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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MODALIDAD: INVESTIGACIÓN TEMA: EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EN GRANOS DE CAFÉ VERDE CULTIVADO EN ECUADOR (Coffea robusta) TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS AUTORES: DANIEL STALIN ÁVALOS FERNÁNDEZ JORGE FABRIZZIO MERA ALCÍVAR TUTORA: Ph.D. TATIANA ZAMORA ZAMORA CO-TUTORA: Ph.D. MERIBARY MONSALVE PAREDES GUAYAQUIL – ECUADOR 2018
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE ÁCIDO
CLOROGÉNICO EN GRANOS DE CAFÉ VERDE CULTIVADO EN ECUADOR
(Coffea robusta)
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS
AUTORES:
DANIEL STALIN ÁVALOS FERNÁNDEZ
JORGE FABRIZZIO MERA ALCÍVAR
TUTORA:
Ph.D. TATIANA ZAMORA ZAMORA
CO-TUTORA:
Ph.D. MERIBARY MONSALVE PAREDES
GUAYAQUIL – ECUADOR
2018
i
DEDICATORIA
En primer lugar, damos gracias a Dios, por la vida, la fuerza y las ganas de seguir
siempre adelante, por nunca permitir que sus hijos (nosotros) dejemos luchar.
De igual manera, le agradecemos nuestra tesis a nuestros padres que han estado
y estarán siempre apoyándonos, guiándonos y a enseñarnos que nunca hay que
rendirse. A nuestros familiares, que siempre con su alegría y satisfacción han estado
con el optimismo de ver a un nuevo Químico Farmacéutico en la sociedad.
A la Compañía Bureau Veritas – Inspectorate, por permitirnos desarrollar nuestra
tesis en sus instalaciones, siempre ayudándonos en lo necesario.
Al Q.F Sergio Maquilón, que nos brindó su ayuda y conocimientos sin nada a
cambio, una de las tantas personas que hizo posible esta exitosa culminación del
trabajo de titulación.
Agradecemos de igual manera a Instituto Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (INIAP) por la cooperación y donación de las muestras de café robusta
para la realización del trabajo de titulación
Y, por último, pero no menos importante, a nuestra tutora Ph.D Tatiana Zamora
Zamora y Co-Tutora Ph.D Meribary Monsalve Paredes por sus valiosos, necesarios
conocimientos y orientación para la culminación de este estudio.
Jorge Mera A. y Daniel Ávalos F.
ii
ÍNDICE GENERAL
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
PROBLEMA ............................................................................................... 3
OBJETIVOS ............................................................................................... 3
GENERAL: ................................................................................................. 3
ESPECÍFICOS: .......................................................................................... 4
HIPÓTESIS ................................................................................................ 4
OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES ................................................ 5
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................ 6
ANTECEDENTES ...................................................................................... 6
I.1 Café verde ....................................................................................... 7
I.1.1 Cultivo de café ................................................................................ 9
I.1.2 Tipos de café del Ecuador ............................................................ 11
I.1.3 Producción de café en Ecuador .................................................... 11
I.2 Café robusta ....................................................................................... 14
I.1.7 Componentes químicos del café verde ........................................ 16
I.1.8 Compuestos fenólicos del café verde ........................................... 19
I.2 Familia: Ácidos clorogénicos ............................................................... 20
I.2.1 Ácido clorogénico ......................................................................... 22
I.2.2 Técnicas de separación ................................................................ 25
I.2.2.1 Método de Soxhlet ..................................................................... 25
I.2.2.2 Método de Maceración .............................................................. 25
I.2.3 Obtención del ácido clorogénico ................................................... 26
I.2.4 Detección del ácido clorogénico ................................................... 26
iii
I.4 Cromatografía ..................................................................................... 27
I.4.1 Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) .............................. 28
I.4.1.1 Detectores de HPLC .................................................................. 29
I.4.3 Espectrofotometría UV-visible ...................................................... 30
I.4.4 Detector de barrido de diodos (DAD o PDA) ................................ 30
CAPÍTULO II: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ....................... 32
II.1 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................. 32
II.2 EQUIPOS Y/O APARATOS ............................................................... 33
II.3 MUESTRAS ....................................................................................... 34
II.4 MÉTODOS ......................................................................................... 34
II.4.1 Parámetros físico-químicos. ............................................................ 34
II.4.2 Determinación de humedad. ........................................................ 35
II.4.3 Determinación de cenizas ........................................................ 35
II.4 Ensayos del tamizaje fitoquímico ....................................................... 37
II.4.1 Preparación de muestras............................................................. 37
II.4.2 Ensayos de reacciones fitoquímica ............................................. 38
II.5 Análisis cromatográfico del ácido clorogénico.................................... 40
II.5.2 Soluciones de trabajo .................................................................. 41
II.6 Selección de condiciones cromatográficas ........................................ 41
II.6.1 Optimización del método para extracción del ácido clorogénico . 42
III.1 Parámetros físicos-químicos ............................................................. 45
III.2 Determinación del porcentaje humedad ............................................ 46
III.3 Determinación de cenizas totales ..................................................... 46
III.4 Tamizaje fitoquímico del café verde. ................................................. 50
iv
III.5. Análisis cromatográfico del ácido clorogénico ................................. 53
III.6 Ensayos preliminares ........................................................................ 60
III.6.1 Primera etapa de optimización ................................................... 62
III.6.2 Segunda y tercera etapa de optimización................................... 65
III.6.3 Análisis de muestras reales con diferentes periodos de
maduración, aplicando extracción por agitación magnética. ................ 67
CONCLUSIÓN ......................................................................................... 72
RECOMENDACIÓN ................................................................................. 73
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................ 74
ANEXOS .................................................................................................. 78
GLOSARIO DE TÉRMINOS .................................................................... 83
v
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA I. Operacionalización de Variables ........................................... 5
TABLA II. Clasificación taxonómica del café ............................................. 7
TABLA III. Clasificación científica ............................................................ 15
TABLA IV. Principales características de las especies arábiga y robusta
................................................................................................................. 16
TABLA V. Promedios de la composición química del grano de café
almendra, según la especie, porcentaje en base seca. ........................... 18
TABLA VI. Ventajas y Desventajas de los detectores más usados en
cromatografía liquida. .............................................................................. 31
TABLA VII. Soluciones de trabajo, curva de calibración ........................ 41
TABLA VIII. Elución de las fases A y B en modo gradientes ................... 42
TABLA IX. Ensayos de optimización de la primera etapa ...................... 43
TABLA X. Promedio y coeficiente de variación (CV) de los parámetros
físicos de los granos de café verde analizados........................................ 45
TABLA XI. Porcentaje de humedad en granos de café verde ................. 46
TABLA XII. Porcentaje de cenizas totales presentes en las semillas del café
verde ........................................................................................................ 47
TABLA XIII. Porcentaje de cenizas totales presentes en cáscara del café
verde ........................................................................................................ 48
TABLA XIV. Porcentaje de cenizas totales presentes en granos completos
de café verde ........................................................................................... 49
TABLA XV. Resultados del tamizaje en cáscara de granos de café verde
................................................................................................................. 51
TABLA XVI. Resultados del tamizaje en semilla de granos de café verde
................................................................................................................. 52
TABLA XVII. Área y concentración del estándar de 5 ppm .................... 58
vi
TABLA XVIII. Área y concentración de ácido clorogénico (5-CQA) en las
diferentes soluciones de trabajo para la curva de calibración .................. 60
TABLA XIX. Área y concentración determinada de las muestras de
ensayos preliminares según la Figura 11. ............................................... 64
TABLA XX. Área y concentración determinada de las muestras de ensayos
preliminares según la Figura 12. ............................................................. 67
TABLA XXI. Área y concentración determinada de las muestras reales por
período de maduración en maceración y vortex por 6 horas, según la Figura
15. ............................................................................................................ 71
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. Grano del café verde .............................................................. 8
FIGURA 2. Principales zonas cafetaleras del Ecuador ........................... 12
FIGURA 3. Evolución de las exportaciones a partir del 2011 ................. 14
FIGURA 4. Estructuras químicas de los ácidos: Cumárico (1), fenílico (2),
clorogénico (3) y cafeico (4). .................................................................... 20
FIGURA 5. Contenidos de ácidos clorogénicos totales en café, según la
variedad y la madurez. ............................................................................. 22
FIGURA 6. Fórmula química del ácido clorogénico ................................ 23
FIGURA 7. Cromatograma obtenido mediante HPLC-UV en: a) una
solución estándar de 5-CQA, y b) en un extracto hidroalcohólico de la
muestra .................................................................................................... 55
FIGURA 8. Cromatograma HPLC-UV de un extracto hidroalcohólico de la
muestra inyectado en una columna C18 de 250 mm, con separación de los
picos 5-CQA y 4-CQA. ............................................................................. 56
FIGURA 9. Pico del estándar del ácido clorogénico (5-CQA) a una
concentración de 5 ppm. .......................................................................... 57
vii
FIGURA 10. Espectro del estándar del ácido clorogénico, 5 ppm .......... 58
FIGURA 11. Curva de calibración del estándar de ácido clorogénico (5-
CQA) ........................................................................................................ 59
FIGURA 12. Cromatograma de los isómeros del ácido clorogénico
presentes en la muestra de café verde robusta detectados por PDA: 3-
cafeoilquinico (3-CQA); 5-cafeoilquinico (5-CQA); 4-cafeoilquinico (4-CQA);
5-feruloilquinico (5-FQA); 3,4-dicafeoilquinico (3,4-diCQA); 3,5-
dicafeoilquinico (3,5-diCQA); 4,5-dicafeoilquinico (4,5-diCQA) ................ 61
FIGURA 13. Cromatogramas de los ensayos preliminares
correspondientes a la primera etapa: A) Extractos hidroalcohólica
EtOH:Agua (2:1), B) Extracto 100 % en agua detectados por PDA. ........ 62
FIGURA 14. Cromatogramas de los ensayos preliminares
correspondientes a la segunda y tercera etapa por maceración con
EtOH:Agua (2:1), a) Ensayos por maceración de 6 y 12 horas; b) Ensayo
de maceración por sonicación durante 1 hora, detectados por PDA. ..... 65
FIGURA 15. Cromatogramas de extracción en muestras reales por
períodos de maduración: Primera semana, cuarta semana y sexta semana
de maduración; a) Extracto por agitación magnética, b) extracto por vortex,
ambos métodos se emplearon por 6 horas. ............................................. 68
FIGURA 16. Espectro del ácido clorogénico - Semana 6 ....................... 69
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXOS A. Parámetros físicos de los granos del café robusta………….81
ANEXOS B. Ensayo fitoquímico………………………...……………………84
ANEXOS C. Análisis cromatográfico…………………………………………85
viii
RESUMEN
El ácido clorogénico es un compuesto fenólico presente en los granos de
café verde. Estudios evidencian que el consumo de este ayuda a la pérdida de
masa en individuos con sobrepeso. El objetivo de esta investigación, es,
demostrar los niveles de concentración del ácido clorogénico (5-CQA) en el grano
de café robusta cultivado en Ecuador, dependiendo de su madurez. Se realizaron
extracciones por maceración con mezclas de solventes en diferentes proporciones
(etanol y agua 2:1) mediante agitación magnética durante un periodo de 6H. La
concentración del 5-CQA se determinó y cuantificó usando un sistema HPLC-
PDA, conformado por una columna C18 de longitud 0,46 x 250 mm; y una fase
móvil en gradiente compuesta de acetonitrilo y ácido fosfórico al 1 %. El promedio
de concentración del 5-CQA en el grano fue del 1,7 %; en relación a su estado de
madurez del período estudiado, no presento variaciones en sus valores.
Palabras claves: Ácido clorogénico, concentración, extracción
ix
ABSTRACT
Chlorogenic acid is a phenolic compound present in green coffee beans.
Studies show that the consumption of this helps the loss of mass in overweight
individuals. The objective of this research is to demonstrate the concentration
levels of chlorogenic acid (5-CQA) in the robusta coffee grain grown in Ecuador,
depending on its maturity. Extractions were made by maceration with mixtures of
solvents in different proportions (ethanol and water 2: 1) by means of magnetic
stirring during a period of 6H. The concentration of 5-CQA was determined and
quantified using a HPLC-PDA system, consisting of a C18 column of length 0.46 x
250 mm; and a gradient mobile phase composed of acetonitrile and 1% phosphoric
acid. The average concentration of 5-CQA in the grain was 1.7%; In relation to its
maturity stage of the period studied, I do not present variations in its values.
Key Words: Chlorogenic acid, concentration, extraction.
1
INTRODUCCIÓN
El café es uno de los productos más apetecidos y demandados por los
consumidores a nivel mundial tanto por su sabor como por su calidad. El grano de
café es la semilla del género Coffea, familia Rubiáceas; cuya planta produce frutos
carnosos rojos o púrpuras llamados cerezas de café con dos núcleos que
contienen cada uno un grano o semilla de café de color verde (Gotteland, 2007).
Entre las diferentes especies que pertenecen a este género, se reconocen
principalmente dos, utilizadas para la preparación de bebidas de café, como lo son
la variedad arábica y robusta.
Ecuador, tradicionalmente, posee una importante capacidad como productor de
café consumibles, siendo uno de los pocos países que exporta los principales tipos
de café, como: arábica lavado, arábica natural y robusta (ProEcuador, 2013). En
el año 2016, de acuerdo con estadísticas de PROECUADOR y Ministerio de
Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca (MAGAP), el volumen de exportación
de la variedad Arábica fue del orden de 64.122,47 sacos de 60 Kg cada uno (entre
arábica lavado, y natural), y 20.247,45 de la variedad robusta, entre otras
variedades producidas a partir de las antes mencionadas.
En la composición de las semillas de café, se reportan más de 1000 sustancias
químicas distintas, incluyendo aminoácidos y otros compuestos nitrogenados,
polisacáridos, azúcares, triglicéridos, y demás ácidos, como los linoleico,
diterpenos y otras sustancias volátiles y no volátiles (algunas de las cuales
contribuyen al aroma del café), compuestos fenólicos, cafeína, vitaminas,
minerales. Existen variaciones importantes en la concentración de estos
componentes según la especie de café y el grado de tostado (Gotteland, 2007). El
café verde particularmente, contiene una gran cantidad de diferentes compuestos
fenólicos que son absorbidos y metabolizados en los seres humanos, y a los que
se les confiere mayor capacidad antiinflamatoria y antioxidante que a la vitamina
C (Gutiérrez, 2002).
2
Cabe destacar que, la Coffea arábica L. (v. arábica) contienen una mayor
cantidad de lípidos y de sacarosa que la Coffea canephora (v. robusta), mientras
que en la composición de robusta se destaca el mayor contenido de polisacáridos,
cafeína y ácidos clorogénicos (Puerta, 2011). Entre los compuestos fenólicos,
derivados del ácido cinámico, se encuentra una gran variedad de ácidos
clorogénicos, entre ellos el 5-CQA (ácido clorogénico) es el que presenta mayor
concentración. En el café se haya principalmente, como mono y di-ésteres, y
conforman varios grupos de isómeros con sustituciones en las posiciones 1, 3, 4
ó 5 del ácido quínico (Marín, 2008), siendo el más abundante el 5-O-cafeoilquínico.
En términos generales, varias importantes investigaciones sobre los ácidos
clorogénicos se han desarrollado para explicar su biodisponibilidad, su mecanismo
de absorción y metabolismo, así como los efectos en la salud de los consumidores
(Marín, 2008). Unas de las razones por la que ha adquirido importancia este
compuesto orgánico (asociado a la actividad antioxidante del café) por su acción
adelgazante; estos ácidos poseen una función reductora sobre los radicales libres,
reduciendo el estrés oxidativo y combatiendo los perjuicios del sobrepeso (Do
Nascimento, 2012). Otros trabajos hacen referencia a los efectos agudos del ácido
clorogénico y triglicéridos en café descafeinado en relación a la tolerancia a la
glucosa en procesos de diabetes (Van Dijk, 2009).
Por otra parte, si bien algunos trabajos (Marín, 2008; Puerta, 2011) reportan
niveles de compuestos fenólicos en variedades de café colombiano, lo cierto es
que, no se conoce la concentración de ácido clorogénico en café ecuatoriano
dependiendo de las variedades cultivadas en el territorio, del origen de la especie,
ni del grado de maduración del grano de café verde. Al respecto, la aplicación y
optimización de técnicas de extracción conforme a las características químicas de
los compuestos fenólicos, favorece la determinación del rendimiento de la
extracción de ácido clorogénico a partir del producto vegetal, y para su posterior
3
cuantificación mediante técnicas analíticas cromatográficas (HPLC-UV) (Craig,
2016).
La información obtenida a partir de investigaciones sobre la identificación del
ácido clorogénico resulta de interés y beneficio para el planteamiento de proyectos
estratégicos en los cuales se pretenda aprovechar industrialmente y disponer
adecuadamente los granos deteriorados y los residuos obtenidos en uno de los
productos más importantes para la alimentación y consumo, como es el café
ecuatoriano.
Este trabajo se enfoca, por tanto, en la evaluación del contenido de ácido
clorogénico en granos de café verde de la variedad robusta cultivados en la
provincia de los Ríos (mayor producción de la variedad), de acuerdo al grado de
maduración de los granos de esta especie.
PROBLEMA
De acuerdo con los puntos señalados en la introducción del trabajo de
titulación, se plantea el siguiente problema: ¿Cuál es la concentración de ácido
clorogénico en diferentes etapas de maduración de la especie de café robusta que
se cultiva en Ecuador?
OBJETIVOS
GENERAL:
• Evaluar los niveles de concentración de ácido clorogénico en granos de
café de la variedad robusta (Coffea robusta), cultivados en la zona costera de
Ecuador
4
ESPECÍFICOS:
• Optimizar un método analítico mediante la aplicación de técnicas
cromatográficas para la cuantificación del ácido clorogénico.
• Establecer las condiciones óptimas de extracción del ácido clorogénico a
partir de las muestras de café verde.
• Comparar las concentraciones de ácido clorogénico de acuerdo a los
diferentes estados de maduración del grano de la variedad estudiada.
HIPÓTESIS
La especie Coffea canephora y sus variedades de robusta son cultivadas
ampliamente en Ecuador para la venta y exportación del producto; el grano de
café verde posee un principio activo del grupo de los polifenoles denominado ácido
clorogénico (5-CQA). La concentración del ácido dependerá específicamente de
cada tipo de variedad, de su procedencia, tratamiento en el proceso de cosecha y
del estado de maduración de la especie; pueden ser cuantificados por métodos
de Cromatografía Líquida de alta eficacia o mejor conocido como sus siglas en
inglés (HPLC) y detectados por barrido de fotodiodos.
5
OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
La variables serán medidas o analizadas dependiendo del método a establecer,
partiendo desde lo más general a lo más específico.
A continuación, en la TABLA I se describe la operacionalización de las
variables.
TABLA I. Operacionalización de Variables
VARIABLES CONCEPTUALIZACIÓN INDICADORES
Dependiente
Concentración de
Ácido clorogénico
Compuesto fenólico con un
grupo funcional éster del ácido
cafeico y del ácido quínico,
llamado también 5-O-
cafeolquínico.
Cualitativo y
Cuantitativo
Independiente
Métodos de
extracción
Procesos que permiten la
separación de una sustancia
química proveniente de una
muestra como puede ser de una
planta.
Cuantitativo y
cualitativo
Interviniente
Tiempo de cultivo
El tiempo de cultivo del café
robusta es de aproximadamente
9 meses, finalizando con el fruto
maduro.
Cuantitativo y
cualitativo
Fase móvil
Es la fase la cual posee una
dirección de movimiento
específica y puede ser un líquido
o un gas para permitir la
separación del analito.
Cuantitativo y
cualitativo
FUENTE: autores, 2018.
6
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
ANTECEDENTES
El café, es uno de los productos de origen vegetal más importantes del
comercio internacional; en la actualidad se produce en distintas regiones, siendo
Ecuador uno de los países con mayor producción y exportación. El país exporta
café según la especie (arábigo o robusta) y según su procesamiento (lavado,
natural, soluble, liofilizado o tostado y molido) (Delgado, 2002).
Los granos del café verde en su estado natural son ricos en antioxidantes,
principalmente en ácidos clorogénicos, de la familia de los polifenoles. Estudios
han demostrado evidencia preliminar de que el consumo de ácido clorogénico
puede ayudar a la pérdida de peso, y la disminución de la masa en individuos con
sobrepeso.
En los últimos tiempos se han realizado diferentes evaluaciones del ácido
clorogénico, una de ellas es la presentada por los bioquímicos Solís y Herrera en
el año 2005. Ellos desarrollaron y validaron una técnica para la cuantificación del
ácido clorogénico empleando espectroscopia ultravioleta. (López y Gallegos,
2014).
Por otro lado, existen investigaciones que emplearon los dos principales tipos
de café: el robusta y el arábico, comprobando que el primero duplica la capacidad
antioxidante del segundo, por su mayor contenido en ácido clorogénico; y aunque
usualmente ambos se mezclan para producir café con diferentes sabores, la
capacidad antioxidante de estas combinaciones varía poco (Maydata, 2002).
López y Gallegos (2014) realizaron caracterizaciones ópticas que implican la
determinación de ácido clorogénico en granos de café verde, mediante la
7
optimización y aplicación de la técnica espectrofotometría UV/Vis, lo compararon
con análisis HPLC; demostrándose que ambas técnicas proporcionan resultados
excelentes.
Por otra parte, se han desarrollado ensayos clínicos en humanos, con la
finalidad de evaluar la eficacia del extracto del café verde en relación con el poder
reductor de peso corporal para personas que padecen de sobrepeso, arrojando
resultados aceptables en comparación a un efecto placebo (López y Gallegos,
2014).
I.1 Café verde
El café es uno de los productos más apetecidos por los consumidores, cuentan
alrededor de 70 especies a nivel global. La planta del café corresponde al género
Coffea de la familia Rubiaceae (TABLA II), Los granos de café arábica y robusta,
son los preferidos por los consumidores de acuerdo a su calidad y, se consideran
como uno de los mejores productos en mercados internacionales, solo por debajo
del petróleo.
TABLA II. Clasificación taxonómica del café
Reino Vegetal
Subreino Angiosperma
Clase Dicotiledónea
Orden Rubiales
Familia Rubiaceae
Género Coffea
8
Los granos del café verde son obtenidos a partir de las cerezas o baya, este
proceso implica la eliminación del epicardio, del mesocarpio, endocarpio, y
finalmente la piel plateada la cual recubre el endospermo del fruto del café
(Naranjo, 2011); tal como se aprecia en la Figura 1.
FIGURA 1. Grano del café verde
FUENTE: Chris Swift (2012)
En el café verde, antes de su proceso de torrefacción, están presentes un gran
número de sustancias bioquímicamente activas, donde estos poseen efectos
farmacológicos potencial e independiente (Mansini, 2014). Con el proceso del
tostado, algunos de ellos se degradan, y se obtiene el sabor característico y
sensorial del café
Hoy en día se conoce que este producto agroalimentario posee una serie de
bioactividades, como sus propiedades antioxidantes, anticarcinogénica y
antimutagénica. Los granos de café verde contienen antioxidantes como ácidos
9
fenólicos, polifenoles y alcaloides; especialmente los ácidos fenólicos elágico,
cafeico y clorogénico; el contenido de estos componentes varía entre especies y
lugar de origen y le dan al café la calidad de alimento funcional y nutracéutico
(Naranjo, 2011).
Muchos estudios han presentado evidencia preliminar de que el consumo de
ácido clorogénico puede ayudar a la pérdida de peso, y a la disminución de la
masa de grasa de los individuos. (Alfredo, 2002)
Se presume que la presencia de ácido clorogénico en el café verde podría
ayudar a saciar el apetito, esto se debe al aumento de la secreción intestinal de
neurotransmisores que envían al cerebro señales de saciedad, "lo que provoca
que nos sintamos llenos por más tiempo" (Naveed, 2017)
Se ha afirmado que "la reducción del riesgo de diabetes tipo 2 en la población
que toma café a diario durante 20 años frente a la que no, es casi del 50 por
ciento". Así, según Gotteland, el grano de café tiene altas concentraciones de
ácido clorogénico, y éste parece ser el responsable de los efectos positivos. "Es
un poderoso antioxidante, lo que ayuda a reducir los niveles de estrés oxidativo,
reduce la absorción de la glucosa, y aumenta los niveles de incretinas (Gotteland,
2007).
I.1.1 Cultivo de café
La calidad del café depende de numerosos factores: La especie vegetal que se
utilice (robusta o arábica), de la variedad de café sembrada, de los factores
genéticos, del árbol y el entorno en que crece. Adicionalmente, la forma como se
siembra y el adecuado manejo agronómico del cultivo, también influenciará la
calidad, según como lo referencia la Federación Nacional de Cafeteros de
Colombia.
10
Según el proceso del cultivo del café en general, se destacan tres etapas:
Siembra
La germinación de la semilla, luego de su siembra, se produce después de 45-
50 días, a los 15 días empiezan a salir las primeras hojas, estas reciben nombre
de chapolas, luego se trasplantan en bolsas negras al almacigo, que consiste en
una estructura que protege a los futuros árboles del sol y la lluvia. Entre 150-180
días, los árboles se trasladan al campo (Asoexport, 2013).
Primera floración
Entre los primeros 540-600 días se da la primera floración, y 240 a 270 días
más tarde se da el primer fruto maduro (Asoexport, 2013).
Recolección
De acuerdo o dependiendo de la topografía la recolección se hace
manualmente del terreno. Con el propósito de mejorar la calidad, los recolectores
solo recogen los granos maduros (Asoexport, 2013).
A continuación, se representa el proceso de cultivo del café con sus respectivos
días de germinación y cosecha, en el Esquema 1.
11
Esquema 1. Proceso de cultivo y cosecha del café.
I.1.2 Tipos de café del Ecuador
Ecuador exporta café según la especie (arábico o robusta) y según su
procesamiento (lavado, natural, soluble, liofilizado o tostado y molido). Las
principales variedades arábigas cultivadas en Ecuador son: Típica, Caturra,
Bourbón, Pacas, Catuaí, Catimor y Sarchimor. En el país se produce café verde,
tostado y soluble (PROECUADOR, 2013).
I.1.3 Producción de café en Ecuador
En Ecuador existe una superficie cultivada de aproximadamente 231.919
hectáreas (ha) de cafetales; de los cuales, 151.958 ha (66%) corresponden a café
arábigo y 79.969 ha a cafetales de la especie robusta (34%). Se estima que en la
240 a 270 días: frutos maduros
Trasladar al campo
540 a 600 días: primera floración
Transplantar al almacigo (fundas negras)
150 a 180 días
Germinación de fósforos (15 días)
Hojas chapolas
Siembra
45 a 50 días
12
región costa se siembra 112.000 ha, en la sierra 62.000 ha, en la región amazónica
55.000 ha y en Galápagos 1.000 ha de cafetales. Esta distribución se presenta
porque Ecuador es uno de los principales productores de café en el mundo. A lo
largo del tiempo, ha sido unos de los principales países con mayor productividad
de café, al cultivar las especies comerciales arábica (Coffea arábica) y robusta
(Coffea canephora). (Delgado, 2002)
En la Figura 2, se presenta un mapa que recoge las principales zonas
productoras de café arábico y en Ecuador, así como, la distribución de la superficie
cultivada de producción.
FUENTE: (ProEcuador, 2013).
FIGURA 2. Principales zonas cafetaleras del Ecuador
13
A continuación, se destacan las principales zonas de producción.
Arábigo Lavado: Loja, Zamora Chinchipe, Manabí, El Oro, Imbabura,
Carchi y Galápagos.
Arábigo Natural: Loja, Manabí, Zamora Chinchipe, El Oro, Imbabura,
Carchi y Galápagos.
Robusta: Sucumbíos, Orellana, Napo, Pichincha, Los Ríos y Guayas.
Industrializado (Soluble): Guayas y Manabí.
Ecuador cuenta con las condiciones óptimas y necesarias, con respecto al
clima y al suelo, que hacen posible la producción de dos de las variedades más
importante del café, como los son, arábica y robusta, lo que permite al país ser un
gran potencial exportador de café en grano verde.
Según el último estudio que se tiene del Consejo Cafetalero Nacional
(COFENAC) institución de derecho privada, se identifica la siguiente estadística
para el año 2015:
Superficie Total: 113.000 Hect.
Área Cosechada: 80.000 Hect.
Área de café Arábigo: 50.000 Hect.
Área de café Robusta: 30.000 Hect.
En el año 2015, Ecuador obtuvo alrededor de 250.000 sacos de 60 kilos, en la
cual el 62 % representaba al café arábico y el 38 % al café robusta, siendo 150.000
sacos para el consumo interno y 100.000 para exportación.
El sector se compone de tres subsectores o productos, donde el café soluble o
también conocido como café instantáneo registra una mayor participación
equivalente al 86,44 % de las exportaciones totales del sector, de acuerdo a datos
del 2015. Y, en menores proporciones el café verde y tostado con el 13,56 %
restante (PROECUADOR, 2015).
14
Sin embargo, el comportamiento de las exportaciones de café verde en los
últimos cinco años, presenta una baja tendencia a partir del 2011; cuyos números
se aprecian en la Figura 3 (PROECUADOR, 2015).
FUENTE: ProEcuador (2015)
I.2 Café robusta
Pertenece al reino Plantae, de la especie Canephora, como se lo detalla en la
TABLA III. Es un arbusto multicaule que puede medir entre 8 a 12 metros de
alturas, sus ramas son largas, de hojas grandes, las inflorescencias son axilares,
formadas por 1 a 3 verticilos, constituido cada uno por 15 a 30 flores blancas, cuya
corola posee de 5 a 7 pétalos, el fruto presenta una longitud de 8 a 16 mm de
longitud.
FIGURA 3. Evolución de las exportaciones a partir del 2011
0
20
40
60
80
100
120
140
2011 2012 2013 2014 2015 2015 2016
EVOLUCIÓN DE LAS EXPORTACIONES
MILLONES USD MILES TONELADAS
15
El café robusta, requiere un clima tropical con altas precipitaciones o en su
defecto riego. Tradicionalmente la región Amazónica ecuatoriana, especialmente
las provincias del Norte Amazónico han cultivado café robusta, y en períodos de
bonanza fue un cultivo que permitió dinamizar la economía. Por la caída de los
precios a inicios de la década, el cultivo se vio mermado y gran parte de estos
están abandonados. En Ecuador se produce las siguientes presentaciones de
café:
Café verde,
Café tostado, en grano y/o molido, pods de café
Café soluble o instantáneo (spray, aglomerado y liofilizado)
TABLA III. Clasificación científica
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Rubiales
Subfamilia Ixoroideae
Tribu Coffeacea
Especie C. canephora
FUENTE: INIAP, Ecuador
La especie robusta presenta algunas características fenotípicas y genotípicas
que la diferencian de la arábica. Las principales características de las especies
arábica y robusta, se presenta en la TABLA IV.
16
TABLA IV. Principales características de las especies arábiga y robusta
Características Arábica Robusta
Tipo de planta Arbusto Árbol
Copa Piramidal Irregular
Hojas Elípticas, oblongas y
veces lanceoladas.
Elípticas, oblongas
de ápice agudo
Inflorescencias 2 a 3 cimas por axila 3 a 5 cimas por axila
Frutos Drupas elipsoidales Drupas elipsoidales o
subglobosas
Fecundación Autógrama Alógrama
Compatibilidad Autocompatible Autoincomparable
Estructura genética Tetraploide Diploide
Número de
cromosomas 2n=44 2n=22
Contenido de
caféina (en % de
materia seca)
0.60 – 1.80 1.30 – 5.20
FUENTE: Charrier, (1985)
I.1.7 Componentes químicos del café verde
Por su composición química, el promedio de ácidos clorogénicos en el café
maduro arábica varía entre 5,24 % a 7,61%, y difiere de robusta, que varía entre
7,45 % a 10,59%, a diferencia del grano tostado arábico que contiene de 1,1 a
1,7%, mientras que la robusta contiene de 2 a 4,5%. El arábico es más dulce y
aromático y sensiblemente menos amargo y astringente, comparado con la
robusta, por lo que la bebida obtenida de esta es más fuerte y amarga. El café
proveniente de la especie arábica es considerado muy superior al obtenido de la
robusta (PROECUADOR, 2013).
17
El grano del café verde está compuesto por más de 1000 sustancias químicas
distintas incluyendo aminoácidos y otros compuestos nitrogenados, polisacáridos,
azúcares, triglicéridos, ácido linoleico, diterpenos (cafestol y kahweol), ácidos
volátiles (fórmico y acético) y no volátiles (láctico, tartárico, pirúvico, cítrico)
compuestos fenólicos (ácido clorogénico), cafeína, sustancias volátiles (sobre 800
identificadas de las cuales 60-80 contribuyen al aroma del café), vitaminas,
minerales (Gotteland, 2007).
Estos componentes se encuentran divididos de la siguiente manera:
1. Agua. Un grano de café verde tiene entre 10 y 13% de agua, que se
evapora durante el proceso de tostado, de manera que el grano en estas últimas
condiciones no tiene más de 5% de humedad.
2. Materias grasas. Un grano de café contiene de 15 a 20% de materia grasa.
3. Proteínas. Un grano de café verde encierra un promedio de 11% de
proteínas, parte de las cuales será destruida durante el tostado.
4. Alcaloides. El principal alcaloide del café es la cafeína. Los cafés arábigos
contienen de 1 a 1,5% de cafeína y los Robusta entre 1,6 a 2,7%. Esto explica que
el café Robusta sea más amargo que el arábigo.
5. Materias minerales. El grano de café contiene pequeñas cantidades de
potasio, calcio, magnesio y fósforo.
6. Ácidos clorogénicos. Los granos de café contienen diversos ácidos
orgánicos, principalmente clorogénicos. Los expertos destacan su papel asociado
con propiedades antioxidantes y antivirales, con absorción de iones metálicos y
con oxidación de lípidos.
Los granos de café almendra de las variedades de Coffea arabica L. contienen
una mayor cantidad de lípidos y de sacarosa que Coffea canephora (Robusta),
mientras que en la composición de robusta se destaca el mayor contenido de
polisacáridos, cafeína, ácidos clorogénicos y cenizas (Quintero, 2011). Esto se
observa claramente en la TABLA V.
18
FUENTE: Puerta, 2011
Otros constituyentes como las melanoidinas, derivan de las reacciones de
pardeamiento no enzimático o de la caramelización de carbohidratos que ocurren
durante el tostado. Existen variaciones importantes en la concentración de estos
componentes según la variedad de café y el grado de tostado (Gotteland, 2007).
Cabe indicar que, el café es la fuente más rica de ácidos fenólicos entre las
bebidas consumidas, en comparación con el jugo de naranja, el vino tinto, la
cerveza, el té negro. Una taza de 200 mL de café tostado y molido proporciona
entre 70 y 350 mg de ácido clorogénico (Alfredo, 2002).
Los ácidos clorogénicos del café derivan de la unión éster entre el ácido cafeico
y el ácido quínico. Se han identificado hasta 11 tipos de ácidos clorogénicos en el
TABLA V. Promedios de la composición química del grano de café almendra, según
la especie, porcentaje en base seca.
Componente químico Arábica (%) Robusta (%)
Polisacáridos 50,8 56,40
Sacarosa 8,00 4,00
Azúcares reductores 0,10 0,40
Proteínas 9,80 9,50
Aminoácidos 0,50 0,80
Cafeína 1,20 2,20
Trigonelina 1,00 0,70
Lípidos 16,20 10,00
Ácidos alifáticos 1,10 1,20
Ácidos clorogénicos 6,90 10,40
Minerales 4,20 4,40
Compuestos aromáticos Trazas Trazas
19
café robusta. Normalmente se denomina ácido clorogénico al que está presente
en mayor cantidad (5-cafeoilquínico). Tomando como ejemplo el café verde
cultivado en Nicaragua, tiene un contenido de 7 % en el café verde y se
descomponen parcialmente (30 a 70 %) durante el tostado, alcanzando niveles
cercanos a 4,0 % (López y Gallegos, 2014).
I.1.8 Compuestos fenólicos del café verde
Los compuestos fenólicos poseen al menos un anillo aromático con 1 o más
grupos hidroxilos; entre ellos, los fenilpropanoides presentan la estructura básica
de los fenoles más una cadena tricarbonada como grupo lateral (Alfredo, 2002).
Los más comunes son los ácidos fenílico, cumárico, cafeico y clorogénico, este
último un éster del ácido cafeico y el ácido quínico cuyas estructuras se presentan
en la Figura 5. Los compuestos fenólicos de las plantas tienen como propiedades
generales las de ser antioxidantes, ejercer efectos quelantes y modular la
actividad de varios sistemas enzimáticos, de modo que actúan mayoritariamente
en la dieta como elementos que promueven salud ante factores químicos y físicos
estresantes para el organismo. Varias de las bebidas consumidas habitualmente
son ricas en compuestos fenólicos; por ejemplo: el café contiene entre 200-500
mg por taza; el té, entre 150-200 mg por taza; y el vino tinto, entre 200-800 mg por
vaso (Gutiérrez, 2002).
20
Fuente: autores (2018)
En los últimos años, se ha presentado un interés en ciertos compuestos
polifenolicos, teniendo estos efectos masivos en la salud que incluyen
antioxidantes y fitoquímicos, Según las últimas investigaciones se dice que los
alimentos y bebidas que son ricos en polifenoles ayudan a prevenir varios tipos de
enfermedades, como el estrés oxidativo, incluida la enfermedad coronaria y
diferentes tipos de cáncer (Gotteland, 2007).
I.2 Familia: Ácidos clorogénicos
Está familia corresponde a muchos ácidos fenólicos hidroxicinámicos,
principalmente el ácido quínico de la quina y el café; el cinámico de la canela y el
FIGURA 4. Estructuras químicas de los ácidos: Cumárico (1), fenílico (2), clorogénico (3) y cafeico (4).
1) 2)
3) 4)
21
maní; el sinápico de la brócoli, la col y las hortalizas de hoja verde; los cumáricos
del maní, las zanahorias, los tomates y el ajo; el ferúlico de la avena, cereales,
manzana, remolacha y la naranja; el cafeico de arándanos, manzana, cidra,
orégano, verbena, tomillo, albahaca, cúrcuma, diente de león, aceitunas y café; el
clorogénico o cafeoilquínico (CQA) que es el más abundante en el café y que
también se encuentra en arándanos y manzanas; y los dicafeoílquínicos (di-CQA)
de la alcachofa, la achicoria y los girasoles (Quintero, 2011).
En los granos de café se han hallado más de 11 ácidos clorogénicos, en
especial ésteres del ácido quínico como CQA (cafeoil-quínicos), di-CQA y FQA.
No se han encontrado diferencias en su proporción según la fertilización, ni la
altitud en los granos de café arábica y robusta. Los granos inmaduros contienen
generalmente más di-CQA que los maduros, y los granos sanos mayor cantidad
de ácidos clorogénicos. Los CQA constituyen el 95% de los ácidos clorogénicos
del grano de café almendra arábica, el 5-CQA es el más abundante. El promedio
del contenido de ácidos clorogénicos del café maduro arábica de Colombia varía
entre 5,24% a 7,61 % y difiere de robusta, que varía entre 7,45 % y 10,59 %
(Quintero, 2011); véase en la Figura 6.
Los ácidos clorogénicos han sido divididos en subgrupos principales, como son
los ácidos cafeoil-quínicos (CQA), en las cuales existen tres isómeros diferentes
que son: 3-; 4-; y 5-CQA. Los ácidos feruloil-quínicos (FQA) poseen tres tipos de
isómeros identificados como 3-; 4- y 5-FQA. El grupo dicafeoil-quínicos (diCQA)
se subdividen por igual en tres isómeros, como es el 3,4-; 3,5- y 4,5-diCQA (Kim
y Hong, 2017).
Estudios posteriores han demostrado que el ácido clorogénico 5-cafeoil-quínico
(5-CQA), está presente en granos de café procesado y además en los extractos
de café verde; el 4-cafeoil-quínico (4-CQA) se demostró que es el principal
22
componente presente en los granos de café tostados en la especie Coffea arábica
(Kim y Hong, 2017).
FUENTE: Puerta, 2011
I.2.1 Ácido clorogénico
El ácido clorogénico, es el éster de ácido cafeico que se encuentra en altas
concentraciones en el grano del café verde. Normalmente se denomina ácido
clorogénico al que está presente en mayor cantidad y es el 5-CQA. Junto a él
también están presentes ácidos feruloilquínicos, ésteres del ácido cafeico y el
ácido ferúlico, siendo estos una importante fuente de fenoles presentes en el café
(Gotteland, 2007).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Borbón Caturra rojo Colombiaamarillo
Colombia rojo Típica Robusta
Áci
do
s cl
oro
gén
ico
s en
caf
é al
men
dra
, % e
n b
ase
seca
Pintón Verde Maduro Sobremaduro No seleccionado
FIGURA 5. Contenidos de ácidos clorogénicos totales en café, según la variedad y la
madurez.
23
El ácido clorogénico su fórmula química es C16 H18 O9, de peso molecular 354.3
g/mol. Se han atribuido al ácido clorogénico numerosas propiedades
farmacológicas, tales como antioxidantes, analgésicas, antipiréticas y actividad
quimio protectora (López y Gallegos, 2014).
I.2.1.1 Actividad antioxidante
Los ácidos clorogénicos son bien reconocidos como antioxidantes. La
capacidad antiradical hidroxilo (OH) del café verde y tostado depende del ácido 5-
cafeoilquínico. Se ha descrito el uso de mezclas de ácido cafeico con ácidos
clorogénicos como alternativa al uso de antioxidantes sintéticos. Igualmente se ha
demostrado que el café instantáneo puede actuar como prooxidante para el ácido
ascórbico y como atracción de radicales libres superóxidos. (Gotteland M, 2007).
FIGURA 6. Fórmula química del ácido clorogénico
24
El café es la primera bebida que se consume con mayor frecuencia en todo el
mundo. Según Sato, su estado varía de una simple bebida cultural antigua a un
componente nutritivo dotado de potencial farmacológico, como el antioxidante,
antitumoral (Rocha, Monteiro y Teodoro, 2012), antidiabético (Ong, Hsu, y Tan,
2012) y efectos antiinflamatorios (Lee, 2013).
El proceso de tostado reduce ligeramente la capacidad antioxidante del café si
se compara con la del café verde, debido a la pérdida de compuestos polifenólicos
y la formación de otros antioxidantes (López y Gallegos, 2014).
Se han realizado ensayos clínicos que han demostrado que los extractos de
café verde que contiene ácido clorogénico presentan efectos terapéuticos, estos
sirven como beneficio para combatir y prevenir la obesidad y la diabetes. Se han
atribuidos otros beneficios como la reducción de la enfermedad de Alzheimer,
diabetes tipo 2, enfermedad cardiovascular, efectos beneficiosos en cáncer de
colon, cáncer de cerebro, tumores de mama, cáncer de pulmón y leucemia
mielógena crónica (Gouthamchandram, 2017).
Los ácidos clorogénicos en alimentos y suplementos son ricos en la prevención
y el tratamiento del síndrome metabólico y trastornos asociados. En particular, los
taninos, lignanos y antocianinas también están presentes en la semilla, sin
embargo, en cantidades menores. Los polifenoles tienen funciones extensas como
antioxidantes, y comportarse como eliminadores de radicales libres (Tom, 2016)
Estos compuestos fenólicos pueden llegar a desempeñar funciones cruciales
en la regulación del metabolismo de glucosa y lípidos, ayudando a reducir los
efectos de la obesidad, efectos cardiovasculares y la diabetes. Al demostrar las
grandes propiedades de los ácidos clorogénicos, pueden llegar a ser usados como
25
un aditivo alimentario, para reemplazar así tipos de medicamentos como pueden
ser antibióticos sintéticos con la finalidad de reducir costos en la obtención de
diferentes formas farmacéuticas (Tom, 2016).
I.2.2 Técnicas de separación
I.2.2.1 Método de Soxhlet
La extracción es una de las operaciones básicas del laboratorio. Se define
como la acción de separar con un líquido una fracción específica de una muestra,
dejando el resto lo más íntegro posible. Se pueden realizar desde los tres estados
de la materia, y se llaman de la siguiente manera: Extracción sólido–líquido;
extracción líquida–líquido y extracción gas–líquido. El método Soxhlet es muy
empleado para la extracción de sustancias a partir de una planta, con reactivos
como etanol, hexano, éter y otros solventes orgánicos. Debido a la polaridad y
afinidad que presenta el ácido clorogénico con compuestos orgánico, este permite
una favorable extracción (Nuñez, 2008).
I.2.2.2 Método de Maceración
La maceración es un proceso que consiste en la separación sólido-líquido. El
producto o materia sólida posee una serie de compuestos solubles afines al líquido
extractante que son los que se pretende extraer. El método de maceración genera
dos productos que pueden ser usados dependiendo de sus necesidades, como
puede ser, el sólido ausente de esencias o el propio extracto. El origen de los
compuestos extraídos por maceración depende de la materia prima empleada, así
como la naturaleza del líquido de extracción (Fernaroli, 1975).
26
I.2.3 Obtención del ácido clorogénico
Se han realizado importantes investigaciones sobre los ácidos clorogénicos con
la finalidad explicar su biodisponibilidad, su mecanismo de absorción y
metabolismo, así como los efectos en la salud de los consumidores (Marín, 2008).
El ácido clorogénico, en los últimos tiempos ha sido evaluado por diferentes
investigadores, como los bioquímicos Solís y Herrera en Costa Rica en el año
2005. Ellos desarrollaron y validaron una técnica de análisis para la cuantificación
del ácido clorogénico, mediante el equipo de espectroscopía ultravioleta. Este
ácido se extrajo por solución acuosa siguiendo una metodología semejante a la
extracción de la cafeína. Los granos de café, molidos y expuestos a solventes de
extracción con características hidroalcohólicas (EtOH:Agua en un volumen de
70%), posterior a la misma, fueron homogenizado a 125 rpm durante un día,
tiempo necesario para favorecer la obtención del ácido clorogénico (Marín, 2008).
I.2.4 Detección del ácido clorogénico
Ciertos compuestos poseen varios enlaces conjugados que son los
responsables de las transiciones y de la absorción en la región ultravioleta, por lo
que son fáciles de ser analizados por métodos de espectrofotometría UV. En los
granos de café se han realizado ensayos de optimización que implican la
determinación del ácido clorogénico mediante la aplicación de esta técnica, debido
a la sensibilidad y rango lineal del detector. El 5-CQA está compuesto por una alta
cantidad de enlaces conjugados, esta característica es favorable con respecto a
su detección a una absorbancia de 324 nm, como se menciona en otras
referencias.
27
I.4 Cromatografía
La cromatografía es una técnica de separación y análisis de diferentes tipos de
muestras. Permiten la separación de las moléculas por medio de condiciones
aplicadas; la fase móvil es una sustancia inerte que sirve como vehículo de los
componentes de la muestra, que fluye dentro de una columna cromatográfica que
está compuesta por una fase estacionaria. La interacción de la muestra con la fase
móvil y estacionaria permite la retención de analitos y luego pasan al detector para
emitir una señal de respuesta. Pueden llevarse a cabo por mecanismos como son:
adsorción, partición e intercambio iónico. (Mayolo, 2012).
La cromatografía de adsorción esta empleada por una fase estacionaria
polar compuesta generalmente por silicagel y una fase móvil no polar como el
hexano.
En la cromatografía de partición, las moléculas son distribuidas entre dos
líquidos que se encuentran homogéneamente dispersos en un soporte solido
siendo la fase móvil y la fase estacionaria.
La cromatografía de intercambio iónico emplea rellenos por partículas de
polímeros o silicagel unidos grupos funcionales aniónicos y catiónicos como
ejemplo son los sulfónicos para intercambios de cationes y amonio cuaternario
para intercambio de aniones.
Dentro de la clasificación general de esta técnica, se reconocen dos grandes
sistemas, la denominada Cromatografía de Gases por sus siglas en inglés (GC),
y Cromatografía de Líquidos (LC). La cromatografía de gases es empleada para
la separación de mezclas que contienen compuestos volátiles orgánicos. Esta
técnica suele presentar dificultades si la sustancia a analizar no es volátiles, si
descomponen a altas temperaturas o poseen alto peso molecular; se estima que
el 20% de compuestos orgánicos conocidos pueden ser separados por GC. Por
otro lado, la cromatografía de líquidos es una técnica muy versátil ya que cubre
una amplia gama de aplicaciones, teniendo la virtud de separar una gran cantidad
28
de compuestos polares y con baja polaridad presentes en una muestra
(Quattrocchi, 1992).
I.4.1 Cromatografía líquida de alta presión (HPLC)
Esta técnica también denominada Cromatografía Líquida o también conocida
como HPLC, por sus siglas en inglés, permite la mencionada separación de
compuestos de una mezcla, fundamentados en la distribución de la molécula entre
la fase estacionaria que puede ser sólida o líquida, y la fase móvil que es líquida,
razón por la cual se debe su nombre.
Existen dos tipos de cromatografía líquida de acuerdo al modo de trabajo para
la retención de compuestos; fase normal y, de fase reversa o inversa. En los
sistemas de HPLC, la fase más utilizada es la reversa, que consiste en la
aplicación de una fase estacionaria de carácter apolar y una fase móvil polar. La
interacción de las moléculas sobre la fase estacionaria permite la retención de los
compuestos apolares, mientras que los compuestos polares eluyen en primer
lugar.
La fase estacionaria utilizada está compuesta de sílica, frecuentemente son de
octadecilsilano (C18) y octilsilano (C8), mientras que la fase móvil se compone de
una mezcla de disolventes que actúa de vehículo de la muestra que fluye por la
fase estacionaria, por lo general agua con metanol o con acetonitrilo. De acuerdo
al carácter ácido o básico de la molécula a analizar se ve favorecida la retención
y separación cromatográfica modificando el pH de la fase móvil.
El modo de operación del sistema permite la inyección de la muestra disuelta
en una solución de fase móvil; a través del sistema de bombas, la fase móvil es
introducida en el sistema acarreando a la muestra, la cual atraviesa la columna
que contiene a la fase estacionaria. La migración de los compuestos dependerá
29
de las interacciones no covalentes entre estos y la fase estacionaria. Los
compuestos separados son medidos a través de sistemas detección integrados al
sistema cromatográfico. La utilización de diferentes tipos de detectores permite y
depende de la medición de propiedades físicas de la molécula objeto de estudio
(Miranda, 2013).
I.4.1.1 Detectores de HPLC
Una de las partes principales del cromatógrafo es el detector, cuya función es
ver y distinguir la ubicación de cada uno de los componentes de la muestra en
tiempo y espacio al momento de salida de la columna cromatográfica. Las
principales características de un detector es tener un amplio rango dinámico de
respuesta, poseer una respuesta lineal, responder a todos los solutos y poseer
una sensibilidad apropiada para los diferentes análisis.
Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografía de líquidos ha
sido el perfeccionamiento de los detectores como son (Harris, 2001):
Detectores de absorbancia
Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros
Detectores de absorbancia en el infrarrojo
Detectores de fluorescencia
Detectores de índice de refracción
Detectores electroquímicos
30
I.4.3 Espectrofotometría UV-visible
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite
determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en la radiación
y absorción ultravioleta y visible, según corresponda, por parte de las moléculas
analizadas, y de acuerdo a la Ley de Beer esa cantidad de luz absorbida responde
en forma lineal a la concentración del analito de interés. En general, el detector
UV-visible opera en un rango de longitud de onda de 190 a 700 nm (Skoog, Holler,
y Crouch, 2008).
I.4.4 Detector de barrido de diodos (DAD o PDA)
El detector de barrido de diodos (DAD) o barrido de fotodiodos (PDA) permiten
la determinación de la concentración de moléculas orgánicas a partir de la
medición de luz absorbida por la misma, al igual que ocurre en los sistemas UV-
Vis. Sin embargo, las diferencias entre estos detectores radican en la capacidad
de trabajo que alcanza el PDA operando en un rango de longitudes de onda
comprendido entre 180 a 800 nm, y permitiendo un análisis con un mayor número
de puntos medidos al trabajar en rango de longitudes de onda en lugar de una
sola.
Este funcionamiento proporciona además una información adicional al generar
un espectro de absorción de luz característico para cada compuesto, de manera
que le confiere al análisis una mayor selectividad-
Los detectores de barrido de diodos son muy utilizados en las aplicaciones de
cromatografía gracias al amplio número de compuestos que puede detectar, con
resultados reproducibles, robustos, específicos y de adecuada sensibilidad
(Esparza, 2011).
31
A continuación, en la tabla VI se destaca las ventajas del PDA en relación con
otro detector.
TABLA VI. Ventajas y Desventajas de los detectores más usados en cromatografía
liquida.
UV, ultravioleta; PDA, Barrido de fotodiodos;
Detector Ventajas Desventajas
UV • El más utilizado
• Buena sensibilidad
• Selectivo
• Bajo costo
• Número de longitud de
onda limitada
PDA • Pureza de pico
• Selectividad
• Información 3d
• Mayor costo
32
CAPÍTULO II: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
II.1 MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
Determinación de
cenizas Tamizaje fitoquímico
-Agua tipo I
-Ácido clorhídrico
-Ácido sulfúrico
-Ácido fórmico
-Reactivo de Sudan
-Reactivo de Dragendortf
-Reactivo de Mayer
-Reactivo de Wagnere
-Reactivo de Borntrager
-Reactivo de Liberman-Burchard
-Ácido sulfúrico conc.
-Reactivo Fehling A y B
-Reactivo Cloruro Férrico
-Reactivo de Baljet
-Ácido clorhídrico conc.
-Alcohol amílico
-Cloroformo
- Hidróxido de sodioAnhídrido
acético
Análisis cromatográfico
-Solución estándar de ácido clorogénico (Sigma
Aldrich) pureza ≥ 95 %
-Acetonitrilo grado HPLC (MERCK)
-Etanol grado reactivo (J.T. BAKER)
-Ácido fosfórico grado HPLC (MERCK)
-Agua tipo I
-Éter etílico ( FISHER CHEMICAL)
-Trifluoroacético ( MERCK)
-Metanol grado HPLC (J.T. BAKER)
33
Materiales
Determinación de humedad y cenizas Tamizaje fitoquímico
Espátula
Crisoles
Pinzas metálicas
Papel filtro libre de cenizas
Campana de desecación
Pipetas (10 mL)
Hornilla
Embudo
Beakers (100, 250 mL)
Gradillas
Tubos de ensayos
Pipetas (5, 10 mL)
Espátulas
Hornilla
Crisoles
Análisis cromatográfico
Beakers de 250 mL
Papel filtro
Filtros específicos 0,45 µm
Viales de 1 mL de alta recuperación
Columna HPLC C18 (Waters) 4,6 x 150 mm
Atlanta
Columna HPLC C18 (Waters) 4,6 x 250 mm Sun
fire
Pipetas graduadas (5,10 mL)
Pipetas automáticas (1-100; 100-1000)
Matraces volumétricos (10, 25, 100, 1000
mL)
Jeringas
Espátulas
Agitador
Barra magnéticas
Fiolas ( 100, 250 mL)
II.2 EQUIPOS Y/O APARATOS
Equipos
Balanza analítica (Acculab)
Cromatografo HPLC Waters con Detector de barrido de diodos Waters
Cromatografo HPLC Merck Hitachi con Detector UV-Vis Hitachi
34
Aparatos
Mufla Thermolyne
Vortex Boeco
Centrifuga Thermo
Ultrasonido (Branson)
Sorbona (Fex)
Agitador magnético LABNET
Estufa (HACEB)
Hornilla eléctrica
II.3 MUESTRAS
Se seleccionaron granos de café verde de la variedad Coffea robusta, cultivada
en el cantón Quevedo, Provincia de Los Ríos. Fueron recolectados, tomando en
cuenta el tiempo del cultivo y de la germinación del fruto. Los granos fueron
cedidos en el mes de Agosto del 2017, por el Instituto Nacional de Investigaciones
AgroPecuarias (INIAP) de la Estación Experimental Tropical Pichilingue ubicados
km 5 vía Quevedo.
II.4 MÉTODOS
II.4.1 Parámetros físico-químicos.
II.4.1.1 Características de longitud y peso
Se determinó las dimensiones de los granos de café verde, midiendo con un
vernier su longitud y anchura máxima, posteriormente son pesadas en una
balanza analítica (Acculab).
35
II.4.2 Determinación de humedad.
II.4.2.1 Método gravimétrico
De la muestra se pesaron aproximadamente 3 g en una cápsula de porcelana
previamente llevada a peso constante, fue secada a 105º C con la ayuda de una
estufa durante 3 horas. Cumplido el tiempo la cápsula se dejó enfriar a
temperatura ambiente y se pesó. Luego se calentó durante 1 hora adicional y se
procedió a pesar nuevamente. Éste procedimiento se repitió hasta obtener un
peso constante. El ensayo se realizó por triplicado. Los valores obtenidos fueron
evaluados en la siguiente ecuación (1):
𝐻𝑔 =𝑀2 − 𝑀1
𝑀2 − 𝑀× 100
Dónde:
Hg: Perdida en peso por desecación (%)
M2: masa del envase con la muestra de ensayos (g)
M1: masa del envase con la muestra de ensayo desecado (g)
M: masa del envase vacía (g)
II.4.3 Determinación de cenizas
II.4.3.1 Cenizas totales
De los granos de café, se pesó 2 g de muestra en un crisol de porcelana
previamente pesado y llevado a peso constante. Se procedió a incinerar en una
mufla a una temperatura entre 550 a 600° C durante 3 a 4 horas aproximadamente
hasta la obtención de un residuo de color blanco o grisáceo. Se depositó el crisol
con muestra en un desecador, para que se enfríe a temperatura ambiente,
posteriormente se pesa el crisol con cenizas (Miranda y Cuellar 2000). Este
Ec. (1)
36
ensayo se realizó por triplicado. Los valores obtenidos fueron evaluados en la
siguiente ecuación (2):
% 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 = 𝑁 ∗100
𝑃
Dónde:
N = gramos de cenizas de la muestra
P = gramos de la muestra
II.4.3.2 Cenizas insolubles en agua
Las cenizas insolubles en agua se determinaron a partir de las cenizas totales;
se disolvió la misma con agua destilada calentada por 5 minutos, luego se filtró
con papel filtro libre de cenizas y se enjuagó la cápsula y el filtro con agua caliente.
Después, se colocó el filtro en la cápsula para su incineración. Se realizan por
triplicado. (Jiménez, 2016) Este ensayo se realizó por triplicado. Los valores
obtenidos fueron evaluados en la siguiente ecuación (3):
Ca=M2-Ma
M1-Mx100=
Dónde:
Ca: cenizas solubles en agua en base hidratada (%)
M2: peso del crisol con las cenizas totales (g)
Ma: peso del crisol con las cenizas insolubles en agua (g)
M1: peso del crisol con la muestra de ensayo (g)
M: peso del crisol vacío (g)
100: factor matemático para el cálculo
Ec. (2)
Ec. (3)
37
II.4.3.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico
Las sustancias minerales insolubles en ácido clorhídrico se determinaron
usando igualmente el método gravimétrico para las cenizas totales y se disolvió
en 10 ml de HCl 1%. Se calentó en baño hirviente por 5 minutos. Se filtró a través
de papel filtro libre de cenizas. Se procedió a colocar el filtro en la cápsula para su
incineración (F. et al., 2007). Este ensayo se realizó por triplicado. Los valores
obtenidos fueron evaluados en la siguiente ecuación (4):
% de cenizas insoluble en ácido = N x 100
P
Dónde:
N= gramos de cenizas Insolubles de la muestra
P= gramos de la muestra
II.4 Ensayos del tamizaje fitoquímico
II.4.1 Preparación de muestras
Se realizó las respectivas maceraciones en diferentes solventes: éter etílico,
etanol y agua tipo 1. Se pesaron aproximadamente 20 g de la muestra en una fiola
de 250 mL, se procedió agregar el solvente para iniciar la maceración por 24
horas. Se realizó maceraciones múltiples por cada solvente.
Cabe mencionar, que se trabajó como muestras: cáscara, semilla y grano
completo del café, esto se realizó con el fin de conocer las características químicas
de parte del café.
Estos ensayos fitoquímico se realizó siguiendo la técnica propuesta por
Miranda y Cuellar.
Ec. (4)
38
II.4.2 Ensayos de reacciones fitoquímica
II.4.2.1 Ensayo de Sudan
Se tomó una alícuota de la fracción del solvente de extracción de las
muestras, se le añadió un 1mL de una solución diluida en agua del colorante
Sudan III o Sudan IV.
Se procedió a calentar en baño de agua hasta evaporación del solvente.
La presencia de compuesto grasos se considera positiva, si aparecen
gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del
tubo de ensayo respectivo.
II.4.2.2 Ensayo de Dragendortf
Se tomó una alícuota del extracto disuelto en un solvente orgánico, se
evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 mL de ácido clorhídrico
al 1%.
Si el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido
clorhídrico concentrado, (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez).
Con la solución acuosa acida se realizó el ensayo, añadiendo 3 gotas del
reactivo de Dragendortf.
II.4.2.3 Ensayo de Mayer
Se realizó el mismo proceso citado anteriormente, hasta obtener la
solución ácida.
Se añadió una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agitó y filtró.
Luego se añadió 2 o 3 gotas de la solución reactiva de Mayer.
II.4.2.4 Ensayo de Wagner
Se realizó al igual que en los casos anteriores de la solución acida,
añadiendo 2 o 3 gotas del reactivo de Wagner.
39
II.4.2.5 Ensayo de Baljet
Para este ensayo, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol,
debe evaporarse el solvente en baño de agua y re disolverse en la menor cantidad
de alcohol (1 mL).
En estas condiciones se adiciona 1mL del reactivo Baljet.
II.4.2.6 Ensayo de Borntrager
En este ensayo, si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo,
deberá evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo re disolverse en 1 mL
de cloroformo.
Se adicionó 1 mL de hidróxido de sodio al 5% en agua. Se agitó mezclando
las fases y se dejó en reposo hasta su separación.
II.4.2.7 Ensayo de Lieberman-Burchard
Si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse
el solvente en baño de agua y el residuo re disolverse en 1mL de cloroformo.
Se adicionó 1 mL de anhídrido acético y se mezcló bien, por la pared del
tubo de ensayos se dejó resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin
agitación.
II.4.2.8 Ensayo de Fehling
Si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, deberá evaporarse el
solvente en baño de agua y el residuo re disolverse en 1-2 mL de agua.
Luego se procedió adicionar 2 mL del reactivo y se calientó en baño de
agua 5-10 minutos la mezcla.
40
II.4.2.9 Ensayo de espuma
Si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen
en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.
II.4.2.10 Ensayo de cloruro férrico
Si el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determina tanto
fenoles como taninos.
A una alícuota del extracto alcohólico se le agregó 3 gotas de una solución
de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9 %
en agua), si el extracto es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente
taninos.
II.4.2.11 Ensayo de Shinoda
Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1mL de
ácido clorhídrico concentrado y un tira pequeña de cinta de magnesio metálico.
Después de la reacción se esperó 5 minutos, se añadió 1 mL de alcohol
amílico se mezclaron las fases y se dejó reposar hasta que se separen.
II.5 Análisis cromatográfico del ácido clorogénico
II.5.1 Solución stock de ácido clorogénico (5-CQA)
La solución stock de 5-CQA se preparó a partir del estándar certificado, para lo
cual se pesó aproximadamente 25 mg del compuesto, fue traspasado a un matraz
volumétrico de 25 mL, se disolvió y llevó enrace con metanol, obteniéndose así
una concentración exacta de la solución de 1005,84 ppm.
41
FUENTE: autores, 2018
II.5.2 Soluciones de trabajo
A partir de la solución stock, se realizaron diferentes diluciones para la
preparación de la curva de calibración del ácido clorogénico. Las concentraciones
ensayadas fueron de 1, 5, 10, 25, 50 y 100 ppm. En TABLA VII se indican los
volúmenes de las alícuotas tomadas para la preparación de las distintas
soluciones de trabajo, todas ellas fueron llevadas a un volumen final de 10 mL en
matraz volumétrico.
II.6 Selección de condiciones cromatográficas
Las condiciones cromatográficas empleadas para el análisis cromatográfico
consistieron en la aplicación de un sistema HPLC en fase reversa, con una
columna C18 de 4,6 mm de diámetro interno y 250 mm de longitud, con tamaño
de partículas de 5 um (marca Waters) para la separación del ácido clorogénico (5-
CQA). La fase móvil estuvo conformada por ácido fosfórico al 1 % en agua (Fase
A) y acetonitrilo grado HPLC (Fase B). La elución se realizó en modo gradiente,
Concentración
(ppm)
Volumen
(µL)
1 9,94
5 49,7
10 99,4
25 248,5
50 497,1
100 994,2
TABLA VII. Soluciones de trabajo, curva de calibración
42
tal como se muestra en la TABLA VIII, con un flujo de 2,0 mL/min. La detección
se efectuó mediante PDA en un rango de longitud de onda de 210 a 350 nm. El
volumen de inyección de la muestra fue de 25 µL y la temperatura del horno de la
columna fue de 25°C.
TABLA VIII. Elución de las fases A y B en modo gradientes
Tiempo
(min) A B
0 90 10
20 80 20
25 70 30
32 60 40
35 90 10
38 90 10
II.6.1 Optimización del método para extracción del ácido clorogénico
Para la optimización de las condiciones de extracción del ácido clorogénico, se
ensayaron diferentes variables en dos etapas, conforme a la planificación recogida
en los ensayos de optimización
II.6.1.1 Primera etapa
El primer ensayo de optimización consistió en la maceración por 24 horas de
los granos de café robusta mediante agitación magnética, para lo cual se pesó 15
g de la muestra en una fiola de 250 mL. Posteriormente se agregó un volumen de
100 mL de las diferentes mezclas de solventes de etanol y agua, como se
43
menciona en la TABLA IX. Los extractos obtenidos fueron filtrados mediante
membranas de PVDF (Polyvinylidene fluoride, por sus siglas en inglés) con
tamaño de poro 0,22 µm. y fueron diluidos 50 veces, tomando 20 uL de extracto
con 980 uL de agua HPLC. Los extractos fueron recogidos en viales de alta
recuperación (capacidad de 1,5 mL) previo a su lectura en el sistema de HPLC-
PDA, para la cuantificación del ácido clorogénico. Los ensayos se realizaron en
número de réplicas de 4.
TABLA IX. Ensayos de optimización de la primera etapa
Muestra Grano verde Grano verde Grano verde Grano verde
Solventes H2O:EtOH (1:1) H2O:EtOH (1:2) H2O:EtOH (2:1) H2O
Tiempo 24 h 24 h 24 h 24 h
Maceración Agitación
Magnética
Agitación
Magnética
Agitación
Magnética
Agitación
Magnética
Réplicas n=4 n=4 n=4 n=4
FUENTE: autores, 2018
II.6.1.2 Segunda etapa
De acuerdo con los resultados obtenidos en la primera etapa se procedió a
seleccionar las condiciones que presentaron mejores valores de repetibilidad con
respecto a la concentración del analito.
En esta etapa los ensayos se realizaron pesando 15 g de muestra en una fiola
de 250 mL, agregando un volumen de 100 mL de la mezcla de solventes (agua y
etanol). Las muestras fueron sometidas a diferentes tiempos de maceración
44
aplicando agitación magnética de 6 y 12 horas respectivamente. Los extractos
obtenidos, previo al análisis cromatográfico (HPLC-PDA), fueron filtrados en
membranas de PVDF de 0.22 µm. y fueron diluidos 50 veces, tomando 20 uL de
extracto con 980 uL de agua HPLC. Estos ensayos se llevaron a cabo por
triplicado.
Adicionalmente se ensayó la evaluación de la maceración de la muestra
mediante sonicación por una hora, utilizando las mismas condiciones de peso de
muestra y volumen de mezcla de solventes, antes indicados. Los ensayos se
realizaron con un número de réplicas de 3.
II.6.1.4 Análisis de muestras reales
De acuerdo los mejores resultados de precisión obtenidos, se realizó el análisis
de muestras de granos verdes de café robusta con diferentes periodos de
maduración comprendidos entre la semana 0 y 6; considerando como 0 la fecha
de cosecha. De esta manera el método de análisis consistió como se detalla a
continuación:
15 g de muestra fueron pesados en una fiola de 250 mL, se agregó un volumen
de 100 mL de la mezcla de solventes etanol y agua en la proporción de 2:1,
respectivamente. La muestra fue llevada a maceración mediante agitación
magnética por 6 horas. Los extractos obtenidos se filtraron a través de membranas
de PVDF de 0,22 µm, y fueron diluidos 50 veces, tomando 20 uL de extracto con
980 uL de agua HPLC. Finalmente, fueron recogidos en viales de alta
recuperación e inyectados en el sistema HPLC-PDA para la identificación y
cuantificación del ácido clorogénico. Las muestras fueron analizadas por
duplicado.
45
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIONES
III.1 Parámetros físicos-químicos
III.1.1 Características físicas
De acuerdo con las mediciones de largo y ancho máximo, así como peso de
los granos de café verde tomados de la muestra, se obtuvieron los valores
promedio recogidos en la TABLA X, con un porcentaje del coeficiente de variación
12,0 % satisfactorio. Los datos de cada una de las muestras se incluyen en el
anexo número A
La evaluación realizada en el grano de café verde de la variedad robusta,
determinó un promedio de altura de 1,50 cm, de ancho 1,03 cm y un peso de 1.05
g. Según los datos obtenidos de estas mediciones y peso, se demuestra que los
granos de café verde proporcionan características físicas satisfactorias en relación
a un producto de calidad. Según datos estadísticos proporcionados por INIAP
(2012) sobre granos de café, detallan un tamaño promedio entre 0,8 a 1,6 cm de
longitud, cuyos datos son semejantes a las características físicas demostradas en
el ensayo.
TABLA X. Promedio y coeficiente de variación (CV) de los parámetros físicos de los
granos de café verde analizados.
Altura Ancho Peso
Promedio 1,50 cm 1,03 cm 1. 05 g
CV 7,61 % 4,90 % 12,01 %
46
III.2 Determinación del porcentaje humedad
Una de las características químicas principales es el porcentaje de humedad
presente en productos alimenticios. En la TABLA XI se detalla el porcentaje de
humedad obtenidos en los granos de café verde estudiados.
TABLA XI. Porcentaje de humedad en granos de café verde
De acuerdo con los resultados, se determinó un promedio de humedad del
67,20 % y un coeficiente de variación de 5,20 % satisfactorio. Referencias
bibliográficas resaltan que los niveles de humedad no deben ser mayor al 12 %
en granos secos, pero en granos verdes del café se determina un alto porcentaje
de humedad. Según información de Oliveros (2010), los granos de café verde
enteros, presentan un porcentaje de humedad del 53 %, asemejándose al valor
obtenido en nuestro ensayo.
III.3 Determinación de cenizas totales
La determinación de cenizas permite establecer el porcentaje de sustancias
inorgánicas presentes al calcinar una muestra orgánica. A continuación, en las
Tablas XII, XIII Y IX, se presentan los ensayos realizados en las diferentes partes
del grano de café verde (semillas, cascara y grano entero).
Muestra Porcentaje de humedad Promedio DS CV
1 70,72
67,20 %
2 63,73 3,49 5,20 %
3 67,16
47
TABLA XII. Porcentaje de cenizas totales presentes en las semillas del café verde
Se determinó el porcentaje de cenizas totales presente en la semilla del grano
de café analizado, obteniendo un promedio de 3,51 % y coeficiente de variación
de 0,01 %. El porcentaje de cenizas insolubles en agua fue de 1,73 % y coeficiente
de variación de 21,76 %. El porcentaje de cenizas insolubles en ácido que se
obtuvo fue de 3,29 % y 12,67 % como coeficiente de variación.
Muestra Porcentaje de cenizas
totales Promedio CV
1 3,55
3,51 %
2 3,47 1,19 %
3 3,53
Porcentaje de cenizas insolubles en agua
1 1,92
1,73 % 21,76 % 2 1,30
3 1,98
Porcentaje de cenizas insolubles en
ácido
1 2,81
3,29 % 12,67 % 2 3,57
3 3,49
48
TABLA XIII. Porcentaje de cenizas totales presentes en cáscara del café verde
En este ensayo se determinó el porcentaje de cenizas totales en una de las
partes del grano de café, siendo la cáscara la muestra a ensayar, se demostró un
promedio de 3,92 % y coeficiente de variación de 3,62 %. El porcentaje de cenizas
insolubles en agua fue de 1,45 % y coeficiente de variación de 15,86 %. El
porcentaje de cenizas insolubles en ácido que se obtuvo fue de 3,64 % y el
coeficiente de variación de 5,49 %.
Muestra Porcentaje de cenizas
totales Promedio CV
1 3,76
3,92 %
2 3,99 3,62 %
3 4,02
Porcentaje de cenizas insolubles en agua
1 1,23
1,45 % 15,86 % 2 1,43
3 1,69
Porcentaje de cenizas insolubles en ácido
1 3,56
3,64 % 5,49 % 2 3,49
3 3,87
49
TABLA XIV. Porcentaje de cenizas totales presentes en granos completos de café
verde
La determinación de cenizas totales presentes en los granos enteros del café
verde demostró los siguientes valores: promedio del 3,29 % y coeficiente de
variación de 12,17 %. El porcentaje de cenizas insolubles en agua fue de 1,72 %
y coeficiente de variación de 4,94 %. El porcentaje de cenizas insolubles en ácido
que se obtuvo fue de 4,19 % y coeficiente de variación de 6,68 %.
El ensayo de cenizas totales, insolubles en agua e insolubles en acido, se
realizaron en tres partes del grano de café, siendo la cascara, semilla y fruto entero
Muestra Porcentaje de cenizas
totales Promedio CV
1 2,81
3,29 %
2 3,57 12,67 %
3 3,49
Porcentaje de cenizas insolubles en agua
1 1,72
1,72 % 4,94 % 2 1,63
3 1,80
Porcentaje de cenizas insolubles en ácido
1 3,91
4,19 % 6,68 % 2 4,19
3 4,47
50
para determinar en cuales de estos presentan mayores cantidades de substancias
orgánicas e inorgánicas. Presentando mayor porcentaje de cenizas totales en la
cascara del café verde. En las semillas, se determinaron un mayor porcentaje de
cenizas insolubles en agua y el grano completo presento un mayor porcentaje de
cenizas insolubles en ácido.
Bressanni (1979), resalta un porcentaje de cenizas totales en el café verde
(pulpa fresca) de 1,5 %. La norma INEN (2015) tiene como requisito máximo un
5,0 % de cenizas totales en los granos de café tostado.
III.4 Tamizaje fitoquímico del café verde.
El tamizaje fitoquímico se basa en estudios químicos que permiten la
identificación de metabolitos primarios y secundarios presentes en las plantas,
como son: alcaloides, lactonas, antraquinonas, colesterol, triterpenos, azucares,
saponinas, fenoles, taninos, ácidos grasos y flavonoides los cuales demuestran
propiedades tales como antioxidantes, antiinflamatorios e incluso funciones de
vaso dilatación. Con la finalidad de identificar este tipo metabolitos en las muestras
de café verde se realizaron los ensayos obteniendo los resultados que se
presentan en la TABLA XV para la cáscara y TABLA XVI para la semilla.
Según los resultados obtenidos TABLA XV para los extractos etéreo,
alcohólico y agua, tanto en el caso de la cáscara como de la semilla los análisis
indican la presencia principalmente de metabolitos primarios como azúcares y
ácidos grasos, y de metabolitos secundarios como alcaloides, quinonas,
triterpenos, flavonoides y fenoles.
51
TABLA XV. Resultados del tamizaje en cáscara de granos de café verde
Nomenclatura de resultados: Muy abundante (++++); Abundante (+++); Moderada (++); Leve
(+); Ausencia (-); No aplica (N/A)
EXTRACTOS
REACCIONES ETER ALCOHOL AGUA
Dragendroff +++ +++ +++
ALCALOIDES Mayer + + -
Wagner + - -
Baljet ++ N/A N/A LACTONAS
Borntrager N/A ++ N/A PARAQUINONAS Y
ANTRAQUINONAS
Lieberman-
burchard
Verde
oscuro - N/A
COLESTEROL Y
TRITERPENOS
Fehling N/A ++ ++++ AZUCARES
Espumas N/A N/A + SAPONINAS
Cloruro ferrico N/A +++ ++++ FENOLES Y TANINOS
Sudan +++ + N/A ACIDOS GRASOS
Shinoda N/A - ++ FLAVONOIDES
52
TABLA XVI. Resultados del tamizaje en semilla de granos de café verde
Reportes sobre la composición química del grano de café, indican la presencia
de taninos, fenoles totales, proteína, alcaloides, azúcares, entre otros (Orozco,
2008) (Farah, 2012).
Como se detalla en la TABLA XVI, los ensayos para alcaloides en ambas
muestras, fueron positivos en una cantidad abundante, ya que se cuenta con el
principal alcaloide presente en el café que es la cafeína. Con respecto al ensayo
EXTRACTOS
REACCIONES ETER ALCOHOL AGUA
Dragendroff +++ +++ +++
ALCALOIDES Mayer + - +++
Wagner + + ++
Baljet ++ N/A N/A LACTONAS
Borntrager N/A + N/A PARAQUINONAS Y
ANTRAQUINONAS
Lieberman-
burchard
Verde
oscuro - N/A
COLESTEROL Y
TRITERPENOS
Fehling N/A + +++ AZUCARES
Espumas N/A + + SAPONINAS
Cloruro ferrico N/A +++ ++++ FENOLES Y TANINOS
Sudan +++ + N/A ACIDOS GRASOS
Shinoda N/A + + FLAVONOIDES
53
de Borntrager se observó la presencia de paraquinonas y antraquinonas en una
forma moderada en la cáscara y leve en la semilla.
El ensayo de Lieberman Burchard demostró una coloración verde oscuro para
ambas muestras, lo que determina la presencia de colesterol. Para determinar
azucares mediante el reactivo de Fehling mostró un resultado muy abundante de
las mismas, tanto en la cascara como en las semillas del café verde.
La presencia de saponinas en ambas muestras es leve, ya que no se evidenció
una gran cantidad de espuma formada en la muestra al ser agitada. En la prueba
de cloruro férrico para determinar la presencia de fenoles y taninos, dio un
resultado muy abundante para ambos casos, lo que demuestra un alto contenido
de fenoles y taninos en la muestra de café verde.
La determinación de ácidos grasos como triglicéridos, se obtuvo un valor
abundante para las muestras tratadas en el ensayo, siendo así, un fruto con
cantidades altas en ácidos grasos. La presencia de flavonoides puede ser
demostrada utilizando el reactivo de Shinoda, en la cáscara se observó una
cantidad moderada y leve en la semilla, determinando que los flavonoides no se
encuentran en grandes cantidades en los granos de café verde
III.5. Análisis cromatográfico del ácido clorogénico
Para la determinación de la concentración del 5-CQA, se realizaron ensayos
preliminares en el sistema HPLC-PDA, variando las proporciones de las mezclas
de solventes (EtOH:Agua) y se tomó en cuenta el grado de madurez de la muestra
de café robusta. Adicionalmente se plantearon las diferentes condiciones para la
preparación de estándares.
54
III.5.1 Selección de condiciones cromatográficas
Inicialmente los ensayos cromatográficos se realizaron en un sistema de HPLC
con detección UV, a 326 nm, inyectando tanto solución estándar del ácido
clorogénico (5-CQA), así como extracto de muestra.
Estos ensayos se realizaron con un volumen de inyección de 5 µl. Se utilizó
una columna HPLC C18 (Atlantis, Waters) 4,6 x 150 mm. La fase móvil fue
Trifluoroacético 0,1 % en agua (Fase A) y acetonitrilo (Fase B). Se aplicó el método
por gradiente de la siguiente manera: las fases A/B, 95/5, 80/20, 80/00, 95/5, 5/95,
5/95, 95/5 en un tiempo de 0,10, 12, 15, 15.1, 16.5, 16.6. El flujo de 1,5/min, la
temperatura del horno de la columna fue de 30°C. Se tomó como muestra la
extracción realizada a partir de la mezcla de solventes EtOH:Agua (2:1).
En la FIGURA 7 se puede observar a) un cromatograma correspondiente al
estándar de ácido clorogénico, y b) un extracto de muestra. En ambos casos se
aprecia una asimetría del pico del compuesto, por lo cual se debe modificar el
gradiente de fase móvil en ensayos subsiguientes. Adicionalmente, cabe destacar,
que debido a la detección de otros picos correspondientes a isómeros de ácidos
clorogénicos, es preciso el mejoramiento de la separación cromatográfica en los
extractos de muestra.
55
A)
B) Coelución de 5-CQA y 4-CQA
FIGURA 7. Cromatograma obtenido mediante HPLC-UV en: a) una solución estándar de 5-CQA, y b) en un extracto hidroalcohólico de la muestra
56
De acuerdo con la literatura científica (Craig, 2016) se conoce que el 5-CQA
corresponde al isómero mayoritario, habitualmente presente en muestras de café;
sin embargo, en menor proporción se encuentran los isómeros 3-CQA, 4-CQA, 5-
FQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA.
En esta investigación, a pesar de no disponer de los estándares certificados de
los demás isómeros de ácido clorogénico, se consiguió justificar el orden de
elución de los compuestos en base a la bibliografía referenciada. Así, se observó
la coelución de los isómeros 5-CQA y 4-CQA, como se muestra en el
cromatograma de la Figura 7.
En la Figura 8, se observa una mejor resolución de los ácidos clorogénicos 5-
CQA y 4-CQA, con una adecuada forma de pico, después de modificar la fase
acuosa con ácido fosfórico al 1%, en lugar de ácido trifluoroacético al 0,1%. Así
5-CQA
4-CQA
FIGURA 8. Cromatograma HPLC-UV de un extracto hidroalcohólico de la muestra inyectado en una columna C18 de 250 mm, con separación de los picos 5-CQA y 4-CQA.
57
también se utilizó una columna de mayor longitud (250 mm, SunFire, Waters), en
lugar de la columna de 150 mm, compuesta por igual fase estacionaria. Bajo estas
condiciones se favoreció la retención de los compuestos facilitando la separación
cromatográfica indicada.
Posteriormente, considerando las características de sensibilidad y selectividad
que proporcionan los diferentes detectores, se decidió realizar los análisis con
detector de barrido de fotodiodos. En este caso, gracias a la capacidad de la
determinación de la pureza de pico que permite el uso del PDA proporcionando el
espectro propio de cada compuesto, se confirmó que los extractos no requerían
una etapa adicional para eliminar interferencias propias de la matriz que pudiesen
coeluir con el ácido clorogénico.
Aplicando las mismas condiciones cromatográficas ensayadas con detección
por UV, se presenta a modo de ejemplo, un cromatograma de una solución
estándar de 5 ppm de concentración inyectado con un volumen de 25 µL (Figura
9)
FIGURA 9. Pico del estándar del ácido clorogénico (5-CQA) a una concentración de
5 ppm.
58
En la Tabla XVII se observa la elución del 5-CQA con un tiempo de retención
de 12,67 minutos, utilizando una columna C18 de 250 mm de longitud, y detección
en un rango de longitud de onda de 210 a 350 nm.
TABLA XVII. Área y concentración del estándar de 5 ppm
En la Figura 10, se observa el espectro de absorción del estándar del ácido
clorogénico, determinando la longitud de onda mayor del analito a 326 nm, con el
uso de una fase móvil de ácido fosfórico al 1 % y una columna de 250 mm de
longitud.
Nombre
del pico
Tiempo
de retención Área
1 5CQA 12,676 363743
AU
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
0,018
0,020
0,022
0,024
0,026
0,028
0,030
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00
217,0
240,6
326,0
FIGURA 10. Espectro del estándar del ácido clorogénico, 5 ppm
59
De esta manera, los ensayos realizados permitieron determinar las mejores
condiciones analíticas como es la fase móvil, la columna, volumen de inyección,
para la determinación de 5-CQA mediante PDA.
IV.5.2 Curva de calibración
La construcción de la curva de calibración con diferentes niveles de
concentración del analito permitió determinar el rango de linealidad de compuesto,
y, en consecuencia, la capacidad de cuantificación de la concentración del método
de acuerdo al área de pico.
En la Figura 11, se observa la curva de calibración del ácido clorogénico en un
rango de concentración de 1 a 100 ppm. De este modo, el coeficiente de
correlación (R) fue de 0.996058, lo que demuestra la relación directamente
FIGURA 11. Curva de calibración del estándar de ácido clorogénico (5-CQA)
60
proporcional del incremento del área en función del incremento de la
concentración del analito.
TABLA XVIII. Área y concentración de ácido clorogénico (5-CQA) en las diferentes
soluciones de trabajo para la curva de calibración
El tiempo promedio de retención de cada uno de los puntos de la curva fue de
12,68 minutos, con un coeficiente de variación de 0,36 %, cuyo valor es favorable,
ya que demuestra que la variación de los datos es mínima. En la Tabla XVIII se
detalla las concentraciones exactas de cada uno de las soluciones de trabajo
inyectadas para la mencionada curva de calibración.
III.6 Ensayos preliminares
Antes de presentar los resultados obtenidos en la optimización del ácido
clorogénico en muestras de granos verdes de café robusta, cabe mencionar que
a partir de la detección de un extracto hidroalcohólico de muestra (2:1, EtOH:H2O)
mediante PDA, se obtuvo el espectro de longitud de onda de los diferentes
compuestos registrados en la muestra. Lo cual permitió confirmar el orden de
elución reportado en la bibliografía de referencia (Marín y Puerta, 2008). A modo
Muestra Área Concentración
(mg/Kg)
%
Desviación
1 5 mg/l 363742,686 4,435 -11,31
2 10 mg/l 698103,295 9,077 -9,23
3 25 mg/l 1686811,392 22,805 -8,78
4 50 mg/l 4079589,208 56,028 12,06
5 100 mg/l 7077716,663 97,655 -2,34
61
de ejemplo se presenta en la Figura 12, una comparativa de los espectros del 5-
CQA y 4-CQA.
En la Figura 12, se observa además el isómero 5-CQA, con un tiempo de
retención de 12,65 min, el cual se corresponde con el pico del estándar en la
Figura 7.
FIGURA 12. Cromatograma de los isómeros del ácido clorogénico presentes en la muestra de café verde robusta detectados por PDA: 3-cafeoilquinico (3-CQA); 5-cafeoilquinico (5-CQA); 4-cafeoilquinico (4-CQA); 5-feruloilquinico (5-FQA); 3,4-dicafeoilquinico (3,4-diCQA); 3,5-dicafeoilquinico (3,5-diCQA); 4,5-dicafeoilquinico (4,5-diCQA)
62
III.6.1 Primera etapa de optimización
Dentro de los ensayos de optimización de extracción del ácido clorogénico, en
la primera etapa se evaluaron como variable diferentes mezclas de solución
extractante de EtOH:Agua
Los resultados de estos ensayos fueron relevantes para la selección de los
análisis de las subsiguientes etapas, seleccionando las condiciones que
presentaron resultados de mayor concentración del compuesto.
FIGURA 13. Cromatogramas de los ensayos preliminares correspondientes a la primera etapa: A) Extractos
hidroalcohólica EtOH:Agua (2:1), B) Extracto 100 % en agua detectados por PDA.
A)
B)
63
En la Figura 13, se observa el isómero ácido clorogénico (5-CQA), en los
extractos que presentaron menor y mayor concentración como los son: Agua y
EtOH:Agua (2:1) respectivamente. Fueron detectados por PDA, a una longitud de
onda entre 210 a 350 nm, a partir de la inyección de 25 µl.
En la TABLA XIX, se observa las áreas y concentraciones de cada uno de los
extractos obtenidos en los ensayos de maceración con diferentes mezclas de
solventes en variadas proporciones.
En la extracción de agua 100 % se detectó una gran cantidad de picos
interferentes; El agua, por ser un compuesto muy polar, permite que eluyan más
componentes de la muestra afines al disolvente. Basándonos en la repetibilidad,
este ensayo presentó concentraciones bajas y dispersas. En la mezcla extractante
EtOH:Agua (1:1), se evidenció un aumento de la concentración del analito.
Desde el punto de vista químico; las extracciones que presentaron mejor y
mayor concentración y resolución del isómero ácido clorogénico (5-CQA) fueron
las mezclas extractante EtOH:Agua (2:1) y EtOH:Agua (1:2,). La maceración de
hidroalcohólico EtOH:Agua en proporción (2:1), demostró mayor concentración en
las repeticiones, esto se debe a la polaridad del analito frente a los solventes
orgánicos, la molécula del 5-CAQ se mantiene más estable, favoreciendo la
extracción.
Cabe mencionar, que el coeficiente de variación de los mejores y mayores
extractante fue de: 8,6% en EtOH:Agua (2:1) y 6,0 % en EtOH:Agua (1:2).
64
TABLA XIX. Área y concentración determinada de las muestras de ensayos
preliminares según la Figura 11.
(Maceración 24
horas)
Tiempo de
retención Área
Concentración
(mg/Kg)
Coeficiente de
variación (%)
1 REP 1 AGUA 12,577 997741 4412,502
92,3
2 REP 2 AGUA 12,606 197173 707,319
3 REP 3 AGUA 12,605 1474953 6621,137
4 REP 4 AGUA 12,603 3394280 15504,153
5 ET:H2O 1:2 REP-1 12,670 2372221 10773,868
6,0
6 ET:H2O 1:2 REP-2 12,672 2114551 9581,319
7 ET:H2O 1:2 REP-3 12,652 2422908 11008,457
8 ET:H2O 1:2 REP-4 12,646 2307459 10474,134
9 ET:H2O 2:1 REP-1 12,637 4774195 21890,672
8,9
10 ET:H2O 2:1 REP-2 12,649 4021179 18405,564
11 ET:H2O 2:1 REP-3 12,648 4021521 18407,148
12 ET:H2O 2:1 REP-4 12,623 4059284 18581,924
13 ET:H2O 1:1 REP-1 12,628 1225392 5466,119
31,6
14 ET:H2O 1:1 REP-2 12,612 2505400 11390,246
15 ET:H2O 1:1 REP-3 12,621 1774789 8008,833
16 ET:H2O 1:1 REP-4 12,601 2486236 11301,550
65
III.6.2 Segunda y tercera etapa de optimización
De acuerdo con los resultados obtenidos en la primera etapa se procedió
dependiendo de los valores de repetibilidad de la concentración, se realizaron
ensayos de maceración por sonicación (ultrasonido) en 1 hora y por agitación
magnética de 6 y 12 horas.
FIGURA 14. Cromatogramas de los ensayos preliminares correspondientes a la segunda y tercera etapa por maceración con EtOH:Agua (2:1), a) Ensayos por maceración de 6 y 12 horas; b) Ensayo de maceración por sonicación durante 1 hora, detectados por PDA.
a)
b)
66
En la Figura 14, se observa el pico del ácido clorogénico (5-CQA), por agitación
magnética de 6 y 12 horas y sonicación de 1 hora.
Los ensayos realizados por agitación magnética durante 6 y 12 horas,
presentaron mayor concentración del 5-CQA, con respecto a la sonicación durante
1 hora. Señalando así, que las extracciones realizadas por agitación magnética
con la mezcla de solventes EtOH:Agua (2:1) durante 6 horas, proporcionan
valores más altos de concentración del analito. Por la alta polaridad del 5-CQA en
un medio hidroalcohólico y por la estabilidad del analito dentro de la sustancia
extrantante, permitió una mejor extracción.
En la TABLA XX se muestran los resultados de las extracciones de EtOH:Agua
(2:1) mediante sonicación y maceración por agitación de 6 y 12 horas de la
segunda etapa de optimización del ácido clorogénico. Dando así, valores de
repetibilidad en las extracciones de 6 y 12 horas. El proceso de extracción
mediante sonicación de la muestra durante una hora no fue suficiente para extraer
la mayor concentración y área a cuantificar.
Con respecto a los datos estadísticos de concentración del 5-CQA de la
segunda y tercera etapa de optimización, el coeficiente de variación del ensayo
realizado por sonicación durante 1 hora, proporcionó un 20,30 %; de la maceración
por agitación 12 horas, el porcentaje fue de 18,05 %, sin embargo, la extracción
magnética por 6 horas, determinó un CV de 4,61 %, demostrando así que el
ensayo por agitación durante 6 horas, proporcionan resultados favorables para el
método aplicado de extracción y su posterior cuantificación.
67
TABLA XX. Área y concentración determinada de las muestras de ensayos
preliminares según la Figura 12.
III.6.3 Análisis de muestras reales con diferentes periodos de maduración,
aplicando extracción por agitación magnética.
A partir de los resultados obtenidos durante la optimización del proceso de
extracción de ácido clorogénico, se procedió al análisis de muestras reales de
granos de café robusta según el período de maduración. Esto se llevó acabo por
agitación magnética y vortex por 6 horas.
Nombre de la muestra
Tiempo de
retención
(min)
Área Concentración
(mg/Kg)
Coeficiente de
variación (%)
1 ET:H2O 2:1 REP-1 MAC 6H 12,634 4233661 19388,975
4,61
2 ET:H2O 2:1 REP-2 MAC 6H 12,640 3984473 18235,682
3 ET:H2O 2:1 REP-3 MAC 6H 12,645 3787974 17326,248
4 ET:H2O 2:1 REP-4 MAC 6H 12,649 4021792 18408,405
5 ET:H2O 2:1 REP-1 MAC 12H 12,650 4218873 19320,532
18,05
6 ET:H2O 2:1 REP-2 MAC 12H 12,635 2727529 12418,300
7 ET:H2O 2:1 REP-3 MAC 12H 12,639 3915477 17916,357
8 ET:H2O 2:1 REP-4 MAC 12H 12,631 3581097 16368,779
9 ET:H2O 2:1 REP-1 SONIC 1
H
12,635 2097063 9500,381
20,30 10 ET:H2O 2:1 REP-2 SONIC 1 H 12,641 1783023 8046,941
11 ET:H2O 2:1 REP-3 SONIC 1 H 12,623 1933000 8741,067
12 ET:H2O 2:1 REP-4 SONIC 1 H 12,645 1280601 5721,637
68
FIGURA 15. Cromatogramas de extracción en muestras reales por períodos de maduración: Primera semana, cuarta semana y sexta semana de maduración; a) Extracto por agitación magnética, b) extracto por vortex, ambos métodos se emplearon por 6 horas.
B)
A)
69
En la Figura 15, se observa los picos del ácido clorogénico (5-CQA) de los
extractos de maceración EtOH:Agua (2:1) por duplicado en agitación magnética y
vortex por 6 horas, junto al espectro del 5-CQA Figura 16 del extracto de la sexta
semana de madurez.
En la TABLA XXI se detalla los datos de concentración de los extractos
hidroalcohólicos por maceración y vortex en muestras reales. La muestra
extractante por agitación magnética, determinó valores de concentraciones
mayores en relación a la extracción por maceración en vortex.
En la maceración por agitación magnética, se determinó que los valores de
concentración por cada semana de maduración del café, presentó pequeñas
variaciones a partir de la tercera hasta la sexta semana. Se observó que en las
últimas semanas de maduración de los granos de café robusta, los niveles de
concentración del 5-CQA se incrementaron.
AU
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
nm
210,00 220,00 230,00 240,00 250,00 260,00 270,00 280,00 290,00 300,00 310,00 320,00 330,00 340,00
217,0
241,8
326,0
FIGURA 16. Espectro del ácido clorogénico - Semana 6
70
El ensayo de maceración por vortex durante 6 horas, se lo realizó con el
propósito de determinar si las concentraciones del ácido clorogénico varían con
un método diferente de homogenización al anterior, como fue por agitación
magnética. Se demostró que no presentaba demasiada variación en las diferentes
muestras del café.
Se determinó que el método de maceración por agitación magnética durante 6
horas presentaba mayor recuperación de ácido clorogénico, con respecto al
método de vortex por 6 horas, que representó aproximadamente la mitad de la
concentración del 5-CQA. En la variación de concentraciones, el segundo método
presentó un coeficiente de variación de 12,74%, a comparación del primer método
de 15,55 % pero, este presentó menor variación que el primero. En términos
generales ambos métodos presentaron ventajas y desventajas.
La cuantificación del ácido clorogénico realizado en los extractos de café en
diferentes estados de maduración por agitación magnética, determinó un
promedio general del 1,78 % de concentración del 5-CQA; Según análisis
realizados por otros investigadores (Marín y Puerta 2008), demostraron que el
isómero ácido clorogénico en café robusta presentó un promedio de 3,88% de
concentración. En otros estudios realizados por Chin-Long Ky, Michel Noirot y
Serge Hamon (1997) se evidenció un porcentaje del 3.5 % de ácido clorogénico
en la especie del Coffea liberica.
Según, referencias bibliográficas, el ácido clorogénico está presente en mayor
concentración en el grano de café inmaduro, es decir, en la etapa de maduración
estos tienden a disminuir. Cabe destacar, que entre los primeros 540 a 600 días
se da la primera floración, y 240 a 270 días más tarde se da el primer fruto maduro
Con respecto a esta investigación, el 5-CQA presentó menor porcentaje de
concentración comparada con otras referencias, esto puede ser por el poco tiempo
de maduración del mismo.
71
TABLA XXI. Área y concentración determinada de las muestras reales por período
de maduración en maceración y vortex por 6 horas, según la Figura 15.
Nombre de la
muestra
Tiempo de
retención
(min)
Área Concentración
(mg/kg) CV (%)
Maceración 6 horas
1 SEM 0 REP1 12,652 3864362 17679,786 8,38
2 SEM 0 REP2 12,652 4345387 19906,061
3 SEM 1 REP1 12,666 2936507 13385,490 3,50
4 SEM 1 REP2 12,637 2796848 12739,121
5 SEM 2 REP1 12,644 2422924 11008,532 20.67
6 SEM 2 REP2 12,645 1816316 8201,029
7 SEM 3 REP1 12,649 4427080 20284,157 1.65
8 SEM 3 REP2 12,635 4325767 19815,257
9 SEM 4 REP1 12,658 5065767 23240,124 3,53
10 SEM 4 REP1 12,648 5322650 24429,027
11 SEM 5 REP1 12,647 4152578 19013,705 1,31
12 SEM 5 REP1 12,636 4229584 19370,105
13 SEM 6 REP1 12,652 4371407 20026,491 0,56
14 SEM 6 REP1 12,659 4406012 20186,648
Vortex 6 horas
15 SEM 1 REP1 12,695 2239341 10158,871 13,49
16 SEM 1 REP2 12,708 1856961 8389,140
17 SEM 2 REP1 12,731 1732974 7815,308 27,00
18 SEM 2 REP2 12,716 1191480 5309,166
19 SEM 3 REP1 12,725 2411744 10956,787 4,45
20 SEM 3 REP2 12,684 2267398 10288,723
21 SEM 4 REP1 12,689 2315666 10512,120 2,34
22 SEM 4 REP2 12,671 2391990 10865,362
23 SEM 5 REP1 12,670 2385142 10833,669 14,16
24 SEM 5 REP2 12,668 1958964 8861,232
25 SEM 6 REP1 12,687 2758583 12562,026 0,40
26 SEM 6 REP2 12,674 2774011 12633,428
72
CONCLUSIÓN
Se logró optimizar un método analítico mediante la aplicación de una técnica
cromatográfica para la cuantificación del ácido clorogénico. Se realizó optimizando
condiciones específicas para la correcta extracción del compuesto en una mezcla
hidroalcohólica, para su posterior aplicación en los respectivos ensayos de
maceración por agitación magnéticas en muestras reales. Además, se utilizó de
gradiente de fase móvil ácido fosfórico al 1 % y acetonitrilo. La columna
seleccionada para la separación cromatográfica del analito fue una C18 de
longitud 0.45 x 250 mm compuesta de una fase estacionaria de sílica modificada,
realizando las lecturas a una longitud de onda de 210 a 350 nm.
De acuerdo a los ensayos preliminares de optimización para la extracción del
ácido clorogénico, se determinó el método de maceración específica para la
obtención y cuantificación del ácido en el sistema HPLC-PDA. Se seleccionó la
mezcla hidroalcohólica de EtOH:Agua (2:1) agitación magnética por 6 horas, esto
se debe a la polaridad del analito frente a los solventes orgánicos, la molécula del
5-CQA se mantiene más estable, favoreciendo la extracción.
Se estableció comparaciones de la concentración del ácido clorogénico de
acuerdo a su madurez. Los resultados del análisis realizado en el sistema HPLC-
PDA, demostró que las concentraciones del 5-CQA presentan un promedio de 1.7
%, determinando que el tiempo de estado de maduración de los granos del café,
no fueron lo suficiente. En los granos de café verde robusta se encuentra una alta
concentración de ácidos clorogénicos, siendo el isómero 5-CQA, el más
abundante en las muestras otorgadas por INIAP de la región costa, provincia de
Los Ríos.
73
RECOMENDACIÓN
El periodo de maduración de los granos de café robusta debería ser de 6
a 9 meses, considerando desde el momento de floración de la planta.
Contemplando las condiciones seleccionadas para la extracción del ácido
clorogénico 5-CQA, realizar el proceso de validación del método aplicado
mediante HPLC, para determinación de parámetros de calidad.
74
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78
ANEXOS
ANEXOS A. Parámetros físicos del café robusta
Altura
(cm)
Ancho
(cm) Peso (mg)
1 1,41 1,05 0,9707
2 1,44 1,11 1,1586
3 1,6 0,97 0,9837
4 1,5 1,08 1,1211
5 1,36 1,08 1,0612
6 1,35 1 0,8907
7 1,34 1,08 0,9775
8 1,58 1,09 1,2942
9 1,59 0,99 0,9719
10 1,55 1,07 1,2198
11 1,6 0,99 1,0761
12 1,49 1,01 1,0852
13 1,57 1 1,1184
14 1,58 1,02 0,9087
15 1,49 1,09 1,0545
16 1,46 0,97 0,9055
17 1,42 1,12 1,0672
18 1,45 1,06 1,0993
19 1,5 0,95 0,8023
79
20 1,59 1 0,9348
21 1,72 1,04 1,1201
22 1,43 0,95 0,8167
23 1,59 1,09 1,2647
24 1,57 0,98 1,0475
25 1,53 0,96 0,9661
26 1,63 1,03 1,2292
27 1,47 0,95 0,9454
28 1,52 1,09 1,2393
29 1,48 1,03 1,0225
30 1,63 1,02 1,0144
31 1,36 1,04 0,8727
32 1,53 1,07 1017,2
33 1,56 1,05 1,1591
34 1,39 1,04 1,0425
35 1,35 1,12 1,2183
36 1,66 1,05 1,2069
37 1,67 1,01 1,1845
38 1,54 1,01 1,0596
39 1,39 1,01 0,8887
40 1,73 1,06 1,2623
41 1,68 0,99 1,1199
42 1,49 1,03 1,0012
43 1,29 1,05 0,9293
80
44 1,58 1,07 1,0118
45 1,46 0,99 1,0852
46 1,43 1,06 1,0065
47 1,55 1 1,1005
48 1,36 0,97 0,8678
49 1,38 1,05 0,9945
50 1,32 0,91 0,8205
51 1,41 1 0,8694
52 1,37 1,05 1,0489
53 1,35 1,16 1,2436
54 1,62 1,05 1,1672
55 1,51 1,08 1,0924
56 1,52 0,95 0,9727
57 1,58 0,98 1,0228
58 1,36 1,04 0,8998
59 1,8 1 1,2013
60 1,6 1,01 1,1971
Promedio 1,50 1,03 1,0489
DS 0,11 0,05 125,89
CV 7,61 4,9 12,0
81
ANEXOS B. Ensayo del tamizaje fitoquímico
FIGURA 2. Granos de café robusta
FIGURA 1. Extractos éterios en la semilla y cáscara del café verde.
82
FIGURA 3. Reacciones fitoquímicas FIGURA 4. Reacciones fitoquímicas
ANEXOS C. Análisis cromatográfico
FIGURA 6 Estándar de 5-CQA. FIGURA 5. Extractos hidroalcohólico en viales de alta de recuperación.
83
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Almacigo.- Arbusto de corteza parda y escamosa, ramas erectas, hojas
perennes y alternas, flores muy pequeñas, de color amarillento a rojo oscuro y
fruto en drupa esférica primero roja y luego negra; puede alcanzar hasta 3 m de
altura.
Astringente.- Sustancias que con su aplicación externa local (tópica) retraen
los tejidos y pueden producir una acción cicatrizante, antiinflamatoria y
antihemorrágica.
Caramelización.- Es la oxidación del azúcar; Como la reacción de Maillard,
la caramelización, es un tipo de dorado no enzimático. Sin embargo, a diferencia
de ésta, la caramelización es una pirólisis, en contraposición a una reacción con
aminoácidos.
Café pods.- Es el equivalente en café a una bolsa de té, molido y dosificado
previamente, envuelto en papel filtro, empacado para evitar su oxidación y listo
para una infusión de agua que resulte un exquisito Café Espresso.
Liofilización.- Es un proceso de deshidratación usado generalmente para
conservar un alimento perecedero o hacer el material más conveniente para el
transporte.
Multicaule.- Del latín multicaulis, con el significado de ("muchos tallos").
Polaridad.- Es una propiedad de las moléculas que representa la separación
de las cargas eléctricas en la misma molécula. Esta propiedad está íntimamente
relacionada con otras propiedades como la solubilidad, el punto de fusión, el punto
de ebullición, las fuerzas intermoleculares, etc.
Optimización.- Es la selección del mejor elemento (con respecto a algún
criterio) de un conjunto de elementos disponibles
![Nota sobre el Convenio núm. 158 y la …...Normas-[2009-02-0247-2]-Sp.doc 1 Parte I. Contenido del Convenio núm. 158 y la Recomendación núm. 166 A. Definiciones y conceptos Despido](https://static.fdocuments.es/doc/165x107/5ea4a124ec841e4e017e44ea/nota-sobre-el-convenio-nm-158-y-la-normas-2009-02-0247-2-spdoc-1-parte.jpg)
