UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MODALIDAD: DESCRIPTIVA EXPERIMENTAL

TEMA:

ESTUDIO FARMACOGNOSTICO Y QUÍMICO DE LA CORTEZA

DE LOS FRUTOS DULCE Y AMARGOS DE Nepphelium lappaceum L.

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO

REQUISITO PREVIO, PARA OPTAR POR EL GRADO DE

QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS

AUTORES:

• BATIOJA GARCIA KAREN ANDREINA

• LARA MARIDUEÑA MARÍA FERNANDA

TUTOR:

Q.F LAURA VALDEZ LOPEZ MSC.

CONSULTORA EXTERNA:

MIGDALIA MIRANDA MARTINEZ

GUAYAQUIL – ECUADOR

2019

I

DEDICATORIA

El presente trabajo investigativo lo dedicamos principalmente a Dios,

por ser el inspirador y darnos fuerza para continuar en este proceso de obtener

uno de los anhelos más deseados.

A nuestros padres, por su amor, trabajo y sacrificio en todos estos años,

gracias a ustedes hemos logrado llegar hasta aquí́ y convertirnos en lo que

somos. Ha sido el orgullo y el privilegio de ser sus hijas, son los mejores

padres.

A nuestros hermanas (os) y a nuestros compañeros de corazón, por estar

siempre presentes, acompañándonos y por el apoyo moral, que nos brindaron

a lo largo de esta etapa de nuestras vidas.

A todas las personas que nos han apoyado y han hecho que el trabajo se

realice con éxito en especial a aquellos que nos abrieron las puertas y

compartieron sus conocimientos

II

AGRADECIMIENTO

Agradecemos a Dios por bendecirnos la vida, por guiarnos a lo largo de

nuestra existencia, ser el apoyo y fortaleza en aquellos momentos de dificultad y de

debilidad.

Gracias a nuestros padres: Miguel y Luz María; y, Franklin y Gina, por ser los

principales promotores de nuestros sueños, por confiar y creer en nuestras

expectativas, por los consejos, valores y principios que nos han inculcado.

Agradecemos a nuestros docentes de la Facultad de Ciencias Químicas, por haber

compartido sus conocimientos a lo largo de la preparación de nuestra profesión, de

manera especial, a la Q.F Laura Valdez tutora de nuestro proyecto de investigación

y la Dra. Migdalia Miranda quien ha guiado con su paciencia, y su rectitud, y al

master Oswaldo Pesantes por su valioso aporte para nuestra investigación.

III

ESTUDIO FARMACOGNOSTICO Y QUÍMICO DE LA CORTEZA

DE LOS FRUTOS DULCE Y AMARGOS DE Nepphelium lappaceum L.

AUTORES: Batioja Garcia Karen Andreina

Lara Maridueña María Fernanda

Tutor: Q.F Laura Valdez López

RESUMEN

El presente estudio farmacognóstico y químico realizado en las corteza

de dos variedades dulce y amarga de Nephelium lappaceum L. procedente del

país de Ecuador, permite demostrar la presencia de metabolitos secundarios

en el vegetal de estudio, se evidencio los resultados a través del tamizaje

fitoquímico obteniendo valores cualitativos de fenoles y flavonoides de gran

interés en las variedades; lo cual lleva a su estudios en la actividad

antioxidante. Mientras que en el estudio farmacognóstico realizamos distintos

análisis como es: Humedad, cenizas totales, cenizas insolubles en ácido

respectivamente dándonos como resultado que la corteza amarga presenta

mayor humedad que la corteza dulce y que la corteza dulce presenta mayor

cantidad de cenizas que la corteza amarga.

Palabras claves: Achotillo, estudio químico, flavonoides,

antioxidantes

IV

PHARMACOGNOSTIC AND CHEMICAL STUDY OF THE BARK OF

SWEET FRUITS AND BLACKBERRIES OF Nepphelium lappaceum L.

Authors: Batioja Garcia Karen Andreina

Lara Maridueña María Fernanda

Advisor: Q.F Laura Valdez López

ABSTRACT

The present pharmacognostic and chemical study conducted in the bark

of two sweet and bitter varieties of Nephelium lappaceum L. from the country of

Ecuador, allows to demonstrate the presence of secondary metabolites in the study

plant, the results were evidenced through phytochemical screening obtaining

qualitative values of phenols and flavonoids of great interest in the varieties; which

leads to his studies on antioxidant activity. While in the pharmacognostic study we

performed different analyzes such as: Moisture, total ash, ash insoluble in acid

respectively giving us as a result that the bitter crust has more moisture than the

sweet crust and that the sweet crust has more ash than the bitter crust

Keywords: Achotillo, chemical study, flavonoids, antioxidants

V

INDICE

RESUMEN........................................................................................................................ III

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1

I.1 Planteamiento del problema ................................................................................... 2

I.2 Hipótesis ................................................................................................................... 3

I.3 Objetivo General ..................................................................................................... 3

Capítulo II MARCO TEÓRICO ..................................................................................... 4

II.1 Nephelium lappaceum L. ............................................................................................ 4

II.1.1. Origen y Distribución ........................................................................................ 4

II.1.2 Taxonomía ........................................................................................................... 5

II.1.3. Descripción botánica .......................................................................................... 5

II.1.3.2.1. Valores Nutricionales del fruto ............................................................ 6

II.1.4. Propiedades Medicinales ................................................................................... 6

II.1.5. Variedades de Nephelium lappaceum L. .......................................................... 7

II.1.6. Composición química de N. lappaceum ......................................................... 8

II.2.1. Compuestos fenólicos ................................................................................. 9

II.2.2. Flavonoides ................................................................................................... 10

II.2.2.1. Clasificación. Distintos tipos de flavonoides. .......................................... 11

II.2.3. Antioxidantes ................................................................................................ 13

II.2.3.1. Generalidades ......................................................................................... 13

II.2.3.2. Comportamiento antioxidante de los fenoles ........................................ 13

II.2.3.3. Mediación de la actividad antioxidante ................................................. 14

II.2.4. Métodos de análisis .......................................................................................... 14

II.2.4.1. Cromatografía ................................................................................................ 14

II.2.4.2. Cromatografía en Capa Fina (CCF) ..................................................... 14

II.2.4.3. Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas.......................... 15

CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................... 16

III.1. Metodología de la investigación ....................................................................... 16

III.2. Material vegetal en estudio ............................................................................... 16

III.3. Técnicas y Métodos ........................................................................................... 16

III.3.1. Análisis Macro-morfológico del fruto ........................................................ 16

III.4. Parámetros físico-químicos de las drogas crudas ........................................... 17

III.4.1. Humedad residual. ...................................................................................... 17

III.4.2. Sustancias solubles o extraíbles. ................................................................ 17

VI

III.4.3. Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido

clorhídrico al 10 %. ................................................................................................. 18

III.4.3.1. Cenizas totales. ..................................................................................... 18

III.4.3.2. Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %. ................................ 18

III.5. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico ........... 19

III.6. Extracción sucesiva del material vegetal ......................................................... 23

II.7. Cromatografía ..................................................................................................... 23

CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSION ........................................................ 26

V.1 CONCLUSIONES .................................................................................................... 39

V.2 RECOMENDACIONES .......................................................................................... 40

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Fruto Nepphelium lappaceum L. .................................................................... 6

Figura 2. Principales clases de compuestos fenólicos presentes en frutos.................... 8

Figura 3. Estructuras químicas de diversos compuestos C6-C3-C6 encontrados en

alimentos .......................................................................................................................... 11

Figura 4. Esquema de extracción del material vegetal para la aplicación de técnicas de

tamizaje fitoquimico ......................................................................................................... 20

Figura 5. Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a realizar a los diferentes

extractos ............................................................................................................................ 20

Figura 6. Esquema de la extracción sucesiva del material vegetal. .............................. 1

Figura 7. Cromatogramas de Capa fina realizados a los extractos obtenidos. .......... 32

Figura 8. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extracto hexanicos de la corteza

de los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2). ................................................ 33

Figura 9. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extractos DCM de la corteza de

los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2). ..................................................... 37

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Taxonomia Nephelium lappaceum L. ............................................................... 5

Tabla II. Análisis Macroscópico de los Frutos ............................................................. 26

Tabla III. Medidas de los frutos de N.Lappaceum ...................................................... 27

Tabla IV. Determinación de parámetros físicos-químicos en las muestras de las dos

variedades ........................................................................................................................ 28

Tabla V. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto etéreo ........................ 29

Tabla VI. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto alcohólico ................ 30

Tabla VII. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto acuoso.................... 30

Tabla VIII. Resultado del factor de retención en la cromatografía de capa fina ...... 32

VII

Tabla IX. Cuadro comparativo de los compuestos identificados por CG-EM en el

extracto hexano ............................................................................................................... 34

Tabla X. Cuadro Comparativo de extracto con Diclorometano ................................. 35

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Recolección del Fruto ..................................................................................... 43

Anexo 2. Corteza de los frutos amargos de Nepphelium lappaceum L. ..................... 43

Anexo 3. Corteza de los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L. .......................... 44

Anexo 4. Medir los frutos amargos de Nepphelium lappaceum L.............................. 44

Anexo 5. Medir los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L. .................................. 45

Anexo 6. Secado de la corteza dulce y amargo de Neppelium lappaceum L. ............ 45

Anexo 7. Triturado de la corteza dulce y amrga de Nepphelium lappaceum L. ....... 46

Anexo 8. Molienda de la corteza dulce y amrga de Nepphelium lappaceum L. ........ 46

Anexo 9. Enasayo de Humedad Residual ...................................................................... 48

Anexo 10. Ensayo de cenizas totales e insolubles .......................................................... 49

Anexo 11. Ensayo de Sustancias Solubles ..................................................................... 50

Anexo 12. Extracto acuoso Cloruro Férrico ................................................................. 51

Anexo 13. Extracto acuoso Dragendorff ....................................................................... 51

Anexo 14. Extracto acuoso Fehling 1 ............................................................................ 52

Anexo 15. Extracto acuoso Fehling 2 ............................................................................ 52

Anexo 16. Extracto acuoso Na OH 1 ............................................................................. 53

Anexo 17. Extracto acuoso Na OH 2 ............................................................................. 53

Anexo 18. Extracto acuoso Shinoda 1 ........................................................................... 54

Anexo 19. Extracto acuoso Shinoda 2 ........................................................................... 54

Anexo 20. Extracto alcohólico Baljet ............................................................................. 55

Anexo 21. Extracto alcohólico Cloruro Férrico ........................................................... 55

Anexo 22. Extracto alcohólico Dragendorff ................................................................. 56

Anexo 23. Extracto alcohólico Fehling .......................................................................... 56

Anexo 24. Extracto alcohólico Liebermann Burchard ................................................ 57

Anexo 25. Extracto alcohólico Shinoda ......................................................................... 57

Anexo 26. Extracto etéreo Baljet ................................................................................... 58

Anexo 27. Extracto etéreo Liebermann Burchard ....................................................... 58

Anexo 28. Extracto etéreo Sudan................................................................................... 59

VIII

Anexo 29. Maceración para Extracción Sucesiva ........................................................ 59

Anexo 30. Muestra filtrada lista para Rota-evaporar ................................................. 60

Anexo 31. Rotaevaporando la muestra ......................................................................... 60

Anexo 32. Extractos obtenidos con el Rotaevaporador ............................................... 61

Anexo 33. Cromatografía Capa Fina de los extractos de N. lappaceum L. ............... 62

1

INTRODUCCIÓN

Desde épocas inmemorables, el hombre se ha valido de las partes de la planta para

satisfacer sus necesidades vitales, alimenticias, por sus propiedades nutricionales.

El fruto es una de las partes de la planta que más valores nutricionales aporta como

vitaminas que ayudan a la eliminación de los radicales libres del organismo.

Nephelium lappaceum L. es un frutal tropical originario de Malasia e Indonesia,

cultivado principalmente para su consumo como fruta fresca que ayuda a la

eliminación de estos radicales tiene formas redonda u ovoide de pericarpio rojo o

amarillo. Dentro las propiedades de achotillo también vale la pena mencionar un

compuesto muy importante llamado el ácido gálico, que también tiene efecto sobre

los radicales libres, protege al cuerpo del daño que producen y combate el cáncer

(Wall, 2006).

Se conoce que el achotillo tiene una gran variedad de compuestos que son

beneficiosos para la salud humana y los cuales se han aplicado para mejorar el estilo

de vida de las personas, pero al no tener conocimiento sobre los diversos

compuestos presenten en las partes de este fruto se puede estar perdiendo una gran

aplicabilidad de estos, en los diferentes campos como en las industrias

farmacéutica, cosmética y alimenticia.

La finalidad de este estudio en la corteza del fruto de la especie, es conocer los

diferentes metabolitos que se encuentran en mayor proporción, mediante diferentes

estudios como son estudios farmacognósticos y fitoquimicos, parámetros físicos

como humedad, cenizas y sustancias solubles; y determinación de la concentración

de los metabolitos presentes en la muestra.

2

CAPÍTULO I. EL PROBLEMA

I.1 Planteamiento del problema

La farmacognosia es el estudio de recursos naturales como fuente de nuevos

productos de importancia farmacéutica. Es la ciencia que estudia las propiedades

físicas, químicas, bioquímicas, biológicas y farmacéuticas de las drogas de origen

natural. Implica además la búsqueda de nuevas drogas a partir de recursos naturales,

combinada con la Química, es la ciencia que estudia tanto la composición, como la

estructura y las propiedades de la materia como los cambios que esta experimenta

durante las reacciones químicas y su relación con la energía. Sin embargo, existe

plantas que aún no han sido estudiadas a profundidad como es el caso del Nephelium

lappaceum L. ya que su corteza es rico en vitamina C; por ejemplo, ayudan a la

absorción del hierro y el cobre; a su vez este tipo de vitamina ayuda a eliminar los

radicales libres del organismo. Dentro las propiedades de achotillo también hay que

mencionar un compuesto llamado el ácido gálico, que también tiene efecto sobre

los radicales libres, protege al cuerpo del daño que producen y combate el cáncer

(Wall, 2006).

Las propiedades beneficiosas de las frutas y vegetales sobre la salud están

asociadas con los metabolitos secundarios llamados fitonutrientes, los cuales

pueden ser agrupados como fenoles, terpenos y derivados azufrados. El término

fenoles de las plantas debería ser el más adecuado, sin embargo, ha sido cambiado

por polifenoles, debido a su utilización en el campo nutricional, la industria

agrícola, cosmética y de alimentos.

1.1.1 Formulación del problema

¿Existirán diferencias farmacognosticas y químicas en la corteza del fruto

entre sus variedades dulce y amargo de Nephelium lappaceum L?

3

I.2 Hipótesis

El estudio farmacognostico y químico permitirá diferenciar las características y

componentes de las variedades dulce y amargo de N. lappaceum L.

I.3 Objetivo General

Realizar el estudio farmacognostico y químico de la corteza de los frutos

dulces y amargos de N. lappaceu

I.4 Objetivos Específicos

Establecer los parámetros físico-químicos de la corteza de los frutos de N.

lappaceum.

Determinar la composición cualitativa del material vegetal en estudio,

mediante tamizaje fitoquímico.

Desarrollar la extracción sucesiva, para la obtención de todos los

metabolitos secundarios.

Analizar los compuestos presentes en los extractos hexánicos y de

diclorometano de la corteza de los frutos de achotillo, mediante

Cromatografía gaseosa / Espectrometría de masas.

4

Capítulo II MARCO TEÓRICO

II.1 Nephelium lappaceum L.

II.1.1. Origen y Distribución

Nephelium lappaceum L. o comúnmente conocido como: achotillo, rambután o

mamón chino es una fruta nativa del continente asiático, particularmente de Malasia

e Indonesia; y que ha sido cultivada en otros países como Thailandia, Vietnam,

India, Sri Lanka desde 1912. Su vocablo proviene de malayo “rambut” que significa

pelo, el mismo que hace mención a las espinas largas y suaves que cubren la fruta.

Este fruto tiene un sabor característico que es dulce, su pulpa es jugosa, y contenido

de ácido ascórbico y riboflavina (Moreno, 2013).

En América es una fruta muy conocida, y uno de los primeros países que la cultivo

fue México en el año 1950. Hoy en día se puede encontrar plantaciones del

Nephelium lappaceum L. en muchas áreas tropicales y subtropicales alrededor de

todo el mundo, así es el caso de Colombia, Ecuador, Honduras, México y Cuba.

(Arias, 2016).

El achotillo es un árbol tropical de medio tamaño, que alcanza 15-25 m de altura,

tiene un tronco recto de 60 cm de ancho, y sus hojas perennes son alternas,

compuestas pinnadas, de 7-30 cm de largo, las ramas son frágiles y rugosas sus

flores son pequeñas y no poseen pétalos (Valdez, 2014).

El fruto del achotillo es ovoide o elipsoidal, es de color rojo brillante o marrón

oscuro de 3-8 cm de largo. Su piel es delgada, coriácea y está cubierta de tubérculos,

de cada uno de los cuales se extiende una espina carnosa, roja o amarilla de 0.5-2

cm de largo, estas puntas son caducas en algunos tipos (Valdez, 2014).

La piel con puntas es responsable de la denominación común de la fruta, que se

basa en la palabra malaya "rambut", que significa "cabello". Adentro la pulpa es

blanca, translúcida, jugosa, ácida, o dulce, con 0.4-0.8 cm de espesor, adherida en

mayor o 6 menor grado a la semilla algo aplanada y ovoide, que es de 2,5-3,4 cm

5

de largo y 1- 1.5 de ancho. Puede haber 1 o 2 frutas subdesarrolladas pequeñas

ubicadas cerca del tallo de una fruta madura (Valdez, 2014).

II.1.2 Taxonomía

En la Tabla I se refiere la clasificación taxonómica de la especie Nephelium

lappaceum L. de acuerdo a Anderson, (2018).

Tabla I. Taxonomia Nephelium lappaceum L.

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Sapindales

Familia Sapindaceae

Genero Nephelium

Especie lappaceum

II.1.3. Descripción botánica

II.1.3.1. El árbol: su tamaño puede alcanzar de 15 a 20 metros de altura, su tronco

puede medir de 50 a 60 cm diámetro. Su corteza es de color gris y café-oscuro

(Navarrete, 2017).

II.1.3.2. Frutos: Los frutos pueden ser redondos elipsoide u ovalados. Los más

comunes son los ovoides miden de 3 a 6 cm de largo y de 3 a 4 cm de ancho de

color rojo claro a intenso. El pericarpio puede variar entre una coloración rosa a

carmesí. La parte comestible (arilo) de la fruta es color blanco translúcido con un

sabor ácido-dulce (Ochoa. 2013).

6

II.1.3.2.1. Valores Nutricionales del fruto

En la figura 1 se expone una foto de los frutos de la especie. A ésta se le atribuyen

propiedades medicinales astringentes y afrodisiacas, es un fruto nutritivo de alto

contenido en Vitamina C y Riboflavina, contiene vitaminas hidrosolubles del

complejo B como el ácido fólico (Perez, 2016).

Vargas (2003), demostró que de los tres componentes del fruto, la cáscara fue el

principal reservorio de macronutrientes con los contenidos más abundantes de N,

K, Ca, Mg y S. Tanto la semilla como la pulpa presentaron cantidades similares de

Ca, Mg y S. El nivel de P en los cultivares fue similar tanto en la cáscara como en

la semilla o en la pulpa.

Figura 1. Fruto Nepphelium lappaceum L.

II.1.4. Propiedades Medicinales

N. lappaceum por tener un gran valor nutricional se le atribuyen propiedades

medicinales tales como (Pérez, 2018):

Antioxidantes. Elimina los radicales libres.

Antiséptica. Desinfecta las heridas si se aplica de forma tópica.

Antivírica. Ayuda a combatir algunos virus.

7

Mejora el tránsito intestinal. Elimina la indigestión y las dolencias

estomacales.Calmante. Mejora el sistema nervioso, ayuda a eliminar y

prevenir la ansiedad y el estrés.

Reduce el colesterol. Reduce los riesgos de padecer enfermedades

cardiovasculares.

Mejora la absorción de hierro del organismo.

Fortalece el sistema inmunológico. Ayuda a la creación de nuevos glóbulos

rojo, glóbulos blancos y plaquetas.

Se utiliza como tratamiento contra la disentería.

Antipirética. La corteza y las raíces del rambután son utilizadas en

infusiones para eliminar y bajar la fiebre alta.

II.1.5. Variedades de Nephelium lappaceum L.

Para la especie se han informado diferentes variedades entre las cuales se pueden

citar (Pérez, 2016)

Nombre de

Variedad

Tamaño

del Fruto

Color de

Cascara

Pulpa de

Fruta

Cosecha p/

Arbol Edad Tipo

Ponderosa Extragrande Rojo 35.73% 138 Kgs. 6 años Freestone

Ferreras

Magsaysay Grande Rojo

Oscuro 42.68% 80 Kgs. 6 años Freestone

Gobernador

Infantada Extragrande Rojo 39.28% 150 Kgs. 6 años Agridulce

El Bebe

Eulie Extragrande Rojo 39.92% 160 Kgs. 8 años Freestone

8

II.1.6. Composición química de N. lappaceum

Nephelium lappaceum es una fruta tropical que posee propiedades antioxidantes.

Se han realizado experimentos sobre el aislamiento e identificación de los

constituyentes activos y sobre su actividad antioxidante utilizando ensayos de

inhibición de la peroxidación lipídica. El extracto metanólico de las cáscaras de N.

lappaceum a exhibido fuertes propiedades antioxidantes. La cromatografía

Sephadex LH-20 ha sido usada en el aislamiento de cada componente y se han

estudiado las propiedades antioxidantes de cada uno de ellos (Thitilertdecha, 2010).

Los compuestos aislados (figura 2), se identificaron como ácido elágico, corilagina

y geraniina .Estos compuestos representaron el 69.3% del extracto metanólico, con

geraniina (56.8%) como el componente principal y exhibieron actividades

antioxidantes mucho mayores que el BHT tanto en la peroxidación lipídica (77-186

veces) como en la DPPH • (42-87 veces) (Thitilertdecha, 2010).

Figura 2. Principales clases de compuestos fenólicos presentes en frutos

9

II.2. Metabolitos secundarios, Activad antioxidante y Métodos de análisis

II.2.1. Compuestos fenólicos

Sólo las plantas y los microorganismos son capaces de biosintetizar el núcleo

aromático. Hay dos vías principales por las cuales se biosintetizan los compuestos

fenólicos en la naturaleza:

• Acetato - malonato (acetogeninas o policétidos aromáticos, formados por

condensación de Claisen o aldólica, casi siempre policíclicos: cromonas,

isocoumarinas, orcinoles, dépsidos, depsidonas, xantonas, quinonas).

• Shiquimato (ácidos cinámicos y sus derivados: ácidos benzoicos, acetofenonas,

lignanos, ligninas y coumarinas).

Ambas vías pueden generar compuestos con el mismo esqueleto (quinonas) o

pueden conjugarse, formando compuestos de origen mixto (flavonoides). El patrón

de oxigenación puede tomarse como un indicio del origen de un polifenol, pues los

derivados del ácido acético pueden conservar la alternancia de los oxígenos (patrón

meta), mientras que los derivados del shiquimato guardan relación orto. No debe

olvidarse la posibilidad de oxigenaciones o deshidrataciones posteriores, que

alteran estos patrones, complicando cualquier análisis superficial.

Los compuestos fenólicos sencillos se pueden clasificar en:

• Derivados de fenoles simples (C6).

• Derivados de ácido benzoico (C6-C1).

• Derivados de acetofenona (C6-C2).

• Derivados del ácido cinámico (C6-C3).

La mayoría de los compuestos fenólicos de bajo peso molecular se presentan en

forma combinada, generalmente como O-glicósidos.

En la naturaleza hay relativamente pocos fenoles simples, aunque son comunes en

las plantas superiores. Se forman a partir del ácido shiquímico o por degradación

de los fenilpropanos correspondientes (ácido cinámico y sus derivados), aunque

10

algunos derivan del ácido acético. Los derivados del ácido benzoico aparecen

generalmente esterificados o formando glicósidos (heterósidos). La mayoría forma

parte de estructuras más complejas (Miranda, 2012).

II.2.2. Flavonoides

Los flavonoides son compuestos que tienen bajo peso molecular que comparten un

esqueleto común difenilpirano (C6-C3-C6), se encuentran mayoritariamente

como glucósidos, y también pueden aparecen en forme libre. Se presentan como

sulfatos, dímeros ó polímeros (Quiñonez, 2012).

En los alimentos existen algunos compuestos bioactivos de tipo flavonoides,

denominados como fitonutrientes estos son una subclasificación de los polifenoles

que se caracterizan por tener estructuras C6-C3-C6 con dos o más anillos

aromáticos, y por tener cada uno, un hidroxilo aromático y unirse a un puente de

carbono. Este puente consta de tres carbonos para los flavonoides que se combina

con un oxígeno y dos carbonos (figura 3) (Hernández, 2015).

11

Figura 3. Estructuras químicas de diversos compuestos C6-C3-C6 encontrados

en alimentos

II.2.2.1. Clasificación. Distintos tipos de flavonoides.

En la mayoría de los flavonoides el anillo A puede ser meta dihidroxilado (5,7) o

victrihidroxilado (5, 6, 7), debido a su origen biosintético diferente del anillo B.

Las estructuras de los diferentes tipos de flavonoides dependen de la naturaleza del

oxígeno heterocíclico pues este deriva del pirano, del pirilo o de la pirona. La

ciclización se acomete entre el tercer carbono de la cadena y un grupo OH del anillo

12

A en posición orto a esta cadena (excepto para las auronas), lo cual conlleva a la

formación de la estructura del cromeno o cromona.

El puente C3 puede variar en su nivel de oxidación, siendo más alto en el caso de

las dehidrochalconas y menor en las catequinas.

De acuerdo con esto tendremos:

2-fenilbenzopirilio: antocianinas.

2-fenilcromonas (cromona = benzo-pirano): flavonas, flavonoles (80 % del

total); flavanonas, dihidroflavonoles; isoflavonas, isoflavanonas (3-

fenilcromanos).

2-fenilcromanos (cromano = benzopirano): flavanos, 3-flavanoles; 3,4-

flavandioles.

Chalconas y dihidrochalconas.

2-bencilideno coumaranonas (auronas).

En las plantas se encuentran fundamentalmente en forma de glicósidos, lo cual les

infieren una alta solubilidad en agua y disolventes polares, lo cual se incrementa

por la alta polaridad de sus estructuras. La variación estructural de los flavonoides

es inmensa, tanto por la naturaleza del azúcar, como por la posición del enlace

glicosídico. Los oligosacáridos que se combinan con los flavonoides están

generalmente restringidos a enlaces 1,2 ó 1,6 y, generalmente el azúcar es glucosa.

La posición de sustitución varía en las diversas estructuras flavonoides. Así, las

antocianinas casi todas tienen un azúcar en C3 y los biglucósidos 3,5 son muy

comunes, siendo raros los glicósidos en C7, como por ejemplo, la cianidina -7¬-

arabinósido. En contraste, los flavonoides frecuentemente tienen un azúcar en las

posiciones C3 y C7.

Mientras que la mayoría de los flavonoides simples son hidrolizados fácilmente por

las emulsinas, las antocianidinas requieren de enzimas específicas (antocianasas)

(Miranda, 2012).

13

II.2.3. Antioxidantes

II.2.3.1. Generalidades

Un antioxidante es un compuesto químico que hallándose presente a bajas

concentraciones con respecto a las de un sustrato oxidable, retarda o previene la

oxidación de dicho sustrato. Igualmente se definen como compuestos que protegen

el sistema celular de efectos potencialmente perjudiciales en los procesos que

puedan causar una oxidación excesiva (Hernández, 2015).

Un antioxidante es una sustancia que tiene las siguientes características:

Hallándose presente a bajas concentraciones respecto a las de un sustrato

oxidable, retarda o previene la oxidación de dicho sustrato.

Previene la formación de radicales libre en cantidades perjudiciales para el

organismo.

Estimula los mecanismos de reparación endógena al daño causado por el

ataque de radicales libres.

Suministra entidades químicas que aumentan la capacidad endógena de

secuestro de radicales libres.

II.2.3.2. Comportamiento antioxidante de los fenoles

Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos son caracterizados por

un núcleo benzénico que lleva uno o varios grupos hidroxilos y una cadena lateral

funcional. La concentración total de compuestos fenólicos suelen clasificar en dos

grandes grupos: no flavonoides y flavonoides (Dominguez, 2012).

Diversos trabajos relacionan la capacidad antioxidante con el contenido de fenoles

totales y antocianinas; ya que cada componente fenólico puede contribuir de forma

y proporción diferente. Distintos autores han determinado que existe una

correlación lineal positiva entre el contenido de fenoles totales y el poder reductor.

Este hecho ha sido observado en distintos productos vegetales, como extractos de

hierbas (Zheng y Wang, 2001) y en té (Benzie y Szeto, 1999) en (Dominguez,

2012).

14

II.2.3.3. Mediación de la actividad antioxidante

No puede ser medida directamente la actividad antioxidante, pero puede

determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación

controlada. Según Clarkson, la medición de una muestra oxidante, pueden usarse

intermediarios o productos finales para este modo valorar la actividad antioxidante

(Hernández, 2015).

La actividad antioxidante de una muestra no puede determinarse solo en un ensayo

de prueba. En la práctica se realizan varios modelos de test in vitro para así evaluar

esta actividad en la muestra de interés; pero es necesario considerar que los modelos

presentan diferentes variaciones ya que puede dificultar un poco la comparación de

los resultados entre un método y otro (Hernández, 2015).

II.2.4. Métodos de análisis

II.2.4.1. Cromatografía

Las técnicas cromatográficas se basan en la separación de las sustancias presentes

en una mezcla compleja al poner ésta en contacto con una fase móvil (líquido o gas)

y otra estacionaria (sólida o líquida) que permanece fija. Las sustancias van a migrar

a través de la fase estacionaria arrastradas por la fase móvil, a distinta velocidad

según su afinidad o solubilidad en una u otra fase. (Palomino, 2001)

Las sustancias más afines por la fase estacionaria migrarán más despacio, y las más

afines por la fase móvil, más deprisa. Ajustando los parámetros cromatográficos,

conseguiremos separar todos los componentes. Los tres tipos más comunes son la

cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía de gases (CGL) y la de líquidos

(HPLC) (Palomino, 2001).

II.2.4.2. Cromatografía en Capa Fina (CCF)

Se emplea en controles de todo tipo de productos naturales, habiéndose establecido

como método analítico muy importante en las farmacopeas modernas. Permite

identificar de forma rápida y bajo coste los componentes presentes en un

15

determinado material vegetal. También se puede emplear como método

semicuantitativo. (Palomino, 2001)

II.2.4.3. Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas

La cromatografía de gases-masas es una técnica que combina la capacidad de

separación que presenta la cromatografía de gases con la sensibilidad y capacidad

selectiva del detector de masas. Esta combinación permite analizar y cuantificar

compuestos trazas en mezclas complejas con un alto grado de efectividad. Esta

técnica está indicada para la separación de compuestos orgánicos volátiles y

semivolátiles. Hidrocarburos Poliaromáticos (PAHs), Pesticidas clorados y VOCs

son separados de forma adecuada mediante esta técnica. (Sarria, 2017)

16

CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS

III.1. Metodología de la investigación

El presente trabajo se basa en un método de investigación de tipo experimental,

según la finalidad de la investigación, se aplicó un método adecuado para la

extracción y la determinación de los compuestos presentes en el fruto, la misma que

se realizó en los Laboratorios de facultad de Ciencias Químicas de la Universidad

de Guayaquil.

III.2. Material vegetal en estudio

El material vegetal objeto de estudio fueron los frutos y se recolectaron entre los

meses de junio y agosto del 2017 en una Finca ubicada en la Provincia de Los Ríos

Cantón Quevedo, ubicada a 1°1´49”S y 79°24´48”E; se escogieron plantas adultas

de aproximadamente 15 a 25 m de altura en estado de floración-fructificación. Para

los análisis experimentales de la investigación se utilizaron dos variedades de

frutos, dulce y amarga.

III.3. Técnicas y Métodos

III.3.1. Análisis Macro-morfológico del fruto

Es una evaluación por medio de los órganos sensoriales en los cuales se tomará en

consideración: Morfología, tamaño, olor, color externo e interno y textura del

órgano vegetal (Miranda 2000).

Procedimiento:

Las características más relevantes a considerar son:

Estado de desarrollo

Condiciones: fresca, seca, completa o parte de ella.

Color.

Olor.

Peculiaridades.

17

III.4. Parámetros físico-químicos de las drogas crudas

III.4.1. Humedad residual.

Se empleó el método gravimétrico, a partir de 2 g de muestra, se utilizó crisoles

tarados y para las pesadas una balanza analítica marca Sartorius. Los resultados se

obtuvieron a partir de la expresión:

Vf - Vi

Mx 100Hr =

Dónde:

Hr: humedad residual (%)

Vf: volumen final de agua (mL)

Vi: volumen inicial de agua (mL)

M: masa de la muestra (g)

100: factor matemático para el cálculo.

III.4.2. Sustancias solubles o extraíbles.

Se coloca 4,0 gramos de la muestra vegetal secado al aire, exactamente pesados, en

un matraz Erlenmeyer. Se añade 100ml del disolvente y pesar para obtener el peso

total incluyendo el matraz. Agitar bien y dejar reposar durante 1 hora. Se acopla un

condensador de reflujo al matraz y se hierve suavemente durante 1 hora, enfriar y

pesar. Ajustar al peso total original con el disolvente especificado en el

procedimiento de prueba para el material vegetal. Agitar bien y filtrar por succión

a través de un papel filtro seco.

Se transfiere 25 ml del filtrado a un plato de fondo plano y se evapora el contenido

hasta sequedad en un baño de agua. Secar a 105oC durante 2 horas, luego se enfría

en un desecador ´por 30 minutos y se procede a pesar.

FORMULA:

R.500.100

M (100-H)Ss =

18

Donde:

Ss: sustancias solubles (%)

R: residuo de la muestra (g)

M: masa de la muestra (g)

H: humedad residual (%)

500 y 100: factores matemáticos para el cálculo.

III.4.3. Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido

clorhídrico al 10 %.

Para las determinaciones se empleó una mufla modelo SX2-12TP,

procedencia China. Las pesadas se realizaron en balanza analítica marca Sartorius.

Cada determinación se efectuó por triplicado a partir de 2 g de material.

III.4.3.1. Cenizas totales.

Los cálculos se efectuaron por la expresión siguiente:

CT =M2 - M

M1 - Mx 100

Donde:

Ct: cenizas totales (%)

M: masa del crisol vacío (g)

M1: masa del crisol con la muestra (g)

M2: masa del crisol con la ceniza (g)


III.4.3.2. Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %.

Se determinaron a partir de las cenizas totales, después de tratar las mismas

con ácido clorhídrico al 10 %. Los resultados se obtuvieron según:

19

M2 - M

M1 - MB = x 100

Donde:

B: cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada (%)

M2: masa del crisol con la ceniza (g)

M: masa del crisol vacío (g)

M1: masa del crisol con la porción de ensayo (g)


III.5. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico

El tamizaje fitoquímico se realizó a la corteza del fruto, según

procedimiento descrito por Miranda y Cuéllar (2000). Se utilizó un sistema

de extracción con una batería de disolventes, de menor a mayor polaridad,

sobre el mismo material vegetal, para lograr que cada metabolito fuera

extraído adecuadamente según su selectividad por el disolvente empleado.

Las muestras se extrajeron sucesivamente con éter di etílico, etanol al

80 % y agua, para obtener los extractos correspondientes, los que fueron

sometidos a los diferentes ensayos. En las figuras 4 y 5 se muestran el

esquema general de extracción y los diferentes ensayos a realizar en cada

extracto obtenido, respectivamente.

20

Figura 4. Esquema de extracción del material vegetal para la

aplicación de técnicas de tamizaje fitoquimico

Figura 5. Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a

realizar a los diferentes extractos

21

En cada caso para realizar los ensayos se procede de la siguiente manera:

Ensayo de Sudan.- En un tubo de ensayo colocar una alícuota del extracto del

material vegetal, agregar 1 mL de la solución de Sudán IV y llevar a baño de agua

hirviendo hasta evaporación del solvente, la presencia de una película o gotas de

color rojo en la superficie del tubo es indicativo de un ensayo positivo para

compuestos grasos.

Ensayos de Dragendorff, Mayer, Wagner.- Son pruebas cualitativas que permiten

identificar la presencia de alcaloides, para ello, si el extracto es acuoso se deberá

agregar para cada ensayo una alícuota del extracto previamente acidificada con 1

a 2 gotas de HCl concentrado y llevar a calentar, mientras, que si el extracto se

realizó con solventes orgánicos se procederá a evaporar y el residuo redisolverse

con 1 mL de HCl al 1% en agua, por último añadir 3 gotas del reactivo específico;

la presencia de opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado

(+++).

Ensayo de Baljet.- Es ideal para la identificación de coumarinas. Cuando el extracto

no es alcohólico, debe evaporarse el solvente en baño María y redisolverse con 1

mL alcohol; y al final se agrega 20 gotas del reactivo Baljet, la aparición de

coloración o precipitado rojo se considera positiva.

Ensayo de Borntrager.- Tomar una alícuota del extracto redisuelta en cloroformo

adicionar 1 mL de solución de hidróxido de sodio al 5 %, agitar mezclando las fases

y reposar. Si la fase acuosa alcalina se torna rosada o roja el ensayo se considera

positivo para quinonas.

Ensayo de Liebermann- Burchard.- Permite reconocer en un extracto la presencia

de triterpenos y/o esteroides por ambos tipos de productos poseer un núcleo del

androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. A una alícuota

del extracto redisuelta en cloroformo adicionar 1 mL de reactivo, y a continuación

observar el cambio rápido de coloración: Rosado azul (muy rápido); Verde intenso

(visible aunque rápido); Verde oscuro (final de la reacción).

22

Ensayo de resinas.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de la solución alcohólica

y 10 mL de agua destilada, la aparición de un precipitado sugiere la presencia de

resinas.

Ensayo de fehling.- Confirma la presencia de azucares reductores con la aparición

de un precipitado rojo, por ello, al residuo de una alícuota del extracto alcohólico

previamente disuelto con 2 mL de agua destilada, adicionar 2 mL del reactivo de

fehling y calentar en baño de agua caliente aproximadamente por 10 minutos, sin

embargo, si es un extracto acuoso agregar directamente el reactivo.

Ensayo de espuma.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de extracto y diluir con

5 veces su volumen en agua, mezclar fuertemente durante 10 minutos. Al presentar

espuma en la superficie del líquido de más de 2mm de altura y persistencia por más

de 2 minutos inmediatamente el ensayo se considera positivo para saponinas.

Ensayo de cloruro férrico.-Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos

y/ o taninos en un extracto vegetal, por ello, si el extracto es alcohólico a una

alícuota de este se le adicionan 3 gotas de cloruro férrico al 5% en solución salina

fisiológica. Si el extracto es acuoso a una alícuota del extracto se añade acetato de

sodio para neutralizar y 3 gotas de una tricloruro férrico al 5% en solución salina

fisiológica, un ensayo positivo puede sugerir la presencia de: Compuestos fenólicos

(Rojo-vino); taninos de tipo pirocatecólicos (verde intenso), taninos del tipo piro

pirogalotánicos (azul).

Ensayo Shinoda.- Exclusivo para la identificación de flavonoides en un extracto de

un vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra el alcohol, se diluye con 1 mL

de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico.

Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se

mezclan las bases y se deja reposar hasta que se separen.

Si la alícuota del extracto se encuentra en agua se procede de igual forma, a partir

de la adición del ácido clorhídrico concentrado. El ensayo se considera positivo,

con el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos

todos los casos.

23

Ensayo de mucílagos.- Permite identificar estructuras de tipo polisacárido,

mediante la formación de coloide hidrófilo al enfriar entre 0-5 °C una alícuota del

extracto acuoso

Ensayo de principios amargos y astringentes.- Saborear 1 gota del extracto acuoso

y diferenciar el sabor de cada uno de estos principios al paladar.

III.6. Extracción sucesiva del material vegetal

El procedimiento seguido para la extracción del material vegetal, se expone en la

figura 6.

II.7. Cromatografía

Procedimiento

En la cámara se adiciona los solventes orgánicos (fase móvil) que son:

Hexano 10ml

Acetato etilo 5ml

Cloroformo 5ml

Metanol 2,5 ml

En la silicagel se mide 1 ml en la parte inferior la misma que será la línea de

referencia o de partida y 1,5 ml en la parte superior.

En la parte inferior se realizarán las punzadas con ayuda de un capilar, se realiza

una punzada se espere que se seque y luego se realiza la segunda punzada.

Luego la silicagel se la coloca en la cámara que esta con la fase móvil y se espera

hasta que los solventes corran o se desplacen sobre la fase fija.

Si en la silicagel al ser expuesta a la luz UV muestra manchas de colores significa

que existe la presencia de grupos cromóforos altamente saturados.

Luego se adiciona ácido sulfúrico al 50% en etanol el mismo que se lo emplea como

revelador no selectivo (revela todos los compuestos).

Rf=distancia recorrida por el soluto

distancia recorrida por la fase movil

24

Figura 6. Esquema de la extracción sucesiva del material vegetal.

500 g de material vegetal, seco y molido

Extracción por maceración7 días con Hexano

Filtrar

EXTRACTOHEXANO

Residuo

Extracción por maceración7 días con Diclorometano

Filtrar

EXTRACTODCM

Residuo

Extracción por maceración7 días con Acetato de etilo

Filtrar

EXTRACTOACETATO DE ETILO

ResiduoExtracción por maceración7 días con Butanol

Filtrar

EXTRACTOBUTANOL

ResiduoExtracción por maceración7 días con Metanol

Filtrar

EXTRACTOMETANOL

ResiduoDESECHAR

25

III.6.1. Análisis por cromatografía gaseosa.

Los extractos no polares se analizaron mediante el uso de un cromatógrafo de gases

Agilent Technologies acoplado a un espectrómetro de masas (sistema 7890A GC y

5975C inerte XL MSD con detector de triple eje). Las condiciones de trabajo fueron

las siguientes: Columna capilar HP-55% Phenyl Methyl Siloxan 325° C: 30 m x

320 µm x 0.25 µm. La temperatura inicial del horno se mantuvo a 70° C durante

2,0 minutos, luego se aumentó a 300° C a 5° C/min, donde se mantuvo por 6

minutos. El espectrómetro de masas fue operado a 70eV en modo full scan desde

40-1000 UMA. Temperatura de la fuente 230° C, temperatura del cuadrupolo 150°

C. Temperatura del inyector: 280° C, volumen de inyección 2 µL con gas portador

helio a 1 mL/min. Los compuestos se identificaron mediante la comparación de sus

espectros de masas y la referencia de masa de Wiley 9th con NIST 2011 MS Library

tomando en cuenta aquellos con un porcentaje de similitud del 95% o superior.

26

CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSION

La recolección de las dos variedades de frutos de achotillo, se realizó en el mes de

octubre del 2018. Cabe resaltar que el tratamiento de secado tuvo que ser inmediato

puesto que por el alto contenido de agua la corteza del fruto pierde sus propiedades

con prontitud.

Luego se realizó la limpieza y el análisis macroscópico de los frutos de las dos

variedades, las características se detallan en la tabla II.

Tabla II. Análisis Macroscópico de los Frutos

MACROSCOPIA

IMAGEN DE CADA

VARIEDAD ASPECTO

DULCE

Fruto esquizocarpo, profundamente partido en 2-3

mericarpios es grande redondeado, rojo, su corteza

delgada, semilla con arilo carnoso, blanco-

translúcido y muy jugoso.

AMARGA

Fruto esquizocarpo, profundamente partido en 2-3

mericarpios es pequeño ovalado, rojo amarillento-

verdoso, su corteza es gruesa, semilla con arilo

carnoso, blanco-translúcido jugoso.

Elaborado por: (Batioja & Lara)

27

Con la ayuda de un vernier se procedió a medir el largo y ancho de los frutos que

representaban nuestra muestra obtenida a partir de un total de 1000 frutos por

variedad, nuestros ejemplares medidos fueron 278, en la tabla 3 se presentan las

medidas promedio de cada variedad, y la desviación estándar correspondiente.

Tabla III. Medidas de los frutos de N. Lappaceum

Variedad Largo Ancho

Dulce 38.61 ± 0.08 32.90 ± 0.06

Amarga 33.21 ± 0.05 25.63 ± 0.04

Elaborado por: (Batioja & Lara)

Con las medidas descritas se pudo corroborar que los frutos de la variedad dulce

son más grande y de forma redondeada mientras que los frutos de la variedad

amarga son pequeños y ovalados.

Para continuar con el estudio se realizó el tratamiento de la muestra. Separamos la

corteza de la pulpa, siendo la corteza la parte de interés.

Se procedió a secar la muestra en la estufa para evitar que microorganismos

provocaran la descomposición de la misma, esta muestra seca fue triturada donde

se obtuvo 1352, 9g de la variedad dulce y 1987,2 de la variedad amarga.

Para las dos variedades de corteza objeto en estudio se determinaron los parámetros

físicos- químicos, los resultados se detallan en la tabla 4.

28

Tabla IV. Determinación de parámetros físicos-químicos en las muestras de las

dos variedades

PARÁMETROS

MUESTRA (CORTEZA DEL FRUTO)

Variedad dulce Variedad amarga

Humedad residual 2,931 ± 0,06 4,440 ± 0,26

Cenizas totales 3,046 ± 0,032 3,275 ± 0,08

Cenizas insolubles en HCl 99,950 ± 0,037 99,927 ± 0,047

Sustancias

solubles

Hexano 2,64 ± 0,065 10,95 ± 0,03

Acetato de

etilo 22,61 ± 0,025 31,40 ± 0,01

Etanol 80% 35,18 ± 0,041 43,36 ± 0,032

Etanol 50% 25,16 ± 0,038 26,78 ± 0,016

Agua 12,57 ± 0,016 16,58 ± 0,01

Elaborado por: Batioja & Lara

El contenido de agua en la muestra se determinó con el análisis de humedad

residual, este se ve dado por la pérdida de peso de la muestra seca, esta prueba

indicó que la variedad dulce presentaba menor porcentaje de humedad residual, y

la corteza amarga mostraba mayor porcentaje de humedad.

Se pudo deducir que la variedad dulce presentaba menor porcentaje de humedad

debido a que su corteza es más delgada y su mayor contenido de agua se encuentra

en la pulpa, mientras que la corteza de la variedad amarga tenía mayor espesor y su

pulpa era menos jugosa.

29

En la determinación de cenizas se demostró que la variedad amarga tenía mayor

contenido de material inorgánico.

La determinación de sustancias solubles se basa en la solubilidad de sustancias

activas en un solvente determinado, esta prueba se realiza cuando no se conoce la

acción de las sustancias activas y composición de la muestra en estudio.

Se realizó la prueba con hexano, acetato de etilo, etanol 80% etanol 50% y agua,

con estos disolventes se demostró que la corteza de la variedad amarga presentaba

mayor contenido de sustancias solubles. La mayor solubilidad de sustancias se dio

en etanol 80% y acetato de etilo.

El tamizaje fitoquímico permite determinar cualitativamente los principales grupos

químicos presentes en una droga y a partir de allí, orientar la extracción y/o

fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés.

Para el tamizaje fitoquímico se realizaron tres maceraciones: éter, metanol y agua,

también se utilizaron los extractos obtenidos en el análisis de sustancias solubles.

Los resultados se exponen en las tablas 5, 6 y 7.

Tabla V. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto etéreo

Ensayo Extracto etéreo

Extractos de sustancias solubles.

Acetato de etilo Hexano

Dulce Amarga Dulce Amarga Dulce Amarga

Sudan

(compuestos grasos) - - + + + +

Dragendorff

(alcaloides) + + + + - -

Baljet

(lactonas y coumarinas) - - - - - -

Liebermann Buchard

(triterpenosesteroides) + + - - - -


30

Tabla VI. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto alcohólico

Ensayo Extracto alcohólico

Extractos de

sustancias solubles.

Etanol 80%

Dulce Amarga Dulce Amarga

Liebermann Buchard

(triterpenosesteroides) - - - -

Dragendorff

(alcaloides) + + - -

Cloruro Férrico

(fenoles y taninos) ++ ++ ++ ++

Fehling

(azucares reductores) - - - -

Shinoda

(flavonoides ) ++ ++ ++ ++

Baljet

(lactonas y coumarinas) + + - -


Tabla VII. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto acuoso

Ensayo Extracto acuoso

Extractos de sustancias solubles.

Agua Etanol 50%

Dulce Amarga Dulce Amarga Dulce Amarga

Cloruro Férrico

(fenoles y taninos) +++ +++ +++ +++ +++ +++

Shinoda

(flavonoides ) +++ +++ ++ ++ - -

Dragendorff

(alcaloides) + + + + - -

Fehling

(azucares reductores) ++ ++ + + - -

Espuma

(saponinas) + + + + - -


31

Los resultados de la tabla V pusieron de manifiesto que en los extractos obtenidos

para las sustancias solubles con acetato de etilo y hexano existían trazas de

compuestos grasos, el ensayo para alcaloides dio positivo en extracto etéreo y en

acetato de etilo, por último el extracto etéreo presentó triterpenos/esteroides.

Cabe destacar que cuando en un extracto suele haber presencia de compuestos con

agrupaciones lactónicas o azúcares, el ensayo de alcaloides da positivo, ya que el

reactivo de Dragendorff precipita con estos compuestos. Se supone por tanto que el

ensayo para alcaloides debe ser producto de un falso positivo, pues en la familia

Sapindaceas no se informa la presencia de estos compuestos.

En la tabla VI se demostró que la corteza en estudio contenía compuestos fenólicos

en todos los extractos, puesto que los ensayo para fenoles, tanino y flavonoides

dieron altamente positivo, los extractos acuosos indicaron presencia de azucares

reductores.

En la tabla VII quedó evidenciado que la corteza del fruto N. lappaceum tenía un

porcentaje representativo de compuestos fenólicos, además de presentar una ligera

presencia de lactonas y coumarinas.

El estudio se continuó con la extracción sucesiva de las sustancias activas del

material vegetal en estudio, la misma se realizó a partir de solventes apolares y

terminó con solventes polares: Hexano, Diclorometano, Acetato de etilo, Butanol y

Metanol.

Con los extractos obtenidos se realizó una cromatografía en capa fina, y esta

permitió separar los componentes de cada uno de los extractos. Los resultados se

muestran en la figura 7.

32

Figura 7. Cromatogramas de Capa fina realizados a los extractos obtenidos.

No se apreciaron diferencias notables en los extractos, con excepción del extracto

de acetato de etilo donde observó una mancha intensa para la variedad dulce, no

distinguible para la variedad amarga. Con el sistema de disolvente empleado, los

extractos butanólicos y metanólicos no desarrollaron buena separación. Los valores

Rf de las manchas de mayor intensidad para los extractos de hexano, dicloro metano

y acetato de etilo se presentan en la tabla VIII.

Tabla VIII. Resultado del factor de retención en la cromatografía de capa fina

Extracto Factor de retención

Dulce Amarga

Hexano 0.71 0.75

Diclorometano 0.74 0.79

Acetato de etilo 0.64 0.64


El análisis por cromatografía en capa fina, permitió demostrar que la muestra en

estudio de ambas variedades tiene componentes similares, ya que así lo manifiesta

el factor de retención con los valores cercanos.

33

Análisis de los extractos por cromatografía de gases acoplado a espectrometría

de Masas (CG/EM)

Constituyó un objetivo de este trabajo, realizar un análisis de los extractos de baja

polaridad por el sistema acoplado CG-EM, para de esta forma identificar los

componentes de estas fracciones y la similitud o no de las variedades objeto de

estudio.

Los cromatogramas gaseosos analíticos de los extractos hexánicos de los frutos de

las variedades amarga y dulce, se presentan en la figura 8.

Figura 8. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extracto hexanicos de la

corteza de los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2).

34

Se observó que existen diferencias en los perfiles cromatográficos de los extractos

hexánicos de la corteza del fruto de las variedades amargas y dulces. El equipo

registró un total de 48 picos cromatográficos para el extracto de la corteza amarga

y 75 para el de la corteza dulces, que a pesar de registrar menor intensidad resultó

de mayor complejidad.

De los 48 compuestos registrados para la variedad amarga, pudieron asignársele

estructura a 19 compuestos, mientras que de los 75 compuestos registrados por el

equipo para la variedad dulce se identificaron 22, en todos los casos por

comparación de los espectros con los de la biblioteca del equipo.

Los extractos obtenidos con hexano estuvieron fundamentalmente constituidos por

ésteres de ácidos grasos e hidrocarburos (Tabla IX).

De los 19 compuestos identificados en el extracto de la variedad amarga, 16 se

encontraban presentes en la variedad dulce, al igual que de los 22 componentes

identificados en la variedad dulce, 16 estaban presentes en la variedad amarga.

Los compuestos presentes en la variedad amarga, no encontrado en la variedad

dulce fueron el ácido linoleico (Acido 9,12- octadecadienoico), que es uno de los

componentes mayoritarios de este extracto; el β 14-H-Pregnano y el escualeno.

En el extracto de la variedad dulce, los ácidos grasos 9-hexadecenoico,

heptadecanoico, octadecanoico y cis-11 eicosenoico, no se encontraron en la

variedad amarga; así como el hidrocarburo tricosano y el α-tocoferol.

Además de las diferencias cualitativas entre ambos extractos, desde el punto de

vista cuantitativo, se observaron también diferencias.

El componente mayoritario del extracto hexánico de la variedad amarga fue el

Ácido cis-11-octadecenoico (ácido vaccénico, 22, 25 %), el cual lo fue también para

la variedad dulce, pero en este caso el porcentaje de abundancia fue de 47,67 %.

Tabla IX. Cuadro comparativo de los compuestos identificados por CG-EM

en el extracto hexano

35

VARIEDAD AMARGA VARIEDAD DULCE

TIEMPO DE RETENCION

COMPUESTO PORCENTAJE ABUNDANCIA

TIEMPO DE RETENCION


24,609 Ácido tetradecanoico 0,32 24,665 Ácido tetradecanoico 0,41

27,993 Ácido hexadecanoico, metil éster

0,85 27,998 Ácido hexadecanoico, metil éster

0,57

28,328 Acido 9-hexadecenoico 0,66

28,952 Ácido hexadecanoico 16,58 29,164 Ácido hexadecanoico 19,83

29,336 Ácido hexadecanoico, etil éster

1,44 29,359 Ácido hexadecanoico, etil éster

1,25

30,676 Ácido heptadecanoico 0,30

31,162 Acido 9,12- octadecadienoico, metil éster

0,69 31,174 Acido 9,12- octadecadienoico, metil éster

0,48

32,169 Acido 9,12- octadecadienoico 19,98

32,320 Ácido cis-11-octadecenoico 22,25 32,576 Ácido cis-11-octadecenoico 47,67

32,827 Ácido octadecanoico 2,39

32,892 Ácido hexadecanoico, butil éster

0,85 32,924 Ácido hexadecanoico, butil éster

0,55

34,901 Tricosano 0,23

35,535 Ácido cis-11 Eicosenoico 0,48

36,542 Tetracosano 0,57 36,563 Tetracosano 0,59

37,606 β 14-H-Pregnano 0,55

38,135 Pentacosano 1,19 38,164 Pentacosano 1,34

39,668 Hexacosano 1,88 39,698 Hexacosano 2,05

41,161 Heptacosano 4,33 41,197 Heptacosano 4,83

42,575 Octacosano 2,23 42,611 Octacosano 2,00

42,693 Escaleno 2,25

43,968 Nonacosano 8,30 43,998 Nonacosano 5,12

45,796 γ Tocoferol 8,34 45,818 γ Tocoferol 4,87

46,795 α Tocoferol 0,99

48,292 Estigmasterol 3,56 48,314 Estigmasterol 2,57

49,645 β- Amirina 0,97 49,662 β- Amirina 0,80

El ácido linoleico fue el segundo componente de mayor abundancia en la variedad

amarga con un 19,98 % de abundancia

36

El otro componente mayoritario para ambas especies fue el ácido hexadecanoico

(palmítico), con un porcentaje de abundancia de 16,58 % para la variedad amarga

y un 19,83 % para la dulce.

De los componentes presentes es importante señalar al ácido vaccénico, (Omega 7),

el cual está presente en grasas vegetales y animales y para el cual se informan

propiedades como hipocolesterolémicos, disminuyendo el colesterol total, LDL y

triglicéridos (Wang y Proctor, 2008). Este compuesto se informa por primera vez

en la corteza del fruto de especie.

Los cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de diclorometano se

presentan en la figura 9.

Para este extracto se encontró mayor similitud cromatográfica. Del 19 picos

cromatográficos registrados para el extracto de la variedad amarga, se identificaron

14; mientras que de los 24 registrados para la variedad dulce se identificaron 9.

Es importante señalar que de los 14 componentes de la variedad amarga, sólo tres

compuestos no se habían identificado en el extracto hexánico que fueron los

hidrocarburos heneicosano, docosano y nonadecano.

De los compuestos identificados en el extracto de la variedad dulce, todos se

encontraban presentes en el extracto hexánico.

Se destaca también que el componente mayoritario de la fracción resultó también

el ácido cia 11-vaccénico para ambas variedades, con porcentajes de 23,35 % y

26,93 % para las variedades amarga y dulce, respectivamente.

El otro componente mayoritario de la fracción el àcido hexadecanoico (palmítico),

con porcentajes superiores a los encontrados en la fracción hexánica (26,67 % var.

amarga; 25,37 % var. dulce).

37

El ácido linoleico, el cual no fue detectado en el extracto hexánico de la variedad

dulce, aparece en este extracto dentro de los componentes mayoritarios de ambas

variedades. En la tabla X. se exponen los componentes identificados en esta

fracción.

Figura 9. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extractos DCM de la

corteza de los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2).

38

Tabla X. Cuadro comparativo de los compuestos identificados por CG-EM en el

extracto DCM

VARIEDAD AMARGA VARIEDAD DULCE

TIEMPO DE RETENCION


TIEMPO DE RETENCION


28,78 Ácido Hexadecanoico 26,67 28,73 Ácido Hexadecanoico 25,37

31,93 Ácido hexadecanoico, etil ester

2,13

31,93 Acido 9,12-Octadecadienoico

15,96 31,88 Acido 9,12-Octadecadienoico

19,01

32,07 Ácido cis-11-octadecenoico

23,35 32,02 Ácido cis-11-octadecenoico

26,93

32,45 Ácido Octadecanoico 4,12 32,42 Ácido Octadecanoico 6,19

32,85 Ácido Hexadecanoico, butil éster

2,76 32,84 Ácido Hexadecanoico, butil éster

4,76

36,51 Tetracosano 1,83

38,10 Heneicosano 2,79

39,63 Hexacosano 2,99 39,61 Hexacosano 4,97

41,097 Heptacosano 4,80

41,109 Docosano 3,69

42,528 Nonadecano 2,79

43,902 Heptacosano 3,26

43,89 Nonacosano 4,68

45,73 γ Tocoferol 2,36 45,72 γ Tocoferol 3,29

48,27 Estigmasterol 5,29

El análisis de los resultados, permitió corroborar, que por el método de extracción

por maceración, no permite agotar la droga ya que la mayoría de los componentes

identificados en este extracto, incluyendo los mayoritarios, ya se habían

identificado en el extracto hexánico.

39

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

V.1 CONCLUSIONES

Las características macroscópicas y los parámetros físicos-químicos,

permitieron establecer previas diferenciaciones entre las variedades

amarga y dulce de Nephelium lappaceum.

Con el estudio cualitativo de la droga, se determinó que los metabolitos

secundarios más abundantes en los extractos fueron: compuestos grasos,

triterpenos/esteroles y compuestos fenólicos.

Se estableció una metodología para la extracción de los metabolitos

secundarios de la corteza de los frutos, empleando una extracción

sucesiva con disolventes de polaridad creciente.

En el análisis por el sistema acoplado cromatografía gaseosa-

espectrometría de masas, se observaron diferencias cuali y cuantitativas

entre los extractos de las dos variedades.

El componente mayoritario para ambas variedades fue el ácido cis-11-

vaccénico, informado por primera vez para la especie.

40

V.2 RECOMENDACIONES

Completar los estudios con las fracciones polares.

Realizar el estudio genético de las variedades de Nephelium lappaceum

41

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43

ANEXOS

Anexo 1. Recolección del Fruto

Anexo 2. Corteza de los frutos amargos de Nepphelium

lappaceum L.

44

Anexo 3. Corteza de los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L.

Anexo 4. Medir los frutos amargos de Nepphelium lappaceum L.

45

Anexo 5. Medir los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L.

Anexo 6. Secado de la corteza dulce y amargo de Neppelium

lappaceum L.

46

Anexo 7. Triturado de la corteza dulce y amrga de Nepphelium

lappaceum L.

Anexo 8. Molienda de la corteza dulce y amrga de Nepphelium

lappaceum L.

48

Anexo 9. Enasayo de Humedad Residual

49

Anexo 10. Ensayo de cenizas totales e insolubles

50

Anexo 11. Ensayo de Sustancias Solubles

51

Tamizaje Fitoquímico

Anexo 12. Extracto acuoso Cloruro Férrico

Anexo 13. Extracto acuoso Dragendorff

52

Anexo 14. Extracto acuoso Fehling 1

Anexo 15. Extracto acuoso Fehling 2

53

Anexo 16. Extracto acuoso Na OH 1

Anexo 17. Extracto acuoso Na OH 2

54

Anexo 18. Extracto acuoso Shinoda 1

Anexo 19. Extracto acuoso Shinoda 2

55

Anexo 20. Extracto alcohólico Baljet

Anexo 21. Extracto alcohólico Cloruro Férrico

56

Anexo 22. Extracto alcohólico Dragendorff

Anexo 23. Extracto alcohólico Fehling

57

Anexo 24. Extracto alcohólico Liebermann Burchard

Anexo 25. Extracto alcohólico Shinoda

58

Anexo 26. Extracto etéreo Baljet

Anexo 27. Extracto etéreo Liebermann Burchard

59

Anexo 28. Extracto etéreo Sudan

Anexo 29. Maceración para Extracción Sucesiva

60

Anexo 30. Muestra filtrada lista para Rota-evaporar

Anexo 31. Rotaevaporando la muestra

61

Anexo 32. Extractos obtenidos con el Rotaevaporador

62

Anexo 33. Cromatografía Capa Fina de los extractos de N.

lappaceum L.

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