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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS DESARROLLO TEMPORAL DE LOS CAMBIOS MORFOFUNCIONALES EN EL AUTOTRANSPLANTE DE TEJIDO PAROTÍDEO COLOCADO EN EL LUGAR DE LA HIPÓFISIS EXTIRPADA EN RATAS: ESTUDIO DE LAS GLÁNDULAS ENDOCRINAS. PRESENTA M. en C. María Dolores Álvarez Rodríguez Tesis para obtener el Grado de Doctor en Ciencias Fisiológicas Especialidad Fisiología ASESOR: Dr. Ramón Álvarez-Buylla de Aldana† COASESORES: Dr. Sergio Adrián Montero Cruz, Biol. Elena Roces de Álvarez Buylla. Colima, Col., Septiembre de 2005
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
DESARROLLO TEMPORAL DE LOS CAMBIOS MORFOFUNCIONALES
EN EL AUTOTRANSPLANTE DE TEJIDO PAROTÍDEO COLOCADO EN
EL LUGAR DE LA HIPÓFISIS EXTIRPADA EN RATAS:
ESTUDIO DE LAS GLÁNDULAS ENDOCRINAS.
PRESENTA
M. en C. María Dolores Álvarez Rodríguez
Tesis para obtener el Grado de Doctor en Ciencias Fisiológicas
Especialidad Fisiología
ASESOR:
Dr. Ramón Álvarez-Buylla de Aldana†
COASESORES:
Dr. Sergio Adrián Montero Cruz, Biol. Elena Roces de Álvarez Buylla.
Colima, Col., Septiembre de 2005
ii
ÍNDICE
Contenido Página
ABREVIATURAS
RESUMEN 1
ABSTRACT 3
INTRODUCCIÓN 5
Consideraciones generales y antecedentes 5
Relaciones funcionales entre el hipotálamo y la hipófisis 26
Efectos de la hipofisectomía 29
Substitución de la hipófisis por otras glándulas 32
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 36
HIPÓTESIS 39
OBJETIVO GENERAL 39
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 39
METODOLOGÍA 41
Animales y técnicas quirúrgicas generales 41
Procedimientos bioquímicos 46
Inmunohistoquímica 47
Protocolo experimental 48
Análisis estadístico 49
RESULTADOS 51
DISCUSIÓN 62
CONCLUSIONES 71
PERSPECTIVAS 72
BIBLIOGRAFÍA 73
iii
ÍNDICE DE TABLA Y FIGURAS
Contenido Pág.
Figura 1.-Diagrama de un corte sagital de hipófisis. 6
Figura 2.- Diagrama del tracto hipotálamo-hipofisiario. 7
Figura 3.- Esquema de la red vascular de la hipófisis. 9
Figura 4.- Diagrama de un corte sagital medio del hipotálamo/hipófisis. 10
Figura 5.- Fotomicrografía de hipotálamo/hipófisis (irrigación portal). 11
Figura 6.- Fotomontaje del flujo axoplásmico (tallo hipofisiario). 12
Figura 7.- Esquema del desarrollo embrionario de la hipófisis. 14
Figura 8.- Esquema de la hipófisis (tipos celulares). 15
Figura 9.- Diagrama de las interrelaciones entre SNC y sistema endocrino. 23
Figura 10.- Diagrama base del cráneo en la rata para trepanación. 43
Figura 11.- Fotomicrografía de la hipofisectomía en rata. 44
Figura 12.- Fotomicrografía del transplante de parótida en rata. 45
Figura 13.- Esquema del protocolo experimental. 50
Figura 14.- Comparación del tiempo de sobreviva y del peso corporal. 52
Figura 15.- Valor estrogénico. 53
Figura 16.- Pesos de los órganos blanco. 54
Figura 17.- Suprarrenal (histología). 59
Figura 18.-Tiroides (histología). 59
Figura 19.- Ovario (histología). 60
Figura 20.- Inmunohistoquímica del transplante (anti-LH). 61
Figura 21.- Inmunohistoquímica del transplante (anti-PRL). 61
Tabla 1.- Células de la adenohipófisis. 16
Tabla 2.- Hormonas hipofisiarias. 22
Tabla 3.- Hormonas liberadoras e inhibidoras hipotalámicas. 28
Tabla 4.-Concentración de hormonas dependientes de hipófisis. 55
Tabla 5.-Concentración de LH en plasma después de LHRH. 56
Tabla 6.-Concentración de TSH en plasma después de TRH. 57
Tabla 7.- Contenido de hormonas hipofisiarias en tejido. 57
iv
Este trabajo de tesis fue realizado en el laboratorio de
Neuroendocrinología del Centro Universitario de Investigaciones
Biomédicas de la Universidad de Colima, con el apoyo del Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT): 110164.
Beca de Ayudante de Investigador Nivel III: 862.
Premio y reconocimiento “Peña Colarada” en el Doctorado en Ciencias Fisiológicas
Colima, Col., 9 de Octubre de 1998.
Resultados preliminares de la tesis se han presentado en los siguientes congresos o
foros:
“Técnica de hipofisectomía en rata”, XX Jornadas de Investigación Biomédica de
Occidente, IMSS, Guadalajara, Jal., 18 al 22 de Noviembre 1996.
“La técnica de hipofisectomía en la rata”, 2da. Reunión Anual de Investigación
Quirúrgica en el Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS, Guadalajara, Jal.,
12 de Diciembre 1997.
“La técnica de hipofisectomía en rata”, Ciencias y Tecnología Jalisco 99, Cámara de
Comercio de Guadalajara, Jal, Mayo 1999.
“Desarrollo temporal de los cambios morfofuncionales en el autotransplante de tejido
parotídeo que substituye a la hipófisis extirpada en ratas: estudio de las glándulas
endocrinas”, Foro Universitario de Ciencias y Tecnología, Colima, Col, 4 á 5 de Diciembre
2003.
“Desarrollo temporal de los cambios morfofuncionales en el autotransplante de tejido
parotídeo que substituye a la hipófisis extirpada en ratas: estudio de las glándulas
endocrinas”, XX Congreso Nacional de Anatomía, Guadalajara, Jal., 18 de Octubre 2004.
v
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Colima a través del Centro Universitario de Investigaciones
Biomédicas por abrirme las puertas para poder realizar mis estudios de postgrado.
En forma muy especial, al Dr. en C. Ramón Álvarez-Buylla por aceptarme como su
alumna y enseñarme sus valiosos conocimientos. Por compartir conmigo una de sus líneas
de investigación, tener la paciencia de enseñarme y guiarme. Por ser mi tutor y amigo. Mil
gracias por sus enseñanzas, siempre estarán conmigo.
Al Dr. en C Sergio Adrián Montero Cruz y a la Biol. Elena Roces de Álvarez-Buylla por
su valiosa ayuda y colaboración. Por sus enseñanzas y amistad.
A la M. en C. Mónica Lemus Vidal por su gran apoyo y ayuda técnica.
Al Dr. Jesús Tresguerres del Departamento de Fisiología Médica y Centro de Cultivo
de Tejidos, Universidad Complutense de Madrid, España, por la implementación de las
técnicas de radioinmunoensayo e inmunohistoquímica, y al Dr. A. F. Parlow por la donación
de anticuerpos anti-LH ovino (NIDDK-anti-oBetaLH-IC-1) y anti-PRL de rata (NIDDK-anti-
rPRL-IC-4ETC).
vi
DEDICATORIA
A mis Padres por enseñarme el camino de la superación.
A mi Esposo Gustavo Adolfo por estar a mi lado en todo momento.
A mis Hijos Gustavo Adolfo y Guillermo Antonio por ser quienes me impulsan a seguir
adelante.
vii
ABREVIATURAS
A: Glándula adrenal
a/ß-MSH: Hormona estimulante de los melanocitos
ACTH: Hormona adrenocorticotropa
AHI: Arterias hipofisiarias inferiores
AHS: Arterias hipofisiarias superiores
AMPc: Monofosfato cíclico de adenosina
AVP/ADH: Arginina-vasopresina/Hormona antidiurética
B: Basal antes de estimular con factores liberadores
ß-LPH: Hormona lipoprotéica
bo: Hueso occipital
CORTICOST.: Corticosterona
CRH: Hormona liberadora de corticotropina
C.S.: Centros superiores
E.: Después de la estimulación con factores liberadores
EGF: Factor de crecimiento epidermal
EM: Eminencia media
ESTROG.: Estrógenos
Fig.: Figura
FITC: Fluoresceína-isotiocianato
FSH: Hormona folículo estimulante
G: Gonadas
GH: Hormona del crecimiento
GHRH: Hormona liberadora de la hormona del crecimiento
GIH: Hormona inhibidora de hormona del crecimiento
GnRH.: Hormona liberadora de gonadotropinas
H.: Hueso
h: horas
H.A.: Hipófisis anterior
H-E: Hematoxilina-Eosina
H.P.: Hipófisis posterior
viii
HIPOX: Hipofisectomizadas
HT: Hipotálamo
IGF-1: Factor de crecimiento semejante a la insulina
im: Intramuscular
ip: Intraperitoneal
iv: Intravenoso
LH: Hormona luteinizante
LHRH: Hormona liberadora de LH
M.: Músculo
MSH: Hormona estimulante de los melanocitos
N.E.: Nervio esplácnico
NGF: Factor de crecimiento nervioso
NPV: Núcleo paravaentricular
NSO: Núcleo supraóptico
OX/OT: Oxitocina/Hormona oxitócica
P: Proceso
PAROT: Glándula parótida in situ
PAS: Ácido Periódico de Schiff
PBS: Tampón de fosfatos
P.D: Pars distalis
PE: Prosencéfalo
PIH: Hormona inhibidora de PRL
PM: Peso molecular
PNB-BSA: Tampón con sueroalbúmina bovino
POMC: Proopiomelanocortina
PRH : Hormona liberadora de prolactina
PRL: Prolactina
P.T: Pars tuberalis
P.V: Vasos portales
RIA: Radioinmunoensayo
S: Sincondrosis
sc: Subcutánea
ix
sem: Semana/s
SN: Sistema nervioso
SNC: Sistema nervioso central
S.O.H: Tracto supraóptico hipofisiario
SS/GIH: Somatostatina/Hormona inhibidora de la hormona de crecimiento
T: Tiroides
T.H: Tallo o tracto hipofisiario
TRANSP: Con transplante
TRH: Hormona liberadora de TSH
TSH: Hormona tirotrófica
TTH: tracto tubero-hipofisiario
T3/T4: Hormonas tiroideas
VE: Valor estrogénico
VIP: Péptido intestinal vasoactivo
VPC: Vasos portales cortos
VPL: Vasos portales largos
1
RESUMEN
La hipófisis, de origen ectodérmico, sintetiza, almacena y secreta
hormonas que regulan las funciones de las glándulas blanco, vitales para la
sobrevida del organismo. Durante el desarrollo, las células se diferencían en
relación con el medio en que se encuentran, por la presencia de una serie de
agentes inductores externos que controlan el ADN en cada tejido. Álvarez-
Buylla y cols. (1970, 1974) sugieren una posible transformación morfofuncional
del tejido de la glándula parótida localizado en la silla turca de perros jóvenes
hipofisectomizados (TRANSP). En este estudio, amplíamos el conocimiento
sobre la posibilidad de transformar un tejido glandular exocrino en otro de tipo
endocrino, bajo la acción de las hormonas procedentes del hipotálamo,
realizando el análisis temporal de los cambios morfofuncionales en las
glándulas blanco (dependientes de la hipófisis) en ratas. En los tiempos
postquirúrgicos más prolongados, el transplante de parótida incrementó el peso
y la sobrevida de los animales hipofisectomizados sin transplante (HIPOX),
coincidiendo con una recuperación de los niveles de corticosterona y hormonas
tiroideas. El peso de las suprarrenales, tiroides y gónadas fue siempre mayor
en las ratas TRANSP en comparación con la ratas HIPOX sin alcanzar los
niveles de las ratas CONTROL. En las ratas TRANSP aumentaron los índices
estrogénicos con presencia de ciclos estrales, detectándose LH y PRL en el
tejido transplantado cuando se comparó con tejidos parotídeos controles (antes
del transplante-inmunohistoquímica); la estimulación con LHRH y TRH en las
ratas TRANSP aumentó los niveles de estrógenos, LH y TSH. Concluimos que
el transplante de parótida, adquirió parcialmente las funciones de la hipófisis.
2
ABSTRACT
The pituitary gland, that has an ectodermal origin, synthesizes, stores and
releases hormones to regulate target glands functions, vital for organism‟s life.
Environmental factors, that control DNA in each tissue, are crucial for cellular
differentiation during development. Early work by Álvarez-Buylla et al. (1970,
1974) suggest that an autotransplant of parotid tissue to the sella turcica in
young dogs after hypophysectomy (TRANSP), led to a partial morphofunctional
transformation of the parotid tissue. Our primary aim in this thesis was to
extend our knowledge about the possibility of transforming an exocrine tissue
into an endocrine one under the influence of hypothalamic hormones in rats.
When a temporal study was performed on target glands (pituitary dependent),
body weight and survival time increased in TRANSP group compared to
hypophysectomized rats without transplant (HIPOX), coinciding with longer
postoperation studies. Adrenal, thyroid and gonadal weight was always higher
in TRANSP group in relation to HIPOX group, without reaching CONTROLl
rat‟s values. The estrogenic value was also higher in TRANSP rats that
showed estral cycles. LH and PRL in parotid transplanted tissue were higher
than in control parotid (before grafting-immunohistochemistry): in the same
way, LHRH and TRH stimulation in TRANSP rats increased estrogen, LH and
TSH levels. We conclude that the parotid transplant, partially acquires the
pituitary function.
3
INTRODUCCIÓN
Consideraciones generales y antecedentes
Hipófisis-anatomía
La hipófisis o glándula pituitaria es un órgano endocrino que
desempeña funciones vitales en los vertebrados: regula el crecimiento, el
metabolismo de hidratos de carbono, grasas y proteínas, así como el desarrollo
y mantenimiento morfo-funcional de las principales glándulas de secreción
interna; además actúa en el mecanismo de control de la diuresis, el parto y la
lactancia. El sistema nervioso (SN), a través del hipotálamo, regula la actividad
hipofisiaria y por lo tanto el resto de las funciones endocrinas (Houssay, 1936;
Guillemin, 2005). La hipófisis es una estructura compleja situada en la base del
cráneo, dentro de una cavidad del hueso esfenoides o silla turca. En la rata no
hay una silla turca propiamente dicha, sin embargo, la hipófisis se aloja en una
pequeña concavidad del esfenoides, separada del cerebro por una deflexión de
la duramadre o diafragma selar, a través del cual pasa el tallo hipofisiario con
sus respectivos vasos sanguíneos para llegar al cuerpo principal de la glándula
(Donald, 1990).
En una rata adulta, de 300 g de peso corporal, la hipófisis mide
3.5x5.5x1 mm y tiene un peso aproximado de 12 mg en el macho y 14 mg en la
hembra. El peso de esta glándula varía con la edad y con la actividad
fisiológica, aumenta durante el embrazo. La hipófisis está formada anatómica,
histológica y funcionalemente por dos partes distintas: una anterior o
adenohipófisis, y una posterior o neurohipófisis. La adenohipófisis está formada
por la pars distalis, pars tuberalis y pars intermedia, y corresponde al 89 % del
peso total. La neurohipófisis está formada por la eminencia media, el
infundíbulo (superior e inferior) y la pars nervosa, y corresponde al 11% del
4
peso total (Fig. 1), (Rioch, Wislocki y O'Leary, 1940; Harris, 1955; Fawcett,
1994).
La glándula pituitaria está conectada al hipotálamo por el tallo
hipofisiario, que en algunas especies como el humano y la rata, es bastante
largo. Está formado por los tractos supraóptico-hipofisiario y tubero-hipofisiario,
que contienen, tanto los axones de los cuerpos neuronales del hipotálamo, como
los vasos sanguíneos (Fig. 2). Don Santiago Ramón y Cajal (Ramón y Cajal,
1894) describió por primera vez las fibras nerviosas que van del hipotálamo a la
hipófisis y les asigna una función sensora; posteriormente, otros investigadores
(Bargman, 1954; Scharrer y Scharrer, 1954; Harris 1955, Guillemin, 2005)
analizaron, detenidamente, la relación del sistema nervioso central (SNC) con la
hipófisis y desde aquí a los órganos blanco describiendo el tracto hipotálamo
hipofisiario.
Figura 1.- Diagrama de un corte sagital de la hipófisis en la rata. (Modificado de Harris,
1955).
Hipotálamo
5
El hipotálamo es una de las regiones más primitivas del cerebro, y ejerce
un papel dominante para dirigir las reacciones somáticas y vegetativas que
mantienen la homeostasis. Es difícil pensar en cualquier función del organismo
que no sea dependiente, directa o indirectamente, del hipotálamo.
Figura 2.- Diagrama que ilustra el tracto hipotálamo-hipofisiario, y sus relaciones con algunas estructuras nerviosas. Las fibras nerviosas penetran a la pars tuberalis y a la pars intermedia. S.O.H., tracto supraóptico-hipofisiario; T.T.H., tracto tubero-hipofisiario. (Modificado de Harris, 1955).
Desde el punto de vista anatómico, la hipófisis está relacionada no
sólo con el hipotálamo sino con otras estructuras importantes, como el área
preóptica, los cuerpos mamilares, el tercer ventrículo, el seno esfenoidal y el
seno cavernoso, a través del cual pasan los pares 3, 4 y 6 de nervios craneales,
y la eminencia media (parte superior del tallo pituitario). Las funciones de la
hipófisis dependen, principalmente, de sus relaciones con el área hipofisiotrópica
del hipotálamo, y están estrechamente vinculadas con su circulación (Daniel y
T.T.H.
6
Prichard, 1956). El aporte sanguíneo, tanto del hipotálamo como de la hipófisis
procede en un 90% de las carótidas internas a través de las arterias hipofisiarias
superiores e inferiores y de la arteria comunicante posterior del círculo de Willis,
que también irrigan a la eminencia media, a la porción superior del tallo
infundibular y a la base de éste (Fig. 3). En la rata, la mayor parte de la sangre
que llega a la adenohipófisis procede de las arterias hipofisiarias superiores que
se ramifican en capilares en el tallo pituitario, y en la eminencia media para
formar amplias zonas de capilares con amplias cavidades, áreas dilatadas y
curso onduloso, conocidas como sinusoides o gomitolos (Figs. 3 y 4). Es decir,
el lóbulo anterior de la hipófisis o adenohipófisis, recibe su irrigación de las
mismas arterias que irrigan antes a la eminencia media y el tallo infundibular
(plexo primario). Estos capilares drenan en senos venosos y finalmente en
venas paralelas para formar los vasos portales largos, que viajan a lo largo del
tallo y terminan en redes capilares secundarias rodeando a los sinusoides entre
las células epiteliales de la adenohipófisis (plexo secundario), y proporcionan
más del 50 % del aporte sanguíneo (Fig. 4 y 5) (Harris, 1955; Adams, Daniels y
Prichard, 1963). Estas arteriolas terminales, rodeadas por una densa red
capilar, modulan la circulación sanguínea en el lóbulo anterior de la hipófisis, y
controlan la entrada de las hormonas reguladoras hipotalámicas (Fawcett, 1994).
Virtualmente, todas las aferencias vasculares de la hipófisis anterior han estado,
primero, en contacto con el área hipotalámica de la eminencia media. El sistema
vascular descrito o sistema portal hipofisiario, es muy característico y particular
de la hipófisis. Constituye la vía para que los productos de neurosecreción
(neuropéptidos hipotalámicos) liberados por terminaciones nerviosas en la
eminencia media y el tallo infundibular, lleguen a las células de la pars distalis, y
sean factores determinantes de los cambios que convierten el epitelio faríngeo
en primordio de la adenohipófisis (Dawson, 1948; Pateels, 1960; Álvarez-Buylla
y Álvarez-Buylla, 1963). El flujo sanguíneo puede invertirse dentro de este
sistema porta-hipofisiario, con lo que se establece una vía de retrocontrol
(“feedback”) entre los diversos componentes endocrinos de la hipófisis y el SNC,
con implicaciones funcionales importantes (Thorner, Vance, Horvath y Kovacs,
7
1992). Dentro de la circulación portal existen también vasos portales cortos que
conectan directamente desde el plexo primario hasta el lóbulo anterior de la
hipófisis, y contribuyen a la circulación de la hipófisis anterior sólo en una
péqueña parte, adyacente a la parte inferior del infundíbulo (Popa y Fielding,
1930). Greep (1963) bautiza al sistema portal como la “vía final común” hacia la
adenohipófisis.
Figura 3.- Representación esquemática de la red vascular de la hipófisis, y su relación con la eminencia media del hipotálamo. El plexo capilar primario termina en los vasos portales largos, que se distribuyen en el parénquima de la adenohipófisis en el plexo secundario. AHI, arteria hipofisiaria inferior; AHS, arteria hipofisiaria superior; EM, eminencia media; VPC, vasos portales cortos; VPL, vasos portales largos; TH, tallo hipofisiario. (Modificado de Krieger y Hughes,1980).
Plexo secundario Trabecula de la
arteria
Trabecula de la
Plexo primario
EM
TH VPL
Tra
bec
ula
de
la
arte
ria Trabecula de la
AHS
VPC
AHI
Trab
ecul
a de
la
arter
ia Trabecula de la
8
El endotelio, que reviste a los senos hipofisiarios, deja un espacio
entre la membrana basal y las células parenquimatosas, donde los gránulos
descargan sus secreciones antes de su entrada a los sinusoides.
Figura 4.- Diagrama de un corte sagital en la línea media del hipotálamo y la hipófisis en la rata. Nótese la disposición del tallo pituitario con los vasos portales y el plexo secundario en la pars distalis. (Modificado de Harris, 1955).
El aporte sanguíneo de la neurohipófisis se realiza por la arteria
hipofisiaria inferior (Fig. 3); y el drenaje venoso sale a través de los senos
cavernosos adyacentes para desembocar en las dos venas yugulares. Es
importante señalar que los vasos portales hipofisiarios tienen una gran
capacidad de regeneración después de la sección del tallo. Veinticuatro a 48 h
después de la sección del tallo pituitario en la rata, se observa el crecimiento de
axones y vasos sanguíneos que parten del hipotálamo (Harris y Jacobsohn,
1950; Álvarez-Buylla, Livett, Uttenthal, Hope y Milton, 1973).
A pesar de su proximidad con el cerebro, el lóbulo anterior de la
hipófisis casi no presenta inervación directa, salvo escasas fibras simpáticas que
Plexo secundario
en adenohipófisis
9
entran a la hipófisis con los vasos sanguíneos, y no participan en la regulación
de la síntesis y liberación hormonal (Thorner y col., 1992). Por el contrario, el
lóbulo posterior de la hipófisis recibe una rica inervación procedente de los
núcleos supraóptico (NSO) y paraventricular (NPV) y otras áreas hipotalámicas
(Fig. 2). La influencia de esas fibras no sólo se ejerce sobre el lóbulo posterior,
sino también sobre el lóbulo anterior por el flujo axoplásmico (Álvarez-Buylla y
col., 1973) (Fig. 6) de hormonas hipotalámicas como la vasopresina (AVP) y la
oxitocina (OX) para, posteriormente, ser liberadas a la circulación periférica. La
estructura y función de la neurohipófisis depende de esta inervación portal, por
lo que la interrupción de la misma, atrofia el lóbulo posterior (Álvarez-Buylla y
col., 1973) con las consecuencias fisiológicas correspondientes (v. gr. diabetes
insípida).
Figura 5.- Fotomicrografía de un corte horizontal a través del hipotálamo y la hipófisis en la rata. Los vasos sanguíneos se inyectaron con tinta china. 15 X. Los vasos portales corren de la pars tuberalis y la eminencia media, a lo largo de la superficie ventral del tallo infundibular, hasta la pars distalis. A, pequeñas asas arteriales llegando a la pars tuberalis; P.D., pars distalis; P.T. pars tuberalis; P.V., vasos portales. (Modificado de Harris, 1955).
10
Figura 6.- Fotomontaje que muestra el flujo axoplásmico de neurofisinas (fluorescencia) acarreadoras de hormonas neurohipofisiarias en el tallo pituitario, desde los núcleos hipotalámicos hasta el lóbulo posterior de la hipófisis. Las flechas marcan el lugar de constricción del tallo, 20 h después de la operación. (Modificado de Álvarez-Buylla y col., 1973).
Hipófisis-embriología
Hasta hace unos años, se pensaba que el origen embriológico de
cualquier glándula endocrina era determinante para su función en la edad adulta.
Es decir, el origen de las células endocrinas (endodermo, mesodermo y
ectodermo) proporcionaría los detalles estructurales de la glándula adulta y por
tanto de su funcionamiento. Trabajos recientes (Filip, English y Mokry, 2004)
plantean la posibilidad de producir un gran espectro de tipos celulares,
11
partiendo, bajo ciertas condiciones, de células madre del mismo origen
embriológico.
El mejor ejemplo de “un tejido-una función”, lo constituye la hipófisis,
glándula de origen ectodérmico que se forma a partir de dos fuentes
embriológicamente diferentes: un crecimiento anterior del techo ectodérmico del
estomodeo (cavidad bucal primitiva) o bolsa de Rathke, y una evaginación del
neuroectodermo del diencéfalo. Este doble origen embrionario explica por qué
la hipófisis está compuesta de dos tejidos distintos. La adenohipófisis (porción
glandular) que proviene del ectodermo bucal, y la neurohipófisis (porción
nerviosa) con el tallo pituitario que se originan del neuroectodermo (Moore,
1995).
El desarrollo de la hipófisis en la rata comienza en los días 10-11
prenatales, cuando el infundíbulo aparece como una depresión en el piso del
prosencéfalo, y la bolsa de Rathke apenas comienza a crecer; en los días 11 y
12 prenatal (Fig. 7A), esta bolsa se alarga, presenta una constricción en la
inserción del epitelio bucal y entra en contacto con el infundíbulo (Beaudoin,
1980). El tallo de la bolsa de Rathke pasa entre los centros de condrificación de
los huesos preesfenoides y basiesfenoides del cráneo para, posteriormente,
unirse a la bolsa de Rathke. La comunicación con la cavidad bucal degenera y
desaparece (Moore, 1995) (Fig. 7B). Durante el desarrollo subsecuente, las
células de la pared anterior de la bolsa de Rathke proliferan activamente y dan
origen a la parte distal de la hipófisis, el tejido alrededor del tallo infundibular
crece para dar lugar a la pars tuberalis (Fig. 7C). La extensa proliferación de la
pared anterior de la bolsa de Rathke reduce su luz hasta quedar como una
hendidura angosta, que no se vé en las glándulas del individuo adulto
(Nathanielsz, 1976). Por el contrario, las células de la pared posterior de la
bolsa de Rathke no proliferan. En la rata las células de la pared posterior de la
bolsa de Rathke, se desarrollan para dar lugar a la pars intermedia que mantiene
12
Figura 7.- Representación esquemática de distintas etapas en el desarrollo embrionario de la hipófisis a partir de la bolsa de Rathke y el infundíbulo. PE, prosencéfalo. (Modificado de Tuchmann-Duplessis, Auroux y Haegel, 1975).
B A
C
13
su forma embriológica en el adulto y puede reconocerse fácilmente.
Aunque la pars intermedia está casi unida a la neurohipófisis, desde el punto de
vista citológico, es más cercana a la pars distalis.
En etapas embriológicas tempranas, las paredes del infundíbulo son
delgadas, pero a medida que las células neuroepiteliales proliferan, el extremo
distal del infundíbulo adquiere una consistencia sólida; las células se diferencian
después en pituicitos, parecidos a las células glíales. En la pars nervosa,
adosada al tallo infundibular (Fig. 7C) crecen también fibras nerviosas
procedentes de la base del cerebro (Nathanielsz, 1976).
Aunque las conexiones neurovasculares entre el hipotálamo y la hipófisis
se fijan en forma definitiva en el día 5 postnatal, el hipotálamo tiene cierta
influencia sobre la hipófisis antes de este momento (Halasz, Kosaras y Lengvari,
1972). La diferenciación de las células de la hipófisis anterior tiene lugar una
vez que las conexiones hipotálamo-hipófisis se han establecido, después del día
18 prenatal, precisamente en el momento en que el sistema portal empieza su
formación.
Hipófisis-histología
La hipófisis está revestida por una cápsula de tejido conectivo que se
prolonga hacia su interior separando la adenohipófisis de la neurohipófisis. El
tejido conectivo se continúa con una red de fibras reticulares que soporta las
células del órgano (Fawcett, 1994). La adenohipófisis constituye la porción
mayor de la hipófisis y está formada por células glandulares dispuestas en
cordones y grupos irregulares. Estas células se clasifican en cromófilas y
cromófobas en base a su avidez para captar los colorantes utilizados en las
tinciones ordinarias de los cortes de tejido (Pelletier, Robert y Hardy, 1978) (Fig.
8, Tabla 1). Se encuentra correspondencia entre la afinidad de la tinción de las
células y su actividad de secreción hormonal específica.
14
Las células cromófilas se dividen en células acidófilas y basófilas,
según las reacciones tintoriales de sus gránulos. Dentro de las células
cromófilas, las acidófilas o células alfa, son las más numerosas en las porciones
posterolaterales de la pars distalis; son pequeñas, redondeadas, de 9 a 14 µm
de diámetro, con un aparato de Golgi yuxtanuclear bien desarrollado y pequeñas
mitocondrias en forma de bastoncillo. Si teñimos los cortes histológicos
ordinarios con hematoxilina-eosina (H-E), las células acidófilas se tiñen con
eosina que es el colorante ácido, y sus gránulos son suficientemente grandes
para ser vistos con el microscopio óptico (Fawcett, 1994). Las células acidófilas
se separan, a su vez, en células somatotropas y lactotropas por métodos de
tinción selectiva y por procedimientos inmunocitoquímicos que usan anticuerpos
contra hormonas específicas (Pelletier y col., 1978).
Figura 8.- Corte histológico de hipófisis (esquemático) teñido con hematoxilina-eosina. Nótese que los sinusoides están en contacto con los distintos tipos celulares. (Álvarez-Fuertes, 1969).
Cromófoba
Basófila
Sinusoide Acidófila
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Tabla 1.- Células de la adenohipófisis.
CÉLULAS AFINIDAD TINTORIAL PAS HORMONA
ACIDÓFILAS - GH
CROMÓFILAS - PRL
BASÓFILAS + ACTH
+ TSH
+ LH/FSH
CROMÓFOBAS - -
*PAS, ácido periódico de Schiff.
Las células somatotropas segregan la hormona de crecimiento (GH),
y están dispuestas en grupos a lo largo de los sinusoides. Contienen gránulos
muy numerosos, esféricos, de 300 a 350 nm de diámetro que se tiñen
selectivamente con el anticuerpo anti-GH. Las cisternas de su retículo
endoplásmico están bien desarrolladas y tienden a disponerse paralelamente a
la superficie de la célula (Richardson y Twente, 1991; Thorpe y Wallis, 1991).
Las células lactotropas secretan prolactina (PRL) que estimula a la glándula
mamaria durante el postparto, para iniciar y mantener la lactación (Thorpe y
Wallis, 1991), contienen numerosos gránulos de unos 200 nm de diámetro, y se
encuentran distribuídas de una en una por el interior de los cordones celulares
(Haggi, Torres, Maldonado y Aoki, 1986). En la hembra sexualmente madura
pero no lactante, son células relativamente pequeñas, con pocas cisternas de
retículo endoplásmico rugoso cerca de la periferia celular; durante la gestación,
el aumento en el nivel de estrógenos circulantes, hace que las células se
hipertrofien en forma considerable (Salpeter y Farquhar, 1981).
Cuando se utiliza la técnica H-E, las células basófilas o células beta
se tiñen con el colorante básico (la hematoxilina) pero son más difíciles de
identificar. Las técnicas histoquímicas con fuscina decolorada como el ácido
periódico de Schiff (PAS), que reacciona con las glucoproteinas citoplásmicas,
16
son las más adecuadas para teñirlas (Fawcett, 1994). Las células basófilas se
dividen a su vez, en células tirotropas, adrenocorticotropas y gonadotropas. Las
células tirotropas segregan la hormona tirotrópica (TSH). Son células alargadas
o poligonales y están dispuestas en grupos en la región anteromedial del lóbulo
anterior; tienden a situarse en la profundidad de los cordones celulares, alejadas
de los sinusoides. Sus gránulos son los más pequeños de todas las células de
la hipófisis, de 140 a 160 nm de diámetro (Jackson, 1982). Las
adrenocorticotropas segregan la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y la
hormona lipotrópica (LPH). En la rata, estas células son de forma estrellada
irregular, con prolongaciones celulares que se extienden entre las células
vecinas y terminan junto a los sinusoides; su citoplasma es de baja densidad,
con un retículo endoplásmico escaso (Challis y Brooks, 1989). Las
gonadotropas segregan las hormonas foliculoestimulante (FSH) y luteinizante
(LH). Son redondas, se encuentran junto a los sinusoides, con un aparato de
Golgi yuxtanuclear muy grande y un retículo endoplásmico bien desarrollado con
cisternas tortuosas. Los gránulos son esféricos y su diámetro varía entre 200 a
400 nm (Piacsek y Goodspeed, 1978).
Las células cromófobas (de reserva), son pequeñas y se encuentran
en grupos en el interior de los cordones celulares. Por lo general, tienen menos
citoplasma que las células cromófilas, pero algunas veces pueden alcanzar las
dimensiones de las acidófilas o basófilas (Fawcett, 1994). Sólo se ven gránulos
citoplasmáticos secretores, con el microscopio electrónico. Se consideran como
una población de reserva, es decir, células relativamente indiferenciadas
capaces de transformarse en acidófilas o basófilas (Pelletier y col., 1978),
posiblemente un nicho de células madre que requiere comprobarse.
En la adenohipófisis hay, además, células foliculares o estrelladas,
que con frecuencia adoptan un modo epitelial de asociación, rodeando a
pequeños folículos que contienen material coloide de baja densidad electrónica.
Estas células contienen microvellosidades y, en ocasiones, penachos de cilios
17
en su superficie luminal; su citoplasma contiene algunos organelos, gotas de
lípidos, abundantes polirribosomas y partículas beta de glucógeno. Las células
estrelladas no recubren la pared de los folículos, sino que extienden sus
prolongaciones ramificadas entre las células secretoras. Su función no está
clara, pero se cree que son fagocitarias pues se encuentran rodeando a
células muertas y desechos celulares (Fawcett, 1994).
La pars intermedia, en las ratas, ratones, perros, gatos y bovinos,
forma un epitelio multiestratificado de células basófilas. En los marsupiales está
reducida a una capa de una a dos células de espesor, y en los cetáceos y
algunas aves no está presente. En el feto humano la pars intermedia es un
epitelio estratificado típico, localizado junto al proceso infundibular, y puede
constituir el 3% de la porción glandular de la hipófisis, pero en el adulto ya no se
puede identificar como una capa distinta (Fawcett, 1994). Las células
principales de la pars intermedia son células epiteliales poligonales grandes,
ricas en mitocondrias, producen la hormona estimulante de los melanocitos
(MSH), tienen el retículo endoplásmico rugoso y el aparato de Golgi bien
desarrollados; se tiñen con la reacción de PAS, con numerosos gránulos
secretorios pequeños, de 200 a 300 nm de diámetro, distribuidos por todo el
citoplasma (Pelletier y col., 1978). Hay otras células estrelladas, no secretoras,
con largas prolongaciones ramificadas alrededor y entre las células glandulares
que forman una red laxa por toda la pars intermedia, y que probablemente
juegan un papel en la regulación de la actividad secretora de las células MSH
(Fawcett, 1994).
La pars tuberalis no constituye un tejido endocrino propiamente dicho,
pero es importante para la vascularización de la pars distalis por ser la porción
más vascularizada de la hipófisis; la atraviesan los vasos arteriales que van al
lóbulo anterior y el sistema portal venoso hipotálamo-hipofisiario, y está
separada del tallo infundibular por una delgada capa de tejido conectivo que se
continúa con la piamadre (Pelletier y col., 1978). Las células epiteliales de la
18
pars tuberalis corresponden a células indiferenciadas, basófilas y acidófilas
pequeñas. Células cilíndricas o cuboideas con mitocondrias en forma de
bastoncillos cortos, contienen gránulos y a veces, gotas de coloide y lípidos.
Son las únicas células de la hipófisis con grandes cantidades de glucógeno, y
están dispuestas formando folículos. En ocasiones se ven islotes de células de
epitelio plano estratificado, pero no se conoce su función específica (Wittkowski,
Schulze-Bonhage y Böckers, 1992).
La neurohipófisis está constituida por axones de neuronas cuyos
cuerpos celulares se localizan en niveles superiores del hipotálamo. El concepto
de neurosecreción postulado por Bargman y Scharrer (1951), surgió
precisamente de la neurohipófisis. Las hormonas sintetizadas en el hipotálamo,
oxitocina (OT) y arginina-vasopresina (AVP) o antidiurética (ADH) viajan,
acarreadas por las neurofisinas, en vesículas neurosecretoras (transporte
axónico) hasta las terminales nerviosas de la neurohipófisis, desde donde son
liberadas a la circulación por estímulos fisiológicos apropiados (Álvarez-Buylla y
col, 1973) (Fig. 6). Además de los axones de las células neurosecretoras
hipotalámicas, el lóbulo posterior contiene una población propia de células,
llamadas pituicitos, que no parecen ser secretoras. Tienen prolongaciones
delgadas que forman una red tridimensional para envolver a los elementos
neuronales. Los pituicitos varían mucho de tamaño y forma; suelen presentar
gránulos de pigmento lipocrómico y gotas lipídicas. Se supone que ejercen una
función trófica, de soporte, y mantienen una composición iónica apropiada en el
compartimiento extracelular (Fawcett, 1994)
Hormonas hipofisiarias
La hipófisis segrega por lo menos 10 hormonas que regulan las
funciones de otros órganos endocrinos. En la rata se han identificado 5 tipos de
células secretoras que participan en la síntesis o almacén de las 7 hormonas
producidas en la hipófisis anterior. Además, el lóbulo anterior de la hipófisis
19
secreta la -LPH que puede ser el precursor de las endorfinas y encefalinas en
los tejidos periféricos (Tabla 2).
Tabla 2.- Hormonas hipofisiarias.
HORMONA NATURALEZA SITIO DE CÉLULA
QUÍMICA SECRECIÓN ESPECÍFICA ACTH/ Proteica Pars distalis Basófila/Corticotropa ß-LPH TSH Glucoproteica Pars distalis Basófila/Tirotropa LH/FSH Glucoproteica Pars distalis Basófila/Gonadotropa GH Proteica Pars distalis Acidófila/Somatotropa PRL Proteica Pars distalis Acidófila/Lactotropa MSH Proteica Pars intermedia Basófila/melanotropa ADH Proteica Neurohipófisis Neuronas NSO y NPV OT Proteica Neurohipófisis Neuronas NSO y NPV
Entre las hormonas de la adenohipófisis tenemos:
1.- La hormona adrenocorticotrópica (ACTH), que se sintetiza a partir de las
células adrenocorticotropas; es un péptido formado por 39 aminoácidos con un
peso molecular (PM) de 4,500 Da; se deriva de una molécula precursora,
propiomelanocortina (POMC), que se detecta en la hipófisis pero no en el suero.
Su función principal es regular la secreción de glucocorticoides y andrógenos por
la corteza suprarrenal, donde la ACTH se une al receptor de la membrana y
estimula la esteroidogénesis con la mediación del monofosfato cíclico de
20
adenosina (AMPc) (Challis y Brooks, 1989). El hipotálamo, con la secreción de
la hormona liberadora de corticotropina (CRH), regula la secreción pulsátil de
ACTH con un ritmo circadiano, que consiste en una mayor producción al
amanecer y un descenso durante el curso del día (Döhler, Mühlen y Döhler,
1977). Los glucocorticoides ejercen una retroalimentación inhibitoria sobre la
secreción de la ACTH, tanto a nivel hipotalámico como hipofisiario (asa larga).
Además, la misma ACTH puede ejercer retroalimentación negativa sobre la
secreción de la CRH (asa corta). Su determinación se hace por RIA y la
concentración en rata es de 200 pg/ml (Rivier, Rivier y Vale, 1982) (Fig 9).
2.- La hormona tirotrópica (TSH), se sintetiza a partir de las células tirotropas.
Es una hormona glucoproteica con PM de 28,000 Da, formada por dos
subunidades denominadas a y b. Contiene 15% de carbohidratos en su
molécula. Se une a receptores de membrana en las células del folículo de la
glándula tiroides, donde estimula la síntesis y secreción de T3 y T4, mediante la
activación de la adenilatociclasa y la generación de AMPc (Larsen, 1982). La
secreción de la TSH se controla por el hipotálamo, mediante la hormona
liberadora de tirotropina (TRH) (Jackson, 1982) (Fig. 9), mientras que la
somatostatina (SS o GIH), la inhibe. Las hormonas tiroideas ejercen
retroalimentación negativa sobre el mecanismo secretor de la TSH, actuando
principalmente a nivel de la hipófisis (Sartor, Dufy-Barbe, Corcuff, Taupignon y
Dufy, 1990). La secreción de TSH es pulsátil, con niveles más altos durante el
inicio de la mañana, más bajos durante la tarde y comienzo de la noche. Se
puede medir por RIA y su concentración en rata es de 2 g/ml (Szabo, Stachura,
Paleologos, Bybee y Frohman, 1984).
3.- Las hormonas gonadotrópicas que corresponden a las hormonas
folículoestimulante (FSH) y luteinizante (LH), y que se sintetizan en las células
gonadotropas, son glucoproteínas con PM de 29,000 Da y están compuestas por
dos subunidades a y b; la subunidad b les confiere la actividad biológica. El
contenido de ácido siálico es de 5% en la FSH y de 1% en la LH, diferencia que
21
se asocia con una vida media mayor observada para la FSH (Döhler y col.,
1977, Rhind, McMillen, McKelvey, Rodriguez-Herrejon y McNeilly, 1989).
Regulan la función gonadal y estimulan la producción de esteroides sexuales.
Se unen a sus receptores en el ovario y en el testículo, donde actúan por medio
de nucleótidos cíclicos. En el ovario, la FSH estimula el desarrollo folicular,
mientras que la LH promueve la ovulación y la formación del cuerpo lúteo
(Piacsek y Goodspeed, 1978; Keeney, Sprando, Robaire, Zirkin y Ewing, 1990).
En el testículo, FSH y LH estimulan la maduración de los espermatozoides;
además la FSH estimula el crecimiento testicular y la producción de la proteína
transportadora de andrógenos por la célula de Sertoli; la LH estimula las células
de Leydig para la producción de testosterona (Odell, Swerdloff, Bain, Wollesen y
Grover, 1974; Pinilla, Garnelo, Gaytan y Aguilar, 1992). La secreción de FSH y
LH se regula por el hipotálamo mediante la hormona liberadora de
gonadotropinas (GnRH o LH-RH) (Fig. 9). Se pueden medir por RIA y sus
niveles varían en relación con el sexo y la edad. Los niveles de LH en la rata son
de 0.32 + 0.06 µg/l y de FSH 160 + 10 µg/l (Keeney y col., 1990).
4.- La hormona somatotrópica u hormona de crecimiento (GH), se sintetiza por
las células somatotropas, es una hormona polipeptídica que consta de una sola
cadena de 191 aminoácidos con PM de 21,500 Da, y se deriva de una molécula
precursora más pesada. Su función principal es estimular el crecimiento
somático por medio de las somatomedinas, que participan como intermediarias
metabólicas. Por este mecanismo, la GH incrementa la síntesis de proteinas,
pero también causa liberación de ácidos grasos del tejido adiposo y afecta el
metabolismo de los carbohidratos (Lea y Harvey, 1990; Schonbrunn, 1990). La
secreción de GH se controla por 2 hormonas hipotalámicas, la hormona
liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH), y la hormona inhibidora de la
hormona del crecimiento (GIH) o somatostatina (SS). La secreción de GH
presenta elevaciones episódicas durante el sueño. Se mide por RIA y en las
ratas los niveles varían de 24 a 200 µg/L (Kamegai, Wakabayashi, Sugihara,
Minami, Kitamura y Yamada, 1991).
22
Figura 9.- Diagrama que ilustra las interrelación entre el sistema nervioso central y el sistema endocrino. A, glándula adrenal; C.S., centros superiores; G, gónadas; H.A., hipófisis anterior; H.P., hipófisis posterior; HT, hipotálamo; N.E., nervio esplácnico; T, tiroides. (Modificado de Harris, 1955).
5.- La hormona lactorópica o prolactina (PRL), se sintetiza en las células
lactotropas, como una cadena polipeptídica compuesta por 198 aminoácidos con
PM de 22,000 Da. Su función principal es promover el desarrollo de la glándula
mamaria y la lactación. Su concentración en sangre aumenta progresivamente
durante el embarazo. En la rata, participa también en el mantenimiento del
HT
23
cuerpo lúteo durante la gestación (Döhler y col., 1977). El hipotálamo controla la
secreción de PRL mediante la dopamina, que tiene una acción inhibitoria sobre
las células lactotropas. Su concentración se cuantifica por RIA, encontrándose
cifras de 50 ng/ml en ratas (Leong, Frawley y Neill, 1983; Soares, Faria, Roby y
Deb, 1991).
6.- La hormona melanotrópica u hormona melanocito estimulante (MSH), se
secreta por la pars intermedia y está formada por dos cadenas polipeptídicas a-
MSH y b-MSH. La a-MSH contiene 13 aminoácidos en una secuencia idéntica a
la de una parte de la molécula de ACTH. La b-MSH contiene 18 aminoácidos,
siete de ellos están en una secuencia semejante a la de la molécula de ACTH.
Actúa sobre los melanocitos provocando la síntesis de melanina (Donald, 1990;
Jones y col., 1990).
Entre las hormonas de la neurohipófisis tenemos:
1.- La hormona antidiurética (ADH) o vasopresina (AVP). Es un péptido formado
por nueve aminoácidos con PM de 1,084 Da. Su función principal es
incrementar la permeabilidad del agua a nivel de los tubos colectores del riñón,
mediante la estimulación de la adenilciclasa y la formación del AMPc. Esta
hormona participa también en otros procesos como la reabsorción de sal por el
riñón, constricción de las arteriolas, aumento de la glucogenólisis, disminución
de la síntesis de ácidos grasos por el hígado y liberación de la ACTH (Bonner y
Brownstein, 1984). La presión osmótica, el volumen sanguíneo y la presión
arterial, son los factores más importantes en la regulación de la secreción de
ADH y el control de la ingesta de líquidos por la sed. Su concentración en la rata
es de 1.7 + 0.5 pg/ml (Bonner y Brownstein, 1984).
2.- La hormona oxitócica (OT) u oxitocina (OX). Es un péptido compuesto por
nueve aminoácidos con PM de 1,007 Da. Estimula las contracciones del
miometrio durante el trabajo de parto y también actúa sobre las células
24
mioepiteliales de los conductos mamarios para producir la eyección láctea. Su
concentración en la rata es de 9.4 + 2.6 pg/ml (Crowley y Amstrong, 1992).
Relaciones funcionales entre el hipotálamo y la hipófisis
En general, existe una relación recíproca entre el SNC, la actividad de
la hipófisis (adenohipófisis y neurohipófisis) y las funciones de las glándulas
blanco (Guillemin, 2005). Por tanto el SN es el responsable, en gran parte, de la
actividad endocrina y de los cambios que el organismo requiere ante las
variaciones del medio externo. En el caso de la neurohipófisis esta relación se
explica fácilmente por el suministro nervioso que le llega del hipotálamo (tracto
hipotalámo-hipofisiario). Pero en el caso de la adenohipófisis el control se ejerce
en forma indirecta por las hormonas tróficas (factores liberadores). El papel
neuroendocrino del hipotálamo se observó por primera vez en experimentos de
estimulación eléctrica y de ablación (Harris, 1955), y mediante lesiones en el
hipotálamo y la eminencia media que producen atrofia de las glándulas
endocrinas, lo mismo que la interrupción del tallo hipofisiario.
Como hemos visto, el hipotálamo constituye un centro de regulación
neuroendocrino importante, con dos sistemas neurosecretores principales: a) el
sistema parvicelular, formado por axones que se extienden desde los cuerpos
celulares hasta la eminencia media, donde segregan las hormonas liberadoras e
inhibidoras que controlan los niveles de algunas hormonas de la adenohipófisis
(Jones, Brown y Dobson, 1990); y b) el sistema neurosecretor magnocelular,
formado por cuerpos neuronales localizados en los núcleos supraóptico y
paraventricular (NSO y NPV); sus axones amielínicos constituyen el haz
hipotálamo-hipofisiario que desciende hacia la neurohipófisis para formar su
masa principal. Este sistema secreta OT y AVP o ADH (Bonner y Brownstein,
1984; Crowley y Armonstrong, 1992). Las células de los núcleos hipotalámicos
son neuronas grandes con pocas prolongaciones, núcleo excéntrico y
citoplasma abundante. El retículo endoplásmico rugoso presenta cisternas
25
paralelas en la periferia del pericarion, el aparato de Golgi es yuxtanuclear y se
encuentra muy desarrollado, secreta gránulos secretores pequeños (120-200
nm). Los neurotúbulos y los neurofilamentos convergen hacia el axón por el que
se transportan los gránulos de neurosecreción hacia el lóbulo posterior de la
hipófisis. En las preparaciones histológicas teñidas con alumbre de cromo-
hematoxilina, se ven acúmulos de un material fuertemente teñido, de tamaño
variable, a todo lo largo del proceso infundibular y del lóbulo neural, conocidos
como cuerpos de Herring (Fawcett, 1994).
Factores liberadores
En 1948 Harris desarrolló la teoría del control neurohumoral de la
adenohipófisis, a partir del hipotálamo. El aporte sanguíneo de la hipófisis
anterior puede compararse, en general, con el del hígado; ambos órganos tienen
circulación arterial sistémica, circulación portal y drenaje sistémico. La sangre
portal que recibe la hipófisis, atraviesa primero el plexo capilar primario en la
pars tuberalis desde donde salen capilares que penetran a la eminencia media,
para después distribuir su sangre en los sinusoides de la pars distalis (Figs. 3 y
4). Es probable que dichas asas capilares sean representativas del tipo primitivo
de vascularización cerebral, que se conserva aún en vertebrados inferiores y
marsupiales. El tallo hipofisiario en la rata es bastante largo, sus vasos portales
corren en forma paralela hacia la glándula pituitaria. La interrupción permanente
de los vasos portales provoca alteración en la función hipofisiaria con falla
gonadal, inactividad de la tiroides, insuficiencia adrenal y detención en el
crecimiento en animales jóvenes. El transplante de hipófisis a eminencia media
restaura las funciones de las glándulas blanco (Harris, 1955). La secreción
hipotalámica es fundamentalmente pulsátil, por lo que el ritmo con el que llegan
las hormonas hipotalámicas a la adenohipófisis condiciona su respuesta. A
veces, una hormona hipofisiaria controla no solo su propia secreción, sino
también la secreción de otras hormonas (regulación local). Se han aislado
26
substancias o factores liberadores para, TSH, FSH, LH ACTH y GH, así como
factores inhibidores para GH y PRL (Tabla 3).
El hipotálamo ventromedial contiene células especializadas (tanicitos
ependimarios) que se extienden desde el piso del 3er ventrículo a través de la
eminencia media, para ponerse en contacto con los capilares del plexo portal
primario. Se ha postulado una acción doble de estas células, transportando
hormonas hacia eminencia media y desde aquí hasta el SNC (Bergland y Page,
1979). Las hormonas hipotalámicas actúan sobre el sistema adenilato ciclasa,
promoviendo la formación de AMPc que estimula el proceso de secreción. A
esto se debe que los análogos de los nucleótidos cíclicos y los inhibidores del
rompimiento de AMPc aumenten la liberación de hormonas.
Tabla 3.- Hormonas liberadoras e inhibidoras hipotalámicas que actúan sobre la hipófisis.
HORMONAS CÉLULAS HORMONAS HIPOTALÁMICAS EFECTORAS HIPOFISIARIAS
CRH Corticotropa ACTH
TRH Tirotropa TSH
GnRH Gonadotropa LH/FSH
PRH Lactotropa PRL
PIH Lactotropa PRL
GHRH Somatotropa GH
GIH Somatotropa GH
Los extractos de la eminencia media y los factores liberadores
sintéticos (TRH y GnRH) aumentan el AMPc en la hipófisis. Como en la mayor
27
parte de los procesos que involucran AMPc, es posible disociar los cambios en
su producción, con la liberación hormonal correspondiente. Por ejemplo, cuando
aumenta la secreción de LH en respuesta a GnRH, lo primero que se ve es un
aumento en la concentración celular de AMPc. Hoy se sabe que la participación
del AMPc es un proceso complejo (Jackson, 1982; Clayton, 1989; Sartor y col.,
1990). Las neuronas hipotalámicas peptidérgicas están a su vez reguladas por
neurotransmisores (monoaminas), de tal manera que la neurona peptidérgica
actúa como un transductor neuroendocrino (Wurtman, 1971).
Efectos de la hipofisectomía
Al ser la hipófisis una glándula esencial para la vida, la hipofisectomía
conlleva a una pérdida de funciones vitales que termina en la muerte del animal,
es por ello que Álvarez-Buylla y su grupo buscaron la forma de substituirla con
otros tejidos que pudieran suplir la función de la hipófisis. Enumeramos, en
forma resumida, los efectos de la hipofisectomía sobre los distintos órganos
endocrinos dependientes de la actividad hipofisiaria:
1.- El tiempo de sobrevida en los perros hipofisectomizados disminuye
considerablemente, y puede llegar a ser de 2.6±0.1 a 6.3±0.6 meses (Houssay,
1922; Álvarez-Buylla, Mandoki y Álvarez-Buylla, 1970; Araujo, Queiroz, Saraiva y
Junqueira, 1975). El aspecto físico y la condición de los animales se deteriora
progresivamente, pierden el apetito, bajan de peso, pierden pelo y se debilitan
hasta llegar a la muerte (Álvarez-Buylla y col., 1970; Araujo y col., 1975).
Cuando la hipofisectomía se hace en animales jóvenes, en etapa de crecimiento,
éste se detiene. A nivel del hueso se retarda la osteogénesis, y la falta de
actividad del osteoblasto en la rata, provoca una disminución en el crecimiento
longitudinal y radial del hueso por falta de GH (Martinez, Vailas y Grindeland,
1991; Chen, Yeh y Aloia, 1995; Yeh, Chen y Aloia, 1995).
28
2.- Desde los trabajos clásicos de Houssay (Houssay, Biasotti y
Sammartino,1935), se sabe que la hipófisis es parte del mecanismo fisiológico
que mantiene la regulación homeostática de la glucosa. Los animales
hipofisectomizados presentan hipoglucemia, el hígado contiene la mitad del
glucógeno almacenado y las enzimas fosforilasa y glucosa-6-fosfatasa están
disminuidas; esto último debido a la ausencia de la GH (Van Lan, Yamaguchi,
Garcia, Ramey y Penhos, 1974; Vanderpooten, Darras, Huybrechts, Rudas,
Decuypere y Kühn, 1991; Vidal, Geloën, Minaire y Riou, 1993). El reflejo
condicionado hipoglucemiante a la insulina en perros y ratas desaparece
después de la hipofisectomía (Álvarez-Buylla y Carrasco-Zanini, 1960; Álvarez-
Buylla, Segura y Álvarez-Buylla, 1961; Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1963,
1964; Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla, 1970).
3.- La respuesta eosinopénica-insulínica desaparece después de la
hipofisectomía y no es posible establecer reflejos condicionados eosinopénicos
utilizando las mismas dosis de insulina que en el animal normal o con
transplante de parótida (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1968a, 1968b; Goldraij
y Álvarez-Buylla, 1971).
4.- En los perros hipofisectomizados desaparece el efecto de la
administración de la metopirona sobre la excreción de 17-corticosteroides,
indicando una falta de estimulación de la corteza suprarrenal por ACTH (Álvarez-
Buylla y Álvarez-Buylla, 1967).
5.- Los niveles de 11-hidroxicorticosteroides en plasma, como una
medida de la actividad adrenocortical, se reducen en un 40% en los animales
hipofisectomizados (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1970).
6.- Los niveles de cortisol en plasma, tanto en reposo como en
respuesta al estrés severo, disminuyen significativamente (Álvarez-Buylla y
Álvarez-Buylla, 1964; Álvarez-Buylla y Tsutsumi, 1979). Las glándulas
29
adrenales de los perros hipofisectomizados presentan una atrofia importante,
con una reducción en el peso del 50% y con disminución de las zonas fascicular
y reticular (Álvarez-Buylla y Tsutsumi, 1979, 1982).
7.- La captación de 131
I por la tiroides en perros hipofisectomizados,
96 h después de la inyección del trazador radiactivo, fue sólo de 7% del control.
El peso de la tiroides en estos perros fue un 50% del normal, presentando una
pérdida de folículos y coloide y un epitelio de revestimiento aplanado (Álvarez-
Buylla, Erlij y Álvarez-Buylla, 1970).
8.- En la rata aumenta la concentración de ADH, OT y CRH en la
sangre portal hipofisiaria (Wetsel y Fernstrom, 1987; Sheward y Fink, 1991).
9.- Tomando los colpocitogramas (valor estrogénico) y la
espermatogénesis como indicadores de las funciones gonadales, después de la
hipofisectomía, hay una depresión de estas funciones tanto en perros hembras
como en machos (Ganong y Hume, 1956; Álvarez-Buylla, Deleón y Álvarez-
Buylla, 1973). Las hembras presentan una ausencia total de ciclos estrales con
una reducción de los niveles estrogénicos con respecto a los perros hembras
normales. En los machos la espermatogénesis desaparece (Deleón, Álvarez-
Buylla y Álvarez-Buylla, 1972). Morfológicamente, hay una disminución mayor
del 50% en el peso de las gónadas con una atrofia importante tanto en los
ovarios como en los testículos. En el testículo de la rata disminuye el número y
el volumen de las células de Leydig. Se reduce el volumen del retículo
endoplásmico liso y la actividad de la enzima microsomal 17-hidroxilasa (Stocco,
Teerds, Van Noort y Rommerts, 1990; Woodward, 1993). Aumenta el
glucógeno citoplasmático a nivel de las espermatogonias, de la célula de Sertoli,
y en menor grado, de los espermatocitos (Leiderman y Mancini, 1974; Schoenle,
Zapf y Froesch, 1979). Hay disminución del número de folículos y atrofia en el
ovario de la hembra por insuficiencia de FSH y LH.
30
Substitución de la hipófisis por otras glándulas
Es evidente que la hipofisectomía total condiciona la aparición de una
serie de problemas endocrinológicos por la ausencia de secreción de las
hormonas, con atrofia de los órganos blanco. La ausencia de tratamiento
substitutivo conduce a la muerte del individuo hipofisectomizado. Álvarez-Buylla
y Álvarez-Buylla en 1963, demostraron que la substitución de la hipófisis por un
fragmento de glándula parótida en el perro es capaz de restaurar parcialmente
las funciones hipofisiarias. El transplante de músculo o grasa no produce dicho
efecto.
1.- En los perros transplantados con parótida después de la
hipofisectomía, se observa un aumento en el tiempo de sobrevida, 29.4±4.6
meses, en comparación con los perros con transplante de músculo (Álvarez-
Buylla y col., 1970; Araujo y col., 1975). Pero cuando el transplante se lleva a
cabo en animales jóvenes se observa una ausencia de crecimiento, indicativo de
un déficit de GH (Álvarez-Buylla y col., 1970).
2.- La inyección de insulina en perros con transplante de parótida, una
semana después de la cirugía, ocasiona una respuesta eosinopénica del 28%, y
dos años después del transplante la respuesta es semejante a la obtenida en
animales normales. Además, 9 semanas después del transplante es posible
establecer reflejos condicionados hipoglucemiantes (Álvarez-Buylla y Álvarez-
Buylla, 1963, 1968a, 1968b).
3.- La función adrenocortical de los animales transplantados valorada
mediante la determinación basal de 17-OH-corticoides en plasma es de 81 a
89% comparada con la encontrada en el perro normal (Álvarez-Buylla y Álvarez-
Buylla, 1970); 24 h después de la inyección de metopirona, método indirecto
para valorar la función adrenocortical, aumentan los 17-OH-corticoides en un
50% (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1967; 1968a). Estos estudios se
31
confirman en trabajos posteriores midiendo cortisol en plasma. Dos meses
depués del transplante, el cortisol plasmático basal es 62% del normal y
aumenta ante un estrés severo hasta 42% de los valores normales (Álvarez-
Buylla y Tsutsumi, 1979). Histológicamente la glándula suprarrenal es similar a
la normal (Álvarez-Buylla y Tsutsumi, 1982).
4.- Los perros con transplante de glándula parótida en substitución de
la hipófisis extirpada, muestran una mejoría en la función tiroidea. Cuando se
valora la captación de 131
I a diferentes tiempos de la inyección del trazador
radioactivo, se encuentra una recuperación del 29 al 55%. El peso de las
tiroides alcanza el 81% del peso normal, e histológicamente presenta folículos
con un epitelio y coloide similares a la glándula normal (Álvarez-Buylla y col.,
1970).
5.- La función gonadal de los perros hipofisectomizados con
transplante de glándula parótida a la silla turca tiende a la normalización; en las
hembras se observan cambios cíclicos del epitelio vaginal y periodos de estro.
Los valores estrogénicos durante la etapa de estro fueron del 78% (Álvarez-
Buylla y col., 1973). La cruza de estas hembras con machos normales o con
transplante dio como resultado la preñez de solo 2 de éllas, llegando el parto a
término y obteniéndose un cachorro por camada. Histológicamente el ovario
presenta atrofia moderada con folículos maduros e inmaduros (Álvarez-Buylla y
col., 1973). Los machos con transplante de glándula parótida en substitución de
la hipófisis presentan un volumen de semen de 2.46 ± 0.5/ml y un conteo de
espermatozoides de 8.5 ± 2.2 millones/ml, ambos valores se encuentran dentro
de los límites normales. Al cruzar estos animales con hembras normales o con
transplante se obtienen crías normales. El estudio microscópico muestra los
túbulos seminíferos formados por varias capas de células en división y células
de Leydig normales (Álvarez-Buylla y col., 1973).
32
El estudio histológico de la glándula parótida transplantada en el lugar
de la hipófisis en perros, no muestra una reacción inmediata, no hay cambios
celulares aparentes, tampoco existe infiltración celular en el estroma y los vasos
sanguíneos estan colapsados. A los 5 días de la operación, la glándula presenta
signos de necrobiosis y cromatolisis, sobre todo en la parte central del
transplante. En las células secretoras existe destrucción autolítica e infiltración
leucocitaria; en los conductos excretores esta reacción es menor. Casi no existe
reacción de cuerpo extraño en la glia o la paquimeninge (Araujo y col., 1975;
Costero, Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1975). La vascularización del tejido
parotídeo transplantado comienza en las primeras 24 h después de la cirugía;
proviene principalmente de los vasos que se cortaron en la eminencia media, y
que probablemente pertenecen al sistema porta (Costero y col., 1975). Una
parte del transplante es destruido por autolisis durante las primeras horas; el
tejido glandular que sobrevive y que está en mejores condiciones, es el que se
encuentra en contacto con el hipotálamo, hay crecimiento glial, de axones y
vasos para finalmente cerrar la apertura del tercer ventrículo, produciendo una
gruesa área que ocupa el lugar de la neurohipófisis (Araujo y col., 1975). A los 4
meses después de la operación, el transplante no muestra evidencia de autolisis
o de reacción inflamatoria; el tejido conectivo es abundante y está muy
vascularizado; la distribución de pequeños lóbulos parotídeos se encuentra
parcialmente conservada; muchas de las cavidades glandulares están dilatadas,
haciendo difícil reconocer la posible existencia de conductos excretores (Costero
y col., 1975). Dos años después de la cirugía, los cambios en la distribución
estructural de las células, que caracteriza a la glándula transplantada,
comienzan con la deformación de grupos celulares y dispersión de células;
algunas de ellas se reagrupan en círculos de distintos tamaños que contienen
una substancia acidófila; la apariencia histológica del transplante glandular es
similar al que se observó 7 meses después de la operación. Los conductos
excretores no se distinguen y la morfología del epitelio cúbico sugiere actividad
secretora. La tinción con H-E revela muchas células basófilas, algunas
acidófilas y escasas cromófobas. Es frecuente observar notables granulaciones
33
en el citoplasma celular. Las áres del transplante más cercanas a la eminencia
media conservan mejor vascularización y una estructura microscópica
compatible con actividad secretora (Araujo y col., 1975). En los perros que
sobreviven más de 40 meses después de la operación, el aporte sanguíneo, las
células glandulares y el estroma se comportan como estructuras claramente
establecidas, capaces de funcionar dentro de límites normales (Costero y col.,
1975).
Álvarez-Buylla sugiere la presencia de factores hipotalámicos que
estimulan a las células transplantadas para inducir cambios morfológicos que
producen, a su vez, cambios funcionales (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1970;
Álvarez-Buylla y Tsutsumi, 1979). Cuando los transplantes de glándula parótida
se realizan 4 meses después de la hipofisectomía en perros (transplante tardío),
la recuperación funcional es menor que en los transplantes inmediatos (Álvarez-
Buylla y Álvarez-Buylla y col., 1974). Los transplantes fuera de la región de la
eminencia media no inducen cambios en la degeneración progresiva endocrina
ni en el tiempo de sobrevida (Álvarez-Buylla y Tsutsumi, 1979).
Es un hecho demostrado, la existencia de gran número de células
madre en distintos tejidos adultos; se sugiere que estas células actuarían como
una especie de reservorio, manteniendo el potencial de transdiferenciación de
un fenotipo a otro, constituyendo una posibilidad de terapia celular importante
(Safford y Rice, 2005). De la misma manera, hay muchos reportes sobre la
transdiferenciación de células de médula ósea en células musculares,
pulmonares, hepáticas y neuronales (Crain, Tran y Mezey, 2005). Evidencias
recientes apoyan la existencia de células de mamíferos adultos, principalmente
en la médula ósea que son capaces de transdiferenciarse para cruzar las
fronteras del linaje celular (Corti, Locatelli, Papadimitriou, Strazzer y Comi,
2004).
34
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
El aumento en la complejidad funcional de los seres vivos durante la
evolución, hace necesaria la existencia de sistemas para coordinar las
actividades de los diversos tejidos y órganos (Álvarez-Buylla, Huberman,
Montero, Lemus, Valles y de Álvarez-Buylla, 2003). Los sistemas nervioso y
endocrino son responsables de esta coordinación. El sistema hipotálamo-
hipofisiario es un elemento claro en la relación neuroendocrina, a pesar de la
escasa inervación de la adenohipófisis. Las células hipotalámicas y
extrahipotalámicas sintetizan hormonas que modulan con alta especificidad las
funciones de la hipófisis en la integración neuroendocrina (Harris, 1960;
Guillemin, 2005).
La glándula parótida comparte el origen embriológico con la hipófisis,
es decir, ambas derivan del ectodermo. En esta glándula se han detectado
péptidos y factores de crecimiento como somatostatina (SS), péptido intestinal
vasoactivo (VIP), prolactina (PRL), factor de crecimiento epidermal (EGF) y
factores de crecimiento nervioso (NGF) (Cohen, 1960, Levi-Montalcini, 1987;
Piludu, Lantini, Isola, lecca y Cossu, 2002). Numerosos estudios indican que la
diferenciación celular depende del medio en que se desarrollan las células y de
la acción de una serie de agentes inductores externos como factores de
crecimiento, hormonas, etc. (Patterson, 1978; Hoshi y McKeehan, 1984; Li.
Horb, Tosh y Slach, 2005). Las señales para la diferenciación celular, se
transmiten por factores de transcripción al tejido específico (Kinji y Takafumi,
1991; Levy, 2002), pero aún permanecen muchas dudas por aclarar. El efecto
de la amplia gama de factores que actúan sobre la diferenciación celular se
demuestra, no sólo en tejidos embrionarios, sino también en tejidos adultos,
aunque en estos últimos la capacidad de transformación morfofuncional es
menor (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1963; Potter, Landis, Matsumoto y
Furshpan, 1986).
35
La extirpación total de la hipófisis ocasiona una serie de problemas
endocrinológicos, como son la detención del crecimiento en animales jóvenes,
atrofia de gónadas, tiroides y suprarrenales, trastornos del metabolismo de los
hidratos de carbono, proteinas y lípidos, hasta llegar a la muerte (Houssay,
Biasotti y Sammartino, 1935). Los efectos letales se pueden evitar, en cierta
medida, con terapia substitutiva de las hormonas hipofisiarias, pero el equilibrio
hormonal fino del animal in vivo, con sus respectivas reacciones de
retroalimentación positiva y negativa, no está presente.
Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla (1963), y Álvarez-Buylla y col. (1970)
demostraron que la substitución de hipófisis por un fragmento de glándula
parótida en el perro es capaz de restablecer parcialmente algunas funciones
pituitarias y aumentar la sobrevida en forma significativa. La valoración de las
hormonas dependientes de la hipófisis mostró una recuperación parcial de sus
niveles en plasma (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1968b; Álvarez-Buylla y col.,
1970; Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla 1970). El tejido de la glándula salivar in
vitro es capaz de sufrir transdiferenciación para secretar GH ante una
estimulación con hormona GHRH (Tresguerres, Ariznavarreta, Granados,
Costoya, Pérez-Romero, Salame y Hermanussen, 1999).
El mecanismo por el cual el transplante de glándula parótida
compensa las deficiencias hormonales y aumenta la sobrevida, no está aún bien
aclarado, pero Álvarez-Buylla y Tsutsumi (1979) sugieren que las células
parotídeas se desdiferencian por la estimulación de hormonas hipotalámicas y
adquieren propiedades de células hipofisiarias primitivas. Otra posibilidad sería
que los factores de crecimiento en la parótida promuevan el crecimiento y
diferenciación del tejido hipotalámico (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1963;
Villalobos, Núñez y García-Sancho, 2004). Aunque la primera referencia
publicada por Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla (1963) relaciona el transplante de
la glándula parótida con los factores de crecimiento contenidos en ésta, varias
décadas después los investigadores se interesaron por la importancia de dichos
36
factores en la diferenciación y proliferación neuronales (Takeuchi, Aletta,
Laychock, Tian y Rubin, 2003), principalmente en estudios de inmunidad y de
regeneración del SNC. Los condicionantes microambientales son críticos en la
diferenciación celular (Patterson, 1978), y existe la posibilidad de obtener
cambios morfofuncionales en células adultas, como las células óseas (Bellows,
Ishida, Aubin y Heersche, 1990; Kasperk, Fitzsimmons, Strong, Mohan,
Jennings, Wergedal y Baylink, 1990), intersticiales (Xu y Bjorntorp, 1987),
gonadotropas (Horacek, Campbell y Blake, 1989) y neurales (Furshpan, Landis,
Matsumoto y Potter, 1986; Potter y col., 1986; Corti y col., 2004). Pretendemos
que estos experimentos nos permitan conocer si el SNC participa en la
especialización funcional de un tejido glandular exocrino al ser transplantado en
contacto directo con el hipotálamo basal, en el lugar de la hipófisis extirpada.
Estos experimentos constituirán el punto de partida en la implementación de
nuevas terapias en la clínica endocrina.
37
HIPÓTESIS
Al substituir la hipófisis extirpada por un fragmento de la glándula
parótida, que se coloca en contacto con el hipotálamo basal, las
neurosecreciones procedentes de SNC, transforman los acinos seromucosos en
células acidófilas y basófilas, para producir las hormonas hipofisiarias que
inciden sobre las glándulas blanco y mantienen la vida después de la
hipofisectomía.
OBJETIVO GENERAL
Analizar en ratas hipofisectomizadas sin y con substitución de
hipófisis por un fragmento de tejido parotídeo (autotransplante), los cambios
morfo-fisiológicos en el transplante, tiroides, suprarrenales, ovarios y páncreas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Determinar las curvas de peso corporal, peso de las tiroides,
suprarrenales, ovarios y páncreas en ratas hipofisectomizadas y transplantadas.
b) Valorar la actividad estrogénica por el colpocitograma, en las ratas
hipofisectomizadas y transplantadas.
c) Valorar los niveles séricos de estrógenos y corticosterona en las
ratas hipofisectomizadas y transplantadas.
38
d) Valorar los niveles séricos de LH y TSH basal y con estimulación
de LHRH y TRH en las ratas hipofisectomizadas y transplantadas.
e) Analizar los cambios histológicos de las tiroides, suprarrenales y
ovarios en las ratas hipofisectomizadas y transplantadas
f) Determinar la presencia de LH y PRL en el transplante (tinción
inmunohistoquímica).
g) Valorar por inmunohistoquímica los cambios funcionales en el
tejido transplantado y en el hipotálamo.
39
METODOLOGÍA
Animales, técnicas quirúrgicas e histológicas
Los experimentos se realizaron en 80 ratas hembras Wistar, de
150-200 g de peso. Las ratas se mantuvieron en jaulas aisladas, a
temperatura de 24°C, humedad de 20-30% y periodos de luz-obscuridad de
12/12. Se alimentaron con croquetas comerciales para ratas de laboratorio,
teniendo libre acceso al agua con azúcar (5%). Todos los estudios se
realizaron de acuerdo con los principios y procedimientos de la Guía del NIH
(National Acad. Press, 1996) para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
La hipofisectomía total (HIPOX) se realizó siguiendo la técnica de
Álvarez-Buylla (Álvarez-Buylla, Quintanar, Quintanar y Álvarez-Buylla, 1991).
Después de un ayuno de 12h, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico
(3 mg/100 g de peso) por vía ip. Para evitar las secreciones nasofaríngeas se
les administró atropina (200 µg i.m.). Se fijaron a la mesa de operaciones en
decúbito dorsal, utilizando los dientes incisivos y las extremidades, hasta
conseguir que la parte dorsal del cráneo se encontrara paralela a la mesa de
operaciones. Se realizó intubación endotraqueal por transiluminación (mesa de
operaciones a 45°) y se conectó el ventilador artificial a través del catéter
endotraqueal. La mesa de operaciones se mantuvo en posición horizontal
durante el resto del procedimiento quirúrgico. Una vez desinfectada la parte
ventral del cuello, se incidió con bisturí en la línea media del cuello, por debajo
de la mandíbula y hasta el manubrio del esternón; se disecó la piel hacia ambos
lados de la incisión; se cortaron las fascias de los músculos esternohioideo y
digástrico. A partir de este momento el procedimiento quirúrgico se llevó a cabo
bajo microscopio para microcirugía con una amplificación 20 X. Utilizando como
referencia el borde externo del tendón de los músculos digástricos, se introdujo
el disector de vidrio romo-recto, hasta tocar el hueso occipital y con ayuda de
40
otro disector de vidrio romo-curvo se separaron las estructuras adyacentes. Se
continuaron separando los tejidos hacia ambos lados de la incisión y hacia la
parte rostral hasta dejar visible el hueso occipital. Se limpió el hueso con
osteotomo y se localizó la unión esfeno-occipital. Se colocaron retractores de
cristal y metálicos, para mantener separados los tejidos, cuidando de no dañar la
faringe y dejando el campo libre para la trepanación con una fresa dental (Fig.
10). Una vez visualizada la sincondrosis esfeno-occipital se trepanó el
esfenoides en dirección rostral, tangencial a dicho cartílago. Se limpiaron los
bordes óseos con el periostotomo y con un gancho especial se cortó la
duramadre hasta ver la hipófisis, sin dañarla. Se rasgó la cápsula pituitaria para
exponer la hipófisis profusamente vascularizada, que con ayuda de un aspirador
especial se succionó, para extraerla de una sola pieza. La hipófisis extirpada se
examinó bajo el microscopio para comprobar que la hipofisectomía era completa
(observando la adeno y la neurohipófisis con parte del tallo). Se cubrió el orificio
de la trepanación con un tapón de esponja de silastic. Se quitaron los
separadores y se suturó la piel. Una vez retirada la ventilación artificial, se
aspiraron las secreciones a través de los orificios nasales y del catéter
endotraqueal, para posteriormente retirarlo; se colocó un abrebocas de alambre
durante el postoperatorio hasta que la rata recuperó movimientos y postura. Se
aplicó penicilina G sódica y procaínica (100 U/100 g de peso) e hidrocortisona
(1 mg/100 g de peso) por vía im. La rata se mantuvo a temperatura de 37°C
hasta su recuperación de la anestesia (Fig. 11).
El autotransplante de un fragmento de glándula parótida después de
la hipofisectomía se realizó en la misma sesión quirúrgica. Una vez hecha la
incisión en piel se disecó el tejido subcutáneo, se tomó un fragmento de glándula
parótida (1.5 veces mayor que la hipófisis) libre de tejidos conectivo y adiposo,
se colocó en una cámara húmeda estéril hasta el momento de ser transplantada
en contacto con el hipotálamo basal después de la hipofisectomía, cubriendo el
orificio con esponja de silastic (Álvarez-Buylla, Segura y Álvarez-Buylla, 1961,
Costero y col., 1975) (Figs. 11 y 12).
41
Figura 10.- Diagrama de las relaciones anatómicas de los músculos del cuello y la base del cráneo donde se realiza la trepanación para extirpar la hipófisis. H, hueso; M, músculo; P, proceso; S, sincondrosis:
Con el objeto de hacer un seguimiento del peso corporal y del ciclo
estral en varios grupos de ratas se obtuvieron los pesos por semana y se
tomaron exudados vaginales diarios (colpocitograma). Se introdujo en la vagina
de la rata un isopo estéril, humedecido con solución fisiológica; la muestra se
colocó sobre un portaobjetos extendiéndose sobre el cristal, se fijó en alcohol al
70 % por 1 min y se tiñó por el método de Papanicolaou (Bancroft y Cook,
1994), para observar al microscopio óptico y cuantificar los distintos tipos de
células (superficiales, intermedias, parabasales y basales). El valor estrogénico
(VE) se computó sobre la base del colpocitograma siguiendo el método de
Laguna, Graham, Urrutia, García y Munguía (1958). El VE se calculó por la
suma del número de células superficiales multiplicado por un factor de 1, más la
suma de las células intermedias multiplicado por un factor de 0.6. Los otros
tipos celulares no se tomaron en cuenta. La estimulación con LHRH y TRH se
42
Figura 11.- Campo operatorio a través del microscopio de operaciónes X 20 y la glándula pituitaria extirpada en la rata. A: se exponen los huesos de la base del cráneo después de retraer los músculos. Se localiza la sincondrosis esfenooccipital (flechitas) entre el hueso occipital (bo) y el esfenoides, donde se realiza la trepanación siguiendo la línea punteada. B: una vez terminada la trepanación y después de cortar la duramadre, se visualiza la hipófisis (estrella blanca), con el tallo y su irrigación, que se extrae completa por succión. C: vista ventral de la hipófisis recién extirpada, la neurohipófisis está en el centro (línea punteada), rodeada por la adenohipófisis (*), y el tallo pituitario completo (flecha).
A
1mm
43
hizo bajo anestesia ligera con pentobarbital. Una vez obtenido 1 ml de sangre
de la vena yugular externa con una jeringa heparinizada, se inyectó LHRH (1
µg/100 g) por vía iv y TRH (1µg/100 g) por vía sc. Quince minutos después se
obtuvo la segunda muestra de sangre (3ml) para valoración hormonal.
El sacrificio de las ratas se realizó por decapitación con guillotina o por
perfusión. Para la perfusión, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico
(3 mg/100 g de peso) por vía ip. Después de la toracotomía y antes de empezar
la perfusión, se extrajeron 4 ml de sangre del corazón a nivel del ventrículo
izquierdo con aguja de calibre 22 y jeringa sin anticoagulante, para las medidas
hormonales.
Figura 12.- Campo operatorio a través del microscopio de operaciones X 20 después de poner el transplante de glándula salivar (flecha) en conacto con el hipotálamo en la rata.
La perfusión se llevó a cabo por el método descrito por Feria-Velasco
y Karnovsky (1970). Se colocó un catéter calibre 21 (Clay Adams) en ventrículo
izquierdo, se realizó un corte a nivel de la aurícula derecha para perfundir
1 mm
44
primero con la solución lavadora (solución salina fría, 13 ml/min durante 8 min-
60 a 100 ml/rata), y posteriormente con la solución fijadora (paraformaldehido al
2.5% frío, 12 ml/min durante 5 min |(60 a 100 ml/rata). Inmediatamente después
del sacrificio se extrajeron las dos glándulas tiroides, las dos suprarrenales y los
dos ovarios que se pesaron en la balanza analítica. Los órganos se postfijaron
en paraformaldehido al 2.5% con amortiguador de fosfatos frío (PBS pH 7.3,
4°C) durante dos horas, se deshidrataron en una serie de alcoholes por 90 min,
y se aclararon en xilol por 30 min. Los tejidos incluídos en parafina durante 30
min, se cortaron en un microtomo a 6 µm y se tiñeron con H-E. Los cortes se
analizaron en un microscopio óptico, tomando fotomicrografías con un
microscopio Axioskop.
Procedimientos bioquímicos
Los niveles de corticosterona en plasma se realizaron mediante
análisis por desplazamiento competitivo (CPB) según el método de Mancheño,
Durán y Oriol (1975) después de extraer el plasma con diclorometano y
reconstituírlo con buffer de fosfatos 0.005M con albúmina de suero bovina
(coeficiente de varianza intraanálisisis <14.3; interanálisis <19.3 %). La
sensibilidad de la curva estándar fue 0.6 ng/mL. La concentración de
estrógenos en suero se hizo por radioinmunoensayo (RIA) con doble anticuerpo
y 125I como radio-ligando (Kit de Diagnostic Products, Los Angeles, USA); la
sensibilidad del ensayo fue de 2 pg/mL y el coeficiente de variación: intra <5 %,
inter <0.4 %. Para las determinaciónes de LH y TSH en plasma se utilizaron
RIAs (Fernández-Tresguerres, Álvarez, Álvarez-Buylla y Gil, 1992) por el
método validado por Tresguerres y Esquifino (1981). Todos los anticuerpos
utilizados fueron suministrados por el “National Institute for Arthritis Diabetes,
Digestive and Kidney Diseases” (NIADDK) y el “National Hormone and Pituitary
Program” (NHPP). Se prepararon alícuotas (100-200 µl en buffer de fosfatos) de
las muestras control y de las muestras problema. Después de añadir el primer
anticuerpo (100-200 µl) (anticuerpo anti-LH NIDDK-anti-rLH-S-10 en una dilución
45
1:2000 ó anticuerpo anti-TSH NIDDK-anti-rTSH-S-5 en una dilución 1:10000) y
la hormona marcada con 125I en PBS, se incubó durante 72 h a 4°C, y se añadió
el 2do anticuerpo (“conjugated goat anti-rabbit IgG in PBS”) en polietilenglicol o
hidroxiapatita en suero de conejo al 1 %. Se centrifugó a 1,500 rpm durante 15
min a 4°C, se aspiró el sobrenadante y se lavó el precipitado por dos veces con
1 ml de PBS y acuasol-2, se agitó y se contó en un contador de centelleo
gamma (Packard Cobra Auto-Gamma). La sensibilidd de la curva estándar fue
de 5 pg/mL y el coeficiente de variación: intra <7.5%, inter <12.6%. La
sensibilidad de la curva estándar para TSH fue 25 pg/mL y el coeficiente de
variación: intra <9, inter <14%.
Para la determinación hormonal de LH y PRL en el tejido (área
hipotálamo/hipófisis, hipotálamo/transplante o hipotálamo/con tejidos
remanentes de la hipofisectomía), los tejidos obtenidos con matrices se
colocaron en solución salina, se homogeneizaron por sonificación (Branson
Sonifier 450) a 4°C y se centrifugaron a 17000 rpm a 4°C. El sobrenadante se
sometió al ensayo de contenido hormonal por RIA como en el caso del plasma
(Tresguerres y Esquifino, 1981), utilizando como anticuerpo para PRL el NIDDK-
anti-PRL-S-9 a una dilución de 1:15000 en buffer de fosfatos y 0.25 % de suero
de conejo. La sensibilidad de la curva estándar para PRL fue 50 pg/mL y el
coeficiente de variación: intra <5%, inter <16%. Se estimó el contenido de
proteína en el tejido por el método del azul brillante (Bradford, 1976).
Inmunohistoquímica
Los estudios inmunohistoquímicos del área hipotálamo-hipófisis
(transplante) se hicieron en ratas perfundidas utilizando anticuerpos anti-LH
ovino (NIDDK-anti-obetaLH-IC-1) y anti-PRL de rata (NIDDK-anti-rPRL-IC-4)
ambos crecidos en conejo y obtenidos del Dr. A.F. Parlow (Pituitary Hormones
and Antisera Centre, Harbor-UCLA Centro Médico, Cal., USA). El tejido del
área hipotálamo-hipófisis (transplante) se postfijó durante una h con
46
paraformaldehido, se lavó primero con el buffer de fosfatos 1.0 M, pH 7.3,
durante dos o tres días con varios cambios para eliminar el fijador, y después
con buffer de fosfatos 0.1 M con diferentes concentraciones de sacarosa, 10, 20
y 30 %. Se congeló a -20°C en nitrógeno líquido hasta el procesamiento
posterior. Se hicieron cortes seriados del área hipotálamo/hipófisis o transplante
en el criostato, se lavaron en PBS (0.1 M, ph 7.3) que contenía suero-albúmina
bovino (PNB-BSA) y se preincubaron durante 30 min PBS-BSA al 30% con
suero de cabra normal. Después de lavar con PBS, con tritón X-100 al 0.1%
(Sigma), los cortes se incubaron durante 24 h en diluciones de los anticuerpos
descritos (primer anticuerpo) (PRL: 1/50, 1/100, 1/200, 1/500; LH: 1/100, 1/200,
1/500). Se lavaron 3 veces (5 min c/vez) en PBS, se incubaron por una h con
un segundo anticuerpo”) acoplado a FITC (fluoresceína-isotiocianato). Como
controles negativos se usaron cortes con el procedimiento descrito sin el
anticuerpo primario. Como controles positivos se utilizaron cortes de parótida
normal (in situ) procedentes de ratas no operadas.
En las ratas que se sacrificaron por decapitación, se obtuvo toda la
sangre del tronco, con heparina, que se congeló a -20°C para posteriormente,
hacer el análisis de hormonas.
Protocolo experimental
Los animales se dividieron en 3 grupos: 1) CONTROL, con operación
en blanco; 2) HIPOX, con hipofisectomía total, 3) TRANSP, con transplante de
un fragmento de glándula parótida después de la hipofisectomía total. A su vez,
cada uno de estos grupos se dividió en 2 subgrupos: a) sin estimulación de
LHRH y TRH, y b) con estimulación de LHRH y TRH (Fig. 13). El protocolo
experimental fue el siguiente:
Grupo 1a) ratas CONTROL, citología exfoliativa (1, 2, 4, 8 y 16
semanas), peso corporal, anestesia, toracotomía, extracción de sangre del
47
corazón, determinación de estrógenos y corticosterona, perfusión, peso de
tiroides, suprarrenales, ovarios y páncreas, histología de órganos blanco (n=10).
Grupo 2a) ratas HIPOX, citología exfoliativa (1, 2, 4, 8 y 16 semanas),
peso corporal, anestesia, toracotomía, extracción de sangre del corazón,
determinación de estrógenos y corticosterona, perfusión, peso de tiroides,
suprarrenales, ovarios y páncreas, histología de órganos blanco (n=20).
Grupo 3a) ratas TRANSP, citología exfoliativa (1, 2, 4, 8 y 16
semanas), peso corporal, anestesia, toracotomía, extracción de sangre del
corazón, determinación de estrógenos y corticosterona, perfusión, peso de
tiroides, suprarrenales, ovarios y páncreas, histología de órganos blanco (n=20)
Grupo 1b) ratas CONTROL, determinación de LH y TSH en la sangre
venosa (4, 8 y 16 semanas), inyección de factores estimuladores (LHRH y TRH),
15 min después, extracción de sangre del corazón y determinación de LH y TSH,
perfusión, inmunohistoquímica para la determinación de LH y PRL en los
tejidos, y fotomicrografías (n=6).
Grupo 2b) ratas HIPOX, determinación de LH y TSH en la sangre
venosa (4, 8 y 16 semanas), inyección de factores estimuladores (LHRH y TRH),
15 min después, extracción de sangre del corazón y determinación de LH y TSH,
perfusión, inmunohistoquímica para la determinación de LH y PRL en los tejidos,
y fotomicrografías (n=12).
Grupo 3b) ratas TRANSP, determinación de LH y TSH en la sangre
venosa (4, 8 y 16 semanas), inyección de factores estimuladores (LHRH y TRH),
15 min después, extracción de sangre del corazón y determinación de LH y TSH,
perfusión, inmunohistoquímica para la determinación de LH y prolactina en los
tejidos, y fotomicrografías (n=12).
48
Figura 13.- Flujo del protocolo experimental.
Análisis estadístico
Los valores se expresaron como medias aritméticas±error estándar.
Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para la comparación entre los valores
controles y los grupos experimentales. El nivel de significancia se fijó en P<0.05.
1) CONTROL n=16
2) HIPOX n=32
a) n=10 Sin
estimulación LHRH y TRH
b)n=6 Con
estimulación LHRH y TRH
a)n=20 Sin
estimulación LHRH y TRH
b)n=12 Con
estimulación LHRH y TRH
a)n=20 Sin
estimulación LHRH y TRH
3) TRANSP n=32
b)n=12 Con
estimulaciónLHRH y TRH
Ratas Wistar (hembras 150-200g) N=80
Subgrupos a)
Citología exfoliativa (1, 2, 4, 8 y 16 sem), peso corporal por semana, anestesia pentobarbital, determinación de estrógenos y corticosterona en sangre cardiaca, perfusión, extirpación de tiroides, suprarrenales, ovarios y
páncreas (peso/ histología).
Subgrupos b) Determinación de LH y TSH en sangre de vena yugular (4, 8 y 16 sem), se inyecta LHRH y/o TRH, 15 min. después extracción de sangre cardiaca, perfusión, extracción de hipotálamo-hipófisis /transplante, determinación de LH y PRL por inmunohistoquímica.
49
RESULTADOS
Sobrevida y peso corporal
Como se muestra en la figura 14 A, el promedio de la sobrevida en el
grupo HIPOX fue de 13±0.5 sem, por el contrario, el grupo TRANSP alcanzó una
sobrevida promedio de 18±0.2 (P<0.05). Si comparamos los resultados en
porcentajes, el grupo HIPOX tuvo una mortalidad del 20%, mientras que con el
transplante después de la hipofisectomía la mortalidad fue sólo del 10%,
tomando como referencia el grupo CONTROL (0 % de mortalidad). Estos
resultados coinciden con la valoración de los pesos corporales; en efecto,
cuando comparamos los promedios del peso corporal de las ratas CONTROL
con los de las ratas HIPOX y las ratas TRANSP, durante el periodo de estudio,
1, 2, 4, 8 y 16 semanas, no se observaron diferencias significativas durante las
dos primeras semanas después de la intervención quirúrgica. A partir de la
cuarta semana, el peso de las ratas HIPOX disminuyó en una proporción mayor
en comparación con el de las ratas TRANSP, y esta diferencia, estadísticamente
significativa (P<0.05), se mantuvo hasta la semana 16. El peso de las ratas
CONTROL durante el tiempo de estudio, siempre fue superior al de las ratas
TRANSP (Fig. 14 B). Es importante observar que a medida que aumentaba el
tiempo postoperatorio en el caso de las ratas TRANSP, la sobrevida, y los pesos
corporales se iban aproximando a los encontrados en las ratas CONTROL,
alejándose de los encontrados en el grupo HIPOX.
Ciclo estral
A partir de la obtención diaria de los exudados vaginales, tomados
después de las operaciones quirúrgicas, fue posible registrar el VE y por tanto, el
ciclo estral en los 3 grupos de estudio. El grupo CONTROL presentó ciclicidad
estrogénica durante todas las semanas del estudio (1, 2, 4, 8 y 16), es decir, se
pudieron observar consecutivamente las 4 etapas del ciclo: a) proestro con
células intermedias, de forma redondeada o poligonal, núcleo redondo u oval, de
50
color azul (acción progestágena); b) estro con escamas o células superficiales
grandes y aplanadas, en ocasiones con núcleo picnótico de color rosa (acción
estrogénica), y que corresponde a la etapa de ovulación; c) metaestro con
abundantes leucocitos y células basales y parabasales; d) diestro, leucocitos y
pocas células basales y parabasales, y gran cantidad de mucina.
Figura 14.- Comparación del tiempo de sobrevida (A) y el peso corporal (B) en las ratas
CONTROL, ratas HIPOX y ratas TRANSP. *P<0.05 entre TRANSP e HIPOX.
El grupo HIPOX no presentó ciclos estrales durante todo el periodo de
estudio (1, 2, 4, 8, y 16 semanas). Estas ratas permanecieron en anestro
constante, es decir, todos los días del ciclo estuvieron en la etapa de metaestro-
diestro, con abundantes leucocitos, escasas células basales y parabasales, y
abundante mucina.
HIPOX
TRANSP
SE
MA
NA
S
0
5
10
15
20
TRANSP
*
1 2 4 8 16 SEMANAS
100
200
300
*
CONTROL
0
PE
SO
S (
g)
HIPOX
51
Durante las semana 1 y 2 del estudio, todas las ratas del grupo
TRANSP permanecieron en diestro. A medida que se avanzó en el tiempo de
sobrevida, el aspecto de los exudados vaginales mostró un aumento gradual en
la ciclicidad estrogénica, que alcanzó el 50 % de las ratas en la semana 4, y el
75 % de las ratas en las semanas 8 y 16 (Fig. 15).
0
20
40
60
80
100
1 2 4 8 16
CONTROL
TRANSP
HIPOX
Figura 15- Valor estrogénico en las ratas CONTROL, ratas HIPOX y ratas TRANSP durante las
semanas que duró el estudio. *P<0.05 entre TRANSP e HIPOX.
Peso de las glándulas blanco
Al comparar los promedios del peso de las glándulas blanco
estudiadas en los tres grupos experimentales, se observó que aunque el peso
fue siempre mayor en el grupo TRANSP con relación al grupo HIPOX, éste
SEMANAS
VA
LO
R E
ST
RO
GÉ
NIC
O (
%) *
*
52
estuvo alejado del peso obtenido en las ratas CONTROL salvo en el peso de las
tiroides, hasta el final del periodo de estudio (1, 2, 4, 8 y 16 sem). Cuando
comparamos solo los dos grupos hipofisectomizados, se vio un incremento
significativo en el peso de las suprarrenales y tiroides del grupo TRANSP en
relación con el grupo HIPOX (P<0.05) a partir de la semana 8 después de la
operación (Fig. 16 A y B). Con respecto al peso de los ovarios, se obtuvieron
diferencias significativas (P<0.05) entre el las ratas TRANSP y las ratas HIPOX a
partir de la semana 4 postoperatoria (Fig. 16 C). Es interesante ver que a
medida que aumenta el peso ponderal con aumento del tiempo de sobrevida, en
las ratas operadas con transplante, las glándulas dependientes de la hipófisis
también aumentan de tamaño, aunque lentamente.
Las diferencias en el peso, observado en las glándulas suprarrenales
y en los ovarios de las ratas CONTROL, durante las 4 primeras semanas, podría
deberse a la recuperación postoperatoria (operación simulada), ya que los
requerimientos energéticos en las ratas normales adultas aumentan
abruptamente, fase de flujo tardía. Sería necesario aumentar el número de
animales por grupo y prolongar los experimentos por periodos de tiempo más
largos para definir estas diferencias.
También el peso del páncreas fue mayor en el grupo control a medida
que avanzaba el tiempo postoperatorio hasta la semana 4. Cuando se comparó
el peso del páncreas entre el grupo HIPOX y el grupo TRANSP no se
encontraron diferencias significativas durante el periodo experimental, aunque se
observó una tendencia a ser mayor en las ratas TRANSP en las últimas
semanas del estudio (Fig. 16 D).
53
Figura 16.- Comparación del peso promedio de las glándulas suprarrenales (A), tiroides (B),
ovarios (C) y páncreas (D) de los grupos CONTROL, HIPOX y TRANSP. *P<0.05 entre
TRANSP e HIPOX.
Niveles hormonales en plasma de las glándulas blanco
La comparación de los niveles plasmáticos de corticosterona entre los dos
grupos hipofisectomizados, durante el periodo de estudio, dio los siguientes
resultados. En el grupo TRANSP llegaron hasta 5.52 µg/dL, mientras que en el
grupo HIPOX se mantuvieron entre 0.3 y 0.8 µg/dL hasta la semana 16, y esta
diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.043) (Tabla 4). En el grupo
0
50
100
150
200
250
300
PE
SO
(m
g)
1 2 4 8 16
SEMANAS
0
1
2
3P
ES
O (
g)
1 2 4 8 16
A B
C D
* *
* *
0
20
40
60
PE
SO
(m
g)
1 2 4 8 16
* * *
0
20
40
60
1 2 4 8 16
CONTROL
TRANSP
HIPOX
54
CONTROL el nivel de corticosterona en el plasma (26.5±1.0 µg/dL) fue siempre
mayor que en las ratas TRANSP.
En cuanto a los niveles de estrógenos en suero, en los dos grupos
de ratas con hipofisectomía (HIPOX y TRANSP) fueron significativamente
menores que en el grupo CONTROL (27.30±4.3 pg/mL) en todos los tiempos
estudiados, la significancia entre el grupo TRANSP y el CONTROL fue P<0.045,
P<0.038, P<0.036 respectivamente). Sin embargo, a partir de la semana 4
postoperatoria, el nivel de estrógenos en suero aumentó progresivamente en el
grupo TRANSP hasta alcanzar, en la semana 16, un valor de 5.06±0.5 pg/mL,
significativamente mayor que en las ratas HIPOX, que no tuvieron niveles
detectables en la misma semana del estudio (P<0.05) (Tabla 4).
Tabla 4.- Concentración en sangre de las hormonas dependientes de la hipófisis.
HIPOX TRANSP
Tiempo CORTICOST.
(µg/dL)
ESTROG.
(pg/mL)
CORTICOST.
(µg/dL)
ESTROG.
(pg/mL)
4 0.30±0.03 <2 1.81±0.41* 2.9±0.2*
8 0.80±0.05 <2 3.70±0.50* 4.5±0.3*
16 0.44±0.02 <2 5.52±0.60* 6.8±0.5*
Tiempo; semanas. CORTICOST., corticosterona; ESTROG., estrógenos; *P<0.0.5.
Niveles de algunas hormonas hipofisiarias (plasma y tejido) antes y después de la estimulación con factores liberadores hipotalámicos.
Los niveles promedio de LH en plasma fueron significativamente
menores (P<0.05) en los dos grupos hipofisectomizados (HIPOX y TRANSP)
cuando se compararon con los obtenidos en el grupo CONTROL, en todos los
tiempos estudiados. Sin embargo, a partir de la semana 8, los valores de LH en
55
el grupo TRANSP aumentaron progresivamente, llegando en la semana 16, a un
valor de 7.2±1.0 pg/mL (Tabla 5). Estas ratas, también mostraron un aumento
significativo (P<0.05) en el nivel de LH en el plasma después de la estimulación
con LHRH en las semanas 8 y 16 cuando se compararon con ratas HIPOX de
los mismos tiempos postoperatorios, que no mostraron efectos post-estimulación
(Tabla 5).
Tabla 5.- Efectos de la estimulación con LHRH sobre la concentración plasmática de LH (pg/mL).
Tiempo; semanas. B, basal antes de la estimulación con LHRH; E, después de la estimulación con LHRH; No det., no detectable. *P<0.05 entre B y E en CONTROL, y entre TRANSP e HIPOX a los mismos tiempos.
El promedio de los niveles plasmáticos de TSH en los grupos HIPOX y
TRANSP durante el periodo de estudio, siempre estuvo por debajo de los
obtenidos en el grupo CONTROL. Pero, cuando se compararon los grupos
HIPOX y TRANSP entre sí, después de la estimulación con TRH, se obtuvieron
diferencias significativas a las 8 y 16 semanas postoperatorias a favor de las
ratas transplantadas (Tabla 6).
Después de la estimulación con los factores liberadores también
medimos el contenido de LH y PRL en el tejido transplantado. El transplante de
parótida se reconocía fácilmente después de la disección del área hipotálamo-
Tiempo CONTROL HIPOX TRANSP
B E B E B E
4 59.2±18 904.9±20.6* 1.0±0.2 No det. 2.1±0.2 3.1±0.3
8 2.1±0.4 2.2±0.6 5.1±1.0 16.2±1.2*
16 2.9±0.8 No det. 7.2±2.0 28.3±6.5*
56
transplante, tanto en las ratas prefundidas como en fresco. Los valores
obtenidos se ilustran en la Tabla 7. Cuando comparamos el contenido de PRL y
LH en el tejido transplantado o en la zona operatoria después de la
hipofisectomía, se observaron diferencias significativas en la semana 16
(P<0.05). El contenido hormonal en el tejido transplantado fue siempre mayor
en las ratas TRANSP en comparación con el de las ratas HIPOX, pero estuvo
muy por debajo del contenido hipofisiario en las ratas CONTRL. Como se
esperaba, la valoración del contenido hormonal en la parótida normal in situ no
dio valores detectables.
Tabla 6.- Efectos de la estimulación con TRH sobre la concentración de TSH en plasma (ng/mL.
Tiempo CONTROL HIPOX TRANSP
B E B E B E
4 5.3±1.0 12.6±2.* 2.2±1.0 2.4±0.9 2.1±0.4 3.9±0.3
8 3.1±0.7 3.0±0.8 4.1±1.0 8.0±0.5*
16 3.9±0.9 3.1±0.5 4.2±0.2 6.1±0.4*
Tiempo; semanas. B, basal antes de la estimulación con TRH; E, después de la estimulación con
TRH. *P<0.05 entre HIPOX y TRANSP.
Tabla 7.- Contenido de hormonas hipofisiarias en el tejido.
PAROT in situ HIPOX TRANSP
LH (ng/mg prot.) No detectable 5.1±4 29.3±14*
PRL (ng/mg prot.) 1.1±0.1 3.5±3 20.2±7*
PAROT in situ, tejido de glándula parótida de una rata normal. *P<0.05 entre TRANSP e HIPOX.
57
Histología
Dos semanas después del transplante la glándula suprarrenal
presentaba una disminución de las zonas fascicular y reticular, en las semanas
4, 8 y 16 la disminución de estas zonas se hizo menor y las células tenían un
aspecto funcional relativo para la síntesis y secreción de hormonas adrenales.
En el grupo HIPOX la glándula suprarrenal en la semana 4 tenía un atrofia
importante de las zonas fascicular y reticular, para llegar, en la semana 16 a una
atrofia severa. No se apreciaron cambios en la zona glomerular, ni en la médula
adrenal, en los 3 grupos estudiados (Fig. 17).
En la tiroides de las ratas HIPOX, conforme avanzaban las semanas
de la operación, se observó una pérdida importante de folículos y material
coloide acidófilo, rico en yodo y que contiene las hormonas tiroideas, el epitelio
columnar de recubrimiento folicular era aplanado con núcleos de mayor tamaño
que lo normal. El tejido tiroideo en las ratas TRANSP tenía más folículos con
coloide, y el epitelio de recubrimiento folicular se aproximaba al normal (Fig.18).
En las ratas HIPOX, una sem después de la operación, la histología
ovárica, cápsula, corteza y médula, se aproximaba a la del ovario normal. En la
semana 2, a nivel de corteza, solo se observaron folículos primarios. En la
semana 4 la corteza presentó folículos primarios y la médula abundante
estroma. En la semana 8 los folículos estaban atrésicos, con abundante
estroma, y en la semana 16 los ovarios mostraban una marcada atrofia con
folículos atrésicos. Por el contrario, en el grupo TRANSP, a partir de la semana
8. se pudieron observar en todos los cortes histológicos, las distintas regiones,
cápsula, corteza y médula, aproximándose al aspecto de las ratas CONTROL,
con folículos primarios y secundarios (Fig. 19).
No se observaron cambios significativos en la histología del páncreas
en ninguno de los grupos estudiados (resultados no mostrados).
58
Figura 17.- Histología de la glándula suprarrenal en las ratas HIPOX (A) y TRANSP (B) en la semana16, hematoxilina eosina X 20.
Figura 18.- Histología de la glándula tiroides en las ratas HIPOX (A) y TRANSP (B) en la semana 16, hematoxilina eosina X 20.
BB A B
A
B
59
Figura 19.- Histología del ovario en las ratas HIPOX (A) y TRANSP (B) en la semana 16, hematoxilina eosina X 20.
Inmunohistoquímica
Las inmunotinciones con anticuerpos anti-LH y anti-PRL, mostraron,
en la semana 16, la presencia de células positivas a estos factores
hipotalámicos en los tejidos parotídeos transplantados. Se observaron varios
nódulos de células ovales de mayor tamaño que las parotídeas pero menores
que las de la adenohipófisis, con distintos grados de transformación estructural y
cierto grado de acidofilia (Fig. 20). Las células LH reactivas eran de forma oval
y estaban esparcidas en el tejido transplantado. Se encontró un número
sorprendentemente alto células reactivas a PRL. Cuando observamos el
transplante inmunoteñido con microscopio fluorescente, se pudo observar que
estas células, de forma redondeada, se diferenciaban claramente del resto de
las células en el tejido (Fig. 21). Las inmunotinciones en las parótidas in situ
A B A
60
(antes de ser transplantadas) mostraron glándulas acinares dentro de tejido
conectivo, sin cambios de diferenciación
Figura 20.- Tinción inmunohistoquímica con anticuerpo anti-LH en la parótida control (in situ), la hipófisis control (in situ) y la parótida transplantada en la silla turca después de la hipofisectomía total (16 semanas) X 250. En el recuadro dentro de la hipófisis control (asterisco) tenemos la misma hipófisis control con un aumento mayor, X 800.
Parótida control
Transplante parótida Hipófisis control
*
61
Figura 21.- Tinción inmunohistoquímica con anticuerpo anti-PRL en la parótida control (in situ), la hipófisis control (in situ) y la parótida transplantada en la silla turca después de la hipofisectomía total (16 sem) X 250.
Hipófisis control controlol
Transplante parótida Parótida control
62
DISCUSIÓN
En 1962 se descubrió el factor de crecimiento epidermal (EGF) en la
glándula parótida (Cohen, 1962), y un año más tarde Álvarez-Buylla y Álvarez-
Buylla (1963) publican su primer trabajo sobre el transplante de glándula
parótida en lugar de la hipófisis en perros, sugiriendo que el factor de
crecimiento contenido en la glándula podría promover el crecimiento y la
diferenciación celular; un dato más, que sumado a la vascularización
hipotalámica que irriga el tejido parotideo transplantado, podría facilitar la
transformación parcial de las células parotídeas a células hipofisiarias. En la
parótida se han encontrado péptidos como SS, VIP y PRL (Hauser-Kromberger,
Albegger, Saria y Hacker, 1992), así como factores de transcripción específicos
para hormonas de la hipófisis (Voutetakis, Bossis, Kok, Zhang, Wang, Cotrim,
Zheng, Chiorini, Nierman y Baum, 2005), lo que hará posible que bajo
circunstancias especiales, las células parotídeas sean capaces de sufrir una
transdiferenciación celular para secretar hormonas hipofisiarias. Cuando se
realiza un transplante de tejido graso, la sobrevida está por encima de la
observada en los perros hipofisectomizados sin transplante, pero el resto de los
parámetros estudiados está muy por debajo de lo alcanzado con tejido de
glándula parótida (Álvarez-Buylla y col., 1970; Tresguerres y col., 1999; Safford
y col, 2005).
La elección de la glándula parótida para el transplante en este trabajo
de tesis, se realizó en base al origen embriológico que tiene en común con la
hipófisis, es decir, el ectodermo; a pesar de que posteriormente, ésta es una
glándula exocrina y la hipófisis una glándula endocrina, como vimos en la
introducción de esta tesis. La posibilidad de que ocurran cambios
morfofuncionales en una célula parotídea para transformarla en una célula
hipofisiaria-semejante, se llevaría a cabo siempre que la vía de vascularización
del tejido transplantado provenga del hipotálamo y contenga las
63
neurosecreciones correspondientes (Guillemin, 2005) capaces de inducir
diferenciación celular.
Desde los trabajos de Patterson y Chun (1977), se sabe que los
factores ambientales influyen de manera determinante en la diferenciación
celular. En efecto, la plasticidad celular se pone de manifiesto en múltiples
experimentos con cultivo de distintos tejidos (Filip y col., 2004). La mayoría de
los tejidos en el adulto retienen un reservorio de células madre o “stem cells”
pluripotentes que pueden generar distintos componentes tisulares (Álvarez-
Buylla, García-Verdugo y Tramontin, 2001). Hasta los años recientes se
pensaba que el cerebro constituía una excepción para esta regla general y los
investigadores aseguraban que las células madre, que dan origen a neuronas,
se acababan después del nacimiento, momento en que se detenía la
neurogénesis (Altman, 1962); pero, durante los últimos años se ha ido reuniendo
información que nos demuestra la retención de células madre con producción de
neuronas y glías en el cerebro adulto (Seri, García-Verdugo, Mc Ewen y Álvarez-
Buylla, 2001; Sanai, Tramontin, Qiñones-Hinojosa, Barbaro, Gupta, Kunwar,
Lawton, McDermott, Parsa, García-Verdugo, Berger y Álvarez-Buylla, 2004),
sugiriendo que en el cerebro persiste un continuum de actividad germinal
(Álvarez-Buylla y col., 2001; Fuchs y Segre, 2000). Es bien conocido el hecho
de que los medios de cultivo condicionan el proceso de diferenciación celular
(Potter y col., 1986; Villalobos y col., 2004); así, Furshpan y col. (1986) muestran
que cuando se cultivan neuronas simpáticas neonatales con miocitos cardiacos,
las neuronas cambian de ser adrenérgicas a colinérgicas. Los cambios
morfológicos en neuronas adultas, y en otros tipos celulares, también son
factibles, aunque, más difíciles de lograr. De la misma manera, se demuestra
que ciertas hormonas como los andrógenos, y algunos transgenes, estimulan la
diferenciación y mitogénesis e inducen cambios morfológicos en los osteoblastos
(Kasperk y col., 1990), en las células intestinales y las células precursoras de
células adiposas (Xu y Bjorntorp, 1987), y en las células pancreáticas (Li y col,
2005). Inoue y Sakai (1991) encuentra in vitro, que el factor de crecimiento
64
semejante a la insulina (IGF-1) cambia las células pituitarias somatotropas en
células lactotropas.
No hay datos que demuestren claramente si todos los tipos celulares
de la hipófisis derivan de las mismas células progenitoras, pero Hoeffler y
Frawley (1987, 1991) apoyan la existencia de un linaje común para las células
lactotropas y somatotropas en la rata, y demuestran que los factores
hipotalámicos son capaces de modificar la proporción de células secretoras de
LH o PRL en tejidos hipofisiarios in vitro. Estos experimentos nos indican que
algunos factores, que no influyen normalmente en la producción de LH y PRL,
pueden inducir, bajo condiciones crónicas, diferenciación celular en las células
secretoras de estas hormonas (Xiaoqin, Nishimura y Porter, 2004). Heritier y
Dubois (1993, 1994) señalan que la TRH es capaz de inducir la formación de
células gonadotropas, y la LHRH, la formación de células tirotropas en tejidos
embrionarios de hipófisis bajo ciertas condiciones in vitro; por el contrario, los
mismos autores señalan que una sola hormona hipotalámica es capaz de inducir
diferenciación en más de una célula hipofisiaria (Heritier y Dubois, 1994). En el
mismo sentido, se ha descrito la participación de factores de transcripción y
expresión genética en la síntesis de algunas hormonas como GH, PRL y TSH
(Simmons, Voss y Ingraham, 1990).
El estudio de la rata hipofisectomizada ha jugado un papel central para
explicar las funciones neuroendorinas hipotálamo-hipófisis-glándulas blanco o
diana (Harris, 1955), por lo que pensamos que es importante reproducir en
ratas, los estudios realizados en perros (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1963).
El primer reto para conseguir el objetivo de este trabajo, fue la puesta en marcha
de la técnica para realizar la hipofisectomía completa en ratas, por vía
retrofaríngea, bajo control microscópico, descrita en la sección de Métodos; así
como el autotransplante inmediato de un fragmento de glándula salivar
(parótida) en el mismo acto quirúrgico. Dadas las diferencias anatómicas entre
las dos especies, la técnica descrita por Álvarez-Buylla y col. (1991) fue la
65
primera en definir los parámetros detallados para su implementación posterior.
Las principales ventajas de dicha técnica radican en lo siguiente: el tipo de
anestesia ip, con una duración suficiente para cubrir el tiempo quirúrgico; la
intubación endotraqueal a través de la boca, evitando el trauma de una
traqueotomía, para proporcionar ventilación artificial y conseguir mayor
probabilidad de éxito en el momento de separar las estructuras del cuello; la
apertura amplia del hueso y de la duramadre con una aguja especial, que
permite una visión perfecta de la hipófisis para su aspiración (controlada)
posterior, extrayendo íntegra la hipófisis con el tallo hipofisiario. Este paso es
primordial, tanto en cuanto al lugar de la trepanación, como a su tamaño,
evitando dañar a la duramadre. El exquisito cuidado de la técnica evita la
hemorragia, pero en caso de presentarse, se reduce con “gel-foam”. El
transplante se llevó a cabo según la técnica descrita en Métodos en un campo
totalmente visible y libre de hemorragia, después de abrir el diafragma selar, con
objeto de poner el fragmento de tejido parotídeo en contacto directo con el
hipotálamo. En la sangre sistémica las neurosecreciones se encuentran en una
concentración tan baja que no son capaces de inducir diferenciación celular; por
lo que la superficie de contacto entre el hipotálamo y el transplante debe ser la
vía de vascularización, para que los factores hipotalámicos generen los cambios
morfofisiológicos (Álvarez-Buylla y Tsutsumi, 1979). Para garantizar esta vía de
vascularización el transplante se aisla en su parte ventral por un taponcito de
silastic (Dow Corning).
De los experimentos descritos por Álvarez-Buylla y cols. (1963, 1964,
1970, 1974 y 1979), así como de nuestros resultados, se deriva la siguiente
pregunta: ¿los efectos observados se deben a la inducción de las células de
parótida o a un efecto indirecto sobre las células adenohipofisiarias remanentes?
Debemos tener en cuenta que con la técnica de Álvarez-Buylla y col. (1991) se
consigue remover la hipófisis completa con su tallo pítuitario y sin hemorragia,
pudiendo examinarla a simple vista o bajo microscopio (Fig. 11). Esta técnica
dista mucho de las técnicas descritas con anterioridad por Zarrow, Yochim y
66
McCarty (1964), cuya aproximación auricular no permite la visualización directa
de la hipófisis.
En este estudio, el peso corporal de las ratas HIPOX disminuyó 30%
en el transcurso de las semanas posteriores a la cirugía, y su estado de salud
se fue deteriorando con el tiempo de sobrevida. Por el contrario, las ratas
TRANSP recuperaron parte del peso ponderal, perdido durante los primeros
días postoperatorios, a 16 semanas después de la operación, consiguiendo
aproximarse al grupo CONTROL, aunque sin llegar nunca a los pesos de estas
ratas. Esto sugería que la recuperación de GH es poco notoria, probablemente
debido al predominio del efecto negativo de la SS (Devesa, Lima y Tresguerres,
1992). Aunque se ha reportado en ratas, la síntesis de GH bajo la estimulación
GHRH en células cultivadas (Tresguerres y col., 1999), en estudios in vivo se
ve que la recuperación de los niveles de GH plasmáticos, tanto los basales como
los obtenidos después de GRF, son indetectables en las primeras semanas
después del transplante (Fernández-Tresguerres y col., 1999). Nuestros
resultados en cuanto a la sobrevida de los animales concuerdan con los de
Álvarez-Buylla y col. (1970) que observan una sobrevida más larga en los perros
hipofisectomizados con transplante de glándula parótida que en los que no
tenían transplante. La mortalidad en el grupo HIPOX se presentó con una
frecuencia más alta en los animales que tenían mayor tiempo de operados, lo
que se explica por la falta de hormonas producidas por la hipófisis (ACTH, GH y
TSH) necesarias para realizar las diversas funciones vitales para mantener la
homeostasis del organismo de los mamíferos (Álvarez-Buylla y col., 1970; 1973;
Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1974; Álvarez-Buylla y Tsutsumi, 1979). El
cortisol secretado por las adrenales empieza a decrecer a las 24 h de la
hipofisectomía por la ausencia de ACTH (Curpide, 1954). A partir de la semana
4 después del transplante, se presentó una clara recuperación del peso corporal.
Observación que sugiere la presencia de sustancias de origen hipotalámico que
estimulan a la glándula parótida, y pensamos que debe transcurrir cierto tiempo
para que la desdiferenciación y transformación de las células transplantadas se
67
lleve a cabo, lo que nos hace suponer la existencia, en ese momento, de células
diferenciadas, funcionales.
El ciclo estrogénico, reflejo de la actividad gonadotrópica de la
hipófisis, estuvo presente en algunas de las ratas TRANSP a partir de la
semana 4; al pasar las semanas, se fue regulando el ciclo en cuanto al tiempo,
y en la semana 16 el porcentaje de ratas con ciclicidad presente fue mayor,
debido a la actividad de los ovarios tras el estímulo del transplante. El hecho de
que no todos los animales presentaran ciclo estral, se debe probablemente, al
estrés postquirúrgico que influye en la vascularización del transplante, y a la
manipulación del animal para realizar el estudio, lo que modifica la actividad
hormonal en las ratas más sensibles (Yehuda, 1998). La aparición de los ciclos
estrales en las ratas TRANSP confirmó datos anteriores en perros (Álvarez-
Buylla y col., 1973), Los ciclos se presentaron simultáneamente con un
aumento significativo en los niveles de estrógenos y LH en plasma. Aunque los
niveles de estrógenos y LH en las ratas TRANSP siempre fueron menores que
en las ratas CONTROL, también aumentaron en respuesta a la estimulación
LHRH, datos que sugieren fuertemente la desdiferenciación de las células
salivares en células hipofisiarias-semejantes. La producción de LH se pudo
observar también en ratas con transplante de grasa, pero en este caso los
niveles fueron significatívamente menores (Tresguerres y col., 1999). Nuestros
datos no excluyen la posibilidad que el tejido transplantado facilite la expresión
de células pituitarias remanentes (Dedov, 1972). Resulta interesante el hecho
que a partir del segundo mes del transplante sea cuando aparezcan los cambios
funcionales, tanto en cuanto a peso corporal, como al ciclo estral y por supuesto,
a la sobrevida. Álvarez-Buylla y col. (1973) observaron en los perros
transplantados con glándula parótida, cierta normalización de los ciclos estrales
en las hembras, así como la producción de espermatozoides en los machos. Se
debe tener en cuenta que el seguimiento del estudio en estos animales fue entre
uno y dos años, además de que el ciclo estral en las perras es muy diferente al
de las ratas que tienen una ciclicidad muy corta (4-5 días).
68
Observamos una disminución marcada en cuanto al peso de los
órganos diana (suprarrenales, tiroides, ovario) de las ratas HIPOX en relación a
las ratas CONTROL. En el caso de las ratas TRANSP el peso de estos órganos
se afecta menos, fundamentalmente en los animales que presentaron el estado
de estro y niveles mayores de corticosterona, y las diferencias con respecto al
grupo HIPOX fueron significativas (P<0.05). Estos resultados coinciden con los
presentados por Álvarez-Buylla y col. (1974, 1979) en experimentos in vivo, y
Tresguerres y col. (1999) en cultivo de células de parótida bajo la estimulación
de hormonas hipotalámicas, y sugieren la presencia de algún factor o factores
hipotalámicos que inducen la diferenciación celular de la parótida. Es distinto el
tiempo que se tarda el tejido transplantado in vivo en asumir las características
de los tejidos adultos, con el tiempo en que los el tejidos in vitro adquieren
características endocrinas (Tresguerres y col., 1999), debido probablemente al
tiempo que transcurre en establecerse la red hipotalámica de vascularización, ya
que el tejido transplantado al principio sufre una degeneración parcial (Costero y
col., 1975).
Las glándulas suprarrenales aumentaron de peso en las semanas 8 y
16 en el grupo TRANSP, y los niveles de corticosterona aumentaron a partir de
la semana 4, a pesar de que los cambios histológicos fueron mas marcados a
partir de la semana 8. Esto indicaría que las células transplantadas para
diferenciarse en células corticotropas necesitan más tiempo que las otras células
hipofisiarias, sin embargo, la liberación de corticosterona observada, es una
indicación de la actividad de las células adrenales, y esto explicaría el aumento
en la sobrevida de este grupo de ratas en relación al grupo HIPOX. Es
importante señalar que en el feto, el control hipotalámico sobre la secreción de
ACTH es imprescindible, mientras que el resto de las hormonas hipofisiarias
tienen una dependencia mucho menor (Tuchman-Duplessis, Auroux y Haegel,
1975). Álvarez-Buylla y su grupo (Álvarez-Buylla y col.,1967, 1970a, 1979) y
Tresguerres y col. (1999), evaluando la actividad adrenocortical mediante varias
69
técnicas, comprueban las diferencias en la recuperación después del
transplante.
Los pesos de la tiroides en las ratas HIPOX son significatívamente
más bajos que en las ratas TRANSP y no mostraron variaciones significativas
durante las primeras semanas del estudio al igual que en los cortes histológicos
de tiroides, donde se observó una atrofia muy avanzada. Sin embargo, hacia las
semanas 8 y 16 del estudio, en las ratas TRANSP se vio un aumento pequeño
pero significativo en el peso tiroideo, y este aumento coincidió con la presencia
de TSH en plasma y en el tejido transplantado, ante el estímulo de TRH, pero el
efecto positivo fue más retardado. Pensamos que este efecto podría deberse a
que la tiroides es la única glándula endocrina que almacena su material de
secreción.
Los ovarios aumentaron de tamaño a partir de la semana 4 en las
ratas TRANSP, coincidiendo con el aumento en los niveles de estrógenos en la
misma semana. El aspecto de la histología de los ovarios mostró la presencia
de folículos en desarrollo desde las primeras semanas, del transplante, hecho
que nos indica que las células transplantadas que primero se diferencian son las
gonadotropas. Cuando se estimuló con LHRH, se encontró un claro efecto
sobre los niveles plasmáticos de LH, así como LH y PRL en el tejido
transplantado; resultados que coinciden con los encontrados por Tresguerres y
col. (1999) en experimentos in vitro. Aunque la presencia de LH y PRL que se
pudo detectar en la parótida transplantada fue muy inferior al de la hipófisis
normal, siempre fue superior al de la parótida normal in situ, antes de ser
transplantada, donde los niveles no fueron detectables, o no fueron
significativos. El pico de LH tras el estímulo con LHRH en la rata hembra
depende de la fase del ciclo estral en que se realice (Kalra y Kalra, 1989). El
aumento en las concentraciones circulantes de estradiol (fase de estro)
desencadena la liberación, al sistema portal hipofisiario, de concentraciones
altas de LHRH (Fink, 1979) procedentes de neuronas hipotalámicas. La
70
liberación de LHRH es pulsátil (Knobil y Neill, 1994), y es capaz de liberar tanto
LH como FSH de la hipófisis, en proporción a los esteroides sexuales y a la
inhibina (Tresguerres, 1989). La administración continua de LHRH provoca
niveles bajos de LH y FSH por un fenómeno de regulación a la baja (down
regulation) o desensibilización de los receptores hipofisiarios para LHRH (Poyo-
Guerrero, Castel y Tresguerres, 1989); por lo tanto para conseguir un estímulo
semejante al de la rata normal sería necesario diseñar la estimulación crónica
con liberación de pulsos de LHRH cada 90-120 min añadiendo GH (Poyo-
Guerrero y col., 1989), con lo que probablemente se conseguiría revertir el
hipogonadismo en el animal crónico después del transplante.
El páncreas no mostró variaciones de peso en ninguno de los grupos
hipofisectomizados, tampoco se observaron cambios en los cortes histológicos,
pensamos que el periodo de estudio fue demasiado corto para observar cambios
en la homeostasis glucémica derivada de una atrofia de células beta en el
páncreas. Aunque la hormona de crecimiento tiene efecto diabetogénico
(Houssay, 1922), es probable que el hecho de utilizar ratas adultas en este
estudio haya sido la causa de esta divergencia.
Las diferencias observadas entre las ratas de un mismo grupo pueden
deberse a diversos factores: técnica quirúrgica adecuada o no, presencia o no
de hemorragia, compresión hipotalámica y por tanto mayor aparición de zonas
necrosadas, etc. Sin embargo, los estudios anteriores indican que las zonas del
transplante mejor conservadas y diferenciadas son aquellas que están más
próximas al tercer ventrículo, y es en este lugar donde empiezan a formarse
estructuras foliculares con distintas afinidades tintoriales, lo que sugiere que sea
precisamente la presencia de factores hipotalámicos (Guilemin, 2005) la que
induce los cambios morfológicos (Costero y col., 1975).
Los análisis histológicos con técnicas inmunohistoquímicas mostraron
la aparición de cambios en la estructura parotídea a la semana 16. Se puede
71
detectar la presencia de estructuras acinares de la glándula salivar, así como
células reactivas para LH y/o para PRL, parecidas a las hipofisiarias, ante la
presencia de anticuerpos anti-LH y anti-PRL. En la parótida normal in situ no se
pudieron observar los cambios descritos (Figs. 20 y 21), pero sí como es
natural, en la hipófisis normal in situ.
Ante las evidencias crecientes que sugieren la presencia de
transdiferenciación en distintos tejidos transplantados, así como la presencia de
reservorios de células madre en SNC en el cerebro de roedores (Ferrell y
Machleder, 1998), y en el cerebro humano ( Nader, Tramontin, Quiñones-
Hinojosa, Barbaro, Gupta, Kunwar, Lawton, Mcdermott, Parsa, García Verdugo,
Berger, Álvarez-Buylla, 2004) que dan origen a nuevas neuronas en el adulto,
pensamos que existen posibilidades excitantes para afrontar los retos que nos
presentan los múltiples desórdenes neurológicos (Álvarez-Buylla, García y
Tramontin, 2001; Filip y col., 2004).
72
CONCLUSIONES
1.- El transplante de parótida incrementa el peso y la sobrevida de las
ratas TRANSP en comparación con las ratas HIPOX, coincidiendo con la
elevación de los niveles de corticosterona en plasma, y con la presencia de
células acidófilas y basófilas en el tejido parotídeo transplantado al lugar de la
hipófisis.
2.- El transplante de parótida responde a los estímulos de LHRH,
modificando la histología ovárica, incrementando los niveles de estrógenos y LH
en plasma, así como la aparición inmunohistoquímica de células LH-positivas del
tejido parotídeo transplantado. El tejido parotídeo normal in situ fue negativo
para la inmunohistoquímica.
3.- El transplante de parótida responde a los estímulos de TRH,
modificando la estructura tiroidea, incrementando los niveles de TSH en plasma.
4.- En el tejido de parótida transplantado se incrementan los niveles de
PRL, en relación con tejido de parótida no transplantada. De la misma manera,
se incrementa la aparición de células PRL-positivas cuando utilizamos técnicas
inmunohistoquímicas.
5.- Se observaron células basófilas y acidófilas en el tejido parotídeo
transplantado, demostrado por imnunohistoquímica.
6.- El transplante de parótida en la silla turca, en substitución de la
hipófisis extirpada, es capaz de asumir en forma parcial las funciones de la
hipófisis.
73
PERSPECTIVAS
El conocimiento actual de las funciones normales de la hipófisis, así
como de su patofisiología, no nos permite acceder a patrones de terapia
substitutiva eficientes en los casos de hipofisectomía quirúrgica. Con este
trabajo intentamos conseguir modelos de substitución, que nos permitan conocer
los mecanismos de la diferenciación celular que obedecen a señales
procedentes de SNC y que modifican los tejidos transplantados en la silla turca.
Para trabajos posteriores nos parece importante realizar los siguientes
experimentos:
a) Ratas con transplante de un fragmento de parótida en el lugar de la
hipófisis extirpada, prolongando el tiempo de sobrevida hasta 24
semanas o más.
b) Experimentos en ratones hipofisectomizados con transplante de un
fragmento de glándula parótida extirpada de ratones transgénicos, en
los que se pueda monitorear con precisión, en el huésped, a las
células transplantadas.
c) Experimentos con transplantes de tejidos capaces de ser
transdiferenciables en cultivo.
d) Transplantes de células madre de SNC en contacto con el hipotálamo
basal.
e) En cultivo de tejidos de parótida, buscar las neurosecreciones y/o los
factores que llevan a cabo la diferenciación de células parotídeas a
hipofisiaria-semejantes.
74
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