UNIVERSIDAD DE CHILE · Enlace peptídico absorbe luz UV entre 200 y 220 nm (215nm) Proteínas y...

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

Desarrollo, Validación y Aplicación de ensayos analíticos para péptidos y proteínas, farmacológicamente activas, utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución. Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Ciencias Farmacéuticas, por

CRISTÓBAL ANTONIO VALLEJOS RAMOS DIRECTOR DE TESIS Dra. Maria Nella Gai Hernández

Santiago - Chile 2007

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGISTER

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Magister presentada por el candidato:

CRISTÓBAL ANTONIO VALLEJOS RAMOS Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis para optar al grado de Magister en Ciencias Farmacéuticas, en el examen de defensa de Tesis rendido el día de del 2007. ________________________________________________________________________________ DIRECTOR DE TESIS Dra. María Nella Gaí Hernández ______________________ COMISIÓN INFORMANTE DE TESIS Prof. Inés Ruiz Alvarez (Presidente) ______________________

Prof. Iván C. Sturm Schaub ______________________

Prof. Fernando López Silva ______________________

Prof. María Teresa Andonaegui ______________________

“Para mi familia, en especial mi esposa, mis Hijos y mis Padres

que tanto Amo”.

“El amor es el gozo de los buenos, la maravilla de los sabios, el

asombro de los Dioses”

Platón

AGRADECIMIENTO

A la Gerencia de la Corporación Farmacéutica Recalcine S.A., por darme todas las facilidades para

emplear equipos e instalaciones durante el desarrollo de este trabajo de Tesis, para optar al Grado

de Magister en Ciencias Farmacéuticas.

A mi Director de Tesis Dra. María Nella Gaí Hernádez, por su guía, apoyo incondicional y por

confiar siempre en la finalización exitosa de este trabajo de investigación .

A mi querido amigo Profesor Ronny Bocic Vildosola, por su paciente compañía y estimulo

constante en la realización de este trabajo.

A mi colega, Químico Farmacéutico Andrés Navarrete, por su apoyo, consejos y estimulo para

finalizar esta Tesis.

A Carmen Cecilia Jeldrez, por su apoyo y aporte en la realización de todo el trabajo de

investigación.

A Jeannette Labra, por su colaboración en el escrito final de esta Tesis.

A todos los analistas y amigos del Departamento de Control de Calidad de Laboratorios Lafi, que

me ayudaron y colaboraron en la realización del trabajo de investigación plasmado finalmente en

esta Tesis.

A mis muy queridos amigos, por mis prolongadas ausencias debido al tiempo que requirio mi

trabajo de Tesis.

INDICE GENERAL Página

Indice General

Abstract 2

Resumen 4

Introducción 6

Fundamento del trabajo efectuado y objetivos del estudio 11

Hipótesis 18

Objetivo General 18

Objetivos Específicos 18

Materiales y Métodos 19

Materiales 19

Protocolo para la validación analítica de proteínas y péptidos 20

Equipos Utilizados 20

Parámetros de la validación 21

Selectividad 21

Linealidad 22

Exactitud 23

Precisión 25

Límite de Detección y Cuantificación 26

Características de las Insulinas 28

Características de las Calcitonina 31

Características de la Desmopresina 32

Resultados 34

Validación Insulina Humana

(Primer ensayo, siguiendo la técnica de la USP 27)

34

Composición del producto 34

Metodología empleada 34

Resultados de la validación 39

Página

Validación Insulina Humana

(Segundo ensayo, TFA-Gradiente)

49

Composición del Producto 49

Metodología Empleada 49


Validación Insulina Lispro 61

Composición del Producto 61



Validación Calcitonina 72




Validación Desmopresina 83




Discusión de los resultados 95

Conclusiones 99

Referencias 100

Anexos 104

2

Abstract

Nowadays, the validation of analytical methods is more than a necessity. It’s a mandatory

practice in every laboratory of analysis in order to guarantee the quality of the products

manufactured by the pharmaceutical industry.

Validation is the process that allows to verify if a specific method is appropriate to solve an

specific analytical problem. Partial or complete validation of official compendial methods is also

necessary as the only way to establish the parameters of an analytical validation.

In this work the following hypothesis was tested: using high performance liquid chromatography

with UV detection and making an appropriate selection of chromatographic columns, is possible

the development and validation of simple, fast and specific analytical methods in order to

quantify peptidic drugs in pharmaceutical dosage forms.

Consecuently, the specific aims of this work were: to study the experimental conditions for the

development and validation of HPLC methods for the assay of human insulin, lispro insulin,

desmopresin and calcitonin in pharmaceutical dosage forms.

No stability problems were found in the peptides studied in this work, therefore no special

precautions in sample handling were needed. Undoubtedly, this behavior is attributable to the

characteristics of each peptide. It is not possible to make a generalization, but we can assert that

human insulin, lispro insulin, calcitonin and desmopresin remain stable for several days at room

temperature in the solvents indicated in each methodology for each drug.

The use of appropriate columns for high molecular weight peptides as Calcitonin and Insulin,

long and short chain, C-4 or C-8, with a pore size over 100 Aº (specifically 300 Aº, used in this

work) allowed the development of reliable analytical techniques, on times according to the needs

of a high demanding work quality control laboratory.

The analytical techniques developed in this work for Human Insulin, Lispro Insulin, Calcitonin

and Desmopresin were validated for its use in routine analysis of the pharmaceutical products

3

containing those peptides. All the parameters involved in the validation of the analytical

methodology, according the USP Category I classification, were established for each drug.

Additionally, detection and quantitation limits were determined.

The experience obtained in the handling of adequate solvents to dissolve the samples and to

form the mobile phases and the type of column (filling and length) will allow a faster

development and validation of analytical techniques for other peptides in the future.

4

Resumen Hoy en día la validación de los métodos analíticos es más que una necesidad: es una exigencia y

una práctica necesaria en todos los laboratorios de análisis que pretendan garantizar la calidad

de los productos que elaboran.

La validación es el proceso que permite verificar que un método es adecuado, para resolver un

problema analítico particular, incluso es necesaria la validación de métodos considerados

oficiales, ya sea en forma parcial o completa, como única forma de conocer los parámetros

exigidos en una validación analítica.

En este trabajo la siguiente hipótesis fue examinada: aplicando cromatografía líquida de alta

resolución con detector UV y seleccionando adecuadamente las columnas cromatográficas, es

posible desarrollar metodologías analíticas sencillas, rápidas y específicas para cuantificar

fármacos de naturaleza polipeptídica en formas farmacéuticas.

Consecuentemente los objetivos específicos de este trabajo fueron: estudiar las condiciones

experimentales para el desarrollo y validación por HPLC para métodos de análisis para insulina

humana, insulina lispro, desmopresina y calcitonina en sus respectivas formas farmacéuticas.

En el rango de péptidos estudiados no se encontraron grandes problemas de estabilidad que

obligaran a tomar precauciones especiales en el manejo de las muestras, pero sin duda esto más

bien recae en las características particulares de cada péptido y no se puede generalizar, pero sí se

puede asegurar que la insulina humana, la insulina lispro, la calcitonina y la desmopresina, se

mantienen estables por varios días, incluso a temperatura ambiente, disueltas en los solventes

indicados en cada metodología, parte de este trabajo.

El empleo de columnas apropiadas, para péptidos de alto peso molecular, como calcitonina e

insulinas, columnas largas y de cadena corta C-4 o C-8 con un tamaño de poro sobre 100 A°,

por ejemplo de 300 A°, permite montar técnicas analíticas , confiables, de buena resolución y

rápido desarrollo, absolutamente validables para su empleo en análisis de rutina en productos

farmacéuticos que contengan estas moléculas.

5

Se estableció un método preciso y confiable, para el análisis de todos los péptidos estudiados:

insulina humana, insulina lispro, calcitonina y desmopresina , para ser aplicada en su forma

farmacéutica comercial.

Se estudiaron todos los parámetros involucrados en la validación de cada una de las

metodologías analíticas, para cada uno de los péptidos involucrados en el estudio, logrando

finalmente validar los métodos de análisis.

La experiencia lograda en el manejo de solventes adecuados, para disolver las muestras y para

formar las fases móviles, como también el tipo de columna (relleno y largo), sin duda permitirá

el desarrollo más rápido y la validación de técnicas analíticas para otros péptidos que se deseen

evaluar en el futuro.

6

INTRODUCCIÓN Una de las cualidades más importantes de toda Empresa Farmacéutica es la calidad de los

productos que manufactura, ya que de esto dependerá tanto el prestigio como el desarrollo

económico y el crecimiento de la misma, con medicamentos de calidad y al alcance de la

población. Atendiendo a esta necesidad se han venido desarrollando diferentes normas y

reglamentos establecidos por instituciones internacionales, tales como la FDA y la OMS

(1,2), normas recogidas por las diferentes Farmacopeas a nivel mundial(USP; BP y EP), para

lograr así la mejor calidad de los distintos productos farmacéuticos. La aplicación de un sistema

integral de garantía de la calidad en una empresa farmacéutica, incide en la aplicación de las

buenas prácticas de laboratorio (BPL), como también en las buenas prácticas de manufactura

(GMP) (3-5)

Una de las herramientas con las que se cuenta para asegurar la calidad de los productos

farmacéuticos es la validación de los procedimientos de manufactura y la validación de las

metodologías analíticas, por lo cual, la adopción de un nuevo método analítico debe estar

soportado en suficientes datos de laboratorio, lo que se traduce finalmente en una validación

bien documentada, que cumpla con los requisitos establecidos, para que un método sea

reproducible y confiable (6-8)

Hoy en día la validación de los métodos analíticos es más que una necesidad: es una exigencia y

una práctica necesaria en todos los laboratorios de producción farmacéuticos, que pretendan

garantizar la calidad de los productos que elaboran (1,6,7)

La validación es el proceso que permite verificar que un método es adecuado, para resolver un

problema analítico particular, incluso se recomienda la validación de métodos considerados

oficiales, ya sea en forma parcial o completa, como única forma de conocer los parámetros

exigidos en una validación analítica(7)

El único modo de tener resultados analíticos confiables es mediante la validación de las

metodologías, sumado a otras actividades, tales como: mantención y calibración de los

7

instrumentos, uso de estándares, todas estas actividades están englobadas en lo que se denomina

“ Aseguramiento o garantía de la Calidad”(6,7)

Los resultados obtenidos de los métodos analíticos validados, confieren un elevado grado de

confianza y sus valores son comparables entre sí.

El desarrollo y la validación de métodos analíticos para fármacos peptídicos, como son la

insulina humana, insulina lispro, calcitonina y desmopresina, representa un gran desafío. Por sus

características peptídicas, son más inestables que la mayoría de los fármacos de naturaleza no

peptídica y además son difíciles de separar. El fármaco activo presenta características muy

similares a la de los productos de degradación y en general presentan una limitada absorbancia

al detector ultravioleta.

Es conocido que la mayoría de las proteínas tienen una absorción aceptable a longitudes de onda

UV bajas, normalmente entre 200 y 220 nm, debido justamente al enlace peptídico, que ellas

presentan. ( Figura Nº1) (9-11)

Figura Nº1 Enlace peptídico

Enlace peptídico absorbe luz UV entre 200 y 220 nm (215nm)

Proteínas y péptidos, con un contenido variable de los aminoácidos, tales como: : Tirosina,

Triptofano y Fenilalanina tienen además, absorción UV entre 250 y 280 nm (270 nm)Por otro

lado, en las publicaciones internacionales evaluadas, se encontraron metodologías por HPLC

para este grupo de fármacos polipeptídicos, entre las cuales destaca la cromatografía líquida de

alta resolución, asociada a detectores distintos al comúnmente utilizado en las técnicas estándar,

como es el detector UV. En las publicaciones encontramos el empleo de detectores tan variados

como: espectrofotometría de masa, radioinmunoensayo, fluorometría (12-22)

8

También en las publicaciones revisadas se encontró que el empaque en la mayoría de las

columnas que permiten la separación de proteínas es sobre la base del tamaño molecular: Gel de

permeación o cromatografía de exclusión (23-25)

Tradicionalmente para la separación de polipéptidos y proteínas se han utilizado soportes con una

resistencia mecánica relativamente baja, por lo que generalmente las separaciones se realizan a

velocidades de flujo muy pequeñas y por lo tanto, el tiempo empleado en estos procedimientos es

muy prolongado, para las necesidades analíticas diarias de un moderno laboratorio de Control de

Calidad.

La forma y el tamaño del material activo de la fase estacionaria, en cromatografía es importante

para la separación de las sustancias químicas semejantes. A mayor superficie del material activo,

es más fácil separar las sustancias químicas que interactúan con el material cromatográfico (2)

Como se puede observar en la Figura Nº2,el sistema HPLC consta normalmente de:

Una o dos bombas

Un mezclador

Un inyector

Una precolumna

Una columna

Un detector

Un registrador

9

Figura Nº2, Esquema de un HPLC

Cuando la elución es isocrática se usa una sóla bomba, mientras que en la elución por gradiente se

utilizan las dos bombas.

El tampón seleccionado para una buena cromatografía de los derivados peptídicos debe ser

compatible con la estabilidad de la columna y de la muestra. La solubilidad de la muestra debe

permitir la interacción adecuada entre la muestra y el soporte. Normalmente esto se logra con

soluciones acuosas salinas o tampones (sulfato de amonio, acetato de amonio, citrato de sodio,

tampón tris acetato, dihidrógenofosfato de potasio, etc.) a concentraciones por debajo de 0,5 M,

para disminuir altas viscosidades, para evitar un aumento de la presión en el instrumento y la

precipitación salina, por cambios de temperatura. Se debe evitar el uso de iones halógenos (NaCl,

KCl, etc.), los cuales pueden afectar la estabilidad de los polipéptidos, degradándose la proteína

(15,24,26,27)

El rango de pH de trabajo debe ser entre 2,5 y 7,5, pues los pH altos o bajos afectan la estabilidad

de la fase estacionaria de la columna, como también la integridad del polipéptido en estudio (24)

La velocidad de flujo debe ser baja al inicio y se aumenta gradualmente hasta obtener la línea base

y el flujo deseado, el que debe ser seleccionado con respecto a la resolución, tiempo de separación,

vida de la columna y la viscosidad, entre otros. Se recomiendan normalmente flujos más bien

10

bajos, para aumentar la eficiencia de la separación, sobre todo para moléculas grandes como las

proteínas, y para prolongar la vida de la columna.

Cuando se cambia la concentración del solvente orgánico de uno de los solventes ( gradiente de

flujo), se debe hacer por un gradiente lineal, ya que los cambios rápidos pueden causar una

disminución en la eficiencia de la columna (11,13,28,29)

Las columnas usadas con soluciones acuosas de clorhidrato de guanidina o urea (normalmente

efectivas para separar muestras con pobre solubilidad en soluciones acuosas, como las proteínas de

alto peso molecular ) por lo general tienen un tiempo de vida más corto. Se debe evitar el uso de

columnas usadas con estos sistemas y preferir siempre trabajar con soluciones acuosas (12,13,24)

La temperatura recomendada en las publicaciones para cromatografía de péptidos señala que debe

estar entre 10 y 45 ºC. Se plantea que temperaturas por debajo de 10 ºC tienden a deteriorar la

eficiencia de la columna y por encima de 45 ºC, se altera el soporte de sílica de la columna

cromatográfica (8,9)

Siempre se debe usar una precolumna adecuada, con características de retención similares a la

columna de separación, para eliminar las impurezas presentes en la muestra, las cuales son

adsorbidas en la entrada de la columna y se acumulan gradualmente causando reducción del

número de platos teóricos y deterioro de la eficiencia de la columna analítica (2,3,23,24)

Siguiendo el esquema señalado en la USP 27 del 2004, considerando los productos

farmacéuticos en la categoría I, para validar las metodologías analíticas fue necesario determinar

solamente la exactitud, precisión, selectividad, linealidad e intervalos de aplicación (1,3,6).

El método que se usó corresponde a la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa,

para todos los productos, con características polipeptídicas o proteicas, tal como: insulina

humana, insulina lispro, desmopresina y salcatonina(2,8,9,11,12,14)

Se consideraron también otros parámetros como límite de detección y cuantificación que

enriquecen el método validado, pero que no son una exigencia, según la USP 27 Ed del año 2004

(3)

11

Fundamento del trabajo efectuado y objetivos del estudio

En este estudio se consideró un grupo de fármacos de naturaleza polipeptídica y proteica, tales

como: desmopresina, insulinas (insulina humana e insulina lispro), y calcitonina. Como modelo

de estudio de los polipéptidos en general, que presentan características especiales y son un

grupo de fármacos con muchas perspectivas futuras, gracias al exitoso desarrollo de la

biotecnología y la creciente capacidad de obtener fármacos de esta naturaleza, en grandes

cantidades (11,23,24)

El medio nacional, que día a día recibe en el mercado estos nuevos medicamentos,

desarrollados en países que cuentan con los avances y el equipamiento tecnológico, debe

desarrollar las metodologías analíticas que permitan hacer el control de calidad de las formas

farmacéuticas que se comercializan. Es frecuente, incluso en los laboratorios de organismos

contralores no encontrar el equipamiento necesario, muchas veces sofisticado, que permita la

rápida solución de estos problemas analíticos.

Los fármacos polipeptídicos escogidos para este trabajo son un modelo de estudio y entre ellos

presentan diferencias notables, tanto en su aplicación terapéutica como en las unidades de

aminoácidos que los forman, las que fluctúan entre la desmopresina con 9 aminoácidos hasta las

insulinas con 51 aminoácidos (3-5,30)

En el último tiempo se ha producido un fuerte desarrollo de un variado tipo de columnas

cromatográficas. La fase estacionaria generalmente es una matriz inerte recubierta con

componentes no polares, tales como los alcanos de cadena larga (3-5), cadenas hidrocarbonadas de

hasta 18 átomos de carbono (C-18) enlazadas covalentemente a partículas de sílica esférica,

constituyen los soportes y son ampliamente usadas; así la retención de los componentes

hidrófobos estará grandemente influida por el espesor de la capa. Una capa C-18 puede acomodar

más material que una C-8 o una C-2 (9)

Para polipéptidos y proteínas se recomiendan cadenas no muy largas, porque se logra una buena

retención y normalmente se usan cadenas C-8 (11,17,24)

12

El tamaño pequeño de las partículas del soporte hidrocarbonado, típicamente de 5-10 µm y de

tamaño de poro superior a 100 Aº hacen a esta cromatografía un método viable, rápido y de alta

resolución para el análisis y la purificación de polipéptidos y también de proteínas (9)

La fase móvil para estos casos se ha descrito como una solución acuosa y un solvente orgánico (de

alta pureza), cuyo tipo y concentración determinará el poder de separación. Los solventes

orgánicos de uso común en orden de polaridad decreciente para estos casos son: metanol, propanol,

acetonitrilo y tetrahidrofurano. Por la naturaleza de los eluyentes empleados, esta cromatografía,

como en el caso de los polipéptidos y las proteínas, es usada sólo con fines analíticos, ya que

pueden ocurrir pérdidas de actividad biológica (11)

Se ha estudiado que a concentraciones por debajo de 0,1 % v/v, de alcohol y otros solventes

orgánicos, de polaridad intermedia, se puede estabilizar la estructura de algunas proteínas, mientras

que a altas concentraciones de estos solventes se producen deformaciones estructurales que pueden

ser reversibles o irreversibles (10,24)

La separación de los polipéptidos en fase reversa ocurre debido a la interacción entre la fase

estacionaria no polar y los sitios no polares de los polipéptidos y el solvente orgánico en la fase

móvil, el que generalmente tiene un carácter más polar (9)

La retención de los polipéptidos en la fase sólida depende tanto del efecto hidrofóbico

(solvofóbico) como del efecto silanofílico. Este último debe ser bajo para disminuir así la

interacción de aminoácidos polares con los grupos silanoles y evitar que afecten la separación y la

resolución cromatográfica (9,11,13)

El tamaño de la columna puede ser variable y las dimensiones dependerán del problema analítico a

resolver.

La composición de la fase móvil dependerá del tipo de péptido, pero se basa en una mezcla de

agua, con un solvente orgánico miscible, tampones y sales disueltas. Se probó, en la fase móvil,

componentes menos volátiles como el ácido trifluoroacético (TFA) el cual ayuda normalmente a la

solubilización de los péptidos en solventes orgánicos (17,25,28,29).

13

Por ejemplo el TFA protona los grupos carboxílicos, incrementando así la afinidad del polipéptido

o proteína por la fase estacionaria.

En la literatura publicada , encontramos que la selección de los parámetros cromatográficos para

las separaciones de polipéptidos generalmente ha sido empírica (15,17,25,29)

Las condiciones típicas para la separación en un soporte macroporoso como el octil- u octadecil-

silica son:

-Combinación con solvente orgánico a bajo pH (usualmente 0-50 % v/v del solvente). Cuando no

existe experiencia previa se comienza con TFA/acetonitrilo o propanol.

-Fuerza iónica relativamente baja (usualmente de 0,01- 0,1 M).

-Velocidad de flujo entre 0,5 – 2,0 ml/minuto.

-Temperatura ambiente. Cuando la fase móvil tiene muy alta viscosidad (Ej. agua/metanol) y

levanta mucha presión se recomienda incrementar la temperatura, así disminuye la viscosidad y

por tanto hay menos resistencia al flujo y disminuye el tiempo de retención (15,17,25,29)

Los métodos estándares publicados para este grupo de fármacos polipeptídicos se caracterizan

por usar generalmente columnas de una longitud poco usual en nuestro país, más largas, de 0,25

m, con fases estacionarias formadas comúnmente por matrices poliméricas (Gel) adsortivamente

recubiertas con componentes no polares: cadenas hidrocarbonadas (C 8 -C18) y temperaturas

altas que alcanzan incluso los 40°C.

Debido a la complejidad cromatográfica y molecular interrelacionada normalmente en la

separación de polipéptidos y proteínas por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa,

se utilizó una resolución por gradiente de solventes (se recomienda iniciar los estudios con una

variación entre un 20 - 60 % de acetonitrilo, durante la separación de proteínas) (2,11,12,14,16,22)

El desarrollo de los métodos analíticos empleados se basó en la literatura disponible para cada

uno de los fármacos que son parte del estudio. La validación consideró la clasificación de la

USP 27 y se llevó a efecto siguiendo el procedimiento establecido en la guía ICH (International

Conference on Harmonization) de 1996 y lo señalado por la Asociación Española de

Farmacéuticos de la Industria, Comisión de Normas de Buena Fabricación y Control de Calidad,

Sección Catalana de Validación de métodos analíticos”, 1996 (6)

14

El método aplicado en la validación de las metodologías analíticas consideró los parámetros para

los productos de clase I, según la USP, que incluye la determinación de exactitud, precisión,

selectividad, linealidad e intervalos de aplicación, a continuación se define cada uno de los

parámetros involucrados en la validación, con una descripción amplia(3)

La exactitud representa la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximos

al valor verdadero. Matemáticamente la exactitud se expresa a través del porcentaje de

recuperación de la cantidad de analito presente en la muestra. Se debe considerar su evaluación

según el test de Student, para determinar si el valor medio encontrado y el valor considerado

verdadero no difieren significativamente, para un grado de probabilidad determinado(6)

Para la determinación de este parámetro se realiza un análisis repetitivo de varias muestras de

concentraciones diferentes y conocidas. Se utilizan como mínimo 6 concentraciones dentro del

rango de linealidad. (Se analiza cada una por triplicado). La exactitud se calcula con los

resultados obtenidos en el parámetro de linealidad.

La validación del método analítico requiere que el estudio de exactitud sea riguroso. Se usa

como valor de referencia la cantidad declarada en el producto farmacéutico terminado.

La exactitud se determina con las concentraciones de los valores recuperados del principio

activo, de concentración de referencia y los obtenidos en la evaluación del parámetro linealidad,

para un mínimo de 6 muestras. Se usa como valor de referencia el 100% (6,7)

La exactitud de un método analítico se mide como el porcentaje de analito recuperado por cada

análisis efectuado y representa el error del método con respecto a la magnitud real(1,6,8,13)

La precisión es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos

analíticos efectuados sobre una muestra homogénea, o expresado de otra forma, corresponde a

la distribución de los valores analíticos alrededor de su media.

También se puede decir que la precisión es una medida de la reproducibilidad del método. La

precisión de un método analítico se determina mediante los ensayos de un número suficiente de

15

alícuotas de una muestra homogénea, tales que sean suficientes para calcular estadísticamente la

desviación estándar relativa (coeficiente de variación).

La determinación de la precisión se basa en el principio de la repetibilidad, que corresponde a la

medida de la precisión de un método, efectuado en las mismas condiciones.

La precisión de un método analítico se expresa como el coeficiente de variación (CV). Para que

el análisis tenga validez la cantidad de datos óptimos es de a lo menos seis valores. El valor

recomendado por la ICH es de un 2% (1)

En los ensayos de repetibilidad se considerarán adecuados los coeficientes de variación (CV)

inferiores al 1,9%, para un rango aceptable de 95 a 105% de lo declarado y de 3,9%, para un

rango aceptable de 90 a 110% de lo declarado. En general se acepta un CV de 1,9% para

insulinas y de 3,9% para los otros polipéptidos ( ver tabla N° 2 en los anexos). En caso que el

CV obtenido experimentalmente sea superior al indicado, la serie de análisis deberá ser repetida,

tomando en cuenta todos los datos obtenidos, en cada una de las determinaciones de la serie. El

CV deberá ser menor al indicado, según el número de repeticiones de los ensayos realizados(6)

Se usa como referencia un estándar de concentración 100% respecto a lo declarado en el

producto farmacéutico y se analiza por triplicado, luego se cuantifica y se promedian las áreas,

obteniendo así el valor de área de referencia.

Se debe analizar como mínimo 6 veces una misma muestra, utilizando la misma técnica analítica

propuesta para cada uno de los polipéptidos objeto del estudio y montada para su validación y el

mismo equipo, registrando la respuesta obtenida en cada una de las inyecciones.

El valor del coeficiente de variación correspondiente al porcentaje de recuperación es indicativo

de la precisión del método. Se debe informar si el método analítico es preciso para el principio

activo ( polipéptido)(1,6,8)

16

La selectividad es la habilidad de un método para medir en forma exacta y especifica, el grado de

interferencia que producen sobre el analito de interés, otros componentes activos, excipientes,

impurezas y productos de degradación que pudieran estar presentes en la matriz de las muestras.

La selectividad será determinada mediante la evaluación de la posible interferencia de excipientes y

de la degradación de la muestra.

Por otro lado la especificidad o selectividad, se consideran términos equivalentes y es la

capacidad que tiene un método analítico para medir exacta y específicamente una señal, debido

sólo a la presencia de un analito, sin interferencias de productos de degradación, impurezas,

compuestos relacionados o excipientes que pueden estar presentes en la matriz de la muestra

(31-35)

La especificidad es una condición esencial para conseguir una buena exactitud, por lo que es, en

todos los casos, un criterio clave en la validación de este tipo de métodos.

Para determinar la especificidad y para asegurar que la señal medida con el método analítico se

debe únicamente a la sustancia a analizar se debe descartar previamente la interferencia de los

excipientes y de los productos de degradación en el análisis.

Se debe informar en el certificado de validación si el método analítico es específico, indicando si

se detectó degradación en los distintos cromatogramas y si existe evidencia de interferencias con

la señal del principio activo. En los casos que corresponda, puede ser necesario incluir análogos

de estos polipéptidos (cuando existan) con el fin de asegurar que el método también es selectivo

respecto a estos análogos (1,6,8,15,16,28)

La linealidad es la capacidad del método para obtener resultados que son directamente

proporcionales a las concentraciones del analito, en un rango determinado. La linealidad se expresa

como el coeficiente de regresión lineal (r) de la curva de calibración.

17

Es decir, la linealidad es la capacidad de un método analítico para obtener resultados linealmente

proporcionales a la concentración de analito en la muestra, dentro de un intervalo de confianza

determinado.

El rango de aplicación será aquél en el que se evalúa este parámetro, es decir, entre un 50% y un

150% del valor declarado en el producto farmacéutico comercial y se considerará definido a

partir de los criterios de linealidad, precisión y exactitud (1,6,8)

18

Hipótesis Aplicando cromatografía líquida de alta resolución con detector UV y seleccionando

adecuadamente las columnas cromatográficas, es posible desarrollar metodologías analíticas

sencillas, rápidas y específicas para cuantificar fármacos de naturaleza polipeptídica en formas

farmacéuticas, que cumplan con los estándares de validación requeridos por las farmacopeas

oficiales.

Objetivos del Estudio Objetivo general: Desarrollar métodos analíticos, sencillos, rápidos y confiables, para fármacos de naturaleza

polipeptídica en sus formas farmacéuticas comerciales, mediante HPLC.

Objetivos específicos -Estudiar las variables que influyen en la obtención de un método específico y reproducible para:

insulinas( insulina humana e insulina lispro), salcatonina y, desmopresina.

-Aplicar los criterios de validación sugeridos por las farmacopeas oficiales, para estos fármacos

en sus respectivas formas farmacéuticas.

19

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Vasos precipitados, pipetas volumétricas y aforadas, matraces kitasato, probetas, agitador

magnético y materiales básicos para las técnicas de laboratorio químico.

Baño Termorregulado MGW Lauda, Thermo-Temp.

Baño Ultrasonido P Selecta, Ultrasons-H

Bomba de vacío GAST.

Crisol filtrante con vaso y pinza sujetadora Millipore.

Papel filtro Whatman Nº 42 y 54

pHmetro Orion 370

Balanza analítica Mettler ab-204;sensibilidad 0,1 mg.

Agua purificada Milli-Q

Fase móvil: Agua/Acetona 95:5

Fase móvil: Agua/Metanol 50:50

Columna: Octadecilsilano (Symetry C18; 5 µm ;15 cm).

Estándares primarios con potencia igual o mayor que 99%

Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 2 Merck.

Modelo: Bomba binaria D 7000 serie: 0703-152

Modelo: Autosampler L7400 serie: 0709-054

Modelo: Detector L-7200 serie: 0711-019

Modelo: Horno L-7100 serie: 0707-173

Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 3 Waters.

Modelo: Bomba binaria1525 serie: E0125P

Modelo: Autosampler 717 plus serie: B0271 P

Modelo: Detector 2487 serie: E01487

Modelo: Horno 5 CH serie: J005CH

20

PROTOCOLO PARA LA VALIDACIÓN ANALÍTICA DE PROTEINAS Y PÉPTIDOS

A continuación se describe el esquema de trabajo llevado a cabo para la validación analítica de

los métodos de análisis

1. OBJETIVO

Establecer una metodología analítica confiable para la determinación de distintas proteínas y

péptidos que lo requieran por su empleo como medicamentos.. Esta determinación se realizará

mediante el método de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa(HPLC). Esta

metodología debe tener las características adecuadas para validar los métodos de análisis en el

rango de evaluación normal de este tipo de medicamentos.

EQUIPOS UTILIZADOS

TODOS LOS EQUIPOS EMPLEADOS DEBEN ESTAR EN UN PROGRAMA DE

MANTENCIÓN Y CALIBRACIÓN EXTERNO Y EN LO POSIBLE, TAMBIÉN CONTAR

CON SU CALIFICACIÓN.

A) Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 2 Merck, Certificado Nº 030624/3

Modelo: Bomba binaria D 7000 serie: 0703-152

Modelo: Autosampler L7400 serie: 0709-054

Modelo: Detector L-7200 serie: 0711-019

Modelo: Horno L-7100 serie: 0707-173

B) Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 3 Waters, Certificado Nº II-016/03

Modelo: Bomba binaria1525 serie: E0125P

Modelo: Autosampler 717 plus serie: B0271 P

Modelo: Detector 2487 serie: E01487

Modelo: Horno 5 CH serie: J005CH

21

C) Nombre: Balanza analítica

Marca : Mettler

Sensibilidad: 0,1 mg

Modelo: AB-204

N°serie: 1113483418

Certificado de calibración: 9560

D) Nombre: pHMETRO

Marca: Orion

Modelo: 370

N°serie: 3327

Certificado de calibración: SMF – 11485

E) Nombre: Baño termorregulado

Marca: Mgw- Lauda

Modelo: Thermo – Temp

N°serie: A17080

Certificado de calibración: 9479

2. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

Utilizar el método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) considerando las

condiciones experimentales establecidas previamente para el análisis de cada proteína o péptido.

3. PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN

3.1 SELECTIVIDAD.

a) Interferencia de los excipientes

Utilizando la técnica de fabricación del producto, se preparó una solución base con los

excipientes de la fórmula, exceptuando el principio activo. Se analizó la muestra según la

metodología analítica correspondiente, de manera tal de identificar los picos respuesta del

principio activo.

22

b) Interferencia de los productos de degradación

Para el ensayo de la muestra degradada se prepararon las siguientes soluciones:

Solución de NaOH 0.5 N para hidrólisis básica.

Solución de HCl 0.5 N para hidrólisis ácida.

Se realizaron tres soluciones:

a) Excipientes ( placebo)

b) Excipientes + péptido

c) Péptido.

A cada una de ellas se les realizó una hidrólisis respectiva, a cada solución se adicionó 5 ml de

ácido o base según corresponda, para posteriormente calentar en un baño termorregulado a 70°C

por 25 minutos. Luego se neutralizó según corresponda con ácido o base y se llevó a

concentración establecida, aforando con fase móvil.

Finalmente se cuantificaron las muestras según el método analítico establecido para cada uno de

los péptidos.

3.2 LINEALIDAD

El parámetro que se evaluó es según la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 27 Ed),

Para demostrar que este procedimiento es lineal deberá cumplir con los siguientes parámetros:

r > 0.9990

Factor de respuesta: CV menor al 5%.

PROCEDIMIENTO

Se pesó con precisión, la cantidad de proteína o péptido estándar, señalado en cada metodología

individual, se disolvió con fase móvil ( o con el solvente indicado en cada metodología

individual) en un matraz aforado, se colocó el matraz en un baño de ultrasonido durante 10

minuto, terminado este proceso se aforó con fase móvil( o con el solvente indicado en la

metodología individual).

23

Luego se realizaron las diluciones para obtener las concentraciones, entre un 50% y 150% de lo

declarado. Se inyectó cada una de las diluciones preparadas, registrándose para cada una los

siguientes parámetros.

Se señala esta tabla a modo de ejemplo.

Conc. UI/ml Área lectura % Conc.

Recuper.

Factor

respuesta

80%

85%

90%

100%

110%

115%

Ecuación de la recta : Y = a + bX, en donde X es la concentración de analito y en

donde Y es el área bajo la curva. Siendo b la pendiente

de la recta.

Promedio X :

Desviación Estándar S :

Coeficiente de variación CV : %

Adicionalmente se calculo r2 que indica la proporción de la varianza total de la variable

independiente Y y se denomina coeficiente de determinación.

3.3 EXACTITUD

Para la determinación del parámetro EXACTITUD, se realizó un análisis repetitivo de varias

muestras diferentes de concentraciones conocidas. Se utilizaron 6 concentraciones (por

triplicado) como mínimo, dentro del rango de linealidad.

Comentario [cv1]:

24

Procedimiento:

Se pesó con precisión, lo indicado en cada metodología analítica, se disolvió con fase móvil ( o

el solvente indicado en la metodología individual) en un matraz aforado, se colocó el matraz en

un baño de ultrasonido durante 10 minuto, terminado este proceso se aforó con fase móvil (o

con el solvente de la metodología).

Luego se realizaron las diluciones necesarias para obtener como mínimo 6 concentraciones

distintas, en el rango entre 50% y 150%:

Se inyectó cada una de las diluciones, registrándose para cada una los siguientes parámetros,

por ejemplo:

Se menciona esta tabla , con un rango de porcentaje(%) a modo de ejemplo.

Conc Área lectura % Conc.

Recuperación

%

Recuperación

80%

90%

100%

110%

115%

120%

Promedio (X) :

Desviación Estándar (S) :

Coeficiente de variación (CV) : %

Con respecto a la tabla de student para pruebas unilaterales para un riesgo (p: 0.05) y a 5 grados

de libertad el t corresponde a: t.95 : 2,571

Al calcular “t obs” o experimental tenemos que :

t obs = ([100 – X]* √ N° muestras) / CV =

t obs ≤ t.95

Por lo tanto para que exista una buena exactitud en el método de análisis que se está evaluando

para el ensayo de péptidos o proteínas, el t obs debe ser menor al t.95.

25

3.4 PRECISIÓN

El parámetro evaluado corresponde a una concentración del 100% de lo declarado, la que debe

ser analizada 10 veces.

Procedimiento:

Se pesó con precisión, lo indicado en cada metodología analítica, se disolvió con fase móvil (o el

solvente indicado en la metodología individual) en un matraz aforado, se dejó el matraz en un

baño de ultrasonido durante 10 minuto, terminado este proceso se aforó con Fase Móvil (o con

el solvente de la metodología).

Luego se realizaron las diluciones necesarias para obtener como mínimo 10 concentraciones

iguales, cercanas al 100%.

N°análisis Conc. Área Conc. Encont. % Recuperac.

1 100%

2 100%

3 100%

4 100%

5 100%

6 100%

7 100%

8 100%

9 100%

10 100%

Promedio X % :

Desviación Estándar S :

Coeficiente de Variación CV : %

En los ensayos de repetibilidad se consideraron adecuados los coeficientes de variación

inferiores al 2 %.

26

Límites de confianza.

Estadísticamente es la expresión más correcta para establecer la precisión de un método, ya que

tiene en cuenta la distribución de t de Student, cuando el número de réplicas es inferior a 30. El

valor de t de Student se halla en las tablas de student, para n – 1 grados de libertad y una

significación, generalmente del 95 %, también se le suele denominar: error del método(6,7)

t.95 : 2,262 (10 valores) (X ± tS)

Límite de confianza % : X% ± tS

Con respecto a la cantidad encontrada :

Límite de confianza :

Todo lo incluido en el punto 3 (3.1 a 3.4) es lo exigido por la USP 27 Ed , para validar una

metodología analítica.

Los límites de detección y cuantificación que se calculan a continuación, no son indispensables y

más bien vienen a complementar la información que caracterizó al método analítico

4.0 LÍMITE DE DETECCIÓN (Ld) Y CUANTIFICACIÓN (Lc)

Determinación por extrapolación a concentración cero de muestras conteniendo concentraciones

bajas de analito.

Conc. Área 1 Área 2 Área 3 Área media Desv. Est.

50%

65%

70%

Para los cálculos de Ld y Lc se utilizaron los datos de menor concentación, proporcionados por

la curva de calibración en el rango establecido ( 50% a 150%).

27

Límite de detección ( Ld )

LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) =

Límite de cuantificación ( Lc )

LC ( K=10) = ( (Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) =

En donde:

Ybl corresponde a la respuesta a concentraciones cero.

Sbl corresponde a la desviación estándar de la respuesta a concentración cero.

B corresponde a la pendiente de la curva obtenida en procedimiento de linealidad.

n corresponde al número de puntos de la curva.

Los valores de las constantes K en las fórmulas son los aceptados por la A.E.F.I (Asociación

Española de Farmacéuticos de la Industria) y su comisión de buena fabricación y control de

calidad, en su referencia “Validación de Métodos Analíticos”(6).

1° Respuesta a concentraciones cero.

Se obtiene por extrapolación a cero en la recta calculada, tomando como “Y” las áreas medias y

como “X” las concentraciones.

X Y Área media

50%

65%

70%

Se obtiene la ecuación de la curva.

Entonces para X = 0 el valor de Y =Ybl.

28

2° Desviación estándar de la respuesta a concentración cero

Se obtiene por extrapolación a cero en la recta calculada tomando como “Y” las desviaciones

estándar de las respuestas y como “X” las concentraciones.

X Y Desv. Est

50%

65%

70%

Se obtiene la ecuación de la curva.

Entonces para X = 0 el valor de Y = Sbl

INSULINAS

La insulina es un polipéptido de doble cadena, formado por 51 aminoácidos, con un peso

molecular aproximado de 6000, este producto como insulina humana está incluido en sus

diferentes presentaciones, como metodología analítica en la Farmacopea Británica(BP),

farmacopea Europea( EP) y en la Farmacopea de los Estados Unidos(USP.) (3,4,6,30)

Insulina Humana Insulina Lispro

29

Esquema tridimensional de la Insulina Humana

Cromatogramas de las insulinas, con detector arreglo de diodo, obtenidas en el laboratorio de

Control de Calidad planta Recalcine, se aprecia que para ambas insulinas, su máxima absorción

es cercana a los 215 nm

30

Insulina humana

Insulina Lispro

31

CALCITONINA

Es un Polipéptido de 32 aminoácidos, con un peso molecular aproximado de 4.500, este

producto se encuentra incluido como metodología analítica en la Farmacopea Británica

(BP)(4,30). La metodología analítica del producto empleando este principio activo se muestra

en los resultados.

Representación tridimensional de Calcitonina

32

Cromatogramas de la Calcitonina, con detector de arreglo de diodos, obtenidos en el laboratorio

de Control de Calidad planta Recalcine, se aprecia que su máxima absorción es cercana a los

215 nm

DESMOPRESINA

Es un Polipéptido de 9 aminoácidos, con un peso molecular de 1.069, este producto se encuentra

incluido en alguna de sus formas farmacéuticas en la Farmacopea Británica( BP) y en la

Farmacopea Europea(EP) (4,5,30)

33

Esquema tridimensional de la Desmopresina

Cromatograma de la Desmopresina, con detector de arreglo de diodos, obtenidas en el

laboratorio de Control de Calidad planta Recalcine, se aprecia que su máxima absorcióna los

215nm.

34

RESULTADOS

VALIDACION INSULINA HUMANA

( Primer ensayo, siguiendo la técnica de la USP 27 )

I. COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO

Cada ml de suspensión contiene:

Insulina Humana, origen DNA recombinante 100 UI

m-Cresol 1,600 mg.

Fenol 0,650 mg.

Glicerina 16,000 mg.

Sulfato de Protamina 0,348 mg.

Fosfato dibásico de sodio 3,780 mg.

Agua para inyectables CSP 1,000 ml.

Ácido clorhídrico al 10% y/o hidróxido de sodio al 10%, para ajustar pH entre 6,9 y 7,5.

II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN DE LA USP PARA EL PRINCIPIO

ACTIVO, EN EL PRODUCTO TERMINADO, ENTRE UN 95,0% A UN 105,0%

III.- METODOLOGÍA EMPLEADA SEGÚN LO ESPECIFICADO .

Se consideró su validación, ya que es la metodología oficial incluida en la USP y la empleada

por el fabricante de las insulinas.

35

1. Preparación de la solución de principio activo.

Solución estándar:

Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de Insulina Humana, calidad estándar de referencia,

con una potencia declarada de 189,21 UI USP en 6,57 mg de insulina por vial, para obtener una

solución de 37,84 UI/ml.

De la solución anterior, se tomó una alícuota de 1 ml, se trasladó a una matraz aforado de 10 ml,

se diluyó y aforó con HCl 0,01N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial, la

solución estándar final tiene 3,784 UI/ml.

Solución Muestra:

Se agregó gota a gota HCl 1N al vial con el producto muestra, hasta disolución total de la

suspensión, de esta solución se tomó 2 ml y se transfirío a un matraz de 50 ml, se diluyó y aforó

con HCl 0,01N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial de HPLC.

PROCEDIMIENTO

Cromatografía líquida de alta resolución.

Condiciones cromatograficas

Columna : Symmetry (C-18; 25cm; 4,6 um)

Fase Móvil : Solución acuosa /Acetonitrilo( 72/28 )

Solución Tampón : 28,4 g de Na2S04 + 2,7 ml de H3PO4

En 1 L de agua y llevar a pH=2,3 con etanolamina.

Flujo : 1,2 ml/minuto

Detector : Ultravioleta a 214 nm.

Temperatura del horno : 40°C

Volumen inyectado : 10 ul

36

EQUIPOS UTILIZADOS

Cromatógrafo líquido de alta resolución menor certificado de calibración N°030624/3.

Bomba binaria D 7000 Serie 0703-152 Autosampler L7400 Serie: 0709-054, detector L-7200,

serie 0711-019, horno L-7100, serie 0707-173.

pH Metro Orion

Modelo 370, serie 3327, certificado de calibración: SMF 10949

Calificación de columna cromatográfica.

Marca Waters; Modelo Symmetry, empaque C-18, N° interno 25

N° Platos teóricos evaluados 18.364, fecha de calificación 24/07/2003.

Balanza analítica Metter

Sensibilidad 0,1 mg

Modelo: AB-204 N°Serie: 1113483418

Certificado de Calibración N°560

PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN

3.1 SELECTIVIDAD

Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes, utilizando la técnica de

fabricación del producto se preparó una solución base con los excipientes de la fórmula

exceptuando el principio activo:

m-Cresol 1,600 mg.

Fenol 0,650 mg.



Fosfato dibásico de Sodio 3,780 mg.

Agua para inyectables csp 1,000 ml.

37

Se analizó esta muestra según la metodología analítica correspondiente de manera tal de

identificar los picos respuesta de los excipientes.

Al igual que lo realizado con el estándar de insulina, a la muestra se agregaron 5,0 ml de HCl

0,01N a un vial de insulina humana, muestra, se diluyó 1 ml, con 10 ml, HCl 0,01N, se analizó

según la metodología analítica correspondiente de tal manera de identificar los picos respuesta

del principio activo.

Interferencia de los productos de degradación: la hidrólisis básica y ácida se realizó con las tres

soluciones patrones:

a) Excipientes (placebo)

b) Excipientes + péptido (estándar)

c) Péptido estándar

Se consideró también el efecto de la temperatura sobre la degradación de la insulina

sin hidrólisis ácida o básica.

Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01N a un vial de insulina estándar, se agitó fuertemente por 5

minutos (solución A), se diluyó 1ml de esta solución y se llevó a un matraz con HCl 0,01N.

Efecto de la temperatura sobre la insulina.

Se tomó 1 ml de la solución (A), se mantuvo en baño maría por 25 minutos a 70°C y se enrasó

posteriormente a 10 ml con HCl 0,01N.

Hidrólisis ácida:

Se tomó 1 ml de la solución A, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño maría por 25

minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01N y se

agitó.

38

Hidrólisis básica:

Se tomó 1 ml de la solución A, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a

70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N se enrasó con HCl 0,01N y se

agitó.

Excipiente + péptido (muestra):

Se tomó 2 ml del vial muestra previamente analizada y de potencia conocida, se transfirió a un

matraz de 50 ml, se diluyó y aforó con HCl 0,01N (B)

Hidrólisis ácida:

Se tomó 1 ml de la solución anterior (B), se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó en un baño

maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl

0,01 N y se agitó.


Se tomó 1 ml de la solución base (B), se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría

a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml. de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N.

Excipientes:

Se tomó 2 ml del matraz solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 50 ml, se diluyó

y aforó con HCl 0,01 N (C).

Hidrólisis ácida:

Se tomó 1 ml de la solución concentrada (C) , se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño


0,01 N y se agitó.

39


Se tomó 1 ml de la solución concentrada, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño

maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N , se enrasó con HCl

0,01 N y se agitó.

RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN

3.1 SELECTIVIDAD.

Interferencia de los productos de degradación o de los excipientes en la resolución

cromatográfica de la insulina. En el pico cromatográfico de la insulina se apreciaron cambios

en los tiempos de retención y por ende no se pudo descartar la no interferencia de excipientes o

productos de degradación, siendo los tiempos de retención diferentes en cada inyección de

estándar de insulina humana

Con temperatura: se produjo degradación de la insulina humana, pero no se pudo descartar

interferencia con la señal del principio activo.

Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de Insulina, pero no fue posible descartar la falta de interferencias entre

estos productos de degradación con la señal del principio activo.

Estándar de insulina + excipientes muestra

Con temperatura: se produjo degradación de la insulina, pero no fue posible descartar la


Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de insulina, pero no fue posible descartar la no interferencia entre los

picos del producto de degradación con la señal del principio activo.

40


Se produjo degradación de insulina, pero no fue posible descartar la interferencia entre los picos

del producto de degradación con la señal del principio activo.

Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método no es específico para insulina,

ya que existe evidencia que el tiempo de retención es variable y existen interferencias en los

análisis. En algunos cromatogramas( Figuras 4,6 y 8) se aprecia otro pico, también con un

tiempo de retención variable con cada inyección: 8,5 minutos ; 6,25 minutos y 7,25 minutos, por

lo que no se puede asegurar que no se superponen en algun momento con el pico de la insulina.

No se pudo descartar la superposición de los picos correspondientes a insulina de los productos

de degradación y/o excipientes.

Los tiempos de retención de insulina determinados en el análisis de selectividad son:

5,25 minutos; 5,27 minutos; 4,33minutos; 4,32minutos; 6,20 minutos y 6,22 minutos.

Estos resultados no son satisfactorios para validar el metodo de análisis incluido en la USP 27

para Insulina humana.

41

Figura Nº3. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC

Tiempo de retención para Insulina: 5,25 minutos

Figura Nº 4. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.


42

Figura Nº 5 Análisis de Insulina Humana , primer ensayo HPLC.


Figura Nº6. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.


43

Figura Nº 7. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.

Tiempo de retención para Insulina: 6,20 minutos.

Figura Nº8. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.Tiempo de retención para Insulina:

6,22 minutos.

44

3.2 LINEALIDAD

Concentración UI/ml Área

1,8921 189,21/10*1/10 494.234

2,2705 189,21/10*4/10*3/10 625.184

3,7842 189,21/10*4/10*5/10 1.086.071

4,7303 189,21/10*5/10*5/10 1.377.873

5,6763 189,21/10*5/10*3/5 1.682.226

7,5684 189,21/10*4/10 2.209.783

9,4605 189,21/10*5/10 2.878.763

LINEALIDAD

0,010,020,030,040,0

0,0 5,0 10,0CONCENTRACIÓN UI/ml

ÁREA x105

45

Ecuación de la recta Y = a + bx

Y= -9,01*104 + 3,10*105 X

Intercepto -9,01*104

Pendiente 3,10*105

r (coeficiente de correlación) 0,9996

Factor de Respuesta

Concentración UI/ml Area

Factor de

respuesta

1,8921 189,21/10*1/10 494.234 261209,24

2,2705 189,21/10*4/10*3/10 625.184 275350,80

3,7842 189,21/10*4/10*5/10 1.086.071 287001,48

4,7303 189,21/10*5/10*5/10 1.377.873 291289,68

5,6763 189,21/10*5/10*3/5 1.682.226 296359,60

7,5684 189,21/10*4/10 2.209.783 291974,92

9,4605 189,21/10*5/10 2.878.763 304292,90

PROMEDIO 28678266,07

CV 4,99%

El procedimiento analítico es lineal, r es mayor a 0.9990(0,9996)

Y en el factor de repuesta CV es menor a 5%; 4.99%

Además el coeficiente de determinación r 2 es 0,9991

46

3.3 EXACTITUD

Concentración

UI/ml ÁREA

Cantidad encontrada

UI/ml % p.a. Encontrado

1,892 499.274 1,708 90,28%

2,270 635.383 2,174 95,74%

3,784 1.106.071 3,784 100,00%

4,730 1.297.878 4,440 93,87%

5,676 1.679.259 5,745 101,00%

7,568 2.199.487 7,525 99,43%

9,460 2.888.261 9,882 104,45%

Promedio 97,86%

CV 4,93%

tobservado 0,0424

ttabla 2,447

El t tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p:0.05) y a 6 grados de libertad

t95 :2,447

Como el t observado es menor al t tabla el método cumplió con la exigencia de exactitud, según los

análisis efectuados

47

3.4 PRECISIÓN

En este ensayo de repetitividad se consideró adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%,

según la norma ICH o de 1,9% según AEFI

El método implementado es preciso, ya que cumplió con un CV inferior a 2%, el valor

encontrado fue de 0,85%

Límite de Confianza 97,02% ± 1,86%

Conclusiones: De acuerdo al protocolo establecido y los parámetros evaluados según la USP 27

Ed, se pudo establecer que la metodología implementada no cumplió con los parámetros

exigidos para su validación, por lo tanto no es apta y confiable para el análisis rutinario de

insulina humana, en el producto inyectable, formulado según lo descrito en la composición del

producto.

N°

análisis

Concentración

UI/ml área

UI encontradas

%

Recuperación

1 4 1.258.052 3,926 98,15%

2 4 1.245.673 3,887 97,18%

3 4 1.232.333 3,846 96,14%

4 4 1.240.342 3,871 96,77%

5 4 1.237.374 3,861 96,54%

6 4 1.236.462 3,859 96,47%

7 4 1.233.511 3,849 96,23%

8 4 1.236.188 3,858 96,44%

9 4 1.254.887 3,916 97,90%

10 4 1.260.670 3,934 98,35%

Promedio 97,02%

CV 0,85%

48

4.0 LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Conc. UI/ml Área1 Área2 Área2

Área

promedio

Desviación

estandar

1,8921 494.242 494.246 494.244 494.244 2,0

2,2705 625.182 625.186 625.189 625.185 3,5

3,7842 1.086.069 1.086.066 1.086.078 1.086.071 6,2

YbI=87.098 SbI=1,65 B=310.467

Límite de detección ( Ld ) LD ( K=3) = (( Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) = 0,16 UI/ml

Límite de cuantificación ( Lc ) LC ( K=10) = (( Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) = 0,16 UI/ml

49

VALIDACIÓN INSULINA HUMANA (Segundo ensayo, TFA-gradiente)



Insulina Humana origen DNA recombinante 100,000 UI

m-Cresol 1,600 mg.

Fenol 0,650 mg.



Fosfato dibásico de sodio 3,780 mg.

Agua para inyectables CSP 1,000 ml

• Acido clorhídrico al 10% y/o hidróxido de sodio al 10%, para ajustar pH :

entre 6,9 y 7,5.

II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN DE LA USP PARA EL PRINCIPIO ACTIVO

EN EL PRODUCTO TERMINADO, ENTRE UN 95,0% A UN 105,0%

III.- METODOLOGÍA EMPLEADA SEGÚN LO ESPECIFICADO.

Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que la descrita en la USP presentó diferencias

en los tiempos de retención.

1. Preparación de la solución de principio activos.

Soluciones estándar:

Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de Insulina Humana, calidad estándar de referencia,

con una potencia declarada de 189,21 UI USP en 6,57 mg de insulina por vial, para obtener una





50

Solución Muestra:

Se agregó gota a gota solución de HCl 1 N al vial con el producto muestra, hasta disolución

total de la suspensión, de esta solución se tomó 2 ml y se transfirió a un matraz de 50 ml, se

diluyó y aforó con HCL 0,01 N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial de

HPLC.

PROCEDIMIENTO


Condiciones cromatográficas

Columna : Jupiter (C-18; 25 cm; 5 um ;300 A° )

Fase Móvil Solución : A : TFA 0.1%en agua/ TFA 0.1% Acetonitrilo

( 71%/29%)

B: TFA 0.1% en agua / TFA 0.1% Acetonitrilo

( 68%/32%)

Comienzo con A y cambio a 100% B en 30 minutos; gradiente 0%-100%

TFA : Ácido trifluoracético


Detector : Ultravioleta: a 215 nm.



51

EQUIPOS UTILIZADOS

Cromatógrafo líquido de alta resolución, certificado de calibración N°030624/3.



pH Metro Orion



Marca Phenomenex; Modelo Júpiter , empaque C-18, N° interno 26


Balanza analítica Mettler

Sensibilidad 0,1 mg




3.1 SELECTIVIDAD Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes utilizando la técnica de

fabricación del producto. Se preparó una solución base con los excipientes, de la fórmula,


m-Cresol 1,600 mg.

Fenol 0,650 mg.

Glicerina 16,000 mg

Sulfato de Protamina 0,348 mg

Fosfato dibásico de Sodio 3,780 mg


52



Lo mismo se realizó con el estándar de insulina se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de

insulina humana estándar, se diluyó 1 ml con 10 ml de HCl 0,01 N, se analizó según la

metodología analítica correspondiente de tal manera de identificar los picos respuesta del

principio activo.

Interferencia de los productos de degradación, la hidrólisis básica y ácida se realizó con las tres





Hidrólisis ácida:

Se tomó 1ml de la solución A, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño maría por 25

minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N y se

agitó.


Se tomó 1 ml de la solución A, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a

70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N y

se agitó.

EXCIPIENTE + PÉPTIDO (muestra):

Se tomó 2 ml del vial muestra previamente analizado y de potencia conocida, se transfirió a un

matraz de 50 ml, se diluyó y aforó con HCl 0,01 N (B)

53

Hidrólisis ácida:



0,01 N y se agitó.


Se tomó 1 ml de la solución base (B), se adicionó 2 ml de Na HO 0,5 N y se calentó a baño

maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCL 0,5 N, se enrasó con HCl

0,01 N.

EXCIPIENTES:

Se tomó 2 ml del matraz solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 50 ml, se diluyó

y aforó con HCL 0,01N (C).

Hidrólisis ácida:

Se tomó 1 ml de la solución concentrada (C) , se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño


0,01 N y se agitó.



maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCL 0,5 N, se enrasó con HCl

0,01 N y se agitó.


3.1 SELECTIVIDAD.


cromatográfica de la insulina

54

En el pico cromatográfico de la insulina no se apreció la interferencia de los picos

cromatográficos de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención fueron

diferentes.

Estándar de insulina humana.

Con temperatura: se produjo la degradación de la insulina humana, pero no se evidenció


Tiempos de retención de insulina humana determinados en el análisis de selectividad: 23,70

minutos; 23,80 minutos; 23,70 minutos; 23,71 minutos; 23,74 minutos; 23,63 minutos; 23,70

minutos; 23,68 minutos; 23,70 minutos y 23,72 minutos.

Valor promedio: 23,70 minutos y S:0,041.

Figura Nº 9. Cromatograma insulina humana HPLC

Tanto los productos de degradación como los excipientes aparecen a tiempos de retención

inferiores a 15 minutos, de tal manera que no interfieren en los análisis, los más característicos

aparecen a los 7,77 minutos y 12,49 minutos.

55

Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de insulina, pero no existió evidencia de interferencias entre estos

productos de degradación con la señal del principio activo.

ESTÁNDAR DE INSULINA + EXCIPIENTES MUESTRA

Con temperatura: se produjo degradación de la insulina, pero no se evidenció interferencia con la

señal del principio activo.

Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de la Insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del

producto de degradación con la señal del principio activo.


Se produjo degradación de insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del


Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método es específico para insulina, ya

que no existió evidencia de alguna interferencia en los análisis.

56

3.2 LINEALIDAD

Concentración

UI/ml Área

1,00 1.995.221

2,00 4.069.962

3,00 6.034.724

4,00 8.429.450

6,00 12.640.290

8,00 16.928.606

10,00 21.020.548

LINEALIDAD INSULINA HUMANA

0

50

100

150

200

250

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

CONCENTRACIÓN UI/ml

Coeficiente de

Correlación 0,9999

Pendiente 2,12*106

Intersección eje -1,75*105

ÁREA x 105

57

Factor de Respuesta

Concentración UI/ml Área Concentración

encontrada Factor de respuesta

1,00 1.995.221 0,98 2025193,86

2,00 4.069.962 1,93 2034981,00

3,00 6.034.724 2,86 2011574,67

4,00 8.429.450 4,00 2107362,50

6,00 12.640.290 5,99 2106715,00

8,00 16.928.606 8,03 2116075,75

10,00 21.020.548 9,97 2102054,80

Promedio 2079793,95

CV 2,15%

El procedimiento analítico es lineal, r es mayor a 0,9990(0,9999)

Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% ; 2,15%

Además el coeficiente de determinación r2 es 0,9998

58

3.3 EXACTITUD


encontrada UI/ml

Porcentaje de

recuperación

1,000 1.992.929 0,949 94,94%

2,000 4.207.603 2,004 100,22%

3,000 6.056.866 2,885 96,18%

4,000 8.396.681 4,000 100,00%

6,000 13.042.760 6,213 103,55%

8,000 16.965.513 8,082 101,03%

10,000 21.190.415 10,095 100,95%

Promedio 99,55%

tobservado 0,400

ttabla

2,447 CV 3,00%

El t tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0,05) y a 6 grados de libertad t.95

=2,447


análisis efectuados.

59

3.4 PRECISIÓN

N° Análisis Área UI/ml Encontrados % Recuperación

1 18.066.651 8,03 100,44%

2 18.005.168 8,00 100,10%

3 18.001.460 8,00 100,08%

4 18.119.340 8,05 100,74%

5 17.998.865 8,00 100,07%

6 18.054.529 8,03 100,38%

7 17.969.457 7,99 99,90%

8 18.038.532 8,02 100,29%

9 18.126.059 8,06 100,77%

10 17.875.481 7,95 99,38%

Promedio 8,01 100,22%

CV 0,41%

En este ensayo de repetitividad se consideró adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%

, según la norma ICH o de 1,9% según AEFI.





Ed, se pudo establecer que la metodología implementada cumplió con los parámetros exigidos

para su validación, por lo tanto es apta y confiable para el análisis rutinario de insulina humana,

en el producto inyectable, formulado según lo descrito en la composición del producto.

60

4.0 Límites de Detección y Cuantificación

Conc.

UI Área1 Área2 Área3

Área

promedio

Desviación

estandar

1,00 1.995.221 1.995.224 1.995.225 1.995.223,33 2,08

2,00 4.137.681 4.137.669 4.137.683 4.137.677,67 7,57

3,00 6.061.260 6.061.240 6.061.252 6.061.250,67 10,06

YbI=1310,3 SbI=1,41 B=2.127.738


LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl )/ B) * ( 1/√ n ) = 3,56*10-4 UI/ml


LC ( K=10) = ( (Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) = 3,59*10-4 UI/ml

61

VALIDACIÓN INSULINA LISPRO I. COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO


Insulina Lispro origen DNA recombinante 100,000 UI

m-Cresol 3,150 mg

Glicerina 16,000 mg

Fosfato dibásico de sodio 1,880 mg

Oxido de Zinc 0,024 mg


Acido clorhídrico al 10% y/o hidróxido de sodio al 10%, para ajustar pH:

entre 7,0 y 7,8.

II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN ENTREGADA POR EL FABRICANTE DEL

PRODUCTO, PARA EL PRINCIPIO ACTIVO EN EL PRODUCTO TERMINADO, ENTRE

UN 95,0% A UN 105,0%


Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que no existia una metodología oficial y la

metodología enviada por el fabricante de las insulinas presentaba diferencias en los tiempos de

retención.



Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de Insulina lispro, calidad estándar de referencia, con

una potencia declarada de 173,5 UI USP en 6,014 mg de insulina por vial, para obtener una





62

Solución Muestra:

Se agregó gota a gota una solución de HCl 1 N al vial con el producto muestra, hasta disolución

total de la suspensión, de esta solución se tomó 2 ml y se transfirió a un matraz de 50 ml, se

diluyó y aforó con HCl 0,01 N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial de

HPLC.

PROCEDIMIENTO



Columna : Jupiter (C-18; 25 cm; 5 um ; 300 A° )

Fase Móvil Solución :

A: TFA 0,1% en agua / TFA 0,1% Acetonitrilo ( 71% / 29% )

B: TFA 0,1% en agua / TFA 0,1% Acetonitrilo ( 68% / 32% )

Comienzo con A y cambio a 100% B en 30 minutos; gradiente 0%-100%

TFA : Ácido trifluoracético





EQUIPOS UTILIZADOS

Cromatógrafo líquido de alta resolución. Certificado de calibración N°030624/3.



pH Metro Orion


63

Calificación de columna cromatográfica

Marca Phenomenex; Modelo Júpiter , empaque C-18, N° interno 26



Sensibilidad 0,1 mg




3.1 SELECTIVIDAD

Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes utilizando la técnica de

fabricación del producto. Se preparó una solución base con los excipientes de la fórmula


m-Cresol 3,150 mg.


Fosfato dibásico de Sodio 1,880 mg.

Oxido de Zinc 0,024 mg




Lo mismo se realizó con el estándar de insulina ,se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de

insulina lispro estándar, se diluyó 1 ml, con 10 ml de HCl 0,01 N, se analizó según la


principio activo.

64

La evaluación de la interferencia de los productos de degradación de la hidrólisis básica y ácida

se realizó con las tres soluciones patrones:




Hidrólisis ácida:


minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N y se

agitó.


Se tomó 1 ml de la solución A , se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a

70°C por 25 minutos, se enfrió y se neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N , se enrasó con HCL 0,01

N y se agitó.


Se tomó 2 ml del vial muestra previamente analizado y de potencia conocida, se transfirió a un

matraz de 50 ml, se diluyó y aforó con HCl 0,01 N (B)

Hidrólisis ácida:



0,01 N y se agitó.


Se tomó 1 ml de la solución base (B), se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría

a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N.

65

Excipientes:

Se tomó 2 ml del matraz solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 50ml., se diluyó

y aforó con HCl 0,01 N (C).

Hidrólisis ácida:

Se tomó 1 ml de la solución concentrada (C) , se adicionó 2 ml de HCL 0,5 N y se calentó a

baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó

con HCl 0,01 N y se agitó.



maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl

0,01 N y se agitó.


3.1 SELECTIVIDAD.


cromatográfica de la insulina

En el pico cromatográfico de la insulina no se apreció interferencia de los picos cromatográficos

de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención fueron muy diferentes.

Estándar de insulina lispro

Con temperatura: se produjo la degradación de la insulina humana, pero no se evidenció


Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de insulina, pero no existió evidencia de interferencias entre estos


66

ESTÁNDAR DE INSULINA + EXCIPIENTES MUESTRA

Con temperatura: se produjo degradación de la insulina, pero no se evidenció interferencia con la

señal del principio activo.

Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de Insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del



Se produjo degradación de insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del


Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método es específico para insulina, ya


Los tiempos de retención de insulina lispro determinados en el análisis de selectividad son:

22,10 minutos; 22,12 minutos; 22,49 minutos; 22,59 minutos; 22,56 minutos; 21,78 minutos;

22,75 minutos; 22,08 minutos; 22,18 minutos y 22,22 minutos.

Valor promedia: 22,18 minutos y S: 0,293.

Figura Nº 10. Cromatograma insulina lispro HPLC

67

Tanto los productos de degradación como los excipientes aparecieron a tiempos de retención

inferiores a 15 minutos, de tal manera que no interfirieron en los análisis, el más característico

apareció a los 12,44 minutos.

3.2 LINEALIDAD


1,00 1.725.232

2,00 4.069.992

3,00 6.035.724

4,00 8.429.450

6,00 12.640.290

8,00 16.928.606

10,00 21.120.548

LINEALIDAD INSULINA LISPRO

0

5

10

15

20

25

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0


ÁREA x 106

68

Coeficiente de

Correlación 0,9999

Pendiente 2,15*106

Intersección eje -3,15*105

Factor de respuesta



1,00 1.725.232 0,81 2107362,50

2,00 4.069.992 1,93 2034996,00

3,00 6.035.724 2,86 2011908,00

4,00 8.429.450 4,00 2107362,50

6,00 12.640.290 5,99 2106715,00

8,00 16.928.606 8,03 2116075,75

10,00 21.120.548 10,02 2112054,80

Promedio 2085210,65

CV 2,05%

El procedimiento analítico es lineal r es mayor a 0,9990 (0,9999)

Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% ; 2,05%


69

3.3 EXACTITUD

Concentración

UI/mL Área Concentración encontrada

Porcentaje de

Recuperación

1,00 1.975.232 0,93 93,99%

2,00 4.137.681 1,96 98,44%

3,00 6.061.260 2,88 96,14%

4,00 8.406.155 4,00 100,00%

6,00 12.642.864 6,01 100,27%

8,00 17.051.502 8,11 101,42%

10,00 21.200.521 10,08 100,88%

Promedio 98,73%

CV 2,78%

tobservado 0,637

ttabla

2,447

El t de tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0,05) y a 6 grados de libertad

t.95=2,447



70

3.4 PRECISIÓN

N° Análisis Área UI/ml

Encontrados % Recuperación

1 17.708.708 8,15 101,91%

2 17.813.480 8,20 102,51%

3 17.950.654 8,26 103,30%

4 17.803.883 8,19 102,46%

5 17.831.500 8,20 102,62%

6 17.903.651 8,24 103,03%

7 17.916.819 8,24 103,11%

8 17.927.004 8,25 103,17%

9 17.967.636 8,27 103,40%

10 17.990.403 8,28 103,53%

Promedio 8,23 102,91%

CV 0,50%



El método implementado fue preciso, ya que cumplió con un CV inferior a 2%, el valor





para su validación, por lo tanto, es apta y confiable para el análisis rutinario de insulina lispro, en

el producto inyectable, formulado según lo descrito en la composición del producto.

71


Conc.mg/ml Área1 Área2 Área3 Área

promedio

Desviación

estandar

1 1.925.222 1.925.212 1.925.222 1.925.218,67 5,77

2 4.069.989 4069991 4.069.993 4.069.991 2,00

3 5.235.719 5.235.720 5.235.721 5.235.720 1,00

YbI=433.141 SbI=7,69 B=2.151.694


LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) = 0,12 UI/ml


LC ( K=10) = (( Ybl +10Sbl )/ B)*( 1/√ n ) = 0,12 UI/ml

72

VALIDACION CALCITONINA


Cada ml contiene:

Calcitonina ( de Salmon) 100,00 UI

Edetato disódico 1,00 mg

Cloruro de sodio 7,50 mg

Cloruro de benzalconio 0,15 mg

Acido clorhídrico csp pH 3,70

Agua para inyectables csp 1,00 ml

II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN CONSIDERADA POR EL LABORATORIO, AL

NO EXISTIR OFICIALMENTE, PARA EL PRINCIPIO ACTIVO EN EL PRODUCTO

TERMINADO, ENTRE UN 90,0% A UN 110,0%


Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que no existia una metodología oficial para el

producto terminado y la metodología empleada en base a una fase movil con gradiende de

solución de hidroxido de tetrametilamonio no presentaba picos aceptables y los tiempos de

retención pqueños no permitian una separación con los excipientes y productos de degradación.

.



Se pesó con precisión, alrededor de 10.000 UI de Salcatonina estándar, aproximadamente 2,0 mg

( se consideró un estándar de 5.000 UI/mg) , se disolvió y diluyó a 10 ml con agua.

Se diluyó 5,0 ml de esta solución a 10 ml con fase móvil

Solución Muestra:

Se mezcló 1,0 ml de muestra con 1,0 ml de fase móvil y se agitó.

73

PROCEDIMIENTO



Columna : Symmetry (C-8;15 cm;4,6 um)

Fase Móvil

A Ácido trifluoracetico al 0,1% en agua / Acetonitrilo ( 75 % / 25 % )

B Ácido trifluoracetico al 0,1% en agua / Acetonitrilo ( 50 % / 50 % )

Gradiente en 20 minutos 0%-100% , inicio con A y termino con B




Volumen inyectado : 20ul

EQUIPOS UTILIZADOS




pH Metro Orion


74


Marca Waters; Modelo Symmetry, empaque C-8, N° interno 1522



Sensibilidad 0,1 mg




3.1 SELECTIVIDAD

Edetato disódico 1,00 mg


Cloruro de benzalconio 0,15 mg





exceptuando el principio activo.



Lo mismo se realizó con el estándar de calcitonina se agrego 10,0 ml de agua a

10.000 UI estándar (solución A), se diluyó 5 ml, con 10 ml de fase móvil A, se analizó según la


principio activo.

75

Interferencia de los productos de degradación, la hidrólisis básica y ácida se realizó con las tres





Se agregó 10,0 ml de agua a 10.000UI de estándar ( solución A)

Hidrólisis ácida:


minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se

agitó.


Se tomó 1 ml de la solución A y se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a

70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl, 0,5 N , se enrasó con fase móvil A

y se agitó.


Se tomó un frasco del producto muestra previamente analizado y de potencia conocida.

Hidrólisis ácida:

Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml , se adicionó 2 ml de HCl

0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de

NaOH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.


Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml , se adicionó 2 ml de

NaOH 0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2

ml de HCl 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.

76

EXCIPIENTES:

Se tomó la solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 10 ml., para cada hidrólisis.

Hidrólisis ácida:

Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl


Na OH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.


Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml , se adicionó 2 ml de




3.1 SELECTIVIDAD.


cromatográfica de la calcitonina

En el pico cromatográfico de la calcitonina no se apreció la interferencia de los picos

cromatográficos de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención son

diferentes

Estándar de calcitonina

Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de calcitonina, pero no existió evidencia de la interferencia entre estos


77


Se produjo degradación de calcitonina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del



Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de calcitonina y de los excipientes, pero no existió evidencia de

interferencias entre estos productos de degradación o de los excipientes con la señal del principio

activo.


Se produjo degradación de calcitonina y de los excipientes, pero no se evidenció interferencia

entre los picos del producto de degradación o de los excipientes con la señal del principio activo.

Excipientes:

En los cromatogramas de los excipientes, tanto sin hidrolizar como hidrolizados fue evidente que

no aparecieron picos al tiempo de retención de la calcitonina.

Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método es específico para calcitonina, ya


Los tiempos de retención de calcitonina determinados en el análisis de selectividad son: 7,60

minutos; 7,59 minutos; 7,54 minutos; 7,59 minutos; 7,54 minutos; 7,58 minutos; 7,55 minutos;

7,58 minutos; 7,59 minutos y 7,60 minutos.


78

Figura Nº 10. Cromatograma calcitonina ( salcatonina) HPLC


distintos a los del pico principal de calcitonina , muy posterior a 15,97 minutos, o mucho antes, a

los 3,14 y 4,22 minutos, de tal manera que no interfirieron en los análisis.

3.2 LINEALIDAD


71,96 288.823

179,91 728.224

269,87 1.103.909

359,83 1.434.135

449,79 1.855.734

749,65 2.924.506

899,58 3.575.780

1349,37 5.261.635

79

LINEALIDAD CALCITONINA

0

10

20

30

40

50

60

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0 1200,0 1400,0 1600,0


Coef.de Correlación 0,9998

Pendiente 3.885,53

Intersección eje 43.564,26

Factor de Respuesta

Concentración UI/ml Área concentración


71,96 288.823 73,90 4013,66

179,91 728.224 186,33 4047,58

269,87 1.103.909 282,46 4090,52

359,83 1.434.135 366,96 3985,52

449,79 1.855.734 474,84 4125,76

749,65 2.924.506 748,31 3901,16

899,58 3.575.780 914,96 3974,93

1349,37 5.261.635 1346,33 3899,31

Promedio 4004,80

CV 2,05%

ÁREA x 105

80

El procedimiento analítico es lineal, r es mayor a 0,9990(0,9998)

Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% ; 2,05


3.3 EXACTITUD

Concentración

UI/ml Área

Concentración

encontrada

UI/ml

Porcentaje de

recuperación

71,96 290.199 73,49 102,13%

179,91 699.788 177,22 98,50%

269,87 1.100.597 278,72 103,28%

359,83 1.394.129 353,06 98,12%

449,79 1.798.787 455,54 101,28%

749,65 2.895.795 733,36 97,83%

899,58 3.489.879 883,82 98,25%

Promedio 99,91%

CV 2,26%

tobservado 0,1051

ttabla 2,4470

El t de tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0.05) y a 6 grados de libertad

t.95=2,447

Como el t observado es menor al t tabla el método cumple con la exigencia de exactitud, según los

análisis efectuados.

81

3.4 PRECISIÓN

N°

Análisis Área UI/ml Encontrados % Recuperación

1 597.812 378,97 105,32%

2 589.535 373,72 103,86%

3 593.069 375,96 104,48%

4 595.412 377,45 104,90%

5 596.016 377,83 105,00%

6 595.522 377,52 104,92%

7 596.834 378,35 105,15%

8 594.938 377,15 104,81%

9 596.810 378,33 105,14%

10 598.420 379,35 105,43%

Promedio 377,46 104,90%

CV 0,43%

< 1.90




encontrado es de 0,43%

Límite de confianza 104,9% ± 1,020%



para su validación, por lo tanto es apta y confiable para el análisis rutinario de calcitonina, en el

producto terminado, formulado según lo descrito en la composición del producto.

82


Conc.

UI Área1 Área2 Área2 Área promedio

Desviación

estandard

72 288.115 288.118 288.123 288.118,6 4,04

180 728.214 728.222 728.220 728.218,6 4,16

270 1.090.732 1.090.739 1.090.744 1.090.738,3 6,02

YbI=3.097,3 SbI=3,05 B=3.885,5


LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) = 0,46 UI/ml


LC ( K=10) = ( (Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) = 0,46 UI/ml

83

VALIDACIÓN DESMOPRESINA


Cada ml contiene:

Acetato de Desmopresina Trihidrato 0,100 mg

Equiv. a Desmopresina 0,089 mg

Clorobutanol 5,000 mg




II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN ENTREGADA POR EL FABRICANTE DEL

PRODUCTO PARA EL PRINCIPIO ACTIVO EN EL PRODUCTO TERMINADO,

ENTRE UN 90,0% A UN 110,0%


Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que no existia una metodología oficial

de farmacopea para esta solución endonasal y la metodología enviada por el fabricante de

la desmopresina presentaba interferencias con los excipientes y los productos de

degradación.


Soluciones estándar :

Se pesó con precisión, alrededor de 10 mg de Acetato de desmopresina trihidrato, calidad

estándar, se disolvió y diluyó a 100 ml con agua.

Solución muestra:

Muestra tal cual.

84

PROCEDIMIENTO


Condiciones cromatográficas

Columna : Kromasil (C-8; 25 cm; 4,6 um)

Fase Móvil :

Tampón Fosfato pH 7.0 / Acetonitrilo (80/ 20)

Tampón : Mezclar 380,0 ml de KH2PO4 0,908 g % en agua con 611,0 ml

de Na2HPO4 2,38 g % en agua

Flujo : 1,5 ml./minuto




EQUIPOS UTILIZADOS




pH Metro Orion



Marca: Akzo-nobel, modelo: Kromasil;, empaque C-8, N° interno 1858



Sensibilidad 0,1 mg



85


3.1 SELECTIVIDAD Clorobutanol 5,0 mg


Ácido clorhídrico csp pH 4,0




exceptuando el principio activo.



Lo mismo se realizó con el estándar, se pesó con precisión , una cantidad cercana a 10 mg de

acetato de desmopresina trihidrato , calidad estándar, se disolvió y diluyó a 100 ml con agua, se

analizó según la metodología analítica correspondiente, de tal manera de identificar los picos

respuesta del principio activo.

Interferencia de los productos de degradación, la hidrólisis básica y ácida se realiza con las tres





Se peso con precisión, alrededor de 10 mg de Acetato de desmopresina trihidrato, calidad

estándar, se disolvió y diluyo a 10 ml con agua.( solución A)

86

Hidrólisis ácida:

Se tomó 1 ml de la solución A, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N

y se calentó a baño maría por 25 minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5

N, se enrasó con Fase Móvil A , se agitó.


Se tomó 1 ml de la solución A , se trasladó a un matraz aforado de 10 ml, se adicionó 2 ml de

NaOH 0,5 N y se calentó a baño María a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de

HCl 0,5 N , se enrasó con fase móvil A y se agitó.


Se tomó un frasco del producto muestra previamente analizado y de potencia conocida.

Hidrólisis ácida:

Se tomó 2 ml de la solución anterior, se traslado a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl


NaOH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.


Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de


ml de HCl 0,5N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.

EXCIPIENTES:

Se tomo la solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 10 ml, para cada hidrólisis

Hidrólisis ácida:

Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl


Na OH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.

87


Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de




3.1 SELECTIVIDAD.


cromatográfica de la desmopresina.

En el pico cromatográfico de la Desmopresina no se aprecio la interferencia de los picos

cromatográficos de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención fueron muy

diferentes.

Estándar de desmopresina

Hidrólisis ácida:

Se produjo la degradación de la esmopresina, pero no existió evidencia de interferencias entre

estos productos de degradación con la señal del principio activo.


Se produjo degradación de la desmopresina, pero no se evidencio interferencia entre los picos

del producto de degradación con la señal del principio activo.

88


Hidrólisis ácida:

Se produjo degradación de la desmopresina y de los excipientes, pero no existió evidencia de

interferencias entre estos productos de degradación o de los excipientes con la señal del principio

activo.


Se produjo degradación de la desmopresina y de los excipientes, pero no se evidencio

interferencia entre los picos del producto de degradación o de los excipientes con la señal del

principio activo.

Excipientes:

En los cromatogramas de los excipientes, tanto sin hidrolizar como hidrolizados, es evidente que

no aparecieron picos al tiempo de retención de la Desmopresina.

Con los cromatogramas de respaldo se concluyo que el método es específico para, desmopresina

ya que no existió evidencia de alguna interferencia en los análisis.

Los tiempos de retención de desmopresina determinados en el análisis de selectividad son: 9,50

minutos; 9,51 minutos; 9,54 minutos; 9,53 minutos; 9,54 minutos; 9,58 minutos; 9,56 minutos;

9,50 minutos; 9,52 minutos y 9,60 minutos.


89

Figura Nº 11. Cromatograma desmopresina HPLC


distintos a los del pico principal de desmopresina , muy anteriores a 6,42 minutos, o mucho

antes 2,66 y 5,08 minutos, de tal manera que no interfirieron en los análisis.

3.2 LINEALIDAD

Concentración

mg/ml Área

0,0050 64.673

0,0100 126.787

0,0200 267.810

0,0400 488.230

0,0450 591.537

0,0500 655.216

0,1000 1.291.878

90

LINEALIDAD DESMOPRESINA

0

20

40

60

80

100

120

140

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12

CONCENTRACIÓN mg/ml

Coeficiente de

Correlación 0,9994

Pendiente 1,2*107

Intersección eje -410,23

ÁREA x 104

91

Factor de Respuesta

Concentración mg/ml Área Concentración


0,005 64.673 0,0049 12934600,00

0,010 126.787 0,0090 12678700,00

0,020 267.810 0,0210 13390500,00

0,040 488.230 0,0040 12205750,00

0,045 591.537 0,0440 13145266,67

0,050 655.216 0,0499 13104320,00

0,100 1.291.878 0,0999 12918780,00

Promedio 12911130,95

CV 2,96%

El procedimiento analítico es lineal r es mayor a 0,9990(0,9994)

Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% : 2,96%

Además el coeficiente de determinación r2 es 0,9989.

92

3.3 EXACTITUD

Concentración mg/ml Área Concentración

encontrada mg/ml

Porcentaje de

recuperación

0,0010 12.698 0,00101 101,00%

0,0025 27.987 0,00240 96,00%

0,0050 54.673 0,00477 95,49%

0,0100 116.787 0,01020 101,99%

0,0250 275.269 0,02404 96,15%

0,0500 569.339 0,04972 99,44%

0,1000 1.198.654 0,10468 104,68%

Promedio 99,25%

CV 3,55%

tobservado 0,558

ttabla 2,447

El t tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0,05) y a 6 grados de libertad

t.95=2,447



93

3.4 PRECISIÓN

N° Análisis Área mg/ml

Encontrados % Recuperación

1 1.291.878 0,1000 100,00%

2 1.271.878 0,0984 98,45%

3 1.292.878 0,1000 100,07%

4 1.291.778 0,0999 99,99%

5 1.291.870 0,1000 100,00%

6 1.291.868 0,0999 99,99%

7 1.291.848 0,0999 99,99%

8 1.290.878 0,0999 99,92%

9 1.291.378 0,0999 99,96%

10 1.281.878 0,0992 99,92%

Promedio 0,0997 99,83%

CV 0,49%

En este ensayo de repetitividad se considero adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%,



encontrado es de 0,49%

Límite de Confianza 99,83%% ± 1,1064%



para su validación, por lo tanto es apta y confiable para el análisis rutinario de desmopresina, en

el producto terminado, formulado según lo descrito en la composición del producto.

94


Conc.mg/ml Área1 Área2 Área2 Área promedioDesviación

estandar

0,008 90.059 90.054 90.057 90.056,66 2,51

0,010 139.622 139.626 139.629 139.625,66 3,51

0,015 239.988 239.989 239.980 239.985,66 4,93

YbI=76.199 SbI=0,02 B=12.922.232


LD ( K=3) = ( Ybl +3Sbl / B) * ( 1/√ n ) = 3,4*10-3 mg/ml


LC ( K=10) = ( Ybl +10Sbl / B)*( 1/√ n ) = 3,4*10-3 mg/ml

95

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

-Para dar inicio a la validación de este tipo de sustancias peptídicas, tales como: insulinas,

calcitonina y desmopresina, fue necesario contar de antemano con instrumentos calificados y

con un laboratorio con un Programa de Garantía de la Calidad, que dé la confianza y garantías

necesarias para emplear todos los instrumentos y equipos que se usaron en la validación de las

metodologías analíticas de estas sustancias peptídicas, por menores que estos fueran (6,7)

El lugar de trabajo tenía las condiciones de temperatura y humedad adecuadas (controladas) y

los equipos, especialmente los HPLC, contaban con los módulos necesarios para controlar

esencialmente la temperatura de las columnas y las bombas binarias para hacer gradientes,

condiciones que resultan fundamentales para el desarrollo de las metodologías (9)

-Previo a la validación fue importante conocer las características de cada péptido o proteína, su

labilidad (estabilidad en el medio en que se disolvió finalmente, para el desarrollo del análisis),

con el fin de tomar todas las precauciones necesarias durante los análisis (11)

- Las características peptídicas variadas de estas moléculas, de gran complejidad, fueron un buen

modelo de estudio, debiendo sortearse su inestabilidad, no sólo en soluciones extremas de pH,

sino también cuidando los solventes orgánicos y las soluciones salinas que se emplearon para

disolverlas (23,24)

-La mejor orientación en ese sentido, que constituyó un buen punto de partida para seleccionar el

solvente en que se disolvió o diluyeron las muestras a analizar fue la formulación en la cual

están preparadas estas proteínas, usadas como fármacos por su alta actividad como hormonas, el

pH y las características de las sales en las cuales viene preparado el producto (11,23)

-El solvente seleccionado para disolver las muestras fue de vital importancia, ya que por un lado

permitió mantener estable la proteína sin que se produjera degradación, durante el tiempo que

duró el ensayo y por otro lado permitió una buena resolución cromatográfica, sin mayores

alteraciones de la línea base, especialmente cuando se inyectan volúmenes mayores, para

mejorar la respuesta.

96

-Un aspecto importante y digno de destacar fue el largo de la cadena peptídica, esto conlleva

varias limitaciones se pudo comprobar que a un menor número de aminoácidos, péptidos de

cadena corta, se presentó un problema mayor: disminuye considerablemente la absorbilidad en

la longitud de onda de trabajo, se hace necesario trabajar con concentraciones altas Por ejemplo,

con la desmopresina péptido de tan solo 9 aminoácidos, se usó una concentración de 10 mg %.

Cuando se tiene un largo de cadena considerable, como en el caso de las insulinas que tienen 51

aminoácidos, se presentan otro tipo de problemas con las columnas tradicionales, la interacción

deforma los picos cromatográficos, lo que obligó a usar columnas de un mayor tamaño de poro,

por ejemplo 300 °A y reactivos que mejoraran la solubilidad de la proteína, como el ácido

trifluoracetico(TFA), con el fin de tener una adecuada resolución, de otra forma habría sido

imposible validar estos métodos analíticos(13)

-En el rango de péptidos estudiados no se encontraron grandes problemas de estabilidad, que

obligaran a tomar precauciones especiales en el manejo de las muestras, pero sin duda esto más

bien recae en las características particulares de cada péptido y no se puede generalizar, pero sí se

puede asegurar que para insulina humana, insulina lispro, calcitonina y desmopresina, se

mantienen las soluciones estables por varios días, incluso a temperatura ambiente, disueltas en

los solventes indicados en cada metodología (3-5)

-Se pudo comprobar la necesidad del uso de columnas apropiadas, para péptidos de alto peso

molecular, como calcitonina e insulina humana y lispro, preferentemente columnas largas y de

cadena corta C-4 o C-8 con un tamaño de poro sobre 100 Aº, idealmente de 300 ºA, no

descartando el empleo de columnas C-18 con un tamaño de poro de 300 ºA cuando se requiera

una mejor separación, debido a una mayor área superficial de la fase estacionaria. Esto permitió

montar técnicas analíticas, confiables, de buena resolución y rápido desarrollo, absolutamente

validadas, para su empleo en análisis de rutina, en productos farmacéuticos que las contengan

(9,13,18)

97

-En general, se pudo apreciar que los límites de detección y cuantificación fueron cercanos a

los valores inferiores de las curvas de calibración, lo que no sucede en general con otro tipo de

moléculas, donde los límites de cuantificación (Lc) y límites de detección (Ld) son varios

órdenes inferiores a los valores de la curva de calibración, en esto influye la baja absorbilidad,

que presenta este tipo de moléculas peptídicas, que depende del número de aminoácidos para

generar una buena respuesta en el detector UV. Esto no permite trabajar en concentraciones

muy por debajo de las concentraciones menores de las curvas de calibración.

La diferencia entre el límite de detección (Ld) y el límite de cuantificación (Lc) , en general, es

muy estrecha, esto se explica porque en la ecuación empleada para la determinación de estas

concentraciones límites, el valor del intercepto es muy alto, no es cercano a cero como en una

linea recta ideal y por lo tanto el factor K, que para el cálculo del Ld es de 3 y para el calculo de

Lc es de 10 no es un factor diferenciador para el resultado de estas concentraciones límites

(1,6,7)

En todos los análisis efectuados se encontró una sola excepción respecto a valores de Ld y Lc

por debajo de las concentraciones inferiores de la curva de calibración, que fue con la insulina

humana, el segundo ensayo con gradiente, donde coincide que se trata de una de las moléculas

estudiadas con mayor número de aminoácidos, con buena absorbilidad si se compara con

Calcitonina y Desmopresina y presenta además una de las mejores relaciones entre las

concentraciones bajas de la curva de calibración, respecto a la respuesta del equipo( área).

Por otro lado, no tiene una importancia analítica relevante el hecho de que los límites de

cuantificación(Lc) y detección(Ld) no tengan valores relativos muy bajos, ya que el rango de

trabajo (linealidad de las curvas) en los análisis de todos los péptidos involucrados en el estudio

están en un rango de concentraciones muy superior, totalmente distinto y por lo tanto no influye

en los análisis rutinarios.

Finalmente es importante destacar que en el primer ensayo de insulina humana, siguiendo la

técnica de la USP 27, no se logró cumplir con el requisito de selectividad. En este ensayo el

tiempo de retención de la insulina es variable con cada inyección y es imposible asegurar la no

interferencia de excipientes y/o productos de degradación en la determinación de insulina.

98

Una posible explicación a las variaciones en los tiempos de retención de la insulina, empleando

la fase móvil descrita en la farmacopea de los Estados Unidos, es que esta proteina tiene una

estructura secundaria y terciaria y eso permite que solo una pequeña proporción de la superficie

molecular tenga interacción con la fase estacionaria de la columna, el tiempo de retención estará

determinado por la composición molecular específica de contacto hidrofóbico de la insulina y

cómo influye cada vez la fase móvil con una alta concentración de sales en el ordenamiento

secundario y terciario de esta proteina (3,9)

Por otro lado, evidentemente la interacción de una proteina polipeptídica como la insulina con la

fase estacionaria de la columna no puede ser igual que con una molécula pequeña, la interacción

hidrofóba para este tipo de proteinas con la superficie del relleno será muy dependiente del

componente orgánico de la fase móvil, en este caso acetonitrilo (9,12,13)

La concentración del componente orgánico es crítica en los tiempos de retención de la insulina y

en esto puede influir la volatilidad de acetonitrilo, produciéndose variaciones por la forma de

preparación de la fase móvil y también la posible variación de la concentración del solvente en

la mezcla debido al tiempo de preparación de la fase móvil.

En el segundo ensayo para la determinación de insulina humana se logró montar un método

analítico no oficial, que cumple con todos los requisitos exigidos para una validación analítica,

que emplea una fase móvil con gradiente, donde no se producen estas variaciones en los tiempos

de retención de insulina (1,6,7)

En el caso de calcitonina no se contaba con un método oficial para el producto terminado y el

método para la materia prima, cuya fase móvil está formada principalmente por hidróxido de

tetrametilamonio, presentaba grandes deficiencias por la deformación de los picos

cromatográficos y por su deficiente selectividad entre el pico de calcitonina y los productos de

degradación y/o excipientes (4,6,7)

Finalmente en el caso de desmopresina sucede algo similar, no existe un metodo oficial para la

solución de uso endonasal y la metodología no cumplía con el requisito de selectividad. Tanto

para calcitonina como para desmopresina se logró montar un método analítico que cumple con

todos los requisitos para una validación analítica (1,4-7)

99

CONCLUSIONES

1.Se cumplió plenamente la hipótesis planteada, se logró demostrar que es posible trabajar

adecuadamente péptidos y proteínas de distintas características y efectuar análisis confiables con

métodos analíticos validados, para cada uno de ellos. Basándose en la selección adecuada de

columnas cromatográficas se logró montar técnicas analíticas confiables para una serie de

péptidos, con características disímiles, empleando para ello los equipos HPLC con detectores

UV.

2.Se comparó el método descrito en la USP 27 para insulina humana con un método

desarrollado en este estudio, encontrándose mejoras notables en el método que fue parte de este

estudio, especialmente por su reproducibilidad y ausencia de los problemas que producen las

fases móviles con un alto contenido de sales, como la precipitación de sales al interior de la

columna.

3. Se logró el objetivo general, pues se desarrollaron métodos analíticos adecuados para todos

los fármacos parte del estudio, se estableció un método confiable y validado para el análisis de

todos los péptidos: insulina humana, insulina lispro, calcitonina (salcatonina) y desmopresina,

para ser aplicada en su forma farmacéutica comercial.

4.Se cumplieron todos los objetivos específicos, estudiando las variables que influyen en los

métodos analíticos por HPLC para péptidos y se pudieron validar cada uno de los métodos

analíticos montados, siguiendo los criterios de la farmacopea, para cada uno de los péptidos

involucrados en el estudio.

El modelo de estudio seleccionado, péptidos entre 9 y 51 aminoácidos, unido a la experiencia

lograda, en el manejo de solventes adecuados, para disolver las muestras y para formar las fases

móviles como también el tipo de columna (relleno y largo), permitirá el desarrollo más rápido y

la validación de técnicas analíticas para otros péptidos que se deseen evaluar en el futuro, cuando

se incorporen al arsenal terapéutico nacional.

100

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ANEXOS

TABLA N° 1. Valores de t de Student

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TABLA N° 2. Valores aceptables de CV según límites de aceptación

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