UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

CARRERA INGENIERÍA AGRONÓMICA

PROPAGACIÓN DE VAINILLA (Vanilla tahitensis) EN

DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO in vitro

AUTOR: ROMEL ROMARIO MACAS SARANGO

TUTORA: ING. AGR. LAURA PARISMORENO RIVAS, MSc.

GUAYAQUIL, ABRIL 2019

DEDICATORIA

A Dios por darme salud y vida para seguir alcanzando mis objetivos.

A mis padres por darme siempre ese apoyo para seguir adelante.

A toda mi familia en general que me han ayudado para terminar mis

estudios.

iii

AGRADECIMIENTO

A Dios por darme un día más de vida para seguir cumpliendo mis

objetivos.

A mis profesores de la Facultad de Ciencias Agrarias que me

compartieron sus conocimientos.

A mi Tutora de Trabajo de Titulación Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas,

MSc. por brindarme su apoyo en mi Trabajo de Titulación.

iv

Guayaquil, 19 de febrero del 2019 Sra. Q. F. NELKA TANDAZO FALQUEZ, MSc.

VICEDECANA (E) DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

Ciudad.

De mis consideraciones:

Envío a Ud. el Informe correspondiente a la tutoría realizada al Trabajo de Titulación

Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de

cultivo in vitro del estudiante Romel Romario Macas Sarango indicando que ha

cumplido con todos los parámetros establecidos en la normativa vigente:

• El trabajo es el resultado de una investigación.

• El estudiante demuestra conocimiento profesional integral.

• El trabajo presenta una propuesta en el área de conocimiento.

• El nivel de argumentación es coherente con el campo de conocimiento.

Adicionalmente, se adjunta el certificado de porcentaje de similitud y la valoración del

trabajo de titulación con la respectiva calificación.

Dando por concluida esta tutoría de trabajo de titulación, CERTIFICO, para los fines

pertinentes, que el estudiante está apto para continuar con el proceso de revisión

final.

Atentamente,

Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc

TUTORA DE TRABAJO DE TITULACIÓN

C.I. 0906233770

CC: Unidad de Titulación

v

CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD

Habiendo sido nombrado Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc., tutora

del trabajo de titulación certifico que el presente trabajo de titulación ha sido

elaborado por Romel Romario Macas Sarango C.C. 1104944069, con mi

respectiva supervisión como requerimiento parcial para la obtención del título

de Ingeniero Agrónomo.

Se informa que el trabajo de titulación: “Propagación de vainilla (Vanilla

tahitensis) en diferentes medios de cultivo in vitro”, ha sido orientado durante

todo el periodo de ejecución en el programa antiplagio (URKUND) quedando

el 9% de coincidencia.

vi

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

FICHA DE REGISTRO DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

TÍTULO Y SUBTÍTULO: Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de cultivo in vitro.

AUTOR: Romel Romario Macas Sarango.

Director del Trabajo de titulación: Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc.

INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil

FACULTAD: de Ciencias Agrarias

CARRERA: Ingeniería Agronómica

FECHA DE PUBLICACIÓN: No de páginas: 50

TÍTULO OBTENIDO: Ingeniero Agrónomo

ÁREAS TEMÁTICAS:

PALABRAS CLAVE: in vitro, explante, rentables. RESUMEN/ABSTRACT

Esta investigación se realizó el 2018, en el Laboratorio de biotecnología AGROVITROPARIS ubicado en la ciudad de Guayaquil-parroquia Pascuales avda. Narcisa de Jesús (Metrópolis II etapa H). Se estudiaron 80 tratamientos como resultado de los diferentes medios de cultivos in vitro utilizados. Se utilizó el diseño completamente al azar con desigual número de repeticiones y arreglo grupal. Para el cálculo estadístico se realizó

el análisis de varianza, con valores transformados a √𝑥 + 0,5 , donde se presentaron

diferencias significativas, se realizó la comparación de medias mediante la prueba de Duncan al 5% de probabilidades. Se evaluaron las siguientes variables: número de entrenudos, número de hojas, longitud de raíces (cm) Color del explante (tabla de Munsell). De acuerdo con los resultados se concluye lo siguiente: 1) El tratamiento de (B5 + BAP + AIB) del grupo 2 alcanzó la mayor longitud de la raíz a los 90 días. 2) La aplicación del tratamiento (MS + BAP + G3) del grupo 1 presentó el mayor número de entrenudos y mayor número de hojas con tres entrenudos y dos hojas respectivamente. 3) Los tratamientos más económicos para la producción de explantes de vainilla, fueron (B5+BAP+ANA y B5+BAP+AIB) del grupo número 2.

No. DE REGISTRO (en base de datos):

No. DE CLASIFICACIÓN:

DIRECCIÓN URL (Trabajo de titulación en la web):

ADJUNTO PDF: x SI NO

CONTACTO CON AUTOR/ES Romel Romario Macas Sarango

Teléfono: 0968833562

E-mail: [email protected]

CONTACTO EN LA INSTITUCIÓN: Nombre: Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas MSc. Teléfono:(042)288040

E-mail: [email protected]

vii

CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR

Habiendo sido nombrado Ing. Arg. Eison Wilfrido Valdiviezo Freire MC,

revisor del trabajo de PROPAGACIÓN DE VAINILLA (Vanilla tahitensis)

EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO in vitro, certifico que el presente

trabajo de titulación, elaborado por Romel Romario Macas Sarango, con

mi respectiva supervisión como requerimiento parcial para la obtención del

título de INGENIERO AGRÓNOMO, en la Carrera Ingeniería Agronómica

de la Facultad de Ciencias Agrarias, ha sido REVISADO Y APROBADO en

todas sus partes, encontrándose apto para su sustentación.

Ing. Arg. Eison Wilfrido Valdiviezo Freire MC.

C.I. No. 0908084320

viii

LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL USO NO COMERCIAL DE LA OBRA CON FINES NO ACADÉMICOS

Yo, Romel Romario Macas Sarango con C.I. No. 1104944069, certifico que los

contenidos desarrollados en este trabajo de titulación, cuyo título es Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de cultivo in vitro, son de mi absoluta propiedad y responsabilidad Y SEGÚN EL Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN*, autorizo el uso de una licencia gratita intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la presente obra con fines no académicos, en favor de la Universidad de Guayaquil, para que haga uso del mismo, como fuera pertinente.

________________________________________ Romel Romario Macas Sarango

C.I. No. 1104944069

RESUMEN

*CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN (registro oficial No. 899-Dic./2016) Art. 114.- De los titulares de derechos de obras creadas en las instituciones de educación superior o centros educativos.- En el caso de las obras creadas en centros educativos, universidades, escuelas politécnicas, institutos superiores técnicos, tecnológicos, pedagógicos, de artes y los conservatorios superiores, e institutos públicos como resultado de actividad académica o de investigación tales como trabajos de titulación, proyectos de investigación o innovación, artículos académicos, u otros análogos, sin perjuicios de que pueda existir relación de dependencia, la titularidad de los derechos patrimoniales corresponderá a los autores. Sin embargo, el establecimiento tendrá una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra con fines académicos.

ix

Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de cultivo in

vitro

Autor: Romel Romario Macas Sarango

Tutora: Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc

Resumen

Esta investigación se realizó el 2018, en el Laboratorio de biotecnología

AGROVITROPARIS ubicado en la ciudad de Guayaquil-parroquia Pascuales

avda. Narcisa de Jesús (Metrópolis II etapa H). Se estudiaron 80

tratamientos como resultado de los diferentes medios de cultivos in vitro

utilizados. Se utilizó el diseño completamente al azar con desigual número

de repeticiones y arreglo grupal. Para el cálculo estadístico se realizó el

análisis de varianza, con valores transformados a √𝑥 + 0,5 , donde se

presentaron diferencias significativas, se realizó la comparación de medias

mediante la prueba de Duncan al 5% de probabilidades. Se evaluaron las

siguientes variables: número de entrenudos, número de hojas, longitud de

raíces (cm) Color del explante (tabla de Munsell). De acuerdo con los

resultados se concluye lo siguiente: 1) El tratamiento de (B5 + BAP + AIB)

del grupo 2 alcanzó la mayor longitud de la raíz a los 90 días. 2) La

aplicación del tratamiento (MS + BAP + G3) del grupo 1 presentó el mayor

número de entrenudos y mayor número de hojas con tres entrenudos y dos

hojas respectivamente. 3) Los tratamientos más económicos para la

producción de explantes de vainilla, fueron (B5+BAP+ANA y B5+BAP+AIB)

del grupo número 2.

Palabras Claves: in vitro, explante, rentables.

x

Author: Romel Romario Macas Sarango

Tutor: Eng. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc

Abstract

This research was carried out in 2018, at the AGROVITROPARIS

biotechnology laboratory located in the city of Guayaquil-Pascuales Avda.

Narcisa de Jesús (Metropolis II stage H). 80 treatments were studied as a

result of the different in vitro culture media used. The design was completely

randomized with an unequal number of repetitions and group arrangement.

For the statistical calculation the analysis of variance was performed, with

values transformed to √𝑥 + 0,5 , where significant differences were

presented, the comparison of means was made by the Duncan test at 5% of

probabilities. The following variables were evaluated: number of internodes,

number of leaves, length of roots (cm) Color of the explant (Munsell table).

According to the results, the following is concluded: 1) The treatment of (B5 +

BAP + AIB) from group 2 reached the longest root length at 90 days. 2) The

application of the treatment (MS + BAP + G3) of group 1 presented the

highest number of internodes and greater number of leaves with three

internodes and two leaves respectively. 3) The most economical treatments

for the production of vanilla explants were (B5 + BAP + ANA and B5 + BAP +

AIB) of group number 2.

Keywords: in vitro, explant, profitable.

xi

ÍNDICE

. Página

I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………..…….1

1.1 Planteamiento del problema…………………………………….....…2

1.2 Formulación del problema………………………………………..…...2

1.3 Objetivos de la investigación……………………………………...….3

1.3.1 Objetivo general…………………………………………..……....3

1.3.2 Objetivos específicos…………………………………………..……...3

1.4 Justificación……………………………………………………………….3

1.5 Hipótesis………………………………………………………………..4

II MARCO TEÓRICO……………………………………………………………5

2.1 Cultivo de vainilla…………………………………………………………5

2.1.1 Generalidades………………………………………………………..5

2.1.2 Origen…………………………………………………………………5

2.1.3 Importancia de la vainilla……………………………………………6

2.1.4 Taxonomía de la vainilla…………………………………………….6

2.1.5 Descripción botánica………………………………………………...7

2.2 cultivos in vitro…………………………………………………………….9

2.2.1 Definición………………………………………………………….…..9

2.3 Medio de cultivo………………………………………………………......9

2.4 Micropropagación………………………………………………………..10

2.5 definiciones generales…………………………………………………..10

xii

Página

2.5.1 Hormonas…………………………………………………………....10

2.5.2 Reguladores de crecimiento……………………………………….10

2.5.3 Factores externos…………………………………………………...17

III. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………....19

3.1 Localización del ensayo………………………………………………....19

3.2 Materiales………………………………………………………………....19

3.2.1 Material tecnológico………………………………………………....19

3.2.2 Material biológico………………………………………………….....19

3.2.3 Material técnico…………………………………………………........19

3.3 Tratamientos estudiados…………………………………………….......20

3.4 Variables estudiadas…………………………………………………......21

3.5 Diseño experimental…………………………………………………..….21

3.6 Metodología………………………………………………………………..22

IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………......26

4.1 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo MS……...26

4.2 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo B5………27

4.3 Número de entrenudos evaluados a los 90 días entre el grupo MS y B5….28

4.4 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo MS…………….31

4.5 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo B5……………..32

4.6 Número de hojas evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5…33

4.7 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo MS……………….35

xiii

Página

4.8 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo B5……………….36

4.9 Longitud de raíz evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5….37

4.10 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo MS………..39

4.11 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo B5………...40

4.12 Color del explantes evaluados a los 90 días entre el grupo MS y B5……41

4.13 Análisis económico……………………………………………………..43

V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……………………………..45

5.1 Conclusiones:…………………………………………………….…...….45

5.2 Recomendación:………………………………………………………....46

VI BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………...…47

ANEXOS…………………………………………………………………………51

xiv

ÍNDICE DE CUADROS DEL TEXTO

Página

Cuadro 1 Descripción de los tratamientos estudiados. 20

Cuadro 2 Esquema de Fuente de Variación y Grados de

Libertad para el análisis de la varianza.

21

Cuadro3 Promedio de número de entrenudos evaluados a

los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in

vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019.

30

Cuadro 4 Promedio de número de hojas evaluada a los 90

días determinados en el cultivo de vainilla in vitro

en diferentes medios de cultivos. UG, 2019.

34

Cuadro 5 Promedio de longitud de raíz a los 90 días

determinados en el cultivo de vainilla in vitro en

diferentes medios de cultivos. UG, 2019.

38

Cuadro 6 Promedio de color de explante a los 90 días

determinados en el cultivo de vainilla in vitro en

diferentes medios de cultivos. UG, 2019

42

Cuadro 7 Análisis económicos de los tratamientos. 44

xv

ÍNDICE DE FIGURAS DEL TEXTO

Página

Figura 1 Número de entrenudos evaluados del grupo MS a

los 90 días mediante la aplicación de diferentes

medios de cultivos in vitro.

27

Figura 2 Número de entrenudos del grupo B5 evaluados a los

90 días mediante la aplicación de diferentes medios

de cultivos in vitro.

28

Figura 3 Número de entrenudos evaluados entre el grupo MS

y B5 a los 90 días mediante la aplicación de

diferentes medios de cultivos in vitro.

29

Figura 4 Número de hojas evaluadas del grupo MS a los 90

días mediante la aplicación de diferentes medios de

cultivos in vitro.

31

Figura 5 Número de hojas evaluadas del grupo B5 a los 90


cultivos in vitro.

32

Figura 6 Número de hojas evaluadas entre el grupo MS y B5

a los 90 días mediante la aplicación de diferentes


33

Figura 7 Longitud de raíces evaluadas del grupo MS a los 90


cultivos in vitro.

35

Figura 8 Longitud de raíces evaluadas del grupo B5 a los 90


cultivos in vitro.

36

xvi

Figura 9 Longitud de raíces evaluadas entre el grupo MS y B5

a los 90 días mediante la aplicación de diferentes


37

Figura 10 Color del explante del grupo MS evaluados a los 90


cultivos in vitro.

39

Figura 11 Color del explante del grupo B5 evaluados a los 90


cultivos in vitro.

40

Figura 12 Color de los explantes de los grupos MS y B5

evaluados a los 90 días mediante la aplicación de

diferentes medios de cultivos in vitro.

41

xvii

ÍNDICE DE CUADROS DEL ANEXOS

Página

Cuadro 1 A Análisis de la varianza de la variable número de

entrenudos con valores transformados √𝑋 + 0,5 a

los 90 días después de la siembra. Guayaquil, 2019.

52

Cuadro 2 A Análisis de la varianza de la variable número de

hojas con valores transformados √𝑋 + 0,5 a

los 90 días después de la siembra. Guayaquil, 2019.

52

Cuadro 3 A Análisis de la varianza de la variable color del explante

con valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días

después de la siembra. Guayaquil, 2019.

53

Cuadro 4 A Análisis de la varianza de la variable largo de raíces

con valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días

después de la siembra. Guayaquil, 2019.

53

xviii

ÍNDICE DE FIGURAS DEL ANEXOS

Página

Figura 1 A Cultivo de vainilla, 2018. 54

Figura 2 A Siembra de plantas madre de

vainilla, 2018.

54

Figura 3 A Obtención de explantes de vainilla,

2018

55

Figura 4 A Explantes de vainillas en los tubos

de ensayos, 2018.

55

Figura 5 A Explantes de vainillas

contaminados, 2019.

56

Figura 6 A Explante de vainilla en desarrollo,

2019.

56

I. INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la vainilla es una de las especias más demandadas a

nivel mundial. Pertenece a la familia de las Orquídeas. Existen

aproximadamente 150 variedades de vainilla en todo el mundo, de las cuales

sólo dos variedades son cultivadas comercialmente, la Vainilla Borbón

(Vanilla planifolia) y la Vainilla de Tahití (Vanilla tahitensis) (Molina, 2017).

Este cultivo pertenece a una especie de orquídea nativa de México, que

se caracteriza por ser una planta hermafrodita y ser la única de la cual se

obtiene un fruto en forma de vaina, que se lo conoce con el nombre “vainilla”

(Torregroza, 2018).

Este dicho nombre fue otorgado por los españoles, quienes decidieron

llamarla así por la forma de su fruto. Sin embargo, esta planta ya era

conocida por los antiguos habitantes (tonacas) con el nombre de Xahanat o

flor negra, y por los aztecas con el nombre de Tlixotlil. En estos tiempos, las

personas utilizaban a la vainilla como aromatizante, y como medicina, dado

que la vainilla cuenta con propiedades antisépticas que sirve para tratar

ciertas infecciones bacterianas (Torregroza, 2018).

La especie de vainilla era cultivada solo en México y cuando los europeos

intentaron cultivarla notaron que solo producía flor pero no daban frutos esto

se debía a que la polinización era muy baja por parte de los insectos de la

zona de manera que le surgió la necesidad de realizar una polinización

artificial y de este modo fue como la vainilla paso de cultivarse solo en

2

México a ser producida en otras regiones del mundo ya que no era

necesario del insecto (Torregroza, 2018).

Cabe recalcar que mediante la polinización artificial obtenemos las vainas

en cualquier parte del mundo pero el proceso de producción no termina ahí

dado que el proceso de recolección es manual y se requiere un tiempo de 13

a 15 meses para que las vainas estén listas para la cosecha. Por este motivo

la vainilla es una de las especies más costosas y apreciadas junto con otras

de gran valor como el azafrán (Torregroza, 2018).

1.1 Planteamiento del problema

La vainilla es una orquídea de gran importancia comercial, pues de ella

se obtiene el extracto natural de este saborizante. Bajo condiciones

naturales, las semillas de dicha especie requieren el contacto con un hongo

específico que permite el proceso de germinación lo cual hace que el

proceso de germinación natural sea más tardado y muy complicado.

1.2 Formulación del problema

¿En qué medio de cultivo in vitro es más recomendable realizar la

propagación de la vainilla (Vanilla tahitensis)?

3

1.3 Objetivos de la investigación

1.3.1 Objetivo general

Realizar la propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes

medios de cultivo in vitro.

1.3.2 Objetivos específicos

1. Encontrar un protocolo para la propagación in vitro de vainilla.

2. Determinar el medio de cultivo con la adición de fitohormonas que

permita mejorar el desarrollo caulinarmente y radicularmente de la planta.

3. Realizar análisis económico del ensayo.

1.4 Justificación

En este trabajo de titulación se justifica realizar diferentes medios de

cultivo in vitro para la propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) ya que su

proceso de germinación de la semilla es muy lento. Esta investigación nos

permitirá saber cuál es el medio in vitro más óptimo para su propagación y

así ayudar a los productores de vainilla a reducir el tiempo de espera.

4

1.5 Hipótesis

El uso de diferentes tipos de medios de cultivos in vitro ayuda a

potencializar el nacimiento y posterior crecimiento de esta planta, basándose

en las metodologías de cultivo de semilla, ápices y el uso de fitohormonas

que ayuden a aumentar el número de ejemplares. Lo cual el resultado de la

investigación ayudaría a los agricultores de vainilla saber en qué medio de

cultivo in vitro se desarrolla mejor este tipo de planta y así evitar pérdidas.

5

II MARCO TEÓRICO

2.1 Cultivo de vainilla

2.1.1 Generalidades

El cultivo de vainilla tahitensis se tratará como una “especie” aparte, a

pesar de ello se ha demostrado que es un hibrido entre V. planifolia y V.

odorata. Debido a que su floración es simultánea con V. planifolia y V.

odorata y conserva el tono herbal y aroma de canela de ambas especies

mencionadas, esta especie tiene un rápido desarrollo del sabor inicial y es

un poco dulce, aunque se presenta un poco mantecosa (Alicia, 2012).

2.1.2 Origen

Este cultivo pertenece a una especie de orquídea nativa de México, que

se caracteriza por ser una planta hermafrodita y ser la única de la cual se

obtiene un fruto en forma de vaina, que se lo conoce con el nombre “vainilla”

(Torregroza, 2018).

En el siglo XVI los europeos llevaron la vainilla a su país (España)

quiénes eran los que comercializaban este producto. Ahí fue donde se

dispersó el cultivo a todo el mundo, principalmente a jardines botánicos

donde se realizaron estudios sobre su horticultura. Posteriormente el cultivo

de vainilla fue introducido a las colonias inglesas, francesas y holandesas

luego a finales del siglo XVIII y principios del siglo XIX fue introducida a sitios

como Java, India, Tahití y las islas Seichelles, entre otros. Aunque en

principio el cultivo fracaso en estos lugares debido a la falta de polinizadores

naturales (Ordoñes, 2012).

6

2.1.3 Importancia de la vainilla

La vainilla es un cultivo de exportación, pues de ella se obtiene de sus

frutos los cuales son el saborizante natural de mayor importancia a nivel

mundial. Se usa generalmente en la industria alimenticia, refresquera,

licorera, farmacéutica, de perfumería y cosméticos, y en una menor cantidad

en la industria tabacalera y de artesanías (Luna, 2003).

Las industrias que elaboran productos tales como: lácteos, helados,

bombones, dulces, pasteles y perfumes, son los mayores consumidores de

vainilla en su forma natural como extracto o esencia (Luna, 2003).

2.1.4 Taxonomía de la vainilla

De acuerdo con Miller (1786) la clasificación taxonómica del cultivo de

vainilla queda de la siguiente manera:

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Liliopsida

Subclase: Liliidae

Orden: Orchidales

Familia: Orchidaceae

Subfamilia: Vanilloideae

Tribu: Vanilleae

Subtribu: Vanillinae

Género: Vanilla

7

2.1.5 Descripción botánica

Raíz:

Sus raíces son adventicias carnosas y largas, que le sirven a la planta

para adherirse al tutor, y en su exterior tienen una estructura llamada

velamen que les permite absorber y retener agua. Mientras que sus raíces

subterráneas se llaman trazadoras ya que se crecen a un radio de hasta 8

cm, y través de ellas adquieren los nutrientes del suelo (Luna, 2003).

Tallo:

Los tallos se pueden desarrollar de dos maneras: simples o ramificados,

a partir de estos es donde se desarrollan las hojas y las raíces, son de gran

tamaño, verdes, y carnosos (Luna, 2003).

Hojas:

Las hojas se caracterizan por ser enteras, planas, ovales, oblongas y

terminadas en punta, se alternan sobre todo el tallo, son gruesas y cerosas

con un diámetro de 15 a 18 cm y de cinco a siete cm de ancho, nacen de

cada uno de los nudos del tallo, están provistas de un peciolo corto que

forma una especie de canaladura, tiene nervaduras paralelas y oscuras,

cuando las hojas se secan se vuelven prominentes (Luna, 2003).

Flores:

El tipo de inflorescencia de la vainilla es en forma de racimos axilares,

cada planta puede producir de 10 a 20 racimos dependiendo de la adultez

8

de la planta, cada racimo tiene de 10 a 20 flores respectivamente. La flor

tiene un tamaño de cinco cm aproximadamente y es hermafrodita, posee un

color blanco, ligeramente amarillo verdoso y un poco abiertas.

La flor está compuesta por tres pétalos y tres sépalos, un pétalo

modificado alargado en forma de labio, el labelo que es el más corto de

todas las partes y posee lóbulos crenulados. El ovario permanece recto y se

vuelve pendiente luego de la floración (Luna, 2003).

Fruto:

El fruto se desarrolla por completo a partir de cuatro u ocho semanas

luego de la fertilización del ovario. Es una capsula carnosa, larga,

ligeramente triangular y alcanza un tamaño de 15 a 25 cm de largo y con

diámetro de ocho a 14 mm, posee un color verde oscuro brillante en su

estado inicial y al madurar cambia a un color verde amarillento. Puede tardar

de tres a 10 meses en madurar (Luna, 2003).

Semillas:

Las semillas de la vainilla son redondas y pequeñas; alcanzan una

medida de 0.24 a 0.33 mm en cada vaina de vainilla puede tener hasta 100

000 semillas y estas pueden ser fértiles dependiendo si fueron polinizadas,

además estas semillas carecen de endosperma (Luna, 2003)

9

2.2 cultivos in vitro

2.2.1 Definición

La denomina cultivo in vitro a cultivar plantas dentro de frascos de vidrio

en un ambiente artificial y se debe tener en cuenta dos características

fundamentales que son: La asepsia (ausencia de gérmenes, etc.), y el

control de factores que afectan al crecimiento del cultivo (Castillo, 2004).

Los avances de las ciencias biológicas nos han permitido durante estos

años el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular

y en condiciones laboratorio adecuado se puede realizar todos los factores

que influyen en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Castillo, 2004).

2.3 Medio de cultivo

El medio de cultivo es una solución de nutrientes o sustrato que permite

el desarrollo de la planta, en medios de cultivo de laboratorio se debe elegir

el medio nutritivo adecuado de acuerdo a la necesidad del cultivo para que

pueda desarrollarse (López Tévez, Leonor; Torres, Carola , 2006).

Los medios de cultivo más utilizados para la propagación de plantas son:

• Murashige & Skoog (1962)

• White (1963)

• Gamborg (1968)

Estos medios pueden ser semi-solidos o líquidos (Luna, 2003).

10

2.4 Micropropagación

La micropropagación está entre las diversas técnicas de cultivo in vitro y

consiste en la producción clonal de vegetales a partir de ápices o explantos

nodales extraídos de la planta madre. Las nuevas plantas se ven favorecidas

gracias al rápido crecimiento en este tipo de medio (Alvarado, 2013).

2.5 definiciones generales

2.5.1 Hormonas

Las hormonas vegetales (fitohormonas) son moléculas orgánicas que en

pequeñas cantidades pueden acelerar, retardar o inhibir determinados

procesos fisiológicos de la planta (Parra, 2017).

2.5.2 Reguladores de crecimiento

Son compuestos que administrados en pequeñas cantidades al medio

estimulan, inhiben o modifican el desarrollo del cultivo. Existen varios tipos

de reguladores de crecimiento entre los cuales tenemos: Auxinas,

citocininas, giberelinas, ácido absícico, etileno, etc (Luna, 2003).

Auxinas:

Las auxinas son las reguladoras del crecimiento en las plantas, y son las

causantes de la elongación de las células, se sintetizan en las regiones

meristematicas del ápice del tallo desplazándose luego hacia el resto de la

11

planta primordialmente hacia las raíces (Parra, 2017).

Citocininas:

Este tipo de hormonas vegetales promueven la división y diferenciación

celular y son primordiales para el proceso de organogénesis (formación de

órganos) y la regulación de procesos fisiológicos (fotosíntesis, regulación de

crecimiento, senescencia, resistencia a patógenos) en la planta. Se

sintetizan en el ápice de la raíz y el xilema, floema y hojas. Cuando la

citocinina es mayor que la auxina en concentración, se forman yemas

mientras que si ocurre lo contrario, el tejido indiferenciado organiza raíces

(Parra, 2017).

Giberelinas:

Estas hormonas estimulan el alargamiento celular de entrenudos del tallo

y los pedúnculos florales, se los obtiene de un hogo llamado Giberrella

fujikuroi (Fusarium heterosporium) además ayuda a romper la dormancia de

semillas y brotes. Este tipo de hormona es empleado en forma de ácido

giberèlico (AG3) en los diferentes medios de cultivo (Luna, 2003).

Ácido absícico:

El ácido absícico (ABA) participa en el desarrollo y crecimiento vegetal,

esta fitohormona es capaz de inducir el etileno por lo cual se la ha

relacionado con la madures y senescencia de la planta. También se dice que

da una resistencia a enfermedades pero no está muy esclarecida debido que

12

varía de acuerdo a cada tejido, desarrollo de la planta o el tipo de interacción

por lo general esta fitohormona ayuda a la resistencia a enfermedades en las

etapas tempranas de la infección y en las etapas posteriores tienen un papel

negativo (Parra, 2017).

Etileno:

El etileno inducido en altas concentraciones ayuda a inducir el

crecimiento, la formación de raíces, tallos, hojas, pedúnculos florales, y

maduración de los frutos. Esta hormona además puede ser inducida en

plantas que presenten heridas mecánicas o estrés (Parra, 2017).

Explante:

Un explante es cualquier parte vegetal que ha sido sacada de la planta,

pueden ser tallos, fragmentos de hojas, raíces, etc. Todos estos tejidos

están constituidos por células somáticos y para tener un buen explante se

debe tomar de plantas que estén en perfectas condiciones (Mojica, 2012).

Totipotencia:

La totipotencia es la capacidad de las células para regenerar la planta ya

que tienen la capacidad de dar cualquier órgano que nosotros deseemos

(Contreras, 2013).

13

Cuando se obtiene una célula totipotente a partir de una célula que no lo

es denominamos a esto embriogénesis somática (Contreras, 2013).

Organogénesis:

La organogénesis son un conjunto de procesos morfológicos en los

cuales las estructuras forman órganos no-autónomos en el explante

(protoplastos, células, callos, fragmentos de tejido, fragmentos de planta)

(Luna, 2003).

Una de las características más importantes de la organogénesis, es el

potencial organogenético de los explantes, y se puede presentar bajo cuatro

vías morfogenéticas que conducen a la rizogénesis o formación de raíces,

caulogénesis o formación de yemas, callogénesis o formación de callo y la

embriogénesis somática (Luna, 2003).

Embriogénesis somática:

Se le llama embriogénesis somática a la formación de un embrión a partir

de una célula, sin la tener la necesidad de fusión de gametos (Seijo, 2003).

Este fenómeno no se trata de algo artificial y se lo puede encontrar en la

naturaleza como una forma de apomixis (Seijo, 2003).

14

Rizogénesis:

La rizogénesis puede ser promovida por las auxinas, hidratos de carbono,

y por la luz. Estas condiciones cambian de acuerdo al tipo de cultivo y en

algunas ocasiones según las variedades de esta misma especie, por lo cual

las variaciones en las concentraciones de auxinas pueden variar (Luna,

2003).

Asepsia:

Es el procedimiento que se utiliza para evitar infecciones en tejidos

cuando hacemos las intervenciones y así mantener la esterilidad del medio

en el que vamos a trabajar (Fuentes, 2011).

Aminoácidos:

Son moléculas orgánicas que están compuestas de carbono, hidrógeno,

oxígeno y nitrógeno. El nombre de aminoácidos se debe a que los grupos

funcionales que contiene: un grupo amino básico (NH2) y un grupo carboxilo

ácido (COOH) que están unidos a una cadena carbonada (R) (AEFA, 1998).

Agentes Gelificantes:

Se trata de una gelatina vegetal de origen marino que se la obtiene en

diferentes algas rojas marinas, y se adiciona un porcentaje de 0,6 a 1%

considerando la pureza del agar (Guillén & Castro, 2015).

15

Murashige & skoog 1962 (MS):

Este medio de cultivo es el más utilizado comúnmente en cultivos de

tejidos vegetales y está comprobado que es efectivo en el crecimiento y

propagación de monocotiledóneas y dicotiledóneas (Guillén & Castro, 2015).

MS está caracterizado por una gran concentración de nitrato (NO-3) y

amonio (NH+4), el incremento de crecimiento es de cinco a siete veces más

comprado con los medios tradicionales usados comúnmente (Guillén &

Castro, 2015).

16

Componentes Murashige & Skoog 1962 y B5 **(Gamborg, 1976):

Según Mroginski y Roca estas son las cantidades de acuerdo a la

sustancia.

SUSTANCIA *CANTIDAD g

y mg/L

**CANTIDAD

g y mg/L

NH4NO3

(NH4)S04

KNO3

KH2PO4

CaCI2.2H2O

MgSO4.7H2O

KI

H2BO3

MnSO4.4H2O

ZnSO4.7H2O

Na2MoO4.2H2O

CuSO4.5H2O

FeSO4.7H20

Na2EDTA

CoCI2.6H2O

Glicina

Tiamina- HCI

Piridoxina- HCI

Acido nicotínico

Mioinositol

Sacarosa

pH

1650

1900

170

440

370

0.83

6.20

22.30

8.60

0.25

0.025

27.80

37.30

0.025

2.00

0.10

0.50

0.50

100.00

30,000

5.7

0.134

2.528

0.15

0.15

0.246

17

Elaboración del medio de cultivo MS y Hoagland:

Para hacer del medio de cultivo MS según (Alvarado, 2013) se realizan

las siguientes soluciones madre:

Soluciones stock de nutrientes:

• Stock de macronutrientes,

• Stock de Calcio,

• Stock de micronutrientes

• Stock de hierro y EDTA

Soluciones Stock de vitaminas.

Soluciones Stock de Reguladores.

2.5.3 Factores externos

Los principales factores físicos que se deben tener en cuenta son la

temperatura y la luz; el grado higrométrico del aire generalmente no tiene

mucha importancia ya que las plantas cultivadas in vitro se encuentran en

una atmósfera naturalmente saturada (Luna, 2003).

Luz:

Es el principal factor físico y se ha demostrado que tiene un gran efecto

sobre los cultivos in vitro. Por lo general los cuartos de crecimiento deben

tener un fotoperiodo de 12 a 16 horas con una intensidad lumínica de 1000

10000 lux. El cambio de intensidad lumínica causa organogénesis y cambios

18

morfogenéticos debido a la longitud de onda de la iluminación (Luna, 2003).

Temperatura:

Los cultivos in vitro se desarrollan normalmente en un rango que va de

los 20° C a los 25°C; sin embargo también se pueden desarrollar en

temperaturas de 18°C a 28°C obteniendo buenos resultados (Luna, 2003).

19

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Localización del ensayo

El Trabajo de titulación se realizó en el Laboratorio de biotecnología

AGROVITROPARIS ubicado en la ciudad de Guayaquil-parroquia Pascuales

avda. Narcisa de Jesus (Metrópolis II etapa H).

3.2 Materiales

3.2.1 Material tecnológico

• Cámara Fotográfica

• Computadora

• Cámara de flujo laminar

3.2.2 Material biológico

• Plantas madre

• Reactivo químicamente puro

• Agente gelificante

• Fitohormonas

• Vitaminas

3.2.3 Material técnico

• Agenda

• Mandil

• Guantes

• Probetas

• Pipetas

20

• Cajas Petri

• Balanza analítica

• Autoclave

• Agitador magnético

• Frascos desecadores

• Mascarilla

• Balanza

• Frascos

• Erlenmeyer

3.3 Tratamientos estudiados

Se estudiaron ocho tratamientos, los mismos que se describen en el

Cuadro 1:

Cuadro 1. Descripción de los tratamientos estudiados.

No. de

tratamientos

No. de

grupos

Tratamientos

1 MS+BAP+G3

2 Grupo 1. MS+BAP+ANA

3 MS+BAP+AIB

4 Testigo

5 B5+BAP+G3

6 Grupo 2. B5+BAP+ANA

7 B5+BAP+AIB

8 Testigo

21

3.4 Variables estudiadas

• Número de entrenudos.

• Número de hojas.

• Color del explante (Escala de Munsell).

• Longitud de raíces (cm).

3.5 Diseño experimental

Se utilizó el diseño completamente al azar con desigual número de

repeticiones y arreglo grupal. Para el cálculo estadístico se realizó el análisis

de varianza con valores transformados a √𝑥 + 0,5 , donde se presentaron

diferencias significativas, se realizó la comparación de medias mediante la

prueba de Duncan al 5% de probabilidades.

Cuadro 2. Esquema de Fuente de Variación y Grados de Libertad para el

análisis de la varianza.

Fuente de Variación Grados de Libertad

Tratamientos 7

Grupos 1 3

Grupos 2 3

Entre grupos 1

Error experimental 47

Total 63

22

3.6 Metodología

Selección de plantas madres:

Se utilizó plantas madres seleccionadas de orquídeas Vainilla thaitensis

adquiridas en viveros en Santo Domingo, se utilizó yemas axilares y apicales

como explantes.

Desinfección del material vegetal:

Una vez seleccionada la planta madre, se cortaron los fragmentos a partir

de los cuales se obtuvieron los explantes. Los tejidos iniciales fueron yemas

apicales y axilares. Antes de extraer los explantes se realizó una

desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los

contaminantes externos. Los contaminantes más comunes fueron los

hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez

desinfectado el material vegetal, se mantuvo en condiciones de asepsia. A

efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajó en cabinas de flujo

laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos

explantes se colocaron en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación

para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizó la

desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial),

diluida durante un período de cinco a 15 minutos, seguido por tres a cuatro

enjuagues en agua esterilizada.

23

Preparación de medios de cultivos:

Una vez pesados en balanza analítica los reactivos. Se inició colocando

en un Erlenmeyer de 1000 ml. 300 ml de agua destilada más la solución

madre: macronutrientes, micronutrientes, quelatos de hierro, vitaminas de

Morel, inositol, azúcar de coco; luego se añadió al agitador magnético hasta

que se disuelvan todos los reactivos precipitados, cuando ya esté bien

disueltos, las soluciones, enrazamos en el Erlenmeyer hasta un litro con

agua destilada, luego se ajustó el pH con unas gotas de NaOH.y HCl.

Posteriormente se agregó el medio en un frasco de 200 ml a razón de 30 –

35 ml por frasco se tapó con papel aluminio y se selló con papel aluminio.

Finalmente, se esterilizó el medio de cultivo en una autoclave a 121 °C por

15 minutos. La cantidad inicial por cada tratamiento fue de 28 frascos de 200

ml.

Aclimatación de explantes enraizados:

Cuando Los explantes están recién enraizados son mucho más sensibles

a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el

proceso realizado depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas

sufren cambios de diferentes tipos que les permite la adaptación a las

condiciones naturales en donde van a estar. En el momento en que se

extraen los explantes enraizados de los frascos, estos no están adaptados a

crecer en un invernáculo, ya que estos han crecido en ambientes con una

humedad relativa muy elevada (Castillo, 2004).

24

Por otra parte, cuando las plantas crecen en ambientes tan húmedos

también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada,

que les ayuda a las plantas a evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la

superficie de la planta (Castillo, 2004).

Características que presenta una planta en condiciones de laboratorio (in

vitro) a diferencia de una planta en condiciones naturales (in vivo):

In vitro:

• No realiza fotosíntesis.

• Crecimiento en condiciones controladas.

• Crecimiento en condiciones de asepsia.

• Alta humedad relativa.

• Estomas no funcionales.

• Ausencia de pelos radiculares.

• Ausencia de cera en la cutícula.

In vivo:

• Realiza fotosíntesis.

• Crecimiento en condiciones no controladas.

• Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente.

• Humedad relativa variable.

• Estomas funcionales.

• Presencia de pelos radiculares.

• Presencia de cera en la cutícula.

25

La validación externa se verificó mediante comparación con los

resultados de diversos autores. La toma de datos se realizó a los 90 días

después de la siembra aséptica utilizando Verniel, cinta métrica y tablas de

Munsell de medición y seguimiento fotográfico.

La estadística se realizó usando la prueba de DUNCAN para determinar

la diferencia de medios.

Se construyó la forma de las tablas y figuras con los supuestos

indicadores teóricos de la ANDEVA.

Las plantas madres fueron obtenidas en un vivero ubicado en la provincia

de Santo Domingo de los Tsáchilas

Los tratamientos bajo estudio fueron: Murashige & skoog 1962 y B5

(Gamboll).

26

IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo MS.

De acuerdo con el análisis de varianza, el grupo 1 (MS), presentó

significancia estadística al 1 y 5 % (Cuadro 1A), siendo el tratamiento de

MS+BAP+G3 que obtuvo el mayor número de entrenudos con un promedio

de 3 entrenudos, difiere estadísticamente de los demás tratamientos, el

tratamiento testigo presentó el menor promedio con 0.57 entrenudos, igual

estadísticamente a los tratamientos de MS+BAP+ANA y MS+BAP+AIB con

1.29 y 1.33 entrenudos respectivamente (Figura 1). Resultado que coincide

con lo mencionado por Vidalie (2013), quien manifiesta que el uso de

giberelinas es recurrente, pero solo el ácido giberélico (G3), se utiliza en

forma frecuente, adicionándose en el medio de cultivo para estimular el

crecimiento de los meristemos, entrenudos, induce el alargamiento de los

tallos y activar el crecimiento de los embriones somáticos.

27

Figura 1. Número de entrenudos evaluados del grupo MS a los 90 días

mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.

4.2 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo B5.

En esta variable el análisis estadístico de varianza expresa que el grupo 2

(B5) alcanzó significancia estadista al 1 y 5 % (Cuadro 1A), donde

B5+BPA+G3 reportaron el mayor número de entrenudos con un promedio de

1.50 entrenudos, difiere estadísticamente de los demás tratamientos, el

tratamiento testigo obtuvo el menor número de entrenudos con un promedio

de 0.14 entrenudos (Figura 2). Vidalie (2013), expresa que el uso de

sustancia orgánica como B5 es esencial para mejor el número de

entrenudos.

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

MS+BAP+G3 MS+BAP+ANA MS+BAP+AIB Testigo

3.00 a1/

1.29 b 1.33 b

0.57 b

Nú

mer

o d

e en

tren

ud

os

GRUPO MS

1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).

28

Figura 2. Número de entrenudos del grupo B5 evaluados a los 90 días


4.3 Número de entrenudos evaluados a los 90 días entre el grupo MS y

B5.

El análisis de varianza manifiesta que entre grupo presentó significancia

estadística al 1 y 5%, el coeficiente de variación de esta variable fue de

31.41% con un promedio general de 1.25 entrenudos (Cuadro 1A y 3).

El grupo 1 (MS) obtuvo el mayor número de entrenudos con un promedio de

1.58 entrenudos difiere estadísticamente del grupo 2 (B5), la cual alcanzó el

menor promedio de entrenudos con 0.94 entrenudos (Figura 3).

El mejor medio de cultivo de estos grupos fue el de MS+BAP+G3.

Los mejores resultados obtenidos entre los dos grupos MS y B5 con la

variable de número de entrenudos fueron los del grupo MS.

0.00

0.50

1.00

1.50

B5+BAP+G3 B5+BAP+ANA B5+BAP+AIB Testigo

1.50 a1/

1.00 b 1.00 b

0.14 c

Nú

mer

o d

e en

tren

ud

os


29

Figura 3. Número de entrenudos evaluados entre el grupo MS y B5 a los 90

días mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.

0.00

1.00

2.00

3.00

3.00 a1/

1.29 b 1.33 b

0.57 b

1.50 a

1.00 b 1.00 b

0.14 c

1.58 a

0.94 b

Nú

mer

o d

e en

tren

ud

os

GRUPO MS GRUPO B5 ENTRE GRUPOS


30

Cuadro 3. Promedio de número de entrenudos evaluados a los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019

Tratamientos Número de entrenudos

evaluados a los 90 días

Grupo 1.

MS+BAP+G3

3,00 a1/

MS+BAP+ANA 1,29 b

MS+BAP+AIB 1,33 b

Testigo 0,57 b

Grupo 2.

B5+BAP+G3

1,50 a 1/

B5+BAP+ANA 1,00 b

B5+BAP+AIB 1,00 b

Testigo 0,14 c

Entre grupos

Grupo 1 1,58 a 1/

Grupo 2 0,94 b

× 1,25

C.V.(%) 31,412/

1/ Promedios señalados con la misma letra no difieren entre sí (Duncan α 0,05). 2/ Con datos transformados a√𝑥 + 0,5.

31

4.4 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo MS.

De acuerdo con el cuadro 2A, el grupo 1 (MS) obtuvo significancia

estadística al 1 y 5 %, el tratamiento de MS+BAP+G3 presentó el mayor

número de hojas con un promedio de 1.25 hojas, difiere estadísticamente de

los demás tratamientos, el tratamiento testigo generó el menor número de

hoja con un promedio de 0.14 hojas, igual estadísticamente a el tratamiento

de MS+BAP+ANA y MS+BAP+AIB con un promedio de 0.57 y 0.56 hojas

respectivamente (Figura 4). Resultado que coincide con Vargas (2012),

quien mediante la aplicación de MS (Murashige & skoog), obtuvo el mayor

número de hoja.

Figura 4. Número de hojas evaluadas del grupo MS a los 90 días mediante

la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.

0.00

0.50

1.00

1.50


1.25 a1/

0.57 b 0.56 b

0.14 b

Nú

mer

o d

e h

oja

s


32

4.5 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo B5.

De acuerdo con el Cuadro 2A, el grupo 2 (B5) no alcanzó significancia, la

aplicación de B5+BAP+ANA obtuvo el mayor número de hoja con un

promedio de 0.86 hoja, mientras que el testigo generó el menor promedio de

número de hojas con 0.43 hoja (Figura 5). Resultado que coincide con

Garay, Sánchez, García y Gutiérrez (2014), quien indican que las auxinas

(ANA) son hormonas que intervienen durante todo el ciclo de vida de las

plantas y son muy interesantes debido a que se distribuyen diferencialmente

dentro de los tejidos lo que provoca diferentes procesos morfogenéticos

(estimulación y alargamiento de las hojas).

Figura 5. Número de hojas evaluadas del grupo B5 a los 90 días mediante la

aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00


0.75 a0.86 a

0.44 a 0.43 a

Nú

mer

o d

e h

oja

s


33

4.6 Número de hojas evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5.

Entre grupo nos presentó significancia estadística de acuerdo con el

análisis de varianza, el promedio general fue de 0.63 hoja con un coeficiente

de variación de 41.84% (Cuadro 2A y 4).

El mejor medio de cultivo para esta variable es el MS+BAP+G3.


variable de número de hojas fueron los del grupo MS.

Figura 6. Número de hojas evaluadas entre el grupo MS y B5 a los 90 días


0.00

0.50

1.00

1.50 1.25 a1/

0.57 b 0.56 b

0.14 b

0.75 a0.86 a

0.44 a 0.43 a0.65 a 0.61 a

Nú

mer

o d

e h

oja

s



34

Cuadro 4. Promedio de número de hojas evaluada a los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019.

Tratamientos Número de hojas evaluadas a los

90 días

Grupo 1.

1,25 a1/

MS+BAP+G3

0,57 b

MS+BAP+ANA

0,56 b

MS+BAP+AIB 0,14 b

Testigo

Grupo 2. 0,75 a 1/

B5+BAP+G3

0,86 a

B5+BAP+ANA 0,44 a

B5+BAP+AIB

0,43 a

Testigo

Entre grupos

Grupo 1 0,65 a

Grupo 2

0,61 a

× 0,63

C.V.(%) 41,842/


35

4.7 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo MS.

De acuerdo con el análisis de varianza el grupo 1 (MS) alcanzó

significancia estadística al 1 y 5 % (Cuadro 3A), El tratamiento de

MS+BAP+AIB reportó la mayor longitud de la raíz con un promedio de 1.74

cm, igual estadísticamente al tratamiento de MS+BAP+G3 con un promedio

de1.39 cm, difieren estadísticamente de los demás tratamientos, el testigo

presentó la menor longitud de la raíz con un promedio de 0.36 cm, igual

estadísticamente al tratamiento de MS+BAP+G3 con un promedio de 0.39

cm (Figura 7). Resultado que concuerda con el experimento por Menchaca,

Ramos, Moreno, Luna, Mata, Vázquez, & Lozano (2011), en Xalapa (México)

mediante la aplicación de Murashige & skoog + BAP alcanzaron la mayor

longitud de la raíz.

Figura 7. Longitud de raíces evaluadas del grupo MS a los 90 días mediante


0.00

0.50

1.00

1.50

2.00


0.39 b1/

1.39 a

1.74 a

0.36 b

Lon

gitu

d d

e ra

íz (

cm)

1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre sí (Duncan α 0.05).

36

4.8 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo B5.

El grupo 2 (B5) presentó significancia estadística al 1 y 5 % de acuerdo

con el análisis de varianza (Cuadro 3A), la aplicación de B5 +BAP+AIB

reporto la mayor longitud de la raíz con un promedio de 2.31 cm, igual

estadísticamente al tratamiento de B5+BAP+ANA con un promedio de

2.17cm, difieren estadísticamente de los demás tratamientos, el tratamiento

testigo alcanzó la menor longitud de la raíz con un promedio de 0 cm (Figura

8). Resultado que coincide con lo mencionado por Parra (2017), quien indica

que la BAP es un tipo de hormona que promueven la división y

diferenciación celular y son primordiales para el proceso de organogénesis

(formación de órganos) y la regulación de procesos fisiológicos (fotosíntesis,

crecimiento de raíz, senescencia, resistencia a patógenos) en la planta.

Figura 8. Longitud de raíces evaluadas del grupo B5 a los 90 días


0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50


0.65 b

2.17 a2.31 a

0.00 c

Lon

gitu

d d

e ra

íz (

cm)


37

4.9 Longitud de raíz evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5.

Entre grupo reportó significancia estadística al 1 y 5 % según el análisis

estadístico de varianza, con un coeficiente de variación de 22.59 y un

promedio general de 1.16centimetros (Cuadro 3A y 5). El grupo 2 (B5)

reportó la mayor longitud de la raíz con un promedio de 1.33 cm, difiere

estadísticamente del grupo 1 (MS) que alcanzó la menor longitud de la raíz

con un promedio de 1.00 cm.

El mejor medio de cultivo de esta variable es el B5+BAP+AIB.


variable de longitud de raíz fueron los del grupo B5.

Figura 9. Longitud de raíces evaluadas entre el grupo MS y B5 a los 90 días


0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

0.39b1/

1.39 a

1.74 a

0.36 b

0.65 b

2.17 a2.31 a

0.00 c

1.00 b

1.33 a

Lon

gitu

d d

e ra

íz (

cm)



38

Cuadro 5. Promedio de longitud de raíz a los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos.

UG,2019

Tratamientos Longitud de raíz evaluadas a los 90

días

Grupo 1.

MS+BAP+G3

0,39 c1/

MS+BAP+ANA 1,39 c

MS+BAP+AIB

1,74 b

Testigo 0,36 a

Grupo 2.

B5+BAP+G3

0,65 b 1/

B5+BAP+ANA

2,17 a

B5+BAP+AIB 2,31 a

Testigo

0,00 c

Entre grupos

Grupo 1

1,00 b

Grupo 2 1,33 a

× 1,16

C.V.(%)

22,592/

1/ Promedios señalados con la misma letra no difieren entre sí (Duncan α 0,05).

2/ Con datos transformados a√𝑥 + 0,5.

39

4.10 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo MS.

En este grupo (MS), el análisis de varianza obtuvo significancia

estadística al 1 y 5 % (Cuadro 4A), el tratamiento testigo ocasionó el mayor

valor en la escala de munsell con un promedio de 5.37 difiere

estadísticamente de los demás tratamientos, MS+BAP+ANA presentó el

menor valor en la escala de munsell con un promedio de 2.77 igual

estadísticamente al tratamiento de MS+BAP+G3 con un promedio de 2.85

(Figura 10).

Figura 10. Color del explante del grupo MS evaluados a los 90 días


0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00


2.85 c1/ 2.77 c

3.50 b

5.37 a

Co

lor

del

exp

lan

te


40

4.11 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo B5.

El análisis de varianza Andeva indica que el grupo 2 (B5) alcanzó

significancia estadística al 1 y 5 % (Cuadro 4A), el tratamiento testigo

presentó el mayor valor en la escala de munsell con un promedio de 2.32

difiere estadísticamente de los demás tratamientos, los tratamientos

B5+BAP+G3 y B5+ BAP+ ANA reportaron los menores valores en la escala

de munsell con un promedio de 1.68 y 1.66 respectivamente, iguales

estadísticamente entre sí (Figura 11).

Figura 11. Color del explante del grupo B5 evaluados a los 90 días mediante


0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50


1.68 c 1.66 c1.86 b

2.32 a

Co

lor

del

exp

lan

te


41

4.12 Color del explantes evaluados a los 90 días entre el grupo MS y B5.

De acuerdo con el análisis de varianza entre grupo presentó significancia

estadística al 1 y 5 %, con un coeficiente de variación de 13.06% y un

promedio general de 2.73 (Cuadro 4A y 6).

El grupo 1 (MS) alcanzó el mayor valor de la escala de munsell con un

promedio de 3.59 difiere estadísticamente al grupo 2 (B5) con un promedio

de 1.87 (Figura 12).

El mejor medio de cultivo de esta variable es el testigo.


variable de color del explante fueron los del grupo MS.

Figura 12. Color de los explantes de los grupos MS y B5 evaluados a los 90

días mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

2,85c1/2.77 c

3.50 b

5.37 a

1.68 c 1.66 c 1.86 b2.32 a

3.59 a

1.87 b

Co

lor

del

exp

lan

te



42

Cuadro 6. Promedio de color de explante a los 90 días determinados en el . cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019

Tratamientos Color de explante en escala de

Munsell evaluadas a los 90 días

Grupo 1.

MS+BAP+G3

2,85 c3/

MS+BAP+ANA 2,77 c

MS+BAP+AIB 3,50 b

Testigo 5,37 a

Grupo 2.

B5+BAP+G3

1,68 c 3/

B5+BAP+ANA 1,66 c

B5+BAP+AIB 1,86 b

Testigo 2,32 a

Entre grupos

Grupo 1 3,59 a3/

Grupo 2 1,87 b

2,733/

C.V.(%) 13,062/


3/. Promedios con valores transformados a √𝑥 + 0,5.

43

4.13 Análisis económico

Se realizó el análisis económico tomando en cuenta el precio de todos los

materiales y medio de cultivo que se utilizaron en el experimento, se

calcularon los gastos para 200 plantas obtenidas in vitro.

Los tratamientos testigos fueron los más económicos con USD 14.00 de

cada uno de los grupos, mientras que los más costosos correspondieron a

MS+BAP+ANA y MS+BAP+AIB ambos con un precio de USD 75,28 (Cuadro 7).

No constan los valores de mano de obra, ni precio de los explantes por

tratarse de un experimento determinativo.

44

Cuadro 7. Análisis económicos de los tratamientos.

Materiales MS+BAP+G3 MS+BAP+ANA MS+BAP+AIB Testigo B5+BAP+G3 B5+BAP+ANA B5+BAP+AIB Testigo

Obtención de

explantes(USD)

10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00

Tubos de

ensayos (USD)

4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00

Medios de

cultivos (USD)

50.00 61.28 61.28 0.00 37.50 47.28 47.28 0.00

Total (USD) 64.00 75.28 75.28 14.00 51.50 61.28 61.28 14.00

No consta la mano de obra.

45

V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones:

1. El tratamiento de (B5 + BAP + AIB) del grupo 2 alcanzó la mayor

longitud de la raíz a los 90 días.

2. La aplicación del tratamiento (MS + BAP + G3) del grupo 1

presentó el mayor número de entrenudos y mayor número de hojas

con tres entrenudos y dos hojas respectivamente.

3. Los tratamientos más económicos para la producción de

explantes de vainilla, fueron (B5+BAP+ANA y B5+BAP+AIB) del

grupo número 2.

46

5.2 Recomendación:

1. Aplicar B5 + BAP + AIB (tratamiento 7 del grupo 2) para alcanzar

un buen desarrollo radicular en los cultivos in vitro de vainilla.

2. Utilizar MS + BAP + G3 (tratamiento 1 del grupo 1) para lograr un

buen desarrollo caulinar en plantas de vainillas in vitro.

3. Realizar ensayos similares con otras formulaciones de medios

de cultivos con fitohormonas y otras sustancias químicamente

puras.

47

VI BIBLIOGRAFÍA

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51

ANEXOS

52

Cuadro 1A. Análisis de la varianza de la variable número de entrenudos con

valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra.

Guayaquil, 2019.

F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%

Tratamientos 7 38.95870484 5.56552926 21.45** 2.27 7.54

Grupo 1 MS 3 24.40552995 8.13517665 31.35** 2,86 4,37

Grupo 2 B5 3 1.49829585 0.49943195 1.92N.S. 2,86 4,37

Entre grupos 1 13.054487904 13.054487904 50,30** 4,11 3,17

Error Exp. 47 14.01220000 0.25948519

Total 63 52.97090484

Promedio 1,62

C.V. (%) 31,41

** Significativo al 5 y 1% de Probabilidad; N.S. No significativo.

Cuadro 2A. Análisis de la varianza de la variable número de hojas con valores

transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra. Guayaquil,

2019.

F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%

Tratamientos 7 5.33033077 0.76147582 3.75* 2.27 7.54

Grupo 1 MS 3 4.80312340 1.60104113 7.89** 2,86 4,37

Grupo 2 B5 3 0.23587673 0.07862558 0.39NS. 2,86 4,37

Entre grupos 1 0.29133064 0.29133064 1.44 NS. 4,11 3,17

Error Exp. 47 10.95565794 0.20288255

Total 63 16.28598871

Promedio 1.08

C.V. (%) 41.84

* Significativo al 5% de probabilidad; Significativo al 1% de probabilidad; N.S. No significativo.

53

Cuadro 3A. Análisis de la varianza de la variable color del explante con valores

transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra. Guayaquil,

2019.

F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%

Tratamientos 7 79.04933375 11.29276196 88.62** 2.27 7.54

Grupo 1 MS 3 31.35852535 10.45284178 82.03** 2,86 4,37

Grupo 2 B5 3 1.97310518 0.65770173 5.16** 2,86 4,37

Entre grupos 1 45.71770322 45.71770322 358.77** 4,11 3,17

Error Exp- 47 6.88110496 0.12742787

Total 63 85.93043871

Promedio 2.73

C.V. (%) 13.07

** Significativo al 5 y 1% de Probabilidad.

Cuadro 4A. Análisis de la varianza de la variable longitud de raíces (cm) con

valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra.

Guayaquil, 2019.

F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%

Tratamientos 7 17.66824642 2.52403520 25.57** 2.27 7.54

Grupo 1 MS 3 11.92331349 3.97443783 40.26** 2,86 4,37

Grupo 2 B5 3 5.00350712 1.66783571 16.89** 2,86 4,37

Entre grupos 1 0.74142581 0.74142581 7.51** 4,11 3,17

Error Exp. 47 5.33072778 0.09871718

Total 63 22.99897419

Promedio 1.39

C.V. (%) 22.59

** Significativo al 5 y 1% de Probabilidad.

54

Figura 1A. Cultivo de vainilla, 2018.

Figura 2A. Siembra de plantas madre de vainilla, 2018.

55

Figura 3A. Obtención de explantes de vainilla, 2018.

Figura 4A. Explantes de vainillas en los tubos de ensayos, 2018.

56

Figura 5A. Explantes de vainillas contaminados, 2019.

Figura 6A. Explante de vainilla en desarrollo, 2019.

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