UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...

1

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD: INVESTIGACION

Tema: “DETERMINACIÓN MICROBIOLÓGICA, SUB-TIPIFICACIÓN DE

Escherichia coli O157:H7 EN PRODUCTOS CÁRNICOS MOLIDOS

EXPENDIDOS EN MERCADOS DE LA CIUDAD DE GUAYAQUIL”

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO

PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS.

AUTORES:

GUAMINGA GUAMAN JHON RENATO

TUTILLO ZAMBRANO DAMIAN ORLANDO.

TUTOR:

Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO, Mgs.

CO -TUTOR:

BLGO., GUSTAVO SAÚL ESCOBAR VALDIVIESO, MSc.

GUAYAQUIL – ECUADOR

2018-2019

XIII

Dedicatoria

El presente trabajo investigativo lo dedicamos principalmente a Dios, por ser el

inspirador y darnos fuerza para continuar en este proceso de obtener uno de los

anhelos más deseados.

A nuestros padres, por su amor, trabajo y sacrificio en todos estos años, gracias

a ustedes hemos logrado llegar hasta aquí ́y convertirnos en lo que somos. Ha

sido el orgullo y el privilegio de ser sus hijos, son los mejores padres.

A nuestros hermanos (as) por estar siempre presentes, acompañándonos y por

el apoyo moral, que nos brindaron a lo largo de esta etapa de nuestras vidas.

A todas las personas que nos han apoyado y han hecho que el trabajo se realice

con éxito en especial a aquellos que nos abrieron las puertas y compartieron sus

conocimientos.

XIV

Agradecimiento

Agradecemos a Dios por bendecirnos la vida, por guiarnos a lo largo de nuestra

existencia, ser el apoyo y fortaleza en aquellos momentos de dificultad y de

debilidad.

Gracias a nuestros padres: Héctor Tutillo y Rosaura Zambrano; y, Lorenzo

Guaminga y Zoila Guaman, por ser los principales promotores de nuestros

sueños, por confiar y creer en nuestras expectativas, por los consejos, valores y

principios que nos han inculcado.

Agradecemos a nuestros docentes de la Facultad de Química y Farmacia de la

Universidad de Guayaquil, por haber compartido sus conocimientos a lo largo de

la preparación de nuestra profesión, de manera especial, a la Dra. María

Auxiliadora Alarcón tutora de nuestro proyecto de investigación quien ha guiado

con su paciencia, y su rectitud como docente, y a nuestro cotutor el Blgo. Saúl

Escobar por su valioso aporte para nuestra investigación.

XV

INDICE DE CONTENIDO Resumen XIX

ABSTRACT XX

INTRODUCCIÓN 1

Antecedentes 4

CAPÍTULO I: 6

EL PROBLEMA 6

I.1. Justificación. 6

I.1 Formulación del Problema 6

I.2. Objetivos. 7

Objetivo general 7

Objetivos Específicos 7

I.3. Hipótesis 7

I.4. Variable de estudio: 7

Capítulo II 9

Marco Teórico 9

II.1. Carne 9

II.2. Composición Química 10

II.3. Consumo 11

II.4. Escherichia coli 12

II.4.1. Aspectos Morfológicos 13

II.4.2 E.Coli Patogenas 13

II.4.3. Características generales del grupo Coli. 14

II.4.4. Signos clínicos 21

II.4.5. Periodo de incubación 22

II.4.6. Duración de la enfermedad y tratamiento 22

II.4.7. Toxina Shiga 23

II.4.8. Locus Lee 24

II.4.9. Diversos factores de virulencia de ECEH. 25

II.5. Epidemiologia 26

II.6. Prevención 28

II.7. Tratamiento 29

II.8. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7 29

XVI

CAPITULO III 32

Materiales y Métodos 32

III.1. Metodología 32

III.2. Tipo de Investigación 32

III.3. Diseño de Investigación 32

III.4. Población y Muestra 32

III.5. Tiempo de Investigación. 33

III.6. Lugar de investigación 33

III.7. Materiales y Equipo 33

III.8. Flujograma para el aislamiento e identificación de O157:H7 35

III.9. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7 36

CAPÍTULO IV. 39

RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 39

IV.1. Técnica de recolección de información. 39

CAPITULO V. 44

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 44

BIBLIOGRAFÍA 46

ANEXOS 50

XVII

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I: Composición Química de la Carne (FAO, 2015). ................................ 10

Tabla II: Identificación bioquímica de Escherichia Coli (Rodriguez, 2015). ...... 15

Tabla III: Reactivos, funciones y sus marcas. .................................................. 34

Tabla IV: Equipos ............................................................................................. 35

Tabla V: Presencia de otros microorganismos en las muestras analizadas ..... 39

Tabla VI: Escherichia Coli 0157:H7 obtenidas mediante el ensayo Wellcolex

Látex. ............................................................................................................... 41

Tabla VII: Conservación del producto .............................................................. 43

ÍNDICE DE FIGURAS

Gràfica: 1 Presencia de Coliformes Totales y E.coli en muestras de carne molida

bovina ............................................................................................................... 39

Gràfica: 2 Presencia de Coliformes Totales en carne molida expendida en el

mercado de la zona 1, zona 2 y zona 3 de la ciudad de Guayaquil ................. 40

Gráfica: 3: Serotipo O157:H7 encontrados en Cepas de Escherichia coli aisladas

......................................................................................................................... 42

Gráfica: 4 Evaluación de las condiciones de expendio de la carne molida en los

mercados de estudio. ....................................................................................... 42

XVIII

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1: Tabla de los resultados del análisis microbiológico para E. coli en el mercado

de la zona 1, zona 2 y zona 3 de la Ciudad de Guayaquil ........................................... 51

Anexo 2: Lista de chequeo para la inspección de los sitios de venta. ......................... 59

Anexo 3: Resultados de la serotipificación de Escherichia coli ................................... 61

Anexo 4: Tabla bioquimica de identificación de microoganismos mas comunes (Carpio,

2017). ......................................................................................................................... 65

Anexo 5: Preparación de agar agua de peptona ........................................................ 66

Anexo 6: Preparación de agar bilis rojo neutro cristal violeta ...................................... 66

Anexo 7: Preparación de agar soya tripticasa. ............................................................ 67

Anexo 8: Preparación de agar SIM ............................................................................. 67

Anexo 9: Preparación de agar Citrato Simmons. ........................................................ 68

Anexo 10: Preparación de agar Ureasa. ..................................................................... 68

Anexo 11: Preparación y siembra de la muestra. ........................................................ 68

Anexo 12: Procedimiento de pruebas bioquímicas. .................................................... 70

Anexo 13: Homogenización de la muestra en agua peptonada. ................................. 72

Anexo 14: Preparación de Agar Rojo Bilis- Cristal Violeta .......................................... 72

Anexo 15: Pruebas Bioquímicas ................................................................................. 73

Anexo 16: Preparación de Agar Citrato Simmons ....................................................... 73

Anexo 17: Escherichia coli obtenidas .......................................................................... 74

XIX

FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA

UNIDAD DE TITULACIÓN

“DETERMINACIÓN MICROBIOLÓGICA, SUB-TIPIFICACIÓN DE Escherichia coli O157:H7

EN PRODUCTOS CÁRNICOS MOLIDOS EXPENDIDOS EN MERCADOS DE LA CIUDAD DE

GUAYAQUIL”

Autores

JHON RENATO GUAMINGA GUAMAN

DAMIAN ORLANDO TUTILLO ZAMBRANO

Tutora:

Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO.Mg

Resumen

Escherichia coli O157:H7 es un serotipo enterohemorrágico que representa una seria

amenaza para la salud pública ya que produce el Síndrome urémico hemolítico (SUH) y

fallas renales. En Ecuador no existen investigaciones que aseguren la presencia de

E.coli O157:H7. El presente trabajo se realizó con la finalidad de detectar la presencia

de Escherichia coli O157:H7 en carne bovina molida comercializada en los mercados

de la ciudad de Guayaquil. El diseño de estudio que se utilizó fue tipo descriptivo,

observacional con una investigación no experimental, se sembró en agar rojo bilis neutro

cristal violeta. Se procedió a la identificación de Microorganismo y la posterior sub-

tipificación de la Cepa O157H7. Detectándose del total de cepas identificados como

Escherichia coli, un 20% de cepas pertenecientes al sub tipo O157H7. Se pudo evaluar

mediante un Check List las condiciones de almacenamiento y venta de la carne molida.

Palabras Claves: Escherichia coli O157:H7, Verocitotoxina, Carne Molida Bovina,

Wellcolex Látex

XX

FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA UNIDAD DE TITULACIÓN

“MICROBIOLOGICAL DETERMINATION, SUB-TIFICIFICATION OF Escherichia coli O157:

H7 IN MILLED MEAT PRODUCTS AVAILABLE IN THE CITY OF GUAYAQUIL MARKETS”

Authors:

JHON RENATO GUAMINGA GUAMAN

DAMIAN ORLANDO TUTILLO ZAMBRANO

Advisor:

Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO.Mg

ABSTRACT

Escherichia coli O157: H7 is an enterohemorrhagic serotype that represents a serious general

threat to public health and that produces hemolytic uremic syndrome (HUS) and renal failure. In

Ecuador there are no investigations to ensure the presence of E. coli O157: H7. The presence of

Escherichia coli O157: H7 in ground beef sold in the markets of the city of Guayaquil. The design

of a study that has been done is a type of descriptive, observational activity with a non-

experimental investigation, it was sown in neutral red crystal violet bile agar. We proceeded to

the identification of Microorganism and the subsequent sub-typification of the O157H7 strain.

Detection of total strains such as Escherichia coli, 20% of strains belonging to subtype O157H7.

The checklist of the conditions of storage and sale of ground beef

Key Words: Escherichia coli O157: H7, Verocitotoxin, Bovine Ground Beef, Wellcolex Latex

1

INTRODUCCIÓN

El microorganismo Escherichia coli es un bacilo Gram Negativo, móvil y

anaerobio facultativo pertenece al orden de las Eubacteriales, familia

Enterobacteriaceae, Tribu Escherichieae, genero Escherichia, especie coli. Es la

especie anaerobia facultativa más abundante de la flora normal del tracto

intestinal del hombre y de algunos animales siendo pionera entre las primeras

especies en colonizar. Alcanza un tamaño entre 1 y 1,8 µm por 2 a 6 µm, puede

aparecer en pares o aislados, la estructura está constituida por una pared,

fimbrias, flagelos peritricos y una membrana externa. Algunas cepas de E.coli

son capaces de adquirir genes de virulencia móviles localizados en islas de

patogenicidad, bacteriófagos integrados y/o plásmidos, por esto pueden volverse

patógenas (Sanchez, Carpio Klanian, Mariel, 2015).

Entre los microorganismos patógenos que representan un alto costo

económico a la sociedad de muchos países se encuentran Escherichia coli

productor de verocitotoxinas (VTEC) de los serogrupos O157. Más de 250

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) son originadas por el consumo

excesivo de productos alimenticios, especies, bebidas o agua que contienen

cantidades suficientes de sustancias tóxicas o gérmenes patógenos.

La Escherichia coli O157:H7 es transmitida por los alimentos y se logra

concebir como el agente causante de la colitis hemorrágica y Síndrome Urémico

Hemolítico (SUH) en seres humanos. Este microorganismo posee una

extraordinaria capacidad para conseguir transmitirse desde reservorios animales

(vacas, cabras y ovejas) a través de una variedad de vehículos alimentarios que

2

juega un papel crítico en su patogenicidad, emplea múltiples mecanismos para

la colonización a través de la adhesión a las superficies celulares. Se adhiere

fuertemente a la piel, las hojas de espinaca y raíces de brotes de alfalfa

(Sanchez-Solis et al, 2015).

Los productos cárnicos conforman una importante fuente de contaminación

en relación con este microorganismo que es considerado como un patógeno

emergente transmitido por alimentos. Se relaciona con las enfermedades

extraintestinales severa, caracterizada por anemia hemolítica microangiopática

y falla renal aguda. La carne de res es el principal reservorio de E. coli productor

de toxina Shiga (STEC) O157 y no-O157, los alimentos de origen cárnico son la

fuente de infección más importante para el hombre (Jure et al. 2015).

Escherichia coli es una bacteria que se alberga, se alberga en el intestino del

ser humano y de distintos animales de sangre caliente, se transmite por la

ingesta de alimentos y agua contaminada, productos cárnicos pocos cocidos.

Puede causar una enfermedad con un amplio espectro de gravedad, desde

diarrea acuosa y colitis hemorrágica síndrome urémico hemolítico a (SUH), una

condición que amenaza la vida. La infección se correlaciona con la ingestión de

carne o verduras contaminadas, pero también se transmite por el agua o incluso

por el contacto de persona a persona. Los brotes esporádicos o masivos se han

reportado en los países desarrollados, pero en Argentina, el síndrome urémico

hemolítico muestra un patrón endémico y representa un problema de salud

pública grave con altas tasas de mortalidad y morbilidad. Escherichia coli O157:

H7 es el serotipo STEC dominante asociada con SUH en Argentina y en el

3

mundo, aunque serogrupos no O157 STEC puede causar una enfermedad

similar (Fernandez-Brando, Gonzales, Castillo, 2017).

Escherichia coli diarreogénicas en las Enfermedades Diarreicas (EDAS) en la

población infantil según un estudio, un estudio realizado sobre E. coli

enteropatógenas, en el año 1997 reportó que las ECTS están asociadas a las

(EDAS) en la población infantil. En este estudio se reportaron cepas de ECTS

sorbitol negativas las cuales están asociadas al serotipo O157:H7. Cepas

O157:H7 negativas no se incluyeron en el estudio (Gómez, 2014).

4

Antecedentes

La base trascendental de los brotes de E. coli productora de toxina Shiga son

los productos de carne molida cruda o poco cocida, hortalizas y leche cruda

contaminadas por materia fecal, se transmite al hombre principalmente por el

consumo de alimentos contaminados. En el 2011, el serotipo O104:H4 fue el

principal causante de un brote multinacional importante en Europa. En varias

zonas geográficas de los Estados Unidos y Canadá, la infección por E.

coli O157:H7 llego a ser la causa más común de disentería que la shigelosis o la

salmonelosis. El informe de las infecciones por E. coli O157:H7 experimentaron

un aumento de estudio a Nivel Mundial, a partir de su primera descripción en

1982, el primer caso de intoxicación por consumo de hamburguesas se dio en el

mismo año, provocando gastroenteritis en el paciente (Astudillo, 2014).

En el sur del continente específicamente en Argentina, muchos trabajos

determinaron la preponderancia de Escherichia coli productora de Toxina Shiga

(STEC) del 3,8% en carne molida fresca, el 32% en hamburguesas de carne

molida y 8,4% en hamburguesas supercongeladas (Ripodas Navarro, 2017).

La E. coli O157:H7 (ECEH O157:H7) ha sido reconocida como la causa de

este síndrome desde el siglo pasado, específicamente en el año 1980. Los

rumiantes son los principales reservorios de la ECEH O157:H7, en especial el

ganado bovino y las ovejas, que se infectan sin presentar síntomas y eliminan el

organismo en las heces.

Estudios realizados sobre E. coli en el Reino Unido, Irlanda, Dinamarca,

Noruega, Finlandia, EE.UU, Canadá y Japón entre 1982 y 2006 demostró que la

5

fuente de transmisión mediante alimentos, fue de un 42.2% siendo las causas

productos lácteos un 12.2%, contacto de animales un 7.8%, agua un 6.7%,

medio ambiente un 2.2%, y otros factores en un 28.9% (Gonzales, 2010).

La proliferación de bacterias en la carne durante la faena es el principal modo

de contagio de E. coli O157:H7 a los alimentos; los productos elaborados con

carne molida han estado implicados en la mayor parte de la manifestación de

brotes sustancialmente vinculados al consumo de hamburguesas.

Uno de los primeros aislamientos de E. coli O157:H7 fue en el ganado bovino

de la Argentina (1977), en un bovino de menos de un mes de edad con

colibacilosis (Martez, Rivas, Motter, 2014).

A partir de su aislamiento e identificación como agente patógeno en el humano

por primera vez en el año 1982 en los EE.UU. a raíz de un brote de diarrea

hemorrágica, producto del consumo excesivo de hamburguesas elaboradas con

carne bovina, se ha incrementado la cifra de notificaciones de brotes y casos en

el mundo; se ha verificado en su contagio la participación de la carne molida con

un tiempo muy corto de cocción, entre otros alimentos que de ellos derivan como

la leche, carne y aguas con residuos fecales de animales como los principales

vectores (Márquez, 2013).

6

I. CAPÍTULO I:

EL PROBLEMA

I.1. Justificación.

En la actualidad en la ciudad de Guayaquil no existe un control de Calidad

adecuado para la comercialización de carne bovina molida, ni estudios

realizados sobre la posible presencia del serotipo O157:H7 productora de Toxina

Shiga perteneciente a Escherichia coli. Este microorganismo patógeno es el

causante de muchas enfermedades diarreicas y renales especialmente viéndose

afectada la población infantil, por ende, se ha decidido iniciar el estudio

microbiológico y sub-tipificación de E. coli O157:H7 en productos cárnicos

molidos en mercados de la ciudad de Guayaquil seleccionados estratégicamente

según el índice de consumo masivo que presenta la ciudad.

I.1 Formulación del Problema

¿La carne molida bovina expendida en los Mercados de la zona 1, zona 2 y

zona 3 en la ciudad de Guayaquil presentan contaminación por E.coli O157:H7?

7

I.2. Objetivos.

Objetivo general

Evaluar la presencia de Escherichia Coli O157:H7 en carne molida

comercializada en los Mercados de la zona 1, zona 2 y zona 3 en la Ciudad de

Guayaquil”

Objetivos Específicos

✓ Detectar la presencia de coliformes totales mediante el método oficial AOAC

991.14.

✓ Identificación de Escherichia coli en carnes molidas mediante ensayos

microbiológicos.

✓ Sub tipificación de Escherichia coli O157:H7 enterohemolítica en productos

cárnicos molidos mediante el Ensayo de Wellcolex Látex

I.3. Hipótesis

La carne expendida en los Mercados de la zona 1, zona 2 y zona 3 presenta

E.coli O157:H7 productora de Toxina Shiga

I.4. Variable de estudio:

Variable independiente: Lugares de expendio de productos cárnicos.

Variable dependiente: Presencia de E. coli O157:H7 en carne molida.

8

Conceptualización: Es un microrganismo de la familia Enterobacteriaceae que

se encuentra en el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre

caliente. Algunas cepas de E.coli, incluyendo E.coli 0157:H7 producen las

toxinas Shiga llamada, por sus siglas en inglés, STEC.

Indicador: Presencia, Determinación

9

II. Capítulo II

Marco Teórico

II.1. Carne

El Codex Alimentarius precisa la carne como todas las extremidades de un

animal que han sido declaradas como inocuas y preparadas para el consumo

humano. Es la composición de varios tejidos: tejido muscular, tejido conjuntivo y

el tejido graso, sus cualidades (textura, color, sabor) depende de la distribución

y proporción relativos de los tejidos (Araneda, 2018).

La alteración de la carne se debe a su determinada composición y a su

interacción con varios factores físico-químicos. Los más comunes son

enranciamiento, enmohecimiento, putrefacción y coloraciones anormales.

Las fases más relevantes para el control de la carne en el matadero son:

El desollado, es trascendental e importante en la supervisión de la carne

de bovino, ya que la piel del animal suele presentarse sucia e insalubre.

El eviscerado, se debe tener cuidado de enlazar bien el esófago y los

intestinos para prevenir que el contenido intestinal contamine la canal.

La inspección veterinaria oficial, debe inspeccionar en todas las fases y

condiciones del trabajo, así como todas las canales de los animales y sus

vísceras (Velez, 2015).

10

El almacenamiento de las carnes crudas, ya sea en el matadero, industria o

carnicería debe hacerse en excelentes condiciones de higiene y es muy

importante que la cadena de frio se mantenga estable y no se rompa.

II.2. Composición Química

La carne está compuesta de agua, minerales, vitaminas, grasa, proteínas y

ácidos grasos, así como también trazas de carbohidratos y otros componentes

bioactivos,

Tabla I: Composición Química de la Carne (FAO, 2015).

Agua Proteína Grasas Cenizas Kj*

Carne de

vacuno

(magra)

75.0% 22.3 1.8 1.2 485

Según la FAO (2015) hace referencia que la composición química de la carne

tiene como consecuencia sus altos índices de proteínas de calidad, que está

compuesta por vitaminas de elevada biodisponibilidad aminoácidos y

minerales. La carne presenta hierro y vitamina B12 en abundancia, que no se

los encuentra sencillamente libres en las dietas vegetarianas. Los productos

cárnicos de bovinos en su composición principal se observan los siguientes

porcentajes: agua 75%, proteínas del 20-30% (miosina, actina, globinas,

elastina, colágeno, mioglobina, tropomiosina y troponinas), grasas del 1-5%

(incluye colesterol y vitaminas liposolubles), glúcidos, cuyo porcentaje oscila

entre el 0,1-0,5 y por último vitaminas y sales minerales (FAO, 2015).

11

II.3. Consumo

El consumo de carne de vacuno aumentará de manera preponderante durante

los próximos 10 años. Para 2026, y en relación con el periodo base, se espera

que dicho consumo crezca casi un 6% en los países desarrollados, entretanto

que en las regiones en desarrollo se espera que se aumente en alrededor del

17%. En términos per cápita, el consumo de carne de vacuno del mundo en

desarrollo permanece relativamente bajo en comparación con los países que son

potencias mundiales, en alrededor de la cuarta parte en términos de volumen.

Las elevadas cifras de la población de Asia siguen siendo un gran impulsor

del crecimiento, en combinación con la percepción positiva de los acreedores

asiáticos de que las carnes de bovino y ovino sean saludables y estén libres de

la mayor parte de enfermedades; como resultado, se estima que durante la

siguiente década en Asia se registrará un incremento de 44% en el consumo de

carne de vacuno.

Si bien se espera que la demanda de carne se restaurará durante el periodo

de las perspectivas, especialmente en el mundo en desarrollo, básicamente

generalizando las tasas aproximadas serán menores que en los últimos 10 años.

El auge de este producto provendrá en su mayor parte del incremento de los

ingresos y de la población, sobre todo en naciones con clases medias de grandes

magnitudes de Asia, América Latina y el Medio Oriente. En las naciones que son

potencias mundiales, en los que el nivel de consumo es ya alto, la demanda de

carne seguirá incrementándose, en especial los Estados Unidos, aunque a

magnitudes generalmente menores que las de los países en crecimiento, donde

12

el crecimiento de la población suele ser mayor (OECD and Food and Agriculture

Organization of the United Nations, 2017).

Los altos niveles de contaminación de la carne son los agentes

microbiológicos, ya que además de provocar su degradación, ocasionan

enfermedades a quienes la consumen, pudiendo mencionar los patógenos que

se destacan entre ellos: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus,

Clostridium botulinum, Escherichia coli O157:H7, Campylobacter spp,

Clostridium perfringens , Lsteria spp, Salmonella spp (Romeu, 2012).

II.4. Escherichia coli

Es una bacteria que fue descubierta en 1885 por el pediatra alemán, El Dr.

Theodor Escherich, que se ha transformado en uno de los microrganismos más

estudiados en microbiología (Bettelheim, 2015).

Escherichia coli es una bacteria que se alberga en el intestino de los seres

vivos de sangre caliente. La mayoría de las cepas no provocan daños mayores,

algunas tienden a llegar a causar una grave enfermedad producida por el

contagio alimentario. La infección por E. coli se transfiere comúnmente por el

consumo de alimentos o agua contaminados, como productos cárnicos de poca

cocción y leche cruda.

Los indicios de la enfermedad incluyen diarrea y cólicos, que puede ser

sanguinolenta. También puede presentarse fiebre y vómitos. La mayor parte de

13

los pacientes se logran recuperar en el lapso de 10 días, aunque en algunos

casos la enfermedad puede causar la muerte (OMS, 2018).

II.4.1. Aspectos Morfológicos

Escherichia coli es un bacilo recto, móvil, mide entre 1 y 1,5 um por 2 a 6 um.

Su estructura está compuesta por una pared bacteriana, fimbrias, flagelos

peritricos y una membrana externa. El antígeno superficial somatico se

encuentra determinado por los azucares de las cadenas laterales del

lipopolisacarido (LPS) que conforman la membrana externa de las gram-

negativas. Se trata de un polisacárido con estabilidad térmica, haciendo de un

enmascaramiento por el antígeno K (capsular) en bacterias que tienen capsulas

(Campos, 2016).

II.4.2 E.Coli Patogenas

Varias cepas de E. Coli son capaces de alcanzar genes de virulencia móviles

que se localizan en bacteriófagos, integrados y/o plásmidos, por esto se vuelven

patógenas (Campos, 2016).

Los patotipos asociados a enfermedades entéricas se clasifican en 6 tipos,

según sus factores de virulencia y mecanismos de acción:

● E.coli de adeherencia difusiva (DAEC)

● E.coli enteroagregarivo (EAEC)

14

● E.coli enteroinvasivo (EIEC)

● E.coli enteropatogenico (EPEC)

● E.coli enterotoxigenico (ETEC)

● E.coli verototoxigenico (VTEC)

● E.coli productor de toxina Shiga (STEC)

II.4.3. Características generales del grupo Coli.

Escherichia coli habita en el intestino del hombre de 2 a 3 horas después del

nacimiento y se estima de flora normal, sin embargo hay detallado e investigado

seis grupos de E. coli productora de diarrea: enteroagregativa (EAEC) ,

enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena

(EPEC), adherencia difusa (DAEC) y enterotoxigénica (ETEC).

La bacteria se puede deportar y determinar con métodos tradicionales con

matriz en sus características serológicas o bioquímicas, entretanto también se

puede llevar a temas de estudio más a fondo sus sistemas de patogenicidad por

medio de ensayos en animales o cultivos celulares, previamente aplicando

técnicas de biología molecular que constatan la afluencia de genes involucrados

en estos mecanismos.

Escherichia coli es un anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae,

tribu Escherichia, un bacilo gram negativo cuyas principales peculiaridades

bioquímicas se describe a continuación (Campos, 2016).

15

Tabla II: Identificación bioquímica de Escherichia Coli (Rodriguez, 2015).

Identificación Bioquímica de Escherichia coli

Prueba Bioquímica % de positividad

Oxidasa 0

Producción de indol 98

Rojo de metilo 99

Voges-Proskauer 0

Citrato de Simmons 1

H2S (TSI) 1

Hidrolisis de urea 1

Utilizacion de malonato 0

Acido de glucosa 100

Gas de glucosa 95

Fenilalanina desaminasa 0

Arginina dihidrolasa 17

Ornitina descarboxilasa 65

Movilidad a 36 grados Celsius 95

Hidrolisis de gelatina a 22 grados celsius 0

KCN crecimiento en 3

Fermentación de lactosa 95

Fermentación de la sacarosa 50

Fermentación de D-manitol 98

Fermentación de D-sorbitol 94

Fermentación de mucato 95

Fermentación de dulcitol 60

16

E.coli enterotoxigénica

Las ETEC dominan la mucosa del intestino delgado por medio de fimbrias o

pilis que poseen distintas formas denominadas CFA (colonization factor antigens

por sus siglas en inglés), siendo su primordial sistema de patogenicidad la

producción de alguna o ambas enterotoxinas llamadas: toxina termoestable (ST)

y toxina termolábil (LT). Sus genes se alojan en un plásmido que también podría

tener información genética para los CFA´s, pese a que distintos genes de ST se

han hallado en transposones.

Las toxinas ST y LT incrementan el nivel intracelular de cAMP y cGMP

respectivamente, que se ubican en la membrana de las células intestinales,

consecuentemente incitando la salida de iones y agua.

Las ETEC tienden a ser más relevante en lactantes, particularmente en niños

menores de dos años, y principalmente durante los primeros seis meses de vida.

La frecuencia de aislamiento de este grupo patógeno de E. coli en niños con

disentería es de 10 a 30% (Farfán, 2016). En los infantes y en adultos mayores

puede ser poco frecuente y asintomática o producir la disentería del viajero. La

enfermedad tiene un tiempo de incubación de 14 a 50 horas. El cuadro clínico

tiene la característica por diarrea aguda, sin pus, sin moco y en pocos casos se

presentan fiebre, vómito y generalmente sin sangre. La disentería ocasionada

por ETEC puede ser ligera, momentánea y autolimitada pero también puede ser

grave (Ayala, 2015).

La propagación fecal de agua y alimentos es la principal fuente de infección,

siendo la dosis infectiva de 10 UFC (unidades formadoras de colonias).

17

E. coli enterohemorrágica

La EHEC con brotes caracterizados por disentería acuosa hemorrágica y poco

o nada de fiebre, dolor abdominal cuadro al que se le llamó colitis hemorrágica

(CH) y que era debido al consumo de carne cruda o mal cocida. El microrganismo

aislado de todos los casos fue E. coli del serotipo O157:H7. Se la relaciono con

casos esporádicos de síndrome urémico hemolítico (SUH) caracterizado por

trombocitopenia, anemia hemolítica microangiopatica y daño renal aguda,

precedida por disentería con sangre, con la presencia en heces de E. coli

productora de una citotoxina con actividad en células Vero, por lo que se le

denomina verotoxina (VT), y a las cepas que tienen la capacidad de elaborar se

les denominó E. coli verotoxigénicas (VTEC). Además, se logró observar que la

citotoxina se neutralizó con antitoxina obtenida a partir de Shigella dysenteriae

tipo 1, por lo que también se le llamó "shiga-like toxin" o toxina semejante a shiga

(SLT) o "shiga toxin" (STX), y a las E. coli que son capaces de producirla se les

otorga el nombre de STEC (Rodriguez, 2015).

El desplazamiento toxigénico de las cepas es necesaria para que el paciente

evolucione diarrea con sangre y colitis hemorrágica, ya que la citotoxina STX es

el principal mecanismo de patogenicidad de EHEC y su producción va de la

mano con la presencia del bacteriófago STX, que se encuentra insertado en el

genoma.

La STX tiene su acción a la altura de la síntesis de proteínas ya que se junta

a la subunidad 60S de los ribosomas de las células intestinales o renales del

hospedero. En las cepas EHEC aisladas, se han encontrado las variantes STX1

18

y STX2 que son inmunológicamente distintas, de tal forma que se pueden aislar

bacterias que produzcan alguna de las toxinas o ambas. Por otra parte, en la

toxina, las EHEC tienen más mecanismos de patogenicidad como el fenómeno

de esfacelación (A/E) y adherencia, y presentan el gen cromosomal eae que

codifica para la proteína de membrana externa (OMP) de 94 kilodaltones (kDa),

se denomina intimina, cuya expresión es frecuentada por genes plasmídicos; el

gene eae también se encuentra en las cepas EPEC. Otro factor de patogenicidad

es el plásmido pO157, de 60 megadaltones (MDa), que codifica para la

enterohemolisina (Rodriguez, 2015).

Otras clasificaciones en función del serotipo:

A. Cepas E. coli O157:H7. Este serotipo no fermenta el D-sorbitol ni la

ramnosa y no produce ß-glocuronidasa; esta bacteria tiende a producir

principalmente Sindrome Uremico Hemolitico (SUH) y CH. E. coli

O157:H7 se encuentra en borregos, bovinos, cabras y con menor

regularidad en pollos y cerdos; su principal alojamiento es el intestino

de ganado bovino. También se pueden recuperar de vegetales y frutas

como alfalfa, rábanos y lechuga; además en productos procesados

como mayonesa y jugos de manzana y naranja no pasteurizados, aun

así, cuando estos productos tengan un pH de 3.4, condición en la que

sobreviven varios días.

La transmisión de E. coli O157:H7 se puede dar por ingerir carne cruda o mal

cocida, leche recién ordeñada o no pasteurizada, agua contaminada; también se

puede repercutir de persona a persona. Hay erudiciones que proponen la

19

importancia de la mosca doméstica (Musca domestica) como vector en la

transmisión de E. coli O157:H7, y b) cepas no-O157:H7 cuya regularidad de

aislamiento es hasta 4 veces mayor que las O157:H7.

E. coli enteroinvasiva

El grupo EIEC y Shigella spp están enlazados bioquímicamente y

genéticamente ya que pertenecen al grupo de las descarboxilasas no móviles y

lactosa negativas. El sistema de patogenicidad de EIEC es la proliferación del

epitelio del colon; para ello uno de los primeros pasos es la unión de la bacteria

a las diversas vellosidades de la mucosa adquiriendo mucinasa y adhesinas,

para después inducir por endocitosis a la célula, para después multiplicar la EIEC

dentro de la célula y diseminación a células sanas adyacentes

Los síntomas comunes en personas infectadas por EIEC son disentería con

sangre, acuosa y moco, pero en varios casos sólo presentan disentería o diarrea,

ésta oportunamente es indiferenciable de la que genera ETEC. Las cepas EIEC

se compaginan más con brotes que con casos aislados, en los cuales el contagio

puede ser de individuo a individuo, por consumo de agua contaminada y

alimentos, transformándose en un patógeno relevante y grave en niños mayores

de seis meses (Rodriguez, 2015).

20

E. coli enteropatógena

EPEC fue el grupo pionero que se identificó serológicamente y se observó

casos clínicos en los cuales provocaron diarrea en infantes, siendo la conexión

su principal factor de patogenicidad. El método de acogida íntima entre la

membrana y la bacteria de las células del epitelio intestinal seguida de la

devastación de la microvellosidad con polimerización de actina, que lleva a la

modificación del citoesqueleto en el sitio de la vinculación de la bacteria, en

deuda al incremento de los niveles de proteína cinasa C y de calcio intracelular,

ha sido nombrado esfacelamiento (A/E) y adherencia. La adherencia está

mediada por fimbrias rizadas que se denominan Bfp (bundle-forming pilus) cuya

información genética está descrita en un plásmido de 50-70MDa llamado EAF

(EPEC adherence factor) y de varios genes cromosomales.

E. coli de adherencia difusa

Las cepas de E. coli de adherencia difusa, no crean microcolonias cuando se

adjuntan a células Hep-2. Existen pocos estudios de su mecanismo de

patogenicidad, pero se ha descrito una fimbria de superficie, haciéndose llamar

como F1845, dentro en el fenómeno de adherencia difusa. Los genes que se

encriptan para esta fimbria se pueden descubrir en el plásmido o en un

cromosoma. El acontecimiento de adherencia difusa también se ha vinculado

con una proteína de membrana externa de 100 kDa, en una cepa del serotipo

0126:H27, en los cuales existen genes que se han secuenciado, pero sólo se

han encontrado en una menor cantidad de cepas aisladas (Rodriguez, 2015).

21

II.4.4. Signos clínicos

La infección en humanos por E. coli O157:H7 puede ser desde asintomática

(raramente) hasta capaz de desarrollar diarrea aguda acompañada con sangre,

calambres abdominales severos, y/o síndrome urémico hemolítico. En algunos

casos el infectado se recupera rápidamente en una semana, mientras que en

otros su cuadro clínico evoluciona desfavorablemente a colitis hemorrágica en

cuestión de días. Los principales síntomas causados por la infección de E.Coli

provocan: dolores abdominales, diarrea intensa, fiebre, vómitos y mareos

(MayoClinic, 2018).

Un elevado porcentaje de los pacientes se rehabilitan en diez días, aunque en

varios casos el paciente enfermo desarrolla el llamado Síndrome Hemolítico

Urémico (SHU), un problema que produce anemia por la destrucción de los

glóbulos rojos e insuficiencia renal súbita. El resultado puede ser un deterioro

renal crónico o incluso el fallecimiento.

Este síndrome se caracteriza porque produce insuficiencia renal,

trombocitopenia y anemia hemolítica. Se encuentra presente en el 16% de los

pacientes que experimentan colitis hemorrágica, siendo los niños (menores de 5

años), ancianos y personas inmunodeprimidas quienes son más propensos a

padecerla, las personas adultas también tienden a desarrollar síndrome urémico

hemolítico provocada por una infección de E. coli o de otro tipo.

Otros síntomas de tipo extra intestinal también han sido reportados, tales

como: Accidentes cerebro vascular, edema cerebral, convulsiones, derrame

pleural, sobrecarga de líquidos y síndrome disneico en adultos

22

La púrpura trombocitopenia trombótica (TTP) es otra consecuencia potencial

del contagio con un sistema productor de toxina Shiga. Es común en individuos

adultos (especialmente ancianos) y aunque sus síntomas son similares al SUH,

se diferencia de ésta en el grado relativo de insuficiencia renal, ya que es menos

probable que causen daño renal, pero afecta con mayor intensidad al SNC

(accidente cerebro vascular, convulsiones, coma) resultando en muchos casos

mortal para el individuo (Salgado, 2015).

II.4.5. Periodo de incubación

El periodo de incubación de la enfermedad provocada por la ECEH O157:H7

va de 1 a 16 días. La mayor parte de las infecciones se manifiestan después de

3 a 4 días; por otra parte, el tiempo medio de incubación fue de 8 días en un

brote sucedido en una institución (OMS, 2017).

II.4.6. Duración de la enfermedad y tratamiento

La enfermedad tiende a durar entre 5 a 10 días después del periodo de

incubación y se trata únicamente cuando los síntomas que presenta el paciente

son: fiebre leve o ausente, disentería intensidad variable y calambres

abdominales. Cuando el paciente desarrolla SUH o PTT su tiempo de duración

es de 1 a 2 semanas, pero no hay que descartar un tiempo de prolongación en

casos más severo.

Los antibióticos son controvertidos y, generalmente, se los evita:

aparentemente, no alivian los síntomas, no previenen las complicaciones ni

reduce la expansión, y tiende a incrementar el nivel de presentar SUH. El empleo

23

de agentes que reducen la motilidad (antidiarreicos) en la colitis hemorrágica

puede aumentar el riesgo de brotar SUH. Las personas con alteraciones pueden

requerir de forma inmediata cuidados intensivos, incluyendo transfusión, infusión

de plaquetas y diálisis (Carpio, 2014).

II.4.7. Toxina Shiga

Las cepas STEC son productoras de potentes citotoxinas las cuales se

denominan toxinas Shiga (también conocidas como vero citotoxinas) Stx1, Stx2,

las cuales una vez estén libres en el intestino acceden a la circulación sanguínea

y provocan daños a nivel del endotelio vascular. La gravedad de las

enfermedades originadas, particularmente cuando afectan a la niñez, y las bajas

dosis infecciosas que caracterizan no sólo a los brotes sino también a los casos

con poca frecuencia (menos de 100 UFC/g), ha permitido clasificarlo como uno

de los patógenos contaminantes por los alimentos de elevado riesgo para la

salud pública (Marcozza, Marucci, Sica, & Alvarez, 2006).

Stx corresponde a una familia de proteínas estructural y funciona en

vinculación con la toxina Shiga producida por la Shigella dysenteriae. Ellas son

nombradas por un número o una combinación de letras y números. La toxina

Shiga tipo 1 (Stx1) presenta inoportunamente un sólo aminoácido con la toxina

Shiga de S. dysenteriae, mientras que la tipo 2 (Stx2) tiene solo 56% de identidad

con Stx12. Además, existen variantes de Stx2 que son más virulentas en el ser

humano, como es el caso de Stx2c y varias formas de Stx2d, que podrían ser

activadas por la elastasa en el mucus humano, la producción de Stx2 aumenta

el riesgo de SUH.

24

Si una persona ingiere alimentos contaminados, la toxina shiga de este

patógeno se combina y entra en contacto con las células endoteliales, actuando

sobre los glóbulos blancos de la submucosa, generando una respuesta

inflamatoria y un aumento de la expresión del receptor (Gb3). Una vez que la

subunidad B se encuentra unido al receptor de membrana, la subunidad A de la

Stx se suma a la célula por pinocitosis.

Si bien la citotoxicidad de Stx está enlazada a la expresión del receptor Gb3

en la superficie celular, la sensibilidad de una célula a la toxina no sólo se enlaza

con la cantidad de Gb3 expresado en su superficie sino también con la estructura

del receptor (Pistote Creydt, Virginia; Nuñez, Pablo; Brccoli, Javier; Silberstein,

Claudia; Zotta, Elsa; Goldstein, Jorge; Ibarra, Cristina; 2006).

II.4.8. Locus Lee

El locus de borrado de enterocitos (LEE) es una isla de patogenicidad de 35.6

kb insertada en el genoma de algunas bacterias como Escherichia coli

enteropatógena, E. coli enterohemorragica, citrobacter, rodentium y Escherichia

coli. LEE abarca los genes responsables de causar lesiones adjuntas y borradas,

una lesión característica que implica la adhesión íntima de bacterias a los

enterocitos.

Está compuesto por 41 marcos de lectura abiertos y cinco operones

principales que codifican un aparato de sistema tipo tres, proteínas secretadas,

una adhesina, llamada intimina, y su receptor llamado receptor de intimina

translocado (Tir).

25

Estos locus están conformados por 5 operones, de las cuales el LEE1, LEE2

y LEE3 codifican para un sistema de secreción de tipo III “SST3” (Palma, 2015).

El sistema SST3 se encarga de transportar las diversas proteínas efectoras

hacia la célula diana. Este sistema está constituido por 20 genes no es único de

ECEH, sino de otras bacterias gram negativas como Hafnia Alvei y Citrobacter

rodentium que también lo usan para contagiar y conllevar a una infección a

plantas, humanos y animales. Poseen diversas series de chaperonas, las cuales

permiten a las proteínas efectoras ser más eficiente, de esta manera mejora el

reconocimiento y estabilidad del sustrato.

II.4.9. Diversos factores de virulencia de ECEH.

Existen otros factores que utilizan estas bacterias para afectar al ser humano,

pueden encontrarse codificados en el genoma bacteriano. Estos factores se

pueden dividir en 6 grupos: proteasas, toxinas, fimbrias, factores necrotizantes,

adhesinas no fimbriales y proteínas efectoras.

Toxinas: La enterohemolisina (HylA) es una toxina elaborada por las cepas

SETC, que tiene como función lisando los grupos hemos de las células

eucariotas.

Fimbrias: Estas presentan distintos tipos de fimbrias en E. coli las cuales

ayudan a colonizar la célula enteritica.

Factores necrotizantes: Existen tres tipos de factores necrotizante: CNF1,

CNF2 y CNF3 (Garcia, 2016).

26

Adhesinas no fimbrilares: dentro de las adhesinas no fimbriales se

encuentran: el factor inhibidor del ciclo celular (Cif), proteína capaz de bloquear

el ciclo celular.

Proteasas: Se describieron distintos tipos de proteasas, las cuales fueron: la

catalasa/peroxidasa (KatP), la metaloproteasa (StcE) o la serin proteasa (EspP).

II.5. Epidemiologia

La E.coli elabora grandes cantidades de una o más toxinas, las cuales causan

daños severos en la mucosa intestinal, la enfermedad aguda causada por la

bacteria Escherichia coli O157:H7 se denomina Colitis hemorrágica.

Su intoxicación generó una gran alerta a nivel internacional por la cantidad de

seres humanos afectados y por el sin número de formas de contagio ya

identificados (vegetales, aguas, alimentos ácidos, aguas de consumo), lo que

llevó a la Organización mundial de la salud a estimular y procrear campañas de

prevención y control.

Las EHEC constituyen más de 100 serotipos que son productoras de toxina

Shiga y toxinas similares a Shiga (E. coli productoras de toxina Shiga [STEC]).

La E. coli O157:H7 es la STEC básicamente más conocida en América del Norte.

Por otra parte, los serotipos de STEC no O157 (especialmente O26, O45, O91,

O103, O111, O113, O121, O128 y O145) tienden y/o pueden provocar

enfermedades enterohemorrágicas, sobre todo en los exteriores de los EE.UU.

La infección dada por E. coli O157:H7 es capaz de presentarse en seres

27

humanos de todas las edades, aunque los cuadros clínicos de mayor gravedad

son más regulares en niños y en ancianos.

La Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) es un serotipo de E. coli

patógenas, que provocan disentería o diarrea hemorrágica en las personas. En

ciertos casos, la disentería hemorrágica conlleva a provocar el síndrome urémico

hemolítico (SUH), un factor muy importante para causar insuficiencia renal aguda

en infantes, morbilidad y mortalidad en personas adultas. En las personas de la

tercera edad la tasa de letalidad por el SUH puede elevarse al 50%.

Las naciones en las que hay mayores problemas de estas infecciones por

ECEH, sobre todo el serotipo O157:H7, son EE.UU., Argentina y Nueva Zelanda.

Es posible que se deba a los malos hábitos alimenticios, tales como el

incremento diario en la dieta de cantidades abundantes de carnes rojas

(Argentina) o el exceso de las comidas rápidas (EEUU). Sin embargo, en la

última década se están infiltrando infecciones asociadas al consumo de

hortalizas.

En Australia las infecciones por ECEH no-O157, fundamentalmente O111,

son más comunes que las de O157. Respecto a Latinoamérica, en Colombia se

comunicó en forma preliminar que E. coli O157:H7 fue el patógeno responsable

del 7,2% de los casos de diarrea y que el 6,5% del ganado era portador de este

patógeno. En Chile y Argentina, ECEH O157 y no-O157 está asociado a casos

de colitis y SUH. Durante el año 2002, se informó el primer caso que vincula a E.

coli O157:H7 con episodios de diarrea sanguinolenta o SUH en Uruguay

(Astudillo, 2014).

28

II.6. Prevención

La prevención y control requieren un enfoque en la producción animal y vegetal,

así como enfoques relacionados en peligro a lo largo de la cadena de provisión

de alimentos. Éstos incluyen la aplicación de, Buenas Prácticas de Fabricación

(BPF), Buenas Prácticas Agrícolas (BPA), Análisis de Peligros y de Puntos

Críticos de Control (APPCC), Buenas Prácticas de Higiene (BPH), desde la

granja hasta llegar al consumidor.

La publicación conjunta FAO/FIL “Guía de Buenas Prácticas en Explotaciones

Lecheras” y el manual FAO “Buenas Prácticas para la Industria de la Carne”, así

como la fabricación de elementos de capacitación y programas de intervención

para la creación de capacitaciones en cuanto a la manipulación y la producción

de la leche y controles de calidad, son algunos ejemplos de las iniciativas de la

FAO para ayudar a evitar las infecciones por E. coli (Org, 2016).

Figura 1: Síndrome clínicos provocados por Eschercihia Coli patógenas (Molina, 2015).

29

Existen diferentes tipos de prevención de E.Coli:

La forma más sencilla para prevenir la propagación es un cuidadoso lavado

de las manos, antes de preparar los alimentos, después de manipular carne

cruda, después de la preparación de alimentos.

Cocción completa de todos los alimentos derivados de animales,

especialmente la carne molida.

Colocar un termómetro para afianzar que la temperatura interna de cocido es

correcta. La temperatura correcta es de 160 grados Fahrenheit para la carne

de res y cerdo, y de 185 grados para las aves.

II.7. Tratamiento

En la actualidad no existen tratamientos por la infección de E. coli, en la

mayoría de los casos el tratamiento consiste en: descanso y consumo excesivo

de agua para prevenir la deshidratación y la fatiga (Campos D. A., 2018).

Es prohibido el consumo de medicamentos antidiarreicos, pues desaceleran el

sistema digestivo y no le permiten al cuerpo deshacerse de las toxinas. En

términos generales no se recomiendan los antibióticos porque tienden a

aumentar el riesgo de complicaciones graves (Campos D. A., 2018).

II.8. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7

Wellcolex E.Coli O157:H7 es un ensayo de aglutinación de latex para la

posible identificación de los aislados de Escherichia coli O157:H7 en medios de

30

laboratorio. El ensayo contiene dos reactivos: el reactivo del ensayo O157 está

formado por partículas de látex de color rojo recubiertas de anticuerpos

específicos frente al E. coli tipo O157. Si se mezcla una gota del reactivo con

una suspensión de organismo de E. coli en una tarjeta de reacción (efecto), se

produce una aglutinación rápida debida a la interacción de las IgG específicas y

del antígeno lipopolisacarido del tipo O157.

De forma parecida, el reactivo del ensayo H7 está formado por partículas de

latex de azul recubiertas de anticuerpos específicos frente a E. coli tipo H7.

31

Glosario

Intoxicaciones alimentarias. - Son las manifestaciones clínicas de toxicidad

consecuente a la exposición a sustancias tóxicas transmitidas por alimentos tanto

sólidos como líquidos, la intoxicación ocurre tras la ingestión de alimentos contaminados

con sustancias orgánicas e inorgánicas, tales como: venenos, toxinas, agentes

biológicos patógenos, metales pesados, etc (Cortés, 2011).

Pinocitosis: Es un tipo de endocitosis que consiste en la captación de material del

espacio extracelular por invaginación de la membrana citoplasmática. Con desunión

hacia el interior celular de una vesícula que contiene líquido con posibles moléculas

disueltas o partículas sólidas en suspensión (Doctissimo, 2017).

Serotipo. - Tipo de microorganismo infeccioso clasificado según los antígenos que

presentan en su superficie celular. Los serotipos permiten diferenciar organismo nivel

de subespecie, algo de gran importancia en epidemiología (Sánchez, 2013).

Síndrome urémico hemolítico. - Es un trastorno que ocurre generalmente cuando una

infección en el aparato digestivo produce sustancias toxicas. Estas sustancias toxicas

destruyen los glóbulos rojos, causando lesión a los riñones.

Serotipificación.- Proceso que permite determinar y distinguir las especies de bacterias

en antígenos que comparten.

https://es.wikipedia.org/wiki/Endocitosis

https://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_citoplasm%C3%A1tica

https://es.wikipedia.org/wiki/Ves%C3%ADcula_(biolog%C3%ADa_celular)

https://www.saludymedicinas.com.mx/

32

III. CAPITULO III

Materiales y Métodos

III.1. Metodología

La realización del presente trabajo investigativo, corresponde a la

identificación de E.Coli O157:H7 en carne bovina molida expendida en los

Mercados de la zona 1, zona 2 y zona 3 de la ciudad de Guayaquil. Se

recolectaron un total de 100 muestras: 35 muestras de carne molida de res en

El Mercado de la zona 3, 15 muestras en el Supermercado de la zona 2 y 50

muestras en el Mercado de la zona 3.

III.2. Tipo de Investigación

Descriptivo con un enfoque cuantitativo.

III.3. Diseño de Investigación

El presente estudio es de tipo no experimental de corte transversal, debido a que

la recolección de los datos fue en un tiempo determinado.

III.4. Población y Muestra

La población y/o lugar de estudio se realizó en los mercados: de la zona 1, zona

2 y zona 3 de la ciudad de Guayaquil. El muestreo fue de tipo no aleatorio en los

meses: noviembre y diciembre del año 2018, recolectándose un total de 100

muestras durante este periodo de tiempo.

33

III.5. Tiempo de Investigación.

El presente trabajo de investigación fue realizado en 2 meses, específicamente

en los meses de noviembre y diciembre del año 2018.

III.6. Lugar de investigación

Se procedió con la recolección de las muestras en los mercados de la zona 1,

zona 2 y zona 3, trasladando las muestras para posterior investigación en el

laboratorio de microbiología de alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas

de la Universidad de Guayaquil.

III.7. Materiales y Equipo

Material de campo

● Fundas herméticas

● Hielera

● Rotulador (Marcador)

Materiales para el Laboratorio:

● Tubos de ensayo

● Cajas Petri

● Algodón

● Guantes

● Cofia

● Espátula

● Asa Microbiológica

● Mandil

34

Tabla III: Reactivos, funciones y sus marcas.

Reactivo Función Marca

Agar agua de

peptona

Medio de enriquecimiento no selectivo utilizado

para recuperar células de enterobacterias

dañadas

BD

Agar rojo-bilis

neutro cristal

violeta

Medio de cultivo de microorganismos, tanto

selectivo. Como diferencial. Que se usa para la

identificación y enumeración de coliformes

BD

Pruebas

bioquímicas

Medios utilizados para pruebas bioquímicas

aplicados a medios biológicos en los cuales es

conocida su reacción, nos permiten identificar

distintos microorganismos presentes.

BD

Agar TSI Medio universalmente empleado para la

diferenciación de enterobacterias

BD

Agar soya

tripticasa

Medio de cultivo recomendado para la

recuperación y aislamiento de toda clase de

bacterias, Gram-positivas t Gram-negativas

aerobias.

BD

Agua libre de

iones

Solvente empleado para disolver los medios de

cultivo.

--

Alcohol Potable Solvente utilizado para desinfectar el área de

trabajo

Ecuainsum

os

Fuente: Realizado por sus autores.

35

Tabla IV: Equipos

Equipo Función

Balanza digital Pesar muestra.

Incubadora Crecimiento y almacenamiento de cultivos

Bacterianos.

Micropipetas Empleado para absorber y transferir

Pequeños volúmenes de líquidos.

Vortex Homogenizador de soluciones.

III.8. Flujograma para el aislamiento e identificación de O157:H7

Pesar la muestra Homogenizacion de

la Muestra

Siembras en : Agar Rojo bilis Cristal-

Violeta

Cultivo en Agar TSIPruebas

Bioquimicas

Siembra de colonias de E.coli en Soja

Tripticasa

Identificacion de E.coli O157:H7

mediante el ensayo Wellcolex

Obtencion de Resultados

Figura 2: Secuencia de análisis.

36

Procedimiento.

La presente investigación sobre la E. coli O157:H7 causante del Síndrome

Urémico Hemolítico (SUH) y problemas renales se realizó en el laboratorio de

microbiología de alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad de Guayaquil. Las muestras recolectadas fueron inicialmente

obtenidas y rotuladas de los 10 sitios de ventas del mercado de la Zona 1, Zona

2 y Zona 3. Posteriormente se las colocó en una hielera para el traslado al

laboratorio de microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad de Guayaquil. En el laboratorio se procedió a pesar la muestra,

realizar la dilución correspondiente en agua de peptona, homogenizar y sembrar

en agar rojo bilis neutro cristal violeta de acuerdo a la norma AOAC 991.14. Para

la posterior identificación y aislamiento de E. coli se realizaron pruebas

bioquímicas y se conservaron las cepas de E. coli en Agar soya tripticasa para

posterior sub-tipificacion la cual fue realizada en el Centro de Investigaciones

Microbiológica (CIM) del Dr. Henry Parra.

III.9. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7

Wellcolex E.Coli O157:H7 es un ensayo de aglutinación de latex para la

posible identificación de los aislados de Escherichia coli O157:H7 en medios de

laboratorio. El ensayo contiene dos reactivos: el reactivo del ensayo O157 está

formado por partículas de látex de color rojo recubiertas de anticuerpos

específicos frente al E. coli tipo O157. Se mezcla una gota del reactivo con una

suspensión de organismo de E. coli en una tarjeta de reacción, se produce una

37

aglutinación rápida debida a la interacción de las IgG específicas y del antígeno

lipopolisacarido del tipo O157.

De forma parecida, el reactivo del ensayo H7 está formado por partículas de latex

de azul recubiertas de anticuerpos específicos frente a E. coli tipo H7.

Sensibilidad y Especificidad.

Se estimó que la sensibilidad del ensayo Wellcolex E. coli O157 con este grupo

de cultivos es del 100% (12/12) con un límite inferior de confianza del 95% -

98,8%.

Se estimó que la especificidad del ensayo Wellcolex E. coli O157 con este grupo

de cultivos es del 99,7% (12/12) con un límite superior e inferior de confianza de

95% del 98,2% y del 99,9%, respectivamente.

Limitaciones del Ensayo

● Solo se debe analizar colonias que estén bien aisladas. Los cultivos positivos se

deben identificar mediante pruebas bioquímicas para confirmar la presencia de

E. coli y se deben analizar para detectar la producción de verocitoxina.

● Ni el agar MacConkey con sorbitol, ni este ensayo pueden confirmar que un

aislado contenga una cepa que produce verocitotoxina. No todos los aislados

que producen Verocitotoxina pertenecen al serotipo O157 ni todos los aislados

O157 producen verocitototxina.

38

● Se debe tener cuidado cuando se analicen cultivos de E. coli O157 para detectar

el antígeno H7. Las E. coli varían en su expresión de los antígenos flagelares y

los aislados inicialmente negativos en un ensayo serológico para detectar el

antígeno H se debe volver a analizar después de haber estado en medios

apropiados para aumentar la motilidad antes de concluir que no expresan

sensibilidad y especificidad de la prueba.

39

IV. CAPÍTULO IV.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

IV.1. Técnica de recolección de información.

El análisis estadístico se realizó utilizando el programa SPSS versión 22.

Gràfica: 1 Presencia de Coliformes Totales y E.coli en muestras de carne molida bovina

De acuerdo con la gráfica 3 se puede observar que, del total de muestras

analizadas un 12% corresponde a E. coli, mientras que el 88% restante pertenece a

otros microorganismos coliformes totales: Klebsiella pseumoniae, Klebsiella oxytoca,

Proteus mirabilis y Providencia morgani

Tabla V: Presencia de otros microorganismos en las muestras analizadas.

N: 100

Escherichia Coli 12%

Otros microorganismos

Klebsiella Pneumoniae 22%

Klebsiella oxytoca 30%

Proteus mirabilis 24%

Providencia morgani 12%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Escherichia Coli OtrosMicroorganismos

Escherichia Coli

40

Gràfica: 2 Presencia de Coliformes Totales en carne molida expendida en los

Mercados de la Zona 1, Zona 2 y Zona 3 de la Ciudad de Guayaquil

De acuerdo a la gráfica 2 en relación a la presencia de otros Microorganismos se

encontró que un 12% correspondió a Escherichia coli, un 88% restante pertenece a otras

bacterias como: Klebsiella pneumoniae (22%), Klebsiella oxytoca (30%), Proteus

mirabilis (24%) y Providencia morgani (12%).

Microorganismos

Escherichia Coli klebsiella pneumoniae

klebsiella oxytoca Proteus mirabilis

Providencia morgani

41

Tabla VI: Escherichia Coli 0157:H7 obtenidas mediante el ensayo Wellcolex

Látex.

Muestra Escherichia Coli Eschercihia Coli

O157:H7

21 + +

22 + -

23 + -

25 + +

54 + -

81 + -

82 + -

86 + -

91 + -

92 + -

94 + -

96 + +

De acuerdo a la tabla VI se aislaron 12 muestras de Escherichia coli, las cuales se

serotipificaron mediante el método Wellcolex látex, dando como resultados positivos

para E.coli O157:H7 las muestras: 21, 25 y 96. La muestra 21 y 25 pertenecían al

Supermercado de la zona 2 y la muestra 96 al Mercado de la zona 1.

42

La siguiente gráfica indica que las 3 cepas de E. Coli O157:H7 encontradas mediante el

ensayo de wellcolex látex representan en 20% y las cepas de E.coli representan un

80%.

Gráfica: 4 Evaluación de las condiciones de expendio de la carne molida en los

mercados de estudio.

100 93%

90

80

70

60

50

40

30

20 7%

10

0

Refrigeración (4°C) Temperatura ambiente

.

80%

20%

Escherichia coli

Escherichia coli Escherichia coli O157:H7

Gráfica: 3: Serotipo O157:H7 encontrados en Cepas de Escherichia coli aisladas

43

Tabla VII: Conservación del producto

Local Nº Nº de muestras a Nº de muestras a

4°C 28°C

1 7 3

2 0 10

3 0 10

4 0 10

5 0 10

6 0 10

7 0 10

8 0 10

9 0 10

10 0 10

En la presente tabla VII se observa las condiciones de venta de la carne

de Acuerdo a la temperatura de exposición, 1 de 10 locales expende carne a 4

℃, mientras que los locales restantes, expenden carne a temperatura Ambiente,

el 93% de los locales expenden las carnes a temperatura ambiente.

44

CAPITULO V.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

V.1. Conclusiones

En el presente trabajo de investigación se pudo detectar la presencia de

coliformes totales, utilizando el método oficial AOAC 991.14. De las 100

muestras analizadas se detectó el siguiente porcentaje de microorganismos: un

12% corresponde a Escherichia coli, mientras que el 88% restante pertenece a

otros microorganismos coliformes totales: Klebsiella pseumoniae (22%),

Klebsiella oxytoca (30%), Proteus mirabilis (24%) y Providencia morgani (12%).

De las muestras analizadas en su totalidad estaban compuestas de

coliformes totales, por ende el estudio detectó una frecuencia alta de agentes

microbianos, principalmente Escherichia coli, y otras bacterias como: Klebsiella

pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis y Providencia morgani.

Se obtuvieron 12 cepas positivas para E. coli las cuales posteriormente se

procedieron a un análisis de serotipificacion – subtipificacion, dando como

resultados 3 cepas positivas para E. coli O157:H7.

45

V.2. Recomendaciones

Al haberse detectado por primera ocasión en el país, una cepa de E.coli

O157:H7 en alimentos se hace necesario continuar con el estudio y proceder con

el análisis molecular para la determinación de la producción de la verotoxina,

causante del Síndrome urémico hemolítico y daño renal.

Una vez confirmada por Biología Molecular la presencia de Verotoxina en las

cepas de E.coli O157H7, proceder a reportar a las autoridades de Salud, la

presencia en el País de la cepa E.coli O157H7, para establecer las BPM como

Norma Obligatoria para este Microorganis

Se debe implementar la vigilancia, rigurosidad y el control de las autoridades

pertinentes para evaluar los lugares de expendio y evitar incidencia del síndrome

urémico hemolítico (SUH) y problemas renales en el País.

Se podría continuar con el estudio, analizando la posible relación que pueda

existir en los casos de insuficiencia renal con la ingesta de carnes contaminadas

y mal cocidas.

46

V. BIBLIOGRAFÍA

Apray, L. A. (2008). Transposones: Los genes saltantes. Educación de la

Naturaleza. Obtenido de

https://www.nature.com/scitable/topicpage/transposons-the-jumping-

genes-518

Araneda, I. M. (20 de 4 de 2018). Edualimentaria.com. Obtenido de

http://www.edualimentaria.com/carnes-cecinas-composicion-propiedades

Astudillo, D. Z. (2014). Escherichia coli O157:H7. Aspectos generales. 8-10.

Ayala, D. G. (21 de 2 de 2015). Organizacion Panamericana de la Salud.

Obtenido de

http://new.paho.org/arg/publicaciones/publicaciones%20virtuales/libroET

As/modulo2/modulo2s.html

Campos, D. A. (24 de 2 de 2018). Tratamientos para la E.coli. Obtenido de Evita

tomar medicamentos antidiarreicos, pues desaceleran el aparato

digestivo y no le permiten al cuerpo deshacerse de las toxinas. En general

no se recomiendan los antibióticos porque pueden aumentar el riesgo de

complicaciones graves.

Campos, N. (16 de 6 de 2016). Microbiologia.Com. Obtenido de

http://www.binasss.sa.cr/revistas/rccm/v16n3/art8.pdf

47

Carpio, I. G. (3 de 5 de 2014). Foodsafety.gov. Obtenido de

https://espanol.foodsafety.gov/intoxicaci%C3%B3n/causas/bacteriasvirus

/ecoli/x3p/%C3%ADndice.html

FAO. (5 de Marzo de 2015). Oranizacion de las Naciones Unidas para la

Alimentacion y la Aricultura. Obtenido de

http://www.fao.org/ag/againfo/themes/es/meat/backgr_composition.html

Farfán, D. A. (16 de 6 de 2016). Scielo. Obtenido de

https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-

10182016000400009

Garcia, D. A. (2016). Mecanismos de virulencia de Escherichia coli

enteropatógena. Universidad de Santander, 10-12.

Gonzales, I. C. (5 de 6 de 2015). Obtenido de

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm

Green, E. D. (2014). National Human Genome Research Institute. Obtenido de

https://www.genome.gov/glossarys/index.cfm?id=155

INEN. (5 de 1 de 2013). Servicio Ecuatoriano de Normalización . Obtenido de

file:///C:/Users/PRINCIPAL/Desktop/nte_inen_1346-2.pdf

Marcozza, M. A., Marucci, P. L., Sica, M. G., & Alvarez, E. E. (2006). Detección

de Escherichia coli O157:H7 en carne picada fresca y hamburguesas

congeladas. Revista argentina de microbiologia.

Martinez Castillo, A. (17 de Julio de 2015). Dipòsit Digital de la Universitat de

Barcelona. Obtenido de http://diposit.ub.edu/dspace/handle/2445/68481

48

MayoClinic. (15 de 12 de 2018). Mayoclinic.org. Obtenido de

https://www.mayoclinic.org/es-es/diseases-conditions/e-coli/symptoms-

causes/syc-20372058

Mc Grath, S., & van Sinderen, D. (2007). Bacteriofago genética y biología

molecular. Irlanda: Caister Academic Press.

Molina, D. J. (3 de 8 de 2015). Universidad Nacional Autonoma de Mexico .

Obtenido de

http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/escheric

hia-coli.html

OECD and Food and Agriculture Organization of the United Nations. (6 de

Octubre de 2017). OECD iLibrary. Obtenido de https://www.oecd-

ilibrary.org/agriculture-and-food/ocde-fao-perspectivas-agricolas-2017-

2026_agr_outlook-2017-es

OMS. (4 de 6 de 2017). Obtenido de http://www.who.int/es/news-room/fact-

sheets/detail/e-coli

OMS. (2018). Obtenido de

http://www.who.int/topics/escherichia_coli_infections/es/

Org. (2016). Prevencion de la E.Coli en alimentos. FAO, 1-3. Obtenido de

http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.

pdf

Palma, D. M. (2015). Locus de borramiento de enterocito. Biomedic Research

Internacional, 16-18.

49

Pistote Creydt, Virginia; Nuñez, Pablo; Brccoli, Javier; Silberstein, Claudia; Zotta,

Elsa; Goldstein, Jorge; Ibarra, Cristina;. (2006). PAPEL DE LA TOXINA

SHIGA EN EL SINDROME UREMICO HEMOLITICO. Laboratorio de

Fisiopatogenia, Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina,

Universidad de Buenos Aires, 11-15.

Ripodas Navarro, f. M. (18 de 7 de 2017). Investigación de Escherichia Coli

productor de toxinas Shiga (STEC) en carnes y derivados cárnicos.

Obtenido de

http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1887-

85712017000300147

Rodriguez, G. A. (2015). Principales características y diagnóstico de los grupos

patógenos de Escherichia coli. Instituto Nacional de salud publica , 464-

475.

Salgado, D. A. (3 de 4 de 2015). MayoClinic.org. Obtenido de

https://www.mayoclinic.org/es-es/diseases-conditions/e-coli/symptoms-

causes/syc-20372058

Shado, D. P. (6 de 4 de 2017). Kham Academy. Obtenido de

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-

sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr

Velez, I. J. (7 de 5 de 2015). Carnes y Derivados . Obtenido de

https://tematico8.asturias.es/export/sites/default/consumo/seguridadAlim

entaria/seguridad-alimentaria-documentos/carnes.pdf

50

ANEXOS

51

TSI SIM

UREA Bacteria Muestras

Pico/ Fondo Producción Movilidad Indol Producción

de Citrato

de SH2 Identificada

Nº

Gas

SH2

Simmons

1 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis









10 Ácido/ Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis

Anexo 1. Tabla de los resultados del análisis microbiológico para E. coli en el mercado Caraguay, El Coral y Sauces IX de la Ciudad de Guayaquil

52









19 Alcalino/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis


21 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli

22 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli


53


25 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli

26 Ácido/ Ácido + + + - + + + Proteus mirabilis



29 Alcalino/Ácido - - + + + - + Providencia

morgani

30 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia

morgani


morgani


morgani


morgani


morgani


morgani

54


morgani


morgani

38 Ácido/ Ácido - - + + + - +

Providencia

morgani


morgani


morgani

41 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae







55







54 Alcalino/Ácido + - - + + - - Escherichia coli

55 Alcalino/Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae



58 Alcalino/Ácido + - + - - - + Providencia morgani

59 Alcalino/Ácido + - + - - - + Proteus mirabilis


61 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca

56



64 Ácido/ Ácido + - + - - - - Klebsiella pneumoniae












57




79 Alcalino/Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca











58







96 Ácido/ Ácido + - - + + - + Escherichia coli





59

Anexo 1: Lista de chequeo para la inspección de los sitios de venta.

Mercado: Zona 1 Fecha: 9/11/2018

Local Nº

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Los operadores utilizan mandil visualmente limpio

X

Los mesones están en buen estado para expender la carne

X

Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias

X

Existe suficiente espacio para almacenar la mercadería que ingresa

X

La carne molida se mantiene en refrigeración

X

El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla

X

Los desagües y cañerías aparentan estar en buen estado

X

Los utensilios y/o maquinarias para moler la carne están debidamente aseadas y aptas para el proceso

X

60

Mercado:Zona 2 Fecha: 13/11/2018

Local Nº

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Los operadores utilizan mandil visualmente limpio

X

Los mesones están en buen estado para expender la carne

X

Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias

X

Existe suficiente espacio para almacenar la mercadería que ingresa

X

La carne molida se mantiene en refrigeración

X

El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla

X

Los desagües y cañerías aparentan estar en buen estado

X

Los utensilios y/o maquinarias para moler la carne están debidamente aseadas y aptas para el proceso

x

61

Anexo 2: Resultados de la serotipificación de Escherichia coli

65

Anexo 3: Tabla bioquímica de identificación de microrganismos más comunes (Carpio, 2017).

66

Protocolo de trabajo para la preparación de medios de cultivo

1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable...

2. Encender el mechero de Bunsen.

3. Disolver 25,5g de agar agua de peptona en 1 L de agua destilada.

4. Agitar hasta disolución completa.

5. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva

por un minuto para disolver completamente el medio

6. Distribuir volúmenes de 90 ml y 9 ml en recipientes apropiados.

7. Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos

1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol.


3. Suspenda 9.77 g del medio en 255 ml de agua esterilizada.


por un minuto para disolver completamente el medio.

5. NO COLOQUE EN EL AUTOCLAVE.

6. Permita el enfriamiento del medio hasta que alcance una

temperatura entre 45–50°C y dispénselo en placas estériles.

Anexo 5: Preparación de agar bilis rojo neutro cristal violeta

Anexo 4: Preparación de agar agua de peptona

67

1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.

2. Encender el mechero de Bunsen

3. Suspenda 3.6 g de agar soya tripticasa en 90 ml de agua destilada



5. Trasvasar la solución a una fiola de 100 ml.

6. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.

7. Añadir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo

que el agar tome forma de pico de flauta.



3. Disolver 2.79 g de agar SIM en 90 ml de agua destilada.







Anexo 6: Preparación de agar soya tripticasa.

Anexo 7: Preparación de agar SIM

68



3. Suspender 2.07g de agar Citrato Simmons en 90 ml de agua destilada

4. Calentar manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva






1. Suspenda 3,87 g del medio deshidratado por cada 100 ml de agua

destilada.

2. Disolver sin calentar y autoclavar a 121ºC por 15 minutos

3. Transferir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de

modo que el agar tome forma de pico de flauta.


2. Encender el mechero de Bunsen

3. Suspender 10 g de carne molida en 90 ml de agua de peptona

4. Agitar constantemente por 1 minuto

Anexo 8: Preparación de agar Citrato Simmons.

Anexo 9: Preparación de agar Ureasa.

Anexo 10: Preparación y siembra de la muestra.

69

5. Transferir alícuotas de 1 ml en tubos que contengan 9 ml de agua

de peptona.

6. Agitar los tubos de ensayo y colocar 1 ml de la dilución en una caja

Petri, estando cerca del mechero.

7. Añadir el medio de cultivo bilis rojo neutro cristal violeta cuando este

haya alcanzado los 40ºC.

8. Agitar por rotación la caja petri y dejar solidificar el agar antes de

incubarla por 12 horas a 37ºC.

9. Sembrar por picadura y estría colonias rojas con halos en Agar TSI

10. Incubar los tubos por 12 horas a 37ºC.

11. En caso de algún crecimiento de colonias presuntivas, sembrar en

pruebas bioquímicas para su diferenciación y confirmación: Úrea

(Siembra por picadura y estría), Citrato (Siembra por picadura y

estría) y Sim (Siembra por Picadura).

12. Incubar de 35 a 37ºC por 24 horas.

13. Analizar los tubos con la ayuda de la tabla de pruebas bioquímicas

para Enterobacterias (Anexo 1)

14. Una vez analizados los resultados, los tubos con presencia

presuntiva de E. coli se siembran por picadura y estría en agar soya

tripticasa para posterior análisis en el Sistema BBL Crystal.

70

Prueba de motilidad: -

1. Tomar una colonia aislada sospechosa de ser Escherichia coli con

un asa estéril.

2. Introducir sobre el centro del tubo con medio de movilidad y formar

una línea de inoculación, hasta una tercera parte del medio.

3. Incubar de 24-48 horas y observar si presenta enturbiamiento.

Producción de indol: Incorporar 2 gotas de reactivo de Kovacs por la pared

interna del tubo (la reacción es inmediata). La formación de un halo rosado

es indicativa de reacción positiva.

Prueba de citrato:

1. Inocular en estría una colonia aislada sospechosa de ser

Escherichia coli en la superficie del medio (pico de flauta).

2. Incubar a 35ºC durante 24-48hr.

Nota: Si el medio se torna de color azul es indicativo de reacción positiva.

Prueba de Urea.




Nota: Si el medio se torna de color rojo rosado es indicativo de reacción

positiva.

Anexo 11: Procedimiento de pruebas bioquímicas.

71

Prueba de citrato:




Nota: Si el medio se torna de color azul es indicativo de reacción positiva.

Nota: Si el medio se torna de color rojo rosado es indicativo de reacción positiva

72

Anexo 12: Homogenización de la muestra

en agua peptonada.

Anexo 13: Preparación de Agar Rojo Bilis- Cristal Violeta

73

Anexo 14: Pruebas Bioquímicas

Anexo 15: Preparación de Agar Citrato Simmons

74

Anexo 16: Escherichia coli obtenidas.

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...

Documents

Transcript of UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...