UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS. DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y

TECNOLOGÍA QUÍMICA. Centro de Investigación y Desarrollo en Grasas y Aceites. CIDGRA.

PROFESOR PATROCINANTE DIRECTOR Prof. Q.F. Lilia Masson S. Prof. Q.F. Lilia Masson S.

“IMPLEMENTACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA LA CUANTIFICACIÓN DE ACRILAMIDA EN PAPAS

CHIPS POR HPLC MS/MS.”

MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE QUIMICO FARMACEUTICO

LUIS GUSTAVO EDUARDO HERNÁNDEZ MORENO Santiago-Chile

2007

ii

AGRADECIEMENTOS

Quiero agradecer profundamente a la Profesora Lilia Masson por todo su apoyo y entrega de

conocimientos que contribuyeron a la realización de esta memoria. A Erik Petersson por

compartir sus conocimientos y toda su experiencia en el tema de esta memoria. Finalmente a

todo el grupo de trabajo del Centro de Investigaciones y Desarrollo en Grasas y Aceites

(CIDGRA) del Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química de la Facultad

de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Conrado Camilo, Cristián Encina y José Reinaldo Muñoz

por el apoyo y camaradería demostrados durante toda la realización de la memoria.

iii

TABLA DE CONTENIDOS

Página SUMMARY iv RESUMEN v 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ACRILAMIDA 3 2.1 Estructura química, propiedades y aplicaciones 3 2.2 Mecanismo de formación 4 2.3 Efectos sobre la salud 6 2.4 Determinación 8 3. OBJETIVOS 10 3.1 Objetivo General 10 3.2 Objetivos Específicos 10 4. MATERIALES Y METODOS 11 4.1 Fundamentos Técnicos 11 4.2 Reactivos 13 4.3 Materiales 13 4.4 Equipos 14 4.5 Determinación por HPLC MS-MS 16 4.6 Cálculo de resultados 21 5. RESULTADOS 23 5.1 Determinación de exactitud 24 5.2 Determinación de precisión 27 5.3 Especificidad 32 5.4 Límite de detección y límite de cuantificación 35 5.5 Linealidad y rango 36 5.6 Muestras reales 37 6. DISCUSIÓN 40 7. CONCLUSION 42 8. BIBLIOGRAFIA 43 9. ANEXOS 46

iv

SUMMARY ANALYTICAL METHOD FOR ACRYLAMIDE DETERMINATION IN POTATOES CHIPS BY HPLC MS/MS In April of the 2002 researchers of the University of Stockholm and from the Swedish National

Food Administration announced to the world that in different foods mainly rich in starch,

normally consumed by the population and processed at high temperatures as frying, baking ,

extruding, acrylamide was formed. The foods with the higher content were potatoes chips,

“french fries”, cookies , crackers, breads, breakfast cereals, the amounts were in ppb.

Acrylamide has been classified as “probable carcinogenic for humans” (Grupo 2A) by the

International Agency of Research on Cancer - IARC , and its exposition cause damage to the

nervous system in human and animals.

Due this communication, it was necessary to develop methods enough sensible, robust at a

reasonable cost , which could be applied to determine acrylamide in different matrixes of food

with a low detection level (ug/kg).

During this research the methodology for determination acrylamide in foods by HPLC MS/MS ,

was implemented at the CIDGRA, Centre of Fats and Oils R&D Department of Food Science

and Chemistry Technology, Faculty of Chemistry and Pharmaceutical Sciences, University of

Chile. The precision and accuracy of the method was determined. The method was apply to

quantify acrylamide in potatoes chips from the commerce and the potatoes chips elaborated at

the laboratory according the research programmed during the development of the UE HEATOX

Project Nº 506820.

As a conclusion, it is possible to say that all the objectives were reached, and the Method is

working at CIDGRA Centre , which is the first step to start with the research for determining

the acrylamide content of the foods more consumed in Chile which potentially could be a source

of acrylamide.

v

RESUMEN

En el año 2002 la Administración Nacional de Alimentos de Suecia detectó altas

concentraciones de acrilamida que se formaba durante el calentamiento a altas temperaturas de

alimentos ricos en almidón, como las papas fritas, pan, galletas, alimentos extruídos, etc.

La acrilamida es genotóxico y ha sido clasificada como “probable carcinogénico para humanos”

(Grupo 2A) por la Agencia Internacional de Investigación sobre Cáncer IARC, y esta exposición

causa daño al sistema nervioso en seres humanos y animales

Con motivo de este hallazgo, surgió el requerimiento urgente de desarrollar un método analítico

sensible, robusto y de un costo razonable, que pueda cuantificar acrilamida en diferentes

matrices de alimentos con bajos niveles de detección (µg/Kg).

Durante el desarrollo de esta memoria se implementó en el Centro de Investigación y Desarrollo

en Grasas y Aceites (CIDGRA), Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología

Química de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmaceúticas de la Universidad de Chile, la

metodología analítica para cuantificar acrilamida por HPLC MS/MS. Se determinó la precisión y

exactitud en el análisis de acrilamida por HPLC MS/MS. Finalmente se aplicó la metodología

para el análisis de papas fritas chips comerciales y elaboradas en el laboratorio dentro del

Proyecto Heatox 506820.

En conclusión se puede decir que se logró una respuesta total a los objetivos planteados siendo

implementado en el Centro de Investigación y Desarrollo en Grasas y Aceites (CIDGRA), la

metodología analítica para la extracción de acrilamida en papas chips y su cuantificación por

HPLC MS/MS. Lo cual abre las puertas, para el comienzo de la investigación, de los alimentos

de consumo habitual en nuestro país y que pudieran contener acrilamida, y así tomar las medidas

necesarias en cuanto a políticas de salud, para el bienestar de nuestra población.

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1. INTRODUCCIÓN

La acrilamida (2- propenamida) es un compuesto hidrofílico de bajo peso molecular conocida

principalmente por su uso como monómero en la producción de poliacrilamida se emplea en

plásticos y como medio de electroforesis.

En el año 2002 la Administración Nacional de Alimentos de Suecia detectó altas

concentraciones de acrilamida que se formaba durante el calentamiento a altas temperaturas de

alimentos ricos en almidón, como las papas fritas, pan, galletas, alimentos extruídos, etc.

Este descubrimiento es de interés público, porque la acrilamida es genotóxico y ha sido

clasificada como “probable carcinogénico para humanos” (Grupo 2A) por la Agencia

Internacional de Investigación sobre Cáncer (IARC) (IARC, 1994, De Wilde et al. 2005)

El descubrimiento se origina a partir de resultados de la formación de un aducto específico en

humanos entre la hemoglobina y la acrilamida, más adelante también encontrada por los

científicos de la Universidad de Estocolmo en ratas alimentadas con papas fritas (Tareke et al.,

2000).

Las conclusiones a la fecha muestran que la acrilamida se forma durante la preparación culinaria

e industrial de alimentos, ricos en carbohidratos que se fríen, hornean o extruyen a temperaturas

que exceden los 120º C, como producto de la reacción de la asparagina y glucosa que

corresponde a la conocida reacción de Maillard.

Con motivo de este hallazgo, surgió el requerimiento urgente de desarrollar un método analítico

sensible, robusto y de un costo razonable, que pueda cuantificar acrilamida en diferentes

matrices de alimentos con bajos niveles de detección (µg/Kg). Diferentes métodos se habían

desarrollado en el pasado para determinar monómero de acrilamida, especialmente en agua,

fluidos biológicos y alimentos. Se basaban en técnicas de cromatografía líquida o de gas. Sin

embargo, estos métodos como tales no eran apropiados, en alimentos cocinados, para analizar

acrilamida en bajos niveles. En particular, carecen de selectividad y el grado adicional de certeza

analítica requerida para confirmar la presencia de esta pequeña molécula como es la acrilamida

en la compleja matriz de un alimento (Paleologos et al. 2005). Es así como a raíz de este

hallazgo diversos grupos de investigación en el mundo inician trabajos para desarrollar

metodologías analíticas que cumplan con estos requisitos de determinación de alta sensibilidad.

El hallazgo de altos niveles de acrilamida en alimentos de consumo habitual despertó

preocupación e interés mundial. La Universidad de Chile a través de la Facultad de Ciencias

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Químicas y Farmacéuticas y el grupo de investigación y desarrollo CIDGRA. Participa en el

proyecto internacional HEATOX Nº 506820, integrado por 24 instituciones de 14 países y

financiado por la Unión Europea. El enfoque del proyecto HEATOX permite la participación de

grupos multidisciplinarios ya que considera investigaciones en metodologías analíticas,

mecanismos de formación, modificación de procesos tecnológicos y aspectos relacionados con el

riesgo para la salud.

El grupo de trabajo del Centro de Investigaciones y Desarrollo en Grasas y Aceites (CIDGRA)

Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química de la Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacéuticas participa en la línea de investigación que tiene por objetivo introducir

modificaciones al proceso de fritura de papas chips para reducir al mínimo las cantidades de

acrilamida y obtener alimentos más seguros. Adicionalmente, este grupo de trabajo implementó

la metodología analítica para determinar acrilamida en papas chips, aplicando el método de Erik

V. Petersson (2006), que emplea cromatografía líquida y espectrometría de masa/masa.

La presente memoria, se financiará con recursos del proyecto HEATOX Nº 506820.

3

2. ACRILAMIDA

2.1 ESTRUCTURA QUÍMICA, PROPIEDADES Y APLICACIONES

Sinónimos: 2-Propenamida, etilén carboxamida, amida acrílica, amida vinílica.

Fórmula : CH2CHCONH2

Peso molecular : 71.09

Punto de ebullición : 125°C

Punto de fusión : 87.5°C

Es un monómero intermediario usado en la síntesis de poliacrilamidas. El monómero es un polvo

blanco cristalino soluble en agua, etanol, metanol, dimetileter y acetona. No es soluble en

heptano y benceno. Es estable a temperatura ambiente, pero puede polimerizar violentamente

cuando se funde o se expone a agentes oxidantes.

Los usos principales de la poliacrilamida son para la producción de plásticos, como agente

floculante en el tratamiento de agua de bebida y en el procesamiento de pulpa y papel. También

se emplea para retirar sólidos suspendidos de aguas industriales de desecho antes de la descarga,

reuso o descarte (Masson L. et al 2005).

Otras aplicaciones son como aditivo en cosmética, agente para el acondicionamiento de suelos y

en la formulación de mezclas para encementado de túneles. El humo del tabaco es una fuente

conocida de exposición a acrilamida.

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2.2 MECANISMO DE LA FORMACIÓN DE LA ACRILAMIDA. Durante el calentamiento de los alimentos, los azúcares reductores reaccionan con aminoácidos

iniciando una cascada de eventos químicos que conducen al pardeamiento de alimentos,

conocido como la reacción de Maillard.

Se sabe que este proceso genera compuestos reactivos como monocarbonilos y dicarbonilos los

cuales son los responsables de la reacción de pardeamiento.

Para entender mejor el mecanismo de formación de la acrilamida desde la asparragina, se

investigó la capacidad de otros compuestos carbonilos, para generar acrilamida en un sistema

modelo de papas snack (Zyazak et. al. 2003)

Se encontró que una gran variedad de fuentes de carbonilos, podían generar acrilamida de la

asparagina bajo calor. Mientras la cadena del azúcar es más corta, la molécula se tensiona, para

formar una estructura cíclica hemiacetal y posteriormente el carbonilo llega a estar más

fácilmente disponible para el ataque nucleofílico alfa-amino de la asparagina. Así, las cadenas

más cortas de azúcares llegan a ser más reactivas.

En base de los resultados de la sustitución por isótopo y los estudios de carbonilos descritos

arriba, se propone el mecanismo exhibido en la figura 2. El grupo libre alfa-amino de la

asparagina reacciona con un azúcar fuente de grupo carbonilo, formando una base de Schiff.

Bajo calor, la base Schiff se descarboxila (facilitado por la descolocación de la carga negativa,

que permite la formación de la base de Schiff), formando un producto que puede reaccionar por

dos vías. Se puede hidrolizar para formar 3-aminopropionamida que se puede degradar más aún,

vía la eliminación del amoníaco para formar la acrilamida cuando se somete a calor.

Alternativamente, la base descarboxilada de Schiff puede descomponerse directamente para

formar acrilamida vía la eliminación de una imina (Zyazak et. al. 2003).

Los factores más importantes que determinan la cinética de formación de acrilamida y su

posterior degradación son la composición de las papas y las variables de proceso. La papa aporta

los precursores en una concentración dependiente de su variedad, de las condiciones del suelo,

del periodo de cosecha y de las condiciones de almacenamiento postcosecha (Low et al., 2006).

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Mecanismo de formación de acrilamida en alimentos sometidos a altas temperaturas. Números

en paréntesis son el peso molecular de los isótopos en asparagina. (figura 2).

Fuente: Zyzak et. al. 2003. Acrylamide formation mechanism in heated foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 4782–4787.

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2.3 EFECTOS SOBRE LA SALUD

La acrilamida es genotóxico y ha sido clasificada como “probable carcinogénico para humanos”

(Grupo 2A) por la Agencia Internacional de Investigación sobre Cáncer (IARC) (IARC, 1994).

(De Wilde et al. 2005)

La exposición a la acrilamida causa daño al sistema nervioso en seres humanos y animales

(Lopachin y Lehning, 1994; Tilson, 1981), también se considera una toxina antireproductiva

(Costa et al., 1992; Dearfield et al., 1988) con características mutágenas y carcinógenas en

sistemas experimentales in-vitro e in-vivo de algunos mamíferos estudiados (Dearfield et al.,

1995).

Se han identificado y cuantificado aductos de hemoglobina (Hb), con el fin de la supervisión in

vivo de la dosis de productos químicos o metabolitos reactivos. La cuantificación de aductos

formados con aminas terminales, como por ejemplo el aminoácido valina de las cadenas de

hemoglobina se han convertido en una herramienta poderosa, para la dosimetría de agentes

químicos genotóxicos carcinógenos. Este método se ha aplicado, para el monitoreo de las dosis

en las personas ocupacionalmente expuestas a la acrilamida (AA).La AA reacciona por la

adición de Michael con los grupos NH2 terminal de las cadenas de hemoglobina durante la

formación de N-(2-carbamoiletill) valina (CEV) (figura1). LA AA se metaboliza a glycidamida,

un epoxido (figura 3) que es reactivo para el ADN y se asume que puede ser el agente

mutagénico e iniciativo de cáncer, mientras que la AA es probablemente la causa principal de los

efectos neurotóxicos producidos por su exposición a AA (Tareke, et al. 2000).

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Fuente: Tareke, E. et. al. 2000. Acrylamide: A cooking carcinogen? Chemistry Research Toxicology 13: 517-522.

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2.4 DETERMINACIÓN DE ACRILAMIDA.

Debido a la alta solubilidad y alta reactividad (Mottran y Wedzicha, 2002) y también, por la

carencia de un grupo cromóforo, la acrilamida no es fácilmente detectable (Jezussek y

Schieberle, 2003).

Diferentes métodos se han desarrollado en los últimos años para determinar el monómero de la

acrilamida, especialmente en agua, líquidos biológicos, y alimentos crudos (azúcar, cultivos de

campo, setas). La mayoría son métodos clásicos basados en la Cromatografía Líquida de Alta

Resolución (HPLC) o las técnicas cromatográficas con gas (Cromatografía Gaseosa) (Bologna et

al., 1999; Castle, 1993; EPA, 1996; Tekel et al., 1989).

Sin embargo, debido a la complejidad de las matrices de los alimentos, estos métodos como tal

no son suficientes para el análisis de la acrilamida en alimentos procesados. Particularmente,

carecen de selectividad y del grado adicional de la certeza del analito requerido, para confirmar

la presencia de una molécula tan pequeña como la acrilamida, en la matriz compleja del

alimento.

El primer método de análisis de la acrilamida en diversos alimentos cocidos y procesados se

publicó en mayo de 2002. Se basa en el uso de la dilución isotópica en cromatografía líquida con

espectrometría de masas (LC-MS/MS) (Rosén y Hellenäs, 2002). Desde entonces, se han

publicado en revistas científicas o se han presentado en las reuniones internacionales, varios

métodos analíticos que describen el análisis de acrilamida en alimentos procesados (Wenzl et al.,

2003). Estos métodos se basan principalmente en el empleo de la Espectrometría de Masas (MS)

como la técnica determinativa, antecedido de una separación cromatográfica por LC (Ahn et al.,

2002; Becalski et al., 2003; Hartig et al., 2002; Höfler et al., 2002; Gutsche et al., 2002; Nemoto

et al., 2002; Tareke et al., 2002), o Cromatografía Gaseosa, donde se derivatiza el analito (Gertz

y Klostermann, 2002; Höfler et al., 2002; Ono et al., 2003; Tareke et al., 2002), o, el análisis del

compuesto directamente (Biedermann et al., 2002; Tateo y Bononi, 2003).

El grupo de trabajo creado para los métodos analíticos que se convocó durante la reunión sobre

la acrilamida (JIFSAN/NCFST, 2002) y Clarke et al., (2002) concluyeron que la mayoría de los

laboratorios aplican el método de LC-MS/MS para el análisis de la acrilamida. La ventaja de los

9

métodos basados en LC-MS/MS, es que la acrilamida se puede analizar sin la derivatización

anterior (ejemplo, bromación), que simplifica y apresura considerablemente el análisis.

Se planteo un estudio optimizado del método de determinación de acrilamida mediante LC-

MS/MS. Este estudio ha demostrado que la acrilamida se puede extraer eficientemente de varias

matrices alimenticias usando agua pura. El uso de una mezcla de etanol-agua como solvente de

extracción, o la eliminación de grasa con un solvente orgánico, tiene un efecto no significativo

sobre la extracción de acrilamida (Petersson et al. 2006).

El método propuesto por Petersson et al. (2006) consiste en el uso de muestras desintegradas,

agua como el solvente de la extracción y agitación de la muestra horizontalmente (100 RPM) a

25 °C durante 45 minutos. Este es un método simple, sin solventes orgánicos, que permite un

alto rendimiento de procesamiento de muestras puesto que se pueden extraer en paralelo.

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3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

Cuantificar el contenido de acrilamida en papas fritas chips.

3.2 Objetivos específicos

Implementar en el Centro de Investigación y Desarrollo en Grasas y Aceites CIDGRA,


Químicas y Farmaceúticas de la Universidad de Chile, la metodología analítica, para la

extracción de acrilamida en papas chips y su cuantificación por HPLC MS/MS.

Aplicar la metodología para el análisis de papas fritas chips comerciales y elaboradas en el

laboratorio, para las investigaciones del Proyecto Heatox 506820.

Determinar la precisión y exactitud en el análisis de acrilamida por HPLC MS/MS.

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4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 FUNDAMENTOS TÉCNICOS

Una porción de prueba (papas fritas 1 gramo) se extrae con agua y se le agrega acrilamida

marcada (Deuterada). El extracto se centrifuga y al sobrenadante se le realiza una purificación y

limpieza con dos columnas de extracción en fase sólida (SPE).

El primer SPE, (Isolute Multimode), contiene una base de sílica con grupos C-18, que actúan

como intercambiadores de aniones y cationes, la acrilamida no es retenida por la columna de

extracción, y pasa a través de ella para ser colectada. La razón para el uso de esta columna es

para retener muchos posibles componentes de la matriz (compuestos no polares como también

aniones y cationes) sin la retención de acrilamida, esta columna “Multimode” se usa como un

filtro químico.

El segundo SPE, (ENV+), contiene un polímero con relativamente alta capacidad para captar

acrilamida. El extracto se pasa a través de la columna, se lava con agua y finalmente se eluye la

acrilamida con metanol al 60%. El propósito de este paso, además de aumentar la limpieza del

extracto, es concentrar el extracto y obtener bajos niveles de límite de cuantificación (Petersson

et al. 2006).

Estructura de Isolute ENV+

Descripción: Copolimero Hidroxilado poliestireno-divinilbenceno.

Partícula promedio: tamaño 90µm

Porosidad Nominal: 800 Å

Comentarios: Extracción de drogas muy polares y metabolitos que no son retenidos por C8 o

C18.

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Luego de la evaporación del metanol el extracto se analiza por cromatografía líquida (HPLC-

MS-MS). Para este propósito se instala una columna con carbono gráfito como fase estacionaria

con un factor de retención (k) relativamente alto (k=4 cuando solventes no orgánicos se agregan

en la fase móvil), comparada con otras columnas comercialmente disponibles.

13

4.2 REACTIVOS

Acetonitrilo Grado HPLC

Metanol grado HPLC

Acido Acético glacial (cas 64-19-7)

Agua grado HPLC

Estándares

Aldrich

Acrilamida 99% (148571) (CAS 79-06-1)

Acrilamida-2,3,3-D3 98% átomo D (636568)

4.3 MATERIALES

Papas fritas chips elaboradas en el laboratorio y papas chips comerciales.

Tubos Falcon de polipropileno 50 ml con tapa.

Tubos Falcon de polipropileno 15 ml con tapa.

Pipetas pasteur

Probeta de 40 ml

Material de vidrio (Clase A)

Matraz volumétrico de 50 ml

Matraz volumétrico de 100 ml

Viales de vidrio autosampler

Micropipetas

Precision calibrada

100- 1000 microlitros

1000-5000 microlitros

14

4.4 EQUIPOS

HPLC MS/MS

Cromatografo líquido consiste de:

Inyector capaz de inyectar 10µ L de la muestra. Bomba del HPLC capaz de mantener un flujo de

la fase móvil de 0.4 ml/minuto

Columna del HPLC.

Hypercarb, 5µm, 50x2.1 mm, con una pre-columna 5 µm, 10x2.1 mm (Thermo Hypersil-

Keystone). La fase estacionaria de esta columna es carbón grafito. Las columnas de otros

proveedores que demuestren las mismas características que la columna especificada puede ser

también aplicada, la igualdad de las características de la columna tiene que ser demostrada.

Espectrómetro de masa.

Espectrómetro de masa triple quadrupole que funciona en electrospray positivo con modo de

monitoreo de reacción múltiple, sistema para obtener resolución de la unidad.

Adquisición de datos y sistema del análisis

Colección de datos y software "masslynx" de evaluación especifico.

Sistemas de extracción de fase sólida

Dispositivo con sistema de vacío para extracción en fase sólida (Vacuum manifold).

SPE column “Multimode”:

Isolute Multimode, 1000 mg / 6 ml, from IST (International Sorbent Technology Ltd), Hengoed,

Mid Glamorgan, UK.

SPE column “ENV+”:

Isolute ENV+, 500 mg / 6 ml, from IST (International Sorbent Technology Ltd), Hengoed, Mid

Glamorgan, UK.

15

Balanza analítica

Sensibilidad 0.01 mg

Mezclador Horizontal

(Capacidad tubos Falcon 50 ml)

Centrifuga

Para tubos Falcón (velocidad 8000 rpm)

Equipo para evaporación del solvente (La temperatura de evaporación no debe exceder los 40

ºC). Se necesita corriente de nitrógeno o vacío.

16

4.5 DETERMINACIÓN POR HPLC-MS-MS Las muestras extraídas, fueron leídas en HPLC MS/MS (LC perkinelmer), facilitado por la

Profesora Betty San Martín del Laboratorio de Farmacología, Facultad de Ciencias Veterinarias

y Pecuarias, de la Universidad de Chile.

Condiciones de HPLC-MS-MS

Para un análisis adecuado es de vital importancia que el instrumento esté en buenas condiciones

y que todos los parámetros instrumentales estén optimizados.

Se utiliza la columna de Hypercarb y la fase móvil con un flujo de 400 µL/min. La columna se

sostiene en un espacio temperado. Se inyecta un volumen de 10 µL.

Se optimizan todos los parámetros como, diversas temperaturas, flujos de gas, voltajes, y

posición de la señal para la detección de la acrilamida en el flujo de la fase móvil. Optimice la

energía de colisión para cada uno de las transiciones siguientes: m/z 72>55, 72>54, 72>44 y

75>58. Se utilizan los ajustes óptimos del tiempo de detección para obtener la mejor

sensibilidad, evitando cualquier interferencia y para obtener cromatógramas con por lo menos 15

puntos de referencias por canal sobre el pico. La acrilamida y el estándar interno se detectan con

las transiciones m/z 72>55 y 75>58 para los propósitos cuantitativos, y m/z 72>55, 72>54 y

72>44 para la confirmación de la identidad de la acrilamida. Usando el instrumento Quattro

Ultima de Micromass el siguiente ajuste de parámetro fue aplicado con éxito:

Parámetros HPLC

Columna HPLC Hypercarb column 50x2.1mm equipped with a Hypercarb pre-column (10x2.1 mm)

Temperatura de Columna 25 º C Volumen de Inyección 10 µL Fase Móvil 0.1% ácido acético en agua Flujo de Fase Móvil 400 µL/min Tiempo de Corrida total 15 min

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Parámetro MS

Desolvation gas N2, 600 dm3/h

Desolvation temperature 400°C Nebulising gas N2, fully open

Cone gas N2, 200 dm3/h

Collision gas Argon, 2,3 mbar Ion source temp 125°C

Capillary voltage 2 kV Cone voltage 20 V Hexapole voltage 10 V Collision energies: 72>55 and 75>58 9 eV 72>44 20 eV 72>54 16 eV Dwell time 0,15 sec Inter channel delay 0,03 sec

Se inyecta el extracto de cada muestra por lo menos dos veces, preferiblemente tres veces.

Inyecte las soluciones estándar por lo menos tres, preferiblemente cuatro veces: antes, entre y

después del conjunto de extractos de muestra. Utilice un tiempo de pasada de 15 minutos para

las muestras para permitir que los componentes de la matriz se enjuaguen de la columna. En

caso de necesidad lave la columna con acetonitrilo al 80% en agua, según lo descrito más

adelante "lavado de la columna del HPLC", entre el conjunto de muestras, o después del final de

la jornada.

Sistema adecuado

La respuesta del LC/MS puede variar día a día o en períodos más largos. También la columna

del HPLC puede deteriorarse después de haber sido utilizada varias veces, o apenas una vez,

dependiendo del número de inyecciones y del tipo de muestras analizaba. Por lo tanto, el sistema

se debe comprobar antes de cada serie de análisis:

La columna se debe equilibrar con la fase móvil y el espectrómetro de masa por ejemplo 30

minutos. Se inyecta por lo menos tres veces una de las soluciones estándar para comprobar la

respuesta del equipo de LCMS así como el tiempo de retención, forma máxima y anchura

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máxima del pico. La respuesta debe ser similar antes como después de la optimización. Si no, la

interfase necesita limpiarse y / o el espectrómetro de masa necesita re-optimizarse. El tiempo de

retención no debe ser menor a 1.7 min. (En un flujo de 0.4 ml/minuto), y la anchura máxima

media debe ser bajo de 0.2 min. El alargamiento del pico ocurre incluso para las columnas

nuevas pero la distancia máxima al borde del pico (medido en la altura del 10%) no debe ser más

de dos veces la distancia del máximo al borde del pico principal. Para una ilustración mejor, un

cromatógrama típico para los productos de la patata se demuestra a continuación.

Las columnas que no satisfagan estos requisitos pudieran ser reacondicionadas lavándose. Si el

re-acondicionamiento no es el acertado, la columna tiene que ser cambiada. Las tres inyecciones

de la solución de estándar deben dar resultados casi idénticos.

Debe inyectarse agua pura para comprobar si hay posible contaminación del sistema. No debe

detectarse ningún rastro de acrilamida.

prov 70 Havrefras (omanalys)

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

analys 020326 037 Sm (Mn, 2x3) MRM of 5 Channels ES+ 74.8 > 57.8

3.11e5Area

2.1365316


1.59e6Area

2.15318210


8.39e5Area

2.15174304


1.99e4Area

2.153869


1.14e4Area

2.152294

19

Lavado de la columna del HPLC

Si el funcionamiento de la columna del HPLC es perceptiblemente peor de lo esperado o

requerido (véase que la "conveniencia del sistema") puede ser restaurada lavándose. La columna

se puede lavar con acetonitrilo al 80% en agua con un flujo de 0.4 ml/minuto por 30 minutos en

línea con el LCMS. Esto se puede hacer rutinariamente después de cada día de trabajo o aún

entre cada lote de inyecciones. Cerciórese de dar tiempo para el equilibrio con la fase móvil.

Para casos más severos el siguiente procedimiento de lavado, preferiblemente realizado sin

LCMS, puede ser usado:

Disponga de la pre-columna. Cambie el sentido del lavado y limpie la columna a la temperatura

ambiente 0.2 ml/minuto en un orden consecutivo:

(a) dos horas con una mezcla de 50% tetrahidrofurano (THF), 10% amoníaco y 40% agua. Por

favor, considere que algunos polímeros usados en HPLC no son resistentes al THF.

(b) 30 minutos con metanol puro.

(c) 30 minutos con la fase móvil para el equilibrio.

Control de Calidad

Para cada lote de muestras se utilizan los controles siguientes:

Estándares de la calibración

Los estándares de la calibración que empiezan con la concentración más baja se analizan al

principio de cada lote y la curva de calibración que resulta, se utiliza para cuantificar ese lote de

muestras. Al final de cada jornada un estándar del punto medio se debe analizar para supervisar

la desviación del instrumento. Los valores aceptables son el ± el 5% de la concentración

original.

Muestra en blanco:

El Puré de papas, en caso de los productos de la papa, tiene que ser analizadas con cada lote de

muestras.

20

Muestras con acrilamida agregada.

Puré de papas u otro material apropiado con acrilamida a un nivel adecuado para el alimento

bajo investigación, deben ser analizadas con cada lote de muestras.

Materiales de referencia

Materiales certificados de referencia.

Materiales de referencia del laboratorio

Las matrices o las muestras apropiadas de control con acrilamida agregada (spiked), se

recomiendan para el uso como materiales de referencia internos del laboratorio.

Carta de control

Los resultados para las muestras spiked, así como para los materiales de referencia del

laboratorio (CRM) respectivamente serán supervisados en cartas de control. Los resultados

aceptables deben ser dentro de los límites de 3 veces la desviación de estándar intermedia de la

reproducibilidad del método.

Duplicados

Cada muestra se debe medir por lo menos en duplicado. La diferencia absoluta entre valores de

replicas para una muestra dada, hechos por un operador, con un instrumento dentro del intervalo

de tiempo más corto, debe estar en 95 % de todos los casos dentro de la desviación de estándar

de la capacidad de repetición.

21

4.6CALCULO DE RESULTADOS

La identificación de los picos es confirmada por comparación de la razón de picos de áreas para

m/z 54/55, y 44/55 de las soluciones estándar.

La calibración se realiza con un estándar interno y este se aplica para la determinación de

acrilamida. Esta calibración nesecita de la determinación de un factor de respuesta Rf el cual se

define en la siguiente ecuación:

Rf = ASAA × C[d3]AA Ecuación 1 A[d3]AA × CSAA

Donde: ASAA Área del pico de acrilamida como trazas de masa MRM m/z 72/55 en los estándares de calibración. A[d3]AA Área del pico de acrilamida-D3 marcada como trazas de masa m/z 75/58. C[d3]AA Concentración de acrilamida-D3 de la solución estandar interno. CSAA Concentración de acrilamida de la solución de estandar de calibración.

Calcular para cada muestra el promedio de la cantidad de acrilamida que fue extraída (XAA), para

N número de replicas de muestra que fueron inyectadas usando la siguiente ecuación.

XAA = 1 1ΣN AAA × X[d3]AA Ecuación 2

N A[d3]AA × Rf

Donde: XAA Valor absoluto de la cantidad de acrilamida (ng) que fue extraída de la muestra. AAA Area del pico de acrilamida para transición 72/55 de la muestra. A[d3]AA Area del pico de acrilamida-D3 para la transición 75/58 de la muestra. X[d3]AA Valor absoluto de la cantidad de acrilamida-D3 (ng) agregado a la muestra.

22

Rf El factor de respuesta determinado por el análisis de los estandares de acrilamida y acrilamida-D3.

La concentración de acrilmida en la muestra Cm (µg/Kg) es obtenida de la ecuación 3.

Cm (µg/Kg) = XAA Ecuación 3 WS

Donde XAA Cantidad absoluta (ng) de acrilamida que fue extraida de la muestra. WS Peso de la muestra en gramos

23

5. RESULTADOS

Primeramente se comenzó con la revisión bibliográfica, para familiarizarse lo más posible con

este tema de gran importancia, como lo es la acrilamida y su estrecha relación con la

alimentación a nivel mundial, ya que afecta directamente la salud todos los consumidores, por su

condición de probable cancerigeno y causante de daños al sistema nervioso. Por otro lado

también se comienza con la búsqueda de referencias para la metodología analítica mas adecuada

para la cuantificación de acrilamida. Hecho esto se empieza a buscar los materiales y los equipos

necesarios para comenzar con los análisis de cuantificación por HPLC MS/MS. Se empieza a

trabajar en las preparaciones de soluciones patrones de acrilamida, tanto en al solución Standard

interno (acrilamida deuterada), como en el Standard de acrilamida de alta pureza (≤ 99 %).

Se comienza a trabajar con el equipo HPLC MS/MS de la Facultad de Ciencias Veterinarias y

Pecuarias, de la Universidad de Chile, en el Laboratorio de Farmacología con la Profesora Betty

San Martín. En este laboratorio se comienza con los primeros análisis de muestra. El equipo se

pone en marcha ajustando los parámetros para máxima respuesta en la señal de acrilamida con la

ayuda del Doctor Erik Petersson de la Universidad de Uppsala, Institute of Chemistry,

Department of Analytical Chemistry. Suecia y de la Agencia Nacional de Administración de

Alimentos Uppsala , Suecia.

24

DETERMINACION DE EXACTITUD Y PRECISION

5.1 EXACTITUD

La exactitud de un método analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos

mediante este método, y el valor verdadero. La exactitud de un método analítico debe

establecerse en todo su intervalo.

Se recomienda que se evalúe la exactitud utilizando un mínimo de nueve determinaciones sobre

un mínimo de tres niveles de concentración y tres determinaciones repetidas de cada

concentración.

Calculo de exactitud mediante comparación con material de referencia, aportado por la Agencia

Nacional de Administración de Alimentos, Uppsala, Suecia.

pool 1 487 409 -78 -16,02 43,2 2,6

pool 2 497 498 1 0,20 220 11

pool 3 638 674 36 5,64 94 7,5

SD CV %

Muestra Error absoluto

Error relativo(%)

Valor de referencia

(ppb)

Valor Cuantificado

(ppb)

n = 3

25

Recuperación determinada mediante experimentos con matriz en blanco enriquecida con

acrilamida y muestras reales.

Exactitud:

C1 = Concentración determinada en la muestra enriquecida.

C2 = Concentración determinada en el blanco.

C3 = Concentración utilizada para enriquecer.

Recuperación (%) = (C1- C2) / C3 x 100

Muestras Concentración

100 ppb Recuperación

(%) M1 97 97 M2 92 92 M3 97 97 M4 98 98 M5 100 100 M6 104 104 M7 94 94

Promedio 97,4 97,4

Concentración 500 ppb Recuperación (%)

M1 535 107 M2 510 102 M3 545 109 M4 495 99

Promedio 524 104,7

26

Criterios de funcionamiento y otros requisitos que deben cumplir los métodos cuantitativos de

análisis.

Veracidad de los métodos cuantitativos

En el caso de análisis repetido de un material de referencia certificado, los intervalos de

referencia de la desviación entre la fracción de la masa media determinada experimentalmente,

con corrector de recuperación, y el valor auténtico estarán dentro de los siguientes límites:

Veracidad mínima de los métodos cuantitativos

Fracción de masa Intervalo

≤ 1 µg/Kg > 1 µg/Kg a 10 µg/Kg

≥ 10 µg/Kg

-50% a + 20% -30% a +10% -20% a + 10%

Cuando no se dispone de tales CRM, se acepta una valoración de la veracidad de las mediciones

mediante recuperación de adiciones de cantidades conocidas de uno o varios analitos a una

matriz en blanco. Los datos corregidos mediante la recuperación media sólo son aceptables si

entran dentro de los intervalos expuestos en el cuadro anterior.

Los datos obtenidos de exactitud son aceptables según los criterios de aceptación, ya que se esta

dentro de los límites permitidos en el caso de materiales de referencia certificado, para masa

mayor igual a 10 µg/Kg se esta entre el -20% a +10%, siendo los valores para las muestras

entregadas pool 1, pool 2 y pool 3, son -16,02 %; 0,20 %; y 5,64% respectivamente. En el caso

de ensayos de recuperación también son aceptados, debido a que para una concentración de 100

ppb y 500 ppb se obtuvieron en promedio un 97,4% y 104,7% de recuperación respectivamente

lo que cae dentro del rango establecido en el recuadro anterior.

27

5.2 PRECISIÓN: REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el

método repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. La precisión de un

método analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar

relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La precisión puede ser una

medida del grado de reproducibilidad o repetibilidad del método analítico en condiciones

normales de operación. En este contexto, la reproducibilidad se refiere al uso del procedimiento

analítico en diferentes laboratorios, diferentes analistas, diferentes días, diferentes temperaturas,

etc. La repetibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un laboratorio

durante un periodo corto realizado por el mismo analista con el mismo equipo.

Para el análisis realizado bajo condiciones de repetibilidad, el coeficiente de variación intra-

laboratorio debe estar entre la mitad y dos tercios del valor, derivado de la ecuación modificada

de Horwitz.

Para los análisis realizados bajo condiciones intermedias de reproducibilidad (intra-laboratorio),

la desviación de estándar no será mayor que el valor derivado de la ecuación modificada de

Horwitz.

Por debajo de un contenido de la acrilamida de 120 µg/kilogramo, la desviación de estándar se

fija a 22 % del contenido de la acrilamida. Sobre ese valor, se calcula según la ecuación 4, que

incluye el promedio de la acrilamida contenido en la muestra respectiva, expresada como

cociente total sin dimensiones (1µg/kg ~1 ppb = 1.10-9).

σ: desviación estándar; : contenido promedio del analito (µg/kg).

28

Los ejemplos para la desviación de estándar modificada de Horwitz son:

El coeficiente de variación (CV), para el análisis repetido de un material de referencia o

enriquecido, en condiciones de reproducibilidad, no superará el nivel de cálculo mediante la

ecuación de Horwitz, a saber:

CV = 2 (1 – 0,5 log C)

Donde C es la fracción de masa expresada como potencia (exponente) de 10 (por ejemplo, 1

mg/g = 10-3 ). El cuadro siguiente recoge varios ejemplos.

CV de reproducibilidad de los métodos cuantitativos en un intervalo de fracciones de masa de

analito.

Fracción de masa CV de reproducibilidad (%)

1 µg/kg (*)

10 µg/kg (*)

100 µg/kg 23

1000 µg/kg 16

(*) Con fracciones de masa inferiores a 100 µg/kg, la aplicación de la ecuación de Horwitz

conduce a valores inaceptablemente elevados. Por ello, los coeficientes de variación de las

concentraciones inferiores a 100 µg/kg serán lo más bajo posible (Diario Oficial de las

Comunidades Europeas 17.8.2002).

Contenido promedio de acrilamida. Desviación Standard modificada por Horwitz

µg/kg µg/kg

100 22.0

200 40.8

500 88.8

1000 160.0

2000 288.2

29

Precisión del método: Repetibilidad intra-día

Concentración 100 ppb 500 ppb M1 97 535 M2 92 510 M3 97 554 M4 98 495

Promedio 96 524 Desviación estandar 2,7 26

C.V. (%) 2,8 5 Reproducibilidad Inter-día

Concentración 100 ppb M1 98 M2 103 M3 100

Promedio 100,3 Desviación estandar 2,52

C.V. (%) 2,51

En análisis realizados en condiciones de repetibilidad, los coeficientes de variación intra-

laboratorio suelen arrojar valores situados entre la mitad y dos tercios de los coeficientes de

variación (CV) entregados por la ecuación modificada de Horwitz, según este planteamiento los

resultados obtenidos para repetibilidad intra-laboratorio están dentro de lo indicado, con valores

de CV de 2,8%, para concentración de 100 ppb y 5 %, para 500 ppb.

Por otra parte, en análisis realizados en condiciones de reproducibilidad intra-laboratorio, los CV

no serán superiores a los CV entregados por la ecuación modificada de Horwitz. De los dicho

anteriormente la reproducibilidad intralaboratorio esta dentro de lo recomendado con un CV de

2,51% para 100 ppb.

30

Repetibilidad Intra-día Curva Calibración

Concentración agregada ng/g

Concentración promedio cuantificada ng/g

Desviación estándar

n CV %

0 <10

5 5,0 0,8 3 15,6

10 10,4 0,7 3 6,6

50 52,1 1,2 3 2,3

100 103,9 2,5 3 2,5

500 512,3 13,7 3 2,7

1000 1015,7 37,2 3 3,7

2000 2024,0 29,0 3 1,4

5000 4941,7 102,2 3 2,1 Reproducibilidad Inter-día Curva Calibración

Concentración agregada ng/g

Concentración promedio cuantificada ng/g

Desviación estándar

n CV %

0 <10

2 1,8 0,4 4 22

5 5,5 0,9 4 17

10 9 2 4 16

50 48 3 4 6

100 100 3 4 3

500 497 12 4 2

1000 1029 48 4 5

2000 1977 58 4 3

5000 5047 56 4 1 Las curvas de calibración con rango de 0 a 5000 ng/ml entregan coeficientes de correlación ≥

0.999 lo cual nos indica un buen resultado. Cuando se agregaron concentraciones conocidas a

muestras en blanco para la curva de calibración el coeficiente de variación fluctúa de 1,4 a 15,6

% en condiciones de repetibilidad Intra-dia y de 1 a 22% incondiciones Inter-día.

31

Reproducibilidad Inter-analista.

Analista 1 Analista 2 Analista 3 Concentración (ppb) 100 ppb 100 ppb 100 ppb

M1 97 92 97 M2 94 100 98 M3 104 97 98

Promedio 98 96 97 Desviación estandar 5,1 4 0.58

C.V. (%) 5,2 4,2 0,59 Resultado Analistas 98 96 97

Promedio 97 Desviación estandar 1

C.V. (%) 1 La reproducibilidad Inter-analista nos entrega un coeficiente de variación de 1% lo cual esta

dentro de lo recomendado por la ecuación de Horwitz.

32

5.3 ESPECIFICIDAD

Los documentos de Validación de Procedimientos Analíticos y el texto suplementario

Metodología, ambos de la Conferencia Internacional Tripartita Sobre Armonización (ICH) , que

tratan sobre procedimientos analíticos incluidos como parte de las solicitudes de registro

presentada en la UE, Japón y EE.UU. definen especificidad como la capacidad de evaluar de

manera inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta

previsible, como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. También

afirman que cuando se utilizan los procedimientos cromatográficos, deberán presentarse

cromatogramas representativos para demostrar el grado de selectividad y los picos deberán

identificarse adecuadamente. Las pruebas de pureza de picos (por ejemplo, utilizando redes de

iodos o espectrometría de masa) pueden resultar útiles para demostrar que el pico

cromatográfico del analito no puede atribuirse a más que un solo componente (USP 29).

33

Fragmentos para la confirmación de una molécula de acrilamida. Solo la transición m/z 72>55

muestra una intensidad relativamente alta mientras que las transiciones remanentes m/z 72>54,

72>44 y 72>27 muestran una intensidad relativa de aproximadamente 2%, 1% y 0.2%

respectivamente. Se sugiere que estas cuatro transiciones corresponden a la pérdida de amonio,

agua, eteno y formamida respectivamente, estos representas distintas partes de la molécula.

35

5.4 LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN.

Límite de detección:

Es una característica de las pruebas de límite. Es la cantidad mínima de analito en una muestra

que puede detectarse, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales

indicadas. Las pruebas de límite simplemente comprueban que la cantidad de analito se

encuentra por encima o por debajo de un nivel determinado. Se establece la concentración

mínima a la que puede cuantificarse confiablemente un analito. Una relación señal-ruido

habitualmente aceptable es de 2:1 o 3:1. El límite de detección generalmente se expresa en forma

de concentración de analito en la muestra.

Límite de cuantificación:

Es un a característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja

concentración en la matriz de una muestra. Es la mínima cantidad de analito en una muestra que

se puede determinar con precisión y exactitud aceptables en las condiciones experimentales

indicadas. Se establece la concentración mínima a la que puede cuantificarse confiablemente un

analito. Una relación señal-ruido habitualmente aceptable es de 10:1. El límite de cuantificación

generalmente se expresa en forma de concentración de analito en la muestra.

El límite de la detección (LOD) y el límite de la cuantificación (LOQ) para la acrilamida en

alimentos se pueden extrapolar del señal/ruido (S/N) obtenidos para las respuestas de las trazas

en el MRM m/z 72>55 y m/z 72>54 respectivamente 72> 44. El límite de la detección (S/N=3)

se espera que este entre 15 y 30 el µg/kg. Se espera que el límite de la cuantificación (S/N = 10)

este entre 40 y 70 el µg/kg .

Si LOQ se define como el nivel validado mas bajo con la recuperación y la precisión aceptables,

LOQ estara entre 2 y 5 el µg/kg para la transición m/z 72>55 según la tabla presentada en la

sección repetibilidad y reproducibilidad.

36

5.5 LINEALIDAD Y RANGO

La linealidad de un método analítico es su capacidad para obtener resultados de prueba que sean

proporcionales ya sea directamente, o por medio de una trasformación matemática definida, a la

concentración de analito en muestras en un intervalo dado. El rango es el intervalo entre los

niveles inferior y superior del analito, que han demostrado pueden ser determinados con un

adecuado nivel de precisión, exactitud y linealidad.

La curva de calibración debe ser lineal sobre el rango de concentraciones medidas. Compruebe

la homogeneidad de variaciones en el nivel de concentración bajo y alto del analito. Un

aceptable coeficiente de correlación (valor r2) es ≥ 0.99.

Concentarción agregada ng/g

0 5 10 50 100 500 1000 2000 5000

Curva Calibración Acrilamida

y = 0,0034x

R2 = 0,999

0,000

5,000

10,000

15,000

20,000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Concentración AA

Razón A

A/D

-AA

37

5.6 MUESTRAS REALES.

Con los parámetros de precisión y exactitud ya definidos se precedió a realizar análisis a

muestras reales.

Los niveles de acrilamida se cuantificaran en papas (variedad Panda) sometidas a pretratamiento

y papas control sin pretratamiento, antes del proceso de fritura con el objetivo de reducir el

contenido de acrilamida, en las papas que son pre-tratadas.

Estos pretratamiento se realizarán por Cristián Encina Ingeniero en alimentos que trabajara con

fritura al vacío en papas pre-tratadas y en papas control (sin pre-tratamiento). Y por José

Reinaldo Muñoz Ingeniero Agroindustrial que trabajara con fritura a temperatura ambiente en

papas pre-tratadas y en papas control (sin pre-tratamiento). También se trabajará con algunas

muestras obtenidas del mercado nacional preferentemente las de mayor consumo como por

ejemplo papas fritas Lays, papas fritas en tarro de marcas conocidas tales como Lays, Pringles y

Kryspo y otras del mercado internacional papas fritas Picadilli. Algunas de estas muestras serán

comparadas con laboratorios certificados como la Agencia Nacional de Alimentos, Uppsala,

Suecia y el Centro Nacional de Tecnología y Seguridad Alimentaria CNTA, Laboratorio del

Ebro.

38

Muestras de papas fritas chips elaboradas en laboratorio y su contenido de Acrilamida en ppb.

Acrilamida

Muestra ppb

SD CV

150 V N.D - -

160 V 2,1 0,5 6,3

170 V 5 1 5,5

150 N 6 2,5 11,1

160 N 5 2,1 21,8

170 N 29 0,7 0,6

150 CV 80 29,4 8,4

160 CV 218 8,6 1

170 CV 267 13,6 1,3

150 CN 87 24,4 7

160 CN 233 106,6 11,3

170 CN 760 121,7 4

El contenido de acrilamida en papas chips freídas al vacío y a presión atmosférica, con

pretratamientos, muestran un bajo contenido de Acrilamida (N.D.-29 ppb), mientras que las

papas fritas sin pretratamiento muestran un nivel mas elevado en su contenido de acrilamida (80-

760 ppb).

39

Contenido de acrilamida en papas fritas chips comerciales y algunos alimentos expresados en

ppb (µg/kg).

Muestras AA ppb SD CV % Galleta (Cookies) 76 22,6 7,7 Pan marraqueta ( white bread, no loaf) 21 9,7 11,9 Sopaipilla (fried product with mashed pupkin ) 36 7,1 5,1 Berlín (Fried Wheat dough) 22 4,6 5,6 Papas fritas Lays tarro lote 1 (pot.Crisps) 589 160,9 6,8 Papas fritas Lays tarro lote 2 545 124,4 5,7 Papas fritas Kryspo tarro lote1 (like Pringles) 164 48,1 7,3 Papas fritas Kryspo tarro lote 2 382 78,2 5,1 Papas fritas Pringles tarro lote 1 793 165,1 5,2 Papas fritas Pringles tarro lote 2 570 134,0 5,9 Papas fritas Lays artesanales (Pot.crisps) 828 140,8 4,3 Papas fritas Chips Limón (P.crisps lemon) 879 63,5 1,2 Papas fritas Picadilli 2159 765,8 8,9

El contenido de acrilamida en papas chips comerciales, muestran un contenido de acrilamida con

un rango de entre 164 ppb para papas fritas Kryspo tarro del lote 1, y 2159 ppb, para las papas

fritas Picadilli. Por otra parte, para otro tipo de alimentos como por ejemplo: Galletas, Pan

(marraqueta), Sopaipillas y Berlín el contenido de acrilamida fue muy bajo 76 ppb, 21 ppb , 36

ppb y 22 ppb respectivamente, en comparación con las papas fritas.

40

6. DISCUSIÓN

El objetivo principal de este trabajo fue el desarrollo de una metodología analítica para la

cuantificación de acrilamida en papas chips por HPLC MS/MS, que verificaría inequívocamente

la presencia de acrilamida en dichas papas. La elección de cromatografía liquida de alta

resolución (HPLC) se debe a las propiedades hidrofílicas de la acrilamida, y el detector de masa

(MS-MS), para un alto grado de verificación de las transiciones que podrían encontrarse.

Electrospray positivo probó ser el modo más sensible que presentaba el instrumento. Todos los

parámetros fueron optimizados para obtener como una posible gran señal al ión [M+1]+ en

solución acuosa. Las transiciones de los iones hijos con la más alta respuesta fueron

identificadas por escaner. Para cada transición la energía de colisión fue optimizada.

Solo la m/z transición 72>55 muestra una intensidad relativamente alta mientras que las

transiciones m/z remanentes 72>54, 72>44 y 72>27 muestran una intensidad relativa de

aproximadamente 2%, 1% y 0.2% respectivamente. Se sugiere que estas cuatro transiciones

corresponden a la pérdida de amonio, agua, eteno y formamida respectivamente, estos

representas distintas partes de la molécula. Esto fue comprobado por el hecho que la acrilamida

deuterada (CD2CDCONH2) entrega los correspondientes fragmentos m/z 75>58, 75>57,75>44 y

75>30, los cuales son optimizados en iguales colisiones de energía correspondientes a las

transiciones para la acrilamida.

Para propósitos de análisis de acrilamida en papas chips el instrumento fue utilizado en modo

MRM montado para registro de m/z 72>55, 72>54, 72>44, 72>72 y 72>58. Para la

cuantificación de acrilamida fue usada la razón m/z 55/58, y las concentraciones fueron

calculadas con una curva de estandards de calibración. Las curvas de calibración con rango de 0

a 5000 ng/ml entregan coeficientes de correlación ≥ 0.999 lo cual indica un buen resultado.

Cuando se agregaron concentraciones conocidas a muestras en blanco para la curva de

calibración el coeficiente de variación fluctuó de 1.4 a 15.6 % en condiciones de repetibilidad

Intra-dia y de 1 a 22% incondiciones Inter.-día. El límite de detección LOQ está entre 2 y 5 el

µg/kg para la transición m/z 72>55.

En análisis realizados en condiciones de repetibilidad, los coeficientes de variación intra-

laboratorio suelen arrojar valores situados entre la mitad y dos tercios de los coeficientes de

variación (CV) entregados por la ecuación modificada de Horwitz, según este planteamiento los

41

resultados obtenidos para repetibilidad intra-laboratorio están dentro de lo indicado, con valores

de CV de 2,8%, para concentración de 100 ppb y 5 %, para 500 ppb.

Por otra parte, en análisis realizados en condiciones de reproducibilidad intra-laboratorio, los CV

no serán superiores a los CV entregados por la ecuación modificada de Horwitz. De los dicho

anteriormente la reproducibilidad intra-laboratorio esta dentro de lo recomendado con un CV de

2,51% para 100 ppb.

La reproducibilidad Inter-analista entrega un coeficiente de variación de 1% lo cual esta dentro

de lo recomendado por la ecuación de Horwitz.

Finalmente las muestras reales a las que se les cuantificaron el contenido de acrilamida, dieron

resultados acorde a los datos que se encuentran en la literatura.

42

7. CONCLUSION

En conclusión se puede decir que se logró una respuesta total a los objetivos planteados siendo

Implementado en el Centro de Investigación y Desarrollo en Grasas y Aceites (CIDGRA),


Químicas y Farmaceúticas de la Universidad de Chile, la metodología analítica para la

extracción de acrilamida en papas chips y su cuantificación por HPLC MS/MS. Se determino

con éxito la precisión y exactitud y se aplicó la metodología para el análisis de papas fritas chips

comerciales y elaborados en el laboratorio dentro del Proyecto Heatox 506820.

43

8. BIBLIOGRAFIA

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9. ANEXOS

Anexo Nº 1: Abreviaturas empleadas.

Muestra Significado

150 V 150º C con pretratamiento al vacío



150 N 150º C con pretratamiento temperatura ambiente



150 CV 150º C sin pretratamiento al vacío (control vacío)



150 CN 150º C sin pretratamiento temperatura ambiente (control TA)



150 VS 150º C con pretratamiento al vacío mas spiked



150 NS 150º C con pretratamiento temperatura ambiente mas spiked



150 CVS 150º C sin pretratamiento al vacío (control vacío) mas spiked



150 CNS 150º C sin pretratamiento temperatura ambiente (control TA) mas spiked



Puré Puré de papas utilizado como blanco

Puré S Puré de papas utilizado como blanco mas spiked

Lays Control en el mercado

Lays S Control en el mercado mas spiked

Spiked Estándar de acrilamida agregado con concentración conocida

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Anexo Nº 5: Análisis muestras 22 de Noviembre 2006

Muestra Spiked ug/kg n AA ppb SD CV % Puré 0ml/g 3 Puré S 100ml/g 3 103,6 16,5 4,0 150 V 0ml/g 3 1,3 2,2 43,1 160 V 0ml/g 3 2,1 0,5 6,3 170 V 0ml/g 3 4,5 1,0 5,5 150 N 0ml/g 3 5,7 2,5 11,1 160 N 0ml/g 3 2,4 2,1 21,8 170 N 0ml/g 3 28,8 0,7 0,6 150 CV 0ml/g 3 80,0 29,4 8,4 160 CV 0ml/g 3 218,0 8,6 1,0 170 CV 0ml/g 3 267,2 13,6 1,3 150 CN 0ml/g 3 87 24,4 7 160 CN 0ml/g 3 233 106,6 11.3 170 CN 0ml/g 3 763,9 121,7 4,0 150 TV S 100ml/g 3 96,2 1,4 0,4 160 TV S 100ml/g 3 101,3 170 TV S 100ml/g 3 103,2 1,2 0,3 150 TN S 100ml/g 3 104,9 14,8 3,5 160 TN S 100ml/g 3 96,6 11,0 2,9 170 TN S 100ml/g 3 125,2 2,2 0,4 150 CV S 100ml/g 3 178,5 0,0 0,0 160 CV S 100ml/g 3 321,9 40,7 3,2 170 CV S 100ml/g 3 377,1 27,9 1,9 150 CN S 100ml/g 3 594,8 44,6 1,9 160 CN S 100ml/g 3 663,9 45,3 1,7 170 CN S 100ml/g 3 891,6 150,1 4,2 Crisp 118 0ml/g 3 34,9 24,6 17,6 Crisp 118 S 100ml/g 3 129,9 4,4 0,8 Crisp 125 0ml/g 3 286,1 40,0 3,5 Crisp 125 S 100ml/g 3 372,6 38,8 2,6 Picadilli 0ml/g 3 2018,1 90,4 1,1 Picadilli S 100ml/g 3 2023,7 102,7 1,3

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Anexo Nº 6: Análisis muestras 07 de Agosto 2007

Muestras Spiked ug/kg n AA ppb SD CV%

Puré (Mashed Potatoe) 4 2,8 3,8 33,8 Puré Spiked 100 4 107,9 36,8 8,5 Galleta (Cookies) 4 73,2 22,6 7,7 Galleta Spiked 100 4 178,9 33,7 4,7 Pan marraqueta ( white bread, no loaf) 4 20,3 9,7 11,9 Pan marraqueta Spiked 100 4 121,3 27,8 5,7 Sopaipilla(fried product with mashedpupkin) 4 35,2 7,1 5,1 Sopaipilla Spiked 100 4 136,3 27,4 5,0 Berlín (Fried Wheat dough) 4 20,5 4,6 5,6 Berlín Spiked 100 4 124,5 23,7 4,8 Papas fritas Lays tarro lote 1 (pot.Crisps) 4 589,3 160,9 6,8 Papas fritas Lays tarro lote 1 Spiked 250 4 810,1 229,3 7,1 Papas fritas Lays tarro lote 2 4 545,7 124,4 5,7 Papas fritas Lays tarro lote 2 Spiked 250 4 788,6 253,0 8,0 Papas fritas Kryspo tarro lote1 (like Pringles) 4 164,5 48,1 7,3 Papas fritas Kryspo tarro lote1 Spiked 250 4 421,2 79,3 4,7 Papas fritas Kryspo tarro lote 2 4 382,2 78,2 5,1 Papas fritas Kryspo tarro lote 2 Spiked 250 4 616,9 145,0 5,9 Papas fritas Pringles tarro lote 1 4 793,2 165,1 5,2 Papas fritas Pringles tarro lote 1 Spiked 250 4 1045,3 212,5 5,1 Papas fritas Pringles tarro lote 2 4 570,1 134,0 5,9 Papas fritas Pringles tarro lote 2 Spiked 250 4 784,1 283,4 9,0 Papas fritas Lays artesanales (Pot.crisps) 4 828,1 140,8 4,3 Papas fritas Lays artesanales Spiked 500 4 1313,4 230,8 4,4 Papas fritas Chips Limón (P.crisps lemon) 4 879,4 205,5 5,8 Papas fritas Chips Limón Spiked 500 4 1298,0 63,5 1,2 Papas fritas Pool 1 (P.crisps pool) 4 408,8 43,2 2,6 Papas fritas Pool 1 Spiked 500 4 888,3 263,8 7,4 Papas fritas Pool 2 4 497,9 220,0 11,0 Papas fritas Pool 2 Spiked 500 4 970,2 237,0 6,1 Papas fritas Pool 3 4 315,0 94,2 7,5 Papas fritas Pool 3 Spiked 500 4 827,2 132,9 4,0 Papas fritas Picadilli 4 2159,3 765,8 8,9 Papas fritas Picadilli Spiked 2000 4 3934,7 997,4 6,3

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