirresistentes, causando estragos en la población bovina en G. Bretaña, los fagotipos 204, 193 y 204c. Este brote cruzó al continente europeo y también se presentaron casos humanos. También en USA se describieron casos de antibioticorresistencia en Salmonella, relacionándosela con infecciones y resistencia

en animales. El fagotipo 204c predominó hasta los años 90, cuando comenzó a declinar. Recientemente una cepa multirresistente de S. Typhimurium muy patógena tanto para humanos como para bovinos fue aislada de estos últimos. Esta cepa fagotipo DT 104, al parecer originada en Inglaterra y difundida luego a todos los continentes, causa enfermedad severa en aves, bovinos y cerdos. A diferencia de los anteriores fagotipos en este caso la multirresistencia parece estar integrada en el cromosoma. Este microorganismo es el más utilizado en la argumentación sobre uso de antibióticos en animales y el desarrollo de resistencias que puedan causar enfermedad seria en el hombre.!

Las fluoroquinolonas de uso veterinario, aparecen en la década del 90 en medio de discrepancias porque era el único grupo nuevo de antibacterianos disponible. Se trata de un grupo de drogas que se puede utilizar en forma terapéutica y eventualmente preventiva en el hombre y de la misma manera en los animales, ya que, en estos últimos no se las usa como promotores del crecimiento. Luego de varios años de uso en Europa, aparecieron cepas de Campylobacter jejuni resistentes a fluoroquinolonas.

La llegada de las bacterias animales a la población humana: Escherichia coli multirresistentes, Salmonella Typhimurium multirresistentes, Enterococcus vancomicina resistentes, Campylobacter quinolonas resistentes, son microorganismos que habrían emergido, por lo menos en parte de explotaciones agropecuarias. Este hecho se debe sumar al conocimiento de la enorme capacidad de intercambio genético existente en el intestino, y de la magnitud del reservorio de resistencia representado por los microorganismos saprófitos que lo pueblan. Esto ha generado una permanente discusión sobre el tema de la transferencia de resistencias de los animales al hombre. En esta discusión el punto central es la utilización de antibióticos a dosis por debajo de las terapéuticas para la prevención de enfermedades o, simplemente para el aprovechamiento de los efectos “productivos” de los antimicrobianos. Sin embargo, este fenómeno de transferencia no es fácil de demostrar, y menos aún, de medir. Por otra parte una de las piedras angulares de esta discusión ha sido siempre el origen de estas resistencias: ¿Provienen las mismas de la utilización animal? ¿O provienen del uso en seres humanos? Indudablemente, provienen de ambas partes, en proporciones difíciles de cuantificar. Es evidente que, a nivel mundial, la utilización de antimicrobianos en seres humanos dista de ser consciente y correcta, la automedicación alcanza niveles alarmantes, la compra de antibióticos sin recetas es habitual en muchos países y, por lo tanto, mientas esto ocurra, la emergencia de resistencias no podrá ser controlada de ninguna manera. Algo similar podemos decir de la utilización de antimicrobianos en explotaciones agropecuarias. Si drogas de grupos químicos y mecanismos de acción similares a las utilizadas en tratamientos humanos, son usados para promoción del crecimiento, a dosis subterapéuticas y durante prolongados períodos de tiempo, tampoco se podrá ejercer ningún control. Finalmente, y a la luz de los más modernos conocimientos sobre terapia antimicrobiana, probablemente muchos de los actuales conceptos que hacen a la antibioterapia humana y animal deban ser revistos, a efectos de, efectivamente, transformarla en racional y eficaz. Clásicamente, desde que el Gobierno de Gran Bretaña formó un comité para que se expidiera sobre el tema en 1969, se comenzó a proponer que se podría continuar con la utilización de antibióticos como suplementos en los alimentos en el caso que las drogas utilizadas fueran de uso limitado en el hombre, no fueran capaces de inducir resistencias cruzadas con drogas usadas en el hombre y si redujeran el costo de la producción animal. En esa época estas conclusiones dieron lugar a una gran discusión. Como hemos mencionado antes, esta discusión aún continúa, aunque no por el informe en sí, sino porque aún en nuestros días no es globalmente aplicado. Si las conclusiones del informe hubieran sido aplicadas globalmente, posiblemente no hubiéramos padecido el incremento de resistencias que actualmente conocemos, aunque, de ninguna manera se hubiera detenido su avance, que es un fenómeno normal de selección bacteriana frente al uso de antimicrobianos.!

Uso Racional de los Antibióticos: Puesto que los antibióticos son imprescindibles para garantizar la salud de los animales, es necesario que su uso se lleve a cabo de acuerdo con las normas estrictas que han sido enunciadas por distintas organizaciones, y que podemos resumir en las siguientes líneas de utilización:

• Sólo se deben prescribir en infecciones producidas por bacterias y cuando dichas bacterias sean sensibles al antibiótico. Esto implica que el proceso debe ser correctamente diagnosticado y que la sensibilidad de la bacteria debe estar comprobada.

• Se debe emplear el antibiótico de espectro más restringido y más antiguo de entre los posibles. • Los antibióticos deben administrarse siguiendo estrictamente las condiciones de autorización (la

ficha técnica) de cada medicamento.

• Respetar la dosificación y las pautas específicas de administración del medicamento. • Respetar el tiempo de espera establecido para cada medicamento. Hay que tener en cuenta que si se

varían las condiciones de administración (por ej. dosis, posología), el veterinario debe establecer un nuevo tiempo de espera

• Los antibióticos no son la solución global para los problemas de una granja. No se pueden emplear como sustitutos de buenas prácticas de manejo e higiene, o para desinfección de las explotaciones.!

• Se debe promover la instauración de las técnicas de prevención basadas en el empleo de vacunas.!• Los antibióticos pueden generar problemas de salud pública, que se minimizarán si: Se respetan los

tiempos de espera; se siguen procedimientos de gestión de residuos ganaderos; se restringe su uso a los procesos en los que esté garantizada su eficacia.

Otro aspecto MUY importante que se debe tener en cuenta en la realización de las pruebas de susceptibilidad, es la elección correcta de los antibióticos, basado en los siguientes criterios: !• Microorganismo aislado. • Mecanismo de acción del antibiótico. • Espectro de acción del antibiótico. • Biodisponibilidad del antibiótico en órganos y sistemas (localización de la infección). • Origen o fuente de la infección (hospitalaria o extrahospitalaria). • Estados fisiológicos del paciente (edad, gestación, entre otros). • Estados patológicos subyacentes (inmunosupresión, tratamiento previo con antibióticos,

insuficiencia renal o hepática, entre otros). • La prescripción de algunos medicamentos está sujeta en muchas ocasiones a factores o

circunstancias inherentes al hospedero. Los antibióticos no son la excepción. Es por ello que el veterinario deberá conocer las restricciones que tiene el uso clínico de algunos antibióticos, con el fin de elaborar pruebas de susceptibilidad que proporcionen una valiosa información. !

PREGUNTAS

1. ¿Cuál es el método más utilizado para evaluar la sensibilidad antibiótica de una bacteria? 2. ¿Qué es el CIM y cuál es su importancia en la práctica veterinaria? !" ¿En qué consiste la “hipótesis del reservorio”?!#" ¿Por qué el tracto gastrointestinal, las aguas y el suelo han sido considerados como lugares de

elección de las transferencias de resistencias?!5. ¿Decriba brevemente cada uno de los mecanismos de transferencia de resistencia? $" ¿Cuál es la diferencia entre Resistencia relativa, absoluta y Seudorresistencia?!%" ¿Por qué los géneros Salmonella y E. coli son bacterias de interés veterinario con alto grado de

resistencia antibiótica?!8. Describa los principales factores a tener en cuenta para el uso racional de los antibióticos en la

práctica veterinaria? 9. ¿Qué criterios se deben tener en cuenta para seleccionar un antibiótico en la prueba de sensibilidad? &'" En el Laboratorio de Microbiología de la FCA, de acuerdo a la casuística, a la experiencia clínica y

de campo, se ha diseñado una lista de antibióticos a evaluar en un antibiograma; teniendo en cuenta esto, proponga 3 antibióticos a evaluar en un caso de: cistitis, dermatitis, diarrea, conjuntivitis, aborto y septicemia (Ver documento adjunto).!

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PROCEDIMIENTO

1. Cepa bacteriana a estudiar: Debe provenir de un cultivo fresco, preferiblemente de un cultivo en agar, de manera que podamos comprobar la pureza de la cepa.!2. Inóculo: Se transferirán una o dos colonias del cultivo a un tubo que contenga solución fisiológica estéril. Ajustar a la turbidez del patrón 0.5 del estándar de McFarland.

3. Se introducirá un hisopo de algodón estéril al tubo con el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se eliminará haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.!4. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculará en tres o cuatro direcciones toda la superficie de una placa con agar Mueller-Hinton, girando sucesivamente dicha placa en ángulos de 90º. Se deja secar el inóculo a temperatura ambiente durante algunos minutos (no más de 20 minutos).

5. Se colocarán con una pinza estéril hasta un máximo de 6 discos de antibióticos en forma equidistantes, presionándolos suavemente contra la superficie de agar (Se podrá usar la torreta dispensadora).

6. Se colocarán las placas a 37ºC, en atmósfera aeróbica durante toda la noche.

7. Lectura: Se realizará después de 18 horas de incubación. Con una regla milimetrada, se medirá la zona clara alrededor del disco de antibiótico, el cual se corresponde con la inhibición del crecimiento bacteriano. Estos datos se compararán con los diámetros de zona establecidos para cada antibiótico en las tablas de interpretación internacional. La interpretación de los halos de inhibición nos permitirán expresar los resultados como sensible, sensibilidad intermedia o resistente. Estas categorías indican lo siguiente:

• Sensible (S): la infección debida al microorganismo aislado puede ser tratada apropiadamente con el antibiótico a la dosis recomendada, de acuerdo a la gravedad de la infección. Sin embargo, para la prescripción definitiva del medicamento, el veterinario tratante tendrá en cuenta algunos factores tales como biodisponibilidad del antibiótico en el tejido o sistema afectado, presentación del medicamento, edad del paciente, condiciones patológicas subyacentes o fisiológicas, entre otras.

• Intermedia (I): indica que el antibiótico tiene aplicabilidad clínica en sitios corporales donde el antibiótico alcance concentraciones terapéuticas adecuadas, como es el caso de !-lactámicos y quinolonas en el tracto urinario. En otros casos, puede utilizarse el medicamento con seguridad en dosis elevadas que no alcancen los niveles de toxicidad pero que garanticen actividad terapéutica. Sin embargo, es recomendable evitar el uso de la categoría “intermedia” cuando sea posible.

• Resistente (R): la bacteria aislada no es inhibida por el antibiótico a las concentraciones terapéuticas ideales o la bacteria ha generado mecanismos de resistencia que evaden la actividad del antibiótico, por lo tanto, la eficacia clínica de éste no es confiable. Es recomendable que ante el aislamiento de un microorganismo multirresistente clínicamente significativo se ensayen otras pruebas de susceptibilidad adicionales (CIM).

8. El reporte de los resultados del antibiograma debe ser realizado en forma clara y precisa y enviados en forma inmediata al veterinario tratante. Utilice la siguiente tabla para registrar los resultados obtenidos en los antibiogramas problema:

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