UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE …repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/7991/1/BCIEQ- T- 0010...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD INVESTIGACIÓN

TEMA:

REVISIÓN DE LOS MÉTODOS UTILIZADOS EN LA

DETERMINACIÓN DE SALMONELLA SPP. EN CAMARÓN

(LITOPENAEUS VANNAMEI) CRUDO ENTERO

CONGELADO, GUAYAS, 2014

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO.

AUTOR:

CHALÉN GUARANDA CYNTHIA BELÉN

TUTOR:

DRA. CELESTE CARRILLO

GUAYAQUIL – ECUADOR

2014

ii

CERTIFICADO DEL TRIBUNAL

Acta de registro de la Sustentación Oral

El Tribunal de Sustentación del Trabajo de Titulación de la Srta. CYNTHIA

BELÉN CHALÉN GUARANDA, después de ser examinado en su presentación,

memoria científica y de defensa oral, da por aprobado el Trabajo de Titulación.

iii

CERTIFICADO DEL GRAMATÓLOGO

iv

CERTIFICADO DEL TUTOR

En calidad de tutora del trabajo de titulación, Certifico: que he asesorado,

guiado y revisado el trabajo de titulación en la modalidad de Proyecto de

Investigación, cuyo título es “Revisión de los métodos utilizados en la

determinación de Salmonella spp. en camarón (Litopenaeus vannamei)

crudo entero congelado, Guayas, 2014”, presentado por la Srta. Cynthia

Belén Chalén Guaranda con cédula de ciudadanía #0924933302, previo a la

obtención del título de Química y Farmacéutica.

Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de Anti-

plagio del programa URKUND. Lo certifico.

Dra. Celeste Carrillo

TUTOR DE TESIS

Guayaquil, Octubre del 2014

v

CERTIFICADO DEL TUTOR

INFORME DE ANTI-PLAGIO DEL PROGRAMA URKUND.

Por la presente certifico que el Proyecto de Investigación cuyo tema es

“Revisión de los métodos utilizados en la determinación de Salmonella

spp. en camarón (Litopenaeus vannamei) crudo entero congelado,

Guayas, 2014”, correspondiente a la Srta. Cynthia Belén Chalén Guaranda,

con C.I.: 0924933302, ha sido subido al programa URKUND y revisado,

arrojando un porcentaje de similitud del 2% el cual se encuentra dentro de los

límites aceptables.

En honor a la verdad,

Dra. Celeste Carrillo

TUTOR DE TESIS

Guayaquil, Octubre del 2014

vi

CARTA DE AUTORÍA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

Yo, CYNTHIA BELÉN CHALÉN GUARANDA, autor de este trabajo declaro

ante las autoridades de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de

Guayaquil, que la responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE

TITULACIÓN, me corresponde exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la

misma a la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.

Declaro también que todo el material escrito me pertenece, salvo el que está

debidamente referenciado en el texto. Además ratifico que este trabajo no ha

sido parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en la

universidad nacional, ni en una extranjera.

Guayaquil, 24 de Octubre del 2014.

Cynthia Belén Chalén Guaranda

CC: 0924933302

vii

DEDICATORIA

A Dios, por la fortaleza y sabiduría concedida para culminar una etapa de mi

vida e iniciar con éxito mi carrera profesional.

A mi grandiosa madre, mi gratitud y amor infinito, sin su apoyo incondicional,

no hubiese podido alcanzar esta meta.

A mi padre y hermano, pilares fundamentales en mi vida, quienes con su

elevado sentido del humor, le dan ese toque de alegría a mis logros.

A mis queridas maestras y amigas: Q.F. Leila Prias Mogro M.Sc. y Q.F.

Glenda Sarmiento M.Sc., por sus sabias enseñanzas y experiencia

transmitida que me impulsan a crecer profesionalmente.

A mi tutora Dra. Jaqueline Carrillo, que me guio para alcanzar la

materialización de este sueño.

Cynthia Belén Chalén Guaranda

viii

INDICE

CERTIFICADO DEL TRIBUNAL II

CERTIFICADO DEL GRAMATÓLOGO III

CERTIFICADO DEL TUTOR IV

CERTIFICADO DEL TUTOR V

CARTA DE AUTORÍA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN VI

DEDICATORIA VII

INDICE VIII

INDICE DE TABLAS X

INDICE DE GRÁFICOS XI

LISTADO DE ANEXOS XII

RESUMEN XIV

ABSTRACT XV

INTRODUCCIÓN 1

CAPÍTULO I: EL PROBLEMA 4

DELIMITACIÓN DEL TEMA 7

CAMPO: 7

ÁREA: 7

ASPECTOS: 7

TEMA: 7

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA: 7

OBJETIVO GENERAL: 8

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 8

JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA 9

VARIABLES. 10

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO 11

ix

ANTECEDENTES 11

LAS BASES TEÓRICAS 15

SALMONELLA 15

SALMONELLOSIS 20

EL CAMARÓN Y SU EXPORTACIÓN EN EL ECUADOR 22

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN

ALIMENTOS 25

CAPÍTULO III: METODOLOGÍA, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 47

DISEÑO METODOLÓGICO 47

PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN: 50

INSTRUMENTOS DE INVESTIGACIÓN 52

ENCUESTA 52

POBLACIÓN Y MUESTRA: 54

POBLACIÓN 54

MUESTRA 57

RESULTADOS (GRÁFICOS) 58

ANÁLISIS DE RESULTADOS 86

CAPITULO IV: LA PROPUESTA 87

TEMA: 87

OBJETIVO: 87

DESARROLLO: 87

CONCLUSIONES 88

RECOMENDACIONES 89

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 90

ANEXOS 95

x

INDICE DE TABLAS

Tabla 1: Clasificación de los Métodos Rápidos para la Detección de

Patógenos ................................................................................................. 32

Tabla 2: Población ................................................................................... 54

Tabla 3: Empacadoras del Guayas ........................................................... 55

Tabla 4: Laboratorios de Control de Alimentos .......................................... 56

Tabla 5: Organismo de Control del Guayas ................................................... 56

Tabla 6: Muestra ...................................................................................... 57

Tabla 7: Método convencional Vs Técnicas bioquímicas empleadas en la

detección de Salmonella spp. en Alimentos ................................................. 58

Tabla 8: Método convencional Vs Técnicas inmunológicas empleadas en la


Tabla 9: Método convencional Vs Técnicas moleculares empleadas en la


Tabla 10: Método convencional Vs Métodos Rápidos más empleados en la

detección de Salmonella spp. en Alimentos, Guayas .................................... 61

Tabla 11: Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Pre-enriquecimiento

en la detección de Salmonella spp. en Alimentos ......................................... 62

Tabla 12: Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Enriquecimiento

selectivo en la detección de Salmonella spp. en Alimentos ........................... 63

Tabla 13: Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Aislamiento en

medios selectivos sólidos en la detección de Salmonella spp. en Alimentos ... 65

Tabla 14: Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Siembra en Agares

Diferenciales en la detección de Salmonella spp. en Alimentos ..................... 67

Tabla 15: Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Identificación

bioquímica en la detección de Salmonella spp. en Alimentos ........................ 68

Tabla 16: Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Serotipificación en la


Tabla 17: Resumen preguntas realizadas a Empacadoras de Camarón ........ 72

Tabla 18: Resumen preguntas realizadas a Laboratorios de Control ............. 80

xi

INDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Análisis de Salmonella spp. en Empacadoras .............................. 73

Gráfico 2: Normas empleadas por Empacadoras para el Análisis de

Salmonella spp. ......................................................................................... 74

Gráfico 3: Análisis de Salmonella spp. dentro de instalaciones en

Empacadoras............................................................................................. 75

Gráfico 4: Análisis de Salmonella spp. en Laboratorios Externos por

Empacadoras............................................................................................. 76

Gráfico 5: Métodos que han Empleado para el Análisis de Salmonella spp. en

Empacadoras............................................................................................. 77

Gráfico 6: Métodos Empleados para el Análisis de Salmonella spp. en

Empacadoras............................................................................................. 78

Gráfico 7: Conocimiento por parte de las Empacadoras del método empleado

en los Laboratorios Externos para el análisis de Salmonella spp. .................. 79

Gráfico 8: Método Empleado en los Laboratorios Externos donde se derivan

los análisis de Salmonella spp. de las Empacadoras .................................... 79

Gráfico 9: Análisis de Salmonella spp. en Laboratorios de Control ............... 81

Gráfico 10: Normas empleadas por Laboratorios de Control para el Análisis de

Salmonella spp. ......................................................................................... 82


Empacadoras............................................................................................. 83


Laboratorios de Control .............................................................................. 84


Laboratorios de Control .............................................................................. 85

xii

LISTADO DE ANEXOS

Anexo 1: Formato de Encuestas.

Anexo 2: Encuestas realizadas a las Empacadoras de Camarón.

Anexo 3: Encuestas realizadas a los Laboratorios de Control.

Anexo 4: Tabla de datos Enfermedades Transmitidas por Agua y Alimentos,

Mapa de Fiebre Tifoidea y Paratifoidea, por provincias; Anuario de Vigilancia

Epidemiológica 1994-2013 Enfermedades Transmitidas por Agua y Alimentos,

Exportaciones de Camarón Ecuatoriano de Enero 2011 a Abril 2014 Libras Vs

Dólares.

Anexo 5: AOAC Official Method 995.20 Salmonella in Raw, Highly

Contaminated Foods and Poultry Feed Detection.

Anexo 6: AOAC Official Method 998.09 Salmonella in Foods, Colorimetric

Polyclonal Enzyme Inmunoassay Screening Method with Rappaport-Vassiliadis

(R10) Broth and Tetrathionate Broth (TECRA Salmonella Visual Inmunoassay).

Anexo 7: BAM: Salmonella. December 2007 Edition. Bacteriological

Analytical Manual, Chapter 5.- Salmonella.

Anexo 8: BAM: Rapid Methods for Detecting Foodborne Pathogens. January

2001. Bacteriological Analytical Manual, Appendix 1.- Rapid Methods for

Detecting Foodborne Pathogens.

Anexo 9: Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-15:2013 Primera

Revisión. Control Microbiológico de los Alimentos. Salmonella. Método de

Detección.

xiii

Anexo 10: Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 456:2013 Primera Revisión.

Camarones o Langostinos Congelados. Requisitos.

Anexo 11: 3M PetrifilmTM Plate Certificates, Recognitions and Validations.

Anexo 12: 3M Petrifilm Salmonella Express System Receives First AOAC

Official Methods of Analysis Validation.

Anexo 13: Journal of AOAC International Vol. 96, No. 6, 2013. Evaluation of

3MTM Molecular Detection of Salmonella in Selected Foods: Collaborative

Study.

Anexo 14: Neogen. Europe Ltd. Reveal 2.0 for Salmonella.

xiv

RESUMEN

El camarón es un alimento de gran demanda y tercera fuente de exportación

en Ecuador. Por esto, es relevante que las Empacadoras otorguen alimentos

inocuos al consumidor, conociéndose que la Salmonella spp. es una bacteria

patógena cuyo principal vehículo de transmisión son alimentos como mariscos

y productos derivados de los mismos, causantes de ETA. El objetivo de este

trabajo es realizar un estudio bibliográfico de los métodos utilizados en

detección de Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado, con el fin de

sugerir la evaluación de NTE INEN 1529-15:2013. Para el estudio se recurrió a

métodos: exploratorio, descriptivo y correlacional, mediante la revisión de

normas oficiales comparadas con INEN 1529-15:2013 mostrando algunas

incoherencias en la utilización de medios de cultivos obsoletos y ciertas

incongruencias en temperaturas y tiempos de incubación; se efectuaron

encuestas a Empacadoras, Laboratorios y Organismo de control de Guayaquil

obteniendo que 75% de Empacadoras realiza el análisis de Salmonella spp. en

sus instalaciones, donde el 37% emplea Métodos Convencionales, 25%

Inmunológicos, 25% Medios de cultivos deshidratados y 13%

Inmunofluorescencia. El 62% de los Laboratorios de Control utilizan el método

descrito por FDA-BAM, aplicando 55% Métodos Convencionales, 27%

Inmunológicos, 9% Detección Molecular y 9% Métodos Bioquímicos.

Actualmente, existen métodos rápidos preferidos por el sector pesquero como

ELISA y Detección Molecular que van de la mano con el método convencional

establecido en la FDA – BAM (Capítulo 5/Salmonella) demostrando que la

INEN 1529-15:2013 no es utilizada por las Empacadoras y Laboratorios de

Control en la Provincia del Guayas.

PALABRAS CLAVES: Camarón, Salmonella spp., empacadoras de

camarones, laboratorios de control, detección molecular, métodos

convencionales, inmunofluorescencia, inmunocromatografía, FDA-BAM, INEN,

AOAC, medios de cultivo, antígeno, anticuerpo.

xv

ABSTRACT

Shrimp is a great demanded food and the third source of exportation in

Ecuador. So Shrimp Packing plants should offer an innocuous product to the

consumers, knowing that Salmonella spp. is a pathogen bacteria which

principal transportation vehicle are seafood and derivate of them, causing

Foodborne illness. The objective of this work is to make a bibliography study of

methods that are used for Salmonella spp. detection in whole frozen shrimp,

suggesting the evaluation of NTE INEN 1529-15:2013. In this study we use

exploratory, descriptive and correlational methods, by the bibliography research

of different official normative and comparing them with INEN 1529-15:2013

showing some incoherencies in the use of nonuse enrichments medium and the

absence of details as temperatures and incubation time; surveys were made to

Shrimp Packing plants, Laboratories and Control Organism in Guayaquil

obtaining that 75% of Shrimp Packing plants made the Salmonella spp. analysis

in their installations, of this, 37% use Conventional Methods, 25%

Immunological, 25% Dehydrated films enrichment medium and 13%

Inmunofluorescence methods. 62% of Control Laboratories use the FDA-BAM

method, using 55% Conventional, 27% Immunological, 9% Molecular Detection

and 9% Biochemical method. Actually, there are Rapid Methods that fisheries

prefer as ELISA and Molecular Detection combine with FDA-BAM (Chapter

5/Salmonella) Conventional Method exposing that INEN 1529-15:2013 is not

being use by Shrimp Packing plants and Control Laboratories in Guayas.

KEY WORDS: Shrimp, Salmonella spp., shrimp packing plants, control

laboratories, molecular detection, conventional method, inmunofluorescence,

inmunochromatography, FDA-BAM, INEN, AOAC, enrichments medium,

antigen, antibody.

1

INTRODUCCIÓN

“La acuicultura y en especial la camaronicultura (cultivo de camarones) han

sido grandes fuentes de empleo y generadores de divisas para el país”

(Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura,

2005) “Siendo la tercera fuente primaria de exportación en el Ecuador” (Banco

Central del Ecuador, 2014)

El camarón por ser un alimento muy consumido en nuestro país y por el

impacto económico social que su consumo representa, ha sido considerado

como alimento de estudio de esta investigación. A pesar de que la mayoría de

las Empacadoras en el Guayas actualmente se manejan con Sistema HACCP

(Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control), BRC (British Retail

Consortium) y otras normas de gran importancia exigidas por la FDA como las

BPM (Buenas Prácticas de Manufactura), ACC (Consejo de Certificación de

Acuicultura), BAP (Mejores Prácticas de Acuicultura), SSOP-POES

(Procedimientos Operativos Estándares de Saneamiento), entre otras (Pin

Hidalgo, 2001). Es primordial evaluar que el producto que están

comercializando sea inocuo para el consumidor y no sean la causa por la cual

la población padezca de enfermedades gastrointestinales.

El mayor problema en seguridad sanitaria radica en la necesidad de obtener

resultados rápidos de los microorganismos patógenos presentes en los

alimentos para evitar la transmisión de enfermedades en una gran población.

Según (Pin Hidalgo, 2001) la Salmonella spp. es una bacteria patógena cuya

importancia reside en que alimentos como carnes, aves, mariscos y otros

productos derivados de los mismos, son un excelente vehículo para su

transmisión, por lo cual ha llegado a ser causante de varias enfermedades

2

gastrointestinales, infecciones e intoxicaciones alimentarias, las cuales afectan

la salud del consumidor.

“A nivel mundial, las enfermedades gastrointestinales se encuentran entre las

primeras causas de hospitalizaciones y muerte” (Center for Disease Control

and Prevention, 2011) El Ecuador también forma parte de esta población lo

cual hace de su estudio un elemento clave para poder prevenir este tipo de

enfermedades.

El impacto de la Salmonella spp. sobre la comercialización de camarones no

ha sido medido, sin embargo se considera primordial su identificación, rechazo

y devolución. “Estos sucesos pueden originar pérdidas financieras directas e

indirectas, producidas por re-inspecciones, análisis de muestras, revisión de

registros, expiración de la vida útil y el costo de la manipulación de los

productos” (Morales et al., 2012) Debido a esto, la importancia de realizar un

estudio sobre los métodos utilizados para la detección de este microorganismo

con la finalidad de conocer las diferencias entre los métodos convencionales y

los métodos existentes en la actualidad. A su vez se realizará una revisión de

las Normativas con las que operan las Empacadoras, Laboratorios de Control y

Organismo de Control.

Los métodos usados para la detección de Salmonella en nuestro país van

desde Métodos Tradicionales a los métodos de Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR), por su recuperación de material genético; sin dejar de lado

a los Inmunoensayos, y métodos a base de películas de medios de cultivo

deshidratados.

3

El método más utilizado es el convencional debido a que los precios son

accesibles, mientras que aquellos basados en Biología Molecular son muy

costosos y no todas las empresas y laboratorios tienen las facilidades para

adquirirlos. Considerando el aspecto económico nos convendría utilizar

métodos tradicionales, pero si vemos más allá y hablamos de eficiencia,

eficacia y sensibilidad en el método, podemos notar que la nueva tecnología

nos ofrece muchas ventajas en comparación con los métodos tradicionales.

Estas ventajas radican en la mayor sensibilidad al momento de detectar el

patógeno, gracias a esto tenemos un número de colonias más cercano al

verdadero. Los resultados se obtienen de manera más rápida, permitiendo

realizar un mayor número de análisis en menos tiempo que con el método

tradicional. La vida media de los reactivos es más larga que la de los medios

utilizados en el método tradicional. Entre otras ventajas que veremos a lo largo

de esta investigación.

Los resultados que se obtengan serán beneficiosos para la Industria

Camaronera, otras Industrias afines del país y organismos de control, ya que

podrán ser tomados como referencia para las Empacadoras y Laboratorios de

Control dando a conocer las nuevas metodologías usadas en el país y las

Normas con las cuales cada empresa opera.

4

CAPÍTULO I: EL PROBLEMA

La presencia de bacterias patógenas en los alimentos es la causa de ETAs

(Enfermedades de Transmisión Alimentaria). Una de estas bacterias comunes

en nuestro medio es la Salmonella spp., la cual es una de las principales

causas de ETA en el mundo. La Salmonella se encuentra presente en carnes,

aves, mariscos y sus derivados. Guayas por ser una de las provincias con

mayor número de empacadoras de camarón en el país, de gran presencia en el

mercado, especialmente en el exterior, es una zona donde es necesario el

estudio de este patógeno. Esta investigación estará direccionada a los

camarones crudos enteros congelados analizados en las empacadoras,

laboratorios de control o camaroneras del Guayas, ya que el camarón es el

segundo producto no petrolero de exportación en Ecuador y una gran fuente de

empleo en la provincia.

Dentro de los métodos utilizados para detectar Salmonella tenemos los

tradicionales y aquellos a base de Inmunoensayos y películas de medios

deshidratados selectivos (Films secos), con los cuales las compañías y

laboratorios se han manejado hasta la actualidad. En el caso de los métodos

tradicionales si existe una muestra positiva se debe confirmar mediante

pruebas bioquímicas, proceso que requiere la experticia del analista para tomar

decisiones basadas en su experiencia y a su vez obteniendo resultados en

espacios prolongados de tiempo.

En la actualidad existen nuevos equipos y métodos basados en biología

molecular, estos métodos permiten obtener resultados con menor margen de

error ya que son más sensibles al momento de detectar bacterias patógenas

como la E. coli O157H7, Listeria monocytogenes y Salmonella spp.,

obteniendo resultados en menor tiempo (28 a 30 horas), gastando menor

cantidad de reactivos, con la capacidad de realizar varias pruebas a la vez en

5

una misma corrida. La principal desventaja en la implementación de esta nueva

tecnología radica en los elevados precios de los equipos y reactivos; al mismo

tiempo que no existen trabajos de investigación en Ecuador que den a conocer

las ventajas o desventajas de su uso. En el mundo vemos la constante

actualización de los métodos utilizados en la detección de patógenos

alimenticios y a su vez artículos donde comparan las metodologías

tradicionales frente a los métodos rápidos ofertados en la actualidad. Estos

estudios buscan establecer el porcentaje de recuperación de la bacteria

analizada, el tiempo en que se demora el estudio, los medios empleados y la

diferencia de los costos de los diferentes ensayos. Ya que en la actualidad las

empresas requieren de métodos que les permitan optimizar sus procesos

obteniendo resultados en menos tiempo y con técnicas amigables al medio

ambiente, es decir, que utilicen menos cantidad de reactivos y a su vez

disminuyendo la generación de desechos.

Otra de las problemáticas radica en las diferentes Normativas implementadas

en los Laboratorios de Control, Empacadoras y Organismo de Control, para el

análisis de Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado, ya que cada

empresa elige abiertamente que norma utilizar sean Normas Estatales (Instituto

Ecuatoriano de Normalización (INEN) - Normas Técnicas Ecuatorianas (NTE)

NTE INEN 1529-15:2013, Primera revisión. Control microbiológico de los

alimentos.- Salmonella.- Método de detección.) u otras normas a nivel mundial

o regional. El no esclarecer este punto impediría que las Agencias Estatales de

Control tengan conocimiento de la realidad de la situación y en el caso de que

no se utilice la Norma Ecuatoriana, tomar las medidas correctivas

correspondientes.

El no realizar este estudio impedirá que aquellos Laboratorios de las Agencias

Estatales de Control, los Laboratorios de las Empresas Exportadoras y

Empacadoras de Camarón, tengan una visión más clara de las ventajas o

6

desventajas que ofrecen los métodos que actualmente se han desarrollado, ni

conocerán la existencia de otros métodos y equipos que pueden ayudarles a

obtener mejores resultados. Esta mejora se refiere a disminuir la incidencia de

falsos negativos y falsos positivos en los resultados de sus análisis para poder

liberar el producto, brindando datos confiables para el consumidor y aptos para

su exportación.

7

Delimitación del Tema

Campo:

Microbiología

Área:

Alimentos

Aspectos:

Revisión de los métodos empleados en la identificación de Salmonella

spp. en alimentos.

Tema:

Revisión de los Métodos utilizados en la Determinación de Salmonella

spp. en Camarón (Litopenaeus vannamei) Crudo entero congelado,

Guayas, 2014.

Formulación del Problema:

¿Cuáles son los métodos utilizados para la determinación de Salmonella spp.

en Camarón (Litopenaeus vannamei) Crudo entero congelado de la provincia

del Guayas?

8

Objetivo General:

Revisar los métodos utilizados en la detección de Salmonella spp. en Camarón

(Litopenaeus vannamei) crudo entero congelado a través de estudio

bibliográfico, para sugerir la evaluación de la Norma Técnica Ecuatoriana INEN

1529-15:2013.

Objetivos Específicos:

Examinar los métodos rápidos y convencionales empleados en la detección

de Salmonella spp. en alimentos.

Comparar la Norma Técnica Ecuatoriana de Normalización INEN 1529-

15:2013, frente a las normas oficiales de la AOAC 995.20, FDA (BAM,

Capítulo 5), Método Estándar (ISO 6579:2003) y a Normativas a Nivel

Regional (Argentina, Chile, México) para la detección de Salmonella spp. en

alimentos.

Identificar las metodologías y normas usadas en los Laboratorios de Control

y Empacadoras de Camarón de la Provincia del Guayas, para la detección

de Salmonella spp. en Camarón Crudo Entero Congelado.

Sugerir la evaluación de la NTE INEN 1529-15:2013 para detección de

Salmonella spp. en alimentos, de acuerdo a la norma oficial AOAC 995.20 y

FDA (BAM, capítulo 5) para Salmonella spp. en alimentos.

9

Justificación e Importancia

La evaluación de la calidad sanitaria de los camarones enteros crudos

congelados destinados para la exportación o el consumo de nuestra población

requiere determinaciones constantes y permanentes que garanticen la

inocuidad del producto. Una de estas determinaciones es la identificación de

Salmonella spp., cuyos datos estadísticos en el Ecuador son muy escasos y la

importancia de su análisis está en la “resistencia a bajas temperaturas por la

cual se caracteriza este patógeno” (Cisneros Despaigne, Leyva Castillo, Valdés

Amey, Nolasco Charón, & Pérez Rodríguez, 1998) y a su vez “la incidencia de

Salmonelosis a nivel mundial, considerada como una enfermedad

gastrointestinal con un alto índice de hospitalizaciones (62%)” (CDC, 2011)

A su vez, debido a la importancia de detectar Salmonella spp. en los alimentos,

en este caso, en camarones crudos enteros congelados vemos la necesidad de

evaluar los métodos que se han venido utilizando tanto en empacadoras,

Laboratorios de Control, así como en el Organismo de Control – Agencia de

Regulación y Control Sanitario (ARCSA), para poder dar a conocer los métodos

usados en la actualidad sugiriendo la utilización de varios métodos que les

permita obtener resultados en menor tiempo y tomar decisiones cruciales de

una manera más rápida favoreciendo de esta manera a todas las empresas

antes de liberar su producto.

Esto se lograría utilizando métodos modernos y rápidos aplicados a la

microbiología de alimentos, cuyo uso y desarrollo se justifica debido a las

presiones regulatorias ejercidas en nuestro país, las modernas prácticas de

producción y la complejidad analítica que representan aquellos métodos

convencionales. Dicho avance se ve reflejado en la cantidad y variedad de

equipos y técnicas que se expenden en la actualidad con la finalidad de

10

obtener resultados rápidos, en tiempo real, exactos y de bajo costo. Uno de los

sistemas propuesto en esta investigación es el análisis por biología molecular,

gracias a su capacidad de detectar el ADN del patógeno, proporcionando

resultados rápidos y exactos, además de facilidad de uso.

De acuerdo a los resultados que se obtengan, se determinará el método más

usado en nuestra región y la diferencia en la utilización de métodos

tradicionales frente a los métodos rápidos aplicados a la microbiología de

alimentos. Veremos en base a qué normativa se rigen las diferentes

Empacadoras, Laboratorios de Control y Organismo de Control que realicen el

análisis de Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado con el fin de

aportar al INEN (Instituto de Normalización Ecuatoriana) con la información a

recopilarse en este trabajo y que ellos establezcan acciones correctivas o

preventivas con respecto al uso de su norma (NTE INEN 1529-15:2013) en la

provincia del Guayas.

Variables.

VARIABLE INDEPENDIENTE:

Método de Detección de Salmonella spp.

VARIABLE DEPENDIENTE:

Tiempo del análisis.

Grado de recuperación.

Experticia del analista.

11

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO

Antecedentes

“La acuicultura y en especial la camaronicultura (cultivo de camarones) han

sido grandes fuentes de empleo y generadores de divisas para el país” (Food

and Agriculture Organization of the United Nations, 2005) “Siendo la tercera

fuente primaria de exportación en el Ecuador” (Banco Central del Ecuador,

2014)

La (Agencia de Noticias Públicas del Ecuador, 2014) señala que:

Las exportaciones ecuatorianas de camarón se duplicaron en los dos

primeros meses del año (399 millones de dólares – 97,2%), al comparar las

cifras con las de enero y febrero de 2013 (202,3 millones de dólares); y a su

vez viendo un incremento en el volumen de exportación de un 32,4%, de

31.000 a 41.000 toneladas. En comparación al precio de hace un año, el

camarón se ha incrementado en un 48,9%, que pasó de 6.456,7 dólares, por

cada tonelada, a 9.614,9 dólares.

A nivel mundial, la Salmonelosis es una de las enfermedades de transmisión

alimentaria más comunes con decenas de millones de casos cada año. La

mayoría de estos casos son leves pero en algunas ocasiones causan la muerte

del paciente, dependiendo del estado del mismo y del serotipo de Salmonella.

Desde los inicios de 1990, la Salmonella ha ganado resistencia a un gran

número de antibióticos lo cuál ha generado preocupación en la salud pública.

Se han descubierto alrededor de 2500 serotipos diferentes de Salmonella

12

siendo la Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium los más

importantes debido a que su transmisión es de animales a humanos causantes

de un elevado porcentaje de Salmonelosis en el mundo (World Health

Organizartion, 2013)

En Estados Unidos, la Salmonelosis es una de las Infecciones alimentarias con

mayor incidencia siendo la causante de 1.2 millones de casos

aproximadamente anuales (13.2 por ciento de todas las infecciones

alimentarias), ya que existen casos leves los cuales no son reportados, de los

cuales 23000 requieren de hospitalizaciones y 450 mueren (Center for Disease

Control and Prevention, 2011)

En el Anuario de Estadísticas Hospitalarias: Camas y Egresos del INEC del

2011 refleja que la Diarrea y Gastroenteritis de presunto origen infeccioso es la

segunda enfermedad principal causante de morbilidad (hospitalizaciones) en el

país. Representando un 21,03% de la Tasa de Morbilidad a Nivel Nacional,

entre 10 enfermedades. En el caso de los hombres, sigue siendo la segunda

causa de morbilidad mientras que en las mujeres es la cuarta causa de

morbilidad. Por otro lado en infantes pasa a ser la quinta causa de morbilidad

en el Ecuador. (Instituto Nacional de Estadísticas y Censos, 2011)

Debido a las presiones regulatorias y a los requisitos a nivel internacional para

la exportación de Camarón, la industria alimentaria se ve en la obligación de

utilizar métodos oficiales de referencia como los recomendados por la FDA,

Asociación Internacional de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC), ISO, entre

otras. Sin embargo algunas de estas organizaciones mencionadas, también

proponen el uso de métodos rápidos como técnicas de tamizaje.

(Departamento de Agricultura/Seguridad Alimentaria y Servicio de Inspección,

2008) No obstante, estos métodos para poder ser aplicados necesitan de

13

estandarizaciones o controles internos como externos para garantizar la

veracidad de sus resultados.

Para (A. Leotta, 2009), desde la década del 70, el desarrollo y la

implementación de los métodos rápidos para la identificación de

microorganismos evolucionaron en paralelo con los adelantos en otras áreas

de la investigación científica, en particular con la generalización del uso de

galerías de pruebas bioquímicas miniaturizadas.

El progreso en la fabricación de anticuerpos monoclonales tuvo lugar en los

años 80, donde se desarrollaron pruebas inmunológicas de caracterización

como la inmunocromatografía y el ELISA. En la década de los 90 por otra

parte, se comenzaron a utilizar técnicas basadas en biología molecular, como

la PCR con la finalidad ya sea de identificar microorganismos, como para

determinar factores de virulencia. Es en el año 2000 cuando se innovaron

técnicas de alta tecnología como los biosensores, biochips y microarreglos,

también conocidos como microarrays.

Como podemos ver, el desarrollo de métodos rápidos está dirigido a las

empresas productoras de alimentos. A pesar de esto, las entidades nacionales,

provinciales o municipales comprometidos a realizar el control de los alimentos

dentro de sus métodos de detección de patógenos no incluyen regularmente

aquellos métodos rápidos, incluyendo los métodos moleculares. Esto se debe a

que actualmente la tendencia internacional de los organismos de control está

orientada al aseguramiento de los programas de calidad como HACCP

(Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control), BPM (Buenas Prácticas de

Manufactura), BRC (British Retail Consortium), entre otros, utilizados por las

empresas productoras de alimentos y no al análisis microbiológico del producto

final. Aunque en países como el nuestro, donde la aplicación de este tipo de

14

programas de control aún no es de cumplimiento obligatorio, no es posible

asegurar que todos los productos alimenticios que ingieren los consumidores

provengan de empresas que utilizan programas HACCP, considerando que en

nuestro país la norma oficial para el control de alimentos son las BPM. Es

entonces cuando la implementación de métodos rápidos puede acelerar y

optimizar los resultados generados por los organismos de control. Sin

embargo, se debe considerar que para la utilización de los métodos rápidos,

además de inversiones y operadores capacitados, “se requieren políticas

estatales de control tendientes a asegurar la calidad de los alimentos que

consumimos mediante la utilización de estos métodos” (A. Leotta, 2009)

En Ecuador y la mayoría de los países en vías de desarrollo utilizan métodos

tradicionales para la detección de patógenos basados en la metodología

proporcionada por la AOAC y FDA (Food and Drug Administration) publicada

en el BAM (Bacteriological Analytical Manual) el cuál es un organismo

internacional que actualiza constantemente su información con el fin de

generar productos inocuos a los consumidores.

La metodología usada en el Ecuador para la detección de Salmonella spp. es

la descrita por el NTE INEN 1529-15:2013 Primera revisión, la cual en esta

investigación será comparada frente a la que propone el AOAC 995.20, BAM

Capítulo 5, Norma de la Organización de Estándares Internacionales (ISO)

6579:2002, Norma Oficial Chilena, Norma Mexicana NOM-114-SSA1-1994 y la

Norma Argentina, para establecer sus semejanzas y diferencias.

15

Las bases teóricas

La Salmonelosis es una de las Enfermedades de Transmisión Alimentaria más

comunes causada por la Salmonella a nivel mundial, su estudio es importante

ya que existen varios tipos o serotipos de Salmonella en el mundo que pueden

llegar a causar más de cien mil muertes. La Salmonella es una bacteria que es

capaz de resistir varias semanas en un ambiente seco e incluso varios meses

en agua, lo cual es un factor por el cual debe ser considerada su presencia en

alimentos marinos, como el camarón (Kopper, Calderón, Schneider, Domíngez,

& Gutiérrez, 2009)

La Salmonella es causante de gastroenteritis, la cual usualmente es inofensiva,

sin necesidad de tratamiento y no afecta la vida del paciente, sin embargo en

aquellos que tienen su sistema inmunológico débil puede llegar a ser severa.

Dentro de este grupo se encuentran los niños, ancianos o personas con el

sistema inmunológico afectado. (World Health Organizartion, 2013)

SALMONELLA

De acuerdo al manual de Bergey (2000), Salmonella es un género de bacterias

perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, con un rango de temperatura de

crecimiento que va de 5 a 46° C, siendo el rango óptimo de crecimiento de 35 a

43 ° C y su tamaño oscila de 0,3 μm x 1,0 – 6,0 μm. Generalmente están

formado por bacilos cortos móviles, gram negativos, no esporulados,

anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con formación de gas y no

fermentan la lactosa; siendo estas características importantes para su cultivo e

identificación. Está integrado por microorganismos que forman colonias típicas

16

sobre medios sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas

definidas.

Se encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza, son bastante

resistentes a las condiciones ambientales y muy poco exigentes en sus

requisitos nutricionales lo que les permite un rápido crecimiento y capacidad de

colonización de ambientes muy diversos, entre ellos el agua y los alimentos.

Son habitantes frecuentes del intestino de los vertebrados, incluyendo el

hombre, pudiendo invadir otros tejidos aparte de los del tracto intestinal, y

característicamente se comportan como parásitos intracelulares facultativos.

En los individuos infectados pueden originar procesos que cursan

habitualmente con cuadros gastroentéricos. No obstante en ocasiones pueden

causar graves septicemias y producir la muerte. Son extraordinariamente

frecuentes, así mismo, los procesos subclínicos con estados de portador

asintomático.

El hecho de que puedan vivir y multiplicarse tanto en el medio ambiente, de

forma libre, como en los animales e incluso en el interior de las células les

confiere una extraordinaria capacidad de adaptación y ubicuidad.

17

HISTORIA

La Salmonella, cómo ahora se la conoce, fue aislada por primera vez en el año

de 1886 por el Bacteriólogo Americano D.E. Salmon en compañía de Theobald

Smith, y fue nombrada Bacterium suipestifer.

En 1894 fueron descritas por primera vez las Fiebres Paratifoideas siendo en

1898 cuando Sir. Almroth Wright quien elaboró por primera vez una vacuna en

contra de la Fiebre Tifoidea a base de microorganismos muertos por calor, es

decir un tipo de vacuna inactiva o muerta, la cual generó una disminución

significativa de la tasa de morbilidad llegando de un 8.9 a 2.3 por cada 1000

individuos.

(Adelantado Faura et al., n.d.) Indica que fue en 1900 cuando Lignières

propuso nombrar al género que engloba a todos aquellos microorganismos

capaces de desarrollar fiebre tifoidea o tifus como Salmonella en honor a su

descubridor, cuya especie aislada fue nombrada con el tiempo como

Salmonella choleare-suis, nombre aprobado oficialmente en 1933

En 1915 se manisfestó un brote importante de Salmonella, se presentó en

tropas británicas ya inmunizadas, donde decidieron fortalecer y a su vez

mejorar la vacuna añadiendo Salmonella paratyphi A y B lo que dio paso a las

vacunas específicas las cuales disminuyeron notablemente el índice de

morbilidad a causa de este microorganismo.

En 1929 Topley y Wilson tuvieron ciertas dudas sobre la aceptación y

reconocimiento del género Salmonella ya que de acuerdo a los trabajos

18

realizados concluyeron que la Salmonella del uno no era la misma que la que

había analizado el otro. Sin embargo, establecieron de acuerdo a estos mismos

resultados que el término Salmonella se refería a aquel bacilo no fermentador

de lactosa que produce gas y ácido en la dextrosa y otros azúcares, fermenta

la xilosa y produce en el litmus una reacción alcalina. A su vez (Bell &

Kyriakides, 2002), definieron una intoxicación alimentaria como aquella

enfermedad capaz de producir gastroenteritis de corto plazo y que en la

mayoría de los casos es causada por la ingesta de alimentos contaminados por

algún microorganismo perteneciente al grupo de la Salmonella, usualmente

Bacterium enteritidis (Actualmente Salmonella enteritidis aislada en 1888 por

Gaertner) o Bacterium aertrycke

Durante los inicios de 1900 surgieron otras especies de Salmonella como la

Salmonella typhosum (en la actualidad, Salmonella typhi), Salmonella

paratyphosum A y B (Salmonella paratyphi A y B), Salmonella gallinarum,

Salmonella typhimurium; entre otras las cuales fueron reconocidas por ser

agente causante de enfermedades tanto en el hombre como en animales.

Gracias a los estudios realizados por White y Kauffman en 1930, se pudo

establecer una primera clasificación serológica de las cepas aisladas de los

más diversos hospedadores y hábitats, la cual se ha venido actualizando y

modificando hasta la actualidad (taxonomía del género Salmonella).

En la actualidad las especies de Salmonella han sido reconocidas por ser

microorganismos de transmisión alimentaria o de transmisión por agua

causantes de un amplio rango de enfermedades dentro de las más incidentes

se encuentran las Intoxicaciones Alimentarias (Gastroenteritis), Tifoidea (Fiebre

Entérica), Paratifoidea, Bacteremia, Septicemia, entre otras. Esto confirma la

importancia de su estudio y el efecto que causaría su presencia en productos

19

alimenticios, en este caso particular el efecto en las exportaciones de camarón

de nuestro país que veremos en esta investigación.

TAXONOMÍA

El género Salmonella está formado por más de 2000 cepas diferentes. En la

mayoría de los casos, las colonias aisladas eran denominadas ya sea por el

lugar donde fue originalmente encontrada (S. dublin), del huésped o de la

enfermedad que causaba (S. typhimurium – causa infecciones en los ratones).

Pero siguiendo el esquema de Le Minor, el género Salmonella perteneciente a

la familia Enterobacteriaceae posee una única especie, Salmonella enterica, y

un total de 7 subespecies; I, II, IIIa, IIIb, IV, V, y VI. Estas subespecies han

sido descubiertas aplicando test bioquímicos, los cuales permitieron

clasificarlas.

Las cepas de Salmonella spp. son clasificadas en serotipos o serovariedades,

de acuerdo al esquema de Kauffmann-White, el cual clasifica a los serotipos de

acuerdo a su tipo de antígeno, debido a su amplia diversidad observada, en

antígeno somático (O – presente en el lipopolisacárido), capsular (Vi) y flagelar

(H – en los flagelos). Los serotipos aislados de mayor importancia

epidemiológica, es decir, que causan la mayoría de infecciones en la especie

humana pertenecen a la subespecie o subgrupo I y son: Salmonella serotipo

enteritidis, Salmonella serotipo typhimurium y Salmonella serotipo virchow. Las

demás subespecies comprenden a aquellos microorganismos presentes en

animales de sangre fría o en el ambiente.

Si bien la clasificación taxonómica no es esencial para una identificación

clínica, es muy útil desde un punto de vista epidemiológico ya que conocer el

serotipo ayuda a los epidemiólogos a seguir la pista del origen de un

20

determinado brote infeccioso. Aproximadamente el 95% de los casos

declarados son ocasionados por 40 de los serotipos de los más de 2000

conocidos. (Ingraham & Ingraham, 1998, p. 559)

SALMONELLOSIS

(Ingraham & Ingraham, 1998, p. 561) sobre la salmonelosis indica que:

Es una infección bacteriana que generalmente afecta el tracto intestinal y

ocasionalmente, el torrente sanguíneo que puede llegar a ser muy grave,

especialmente en el caso de niños muy pequeños o personas de edad

avanzada; y constituye una de las causas más comunes de gastroenteritis y

produce varios miles de casos cada año en el mundo

La infección inicia cuando una persona ingiere grandes cantidades,

generalmente millones, de Salmonellas que invaden el epitelio del intestino

delgado donde se multiplican, estas bacterias no se diseminan posteriormente

a diferencia de los bacilos tifoideos.

Después de un día de haber ingerido el alimento contaminado, comienzan a

aparecer los síntomas gastrointestinales. “Los síntomas incluyen fiebre,

diarrea, cólicos abdominales, náuseas, vómitos y dolor de cabeza; los síntomas

suelen durar entre 4 y 7 días” (Ingraham & Ingraham, 1998)

La mayoría de las personas mejoran sin tratamiento (sin necesidad de

administración de antibióticos), en el caso de que gocen de una buena salud

antes de la infección. Pero existen casos donde puede ser más grave y pueden

presentarse complicaciones, por lo general entre los ancianos, niños pequeños

21

y personas inmunodeprimidas. También hay casos contados en donde

personas que estaban sanas, mueren a causa de haber ingerido un elevado

número de Salmonellas ya que les ocasionó una grave deshidratación o una

septicemia. Si la Salmonella penetra en el torrente sanguíneo, puede

desarrollarse un cuadro serio y hasta riesgoso para la vida. El tratamiento

habitual es a base de antibióticos.

También se puede adquirir una infección por Salmonella después de manipular

mascotas, especialmente reptiles como las serpientes, tortugas y lagartos. La

fiebre tifoidea, una enfermedad más seria causada por Salmonella, ocurre

frecuentemente en países en vías de desarrollo. (Instituto Nacional de Alergias

y Enfermedades Infecciosas, n.d.)

Debido a que la Salmonella se encuentra en las heces, sólo es necesario aislar

a las personas con diarrea activa que no puedan controlar sus hábitos

intestinales (por ejemplo, bebés, niños pequeños y ciertas personas

discapacitadas). La mayoría de las personas infectadas podrán regresar al

trabajo o a la escuela cuando puedan controlar dichos hábitos, siempre y

cuando se laven muy bien las manos después de evacuar. Las personas que

manipulen alimentos, los niños que asistan a guarderías y los trabajadores de

la salud deben obtener aprobación del departamento de salud local o estatal

antes de regresar a sus actividades de rutina.

La mayoría de las personas infectadas por salmonelosis se recuperan sin

ayuda o sólo necesitan líquidos para evitar la deshidratación. Por lo general, no

se recomienda el uso de antibióticos ni de medicamentos que controlen la

diarrea para los casos comunes con infecciones intestinales.

22

La salmonelosis en general es un grave problema sanitario. Como podemos

ver en Ecuador las enfermedades gastrointestinales son la causa del 21% de

casos de ingresos hospitalarios anualmente reportados, ya que la mayoría de

la población ha sufrido de enfermedades gastrointestinales, en este caso de

salmonelosis, en algún momento de su vida. Y a pesar de que muy pocas

personas mueren a consecuencia de esta enfermedad, afecta al país ya que se

pierden una gran cantidad de jornadas de trabajo y a su vez causa sufrimiento

y dolor a la población.

Se considera a la salmonelosis como una infección cosmopolita ya que

podemos infectarnos cada vez que ingerimos alimentos que estén

contaminados, he aquí la importancia del control de los alimentos y de la

prevención de la contaminación de los mismos para disminuir la tasa de

infecciones a causa de este microorganismo.

EL CAMARÓN Y SU EXPORTACIÓN EN EL ECUADOR

Según la Cámara Nacional de Acuacultura del Ecuador, las exportaciones de

camarón en nuestro país llegaron a su punto más alto en el año de 1998 donde

se alcanzó a exportar 11400 toneladas, recibiendo 875 millones de dólares de

Estados Unidos. Esto demuestra la importancia de la acuicultura y en especial

la camaronicultura, ya que genera divisas para el país y empleo para los

ciudadanos.

La (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura,

2005) indica sobre la industria camaronera que:

En el año 2000 debido al impacto del virus de la Mancha blanca tocó fondo,

con una producción de tan sólo 37,7 mil toneladas, para finales del 2002 el

23

Ecuador alcanzó la cifra de 46,8 mil toneladas exportadas, 3,24 por ciento

más que el año anterior, pero todavía lejos de una real recuperación en la

producción; y adicional a la Mancha Blanca, la Industria Acuícola

Camaronera ecuatoriana se ha visto afectada por una drástica caída en los

precios internacionales

En el año 2001 los precios del camarón ecuatoriano bajaron cerca de un 22 por

ciento en proporción al año anterior, y una disminución del 9 por ciento en el

año 2002, agudizando aún más la crisis del sector. Las expediciones de

camarón a inicios del 2005 (período Enero - Mayo), registraron un monto

récord de 35 854 toneladas, un 28 por ciento más en comparación con el

mismo período en 2004.

En agosto del 2013 el camarón ecuatoriano fue castigado en Estados

Unidos con el pago de un arancel de 13,5%, debido a que el país

norteamericano aseveraba que el camarón de Ecuador competía de forma

asimétrica con el producto local. Sin embargo, esa medida fue restituida en

septiembre cuando se indicó en la Comisión de Comercio Internacional de

Estados Unidos (USITC) que la industria camaronera del Ecuador no recibe

ningún subsidio gubernamental, por lo cual el marisco volvió a ingresar sin

arancel en Estados Unidos.

La (Agencia de Noticias Públicas del Ecuador, 2014) declaró que:

El argumento utilizado por Ecuador incluyó el análisis de que por cada

empleo creado en torno a la producción de camarón en las áreas rurales de

la costa, un empleo indirecto se crea vinculado a su comercialización en

Estados Unidos, es decir, es un producto complementario

24

En abril del presente año (Andes, 2014) señaló sobre las exportaciones de

camarón que:

Según el Banco Central del Ecuador, las exportaciones de camarón se

duplicaron en los dos primeros meses del presente año, al comparar las

cifras con las de enero y febrero de 2013; este fenómeno se debe al

desarrollo del volumen de las exportaciones y al incremento del precio del

marisco.

“Este aumento llegó a una cifra de 399 millones de dólares, un crecimiento de

97,2% frente a los dos primeros meses del 2013, cuando el Ecuador vendió

202,3 millones de dólares de ese producto” (Andes, 2014)

En asimilación al costo de hace un año, el precio del camarón se ha

aumentado en un 48,9%, que cambió de 6.456,7 dólares, por cada tonelada, a

9.614,9 dólares. “El volumen de exportación de camarón también se

incrementó en 32,4%, de 31.000 a 41.000 toneladas en los dos meses de

análisis” (CORREO, 2014)

25

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS

PATÓGENOS EN ALIMENTOS

El control de los microorganismos causantes de ETA depende del método

analítico que se utilice para su detección, siendo de gran importancia para el

Sistema de Salud Pública, así como para las plantas procesadoras de

alimentos.

Existe una serie de razones que justifican la necesidad de analizar los

alimentos para determinar cualitativa o cuantitativamente sus microorganismos.

Los principales objetivos del análisis microbiológico son asegurar:

1. Que el alimento cumple ciertas normas estatutarias;

2. Que se ajusta a normas internas establecidas por la compañía

procesadora y a las externas exigidas por el comprador;

3. Que las materias primas que lleguen a la fábrica para ser

procesadas cumplen las normas exigidas y las pactadas con el

producto;

4. Que se mantiene el control del proceso y la higiene en la línea de

fabricación.

26

Las infecciones se diagnostican tradicionalmente mediante el cultivo de

muestras de alimentos que se suponen contaminados y la identificación de

aquellas bacterias que crecen en estos medios de cultivo, basándose en sus

características fisiológicas y morfológicas. (Mtra. Tania González Flores, 2005)

MÉTODOS Y TÉCNICAS CONVENCIONALES DE DETECCIÓN

Sobre los métodos convencionales, (Herranz Sorribes, 2008a) indica que:

Los métodos “convencionales” de detección de microorganismos,

empleados actualmente en numerosos laboratorios de todo el mundo y

establecidos en muchos casos como métodos estándares de análisis

microbiológico de los alimentos, requieren en primer lugar que la bacteria

objeto del análisis forme una colonia en un medio de cultivo

Estos métodos no implican una inversión económica, si lo comparamos con

los métodos automatizados. Sin embargo, se caracterizan por ser laboriosos,

emplear grandes volúmenes de medios de cultivo, necesitan mano de obra

suficiente para la preparación de medios y registro de resultados. Además,

requieren un tiempo considerable para la obtención y el análisis de los

resultados puesto que se necesita un periodo de incubación, el cual demanda

varios días ya que el microorganismo buscado puede ser minoritario respecto a

la flora total y puede estar subletalmente lesionado, por esto deben

incorporarse cultivos de recuperación o de enriquecimiento antes de utilizar los

métodos selectivos (Rodríguez et al., 2009).

Existen ciertas limitaciones al usar esta metodología convencional como

herramienta de diagnóstico, tales como:

27

1. Existencia de células bacterianas que pueden entrar en estado viable

pero no cultivable, debido al tipo de procesamiento al que ha sido

sometido el alimento.

2. La obtención de resultados puede tomar días o semanas.

La mayoría de ETA no pueden asociarse con algún alimento en específico o no

se puede identificar el patógeno responsable.

Todo esto nos ha llevado a la necesidad de recurrir a métodos rápidos y

eficientes de detección del agente causal, descritos en esta investigación, así

como también se detallará el método tradicional para poder establecer las

diferencias entre todos estas técnicas instituyendo la más adecuada para

nuestros intereses, en este caso la Salmonella spp., por lo cual se mostrarán

las metodologías usadas para su detección, a continuación:

DETECCIÓN TRADICIONAL DE SALMONELLA SPP.

La norma ecuatoriana para la identificación de este microorganismo es

la establecida por el Instituto Ecuatoriano de Normalización (INEN) en las

Normas Técnicas Ecuatorianas (NTE) NTE INEN 1529-15:2013, Primera

revisión. Control microbiológico de los alimentos.- Salmonella.- Método de

detección. En la cual describe el siguiente procedimiento tradicional para la

identificación de Salmonella:

28

1. Pre-enriquecimiento. “Cultivo de la naturales 37 °C en

medios mínimos sencillos, exentos de agentes químicos

selectivos a fin de lograr la revitalización de las salmonellas

lesionadas” (Instituto Ecuatoriano de Normalización, 2013)

2. Enriquecimiento selectivo. “Subcultivo a 37°C y entre 42 a

43°C, en medios líquidos selectivos del cultivo pre-

enriquecido, para inhibir o restringir el crecimiento de la flora

competitiva y favorecer la multiplicación de las Salmonellas”

(Instituto Ecuatoriano de Normalización, 2013)

3. Aislamiento en medios selectivos sólidos. “Inoculación de

los cultivos de enriquecimiento selectivo en la superficie de

agares selectivos, para el aislamiento de Salmonellas de un

medio microbiano mixto” (Instituto Ecuatoriano de

Normalización, 2013)

4. Siembra en Agares Diferenciales: “Inoculación de los

cultivos de medios selectivos sólidos en la superficie de

agares diferenciales, para visualizar las colonias que por su

aspecto característico se las considera como se Salmonella

presuntiva” (Instituto Ecuatoriano de Normalización, 2013)

5. Identificación bioquímica: “Subcultivo de las colonias de

Salmonella presuntiva y determinación de sus características

bioquímicas y serológicas para identificarlas como miembros

29

del género Salmonella y la eliminación de cultivos

sospechosos falsos” (Instituto Ecuatoriano de Normalización,

2013)

6. Serotipificación: es una técnica inmunológica (antígeno-

anticuerpo) que permite la identificación específica de un

microorganismo.

MÉTODOS RÁPIDOS PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS

PATÓGENOS

Sobre los métodos rápidos de detección de patógenos, (Herranz Sorribes,

2008a) los define como:

Cualquier método destinado a la detección, el recuento, la caracterización y

la subtipificación de microorganismos (patógenos y de deterioro) mediante el

cual se obtienen resultados de manera sencilla, fiable en un tiempo reducido

y/o permiten procesar un número elevado de muestras por unidad de

tiempo, y son en general fáciles de usar, precisos (sensibilidad y

especificidad adecuadas y límites de detección bajos) y económicamente

rentables (aunque, en algunos casos, pueden requerir una inversión

económica inicial considerable)

Conviene destacar que, en la mayoría de los casos, el empleo de métodos

rápidos no excluye la etapa de enriquecimiento del microorganismo diana ni la

necesidad de obtener cultivos puros, así como que los resultados positivos

obtenidos con métodos alternativos (distintos del método de referencia) deben

ser confirmados.

30

El desarrollo de métodos rápidos y automatizados constituye un área de la

microbiología aplicada muy dinámica y en continua evolución. En las últimas

cinco décadas hubo numerosos avances en el desarrollo de métodos rápidos y

desde hace 20 años este campo cobró gran importancia en investigación y en

la industria alimentaria.

Los principales requisitos que deben cumplir los métodos rápidos y

automatizados de análisis microbiológico de los alimentos, pueden resumirse

en los siguientes puntos:

Exactitud: El método debe contener una alta sensibilidad, sus límites de

detección deben ser mínimos, poseer una elevada especificidad del

sistema de análisis en la obtención de resultados de acuerdo a las

especificaciones requeridas. A su vez debe ser versátil, de aplicación

potencial y permitir la comparación con métodos de referencia.

Rapidez: El método a utilizarse deberá requerir un tiempo mínimo para

la obtención de resultados, esto quiere decir un mayor número de

muestras procesadas en cada ensayo en una hora y por día.

Coste mínimo: Inicial, por análisis, reactivos, trabajo.

Aceptabilidad: Por parte de la comunidad científica y de las agencias

reguladoras de los sistemas analíticos.

31

Sencillez de manejo: Preparación de la muestra, funcionamiento del

equipo analítico y procesamiento informático de los datos.

Cualificación y formación del personal adecuada para la técnica a

realizar.

Reactivos: Facilidad de preparación, estabilidad, disponibilidad.

Fiabilidad del método: Avalada por la compañía u organismo

responsable de la técnica analítica.

Soporte técnico adecuado: Rapidez, disponibilidad y coste.

Mínimo espacio útil requerido. (Martín de Santos, 2009)

Los métodos microbiológicos rápidos mayormente utilizados en nuestro medio

se pueden dividir en tres grupos de acuerdo a las innovaciones introducidas

recientemente en cada uno de estos grupos:

1. Técnicas Bioquímicas.

2. Técnicas Inmunológicas.

3. Técnicas Moleculares.

32

Tabla 1

Clasificación de los Métodos Rápidos para la Detección de Patógenos

Clasificación de los Métodos Rápidos para la Detección de Patógenos

Técnicas Bioquímicas

Películas de medios de cultivos

deshidratados selectivos

Galerías miniaturizadas

Galerías automatizadas

Técnicas Inmunológicas

Precipitación

Aglutinación

Inmunofluorescencia

Enzimoinmunoensayo

Inmunocromatografía

Técnicas Moleculares

Hibridación

PCR

Biochips o biosensores

TÉCNICAS BIOQUÍMICAS

Consiste en aquellos ensayos basados en el comportamiento de los

microorganismos frente a reactivos específicos, los cuales permiten

diferenciarlos entre aquellos de una misma familia pero de la misma especie.

Como por ejemplo aquellos microorganismos fermentadores de azúcares,

presencia de enzimas, degradación de compuestos colorados, etc.

33

Películas de medios de cultivos deshidratados selectivos

“Son aquellos métodos que contienen pectina como agente gelificante en lugar

de agar, evitando de esta manera la necesidad de calentar el medio para

fundirlo” (Herranz Sorribes, 2008b) Encontramos también medios liofilizados

que emplean como soporte una película plástica de tamaño y grosor similar al

de una tarjeta de crédito, la cual está compuesta de geles solubles en agua fría

que se rehidratan al depositar la muestra en su superficie, este método

demanda un espacio mínimo para su almacenamiento e incubación, existiendo

asimismo instrumentos para la lectura rápida y automática de los resultados.

En el caso para la detección de Salmonella spp. en alimento altamente

contaminados, el procedimiento consiste en:

Preparar la Muestra.

Colocar la muestra en el gel.

Incubar 24 ± 2 hrs a 41.5°C.

Leer el medio.

Seleccionar las colonias presuntamente positivas.

Dejar incubando. En el caso de ser negativos la respuesta se verá a las

48 – 52 hrs.

Añadir los discos de confirmación para la confirmación bioquímica.

Incubar por 4 hrs a 41.5°C.

34

Usualmente este procedimiento se tarda 52 - 56 horas para poder obtener

resultados. Esto equivale a un aproximado de 3 a 4 días.

Galerías miniaturizadas

Este método fue implementado inicialmente para la diferenciación de bacterias

en el área de la clínica. Pero debido a que su uso se ha extendido, actualmente

también se utiliza en áreas como la alimentaria y farmacéutica. En este caso,

nos conviene enfocarnos en el área de microbiología alimentaria.

Se caracteriza debido a que permite realizar varias pruebas bioquímicas de

manera simultánea y a su vez facilita la identificación de la bacteria en menor

tiempo, disminuyendo en el ensayo el consumo de grandes cantidades de

reactivos y medios a utilizarse. Por lo tanto es un método amigable al medio

ambiente.

Cada ensayo consta de un tubo miniaturizado que contiene el medio de cultivo

específico, el cual al ser inoculado con la suspensión bacteriana pura, se

hidrata. A los resultados positivos de dichos ensayos, se les asigna un

determinado valor numérico, obteniendo un código el cual será traducido por

una base de datos proporcionando el género o especie hallada.

Para el caso de Salmonella spp. se utilizan galerías de la Familia

Enterobacteriaceae. Las cuales dan resultados aproximadamente luego de 18

– 24 horas.

35

Limitación del método

Radica en la probabilidad de aparición de cepas mutantes y la

adquisición de plasmidios que pueden dar origen a cepas con

características diferentes.

Se necesita de la experticia del analista para que de una correcta

interpretación de los resultados y así determinar el género y especie

adecuado.

Cabe recalcar que el uso de estas galerías es complementario a la

determinación de Salmonella spp. por el método convencional u otro

método, ya que esta determinación corresponde a la Etapa de Pruebas

Bioquímicas, donde de todas maneras agilitamos el proceso.

Galerías automatizadas

“Son aquellos sistemas miniaturizados que ofrecen la posibilidad de lectura e

interpretación de resultados de manera automatizada, basados en el

metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y su

detección mediante diversos sistemas indicadores” (Herranz Sorribes, 2008b)

Dentro de estos destacan los siguientes:

“Tarjetas desechables para la identificación sencilla de colonias

sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas que permiten la

36

identificación de más de 800 especies de bacterias y levaduras” (Cruz

Martínez, 2007)

“Tubos de plástico con compartimentos que contienen agar con distintos

sustratos y con una aguja en su interior que posibilita la inoculación del

tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia” (Herranz

Sorribes, 2008b)

“Soportes plásticos con pocillos de fácil inoculación que poseen

sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos en estado deshidratado que

se rehidratan al contacto con la muestra” (Herranz Sorribes, 2008b)

Sistema Biolog que consiste en la detección de microorganismos aptos

para provocar la oxidación de 95 fuentes de carbono. A su vez, además

de la identificación, sus patrones metabólicos permiten crear relaciones

filogenéticas entre otros aislados. La lectura de los resultados se ve

facilitada debido al uso de un único cromógeno como indicador rédox,

en este caso el Violeta de Tetrazoilo. Este es capaz de reducirse de

forma irreversible, debido a la actividad metabólica bacteriana, a

formazán dando una tonalidad violeta.

Tiempo de lectura: 4 horas

37

TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

Estos métodos implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas

específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran

utilidad en la identificación microbiana en muestras puras o en muestras

biológicas. De manera general su fundamento se basa en la visualización

objetiva de la interacción entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo. La

solución que contiene los anticuerpos se denomina antisuero. Estos métodos

se caracterizan por su alta sensibilidad, especificidad, su gran rapidez y bajo

costo.

Precipitación

(Martínez Ballesteros, 2011) Indica que los métodos basados en inmunología,

en este caso los de precipitación son:

Métodos rápidos, de uso sencillo y fáciles de interpretar. Normalmente están

compuestos por una membrana, habitualmente de nitrocelulosa, donde está

inmovilizado el anticuerpo que específicamente une y captura el antígeno

específico de la bacteria si está presente en la muestra, formándose una

línea visible debido a la utilización de partículas de látex coloreadas

Aglutinación

Sobre la aglutinación (Martínez Ballesteros, 2011) señala que es el método

inmunológico más utilizado es la aglutinación en látex, por su sencillez, en el

que las partículas de látex son unidas a los anticuerpos específicos que en

38

contacto con los antígenos específicos del microorganismo diana produce una

reacción de aglutinación que es detectada visualmente.

Para Salmonella existen varios test de aglutinación. Normalmente estos test

son utilizados en la última fase del método tradicional de detección de

Salmonella, es decir, en la confirmación serológica.

Inmunofluorescencia

“La inmunofluorescencia ha resultado ser sumamente útil en casos de

infecciones de diferente origen. Puede utilizarse para la identificación del

microorganismo aislado o presente en una muestra biológica” (De Vizcarrondo

& Gutiérrez, 2002)

Consiste en fijar la muestra problema a una lámina y se pone en contacto con

el antisuero específico marcado con una sustancia fluorescente (rodamina o

fluoresceína). Una vez transcurrido el tiempo para que tenga lugar la reacción

antígeno anticuerpo, se expone la lámina a la radiación ultravioleta para

visualizar la reacción.

Enzimoinmunoensayo

(Martínez Ballesteros, 2011) señala que el método ELISA (Enzyme Linked

ImmunoSorbent Assay) es uno de los formatos basados en anticuerpos más

utilizados para el análisis de patógenos en alimentos, aquí se utiliza un

anticuerpo unido a una matriz sólida que captura los antígenos presentes en el

39

cultivo enriquecido, a su vez para realizar la detección se utiliza un segundo

anticuerpo conjugado con una enzima y en presencia del sustrato la enzima

catalizará una reacción colorimétrica.

En esta clase de pruebas se usan con mayor frecuencia las paredes de los

pocillos que conforman a las placas de microtitulación.

En la actualidad se halla una gran diversidad de kits en formato ELISA para la

detección de Salmonella. “Hoy en día muchos de estos test se proporcionan

como sistemas automatizados y robotizados que ahorran tiempo gracias a la

disminución del trabajo manual, pero además, aumentan la reproducibilidad y

la estandarización de cada paso” (Paucar Sánchez & Tenecora Quito, 2013)

En los últimos años, se han desarrollado sistemas que permiten realizar el

ensayo ELISA de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la

detección de Salmonella, E. Coli O157:H7, Listeria monocytogenes,

Campylobacter spp. y toxinas. Un número considerable de laboratorios de

microbiología de los alimentos emplea instrumentos automatizados basados en

una variante de la tecnología ELISA conocida como ELFA (Enzyme-Linked

Fluorescent Assay), en la que el producto final de la reacción es fluorescente

en lugar de cromogénico, para la detección de los patógenos alimentarios. En

ocasiones, se utiliza la técnica de separación inmunomagnética (SIM), que

emplea partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos

(Dynabeads, Dynal), para concentrar el antígeno de interés como etapa previa

a la realización del ELISA. La SIM permite reducir el tiempo requerido para el

enriquecimiento de la muestra, así como obtener suspensiones que contienen

menor cantidad de partículas del alimento, lo que facilita su procesado

posterior mediante distintas técnicas (hibridación con sondas génicas, PCR,

etc.). Otro tipo de ensayos inmunológicos rápidos y listos para usar son los

40

basados en la inmunodifusión en un vial de agar para la detección rápida de

serovares mótiles de Salmonella o en la aglutinación reversa pasiva con

partículas de látex para la detección de microorganismos patógenos

(Microscreen, Microgen Bioproducts) y toxinas microbianas (RPLA kits, Oxoid)

Estos métodos se demoran alrededor de 1 a 2 días.

Inmunocromatografía

Para laboratorios con un volumen moderado de muestras a analizar existen kits

de diagnóstico basados en el principio de la inmunocromatografía de flujo

lateral caracterizados por ser rápidos, sencillos y no requerir instrumentación

especial. Su tecnología permite el análisis de diferentes matrices de alimentos

utilizando una pequeña porción de muestra.

El método consiste en colocar la muestra enriquecida en el dispositivo

cromatográfico, donde es arrastrada capilarmente pasando por la zona que

contiene el reactivo con el anticuerpo específico conjugado con partículas de

oro coloidales. Si el antígeno está presente en la muestra, se formará una línea

en la zona de prueba del dispositivo. Para asegurarnos que la prueba está

funcionando correctamente, detectando la presencia o ausencia del antígeno

Salmonella, aparecerá asimismo una línea control en la zona control. El tiempo

que demora esta muestra, es de alrededor de 1-2 horas.

41

TÉCNICAS MOLECULARES

“Modernamente adquiere más importancia el uso de métodos basados en

biología molecular donde, a través de procedimientos y reactivos, se pueden

detectar determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado

agente microbiano” (de Vizcarrondo & Gutiérrez, 2002)

PCR

El método que se está utilizando ampliamente en los laboratorios de

diagnóstico es el PCR (Polymerase Chain Reaction), que se aplica

generalmente para la identificación de microorganismos que no pueden ser

cultivados por los métodos convencionales.

A través de este método, puede aumentarse la cantidad de ADN hasta niveles

detectables mediante electroforesis o mediante sondas de ADN.

La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento

particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par

de cebadores, primers o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en

forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y

temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa

termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la

secuencia deseada del ADN (Mullis, 1990).

El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un número de

veces:

42

1. “Separación de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la

temperatura, la cual rompe los enlaces de hidrógeno que mantiene

unidos a las cadenas de ADN” (de Vizcarrondo & Gutiérrez, 2002)

2. Adición de cadenas cortas de polinucleótidos, denominados cebadores,

que se unen por complementariedad de bases a cada una de las

cadenas del fragmento de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la

cadena 5’ ---3’ y otro a la cadena 3’—5’.

3. Disminución de la temperatura para permitir que los cebadores

hibridicen con las cadenas de ADN de la muestra problema, por

complementariedad de bases.

4. Adición de la ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos (ATP, GTP, TTP,

CTP) y demás cofactores, para que tenga lugar la síntesis de la cadena

complementaria.

5. Repetición de las etapas 1 a 4. Este proceso se caracteriza por ser

exponencial. En cada ciclo se duplica la región de ADN ubicada entre

los cebadores. Este procedimiento se realiza en un equipo denominado

termociclador, que permite regular las diferentes temperaturas que se

requieren para cada uno de los pasos.

Tiempo aproximado: 19-46 horas.

43

CONSTITUYENTES DE LA PCR

Para realizar una PCR se necesita mezclar en un tubo el ADN que contiene la

secuencia a amplificar, ambos primers que se alinearán a las cadenas simples

del ADN, la mezcla de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs)

en cantidades suficientes, el tampón de reacción para la polimerasa, agua

ultrapura para completar el volumen final de reacción (que normalmente oscila

entre 20 y 100 µl), y como ingrediente final crucial para la reacción, la enzima

ADN polimerasa termoestable (Barrera et al., 1993).

VENTAJAS Y DESVENTAJAS EN LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS

MEDIANTE PCR

Las principales ventajas del uso de la PCR en la detección e identificación de

bacterias causantes de ETA radica en tres aspectos fundamentales: su

sensibilidad, su especificidad y su capacidad de procesamiento de grandes

cantidades de muestras. Adicionalmente estos métodos identifican

microorganismos que no pueden ser estudiados por técnicas convencionales o

que no pueden cultivarse en substratos artificiales (Scheu et al., 1998).

Una de las limitaciones de las técnicas de PCR descritas radica en que la

amplificación del material genético se produce tanto en las células viables

como en las muertas. Es decir, podemos obtener un resultado positivo a partir

de una muestra de alimento en la que todos los microorganismos hayan sido

destruidos como consecuencia del proceso tecnológico aplicado. Para

resolverlo, cada vez se utiliza más la técnica de PCR que emplea como enzima

una transcriptasa inversa.

44

Entre otros factores que limitan la aplicación de la PCR en la identificación de

microorganismos patógenos en muestras de alimentos, destaca la presencia

de sustancias que pueden ejercer un efecto inhibitorio sobre la reacción, como

la hemoglobina, la lactoferrina, los polisacáridos, las grasas, las proteínas y

iones metálicos presentes en las matrices alimenticias. La repercusión de estos

compuestos en la obtención de resultados falso-negativos puede eliminarse

empleando pasos de preenriquecimiento o polimerasas apropiadas, así como

membranas selectivas (Gentry, 2002).

Otra de las limitaciones de las técnicas de PCR descritas radica en que la

amplificación del material genético se produce tanto en las células viables

como en las muertas. Para resolverlo, cada vez se utiliza más la técnica de

PCR que emplea como enzima una transcriptasa inversa, por lo que esta

técnica se ha propuesto para la detección e identificación de microorganismos

viables, entre los que destacan bacterias patógenas e indicadores de

contaminación (Mayoral et al., 2005).

Aunque muchos laboratorios de diagnóstico alrededor del mundo han

implementado métodos de PCR para la detección de patógenos, existen

algunos parámetros como, la extracción del ADN, la elección de primers y el

tipo de programa de la PCR, que pueden afectar la eficiencia de la reacción,

con lo que los resultados de las pruebas desarrolladas o publicadas por algún

laboratorio en ocasiones pueden ser difíciles de reproducir en otros

laboratorios.

45

Hibridación

Dentro de las técnicas moleculares no basadas en PCR, esta técnica es la más

frecuente. Generalmente se utilizan sondas oligonucleotídicas que reconocen

el ARN ribosómico (ARNr). Las células bacterianas son tratadas con diversos

fijadores y después, se realiza la hibridación con los oligonucleótidos en

condiciones muy restrictivas, bien en superficie de cristal o bien en solución.

Las sondas suelen tener un tamaño de entre 15 y 25 nucleótidos y están

marcadas covalentemente en el extremo 5´ con una molécula fluorescente.

Después de unos lavados para retirar las sondas que no se hayan unido, las

células que estén marcadas gracias a la unión con las sondas, serán

detectadas mediante un microscopio de epifluorescencia. El límite de detección

de esta técnica suele estar en torno a 104 ufc/ml, por lo que se necesita un

paso previo de enriquecimiento para alcanzar esos valores. Este método tiene

una duración de aproximadamente 19-46 horas.

Biochips (Biosensores)

“Son dispositivos compactos de análisis integrado que permite procesar la

señal ocasionada por la interacción entre el elemento de reconocimiento y la

sustancia u organismo que se pretende detectar (analito/muestra)” (Almengor,

2009)

El sistema de análisis integrado se refiere a su composición que puede ser de

un elemento de reconocimiento biológico, que puede ser enzimas, tejidos,

células, anticuerpos o ácidos nucleicos; o también de un elemento de

reconocimiento biomimético, es decir, de polímeros de impresión molecular.

46

Estos dispositivos necesitan a su vez de un sistema de traducción de señal

específico y así mismo un software especializado con los algoritmos

apropiados para poder general los resultados esperados.

Ventajas:

1. Alta especificidad.

2. Sensibilidad.

3. Fiabilidad y capacidad de análisis múltiples.

4. Fácil automatización.

5. Capacidad para trabajar en tiempo real.

Estos dispositivos pueden utilizarse en la detección de biotoxinas y

microorganismos alterantes y patógenos presentes en los alimentos.

(Almengor, 2009) señala que aunque las principales aplicaciones de los

biosensores van dirigidas a la investigación genómica y la medicina, ya se

dispone de dispositivos específicos (basados en la hibridación de ácidos

nucléicos y en interacciones antígeno-anticuerpo) para la detección de

Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Clostridium botulinum y otros microorganismos cuya presencia en los

alimentos y/o la de sus toxinas puede suponer un peligro para la salud de los

consumidores

47

CAPÍTULO III: METODOLOGÍA, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Diseño metodológico

Método de investigación:

Dentro de este trabajo es necesario conocer los diferentes métodos de

investigación que se emplearon para cumplir con los objetivos trazados y dar

resultados conforme a lo planteado.

Se empleó el método exploratorio, descriptivo y correlacional; así mismo la

investigación explicativa, usando datos primarios y secundarios para poder

llegar a una evaluación correcta de los fenómenos que se estudian en esta

investigación. Debido a esto, este documento se convierte en investigación

tanto primaria como secundaria, ya que se obtuvieron datos directos de las

empacadoras y laboratorios de control y a su vez mediante la revisión

bibliográfica de las diferentes normas y métodos utilizados en la detección de

Salmonella spp. en alimentos altamente contaminados (camarón).

El empleo de varios métodos se justifica ya que para realizar una investigación

existen varios caminos que podemos emplear y muchos de estos métodos se

relacionan y complementan entre sí.

48

MÉTODOS TEÓRICOS.

Los métodos teóricos utilizan el uso del pensamiento y sus procesos de

inducción–deducción, análisis–síntesis.

MÉTODO HISTÓRICO-LÓGICO

El mismo reproduce en el plano teórico la esencia del objeto de estudio,

investigando las leyes generales y primordiales del funcionamiento y desarrollo

del objeto de estudio así como sus evolución y desarrollo histórico. (Díaz

Sanjuán, 2011) Este método fue utilizado en la fundamentación teórica del

estudio de los métodos usados en la detección de Salmonella spp. en camarón

crudo entero congelado, así como también el impacto socio-económico que

ejerce la exportación de Camarón crudo entero congelado en nuestro país y a

su vez la importancia del análisis de Salmonella spp. en este alimento.

MÉTODO ANALÍTICO

El análisis y la síntesis, la abstracción, la inducción y la deducción permitieron

el conocimiento de la situación actual de los métodos usados en los

Laboratorios de Control, Empacadoras y Organismo de Control para el análisis

de Camarón crudo entero congelado. Con el fin de obtener una visión completa

de la realidad en nuestro país analizando la información teórica obtenida de

libros, publicaciones, tesis, normas y aquella información recolectada por

medio de las encuestas.

49

MÉTODOS EMPÍRICOS

Este modelo de investigación científica emplea la experimentación y la lógica

empírica, que junto a la observación de fenómenos y su análisis estadísticos, lo

utilizamos en nuestro trabajo de investigación científica. (Cazau, 2006)

MÉTODOS ESTADÍSTICOS

La recopilación de datos obtenidos en la encuestas realizadas a las

Laboratorios de Control, Empacadoras y Organismo de Control en el Guayas,

estableciendo porcentajes que nos permitan evaluar y lograr los objetivos

planteados.

50

Procedimiento de la Investigación:

1. Búsqueda de métodos analíticos desarrollados para la detección de Salmonella spp.

2. Revisión de la Norma INEN 1529-15:2013, para el análisis de

Salmonella spp. en Alimentos.

3. Revisión de las Normas Oficiales para el análisis de Salmonella spp. en

Alimentos de México, Chile y Argentina.

4. Planteamiento del Problema.

5. Justificación e Importancia del análisis de Salmonella spp. en las

empresas exportadoras de camarón (Empacadoras).

6. Establecimiento del título del proyecto de titulación.

7. Planteamiento de los objetivos de la investigación.

8. Desarrollo del marco teórico.

9. Análisis de las bases teóricas recopilada.

51

10. Elaboración de la metodología a emplearse.

11. Construcción de las interrogantes de la encuesta.

12. Realización de la Encuesta a las Empacadoras y Laboratorios de

Control, así como al Organismo de Control.

13. Análisis de los datos obtenidos de las encuestas.

14. Discusión de los resultados obtenidos.

15. Planteamiento de la propuesta.

16. Elaboración de la propuesta.

17. Revisión del Proyecto de Titulación.

18. Elaboración de Conclusiones y Recomendaciones.

52

Instrumentos de investigación

Encuesta

En esta investigación se tomó como medio de investigación a las Encuestas,

debido a que este instrumento nos permitirá obtener la información requerida

para obtener resultados en torno al tema de la Investigación.

Por ello es elemental lo señalado por (Kerlinger, 1981) “El procedimiento más

adecuado es juzgar la representatividad de los reactivos en términos de los

objetivos de la investigación a través de la opinión de los especialistas”.

Esto se llevará a cabo satisfactoriamente con la correcta formulación de las

preguntas, relacionadas con los objetivos de la investigación, a incluirse en la

Encuesta.

Cabe indicar que el tipo de preguntas a utilizarse dentro de la encuesta son en

su mayoría, preguntas cerradas, es decir, preguntas donde simplemente se

selecciona la respuesta a partir de una o varias alternativas que el encuestador

le presenta; esto nos facilitará la tabulación y análisis de los resultados,

obteniendo respuestas claras y concisas.

53

PREGUNTAS INCLUIDAS EN LA ENCUESTA

1. ¿Dentro de las Especificaciones de Calidad de su empresa, se incluye el

análisis de Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado?

2. En caso de utilizarlas, seleccione la Normativa implementada que se

menciona a continuación, de no encontrarse la norma empleada,

mencione la misma.

3. ¿Realiza su empresa el análisis de Salmonella spp. dentro de sus

instalaciones?

4. Si su respuesta fue NO ¿Deriva su empresa el análisis a un Laboratorio

Externo?

5. Si su empresa realiza la detección de Salmonella spp. dentro de sus

instalaciones, ¿Qué métodos ha empleado para la detección de

Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado? Escoja de las

opciones brindadas a continuación, de no encontrarse el método

utilizado, mencione el mismo.

6. ¿Qué método utilizan en la actualidad? Escoja de las opciones

brindadas a continuación, de no encontrarse el método utilizado,

mencione el mismo.

54

7. Si su empresa deriva el análisis de Salmonella spp. en camarón crudo

entero congelado, a un Laboratorio Externo; ¿Conoce Ud. el método que

emplean? Mencione el método.

Población y Muestra:

Población

Constituida por las Empacadoras de Camarón de la Provincia del Guayas, así

como el Organismo de Control y Laboratorios de Control donde está el objeto

de estudio. Esta encuesta será realizada a un representante técnico de dichas

instalaciones.

Tabla 2

Población

Involucrados Número %

Empacadoras 26 66,66

Laboratorios de Control 12 30,77

Organismo de Control 1 2,56

Total 39 99,99

55

EMPACADORAS DEL GUAYAS AFILIADAS A LA CÁMARA NACIONAL DE

ACUACULTURA

Tabla 3

Empacadoras del Guayas

CANTÓN

# GUAYAQUIL DURÁN ELOY ALFARO SAMBORONDÓN

1 NIRSA S.A. ESTAR C.A. OMARSA S.A. TONSNA S.A.

2 GRUPO GRANMAR

S.A. “EMPAGRAN”

EMPACRECI

S.A.

EXPALSA

EXPORTADORA DE

ALIMENTOS S.A.

3 SOMAR S.A. PRODUMAR

S.A.

PROCESADORA

DEL RÍO S.A.

“PRORIOSA”

4 SANTA PRISCILA

S.A.

CRIADEROS DE

MARISCOS S.A.

“CRIMASA”

5 MARINA DEL REY

S.A. “MARDEREY”

6 PROMARISCO

7 SONGA

8 LANGOSMAR S.A.

9 ALQUIMIA MARINA

S.A. ALMARSA

10 AQUAMAR

11 ANISALEO C.A.

12 GRUPO QUIROLA

13 MAKERJUST S.A.

14 SUPESCA S.A.

15 SALINASA S.A.

16 DISOMAR S.A.

17 EDEMAR S.A.

18 TIMERSA S.A.

56

LABORATORIOS DE CONTROL DE ALIMENTOS DEL GUAYAS,

ACREDITADOS POR EL ORGANISMO DE ACREDITACIÓN

ECUATORIANO (OAE)

Tabla 4

Laboratorios de Control de Alimentos

GUAYAS

1 AVILÉS Y VÉLEZ 7 LABORATORIO

PROGECA - BIOTERIO

2 INSPECTORATE DEL

ECUADOR S.A. 8

LABORATORIO WSS

WORLD SURVEY

SERVICES ECUADOR

S.A.

3

LABORATORIO DEL

INSTITUTO NACIONAL

DE PESCA INP

9

SGS DEL ECUADOR –

LABORATORIO DEL

SECTOR AGRÍCOLA

4

LABORATORIO DEL

INSTITUTO NACIONAL

DE PESCA INP EPA

10 LABORATORIOS LASA

5

LABORATORIO DE

EXCELENCIA QUÍMICA

S.A. UBA

11

LABORATORIO PROTAL

– ESCUELA SUPERIOR

POLITÉCNICA DEL

LITORAL

6 LABORATORIOS LAZO 12 JOZALAB S.A.

ORGANISMO DE CONTROL DEL GUAYAS, ACREDITADO POR EL

ORGANISMO DE ACREDITACIÓN ECUATORIANO (OAE)

Tabla 5

Organismo de Control del Guayas

GUAYAS

AGENCIA DE REGULACIÓN Y CALIDAD SANITARIA

(ARCSA)

57

Muestra

Es un subconjunto del conjunto de la población o universo, parte del todo. Es

una porción de la investigación en la que se ha trabajado.

Para sacar la muestra se aplica la siguiente fórmula matemática:

𝐧 =𝐍 × 𝒁𝜶

𝟐 × 𝒑 × 𝒒

(𝐝)𝟐(𝐍 − 𝟏) + 𝒁𝜶𝟐 × 𝒑× 𝒒

(Castellanos, 2012)

N= Total de la Población

𝒁𝜶𝟐= 1,645 al cuadrado (Seguridad del 90%)

p= Población esperada (10%=0,1)

q= 1 – p (1 – 0,1 = 0,90)

d= Precisión (5% = 0,05)

Tabla 6

Muestra

Involucrados Número %

Empacadoras 20 64,52

Laboratorios de Control 10 32,26

Organismo de Control 1 3,22

Total 31 100

58

Resultados (Gráficos)

COMPARACIÓN DE LA METODOLOGÍA CONVENCIONAL Y MÉTODOS RÁPIDOS EMPLEADA EN LA DETECCIÓN DE

SALMONELLA SPP. EN ALIMENTOS

Tabla 7

Método convencional Vs Técnicas bioquímicas empleadas en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

TÉCNICAS

BIOQUÍMICAS

PARÁMETROS

Películas de

medios de

cultivos

deshidratados

selectivos

Galerías

miniaturizadas

(Pruebas

Complementaria)

Galerías

automatizadas

(Pruebas

Complementaria)

MÉTODO

CONVENCIONAL

TIEMPO DE

ANÁLISIS 3 – 4 días

18 – 24 horas + 6

días MC =

7 días

4 horas + 6 días

MC = 6 días 7 – 8 días

SENSIBILIDAD

DEL MÉTODO Media - Alta Media - Alta Alta Alta

GRADO DE

EXPERTICIA

DEL ANALISTA

Básico Intermedio Avanzado Avanzado

59

Tabla 8

Método convencional Vs Técnicas inmunológicas empleadas en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

TÉCNICAS

INMUNOLÓGICAS

PARÁMETROS

Precipitación Aglutinación

Inmuno-

fluorescencia

(Prueba

Presuntiva)

Inmuno-

cromatografía

(Prueba

Complementaria)

Enzimo-

inmunoensayo

MÉTODO

CONVENCIONAL

TIEMPO DE ANÁLISIS 1 – 2 horas 1 – 2 horas 1 – 2 horas 1 – 2 horas 1 – 2 días 7 – 8 días

SENSIBILIDAD DEL

MÉTODO Media Media Media Media - Alta Media - Alta Alta

GRADO DE

EXPERTICIA DEL

ANALISTA

Básico Básico Básico Básico Intermedio Avanzado

Nota: Cabe recalcar que el tiempo del análisis varía de acuerdo a la carga microbiana inicial del Alimento, el cual generalmente necesita una

etapa de Pre-enriquecimiento, requiriendo de esta manera un día más de análisis. En el caso de métodos complementarios se necesita hacer

una siembra en los medios de cultivos de agares selectivos para confirmar la presencia o ausencia del patógeno.

60

Tabla 9

Método convencional Vs Técnicas moleculares empleadas en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

TÉCNICAS

MOLECULARES

PARÁMETROS

Hibridación PCR Biochips o

biosensores

MÉTODO

CONVENCIONAL

TIEMPO DE

ANÁLISIS 2 – 3 días 1 – 2 días 1 – 2 días 7 – 8 días

SENSIBILIDAD

DEL MÉTODO Alta Alta Alta Alta

GRADO DE

EXPERTICIA

DEL ANALISTA

Intermedio/

Avanzado

Intermedio/

Avanzado

Intermedio/

Avanzado Avanzado


etapa de Pre-enriquecimiento, requiriendo de esta manera un día más de análisis.

61

COMPARACIÓN DE LA METODOLOGÍA CONVENCIONAL Y MÉTODOS RÁPIDOS EMPLEADA EN LA DETECCIÓN DE

SALMONELLA SPP. EN ALIMENTOS UTILIZADAS CON MAYOR FRECUENCIA EN NUESTRO MEDIO.

Tabla 10

Método convencional Vs Métodos Rápidos más empleados en la detección de Salmonella spp. en Alimentos, Guayas

TIPO DE

MÉTODO

PARÁMETROS

MÉTODO

CONVENCIONAL

Enzimo-

inmunoensayo

Películas de medios de

cultivos deshidratados

selectivos

Inmuno-

cromatografía PCR

TIEMPO DE

ANÁLISIS 7 – 8 días 1 – 2 días 3 – 4 días 1 – 2 horas 19 – 46 horas

SENSIBILIDAD

DEL MÉTODO Alta Media - Alta Media - Alta Media - Alta Alta

GRADO DE

EXPERTICIA

DEL ANALISTA

Avanzado Intermedio Básico Básico Intermedio/

Avanzado


etapa de Pre-enriquecimiento, requiriendo de esta manera un día más de análisis. En el caso de métodos complementarios se necesita hacer

una siembra en los medios de cultivos de agares selectivos para confirmar la presencia o ausencia del patógeno.

62

COMPARACIÓN DE NORMAS OFICIALES PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP. EN ALIMENTOS (CAMARÓN)

ETAPA DE PRE-ENRIQUECIMIENTO

Tabla 11

Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Pre-enriquecimiento en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

NORMAS

OFICIALES

PARÁMETROS

AOAC

995.20

2002

FDA – BAM

(CAPÍTULO 5)

MAYO 2014

ISO

6579:2003

2012

NTE INEN

2013

NORMA

CHILENA

2009

NORMA

MEXICANA

NOM-114-

SSA1-1994

NORMA

ARGENTINA

2011

MEDIO Caldo de

Lactosa

Caldo de

Lactosa

Agua peptona

tamponada

Agua peptona

tamponada

Caldo de

Lactosa

Caldo de

Lactosa

Agua peptona

tamponada.

TEMPERATURA

DE

INCUBACIÓN

35°C ±

1°C 35°C ± 1°C 37°C ± 1°C 37°C ± 1°C 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C 37°C ± 1°C

TIEMPO DE

INCUBACIÓN 24h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 2h 18h ± 2h 20h ± 2h 24h ± 2h 18h ± 2h

63

ETAPA DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

Tabla 12

Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Enriquecimiento selectivo en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

NORMAS

OFICIALES

PARÁMETROS

AOAC 995.20

2002

FDA – BAM

(CAPÍTULO 5)

MAYO 2014

ISO 6579:2003

2012 NTE INEN 2013

NORMA

CHILENA

2009

NORMA

MEXICANA

NOM-114-SSA1-

1994

NORMA

ARGENTINA

2011

MEDIO A

Caldo

Rappaport-

Vassiliadis (RV)

Caldo

Rappaport-

Vassiliadis (RV)

Caldo

Rappaport-

Vassiliadis con

Soya (RVS)

Caldo Selenito

Cistina

Caldo

Rappaport-

Vassiliadis

Caldo Selenito

Cistina

Caldo

Rappaport-

Vassiliadis (RV)

TEMPERATURA

DE

INCUBACIÓN A

ACM: 42°C ±

0.2°C

ACM: 42°C ±

0.2°C 37°C ± 1°C 37°C ± 1°C

ACM: 42°C ±

0.2°C 35°C ± 1°C 41.5°C ± 1°C

BCM: 42°C ±

0.2°C

BCM: 42°C ±

0.2°C

BCM: 42°C ±

0.2°C

TIEMPO DE

INCUBACIÓN A ACM: 24h ± 2h ACM: 24h ± 2h 24h ± 2h 48h ± 2h ACM: 24h ± 2h 20h ± 2h 24h ± 3h

64

BCM: 24h ± 2h BCM: 24h ± 2h BCM: 24h ± 2h

MEDIO B Caldo

Tetrationato

Caldo

Tetrationato

Caldo Muller-

Kauffmann

(Tetrationato)

Caldo

Tetrationato

Verde Brillante

Caldo

Tetrationato

Verde Brillante

Caldo

Tetrationato

(Rappaport-

Vassiliadis)

Caldo Muller-

Kauffmann

(Tetrationato)

TEMPERATURA

DE

INCUBACIÓN B

ACM: 43°C ±

0.2°C

ACM: 43°C ±

0.2°C 41.5°C ± 1°C

42 – 43°C ± 1°C

ACM: 43°C ±

0.2°C 35°C ± 1°C

37°C ± 1°C –

42.5°C BCM: 35°C ±

2°C

BCM: 35°C ±

2°C

BCM: 35°C ±

2°C

TIEMPO DE

INCUBACIÓN B

ACM: 24h ± 2h ACM: 24h ± 2h 24h ± 2h

48h ± 2h

ACM: 24h ± 2h

20h ± 2h 24h ± 3h

BCM: 24h ± 2h BCM: 24h ± 2h BCM: 24h ± 2h

65

ETAPA DE AISLAMIENTO EN MEDIOS SELECTIVOS SÓLIDOS

Tabla 13

Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Aislamiento en medios selectivos sólidos en la detección de Salmonella spp. en

Alimentos

NORMAS

OFICIALES

PARÁMETROS

AOAC 995.20

2002

FDA – BAM

(CAPÍTULO 5)

MAYO 2014

ISO 6579:2003

2012

NTE INEN

2013

NORMA

CHILENA

2009

NORMA

MEXICANA

NOM-114-

SSA1-1994

NORMA

ARGENTINA

2011

AGAR A XLD XLD XLD Salmonella-

Shigella (SS) XLD/N XLD XLD

TEMPERATURA

DE

INCUBACIÓN A

35°C ± 1°C 35°C ± 1°C 37°C ± 1°C 37°C ± 1°C 35°C ± 0,5°C 35°C ± 1°C 37°C ± 1°C

TIEMPO DE

INCUBACIÓN A 24h ± 2h 48h ± 2h 48 ± 3h 48h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 3h

AGAR B Hektoen

entérico

Hektoen

entérico

Hektoen

entérico

Sulfito de

Bismuto (BS)

Hektoen

entérico

Hektoen

entérico

Elegido por el

laboratorio

TEMPERATURA

DE 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C 37°C ± 1°C 37°C ± 1°C 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C

Según

Fabricante

66

INCUBACIÓN B

TIEMPO DE

INCUBACIÓN B 24h ± 2h 48h ± 2h 48h ± 2h 48h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 2h

Según

Fabricante

AGAR C Sulfito de

Bismuto

Sulfito de

Bismuto

Elegido por el

laboratorio

(BGA, Wilson-

Blair,

Rambach)

Verde-Brillante

Rojo-Fenol

(BG)

Sulfito de

Bismuto

Sulfito de

Bismuto -

TEMPERATURA

DE

INCUBACIÓN C

35°C ± 1°C 35°C ± 1°C Según

Fabricante 37°C ± 1°C 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C -

TIEMPO DE

INCUBACIÓN C 48h ± 2h 48h ± 2h

Según

Fabricante 48h ± 2h 48h ± 2h 48h ± 2h -

AGAR D - - - - - Verde Brillante

(VB) -

TEMPERATURA

DE

INCUBACIÓN D

- - - - - 35°C ± 1°C -

TIEMPO DE

INCUBACIÓN D - - - - - 24h ± 2h -

67

ETAPA DE SIEMBRA EN AGARES DIFERENCIALES

Tabla 14

Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Siembra en Agares Diferenciales en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

NORMAS

OFICIALES

PARÁMETROS

AOAC 995.20

2002

FDA – BAM

(CAPÍTULO 5)

MAYO 2014

ISO 6579:2003

2012 NTE INEN 2013

NORMA

CHILENA

2009

NORMA

MEXICANA NOM-

114-SSA1-1994

NORMA

ARGENTINA

2011

AGAR A TSI (Agar Hierro

Triple azúcar)

TSI (Agar Hierro

Triple azúcar)

TSI (Agar Hierro

Triple azúcar) TSI (Glucosa) TSI TSI TSI

TEMPERATURA DE

INCUBACIÓN A 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C 37°C ± 1°C 36°C ± 1°C 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C 37°C ± 1°C

TIEMPO DE

INCUBACIÓN A 24h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 2h 48h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 3h

AGAR B LIA (Agar Lisina

Hierro)

LIA (Agar Lisina

Hierro) -

LIA (Agar Lisina

Hierro) LIA LIA -

TEMPERATURA DE

INCUBACIÓN B 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C - 36°C ± 1°C 35°C ± 1°C 35°C ± 1°C -

TIEMPO DE

INCUBACIÓN B 24h ± 2h 24h ± 2h - 48h ± 2h 24h ± 2h 24h ± 2h -

68

ETAPA DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

Tabla 15

Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Identificación bioquímica en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

NORMAS

OFICIALES

MEDIOS

AOAC

995.20

2002

FDA – BAM

(CAPÍTULO 5)

MAYO 2014

ISO 6579:2003

2012

NTE INEN

2013

NORMA

CHILENA

2009

NORMA

MEXICANA NOM-

114-SSA1-1994

NORMA

ARGENTINA

2011

A, B o C

- MacConkey - MacConkey MacConkey - -

- Hektoen entérico -

Cristal-violeta

rojo-neutro bilis

lactosa

Hektoen

entérico - -

- XLD - BG XLD - -

TEMPERATUR

A Y TIEMPO DE

INCUBACIÓN

- 35°C ± 1°C - 36°C ± 1°C 35°C ± 1°C - -

- 24h ± 2h - 24h ± 2h 24h ± 2h - -

D - Caldo Urea

Christensen con

úrea (Producción

de urea)

Caldo Urea Caldo Urea Caldo Urea Agar Urea

69

E - Caldo Urea Rápido - - - Caldo Urea

Rápido -

F - Caldo lisina

descarboxilasa

Caldo lisina

descarboxilasa

Caldo lisina

descarboxilasa

Caldo lisina

descarboxilasa

Caldo lisina

descarboxilasa

Caldo lisina

descarboxilas

a

G -

Caldo Rojo fenol

dulcitol o Caldo

morado base

- -

Caldo Rojo

fenol

dulcitol

Caldo Manitol -

H - Caldo triptona o

triptófano

Caldo triptona o

triptófano -

Caldo

triptona o

triptófano

- -

I -

Caldo KCN

(Cianuro de

potasio)

-

Caldo KCN

(Cianuro de

potasio)

Caldo KCN

(Cianuro de

potasio)

Caldo KCN

(Cianuro de

potasio)

-

J - Caldo Malonato - Caldo

Malonato

Caldo

Malonato -

K -

Test Indol

(Reactivo de

Kovacs)

Test Indol

(Reactivo de

Kovacs)

Test Indol

(Reactivo

de Kovacs)

Test Indol

(Reactivo

de Kovacs)

SIM - Test

Indol (Reactivo

de Kovacs)

Test Indol

(Reactivo

de

Kovacs)

70

COLONIAS DE SALMONELLA ATÍPICAS

L -

Caldo Lactosa

Rojo Fenol o Caldo

Lactosa Púrpura

Medio ONPG

(Detección de β-

galactosidasa)

Medio ONPG

(Detección de

β-

galactosidasa)

Caldo Lactosa

Rojo Fenol o

Caldo Lactosa

Púrpura Bromo

Cresol

Caldo Lactosa

Rojo Fenol o

Caldo Lactosa

Púrpura Bromo

Cresol

Medio ONPG

(Detección de

β-

galactosidasa

)

M -

Caldo Sacarosa

Rojo Fenol o Caldo

Sacarosa Púrpura

- Fenilanina-

desaminasa

Caldo

Sacarosa Rojo

Fenol o Caldo

Púrpura Bromo

Cresol

Sacarosa

Caldo Sacarosa

Rojo Fenol o

Caldo Púrpura

Bromo Cresol

Sacarosa

-

N -

Caldo MR-VP

(Rojo de Metilo –

Vogues Proskauer)

Medio Clark

(Reacción Voges-

Proskauer)

Caldo MR-VP

(Rojo de Metilo

– Vogues

Proskauer)

Caldo MR-VP

(Rojo de Metilo

– Vogues

Proskauer)

Caldo MR-VP

(Rojo de Metilo –

Vogues

Proskauer)

Medio Clark

(Reacción

Voges-

Proskauer)

O - Agar Citrato de

Simons -

Agar Citrato de

Simons

Agar Citrato de

Simons

Agar Citrato de

Simons -

71

ETAPA DE SEROTIPIFICACIÓN

Tabla 16

Comparación entre Normas Oficiales: Etapa de Serotipificación en la detección de Salmonella spp. en Alimentos

NORMAS

MEDIOS

ISO 6579:2003

2012

FDA – BAM

(CAPÍTULO 5)

MAYO 2014

NTE INEN 2013

NORMA

CHILENA

2009

NORMA

MEXICANA

NOM-114-

SSA1-1994

NORMA

ARGENTINA

2011

A

Suero anti O

(Antígeno

Somático

polivalente)

Suero anti O

(Antígeno

Somático

polivalente)

Suero anti O

(Antígeno

Somático

polivalente)

Suero anti O

(Antígeno

Somático

polivalente)

Suero anti O

(Antígeno

Somático

polivalente)

Suero anti O

(Antígeno

Somático

polivalente)

B - - Suero anti Vi - Suero anti Vi Suero anti Vi

C

Suero anti H

(Antígeno

flagelar

polivalente)

Suero anti H

(Antígeno

flagelar

polivalente)

Suero anti H

(Antígeno

flagelar

polivalente)

Suero anti H

(Antígeno

flagelar

polivalente)

Suero anti H

(Antígeno

flagelar

polivalente)

Suero anti H

(Antígeno

flagelar

polivalente)

72

ENCUESTAS APLICADAS A LAS EMPACADORAS DE CAMARÓN

Tabla 17

Resumen preguntas realizadas a Empacadoras de Camarón

INTERROGATIVA

RESPUESTAS

¿Dentro de las

Especificaciones de

Calidad de su empresa,

se incluye el análisis de

Salmonella spp. en

camarón crudo entero

congelado?

¿Realiza su

empresa el

análisis de

Salmonella spp.

dentro de sus

instalaciones?

Si su respuesta

fue NO ¿Deriva

su empresa el

análisis a un

Laboratorio

Externo?

Si su empresa deriva el

análisis de Salmonella spp.

en camarón crudo entero

congelado, a un Laboratorio

Externo; ¿Conoce Ud. el

método que emplean?

Mencione el método.

SÍ 100% 75% 100% 20%

NO - 25% - 80%

OTRAS - - - FDA – BAM Ch 6/2007

Salmonella

73

¿Dentro de las Especificaciones de Calidad de su empresa, se incluye el


Gráfico 1: Análisis de Salmonella spp. en Empacadoras

El 100% de las Empacadoras incluye dentro de las Especificaciones de Calidad

de su empresa el análisis de Salmonella spp. en Camarón Crudo Entero

Congelado.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

SI NO

74

En caso de utilizarlas, seleccione la Normativa implementada que se


mencione la misma.

Gráfico 2: Normas empleadas por Empacadoras para el Análisis de Salmonella

spp.

El 56% de las Empacadoras utiliza el método propuesto por la FDA–BAM

(Capítulo 5/Salmonella), un 11% utiliza la Norma Técnica Ecuatoriana INEN

1529-15:2013 así como la AOAC 2011.03, AOAC 2014.01 y AOAC RI 960803,

para el análisis de Salmonella spp. en Alimentos.

56%

11%

11%

11%

11%

FDA - BAM (Capítulo5/Salmonella)

INEN 1529-15:2013

AOAC 2011.03

AOAC 2014.01

AOAC RI 960801

75

¿Realiza su empresa el análisis de Salmonella spp. dentro de sus

instalaciones?

Gráfico 3: Análisis de Salmonella spp. dentro de instalaciones en Empacadoras

El 75% de las Empacadoras realiza el análisis de Salmonella spp. en Camarón

Crudo Entero Congelado dentro de sus instalaciones, mientras que el 25%

restante no realiza el análisis dentro de sus instalaciones.

75%

25%

SI

NO

76

Si su respuesta fue NO ¿Deriva su empresa el análisis a un Laboratorio

Externo?

Gráfico 4: Análisis de Salmonella spp. en Laboratorios Externos por

Empacadoras

El 100% de las Empacadoras que no realizan el análisis de Salmonella spp. en

Camarón Crudo Entero Congelado dentro de sus instalaciones derivan el

análisis a un Laboratorio Externo.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

SI NO

77

Si su empresa realiza la detección de Salmonella spp. dentro de sus





Gráfico 5: Métodos que han Empleado para el Análisis de Salmonella

spp. en Empacadoras

El 37% de las Empacadoras que realizan la detección de Salmonella spp.

dentro de sus instalaciones, emplean Métodos Convencionales, 25% Métodos

Inmunológicos, 25% Películas de medios de cultivos deshidratados selectivos y

un 13% utilizan Inmunofluorescencia para la detección de Salmonella spp. en

Camarón Crudo Entero Congelado.

37%

25%

13%

25%

0%

0% 0%

0%

Métodos Convencionales

Métodos Inmunológicos

Inmunoflorescencia

Películas de medios de cultivos deshidratadosselectivos

Métodos Inmunocromatográficos

Hibridación

PCR

Otro Método

78

¿Qué método utilizan en la actualidad? Escoja de las opciones brindadas

a continuación, de no encontrarse el método utilizado, mencione el

mismo.


Empacadoras

El 43% de las Empacadoras que realizan la detección de Salmonella spp.

dentro de sus instalaciones emplean Métodos Convencionales, 29% aplican

Inmunofluorescencia, 14% Métodos Inmunológicos y 14% emplean Películas

de medios de cultivos deshidratados selectivos en la actualidad para la

detección de Salmonella spp. en Camarón Crudo Entero Congelado.

43%

14%

29%

14%

0%

0% 0%

0%

Método Convencional

Métodos Inmunológico

Inmunoflorescencia

Películas de medios de cultivosdeshidratados selectivos


Hibridación

PCR

Otro Método

79

Si su empresa deriva el análisis de Salmonella spp. en camarón crudo

entero congelado, a un Laboratorio Externo; ¿Conoce Ud. el método que

emplean? Mencione el método.

Gráfico 7: Conocimiento por parte de las Empacadoras del método empleado

en los Laboratorios Externos para el análisis de Salmonella spp.

El 80% de las Empacadoras que no realizan el análisis de Salmonella spp. en

Camarón Crudo Entero Congelado dentro de sus instalaciones desconocen el

método empleado en el Laboratorio Externo donde derivan el análisis y el 20%

conocen dicho método.

Gráfico 8: Método Empleado en los Laboratorios Externos donde se derivan los

análisis de Salmonella spp. de las Empacadoras

El método utilizado por los Laboratorios Externos donde derivan el análisis de

Salmonella spp. en Camarón Crudo Entero Congelado las Empacadoras que

no realizan dicho análisis dentro de sus instalaciones; es el expuesto en la FDA

– BAM Ch 6/2007 Salmonella.

20%

80%

SI

NO

100%

FDA - BAM Ch 6/2007Salmonella

80

ENCUESTAS APLICADAS A LOS LABORATORIOS DE CONTROL

Tabla 18

Resumen preguntas realizadas a Laboratorios de Control

INTERROGATIVA

RESPUESTAS

¿Dentro de las

Especificaciones de

Calidad de su empresa,

se incluye el análisis de

Salmonella spp. en

camarón crudo entero

congelado?

¿Realiza su empresa

el análisis de

Salmonella spp.

dentro de sus

instalaciones?

Si su respuesta fue

NO ¿Deriva su

empresa el análisis a

un Laboratorio

Externo?

SÍ 100% 100% -

NO - - 100%

OTRAS - - -

81

¿Dentro de las Especificaciones de Calidad de su empresa, se incluye el


Gráfico 9: Análisis de Salmonella spp. en Laboratorios de Control

El 100% de los Laboratorios de Control incluye dentro de las Especificaciones

de Calidad de su empresa el análisis de Salmonella spp. en Camarón Crudo

Entero Congelado.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

SI NO

82

En caso de utilizarlas, seleccione la Normativa implementada que se


mencione la misma.

Gráfico 10: Normas empleadas por Laboratorios de Control para el Análisis de

Salmonella spp.

El 62% de los Laboratorios de Control utilizan el método propuesto por la FDA-

BAM, el 12% la AOAC 960801, 13% la AOAC 967.26 y el último 13% la AOAC

031208 para el análisis de Salmonella spp. en Alimentos.

62%

0%

12%

13%

13%

FDA - BAM (Capítulo5/Salmonella)

INEN 1529-15:2013

OTRA NORMA - AOAC 960801

OTRA NORMA - AOAC 967.26

OTRA NORMA - AOAC 031208

83

¿Realiza su empresa el análisis de Salmonella spp. dentro de sus

instalaciones?


Empacadoras

El 100% de los Laboratorios de Control realiza el análisis de Salmonella spp.

en Camarón Crudo Entero Congelado dentro de sus instalaciones, es decir, no

derivan los análisis a ningún otro Laboratorio.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

SI NO

84

Si su empresa realiza la detección de Salmonella spp. dentro de sus






Laboratorios de Control

El 55% de los Laboratorios de Control que realizan la detección de Salmonella

spp. dentro de sus instalaciones, emplean Métodos Convencionales, el 27%

utilizan Métodos Inmunológicos, un 9% aplican Métodos de Detección

Molecular y otro 9% usan Métodos Bioquímicos para la detección de

Salmonella spp. en Camarón Crudo Entero Congelado.

55%27%

0%

0%

0%

0%

0%

9%9%



Inmunoflorescencia



Hibridación

PCR

Otro Método - Detección Molecular

Otro Método - Bioquímica

85

¿Qué método utilizan en la actualidad? Escoja de las opciones brindadas

a continuación, de no encontrarse el método utilizado, mencione el

mismo.


Laboratorios de Control

El 46% de los Laboratorios de Control que realizan la detección de Salmonella

spp. dentro de sus instalaciones, emplean en la actualidad Métodos

Convencionales, un 36% utilizan Métodos Inmunológicos, un 9% Métodos de

Detección Molecular y otro 9% aplican Métodos Bioquímicos, para la detección

de Salmonella spp. en Camarón Crudo Entero Congelado.

46%

36%

0%

0%

0%0%

0%

9%9%



Inmunoflorescencia



Hibridación

PCR

Otro Método - Detección Molecular

Otro Método - Bioquímica

86

Análisis De Resultados

De acuerdo a los datos obtenidos de las Encuestas realizadas tanto a las

Empacadoras Suscritas a la Cámara Nacional de Acuacultura, así como a los

Laboratorios de Control Acreditados por el OAE, se puede establecer que

todos estos organismos incluyen dentro de sus Especificaciones de Calidad, el

análisis de Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado. Esto indica el

uso de Normas de Calidad dentro de sus instalaciones.

A su vez se puede determinar que el método mayormente empleado es el

establecido por la FDA – BAM (Capítulo 5/Salmonella) dejando de lado la NTE

INEN 1529-15:2013. Se deduce que una de las causas de la utilización de

Normas Internaciones podría ser las exigencias de las compañías importadoras

a recibir el producto de acuerdo a estas normas. Otro motivo podría ser la no

conformidad de la NTE INEN-15:2013 por considerarla incompleta de acuerdo

a sus requerimientos.

El método más utilizados para la Detección de Salmonella spp. en camarón

crudo entero congelado tanto en Empacadoras como Laboratorios de Control,

es el método convencional detallada por la AOAC 998.09 2002 y la FDA – BAM

(Capítulo 5/Salmonella), acompañado de métodos complementarios como los

Inmunológicos, Bioquímicos y Moleculares. Esto se debe a la rapidez que

ofrecen estas nuevas metodologías, así como su confiabilidad en los

resultados.

87

CAPITULO IV: LA PROPUESTA

Tema:

Evaluación de la Norma INEN 1529-15:2013 para la detección de Salmonella

spp. en alimentos.

Objetivo:

Evaluar la Norma INEN 1529-15:2013 para la detección de Salmonella spp. en

alimentos, de acuerdo al método establecido por la FDA (BAM, capítulo 5).

Desarrollo:

1. Realizar pesquisa de las Normas Oficiales de Ecuador, Estados

Unidos, Regionales (Argentina, Chile México) y Estándar, para la

Detección de Salmonella spp. en alimentos.

2. Comparar la Norma Técnica Ecuatoriana de Normalización INEN

1529-15:2013, frente a las normas oficiales de la FDA (BAM,

Capítulo 5), Método Estándar (ISO 6579:2003) y a Normativas a

Nivel Regional (Argentina, Chile, México) para la detección de

Salmonella spp. en alimentos.

3. Presentar al INEN una propuesta de mejora de la NTE INEN 1529-

15:2013 por el método establecido en la FDA (BAM, Capítulo 5).

4. Sugerir la inclusión de métodos rápidos complementarios basados en

Biología Molecular, a la NTE INEN 1529-15:2013.

88

CONCLUSIONES

De acuerdo a la revisión de los métodos utilizados en la detección de

Salmonella spp. en Camarón crudo entero congelado, se determinó la

existencia de metodologías sensibles, confiables y rápidas, importantes en la

demanda laboral en el sector pesquero.

Los métodos más empleados en nuestro medio son los Inmunológicos, como el

ELISA y los Moleculares, Detección Molecular. Estos van de la mano con el

método convencional establecido en la AOAC 998.09 2002 equivalente al

descrito en la FDA – BAM (Capítulo 5/Salmonella).

El resultado de las encuestas indicó que la NTE INEN 1529-15:2013 no es

utilizada por las Empacadoras y Laboratorios de Control en la Provincia del

Guayas.

De acuerdo a la comparación de la NTE INEN 1529-15:2013 frente a la, AOAC

998.09 2002, FDA – BAM (Capítulo 5/Salmonella, Método Estándar (ISO

6579:2003) y a Normativas a Nivel Regional (Argentina, Chile, México) para la

detección de Salmonella spp. en alimentos, se determinó algunas

incoherencias en la utilización de medios de cultivos ya obsoletos en la etapa

de pre-enriquecimiento, así mismo se observó la falta de detalles como

temperaturas de incubación y tiempos de incubación adecuadas para alimentos

altamente contaminados o aquellos de baja carga microbiana; y de igual

manera el uso de medios obsoletos en la etapa de enriquecimiento selectivo.

89

RECOMENDACIONES

De acuerdo a las falencias encontradas en la NTE INEN 1529-15:2013, se

recomienda la revisión de esta Norma con la finalidad de mejorarla y que

pueda ser utilizada por nuestras empresas en la Detección de Salmonella spp.

en Camarón crudo entero congelado. A su vez, se recomienda la utilización de

métodos alternativos al método Convencional para la determinación de

Salmonella spp. en alimentos, particularmente camarón crudo entero

congelado, que permitan una obtención de resultados más rápidos y sin afectar

la eficiencia de los resultados, llegando a ser eficientes y eficaces.

90

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Masdeu, L., Martín Estebán, M. A., Ordóñez Ordóñez, G., … Zekaria, D.

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Escuela de Avicultura: S.A., Laboratorios Calier.

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ecuatorianas de camarón se duplicaron entre enero y febrero [Negocios

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http://www.americaeconomia.com/negocios-industrias/exportaciones-

ecuatorianas-de-camaron-se-duplicaron-entre-enero-y-febrero

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Microbiología.

Almengor, L. (2009). NANOTECNOLOGÍA EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA.

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Bell, C., & Kyriakides, A. (2002). Salmonella: A Practical Approach to the

Organism and its Control in Foods (Primera.). London: John Wiley &

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91

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95

ANEXOS


FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICA Y FARMACIA

PROYECTO DE TITULACIÓN

ENCUESTA: EVOLUCIÓN DE LA METODOLOGÍA USADA EN LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA SPP. EN CAMARÓN (LITOPENAEUS VANNAMEI) CRUDO ENTERO CONGELADO

Conteste los siguientes enunciados según el procedimiento llevado a cabo en su empresa. Cabe recalcar que

los fines de esta encuesta son netamente académicos y se conservará la total discreción de los datos

personales del encuestado.

1. ¿Dentro de las Especificaciones de Calidad de su empresa, se incluye el análisis de Salmonella spp.

en camarón crudo entero congelado?

SI NO

2. En caso de utilizarlas, seleccione la Normativa implementada que se menciona a continuación, de

no encontrarse la norma empleada, mencione la misma.

FDA - BAM (Capítulo 5/Salmonella)

INEN 1529-15:2013

Otra Norma:

3. ¿Realiza su empresa el análisis de Salmonella spp. dentro de sus instalaciones?

SI NO

Si su respuesta fue SI, diríjase a la pregunta número 5.

4. Si su respuesta fue NO ¿Deriva su empresa el análisis a un Laboratorio Externo?

SI NO

Si la respuesta anterior fue SI, diríjase a la pregunta número 7.

5. Si su empresa realiza la detección de Salmonella spp. dentro de sus instalaciones, ¿Qué métodos ha

empleado para la detección de Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado? Escoja de las

opciones brindadas a continuación, de no encontrarse el método utilizado, mencione el mismo.

Métodos convencionales


Películas de medios de cultivos deshidratados

selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:

6. ¿Qué método utilizan en la actualidad? Escoja de las opciones brindadas a continuación, de no

encontrarse el método utilizado, mencione el mismo.




selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:

7. Si su empresa deriva el análisis de Salmonella spp. en camarón crudo entero congelado, a un

Laboratorio Externo; ¿Conoce Ud. el método que emplean? Mencione el método.

SI NO

Método:





Conteste los siguientes enunciados según el procedimiento llevado a cabo en su empresa. Cabe recalcar

que los fines de esta encuesta son netamente académicos y se conservará la total discreción de los datos




SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método: Bioquímica






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método: bioquímica



SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma: AOAC 2011.03


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR







selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR




SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma: REVEAL SALMONELLA

PETRIFILM SALMONELLA


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR







selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR




SI NO

Método: CONVENCIONAL










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:










SI x NO



FDA - BAM (Capítulo 5/Salmonella) x

INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO x



SI x NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI x NO

Método: LAB- GYE-ME- 111 FDA/BAM/ on line Ch 6/2007 salmonella










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma: AOAC RI 960801


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:










SI x NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:

AOAC 967.26

AOAC 031208


SI X NO



SI NO





Métodos convencionales X



selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método: Deteccion molecular



Métodos convencionales x



selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método: Deteccion molecular



SI NO x

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR







selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR




SI NO

Método:










SI NO




INEN 1529-15:2013

Otra Norma:


SI NO



SI NO








selectivos

Inmunofluorescencia





Hibridación

PCR

Otro Método:






selectivos

Inmunofluorescencia


Hibridación

PCR

Otro Método:



SI NO

Método:

BAM: Salmonella

December 2007 Edition*

Bacteriological Analytical Manual Chapter 5 Salmonella

Authors

Chapter Contents

Introduction Equipment and Materials Media and Reagents Preparation of foods for isolation of Salmonella Isolation of Salmonella Identification of Salmonella Rapid methods [Appendix 1, see below] References

Introduction

Several changes are being introduced in this edition of BAM (8th Edition). The first change involves the expanded use of Rappaport-Vassiliadis (RV) medium for foods with both high and low levels of competitive microflora. In the previous edition, RV medium was recommended only for the analysis of shrimp. Based on the completion of AOAC precollaborative (5, 6) and collaborative (7, 8) studies, RV medium is now being recommended for the analysis of high microbial and low microbial load foods. RV medium replaces selenite cystine (SC) broth for the analysis of all foods, except guar gum. In addition, RV medium replaces lauryl tryptose broth for use with dry active yeast. Tetrathionate (TT) broth continues to be used as the second selective enrichment broth. However, TT broth is to be incubated at 43°C for the analysis of high microbial load foods and at 35°C for the analysis of low microbial load foods, including guar gum.

The second change involves the option of refrigerating incubated preenrichments and selective enrichments of low-moisture foods for up to 72 h. With this option, sample analyses can be initiated as late as Wednesday or Thursday without weekend work being involved.

The third change involves reducing the period of incubation of the lysine iron agar (LIA) slants. In the former edition (BAM-7), triple sugar iron agar (TSI) and LIA slants were incubated at 35°C for 24 ± 2 h and 48 ± 2 h, respectively. Unpublished data have demonstrated that the 48 h reading of LIA slants is without diagnostic value. Of 193 LIA slants examined, all gave definitive results within 24 ± 2 h of incubation. No significant changes altered the final test result when the slants were incubated an additional 24 h. Thus, both the TSI and LIA slants are now incubated for 24 ± 2 h.

The fourth change involves the procedure for surface disinfection of shell eggs. In the previous edition (BAM-7), egg shells were surface-disinfected by soaking in 0.1% mercuric chloride solution for 1 h followed by soaking in 70% ethanol for 30 min. Mercuric chloride is classified as a hazardous waste, and is expensive to dispose of according to Environmental Protection Agency guidelines. In this edition (BAM-8) egg shells are now surface-disinfected by soaking for at least 10 sec in a 3:1 solution consisting of 3 parts of 70% alcohol (ethyl or isopropyl) to 1 part of iodine/potassium iodide solution.

Version: December 2007 Content current as of June 18, 2009 Page 1 of 21

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm063568.htm




The fifth change involves the sample preparation of eggs. Egg contents (yolk and albumen) are thoroughly mixed before analysis. After mixing the egg contents, 25 g (ml) are added to 225 ml trypticase (tryptic) soy broth supplemented with ferrous sulfate.

A method for the analysis of guar gum has been included. When guar gum is preenriched at a 1:9 sample/broth ratio, a highly viscous, nonpipettable mixture results. Addition of the enzyme cellulase to the preenrichment medium, however, results in a readily pipettable mixture.

A method for orange juice (pasteurized and unpasteurized) has been included due to recent orange juice-related outbreaks.

The directions for picking colonies from the selective plating agars have been made more explicit to reflect the intent of the method. In the absence of typical or suspect colonies on the selective plating agars, it is recommended that atypical colonies be picked to TSI and LIA slants. This recommendation is based on the fact that up to 4% of all Salmonella cultures isolated by FDA analysts from certain foods, especially seafoods, during the past several years have been atypical.

Finally, since the publication of BAM-7, a 6-way comparison was conducted of the relative effectiveness of the three selective plating agars recommended in the BAM (bismuth sulfite, Hektoen enteric, and xylose lysine desoxycholate agars) and three relatively new agars (EF-18, xylose lysine Tergitol 4, and Rambach agars). Our results (9) indicated no advantage in replacing any of the BAM-recommended agars with one or more of the newer agars. Thus, the combination of selective plating agars recommended in BAM-7 remains unchanged.

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A. Equipment and materials 1. Blender and sterile blender jars (see Chapter 1) 2. Sterile, 16 oz (500 ml) wide-mouth, screw-cap jars, sterile 500 ml Erlenmeyer flasks,

sterile 250 ml beakers, sterile glass or paper funnels of appropriate size, and, optionally, containers of appropriate capacity to accommodate composited samples

3. Sterile, bent glass or plastic spreader rods 4. Balance, with weights; 2000 g capacity, sensitivity of 0.1 g 5. Balance, with weights; 120 g capacity, sensitivity of 5 mg 6. Incubator, 35 ± 2 °C 7. Refrigerated incubator or laboratory refrigerator, 4 ± 2°C 8. Water bath, 49 ± 1°C 9. Water bath, circulating, thermostatically-controlled, 43 ± 0.2°C 10. Water bath, circulating, thermostatically-controlled,42 ± 0.2°C 11. Sterile spoons or other appropriate instruments for transferring food samples 12. Sterile culture dishes, 15 x 100 mm, glass or plastic 13. Sterile pipets, 1 ml, with 0.01 ml graduations; 5 and 10 ml, with 0.1 ml graduations 14. Inoculating needle and inoculating loop (about 3 mm id or 10 5l), nichrome, platinum-

iridium, chromel wire, or sterile plastic 15. Sterile test or culture tubes, 16 x 150 mm and 20 x 150 mm; serological tubes, 10 x 75

mm or 13 x 100 mm 16. Test or culture tube racks 17. Vortex mixer 18. Sterile shears, large scissors, scalpel, and forceps 19. Lamp (for observing serological reactions) 20. Fisher or Bunsen burner 21. pH test paper (pH range 6-8) with maximum graduations of 0.4 pH units per color change 22. pH meter 23. Plastic bags, 28 x 37 cm, sterile, with resealable tape. (Items 23-24 are needed in the

analysis of frog legs and rabbit carcasses.)





24. Plastic beakers, 4 liter, autoclavable, for holding plastic bag during shaking and incubation.

25. Sponges, non-bactericidal (Nasco cat # B01299WA), or equivalent. 26. Swabs, non-bactericidal, cotton-tipped.


B. Media and reagents

For preparation of media and reagents, refer to Methods 967.25-967.28 in Official Methods of Analysis (1).

1. Lactose broth (M74) 2. Nonfat dry milk (reconstituted) (M111) 3. Selenite cystine (SC) broth (M134) 4. Tetrathionate (TT) broth (M145) 5. Rappaport-Vassiliadis (RV) medium (M132). NOTE: RV medium must be made from its

individual ingredients. Commercial formulations are not acceptable. 6. Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar (M179) 7. Hektoen enteric (HE) agar (M61) 8. Bismuth sulfite (BS) agar (M19) 9. Triple sugar iron agar (TSI) (M149) 10. Tryptone (tryptophane) broth (M164) 11. Trypticase (tryptic) soy broth (M154) 12. Trypticase soy broth with ferrous sulfate (M186) 13. Trypticase soy-tryptose broth (M160) 14. MR-VP broth (M104) 15. Simmons citrate agar (M138) 16. Urea broth (M171) 17. Urea broth (rapid) (M172) 18. Malonate broth (M92) 19. Lysine iron agar (LIA) (Edwards and Fife) (M89) 20. Lysine decarboxylase broth (M87) 21. Motility test medium (semisolid) (M103) 22. Potassium cyanide (KCN) broth (M126) 23. Phenol red carbohydrate broth (M121) 24. Purple carbohydrate broth (M130) 25. MacConkey agar (M91) 26. Nutrient broth (M114) 27. Brain heart infusion (BHI) broth (M24) 28. Papain solution, 5% (M56a) 29. Cellulase solution, 1% (M187) 30. Tryptose blood agar base (M166) 31. Universal preenrichment broth (M188) 32. Universal preenrichment broth (without ferric ammonium citrate) (M188a) 33. Buffered peptone water (M192) 34. Dey-Engley broth (M193) 35. Potassium sulfite powder, anhydrous 36. Chlorine solution, 200 ppm, containing 0.1% sodium dodecyl sulfate (R12a) 37. Ethanol, 70% (R23) 38. Kovacs' reagent (R38) 39. Voges-Proskauer (VP) test reagents (R89) 40. Creatine phosphate crystals 41. Potassium hydroxide solution, 40% (R65) 42. 1 N Sodium hydroxide solution (R73) 43. 1 N Hydrochloric acid (R36) 44. Brilliant green dye solution, 1% (R8)














































45. Bromcresol purple dye solution, 0.2% (R9) 46. Methyl red indicator (R44) 47. Sterile distilled water 48. Tergitol Anionic 7 (R78) 49. Triton X-100 (R86) 50. Physiological saline solution, 0.85% (sterile) (R63) 51. Formalinized physiological saline solution (R27) 52. Salmonella polyvalent somatic (O) antiserum 53. Salmonella polyvalent flagellar (H) antiserum 54. Salmonella somatic group (O) antisera: A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G, H, I,

Vi, and other groups, as appropriate 55. Salmonella Spicer-Edwards flagellar (H) antisera


C. Preparation of foods for isolation of Salmonella

The following methods are based on the analysis of a 25 g analytical unit at a 1:9 sample/broth ratio. Depending on the extent of compositing, add enough broth to maintain this 1:9 ratio unless otherwise indicated. For samples not analyzed on an exact weight basis, e.g., frog legs, refer to the specific method for instructions.

1. Dried egg yolk, dried egg whites, dried whole eggs, liquid milk (skim milk, 2% fat milk, whole, and buttermilk), and prepared powdered mixes (cake, cookie, doughnut, biscuit, and bread), infant formula, and oral or tube feedings containing egg.

Preferably, do not thaw frozen samples before analysis. If frozen sample must be tempered to obtain analytical portion, thaw suitable portion as rapidly as possible to minimize increase in number of competing organisms or to reduce potential of injuring Salmonella organisms. Thaw below 45°C for 15 min with continuous agitation in thermostatically controlled water bath or thaw within 18 h at 2-5°C. Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. For nonpowdered samples, add 225 ml sterile lactose broth. If product is powdered, add about 15 ml sterile lactose broth and stir with sterile glass rod, spoon, or tongue depressor to smooth suspension. Add 3 additional portions of lactose broth, 10, 10, and 190 ml, for total of 225 ml. Stir thoroughly until sample is suspended without lumps. Cap jar securely and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2 with sterile 1 N NaOH or 1 N HCl. Cap jar securely and mix well before determining final pH. Loosen jar cap about 1/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

2. Eggs a. Shell eggs. Remove any adherent material from the shell surface. Disinfect eggs

with 3:1 solution consisting of 3 parts of 70% alcohol (ethyl or isopropyl) to 1 part iodine/potassium iodide solution. Prepare 70% alcohol solution either by diluting 700 ml 100% alcohol with sterile distilled water for a final volume of 1,000 ml or by diluting 700 ml 95% alcohol with sterile distilled water for a final volume of 950 ml. Prepare iodine/potassium iodide solution by dissolving 100 g potassium iodide in 200-300 ml sterile distilled water. Add 50 g iodine and heat gently with constant mixing until the iodine is dissolved. Dilute the iodine/potassium iodide solution to 1,000 ml with sterile distilled water. Store iodine/potassium iodide solution in amber glass-stoppered bottle in the dark. Prepare the disinfection solution by adding 250 ml iodine/potassium iodide solution to 750 ml 70% alcohol solution and mix well. Submerge eggs in disinfection solution for at least 10 seconds. Remove eggs and allow to air dry. Eggs with chipped, cracked, or









broken shells are not included in the sample. Each sample shall consist of twenty (20) eggs cracked aseptically into a Whirl-Pak bag, for a total of fifty (50) samples per poultry house. Eggs are cracked aseptically by gloved hands, with a change of gloves between samples. Mix samples thoroughly by gloved hands, with a change of gloves between samples. Mix samples thoroughly by hand until yolks are completely mixed with the albumen. Samples are held at room temperature (20-24°C) for 96 ± 2 h. After 96 ± 2 h, remove 25 ml portion from each sample of pooled eggs, and preenrich 25 ml test portion in 225 ml sterile trypticase soy broth (TSB) supplemented with ferrous sulfate (35 mg ferrous sulfate added to 1000 ml TSB) and mix well by swirling. Let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

b. Liquid whole eggs (homogenized). Combine fifteen (15) 25 ml test portions into a 375 ml composite contained in a 6-liter Erlenmeyer flask. Composites are held at room temperature (20-24°C) for 96 ± 2 h. After 96 ± 2 h, add 3,375 ml sterile TSB supplemented with ferrous sulfate, as described above, and mix well by swirling. Let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

c. Hard-boiled eggs (chicken, duck, and others). If the egg shells are still intact, disinfect the shells as described above and aseptically separate the shells from the eggs. Pulverize the eggs (egg yolk solids and egg white solids) aseptically and weigh 25 g into a sterile 500 ml Erlenmeyer flask or other appropriate container. Add 225 ml TSB (without ferrous sulfate) and mix well by swirling. Continue as described above.

3. Nonfat dry milk a. Instant. Aseptically weigh 25 g sample into sterile beaker (250 ml) or other

appropriate container. Using sterile glass or paper funnel (made with tape to withstand autoclaving), pour 25 g analytical unit gently and slowly over surface of 225 ml brilliant green water contained in sterile 500 ml Erlenmeyer flask or other appropriate container. Alternatively, 25 g analytical units may be composited and poured over the surface of proportionately larger volumes of brilliant green water. Prepare brilliant green water by adding 2 ml 1% brilliant green dye solution per 1000 ml sterile distilled water. Let container stand undisturbed for 60 ± 5 min. Incubate loosely capped container, without mixing or pH adjustment, for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

b. Non-Instant. Examine as described for instant nonfat dry milk, except that the 25 g analytical units may not be composited.

4. Dry whole milk. Examine as described for instant nonfat dry milk, except that the 25 g analytical units may not be composited.

5. Casein a. Lactic casein. Aseptically weigh 25 g sample into sterile beaker (250 ml) or

other appropriate container. Using sterile glass or paper funnel (made with tape to withstand autoclaving), pour 25 g analytical unit gently and slowly over the surface of 225 ml Universal Preenrichment broth contained in sterile 500 ml Erlenmeyer flask or other appropriate container. Analytical units (25 g) may be composited. Let container stand undisturbed 60 ± 5 min. Incubate loosely capped container, without mixing or pH adjustment, for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

b. Rennet casein. Aseptically weigh 25 g sample into sterile beaker (250 ml) or other appropriate container. Using sterile glass or paper funnel (made with tape to withstand autoclaving), pour 25 g analytical unit gently and slowly over the surface of 225 ml lactose broth contained in sterile 500 ml Erlenmeyer flask or other appropriate container. Analytical units (25 g) may be composited. Let container stand undisturbed 60 ± 5 min. Incubate loosely capped container, without mixing or pH adjustment, for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.





c. Sodium caseinate. Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml sterile lactose broth and mix well. Analytical units may be composited. Let stand 60 min at room temperature with jar securely capped. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Loosen jar about 1/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

6. Soy flour. Examine as described for rennet casein, except 25 g analytical units (25 g) may not be composited.

7. Egg-containing products (noodles, egg rolls, macaroni, spaghetti), cheese, dough, prepared salads (ham, egg, chicken, tuna, turkey), fresh, frozen, or dried fruits and vegetables, nut meats, crustaceans (shrimp, crab, crayfish, langostinos, lobster), and fish. Preferably, do not thaw frozen samples before analysis. If frozen sample must be tempered to obtain analytical portion, thaw below 45°C for <15 min with continuous agitation in thermostatically controlled water bath or thaw within 18 h at 2-5°C.

Aseptically weigh 25 g sample into sterile blending container. Add 225 ml sterile lactose broth and blend 2 min. Aseptically transfer homogenized mixture to sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Mix well and loosen jar cap about 1/4 turn. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

8. Dried yeast (active and inactive yeast). Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml sterile trypticase soy broth. Mix well to form smooth suspension. Let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2, mixing well before determining final pH. Loosen jar cap 1/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

9. Frosting and topping mixes. Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml nutrient broth and mix well. Cap jar securely and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Loosen jar cap about 1/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

10. Spices a. Black pepper, white pepper, celery seed or flakes, chili powder, cumin,

paprika, parsley flakes, rosemary, sesame seed, thyme, and vegetable flakes.

Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml sterile trypticase soy broth (TSB) and mix well. Cap jar securely and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Loosen jar cap about l/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

b. Onion flakes, onion powder, garlic flakes.

Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Preenrich sample in TSB with added K2SO3 (5 g K2SO3 per 1000 ml TSB, resulting in final 0.5% K2SO3 concentration). Add K2SO3 to broth before autoclaving 225 ml volumes in 500 ml Erlenmeyer flasks at 121°C for 15 min. After autoclaving, aseptically determine and, if necessary, adjust final volume to 225 ml. Add 225 ml sterile TSB with added K2SO3 to sample and mix well. Continue as in C-10a.

c. Allspice, cinnamon, cloves, and oregano.








At this time there are no known methods for neutralizing the toxicity of these 4 spices. Dilute them beyond their toxic levels to examine them. Examine allspice, cinnamon, and oregano at 1:100 sample/broth ratio, and cloves at 1:1000 sample/broth ratio. Examine leafy condiments at sample/broth ratio greater than 1:10 because of physical difficulties encountered by absorption of broth by dehydrated product. Examine these spices as described in C-10a, above, maintaining recommended sample/broth ratios.

11. Candy and candy coating (including chocolate). Aseptically weigh 25 g sample into sterile blending container. Add 225 ml sterile, reconstituted nonfat dry milk and blend 2 min. Aseptically transfer homogenized mixture to sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Add 0.45 ml 1% aqueous brilliant green dye solution and mix well. Loosen jar caps 1/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

12. Coconut. Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml sterile lactose broth, shake well, and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Add up to 2.25 ml steamed (15 min) Tergitol Anionic 7 and mix well. Alternatively, use steamed (15 min) Triton X-100. Limit use of these surfactants to minimum quantity needed to initiate foaming. For Triton X-100 this quantity may be as little as 2 or 3 drops. Loosen jar cap about l/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

13. Food dyes and food coloring substances. For dyes with pH 6.0 or above (10% aqueous suspension), use method described for dried whole eggs (C-l, above). For laked dyes or dyes with pH below 6.0, aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml tetrathionate broth without brilliant green dye. Mix well and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Using pH meter, adjust pH to 6.8 ± 0.2. Add 2.25 ml 0.1% brilliant green dye solution and mix thoroughly by swirling. Loosen jar cap about 1/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 3-11, below.

14. Gelatin. Aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml sterile lactose broth and 5 ml 5% aqueous papain solution and mix well. Cap jar securely and incubate at 35°C for 60 ± 5 min. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Loosen jar cap about 1/4 turn and incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

15. Meats, meat substitutes, meat by-products, animal substances, glandular products, and meals (fish, meat, bone). Aseptically weigh 25 g sample into sterile blending container. Add 225 ml sterile lactose broth and blend 2 min. Aseptically transfer homogenized mixture to sterile wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. If mixture is powder or is ground or comminuted, blending may be omitted. For samples that do not require blending, add lactose broth and mix thoroughly; let stand for 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped.

Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Add up to 2.25 ml steamed (15 min) Tergitol Anionic 7 and mix well. Alternatively, use steamed (15 min) Triton X-100. Limit use of these surfactants to minimum quantity needed to initiate foaming. Actual quantity will depend on composition of test material. Surfactants will not be needed in analysis of powdered glandular products. Loosen jar caps 1/4 turn and incubate sample mixtures 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

16. Frog legs. (This method is used for all domestic and imported frog legs.) Place 15 pairs of frog legs into sterile plastic bag and cover with sterile lactose broth at a 1:9 sample-to-












broth (g/ml) ratio (see A, 23-24, above). If single legs are estimated to average 25 g or more, examine only one leg of each of 15 pairs. Place bag in large plastic beaker or other suitable container. Mix well and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Place plastic bag containing the frog legs and lactose broth into plastic beaker or other suitable container. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue examination as in D, 1-11, below.

17. Rabbit carcasses. (This method is used for all domestic and imported rabbit carcasses.) Place rabbit carcass into sterile plastic bag. Place bag in beaker or other suitable container. Add sterile lactose broth at a 1:9 sample-to-broth (g/ml) ratio to cover carcass (see A, 23-24, above). Mix well by swirling and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Incubate 24 ± 2 h at 35° C . Continue examination as in D, 1-11, below.

18. Guar gum. Aseptically weigh 25 g sample into sterile beaker (250 ml) or other appropriate container. Prepare a 1.0% cellulase solution (add 1 g cellulase to 99 ml sterile distilled water). Dispense into 150 ml bottles. (Cellulase solution may be stored at 2-5°C for up to 2 weeks). Add 225 ml sterile lactose broth and 2.25 ml sterile 1% cellulase solution to sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. While vigorously stirring the cellulase/lactose broth with magnetic stirrer, pour 25 g analytical unit quickly through sterile glass funnel into the cellulase/lactose broth. Cap jar securely and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Incubate loosely capped container without pH adjustment, for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

19. Orange juice (pasteurized and unpasteurized), apple cider (pasteurized and unpasteurized), and apple juice (pasteurized) Aseptically add 25 ml sample to 225 ml Universal preenrichment broth in a sterile, wide mouth, screw-capped jar (500 ml) or other appropriate container. Swirl the flask contents thoroughly. Cap jar securely and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Do not adjust pH. Incubate loosely capped container for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below (treat as a low microbial load food).

20. Pig ears and other types of dog chew pieces. Place 1 piece (or 2-3 pieces if smaller sizes) from each sample unit into sterile plastic bag. Place bag into large beaker or other suitable container. Add sterile lactose broth at a 1:9 sample-to-broth (g/ml) ratio to cover pieces (see A, 23-24, above). Mix well by swirling and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Add either steamed (15 min) Tergitol Anionic 7 or steamed (15 min) Triton X-100 up to a 1% concentration. For example, if 225 ml lactose broth is added, the maximum volume of added surfactant is 2.25 ml. Limit use of these surfactants to minimum quantity to initiate foaming. Incubate 24 ± 2 h at 35° C. Continue examination as in D, 1-11, below.

21. Cantaloupes. Preferably, do not thaw frozen samples before analysis. If frozen sample must be tempered to obtain analytical portion, thaw below 45°C for <15 min with continuous agitation in thermostatically controlled water bath or thaw within 18 h at 2-5°C.

For comminuted or cut fruit, aseptically weigh 25 g sample into sterile blending container. Add 225 ml sterile Universal preenrichment broth (UP) and blend 2 min. Aseptically transfer homogenized mixture to sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Do not adjust pH. Mix well and loosen jar cap about 1/4 turn. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

For whole cantaloupes, do not rinse even if there is visible dirt. Examine the cantaloupes "as is".

Place the cantaloupe into a sterile plastic bag. Add enough UP broth to allow the cantaloupe to float. The volume of UP broth may be 1.5 times the weight of the cantaloupes. For example, cantaloupes weighing 1500 g will probably need a volume of approximately 2250 ml UP broth to float. Add more broth, if necessary. Place the plastic bag, with cantaloupes and UP broth, into a 5 liter beaker, or other appropriate container,









for support during incubation. Allow the open-end flap of the plastic bag to "fold over" so as to form a secure, but not air-tight, closure during incubation.

Let stand for 60 ± 5 min at room temperature. Do not adjust pH. Incubate slightly opened bag, containing cantaloupe, for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

22. Mangoes. Preferably, do not thaw frozen samples before analysis. If frozen sample must be tempered to obtain analytical portion, thaw below 45°C for <15 min with continuous agitation in thermostatically controlled water bath or thaw within 18 h at 2-5°C.

For comminuted or cut fruit, aseptically weigh 25 g sample into sterile blending container. Add 225 ml sterile buffered peptone water (BPW) and blend 2 min. Aseptically transfer homogenized mixture to sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Mix well and loosen jar cap about 1/4 turn. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

For whole mangoes, do not rinse even if there is visible dirt. Examine the mangoes "as is".

Place the mango into a sterile plastic bag. Add enough BPW to allow the mango to float. The volume of BPW may be 1.0 times the weight of the mangoes. For example, mangoes weighing 500 g will probably need a volume of approximately 500 ml BPW broth to float. Add more broth, if necessary. Place the plastic bag, with mangoes and BPW broth, into a 5 liter beaker, or other appropriate container, for support during incubation.

Let stand for 60 ± 5 min at room temperature. Adjust pH to 6.8 ± 0.2, if necessary. Incubate slightly opened bag for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

23. Tomatoes. For comminuted or cut fruit, aseptically weigh 25 g sample into sterile blending container. Add 225 ml sterile buffered peptone water and blend 2 min. Aseptically transfer homogenized mixture to sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Mix well and loosen jar cap about 1/4 turn. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.

For whole tomatoes, do not rinse even if there is visible dirt. Examine the tomatoes "as is".

Place the tomato into a sterile plastic bag or other suitable container (sterile foil covered beaker can be used). Add enough UP broth to allow the tomato to float. The volume of UP broth may be 1.0 times the weight of the tomato. For example, tomatoes weighing 300 g will probably need a volume of approximately 300 ml UP broth to float. Add more, if necessary. Place the plastic bag (if used), with tomato and UP broth, into a sterile beaker (beaker size is dependent on the size of the tomato), or other appropriate container, for support during incubation. Allow the open-end flap of the plastic bag to "fold over" so as to form a secure, but not air-tight, closure during incubation.

Let stand for 60 ± 5 min at room temperature. Do not adjust pH. Incubate slightly opened bag for 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.











24. Environmental testing. Sample environmental surfaces with sterile swabs or sponges. Place the swab/sponge in a sterile Whirl-pak bag, or equivalent, that contains enough Dey-Engley (DE) broth to cover the swab/sponge.

Transport swabs/sponges in an insulated transport container with frozen gel packs to keep the samples cold, but not frozen. If samples cannot be processed immediately, refrigerate at 4 ± 2°C. Start sample analysis within 48 ± 2 h of collection.

Add swab/sponge to 225 ml lactose broth in a sterile, wide mouth, screw-capped jar (500 ml) or other appropriate container. Swirl the flask contents thoroughly. Cap jar securely and let stand 60 ± 5 min at room temperature. Mix well by swirling and determine pH with test paper. Adjust pH, if necessary, to 6.8 ± 0.2. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue examination as in D, 1-11, below.

25. Alfalfa seeds and mung beans. Aseptically weigh 25g alfalfa seeds or mung beans into a sterile 500 mL Erlenmeyer flask. Aseptically add 225 mL lactose broth to the test portion and swirl the Erlenmeyer flask. Cover the mouth of the Erlenmeyer flask with sterile aluminum foil and allow contents to stand at room temperature for 60 ± 5 min. Adjust the pH of the culture to 6.8 ± 0.2, if necessary. Incubate for 24 ± 2h at 35 ± 2°C. Continue as in D, 1-11, below (treat as high microbial load food).

26. Mamey pulp. If frozen, sample must be tempered to obtain analytical portion. Thaw below 45°C for <15 min with continuous agitation in thermostatically controlled water bath or thaw within 18 h at 2-5°C.

For mamey pulp, suspected to be contaminated with S. Typhi, aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml sterile Universal Preenrichment broth without ferric ammonium citrate, mix by swirling, and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Do not adjust pH. Mix well and loosen jar cap about 1/4 turn. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below. Treat as a low microbial load food.

For mamey pulp, NOT suspected to be contaminated with S. Typhi, aseptically weigh 25 g sample into sterile, wide-mouth, screw-cap jar (500 ml) or other appropriate container. Add 225 ml sterile Universal Preenrichment broth, mix by swirling, and let stand 60 ± 5 min at room temperature with jar securely capped. Do not adjust pH. Mix well and loosen jar cap about 1/4 turn. Incubate 24 ± 2 h at 35°C. Continue as in D, 1-11, below.


D. Isolation of Salmonella 1. Tighten lid and gently shake incubated sample.

Guar gum and foods suspected to be contaminated with S. Typhi. Transfer 1 ml mixture to 10 ml selenite cystine (SC) broth and another 1 ml mixture to 10 ml TT broth 98. Vortex.

All other foods. Transfer 0.1 ml mixture to 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium

and another 1 ml mixture to 10 ml tetrathionate (TT) broth. Vortex.

2. Incubate selective enrichment media as follows:

Foods with a high microbial load. Incubate RV medium 24 ± 2 h at 42 ± 0.2°C (circulating, thermostatically-controlled, water bath). Incubate TT broth 24 ± 2 h at 43 ± 0.2°C (circulating, thermostatically-controlled, water bath).








Foods with a low microbial load (except guar gum and foods suspected to be contaminated with S. Typhi). Incubate RV medium 24 ± 2 h at 42 ± 0.2°C (circulating, thermostatically controlled, water bath). Incubate TT broth 24 ± 2 h at 35 ± 2.0°C.

Guar gum and foods suspected to be contaminated with S. Typhi. Incubate SC and TT broths 24 ± 2 h at 35°C.

3. Mix (vortex, if tube) and streak 3 mm loopful (10 µl) incubated TT broth on bismuth sulfite (BS) agar, xylose lysine desoxycholate (XLD) agar, and Hektoen enteric (HE) agar. Prepare BS plates the day before streaking and store in dark at room temperature until streaked.

4. Repeat with 3 mm loopful (10 µl) of RV medium (for samples of high and low microbial load foods) and of SC broth (for guar gum).

5. Refer to 994.04 in Official Methods of Analysis (1) for option of refrigerating incubated sample preenrichments and incubated sample selective enrichments (SC and TT broths only) of low moisture foods. This option allows sample analyses to be initiated as late as Thursday while still avoiding weekend work.

6. Incubate plates 24 ± 2 h at 35°C. 7. Examine plates for presence of colonies that may be Salmonella.

TYPICAL Salmonella COLONY MORPHOLOGY

Pick 2 or more colonies of Salmonella from each selective agar after 24 ± 2 h incubation. Typical Salmonella colonies are as follows:

a. Hektoen enteric (HE) agar. Blue-green to blue colonies with or without black centers. Many cultures of Salmonella may produce colonies with large, glossy black centers or may appear as almost completely black colonies.

b. Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar. Pink colonies with or without black centers. Many cultures of Salmonella may produce colonies with large, glossy black centers or may appear as almost completely black colonies.

c. Bismuth sulfite (BS) agar. Brown, gray, or black colonies; sometimes they have a metallic sheen. Surrounding medium is usually brown at first, but may turn black in time with increased incubation, producing the so-called halo effect.

If typical colonies are present on the BS agar after 24 ± 2 h incubation, then pick 2 or more colonies. Irrespective of whether or not BS agar plates are picked at 24 ± 2 h, reincubate BS agar plates an additional 24 ± 2 h. After 48 ± 2 h incubation, pick 2 or more typical colonies, if present, from the BS agar plates, only if colonies picked from the BS agar plates incubated for 24 ± 2 h give atypical reactions in triple sugar iron agar (TSI) and lysine iron agar (LIA) that result in culture being discarded as not being Salmonella . See sections D.9 and D.10, below, for details in interpreting TSI and LIA reactions.

ATYPICAL Salmonella COLONY MORPHOLOGY

In the absence of typical or suspicious Salmonella colonies, search for atypical Salmonella colonies as follows:

d. HE and XLD agars. Atypically a few Salmonella cultures produce yellow colonies with or without black centers on HE and XLD agars. In the absence of typical Salmonella colonies on HE or XLD agars after 24 ± 2 h incubation, then pick 2 or more atypical Salmonellacolonies.

e. BS agar. Atypically some strains produce green colonies with little or no darkening of the surrounding medium. If typical or suspicious colonies are not






present on BS agar after 24 ± 2 h, then do not pick any colonies but reincubate an additional 24 ± 2 h. If typical or suspicious colonies are not present after 48 ± 2 h incubation, then pick 2 or more atypical colonies.

SUGGESTED CONTROL CULTURES

In addition to the positive control cultures (typical Salmonella), 3 additional Salmonella cultures are recommended to assist in the selection of atypical Salmonella colony morphology on selective agars. These cultures are a lactose-positive, H2S-positive S. diarizonae (ATCC 12325) and a lactose-negative, H2S-negative S. abortus equi (ATCC 9842); OR a lactose-positive, H2S-negative S. diarizonae (ATCC 29934). These cultures may be obtained from the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.

8. Lightly touch the very center of the colony to be picked with sterile inoculating needle and inoculate TSI slant by streaking slant and stabbing butt. Without flaming, inoculate LIA slant by stabbing butt twice and then streaking slant. Since lysine decarboxylation reaction is strictly anaerobic, the LIA slants must have deep butt (4 cm). Store picked selective agar plates at 5-8°C.

9. Incubate TSI and LIA slants at 35°C for 24 ± 2 h. Cap tubes loosely to maintain aerobic conditions while incubating slants to prevent excessive H2S production. Salmonella in culture typically produces alkaline (red) slant and acid (yellow) butt, with or without production of H2S (blackening of agar) in TSI. In LIA, Salmonella typically produces alkaline (purple) reaction in butt of tube. Consider only distinct yellow in butt of tube as acidic (negative) reaction. Do not eliminate cultures that produce discoloration in butt of tube solely on this basis. Most Salmonella cultures produce H2S in LIA. Some non- Salmonella cultures produce a brick-red reaction in LIA slants.

10. All cultures that give an alkaline butt in LIA, regardless of TSI reaction, should be retained as potential Salmonella isolates and submitted for biochemical and serological tests. Cultures that give an acid butt in LIA and an alkaline slant and acid butt in TSI should also be considered potential Salmonella isolates and should be submitted for biochemical and serological tests. Cultures that give an acid butt in LIA and an acid slant and acid butt in TSI may be discarded as not being Salmonella . Test retained, presumed-positive TSI cultures as directed in D-11, below, to determine if they are Salmonella species, including S. arizonae. If TSI cultures fail to give typical reactions for Salmonella (alkaline slant and acid butt) pick additional suspicious colonies from selective medium plate not giving presumed-positive culture and inoculate TSI and LIA slants as described in D-8, above.

11. Apply biochemical and serological identification tests to: a. Three presumptive TSI cultures recovered from set of plates streaked from RV

medium (or SC broth for guar gum), if present, and 3 presumptive TSI agar cultures recovered from plates streaked from TT broth, if present.

b. If 3 presumptive-positive TSI cultures are not isolated from one set of agar plates, test other presumptive-positive TSI agar cultures, if isolated, by bioche mical and serological tests. Examine a minimum of 6 TSI cultures for each 25 g analytical unit or each 375 g composite.


E. Identification of Salmonella 1. Mixed cultures. Streak TSI agar cultures that appear to be mixed on MacConkey agar,

HE agar, or XLD agar. Incubate plates 24 ± 2 h at 35°C. Examine plates for presence of colonies suspected to be Salmonella.

a. MacConkey agar. Typical colonies appear transparent and colorless, sometimes with dark center. Colonies of Salmonella will clear areas of precipitated bile caused by other organisms sometimes present.


http://www.atcc.org/




b. Hektoen enteric (HE) agar. See D-7a, above. c. Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar. See D-7b, above. Transfer at least 2

colonies suspected to be Salmonella to TSI and LIA slants as described in D-7, above, and continue as in D-9, above.

2. Pure cultures a. Urease test (conventional). With sterile needle, inoculate growth from each

presumed-positive TSI slant culture into tubes of urea broth. Since occasional, uninoculated tubes of urea broth turn purple-red (positive test) on standing, include uninoculated tube of this broth as control. Incubate 24 ± 2 h at 35°C.

b. Optional urease test (rapid). Transfer two 3-mm loopfuls of growth from each presumed-positive TSI slant culture into tubes of rapid urea broth. Incubate 2 h in 37 ± 0.5°C water bath. Discard all cultures giving positive test. Retain for further study all cultures that give negative test (no change in color of medium).

3. Serological polyvalent flagellar (H) test a. Perform the polyvalent flagellar (H) test at this point, or later, as described in E-5,

below. Inoculate growth from each urease-negative TSI agar slant into either 1) BHI broth and incubate 4-6 h at 35°C until visible growth occurs (to test on same day); or 2) trypticase soy-tryptose broth and incubate 24 ± 2 h at 35°C (to test on following day). Add 2.5 ml formalinized physiological saline solution to 5 ml of either broth culture.

b. Select 2 formalinized broth cultures and test with Salmonella polyvalent flagellar (H) antisera. Place 0.5 ml of appropriately diluted Salmonella polyvalent flagellar (H) antiserum in 10 x 75 mm or 13 x 100 mm serological test tube. Add 0.5 ml antigen to be tested. Prepare saline control by mixing 0.5 ml formalinized physiological saline solution with 0.5 ml formalinized antigen. Incubate mixtures in 48-50°C water bath. Observe at 15 min intervals and read final results in 1 h.

Positive--agglutination in test mixture and no agglutination in control.

Negative--no agglutination in test mixture and no agglutination in control.

Nonspecific--agglutination in both test mixture and control. Test the cultures giving such results with Spicer-Edwards antisera.

4. Spicer-Edwards serological test. Use this test as an alternative to the polyvalent flagellar (H) test. It may also be used with cultures giving nonspecific agglutination in polyvalent flagellar (H) test. Perform Spicer-Edwards flagellar (H) antisera test as described in E, 3b, above. Perform additional biochemical tests (E, 5a-c, below) on cultures giving positive flagellar test results. If both formalinized broth cultures are negative, perform serological tests on 4 additional broth cultures (E, 3a, above). If possible, obtain 2 positive cultures for additional biochemical testing E, 5a-c, below). If all urease-negative TSI cultures from sample give negative serological flagellar (H) test results, perform additional biochemical tests E, 5a-c, below).

5. Testing of urease-negative cultures a. Lysine decarboxylase broth. If LIA test was satisfactory, it need not be

repeated. Use lysine decarboxylase broth for final determination of lysine decarboxylase if culture gives doubtful LIA reaction. Inoculate broth with small amount of growth from TSI slant suspicious for Salmonella . Replace cap tightly and incubate 48 ± 2 h at 35°C but examine at 24 h intervals. Salmonella species cause alkaline reaction indicated by purple color throughout medium. Negative test is indicated by yellow color throughout medium. If medium appears discolored (neither purple nor yellow) add a few drops of 0.2% bromcresol purple dye and re-read tube reactions.

b. Phenol red dulcitol broth or purple broth base with 0.5% dulcitol. Inoculate broth with small amount of growth from TSI culture. Replace cap loosely and incubate 48 ± 2 h at 35°C, but examine after 24 h. Most Salmonella species give positive test, indicated by gas formation in inner fermentation vial and acid pH









(yellow) of medium. Production of acid should be interpreted as a positive reaction. Negative test is indicated by no gas formation in inner fermentation vial and red (with phenol red as indicator) or purple (with bromcresol purple as indicator) color throughout medium.

c. Tryptone (or tryptophane) broth. Inoculate broth with small growth from TSI agar culture. Incubate 24 ± 2 h at 35°C and proceed as follows:

1. 1) Potassium cyanide (KCN) broth. Transfer 3 mm loopful of 24 h tryptophane broth culture to KCN broth. Heat rim of tube so that good seal is formed when tube is stoppered with wax-coated cork. Incubate 48 ± 2 h at 35°C but examine after 24 h. Interpret growth (indicated by turbidity) as positive. Most Salmonella species do not grow in this medium, as indicated by lack of turbidity.

2. 2) Malonate broth. Transfer 3 mm loopful of 24 h tryptone broth culture to malonate broth. Since occasional uninoculated tubes of malonate broth turn blue (positive test) on standing, include uninoculated tube of this broth as control. Incubate 48 ± 2 h at 35°C, but examine after 24 h. Most Salmonella species cultures give negative test (green or unchanged color) in this broth.

3. 3) Indole test. Transfer 5 ml of 24 h tryptophane broth culture to empty test tube. Add 0.2-0.3 ml Kovacs' reagent. Most Salmonella cultures give negative test (lack of deep red color at surface of broth). Record intermediate shades of orange and pink as ±.

4. 4) Serological flagellar (H) tests for Salmonella . If either polyvalent flagellar (H) test (E-3, above) or the Spicer-Edwards flagellar (H) test tube test (E-4, above) has not already been performed, either test may be performed here.

5. 5) Discard as not Salmonella any culture that shows either positive indole test and negative serological flagellar (H) test, or positive KCN test and negative lysine decarboxylase test.

6. Serological somatic (O) tests for Salmonella. (Pre-test all antisera to Salmonella with known cultures.)

a. Polyvalent somatic (O) test. Using wax pencil, mark off 2 sections about 1 x 2 cm each on inside of glass or plastic petri dish (15 x 100 mm). Commercially available sectioned slides may be used. Emulsify 3 mm loopful of culture from 24-48 h TSI slant or, preferably, tryptose blood agar base (without blood) with 2 ml 0.85% saline. Add 1 drop of culture suspension to upper portion of each rectangular crayon-marked section. Add 1 drop of saline solution to lower part of one section only. Add 1 drop of Salmonella polyvalent somatic (O) antiserum to other section only. With clean sterile transfer loop or needle, mix culture suspension with saline solution for one section and repeat for other section containing antiserum. Tilt mixtures in back-and-forth motion for 1 min and observe against dark background in good illumination. Consider any degree of agglutination a positive reaction. Classify polyvalent somatic (O) test results as follows:

Positive--agglutination in test mixture; no agglutination in saline control.

Negative--no agglutination in test mixture; no agglutination in saline control.

Nonspecific--agglutination in test and in control mixtures. Perform further biochemical and serological tests as described in Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae (2).

b. Somatic (O) group tests. Test as in E-6a, above, using individual group somatic (O) antisera including Vi, if available, in place of Salmonella polyvalent somatic (O) antiserum. For special treatment of cultures giving positive Vi agglutination reaction, refer to sec. 967.28B in Official Methods of Analysis (1). Record






cultures that give positive agglutination with individual somatic (O) antiserum as positive for that group. Record cultures that do not react with individual somatic (O) antiserum as negative for that group.

7. Additional biochemical tests. Classify as Salmonella those cultures which exhibit typical Salmonella reactions for tests 1-11, shown in Table 1. If one TSI culture from 25 g analytical unit is classified as Salmonella, further testing of other TSI cultures from the same 25 g analytical unit is unnecessary. Cultures that contain demonstrable Salmonella antigens as shown by positive Salmonella flagellar (H) test but do not have biochemical characteristics of Salmonella should be purified (E-l, above) and retested, beginning with E-2, above.

Perform the following additional tests on cultures that do not give typical Salmonella reactions for tests 1-11 in Table 1 and that consequently do not classify as Salmonella.

a. Phenol red lactose broth or purple lactose broth. 1) Inoculate broth with small amount of growth from unclassified 24-48 h

TSI slant. Incubate 48 ± 2 h at 35°C, but examine after 24 h.

Positive--acid production (yellow) and gas production in inner fermentation vial. Consider production of acid only as positive reaction. Most cultures of Salmonella give negative test result, indicated by no gas formation in inner fermentation vial and red (with phenol red as indicator) or purple (with bromcresol purple as indicator) throughout medium.

2) Discard as not Salmonella, cultures that give positive lactose tests, except cultures that give acid slants in TSI and positive reactions in LIA, or cultures that give positive malonate broth reactions. Perform further tests on these cultures to determine if they are S. arizonae.

b. Phenol red sucrose broth or purple sucrose broth. Follow procedure described in E,7a-1, above. Discard as not Salmonella , cultures that give positive sucrose tests, except those that give acid slants in TSI and positive reactions in LIA.

c. MR-VP broth. Inoculate medium with small amount of growth from each unclassified TSI slant suspected to contain Salmonella. Incubate 48 ± 2 h at 35°C.

1) Perform Voges-Proskauer (VP) test at room temperature as follows: Transfer 1 ml 48 h culture to test tube and incubate remainder of MR-VP broth an additional 48 h at 35°C. Add 0.6 ml α-naphthol and shake well. Add 0.2 ml 40% KOH solution and shake. To intensify and speed reaction, add a few crystals of creatine. Read results after 4 h; development of pink-to-ruby red color throughout medium is positive test. Most cultures of Salmonella are VP-negative, indicated by absence of development of pink-to-red color throughout broth.

2) Perform methyl red test as follows: To 5 ml of 96 h MR-VP broth, add 5-6 drops of methyl red indicator. Read results immediately. Most Salmonella cultures give positive test, indicated by diffuse red color in medium. A distinct yellow color is negative test. Discard, as not Salmonella, cultures that give positive KCN and VP tests and negative methyl red test.

d. Simmons citrate agar. Inoculate this agar, using needle containing growth from unclassified TSI agar slant. Inoculate by streaking slant and stabbing butt. Incubate 96 ± 2 h at 35°C. Read results as follows:

Positive--presence of growth, usually accompanied by color change from green to blue. Most cultures of Salmonella are citrate-positive.








Negative--no growth or very little growth and no color change.

8. Classification of cultures. Classify, as Salmonella, cultures that have reaction patterns of Table l. Discard, as not Salmonella, cultures that give results listed in any subdivision of Table 2. Perform additional tests described in Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae (2) to classify any culture that is not clearly identified as Salmonella by classification scheme in Table l or not eliminated as not being Salmonella by test reactions in Table 2. If neither of 2 TSI cultures carried through biochemical tests confirms the isolate as Salmonella, perform biochemical tests, beginning with E-5, on remaining urease-negative TSI cultures from same 25 g analytical unit.


Table 1. Biochemical and serological reactions of Salmonella

Result Test or substrate

Positive Negative

Salmonella species

reaction(a)

1. Glucose (TSI)

yellow butt red butt +

2. Lysine decarboxylase (LIA)

purple butt yellow butt +

3. H2S (TSI and LIA)

Blackening no blackening +

4. Urease purple-red color no color change -

5. Lysine decarboxylase broth

purple color yellow color +

6. Phenol red dulcitol broth

yellow color and/or gas

no gas; no color change

+(b)

7. KCN broth Growth no growth -

8. Malonate broth blue color no color change -(c)

9. Indole test violet color at surface

yellow color at surface -

10. Polyvalent flagellar test

Agglutination no agglutination +

11. Polyvalent somatic test

Agglutination no agglutination +

12. Phenol red lactose broth



-(c)

13. Phenol red sucrose broth



-

14. Voges-Proskauer test

pink-to-red color no color change -

15. Methyl red test diffuse red color diffuse yellow color +

16. Simmons citrate growth; blue color no growth; no color change

v

a +, 90% or more positive in 1 or 2 days; -, 90% or more negative in 1 or 2 days; v, variable.

b Majority of S. arizonae cultures are negative.

c Majority of S. arizonae cultures are positive.


Table 2. Criteria for discarding non-Salmonella cultures

Test or substrate Results

1. Urease positive (purple-red color)

2. Indole test and Polyvalent flagellar (H) test;

positive (violet color at surface) negative (no agglutination)

or Indole test and Spicer-Edwards flagellar test

positive (violet color at surface) negative (no agglutination)

3. Lysine decarboxylase and KCN broth

negative (yellow color) positive (growth)

4. Phenol red lactose broth positive (yellow color and/or gas)(a), (b)

5. Phenol red sucrose broth positive (yellow color and/or gas)(b)

6. KCN broth, Voges-Proskauer test, and Methyl red test

positive (growth) positive (pink-to-red color) negative (diffuse yellow color)

a Test malonate broth positive cultures further to determine if they are S. arizonae.

b Do not discard positive broth cultures if corresponding LIA cultures give typical Salmonella reactions; test further to determine if they are Salmonella species.

9. Presumptive generic identification of Salmonella . As alternative to conventional biochemical tube system, use any of 5 commercial biochemical systems (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID, or Vitek GNI) for presumptive generic identification of foodborne Salmonella. Choose a commercial system based on a demonstration in analyst's own laboratory of adequate correlation between commercial system and biochemical tube system delineated in this identification section. Commercial biochemical kits should not be used as a substitute for serological tests (l). Assemble supplies and prepare reagents required for the kit. Inoculate each unit according to Method 978.24 (API 20E, Enterotube II, and Enterobacteriaceae II), sec. 989.12 (MICRO-ID), and Method 991.13 (Vitek GNI) in Official Methods of Analysis (1), incubating for time and temperature specified. Add reagents, observe, and record results. For presumptive identification, classify cultures, according to ref. 1, above, as Salmonella or not Salmonella.

For confirmation of cultures presumptively identified as Salmonella, perform the Salmonella serological somatic (O) test (E-6, above) and the Salmonella serological flagellar (H) test (E-3, above) or the Spicer-Edwards flagellar (H) test (E-4, above), and classify cultures according to the following guidelines:

a. Report as Salmonella those cultures classified as presumptive Salmonella with commercial biochemical kits when the culture demonstrates positive Salmonella somatic (O) test and positive Salmonella (H) test.


b. Discard cultures presumptively classified as not Salmonella with commercial biochemical kits when cultures conform to AOAC criteria (1) for classifying cultures as not Salmonella.

c. For cultures that do not conform to a or b, classify according to additional tests specified in E, 2-7, above, or additional tests as specified by Ewing (2), or send to reference typing laboratory for definitive serotyping and identification.

10. Treatment of cultures giving negative flagellar (H) test. If biochemical reactions of certain flagellar (H)-negative culture strongly suggest that it is Salmonella, the negative flagellar agglutination may be the result of nonmotile organisms or insufficient development of flagellar antigen. Proceed as follows: Inoculate motility test medium in petri dish, using small amount of growth from TSI slant. Inoculate by stabbing medium once about 10 mm from edge of plate to depth of 2-3 mm. Do not stab to bottom of plate or inoculate any other portion. Incubate 24 h at 35°C. If organisms have migrated 40 mm or more, retest as follows: Transfer 3 mm loopful of growth that migrated farthest to trypticase soy-tryptose broth. Repeat either polyvalent flagellar (H) (E-3, above) or Spicer-Edwards (E-4 , above) serological tests. If cultures are not motile after the first 24 h, incubate an additional 24 h at 35°C; if still not motile, incubate up to 5 days at 25°C. Classify culture as nonmotile if above tests are still negative. If flagellar (H)-negative culture is suspected of being a species of Salmonella on the basis of its biochemical reactions, FDA laboratories should submit the culture to

FDA Denver Laboratory Attention Sample Custodian Denver Federal Center, Building 20 6th Avenue & Kipling Streets Denver, CO 80225-0087 (Above address effective October 1, 2004)

for further identification and/or serotyping. Laboratories other than FDA should make arrangements with a reference laboratory for the serotyping of Salmonella cultures.

11. Submission of cultures for serotyping. Submit 1 isolate of each somatic group recovered from each analytical unit, unless otherwise instructed. Submit cultures on BHI agar slants in screw-cap tubes (13 x 100 mm or 16 x 125 mm) with caps secured tightly. Label each tube with sample number, subsample (analytical unit) number, and code, if applicable. Submit a copy of the Collection Report, FD-464, or Import Sample Report, FD-784 for each sample. Place cultures in culture container with official FDA seal. Place accompanying records (E-11, above) inside shipping carton but not within officially sealed culture container. Submit memo or cover letter for each sample number to expedite reporting of results. Prepare cultures for shipment according to requirements for shipment of etiological agents (3). Label secondary shipping container according to ref. 4. Send container by most rapid mail service available. Maintain duplicate cultures of those submitted for serotyping only on those samples under consideration for legal action.

Microbiology Field laboratories should follow the following guidance in sending Salmonella isolates for serotyping:


Isolates from NRL, WEAC, SRL and ARL will be serotyped in ARL:

Arkansas Regional Laboratory 3900 NCTR Road Building 26 Jefferson, AR 72079 Attention: Gwendolyn Anderson Tel # 870-543-4621 Fax# 870-543-4041

Isolates from SAN, PRL-NW, PRL-SW and DEN will be serotyped in DEN

Denver District Laboratory 6th Avenue & Kipling Street DFC Building 20 Denver, CO 80225-0087 Attention: Doris Farmer Tel # 303-236-9604 Fax # 303-236-9675


References

1. AOAC INTERNATIONAL. 2000. Official Methods of Analysis, 17th ed., Methods 967.25-967.28, 978.24, 989.12, 991.13, 994.04, and 995.20. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.

2. Ewing, W.H. 1986. Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriacae, 4th ed. Elsevier, New York.

3. Federal Register. 1971. 36(93):8815 (secs d, e, and f). 4. Federal Register. 1972. 37(191):20556 (sec. 173.388(a)). 5. June, G.A., P.S. Sherrod, T.S. Hammack, R.M. Amaguana, and W.H. Andrews. 1995. Relative

effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: Precollaborative study. J. AOAC Int. 78:375-380.

6. Hammack, T.S., R.M. Amaguana, G.A. June, P.S. Sherrod, and W.H. Andrews. 1999. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from foods with a low microbial load. J. Food Prot. 62:16-21.

7. June, G.A., P.S. Sherrod, T.S. Hammack, R.M. Amaguana, and W.H. Andrews. 1996. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh, highly contaminated foods, and poultry feed: Collaborative study. J. AOAC Int. 79:1307-1323.

8. Hammack, T.S., R.M. Amaguana, and W.H. Andrews. 2000. Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from foods with a low microbial load: Collaborative study. J. AOAC Int. (in press).

9. Sherrod, P.S., R.M. Amaguana, W.H. Andrews, G.A. June, and T.S. Hammack. 1995. Relative effectiveness of selective plating agars for the recovery of Salmonella species from selected high-moisture foods. J. AOAC Int. 78:679-690.


Bad Bug Book: Salmonella

Chapter 5 Contents

Hypertext Source: Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A,1998. Chapter 5. Authors: Wallace H. Andrews and [email protected] Revisions: 1999-DEC, 2000-MAR, and 2000-AUG Final revision on 2000-NOV-14 (see the Introduction for a summary of changes). October 25, 2001 - Extension of the applicability of the orange juice method in section C.19 to apple juice and apple cider. April 2003 - Frog legs method, Lactic casein, Rennet casein, Sodium caseinate and Rabbit carcass methods revised, top ears and other dog chew toys added. Removed section A.25, Mechanical shaker. June 2006 Edition - Eggs method revised for shell eggs and liquid whole eggs. December 2007 - Mamey pulp method added, and Section D revised.

To obtain a copy of a prior version not currently posted, please contact [email protected]


http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/FoodborneIllness/FoodborneIllnessFoodbornePathogensNaturalToxins/BadBugBook/ucm069966.htm

http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/FoodborneIllness/FoodborneIllnessFoodbornePathogensNaturalToxins/BadBugBook/ucm069966.htm

mailto:[email protected]


BAM: Rapid Methods for Detecting Foodborne Pathogens

January 2001

Bacteriological Analytical Manual Appendix 1 Rapid Methods for Detecting Foodborne Pathogens

Authors

Introduction

Authors Note: This section differs from others in this manual in that it lists methods that are not necessarily used by FDA. In addition, the detailed protocols for these methods are not presented, and the user is referred to the instructions that accompany the test kits. One reason for this departure is the incremental rate of change and innovation in rapid testing technology. The best of these new techniques should be evaluated individually by user labs for their particular needs, and also collaboratively for possible adoption as official methods by the AOAC International (1).

The following text and tables list many of the commercially available rapid methods; they are classified by the principles underlying the procedure used. The assay principles and some of the detailed procedures are discussed in other chapters of this manual and/or in the literature cited in the tables. The AOAC status of rapid tests is indicated for those methods that have been validated or evaluated by AOAC (1) and have been adopted as AOAC Official methods. However, these methods continue to be modified or adapted, so that published information may not be the most current. Rapid methods are generally used as screening techniques, with negative results accepted as is, but positive results requiring confirmation by the appropriate official method, which, in many instances, is cultural. In many other instances, the rapid method has not been validated; therefore, the listing of a method or kit in this chapter in no way constitutes FDA recommendation or approval.

Rapid Methods

The rapid detection of pathogens and other microbial contaminants in food is critical for ensuring the safety of consumers. Traditional methods to detect foodborne bacteria often rely on time-consuming growth in culture media, followed by isolation, biochemical identification, and sometimes serology. Recent advances in technology make detection and identification faster, more convenient, more sensitive, and more specific than conventional assays -- at least in theory. These new methods are often referred to as "rapid methods", a subjective term used loosely to describe a vast array of tests that includes miniaturized biochemical kits, antibody- and DNA-based tests, and assays that are modifications of conventional tests to speed up analysis (8, 15, 16, 24, 36). Some of these assays have also been automated to reduce hands-on manipulations. With few exceptions, almost all assays used to detect specific pathogens in foods require some growth in an enrichment medium before analysis.

Experts who were surveyed in 1981 (19) about future developments in methods used for food microbiology, accurately predicted the widespread use of miniaturized biochemical kits for the identification of pure cultures of bacteria isolated from food. Most consist of a disposable device containing 15 - 30 media or substrates specifically designed to identify a bacterial group or species. With the exception of a few kits where results can be read in 4 hrs, most require 18-24 hrs incubation. In general, miniaturized biochemical tests are very similar in format and performance, showing 90-99% accuracy in comparison to conventional methods (5, 16, 21). However, kits that have been in use longer may have a more extensive identification database than newer tests. Most miniaturized kits are designed

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for enteric bacteria, but kits for the identification of non-Enterobacteriaceae are also available, including for Campylobacter, Listeria, anaerobes, non-fermenting Gram-negative bacteria and for Gram-positive bacteria (Table 1).

Advances in instrumentation have enabled automation of the miniaturized biochemical identification tests. These instruments can incubate the reactions and automatically monitor biochemical changes to generate a phenotypic profile, which is then compared with the provided database stored in the computer to provide an identification (8, 23, 35). Other automated systems identify bacteria based on compositional or metabolic properties, such as fatty acid profiles, carbon oxidation profiles (28) or other traits (Table 1).

Not forecast in that 1981 survey were the potential applications of immunological and genetic techniques in food microbiology (19). During the 1980s, major advances in basic research were transferred rapidly to applied areas, as "biotechnology" companies emerged and sought markets in the diagnostic field (11). DNA and antibody-based assays for numerous microbes or their toxins are now available commercially (12).

There are many DNA-based assay formats, but only probes, PCR and bacteriophage have been developed commercially for detecting foodborne pathogens. Probe assays generally target ribosomal RNA (rRNA), taking advantage of the fact that the higher copy number of bacterial rRNA provides a naturally amplified target and affords greater assay sensitivity (6, 14, 25, 37) (Table 2).

The basic principle of DNA hybridization is also being utilized in other technologies, such as the polymerase chain reaction (PCR) assay, where short fragments of DNA (probes) or primers are hybridized to a specific sequence or template, which is then enzymatically amplified by Taq polymerase using a thermocycler (2, 22). Theoretically, PCR can amplify a single copy of DNA by a million fold in less than 2 hrs; hence its potential to eliminate, or greatly reduce the need for cultural enrichment. However, the presence of inhibitors in foods and in many culture media can prevent primer binding and diminish amplification efficiency (26, 34), so that the extreme sensitivity achievable by PCR with pure cultures is often reduced when testing foods. Therefore, some cultural enrichment is still required prior to analysis (Table 2).

The highly specific interaction of phage with its bacterial host has also been used to develop assays for foodborne pathogens (38). One example is an assay for Salmonella, in which a specific bacteriophage was engineered to carry a detectable marker (ice nucleation gene). In the presence of Salmonella, the phage confers the marker to the host, which then expresses the phenotype to allow detection (Table 2).

The highly specific binding of antibody to antigen, especially monoclonal antibody, plus the simplicity and versatility of this reaction, has facilitated the design of a variety of antibody assays and formats, and they comprise the largest group of rapid methods being used in food testing (3, 10, 12, 33). There are 5 basic formats of antibody assays (12), the simplest of which is latex agglutination (LA), in which antibody-coated colored latex beads or colloidal gold particles are used for quick serological identification or typing of pure culture isolates of bacteria from foods (7, 12). A modification of LA, known as reverse passive latex agglutination (RPLA), tests for soluble antigens and is used mostly in testing for toxins in food extracts or for toxin production by pure cultures (12) (Table 3).

In the immunodiffusion test format, an enrichment sample is placed in a gel matrix with the antibody; if the specific antigen is present, a visible line of precipitation is formed (30).

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most prevalent antibody assay format used for pathogen detection in foods (3, 33). Usually designed as a "sandwich" assay, an antibody bound to a solid matrix is used to capture the antigen from enrichment cultures and a second antibody conjugated to an enzyme is used for detection. The walls of wells in microtiter plates are the most commonly used solid support; but ELISAs have also been designed using dipsticks, paddles, membranes, pipet tips or other solid matrices (12) (Table 3).


Antibodies coupled to magnetic particles or beads are also used in immunomagnetic separation (IMS) technology to capture pathogens from pre-enrichment media (31). IMS is analogous to selective enrichment, but instead of using antibiotics or harsh reagents that can cause stress-injury, an antibody is used to capture the antigen, which is a much milder alternative. Captured antigens can be plated or further tested using other assays.

Immunoprecipitation or immunochromatography, still another antibody assay format, is based on the technology developed for home pregnancy tests. It is also a "sandwich" procedure but, instead of enzyme conjugates, the detection antibody is coupled to colored latex beads or to colloidal gold. Using only a 0.1 ml aliquot, the enrichment sample is wicked across a series of chambers to obtain results (9). These assays are extremely simple, require no washing or manipulation and are completed within 10 minutes after cultural enrichment (Table 3).

The last mentioned "category" of rapid methods includes a large variety of assays, ranging from specialized media to simple modifications of conventional assays, which result in saving labor, time, and materials. Some, for instance, use disposable cardboards containing dehydrated media, which eliminates the need for agar plates, constituting savings in storage, incubation and disposal procedures (4, 5). Others incorporate specialized chromogenic and fluorogenic substrates in media to rapidly detect trait enzymatic activity (13, 17, 20, 27, 29). There are also tests that measure bacterial adenosine triphosphate (ATP), which (although not identifying specific species), can be used to rapidly enumerate the presence of total bacteria (Table 4).

Applications and Limitations of Rapid Methods

Almost all rapid methods are designed to detect a single target, which makes them ideal for use in quality control programs to quickly screen large numbers of food samples for the presence of a particular pathogen or toxin. A positive result by a rapid method however, is only regarded as presumptive and must be confirmed by standard methods (11). Although confirmation may extend analysis by several days, this may not be an imposing limitation, as negative results are most often encountered in food analysis.

Most rapid methods can be done in a few minutes to a few hours, so they are more rapid than traditional methods. But, in food analysis, rapid methods still lack sufficient sensitivity and specificity for direct testing; hence, foods still need to be culture-enriched before analysis (12). Although enrichment is a limitation in terms of assay speed, it provides essential benefits, such as diluting the effects of inhibitors, allowing the differentiation of viable from non-viable cells and allowing for repair of cell stress or injury that may have resulted during food processing.

Evaluations of rapid methods show that some perform better in some foods than others. This can be attributed mostly to interference by food components, some of which can be especially troublesome for the technologies used in rapid methods. For example, an ingredient can inhibit DNA hybridization or Taq polymerase, but has no effect on antigen-antibody interactions and the converse situation may also occur (12). Since method efficiencies may be food dependent, it is advisable to perform comparative studies to ensure that a particular assay will be effective in the analysis of that food type.

The specificity of DNA based assays is dictated by short probes; hence, a positive result, for instance with a probe or primers specific for a toxin gene, only indicates that bacteria with those gene sequences are present and that they have the potential to be toxigenic. But, it does not indicate that the gene is actually expressed and that the toxin is made. Likewise, in clostridial and staphylococcal intoxication, DNA probes and PCR can detect only the presence of cells, but are of limited use in detecting the presence of preformed toxins (12).

Currently, there are at least 30 assays each for testing for E. coli O157:H7 and for Salmonella. Such a large number of options can be confusing and overwhelming to the user, but, more importantly, has limited the effective evaluation of these methods. As a result, only few methods have been officially validated for use in food testing (1,11).


Conclusions

As a rapid method is used more frequently, its benefits and at the same time, its limitations also become more apparent. This section only briefly described some of the rapid method formats and selected problems encountered when using these assays in food analysis. However, because of the complex designs and formats of these tests, coupled with the difficulties of testing foods, users must exercise caution when selecting rapid methods and to also evaluate these tests thoroughly, as some may be more suitable than others for distinct testing situations or for assaying certain types of food. Lastly, technology continues to advance at a great pace and next generation assays, such as biosensors (18) and DNA chips (32) already are being developed that potentially have the capability for near real-time and on-line monitoring of multiple pathogens in foods.


NOTE: The listings provided in Tables 1-4 are intended for general reference only and do not indicate endorsement or approval by FDA for use in food analysis.

Table 1. Partial list of miniaturized biochemical kits and automated systems for identifying foodborne bacteria* ( 5, 8, 15, 16, 21, 35, 36 ).

System Format Manufacturer Organisms

APIb biochemical bioMerieux Enterobacteriaceae, Listeria, Staphylococcus, Campylobacter, Non-fermenters, anaerobes

Cobas IDA biochemical Hoffmann LaRoche

Enterobacteriaceae

Micro-IDb biochemical REMEL Enterobacteriaceae, Listeria

EnterotubeII biochemical Roche Enterobacteriaceae

Spectrum 10 biochemical Austin Biological Enterobacteriaceae

RapID biochemical Innovative Diag. Enterobacteriaceae

BBL Crystal biochemical Becton Dickinson Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Non-fermenters, anaerobes

Minitek biochemical Becton Dickinson Enterobacteriaceae

Microbact biochemical Microgen Enterobacteriaceae, Gram negatives, Non-fermenters, Listeria

Vitekb biochemicala bioMerieux Enterobacteriaceae, Gram negatives, Gram positives

Microlog C oxidationa Biolog Enterobacteriaceae, Gram negatives, Gram positives

MISb Fatty acida Microbial-ID Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter

Walk/Away biochemicala MicroScan Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter

Replianalyzer biochemicala Oxoid Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter

Riboprinter nucleic acida Qualicon Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Escherichia coli

Cobas Micro-ID biochemicala Becton Dickinson Enterobacteriaceae, Gram negatives, Non-fermenters

Malthusb conductancea Malthus Salmonella, Listeria, Campylobacter, E. coli, Pseudomonas, coliforms

Bactometer impedancea bioMerieux Salmonella

* Table modified from: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed. a Automated systems b Selected systems adopted AOAC Official First or Final Action.

NOTE: This table is intended for general reference only and lists known available methods. Presence on this list does not indicate verification, endorsement, or approval by FDA for use in food analysis.


Table 2. Partial list of commercially-available, nucleic acid-based assays used in the detection of foodborne bacterial pathogens* (2, 5, 8, 12, 14, 22, 25, 36, 37).

Organism Trade Name Format Manufacturer

Clostridium botulinum Probelia PCR BioControl

AccuProbe probe GEN-PROBE Campylobacter

GENE-TRAK probe Neogen

Escherichia coli GENE-TRAK probe Neogen

BAX PCRa Qualicon E. coli O157:H7

Probelia PCR BioControl

GENE-TRAKc probe Neogen

AccuProbe probe GEN-PROBE

BAX PCR Qualicon

Listeria


GENE-TRAKc probe Neogen

BAX PCR Qualicon

BINDb phage BioControl

Salmonella


AccuProbe probe GEN-PROBE Staphylococcus aureus

GENE-TRAK probe Neogen

Yersinia enterocolitica GENE-TRAK probe Neogen

* Table modified from: Feng, P., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed. a Polymerase chain reaction b Bacterial Ice Nucleation Diagnostics c Adopted AOAC Official First or Final Action



Table 3. Partial list of commercially-available, antibody-based assays for the detection of foodborne pathogens and toxins* (3, 5, 8, 12, 33, 36).

Organism/toxin Trade Name Assay Formata Manufacturer

TECRA ELISA TECRA Bacillus cereus diarrhoeal toxin

BCET RPLA Unipath

Campyslide LA Becton Dickinson

Meritec-campy LA Meridian

MicroScreen LA Mercia

VIDAS ELFAb bioMerieux

EiaFOSS ELISAb Foss

Campylobacter

TECRA ELISA TECRA

Clostridium botulinum toxin ELCA ELISA Elcatech

C. perfringens enterotoxin PET RPLA Unipath

Escherichia coli

RIM LA REMEL

E. coli O157 LA Unipath

Prolex LA PRO-LAB

Ecolex O157 LA Orion Diagnostica

Wellcolex O157 LA Murex

E. coli O157 LA TechLab

O157&H7 sera Difco

PetrifilmHEC Ab-blot 3M

EZ COLI Tube-EIA Difco

Dynabeads Ab-beads Dynal

EHEC-TEK ELISA Organon-Teknika

Assurancee ELISA BioControl

HECO157 ELISA 3M Canada

TECRA ELISA TECRA

E. coli O157 ELISA LMD Lab

Premier O157 ELISA Meridian

E. coli O157:H7 ELISA Binax

E. coli Rapitest ELISA Microgen

Transia Card E. coli O157 ELISA Diffchamb

E. coli O157 EIA/capture TECRA

VIPe Ab-ppt BioControl

EHEC**c O157:H7

Reveal Ab-ppt Neogen


Quix Rapid O157 Ab-ppt Universal HealthWatch

ImmunoCardSTAT Ab-ppt Meridian


EiaFOSS ELISAb Foss

VEROTEST ELISA MicroCarb

Premier EHEC ELISA Meridian

Shiga toxin (Stx)

Verotox-F RPLA Denka Seiken

ETEC c

Labile toxin (LT) VET-RPLA RPLA Oxoid

Stabile toxin (ST) E. coli ST ELISA Oxoid

Microscreen LA Microgen

Listeria Latex LA Microgen

Listeria-TEKe ELISA Organon Teknika

TECRAe ELISA TECRA


Transia Plate Listeria ELISA Diffchamb

Pathalert ELISA Merck

Listertest Ab-beads VICAM


VIPe Ab-ppt BioControl

Clearview Ab-ppt Unipath

RAPIDTEST Ab-ppt Unipath

VIDASe ELFAb bioMerieux

EiaFOSS ELISAb Foss

Listeria

UNIQUE Capture-EIA TECRA

Bactigen LA Wampole Labs

Spectate LA Rhone-Poulenc

Microscreen LA Mercia

Wellcolex LA Laboratoire Wellcome

Serobact LA REMEL

RAPIDTEST LA Unipath


Screen Ab-beads VICAM

CHECKPOINT Ab-blot KPL

1-2 Teste diffusion BioControl

SalmonellaTEKe ELISA Organon Teknika

Salmonella

TECRAe ELISA TECRA


EQUATE ELISA Binax

BacTrace ELISA KPL

LOCATE ELISA Rhone-Poulenc


Salmonella ELISA GEM Biomedical

Transia Plate Salmonella Gold

ELISA Diffchamb

Bioline ELISA Bioline

VIDASe ELFAb bioMerieux

OPUS ELISAb TECRA

PATH-STIK Ab-ppt LUMAC

Reveal Ab-ppt Neogen

Clearview Ab-ppt Unipath

UNIQUEe Capture-EIA TECRA

Bactigen LA Wampole Labs Shigella

Wellcolex Laboratoire Wellcome

Staphyloslide LA Becton Dickinson

AureusTeste LA Trisum

Staph Latex LA Difco

Staphylococcus aureus

S. aureus VIA ELISA TECRA

SET-EIA ELISA Toxin Technology

SET-RPLA RPLA Unipath

TECRAe ELISA TECRA

Transia Plate SE ELISA Diffchamb

RIDASCREEN ELISA R-Biopharm


enterotoxin

OPUS ELISAb TECRA

choleraSMART Ab-ppt New Horizon

bengalSMART Ab-ppt New Horizon

choleraScreen Agglutination New Horizon

Vibrio cholera

bengalScreen Agglutination New Horizon

enterotoxin VET-RPLAd RPLA Unipath

* Table modified from: Feng, P., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed. a Abbreviations: ELISA, enzyme linked immunosorbent assay; ELFA, enzyme linked fluorescent assay; RPLA, reverse passive latex agglutination; LA, latex agglutination; Ab-ppt, immunoprecipitation. b Automated ELISA c EHEC - Enterohemorrhagic E. coli; ETEC - enterotoxigenic E. coli d Also detects E. coli LT enterotoxin e Adopted AOAC Official First or Final Action

** CAUTION: unless the assays claim that they are specific for the O157:H7 serotype, most of


these tests detect only the O157 antigen; hence will also react with O157 strains that are not of H7 serotype. These O157, non-H7 strains, generally do not produce Shiga toxins and are regarded as not pathogenic for humans. Furthermore, some antibodies to O157 can also cross react with Citrobacter, E. hermanii and other enteric organisms.



Table 4. Partial list of other commercially available rapid methods and specialty substrate media for detection of foodborne bacteria* (4, 8, 13, 20, 27, 36).

Organism Trade Name Formata Assay Manufacturer

Redigelb Media RCR Scientific

Isogridb HGMF QA Labs

Enliten ATP Promega

Profile-1 ATP New Horizon

Biotrace ATP Biotrace

Lightning ATP Idexx

Petrifilmb media-film 3M

Bacteria

Sim Plate media Idexx

Isogridb HGMF/MUG QA Labs

Petrifilmb media-film 3M

SimPlate media Idexx

Redigel Media RCR Scientific

ColiQuikc MUG/ONPG Hach

ColiBluec media Hach

Colilertb,c MUG/ONPG Idexx

LST-MUGb MPN media Difco & GIBCO

ColiCompleteb MUG-Xgal BioControl

Colitrak MPN-MUG BioControl

ColiGel & E*Colitec MUG-Xgal Charm Sciences

Coliform/ E. coli

CHROMagar Medium CHROMagar

MUG disc MUG REMEL E. coli

CHROMagar Medium CHROMagar

Rainbow Agar Medium Biolog

BCMO157:H7 Medium Biosynth

EHECd

Fluorocult O157:H7 Medium Merck

Listeria monocytogenes BCM Medium Biosynth

Isogridb HGMF QA Labs

OSRT Medium/ motility Unipath (Oxoid)

Rambach Medium CHROMagar

MUCAP C8esterase Biolife

XLT-4 Medium Difco

Salmonella

MSRVb Medium

Yersinia Crystal violet Dye binding Polysciences


* Table modified from: Feng, P., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed. a Abbreviations: APC, aerobic plate count; HGMF, hydrophobic grid membrane filter; ATP, adenosine triphosphate; MUG, 4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide; ONPG, O-nitrophenyl ß-D-galactoside; MPN, most probable number. b Adopted AOAC Official First or Final Action. c Application for water analysis d EHEC - enterohemorrhagic Escherichia coli



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Hypertext Source: Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A, 1998. Revised 2000-July-18, Final Revision: 2001-Jan-25 Author: Peter Feng


Quito - Ecuador

NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1529-15:2013 Primera revisión

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS.

SALMONELLA. MÉTODO DE DETECCIÓN

Primera edición MICROBIOLOGICAL CONTROL OF FOODS. SALMONELLA. DETECCTION METHOD

First edition

DESCRIPTORES: Microbiología de los alimentos, análisis, microbiológico, determinación de salmonella AL 01.05-311 CDU: 614.32:539.67:579.84 CIIU: 9320 ICS: 07.100.30

CDU: 614.32 :539.67 :579.84 CIIU: 3511

ICS: 07.100.30 AL 01.05-311

2013-1077 -1-

Norma Técnica

Ecuatoriana Voluntaria

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS

SALMONELLA MÉTODO DE DETECCIÓN

NTE INEN

1529-15:2013 Primera revisión

2013-09

1. OBJETO

1.1 Esta norma describe los métodos de análisis para detectar Salmonella en alimentos

2. ALCANCE 2.1 Esta método no es cuantitativo y solo es aplicable para determinar la presencia o ausencia de Salmonella en los alimentos, en general.

3. DEFINICIONES 3.1 Para efectos de esta norma, se adoptan las siguientes definiciones: 3.1.1 Salmonella: Genero perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Está integrado por microrganismos que forman colonias típicas sobre medios sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas. Generalmente son móviles, Gram negativas, fermentan la glucosa con formación de gas y no fermentan la lactosa. 3.1.2 Detección de Salmonella: Es la determinación de la presencia o ausencia de estos microrganismos en una determinada masa, cuando el ensayo es realizado según el método prescrito. 3.1.3 Presuntivo de Salmonella spp. Bacterias que crecen en el medio de enriquecimiento selectivo específico, y forman colonias típicas o atípicas en medios selectivos sólidos. 3.1.4 Confirmación de Salmonella spp. Bacterias que crecen en el medio de enriquecimiento selectivo especificado, y forman colonias típicas y sospechosas en los medios sólidos selectivos, y que muestran características bioquímicas y serológicas específicas.

4. DISPOSICIONES GENERALES 4.1 El pre-enriquecimiento debe ser utilizado para alimentos que han sido sometidos a tratamientos de conservación: físicos (térmicos, desecación, irradiación); químicos (sal común, curado, ahumado, ácidos y substancias conservadoras). Los alimentos que no han sido sometidos a tratamiento alguno, o que son altamente contaminados, homogeneizarlos en los medios de enriquecimiento selectivo.

5. MÉTODOS DE ENSAYO 5.1 Fundamento 5.1.1 Las salmonelas, cuando presentes en los alimentos, generalmente lo están en pequeños números, algunas veces debilitadas y frecuentemente acompañadas de un gran número de potros miembros de Enterobacteriaceae, por tanto, en este método se considera las siguientes etapas: 5.1.2 Pre-enriquecimiento. Cultivo de la naturales 37 °C en medios mínimos sencillos, exentos de agentes químicos selectivos a fin de lograr la revitalización de las salmonelas lesionadas. 5.1.3 Enriquecimiento selectivo. Subcultivo a 37°C y entre 42 a 43°C, en medios liquidos selectivos del cultivo pre-enriquecido, para inhibir o restringir el crecimiento de la flora competitiva y favorecer la multiplicación de las salmonelas.

(Continúa) DESCRIPTORES: Microbiología de los alimentos, análisis, microbiológico, determinación de salmonella.

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5.1.5 Siembra en placa de medios selectivos sólidos. Inoculación de los cultivos de enriquecimiento selectivo en la superficie de agares selectivos y diferenciales, para visualizar las colonias que por su aspecto característico se las considera como se Salmonela presuntiva. 5.1.6 Identificación: Subcultivo de las colonias de Salmonella presuntiva y determinación de sus características bioquímicas y serológicas para identificarlas como miembros del genero Salmonella. 5.2 Equipos 5.2.1 Molino de carne para laboratorio, provisto de placas crivadas, cuyos agujeros no excedan de 4mm de diámetro 5.2.2 Licuadora de 8000 a 45000 rpm, con vasos de metal o vidrio autoclavables, de capacidad adecuada. 5.2.3 Equipo para esterilizar medios de cultivo y material: autoclave, almogadillas de asbesto, membranas filtrantes, bujías de porosidad adecuada. 5.2.4 Estufa de secado, con regulador de temperatura 5.2.5 Incubadora, con regulador de temperatura, para cultivos a 37° C 5.2.6 Baño de agua, con regulador de temperatura 5.2.7 Incubadora o baño de agua para cultivos entre 42°C y 43° C 5.2.8 Microscopio 5.2.9 Refrigeradora 5.2.10 Balanza de 0,1 g de sensibilidad 5.3 Reactivos y materiales 5.3.1 Medios de cultivo y reactivos 5.3.1.1 Requisitos básicos. Para que haya uniformidad en los resultados, es necesario que los componentes de los medios sean de una calidad uniforme y de grado analítico, a su vez, utilizar medios completos deshidratados, que se los reconstituye según las instrucciones del envase. 5.3.2 Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos. Ver NTE INEN 1529-1 5.3.2.1 Agar bismuto –sulfito (BS) 5.3.2.2 Agar citrato de Simmon 5.3.2.3 Agar cristal-violeta rojo-neutro bilis lactosa 5.3.2.4 Agar fenilamina 5.3.2.5 Agar hierro lisina (LIA) 5.3.2.6 Agar hierro triple-azúcar (TSI) 5.3.2.7 Agar nutritivo semisólido 5.3.2.8 Agar SS 5.3.2.9 Agar urea o caldo urea 5.3.2.10 Agar verde-brillante rojo-fenol (BG) 5.3.2.11 Agua peptona tamponada

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5.3.2.12 Caldo base con purpura de bromocresol 5.3.2.13 Caldo lisina-descarboxilase 5.3.2.14 Caldo MR-VP 5.3.2.15 Calo selenito cistina 5.3.2.16 Caldo tetrationato (Muller Kauffmann) 5.3.2.17 Caldo Triptona (Ljutov) 5.3.2.18 Caldo de soya triptica (TSB) 5.3.2.19 Caldo nutritivo 5.3.2.20 Leche descremada en polvo 5.3.2.21 Solución de gelatinasa al 5% 5.3.2.22 Solución de hidróxido de sodio 1N 5.3.2.23 Solución alcohólica de α naftol al 6% 5.3.2.24 Solución de ácido clorhídrico 1N 5.3.2.25 Solución de KOH al 40% 5.3.2.26 Solución fisiológica 5.3.2.27 Solución de creatina al 0,5% 5.3.2.28 Solución fisiológica formalizada 5.3.2.29 Solución de ONPG (O-nitrofenil β – D- galactopiranosida) 5.3.2.30 Solución verde brillante al 1% 5.3.2.31 Reactivo de Kovacs 5.3.2.32 Sulfito de potasio en polvo 5.3.2.33 Rojo de metilo 5.3.2.34 Tergitol aniónico 7 5.3.2.5 Tritón X-100 5.3.2.36 Antisueros “Vi” y polivalentes “O” y “H” 5.3.2.37 Reactivo de Voges-Proskauer (VP) 5.3.3 Materiales 5.3.3.1Requisitos básicos. Toda la vidriería y utensilios que se utilicen en los ensayos deben ser de material inerte y resistente a esterilizaciones repetidas, además, deben estar perfectamente limpios y estériles a) Mechero de Bunsen b) Gradillas o tuberas c) Asas y agujas para cultivos

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d) Materiales varios: cucharas, cuchillos, pinzas, tenedores, espátulas, tijeras, saca-bocadis, etc. e) Tubos de ensayo: de 150mm x 20mm; 160mm x 16mm; 120mm x 12mm; 100mm x 12 mm f) Probetas graduadas g) Pipetas bacteriológicas de punta ancha graduadas en 1/10 de cm

3

h) Placas Petri de vidrio o desechable de 100mm x 15mm i) Erlenmeyer j) Frascos para muestreo con tapas de rosca k) Pipetas Pasteur 5.4 Preparación de la muestra 5.4.1 La unidad analítica debe provenir de una unidad de muestra de por lo menos 100g, y se la tomara según la NTE INEN 1529-2. Si el alimento está congelado, a la cantidad necesaria descongelarla durante la noche entre 2 a 5°C ó, a una temperatura menor de 45°C por aproximadamente 15 minutos, de preferencia, en un baño de agua con agitación. 5.4.2 Las unidades de muestras perecerderas que llegan al laboratorio deben mantenerse en refrigeración (2 a 5°C), por no menos de 24h. En general, las muestras se deben mantener en las condiciones adecuadas al producto, hasta el momento del examen. 5.5 Procedimiento 5.5.1 Diluyentes. Los líquidos de dilución empleados para el objeto de esta norma son: 5.5.1.1 Agua peptona tamponada. Para colorantes alimentarios de ph > 6; productos del mar : crustáceos (camarones, cangrejos, etc), moluscos (bivalvos, caracoles), pescados; carnes y productos cárnicos; huevos pasteurizados, liquido o en polvo, productos con huevo; gelatinas y postres de gelatina; frutas y vegetales desecados; productos de panadería; pastas alimenticias; quesos. 5.5.1.2 Caldo de soya triptica con 0,5% de K2SO3 Para ajos y cebollas en polvo. El sulfito de potasio se añade al caldo antes de esterilizarlo. 5.5.1.3 Caldo de soya triptica. Para especias como; comino, pimienta, páprica, apio, perejil, tomillo, etc, vegetales en hojuelas, levadura seca. 5.5.1.4 Agua destilada estéril. Para productos desecados con alto contenido en sólidos solubles tales como, leche en polvo, productos desecados para bebes, etc. 5.5.1.5 Caldo nutritivo. Para productos de repostería. 5.5.1.6 Leche desnatada en polvo reconstituida. Para caramelos, chocolates y productos de confitería. 5.5.2 Pre-enriquecimiento. Preparar el homogeneizado con 25g de muestra y 225 cm

3 de diluyente, y

si es necesario, ajustar el pH a 6,8 ± 0,2 con una solución estéril de hidróxido de sodio 1N , ó de ácido clorhídrico 1N, ó de fosfato tripotásico al 8% (K3PO4-7H2O). 5.5.2.1 Productos procesados en general a) Asépticamente, pesar 25g de la muestra en un fresco de boca ancha con tapa de rosca (500cm

3),

adicionar 225 cm3

de diluyente, homogeneizar a alta velocidad durante 2 minutos. Si la muestra es pequeña, hacer la dilución proporcionalmente y proceder según el método (informar el resultado en base a la cantidad de muestra realmente analizada).

b) Tapar el frasco y dejar a temperatura ambiente por 60 minutos

NTE INEN 1529-15 2013-09

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c) Mezclar bien y ajustar el pH. Si la muestra es rica en grasa, después de ajustar el pH, adicionar

hasta el 2,2 cm3 de Tergitol Aniónico-7 ó, dos a tres gotas DE Tritón X-100, esterilizados a vapor

por 15 minutos. Utilizar estos surfactantes en la cantidad mínima necesaria para iniciar la formación de espuma.

d) Con la tapa aflojada ¼ de vuelta, incubar a 37°C durante no menos 16 horas y no más de 20

horas e) Continuar con 5.5.3.6 5.5.2.2 Leche en polvo a) Pesar asépticamente 25 g de muestra, adicionar 225 cm

3 de agua destilada estéril, tapar, mezclar

bien y dejar 60 minutos a temperatura ambiente. b) Mezclar y ajustar el pH, adicionar 0,45 cm

3 de verde brillante al 1% y mezclar bien.

c) Con la tapa aflojada ¼ de vuelta, incubar el frasco mínimo 16 horas y máximo 20 horas a 37°C. d) Continuar con 5.5.3.6 5.5.2.3 Levadura deshidratada. Utilizando como diluyente caldo de soya tríptica, proceder según. 5.5.2.1 y continuar con 5.5.2.1literal (b), excepto que para la levadura deshidratada activa, substituir el caldo de enriquecimiento selenito cistina por el caldo lauril sulfato triptosa. 5.5.2.4 Gelatinas. Pesar asépticamente 25g de muestra, adicionar 225 cm

3 de agua peptona

tamponada y 5cm3 de una solución acuosa de gelatinasa al 5,0% esterilizada por filtración y proceder

según 5.5.2.1 literal (b) a 5.5.2.2 literal (d). 5.5.2.5 Caramelos, chocolates y productos de confitería. Pesar 25g de muestra y añadir 225 cm

3 de

leche en polvo desnatada reconstituida estéril. Homogeneizar dos minutos a alta velocidad, tapar y dejar 60 minutos a temperatura ambiente. Proceder según 5.5.2.2 literal (b) a 5.5.2.2 literal (d) utilizando como agente inhibidor 0,9 cm

3 de una solución acuosa de cristal violeta al 1% ó 0,45 cm

3

de verde brillante al 1%. 5.5.2.6 Bivalvos (conchas, almejas, ostiones, ostras). Las muestras de moluscos frescos con sus valvas a) En un recipiente estéril, de boca ancha, de cualquier lote de conchas, desbullar asépticamente 30

conchas sanas. b) Al azar, subdividir las 30 conchas en dos porciones de 15 conchas cada una calcule el peso de

cada porción y separar dos volúmenes de agua peptona tamponada en cantidad suficiente para obtener una suspensión de 10

-1.

c) De cada una de las dos porciones, y dependiendo del peso de cada concha individual, en vasos

estériles adecuados para homogeneizar, pesar por separado, alícuotas de aproximadamente 100g (carne y líquido).

d) Adicionar 300cm

3 de agua peptona tamponada a cada vaso y homogeneizar a alta velocidad

durante 90 segundos, adicionar el restante del agua peptona hasta obtener la suspensión madre de 10

-1. Mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 60 minutos.

e) Mezclar bien por agitación, ajustar el pH. f) Incubar los dos frascos a 37°C por no menos 16h y no más de 20h. g) Continuar con 5.5.3.6

(Continúa)

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5.5.2.7 Aves a) Colocar la canal, o trozos de la misma, dentro de una bolsa plástica, adicionar 300 cm

3 de agua

peptona tamponada y lavarla frotando la superficie de la carcasa durante un minuto. b) Asépticamente, retirar la canal y transferir el líquido de enjuague a un frasco con tapa. Proceder

según 5.5.3.4 a 5.5.3.6 c) Cuando no se requiere de pre-enriquecimiento, recoger el líquido de enjuague en dos frascos, en

volúmenes iguales. A un frasco añadir igual volumen de caldo tetrationato doble concentración, y al otro, caldo selenito cistina doble concentración. Mezclar bien y dejar 60 minutos a temperatura ambiente.

d) Continuar con 5.5.3.4 a 5.5.3.7 teniendo cuidado de mantener la concentración del verde

brillante. 5.5.2.8 Leche cruda: leche tratada térmicamente y productos lácteos líquidos. a) Pipetear 25 ml de la muestra de ensayo y colocarla en un matraz que contiene 225 ml del medio

de pre-enriquecimiento y mezclar. Continuar con el numeral 5.5.3.1 de la INEN 1529-15. 5.5.2.9 Lactosa a) Pesar de la muestra de ensayo 25g asépticamente en un matraz tapado que contenía 225 ml de

medio de pre-enriquecimiento y agitar para disolver. Continuar con el numeral 5.5.3.1 de la INEN 1529-15.

5.5.2.10 Mantequilla a) Agite la muestra fundida aproximadamente a 45°C, tome con una pipeta, 25 ml de muestra a un

matraz que contiene 225 ml del medio de pre-enriquecimiento y mezclar. Continuar con el numeral 5.5.3.1 de la INEN 1529-15.

5.5.3 Enriquecimiento selectivo 5.5.3.1 Tarar dos vasos vacíos estériles de homogeneizador (o sustituto) de aproximadamente 500 cm

3 de capacidad. Asépticamente, en cada uno, de las distintas zonas de la unidad de muestra pesar

25 ± 0,1 g (en pequeños pedazos). 5.5.3.2 Al uno, añadir 225 cm

3 de caldo selenito cistina y al otro 225 cm

3 de caldo tetrationato sin

verde brillante. Sin pérdida de tiempo homogeneizar el alimento a alta velocidad por no más de 2,0 minutos, comenzar con pocas revoluciones hasta llegar entre 15000 y 2000 rpm. Omitir la trituración si la muestra es pulverulenta, molida o triturada. 5.5.3.3 Asépticamente, transferir el homogeneizado a frascos estériles de boca ancha con tapa de rosca (500 cm

3) o a otros similares. Dejar 60 minutos a temperatura ambiente.

Mezclar bien y ajustar el pH. 5.5.3.4 Adicionar 2,25 cm

3 de verde brillante al 0,1% al frasco con caldo tetrationato, mezclar bien.

5.5.3.5 Cuando la muestra ha sido sometida a pre-enriquecimiento (5.5.2), entre las 16 y 20 horas de incubación, ajustar la tapa y delicadamente mezclar el cultivo de pre-enriquecimiento, pipetear 10 cm

3

en 100 cm3 de caldo tetrationato verde brillante y otros 10 cm

3 en 100 cm

3 de selenito cistina.

5.5.3.6 Incubar el caldo selenito cistina a 37 ± 1°C por 48 horas y el caldo tetrationato entre 42 y 43°C durante 48 horas, Ver anexo A. 5.5.4 Siembra en placa de medios sólidos selectivos y diferenciales 5.5.4.1 Cuando el periodo de incubación de los medios tetrationato y selenito alcanza entre las 18 y 24h, ajustar las tapas y de cada uno de ellos con asa de cultivo sembrar en estría sobre la superficie seca de placas de agar verde-brillante rojo-fenol (BG), agar Salmonella-Shigella (SS), agar bismuto sulfito (BS) de manera a obtener colonias aisladas (primer sub cultivo).

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5.5.4.2 Invertir las placas e incubarlas a 37 ± 1°C por 24h. 5.5.4.3 Al término de las 48 horas de incubación de los caldos de enriquecimiento selectivo (5.5.3.7), de cada uno de ellos, realizar en idéntica forma un segundo sub cultivo. 5.5.4.4 Examinar las placas entre las 20 y 24 horas, si el crecimiento es pobre y no aparecen colonias típicas de salmonelas, examinarlas después de 24 horas más de incubación. 5.5.4.5 Aspecto de las colonias de Salmonella en los medios de agar selectivos a) Agar verde-brillante rojo-fenol. La mayoría de las colonias típicas de salmonelas son opacas p

traslúcidas de color rosa o rojo obscuro, y en el medio que las rodea verla de rosáceo a rojo. Las colonias típicas pueden presentarse incoloras, otras pueden aparecer de un color verde traslúcido cuando están rodeadas por colonias de color verde o verde amarillento de microrganismos fermentadores de la lactosa o sacarosa. Las salmonelas fermentadoras de la lactosa (menos del 1%) presentan colonias de color verde amarillento o verde.

b) Agar Salmonella-Shigella. La mayoría de las colonias típicas de salmonelas son opacas o

traslúcidas, incoloras o de color crema, con o sin centro negro. Las pocas salmonelas que fermentan la lactosa presentan colonias lisas de color rosa o naranja.

c) Agar bismuto-sulfito. La colonia típica o sospechosa debe ser confirmada, ya que reconocer las

colonias de Salmonella supone mucha experiencia y el aspecto puede variar no solo de especie a especie sino también de lote de medio de cultivo.

5.5.5 Selección y purificación de las colonias que serán confirmadas 5.5.5.1 Selección. De cada placa de medio selectivo seleccionar típicas o sospechosas bien aisladas y sembrarlas directamente en agar TSI y en LIA (8.6.1). Si en una placa hay menos de cinco colonias típicas, sembrar todas. 5.5.5.2 Purificación de las colonias elegidas a) Si en alguna placa, las colonias típicas o sospechosas están contaminadas con colonias de otras

enterobacterias, con un asa inocular estas colonias en caldo tetrationato y en caldo selenito-cistina y proceder según 5.5.3.7 y 5.5.4

b) Si en alguna placa no hay colonias bien aisladas, cin un asa de cultivo, sin rozar en el agar, tocar

solo el centro de la colonia seleccionada y sembrar en estría la superficie seca de placas individuales de agar cristal-violeta rojo-neutro bilis lactosa (o BG ó agar MacConkey), de tal manera que se obtengan colonias bien aisladas.

c) Invertir las placas e incubarlas a 37°C por 20 a 24 horas. d) Elegir colonias incoloras (lactosa negativa), resembrarlas en tubos de agar nutritivo inclinado e

incubarlas a 37°C por 20 a 24 horas. e) Hacer extensiones a partir de los cultivos en agar nutritivo inclinado y teñirlas por el método de

Gram. Si se comprueba la pureza de los cultivos, utilizarlos para la confirmación bioquímica y serológica.

5.5.6 Confirmación bioquímica 5.5.6.1 Prueba exploratoria a) De los cultivos purificados (5.5.5.2.5) o, directamente de cada una de las colonias típicas (8.5.1),

evitando rozar en el agar selectivo, topar con la aguja solo en el centro y superficie de la colonia elegida.

b) Inocular en agar TSI y en agar LIA, inoculando primero un medio y, sin flamear la aguja, inocular

el segundo medio de la misma manera. Sembrar por picadura la columna del agar y la superficie inclinada en estría, tapar-los con un tapón flojo. En la columna del agar LIA, hacer dos picaduras (la columna de éste, debe ser de por los menos 3cm de altura y el sesgo corto).

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c) Incubar los tubos de TSI y LIA entre 35° y 37°C por 24 ± 2 horas y 48 ± 2 horas, respectivamente. d) Examinar conjuntamente los cambios en el TSI y en el LIA e interpretar de la siguiente manera:

Reacciones típicas:

Agar TSI Agar LIA

Columna: Columna:

Amarilla: reacción acida por fermentación de la glucosa

Púrpura: reacción alcalina; por descarboxilación de la lisina

Burbujas o grietas en el agar: gas a partir de la glucosa (la S.tiphy y S. gallinarum frementan sin producción de gas)

Ennegrecimiento; producción de H2S

Sin ennegrecimiento: sin producción de H2S Sin ennegrecimiento: sin producción de H2S

Ennegrecimiento: producción de H2S

Lengüeta: Roja o inalterada: reacción alcalina, sin fermentación de la lactosa y sacarosa

Amarilla: reacción ácida por utilización de la lactosa o sacarosa (menos del 1% de las Sanomelas fermentan la lactosa y la lengüeta será amarilla).

e) Purificar los cultivos mixtos en TSI o LIA siguiendo lo indicado en los numerales 5.5.5.2 5.5.6.2 Pruebas complementarias. A partir de cada cultivo purificado que presenta reacciones de presuntas salmonelas en agar TSI y LIA, realizar las siguientes pruebas: a) Prueba de la ureasa Sembrar en estría sobre la superficie de agar urea inclinadi (o caldo).

Incubar entre 24 y 48 horas a 37°C. La reacción es positiva cuando el color del medio cambia a risa más intenso o cereza intenso. El medio inalterado indica una reacción negativa: Las salmonelas dan reacción negativa.

b) Prueba de la lisina-decarboxilasa. Inocular en el fondo de la superficie líquida del caldo lisina-

decarboxilasa, vedar con vaselina líquida estéril. Incubar 24 horas a 37°C. La reacción es positiva cuando el color del medio es púrpura, el cambio a amarillo indica una reacción negativa. Si el color del medio no es púrpura ni amarillo, añadir una o dos gotas de una solución al 0,2% de púrpura de bromocresol y volver a leer: Las salmonelas dan reacción positiva.

c) Prueba de la β gelactosidasa

c.1) En un tubo estéril hacer una suspensión bacteriana densa con 0,5 cm3 de solución salina

estéril, agregar una gota de tolueno y agitar vigorosamente. Incubar el tubo en baño de agua a 37°C por 10 minutos. Añadir 0,25 cm

3 de la solución tamponada 0,0133M de ONPG, agitar e

incubar en baño de agua a 37°C por 24 horas. La reacción es positiva cuando aparece un color amarillo, frecuentemente la reacción suele ser apreciable antes de tres horas. Las salmonelas dan reacción negativa.

c.2) También se puede utilizar discos impregnados de ONPG que se los añade a la suspensión

bacteriana, luego, se agita el tubo delicadamente e incuba a 4 a 6 horas a 35°C. d) Prueba de Voges-Proskauer

d.1) Sembrar en un tubo de caldo glucosa fosfato (caldo MR- VP) el cultivo en análisis; incubar a 37°C por 24 a 48 horas.

d.2) Después de este periodo, añadir los siguientes reactivos cuidando de agitar el tubo después

de cada adición:

(Continua)

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d.2.1) Solución alcohólica de α naftol al 6%: 3 gotas d.2.2) Solución de KOH al 40%: 2 gotas d.2.3) Solución de creatina al 0,5%: 2 gotas (para acelerar la reacción, es opcional). d.3) Leer el resultado después de 4 horas, el color rosa-rojo rubí del medio indica una reacción

positiva y es negativa cuando permanece inalterado. Frecuentemente la reacción es apreciable a los 15 minutos. Las salmonelas dan reacción negativa.

e) Prueba del indol. Sembrar en un tubo de agua triptona el cultivo en análisis. Incubar 24 horas a

37°C adicionar al tubo 0,3 ó 0,3 cm3

del reactivo de Kovacs. La aparición de un color rojo obscuro en la capa del reactivo indica una reacción positiva, amarillo una reacción negativa. Las salmonelas son indol negativas.

f) Prueba de la fenilalanina-desaminasa. Sembrar en estría sobre la superficie inclinada de agar

felalanina. Incubar 24 horas a 37°C. Después de este período añadir unas gotas de solución de cloruro férrico 0,5 M. La reacción es positiva cuando aparece un color verde-azulado obscuro. Las salmonelas dan reacción negativa.

g) Prueba de la utilización del citrato. Sembrar en estría sobre la superficie inclinada de agar citrato

de Simmon. Incubar de 24 a 48 horas a 37°C. El cambio del color del medio a un azul fuerte indica una reacción positiva. La mayoría de kas salmonelas dan reacción positiva.

h) En la tabla 1 se resume las características bioquímicas y serológicas de la Salmonella. Cualquier

cultivo que no haya sido claramente identificado como perteneciente, o no, al género Salmonella se debe someter a pruebas bioquímicas adicionales tales como: pruebas relacionadas con aminoácidos, hidratos de carbono, resistencia al KCN, utilización de fuentes de carbono.

5.5.7 Confirmación serológica 5.5.7.1 Para la determinación en porta-objetos de los antígenos “O”, “H” y “Vi” de las salmonelas, utilizar cultivos puros de 18 a 24 h en agar nutritivo inclinado, no autoaglutinables, procedentes del crecimiento en TSI y LIA. Por este procedimiento, que a continuación se indica, no es posible la confirmación serológica de las cepas autoaglutinables (se aglutinan espontáneamente en ausencia de antisuero). 5.5.7.2 Análisis del antígeno somático “O” y capsular “V” a) Comprobar la eficacia de los antisueros, ensayando el antisuero con cultivos testigos conocidos. b) Preparar una suspensión densa del microorganismo en análisis, suspendiendo el crecimiento del

agar inclinado (5.5.7.1) aproximadamente 1 cm3

de solución fisiológica. Tener cuidado para asegurar una suspensión uniforme.

c) En una lámina de vidrio o en la cara interna de una placa Petri de vidrio marcar con un lápiz graso

secciones de alrededor 2,5 cm de lado. d) Poner una gota (0,05 cm

3) de la suspensión bacteriana (5.5.7.4) en cada una de dos secciones

marcadas, adyacentes. e) Colocar una gota de solución salina sobre una de las gotas de la suspensión bacteriana.

Utilizando un asa de cultivo limpia y estéril, mezclar bien. Es el control negativo de la suspensión bacteriana y no debe aglutinarse. Desechar el cultivo si hay aglutinación.

f) Colocar una gota del antisuero Salmonella O poly A sobre la otra oota de la suspensión

bacteriana, mezclar bien. Continuar con el poly B. g) Balancear el porta o la placa Petri, por 1 ó 2 minutos, evitar una evaporación excesiva. h) Observar la reacción contra un fondo negro, de preferencia con ayuda de una lupa. La

aglutinación positiva será rápida y completa. Una aglutinación retrasada o parcial considerarla negativa.

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i) Si se obtiene un resultado negativo con poly A o poly B, ensayar con el antisuero Salmonella Vi,

de la manera indicada. j) Si el cultivo se aglutina con el suero Salmonella Vi, calentar la suspensión bacteriana en baño de

agua hirviente durante 10 minutos y enfriar. Una vez fría, volver a ensayarla con el antisuero VI y con los antisueros O de grupo: D1 C1.

TABLA 1. Reacciones bioquímicas y serológicas de los miembros del género Salmonella

Prueba o substrato

Positiva Negativa

Reacción positiva, + o negativa, -

% medio de serotipos-que tienen esta reacción (1)

TSI glucosa-ácido

Columna amarilla

Columna roja + 100

TSI: glucosa-gas Burbujas grietas Sin burbujas ni grietas

+ 91,9

TSI: lactosa-ácido

Lengüeta amarilla

Lengüeta roja -(a) 99,2

TSI: sacarosa-ácido

Lengüeta amarilla

Lengüeta roja - 99,5

TSI:H2S Ennegrecimiento Sin ennegrecimiento

+ 91,6

Ureasa Color rojo púrpura

Color inalterato - 100

Decarboxilación de la lisina

Color púrpura Color amarillo + 94,6

β-galactosidasa Color amarillo Sin cambio -(a) 98,5

Voges Proskauer

Color rosa a rojo Color inalterado - 100

Indol Anillo púrpura (superficie)

Anillo amarillo - 98,9

Fenilalanina-desaminasa

Verde-azulado obscuro

Color inalterado - 100

Utilizacion de citrato

Crecimiento y color azul

Sin crecimiento y color inalterado

v 87,1

Suero polivalente "O"

Aglutina No aglutina + 100

Suero polivalente "H"

Aglutina No aglutina + 100

(1)+,-, indican que las reacciones son positivas o negativas en 1 o 2 días; v, variable. Estos porcentajes solo indican que no todas las cepas de Salmonella reaccionan conforme a lo calificado como + ó -. Estos porcentajes pueden variar de país a país y de producto alimenticio a producto alimenticio. El subgénero III de Salmonella (Arizona) puede dar reacciones lactosa y β-galactosidasa positivas; el subgénero II de Salmonella puede dar una reacción lactosa negativa, pero una reacción β-galactosidasa positiva.

k) Si el cultivo después de tratado por el calor no reacciona frente al antisuero Vi, pero reacciona con

el antisuero O de grupo D1, probablemente es Salmonella typhi y Samonella paratyphi C si reacciona con el antisuero O de grupo C1 . Confirmar estos resultados utilizando sueros monovalentes.

l) Si el cultivo calentado continúa reaccionando con el antisuero Vi, pero no con los antisueros O de

grupo, probablemente es un miembro del género Citrobacter y no es Salmonella. Confirmar este resultado mediante las pruebas bioquímicas, especialmente lisina-descarboxilasa y KCN.

m) Si el cultivo sin tratamiento térmico (5.5.7.2 i, 5.5.7.2 j) no se aglutina con el antisuero Vi, ensayar

la muestra con los demás antisueros Salmonella polivalentes O. n) Si hay aglutinación con algún antisuero polivalente y se desea identificar el serogrupo al que

pertenece, ensayar la muestra según lo indicado, pero utilizando los correspondientes antisueros O de grupo o monovalentes.

(Continua)

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5.5.7.3 Análisis de antígeno flagelar “H”. Utilizar cultivos puros (5.5.7.1) en agar nutritivo semisólido y ensayar la muestra según 5.5.7.1, pero utilizando antisueros H polivalentes o de grupo. 5.5.7.4 Clasificación de la reacción a) No específica, cuando hay aglutinación en ambas mezclas. La mezcla suspensión bacteriana x

solución fisiológica debe permanecer inalterada. b) Positiva, cuando los microorganismos se aglutinan en presencia de un antisuero. La mezcla

suspensión bacteriana x antisuero forma grumos. c) Negativa, cuando en presencia de un antisuero los microorganismos no se aglutinan,

permaneciendo inalterada la mezcla suspensión bacteriana por antisuero. 5.5.7.5 Interpretación de los resultados a) Son consideradas Salmonella aquellas cepas que presentan reacciones bioquímicas típicas (tabla

1) y dan reacciones serológicas según 5.5.7.2 y 5.5.7.3. b) Pueden ser Salmonella aquellas cepas que presentan reacciones bioquímicas típicas según la

tabla 1, pero no dan reacciones serológicas positivas según 5.5.7.2 y 5.5.7.3., cepas que no presentan reacciones bioquímicas típicas, pero dan reacciones serológicas positivas según 5.5.7.2 y 5.5.7.3. y las cepas autoaglutinables que dan reacciones bioquímicas típicas.

c) No son consideradas como Salmonella las cepas que no presentan reacciones bioquímicas

típicas (tabla 1) y reacciones positivas según 5.5.7.2 y 5.5.7.3. 5.5.7.6 Confirmación definitiva a) Enviar las cepas consideradas como Salmonella (8.7.5.1) y las cepas sospechosas de ser

Salmonella (8.7.5.2) a un Laboratorio de Referencia para Salmonella reconocido para que sean definitivamente tipificadas. Este envío debe ir acompañado de toda la información posible de la cepa (s).

5.6 Cálculos 5.6.1 Si en ninguna de las placas de agar selectivo sembradas con el cultivo de enriquecimiento selectivo, se desarrolla colonia alguna de Salmonella, reportar: “No se aisló Salmonella en 25g (u otra cantidad) de muestra examinada; el medio sólido selectivo secundario fue (SS, bismuto sulfito…)”. 5.6.2 Si a partir de uno, o de ambos medios de enriquecimiento selectivo, se aisla Salmonella en las placas de agar selectivo, reportar: “Se aisló Salmonella en 25g (u otra cantidad) de muestra examinada, el medio(s) de enriquecimiento selectivo fue…; el medio(s) sólido selectivo secundario fue…; las pruebas bioquímicas realizadas fueron…; los antisueros con que se aglutinó fueron:…, la marca…”

6. INFORME DE RESULTADOS 6.1 En el informe del ensayo reportar el resultado como se indica en el numeral 9. Además, indicar la norma de referencia y el nombre exacto del Centro donde se identificó la cepa. 6.2 Indicar cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional. El reporte debe incluir todos los detalles necesarios para la completa identificación de la muestra. .

(Continúa)

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ANEXO A

DETECCIÓN DE SALMONELLA

(Continúa)

NTE INEN 1529-15 2013-09

2013-1077 -13-

(Continúa)

NTE INEN 1529-15 2013-09

2013-1077 -14-

(Continúa)

NTE INEN 1529-15 2013-09

2013-1077 -15-

APÉNDICE Z

Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1 529-1 Control microbiológico de los alimentos.

Preparación de medios de cultivo. Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1 529-2 Control microbiológico de los alimentos. Toma,

envío y preparación de muestras para el análisis microbiológico

Z.2 BASES DE ESTUDIO Norma Internacional. ISO 19250:2010 Water quality -- Detection of Salmonella spp. Ginebra, 2010 Norma Internacional. ISO 6579:2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of Salmonella spp. Ginebra, 2002 Norma Internacional. ISO 6785:2001 (IDF 93: 2001) Milk and milk products -- Detection of Salmonella spp. Ginebra, 2001

http://www.iso.org/iso/home/store/catalogue_tc/catalogue_detail.htm?csnumber=29315

INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

Documento:

NTE INEN 1529-15

Primera revisión

TÍTULO: CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS

ALIMENTOS. SALMONELLA. METODO DE DETECCIÓN

Código:

AL 01.05-311

ORIGINAL:

Fecha de iniciación del estudio:

REVISIÓN:

Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 1995-10-24

Oficialización con el Carácter de Obligatoria

por Acuerdo No. 809 de 1995-12-26

publicado en el Registro Oficial No. 860 de 1996-01-11

Fecha de iniciación del estudio: 2012-07-30

Fechas de consulta pública: 2012-12-03 a 2013-01-02

Subcomité Técnico de:

Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: Integrantes del Subcomité:

NOMBRES:

Mediante compromiso presidencial N° 16364, el

Instituto Ecuatoriano de Normalización – INEN, en vista

de la necesidad urgente, resuelve actualizar el acervo

normativo en base al estado del arte y con el objetivo de

atender a los sectores priorizados así como a todos los

sectores productivos del país.

Para la revisión de esta Norma Técnica se ha

considerado el nivel jerárquico de la normalización,

habiendo el INEN realizado un análisis que ha

determinado su conveniente aplicación en el país.

La Norma en referencia ha sido sometida a consulta

pública por un período de 30 días y por ser considerada

EMERGENTE no ha ingresado a Subcomité Técnico.

INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

Otros trámites: Esta NTE INEN 1529-15:2013 (Primera revisión), reemplaza a las NTE INEN 1529-15:1996.

La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma

Oficializada como: Voluntaria Por Resolución No. 13285 de 2013-08-13

Registro Oficial No. 83 de 2013-09-18

Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8-29 y Av. 6 de Diciembre

Casilla 17-01-3999 - Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 - Fax: (593 2) 2 567815 Dirección General: E-Mail:[email protected]

Área Técnica de Normalización: E-Mail:[email protected] Área Técnica de Certificación: E-Mail:[email protected] Área Técnica de Verificación: E-Mail:[email protected]

Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E-Mail:[email protected] Regional Guayas: E-Mail:[email protected] Regional Azuay: E-Mail:[email protected]

Regional Chimborazo: E-Mail:[email protected] URL:www.inen.gob.ec

Quito - Ecuador

NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 456:2013 Primera revisión

CAMARONES O LANGOSTINOS CONGELADOS. REQUISITOS

Primera edición SALT-WATER PRAWN AND SHRIMPS FREEZED. REQUIREMENTS.

First edition

DESCRIPTORES: Pesca y productos de la pesca. AL 03.03-404 CDU: 637.56.664 CIIU: 3114 ICS: 67.120.30

CDU: 637.56.664 CIIU: 3114

ICS: 67.120.30 AL 03.03-404

2013-074 -1-

Norma Técnica

Ecuatoriana Voluntaria

CAMARONES O LANGOSTINOS CONGELADOS

REQUISITOS

NTE INEN 456:2013

Primera revisión 2013-01

1. OBJETO

1.1 Esta norma establece los requisitos que deben cumplir los camarones o langostinos congelados.

2. ALCANCE 2.1 Esta norma se aplica a los camarones o langostinos congelados, crudos o precocidos, pelados o sin pelar, tanto de origen pesquero y de acuicultura.

3. DEFINICIONES 3.1 Para los efectos de esta norma, se adoptan las siguientes definiciones (ver nota 1): 3.1.1 Camarón y langostino congelado. Producto obtenido de especies de las siguientes familias: - Penaeidae - Pandalidae - Crangonidae - Palaemonidae - Nephropidae - Solenoceridae 3.1.2 Glaseado. Capa protectora delgada de hielo de agua potable, que recubre la superficie del producto dándole un aspecto brillante. 3.1.3 Camarones o langostinos enteros congelados Head on. Productos que se presentan con cefalotórax (cabeza), abdomen y caparazón, que han sido sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos. 3.1.4 Colas de camarones o langostinos congelados Shell on. Productos a los que se les ha eliminado el cefalotórax (cabeza) y presentan el abdomen con caparazón, sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos. 3.1.5 Colas peladas de camarones o langostinos congelados Tail on. Productos a los que se les ha eliminado el cefalotórax (cabeza) y presenta caparazón, solo en el último segmento incluido el telson, sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos. 3.1.6 Colas peladas de camarones o langostinos congelados Shell off (PUD). Productos a los que se les ha eliminado el cefalotórax (cabeza) y sin caparazón en el abdomen, sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos 3.1.7 Colas peladas y devenadas de camarones o langostinos congelados P&D. Productos sin los intestinos, sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos. 3.1.8 Colas devenadas de camarones o langostinos. Productos sin los intestinos y con el caparazón, sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos. 3.1.9 Colas peladas y devenadas de camarones o langostinos congelados corte mariposa. Productos en los cuales se ha retirado todo el caparazón de la cola y la aleta (uropodo), al igual que la vena, hasta el último segmento mediante un corte longitudinal, a lo largo del eje dorsal, dejándolos abiertos y desprovistos de los intestinos, sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos, con telson o sin telson. ___________ NOTA 1. Estas definiciones se refieren a las presentaciones más comunes en el mercado, sin embargo no se excluye que puedan existir en otras presentaciones o en una mezcla de las definidas en 3.1.

(Continua) _________________________________________________________________________________ DESCRIPTORES: Pesca y productos de la pesca

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=es&prev=/search%3Fq%3D-%2509Hymenopenaeus%26hl%3Des%26biw%3D1024%26bih%3D544%26prmd%3Dimvns&rurl=translate.google.com.ec&sl=fr&u=http://fr.wikipedia.org/wiki/Solenoceridae&usg=ALkJrhjkP3R-_TztxEcr3uCxkkzQJjcGGw

NTE INEN 456 2013-01

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3.1.10 Colas en trozos o trocitos de camarones o langostinos congelados. Porciones de colas de camarones o langostinos, desprovistos de caparazón, de tamaño variable, sometidos a un proceso de congelación, pueden ser crudos o precocidos.

4. CLASIFICACIÓN 4.1 De acuerdo con el tamaño este producto se clasifica en:

a) Extra grande b) Grande c) Mediano d) Pequeño

5. DISPOSICIONES GENERALES 5.1 Los productos contemplados por las disposiciones de la presente norma se deben preparar y manipular de conformidad con lo establecido en el Reglamento de Buenas Prácticas de Manufactura para alimentos procesados del Ministerio de Salud Pública y con los requisitos sanitarios mínimos que deben cumplir las industrias pesqueras y acuícolas. 5.2 El producto debe prepararse con camarones o langostinos sanos, limpios y comestibles, perteneciente a una de las familias enumeradas en el numeral 3.1.1 y debe manipularse desde la captura en condiciones sanitarias apropiadas, libres de arena o de otra materia extraña. 5.3 El agua utilizada para la cocción y la refrigeración debe ser potable. 5.4 El proceso de congelación debe realizase en un equipo apropiado, de manera que atraviese rápidamente el intervalo de temperaturas de cristalización máxima. El proceso de congelación no se considerará completo hasta que el producto alcance una temperatura de -18 °C o inferior en el centro térmico, una vez estabilizada la temperatura. 5.5 Se recomienda que el producto al que se aplican las disposiciones de la presente norma se prepare y manipule en conformidad con las secciones apropiadas del Plan Nacional de Control, Código Internacional de Prácticas - Principios Generales de Higiene de los Alimentos (CAC/RCP 1-1969) y los siguientes códigos afines: 5.5.1 CAC/RCP 8-1976 Código de Prácticas para la Elaboración y Manipulación de Alimentos Congelados Rápidamente. 5.5.2 CAC/RCP 52-2003 Código de prácticas para el pescado y los productos pesqueros.

6. REQUISITOS

6.1 Requisitos específicos 6.1.1 El olor, color y sabor deben ser los característicos del producto. No se permiten olores o sabores objetables persistentes e inconfundibles que sean signo de descomposición o característicos de los piensos utilizados en la alimentación de camarones o langostinos.

6.1.2 De acuerdo a la clasificación por tamaño las unidades de colas de camarones y langostinos por cada 500 g son las que se indican en la tabla 1.

(Continua)

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Tabla No. 1 Unidades de colas de camarones y langostinos por cada 500 g

Tamaño Conteo (con referencia al peso de las colas)

Unidades promedio en 500 gramos

Extra grande

U-8 (langostino) 6

U-10 (langostino) 7

U-12 (langostino) 9

Grande

U-15 (langostino) 14

16/20 (langostino) 18

21/25 23

Mediano

26/30 28

31/35 33

36/40 38

Pequeño

41/50 45

51/60 55

61/70 65

71/90 80

91/110 101

111/150 130

151/250 200

6.1.3 Los camarones o langostinos congelados, ensayados de acuerdo a las normas ecuatorianas correspondientes, deben cumplir con los requisitos establecidos en la tabla 2.

Tabla 2. Requisitos para los camarones y langostinos congelados

Requisito mín. máx. Método de ensayo

Nitrógeno básico volátil total mg/100g

- 30 NTE INEN 182

Metabisulfito de sodio, mg/kg

- 150 AOAC 990.28

6.1.4 Requisitos microbiológicos 6.1.4.1 Los productos deben estar exentos de microorganismos patógenos y sustancias tóxicas producidas por estos, que puedan ocasionar un peligro para la salud. 6.1.4.2 Los productos deben cumplir con lo indicado en la tabla 3 o 4 según corresponda.

Tabla 3. Requisitos microbiológicos para los camarones y langostinos crudos congelados

Requisito n m M c Método de ensayo

Recuento de microorganismos mesófilos, ufc/g

5 5 x 104

1 x 10

5

3 AOAC 990.12

E. coli ufc/g 5 < 10

10

2 AOAC 998.08

Staphylococcus aureus coagulasa positiva, ufc/g

5 100 1000 2 AOAC 2003.11

Salmonella /25g 5 no detectado - 0 NTE INEN 1529-15

Vibrio cholerae/25 g 5 no detectado - 0 ISO/TS 21872-1

Vibrio parahaemolyticus/25 g 5 no detectado ISO/TS 21872-1

(Continua)

NTE INEN 456 2013-01

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Tabla 4. Requisitos microbiológicos para los camarones y langostinos precocidos congelados

Requisito n m M c Método de ensayo

Recuento de microorganismos mesófilos, ufc/g

5 1 x 104

1 x 105

2 AOAC 990.12

E. coli ufc/g 5 < 10

10

1 AOAC 998.08

Staphylococcus aureus coagulasa positiva, ufc/g

5 100 1000 2 AOAC 2003.11

Salmonella /25g 5 no detectado - 0 NTE INEN 1529-15

Vibrio parahaemolyticus /25 g 5 no detectado - 1 ISO/TS 21872-1

Lysteria monocitogenes 25 g 5 no detectado - 0 ISO/TS 21872-1

donde

n: Número de muestras a examinar. m: Índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad. M: Índice máximo permisible para identificar nivel aceptable de calidad. c: Número de muestras permisibles con resultados entre m y M.

6.1.4 Aditivos

6.1.4.1 Se permite el uso de los aditivos enlistados en la NTE INEN 2074.

6.1.5 Contaminantes

6.1.5.1 El límite máximo de contaminantes no debe superar lo establecido en la tabla 5.

Tabla No. 5 Límite máximo de contaminantes

CONTAMINANTE

LÍMITE MÁXIMO

mg/kg

MÉTODO DE ENSAYO

Mercurio, como Hg 0,5 AOAC 974.14

Cadmio como Cd 0,5 AOAC 999.10

Plomo, como Pb 0,5 AOAC 999.10

Hidrocarburos aromáticos policiclicos (en productos no ahumados), Benzo pireno, µg/kg

2,0

HPLC – DAD HPLC - FL cromatografía de gases -FID

6.1.5.2 El límite máximo de residuos de medicamentos veterinarios, en los camarones o langostinos de producción acuícola, son los en la tabla 6.

(Continua)

NTE INEN 456 2013-01

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Tabla No. 6 Residuos de medicamentos veterinarios

MEDICAMENTO LIMITE MÁXIMO MÉTODO DE ENSAYO

Cloranfenicol, µg/kg (límite máximo residual)

0,3 LC – MS/MS Cromatografía de gases –MS/MS

Nitrofurano, µg/kg (AMOZ;AOZ;AHD,SEM)

1,0 LC – MS/MS

- Tetraciclina, µg/kg - Oxitetraciclina, µg/kg - Clortetraciclina, µg/kg

100 100 100

HPLC - DAD

Sulfonamidas, µg/kg - Sulfanimalida - Sulfametacina - Sulfadiacina - Sulfameracina - Sulfatiazol

100 100 100 100 100

HPLC - DAD

Quinolonas, µg/kg - Enrofloxacina - Ácido oxolilico - Danafloxacina - Flumequina

100 100 100 200

HPLC – FLD

Florfenicol, µg/kg 100 HPLC – MS/MS

Verde malaquita más leuco verde malaquita, µg/kg

2,0 HPLC – MS/MS

6.1.5.3 El límite máximo de residuos de plaguicidas, en los camarones o langostinos de producción acuícola son los establecidos en la tabla 7.

Tabla No. 7 Residuos de plaguicidas

Plaguicidas

Límite máximo

Método de ensayo

Compuestos Organoclorados incluidos PCBs Dioxinas pg/g

- EQT - PCDD - F-PCB

8

Cromatografía de gases - ECD

- Hecta cloro, µg/kg - Aldrín, µg/kg - Cloradano iso A, µg/kg - Cloradano iso B, µg/kg - DDE + 3,4,4’,5-tetracloro bifenil, , µg/kg - 3,4,4’,5-tetracloro bifenil + Dieldrín - 2,3’,4,4’ pentacloro bifenilo - 2’,3,4,4’ pentacloro bifenil - DDD + 2,3,4,4’,5 tetraclorobifenilo - 2,3,4,4’,5 tetraclorobifenilo - DDT - 3,3’,4,4’,5 pentacloro bifenilo - 2,3,3’,4,4’,5 hexacloro bifenilo - 2,3’,4,4’,5,5’ hexacloro bifenilo - 3,3’,4,4’,5,5’ hexacloro bifenilo

200 200 50 50 15 15 15 15 15 15

1 000 15 15 15 15

Cromatografía de gases - ECD

6.2 Requisitos complementarios 6.2.1 Las unidades de comercialización de estos productos deben cumplir con lo dispuesto en la Ley del Sistema Ecuatoriano de la Calidad.

7. INSPECCIÓN 7.1 Muestreo. El muestreo debe realizarse de acuerdo con Codex Alimentarius CAC/GL 50-2004. 7.2 Criterios de aceptación o rechazo 7.2.1 Se acepta el producto si cumple con los requisitos establecidos en esta norma, caso contrario se rechaza.

(Continúa)

NTE INEN 456 2013-01

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8. ENVASADO Y EMBALADO 8.1 Los camarones y langostinos congelados se prepararán y envasarán de manera que la deshidratación y la oxidación sean mínimas. 8.2 El material del envase debe ser resistente a la acción del producto, de manera que no altere su composición y su calidad organoléptica. 8.3 El envasado y el embalaje debe hacerse en condiciones que mantengan las características del producto y aseguren su inocuidad durante el almacenamiento, transporte y expendio. 8.4 El producto se mantendrá en congelación (-18 °C) de modo que mantenga su calidad durante el transporte, el almacenamiento y la distribución.

9. ROTULADO 9.1 El rotulado de estos productos deben cumplir con lo establecido en el RTE INEN 022. 9.2 Los productos se denominarán "precocidos" o "crudos", según corresponda. 9.3 En la etiqueta se debe declarar si el producto es de pesca o acuicultura. 9.4 Se indicará en la etiqueta que el producto debe conservarse en condiciones que mantengan su calidad durante el transporte, el almacenamiento y la distribución.

(Continúa)

NTE INEN 456 2013-01

2013-074 -7-

APENDICE Z

Z.1 NORMAS A CONSULTAR

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 182 Conservas envasadas de pescado. Determinación de nitrógeno básico volátil.

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 783 Carne y productos cárnicos. Determinación del pH.

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-5 Control microbiológico de los alimentos. Determinación de la cantidad de microorganismos aerobios mesófilos. REP.

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-8 Control microbiológico de los alimentos. Determinación de los coliformes fecales y E. coli.

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-14 Control microbiológico de los alimentos.Staphylococcus aureus. Recuento en placa de siembra por extensión en superficie.

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-15 Control microbiológico de los alimentos. Salmonella. Método de detección.

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 2074 Aditivos alimentarios permitidos para consumo humano. Listas positivas. Requisitos. Segunda revision.

Norma ISO/TS 21872-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. – Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae.

AOAC Official Method 974.14 Mercury in Fish. Alternative Digestion Method. AOAC Official Method 999.10 Lead, Cadmiun, Zinc, Copper and Iron in Foods

Atomic Absorption Spectrophotometry after microwave digestion.

AOAC Official Method 990.12 Aerobic Plate Count in Foods. Dry Rehydratable film Method.

AOAC Official Method 990.28 Sulfites in foods. Optimized Monier-Williams Method.

AOAC Official Method 998.08 Confirmed Escherichia coli counts in poultry, meats and seafoods. Dry rehydratable film method.

AOAC Official Method 2003.11 Enumeration of staphylococcus aureus in Select meat, seafoods and poultry. Petrifilm Staph Express count plate method.

Reglamento Técnico Ecuatoriano RTE INEN 022 Rotulado de productos alimenticios procesados, envasados y empacados.

Decreto Ejecutivo No. 3253 Reglamento de Buenas Prácticas de Manufactura para alimentos procesados. Publicado en el Registro Oficial No. 696 del 4 de noviembre de 2002. Ley No. 2007-76 Ley del Sistema Ecuatoriano de la Calidad, publicada en Registro Oficial No. 26 del 22 de febrero de 2007. CAC/RCP 1 Código Internacional Recomendado de Prácticas - Principios Generales de Higiene de los Alimentos. CAC/RCP 16-1978 Código Internacional Recomendado de Prácticas para el Pescado Congelado. CAC/RCP 17-1978 y suplemento de noviembre de 1989 Código Internacional Recomendado de Prácticas para los Camarones. CAC/RCP 8-1976 Código Recomendado de Prácticas para la Elaboración y Manipulación de Alimentos Congelados Rápidamente. CAC/GL 50-2004 Directrices generales sobre muestreo.

(Continua)

NTE INEN 456 2013-01

2013-074 -8-

CAC/RCP 52-2003 Código de prácticas para el pescado y los productos pesqueros, adoptado en 2003. Revisión 2004, 2005, 2007, 2008, 2010, 2011. INSTITUTO NACIONAL DE PESCA. Plan Nacional de Control, Para el ofrecimiento de garantías oficiales respecto a la exportación de productos pesqueros y acuícolas de la Republica del Ecuador a la Unión Europea Septiembre 6 de 2006. Acuerdo Ministerial No. 241, Requisitos sanitarios mínimos que deben cumplir las industrias pesqueras y acuícolas, publicado en Registro Oficial No. 228 del 5 de julio de 2010.

Z.2 BASES DE ESTUDIO NORMA DEL CODEX PARA LOS CAMARONES CONGELADOS RÁPIDAMENTE CODEX STAN 92-1981, Rev. 1-1995. Norma Andina NA 0043 2008-02-04 PRODUTOS DE LA PESCA Y LA ACUICULTURA. Camarones y langostinos. REGLAMENTO (CE) no 2073/2005 DE LA COMISIÓN de 15 de noviembre de 2005 Relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios. INSTITUTO NACIONAL DE PESCA. Plan Nacional de Control, Para el ofrecimiento de garantías oficiales respecto a la exportación de productos pesqueros y acuícolas de la Republica del Ecuador a la Unión Europea. Septiembre 6 de 2006. Acuerdo ministerial No. 241 Requisitos sanitarios mínimos que deben cumplir las industrias pesqueras y acuícolas, publicado en Registro Oficial No. 228 del 5 de julio de 2010.

INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

Documento:

NTE INEN 456

Primera revisión

TITULO: CAMARONES O LANGOSTINOS CONGELADOS.

REQUISITOS

Código:

AL 03.03-404

ORIGINAL:

Fecha de iniciación del estudio:

REVISIÓN:

Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 1980-11-28

Oficialización con el Carácter de Obligatoria

por Acuerdo No. 215 de 1981-03-04

publicado en el Registro Oficial No. 416 de 1981-04-09

Fecha de iniciación del estudio: 2012-04

Fechas de consulta pública: de 2012-05-03 a 2012-05-17

Subcomité Técnico: PESCADO Y PRODUCTOS PESQUEROS

Fecha de iniciación: 2012-05-21 y 22 Fecha de aprobación: 2012-05-21 y 22

Integrantes del Subcomité Técnico: NOMBRES:

2012-05-21

Ing. Fernanda Hurtado (Presidenta)

Ing. Gladys Niza

Dr. Eduardo Solís

Ing. Jorge Correa

Ing. Valentina Ortega

Ing. Edgar Benítez

Dra. Rocío Trejos

Ing. Sully Stacio

Dra. Luisa Ponguillo

Dra. Nancy Llanga

Dr. Leonardo Maridueña

Ing. Félix Martínez

Ing. Isaías Suarez

Ing. Lourdes Lata

Dra. Inés Chiriboga

Ing. Nohelia Vásquez

Ing. María E. Dávalos (Secretaria Técnica)

2012-05-22

Ing. Fernanda Hurtado (Presidenta)

Ing. Gladys Niza

Dr. Eduardo Solís

Ing. Jorge Correa

Ing. Valentina Ortega

Ing. Edgar Benítez

Dra. Rocío Trejos

Ing. Sully Stacio

Dra. Luisa Ponguillo

Dra. Nancy Llanga

Ing. Félix Martínez

Ing. Isaías Suarez

Ing. Lourdes Lata

Dra. Inés Chiriboga

Ing. Lorena Castro

Ing. Nelson Bautista

Ing. Nohelia Vásquez

Ing. María E. Dávalos (Secretaria Técnica)

INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

INSTITUTO NACIONAL DE PESCA

MIPRO – SUBSECRETARÍA GUAYAS







INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE, Guayaquil


CÁMARA NACIONAL DE ACUACULTURA

PRONACA

MARDEX S.A.

EXPANSION CORP.

TROPACK

INEN – REGIONAL GUAYAS

INEN – REGIONAL CHIMBORAZO


MIPRO – SUBSECRETARÍA GUAYAS









PRONACA

MARDEX S.A.

EXPANSION CORP.

TROPACK

EDPACIFIC S.A.



INEN – REGIONAL CHIMBORAZO

Otros trámites: Esta NTE INEN 456:2013 (Primera revisión), reemplaza a la NTE INEN 456:1980

♦10 Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de OBLIGATORIA a

VOLUNTARIA, según Resolución Ministerial y oficializada mediante Resolución No. 14158 de 2014-04-21, publicado en

el Registro Oficial No. 239 del 2014-05-06.

La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma

Oficializada como: Obligatoria Por Resolución No.12 304 de 2012-12-17

Registro Oficial No. 868 de 2013-01-11

Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8-29 y Av. 6 de Diciembre

Casilla 17-01-3999 - Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 - Fax: (593 2) 2 567815 Dirección General: E-Mail:[email protected]

Área Técnica de Normalización: E-Mail:[email protected] Área Técnica de Certificación: E-Mail:[email protected] Área Técnica de Verificación: E-Mail:[email protected]

Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E-Mail:[email protected] Regional Guayas: E-Mail:[email protected] Regional Azuay: E-Mail:[email protected]

Regional Chimborazo: E-Mail:[email protected] URL:www.inen.gov.ec

3M™ Petrifilm™ Plate Certificates, Recognitions and Validations3M Microbiology is certified to ISO-9001 for design and manufacturing

AFNOR

All foods Aerobic Count Plates AFNOR Certificate Number 3M 01/1-09/89 (as compared to ISO 4833 method)

All foods (except raw shellfish) Coliform Count Plates 24 hour total coliform result

AFNOR Certificate Number 3M 01/2-09/89A (as compared to ISO 4832 VRBL method)

All foods (except raw shellfish) Coliform Count Plates 24 hour total coliform result

AFNOR Certificate Number 3M 01/2-09/89B (as compared to ISO 4831 MPN method)

All foods Coliform Count Plates 24 hour thermotolerant coliform result

AFNOR Certificate Number 3M 01/2-09/89C (as compared to V08-060 VRBL at 44°C method)

All foods Select E. coli Count Plates AFNOR Certificate Number 3M 01/8-06/01 (as compared to ISO 16649-2 E. coli method)

All foods Rapid Coliform Count Plates 14 hour result (Incubate at 30°C for processed pork products)

AFNOR Certificate Number 3M 01/5-03/97A (as compared to ISO 4832 VRBL 30°C method)

All foods Rapid Coliform Count Plates 24 hour result (Incubate at 30°C for processed pork products)

AFNOR Certificate Number 3M 01/5-03/97B (as compared to ISO 4832 VRBL 30°C method)

All foods (except processed pork products) Rapid Coliform Count Plates 24 hour result (Incubate at 30°C for seafood products)

AFNOR Certificate Number 3M 01/5-03/97C (as compared to ISO 4831 MPN method)

All foods Enterobacteriaceae Count Plates AFNOR Certificate Number 3M 01/6-09/97 (as compared to ISO 21528 part 2 VRBG method)

All foods High-Sensitivity Coliform Count Plates AFNOR Certificate Number 3M 01/7-03/99 (as compared to ISO 4831 MPN method)

All foods Staph Express Count System AFNOR Certificate Number 3M 01/9-04/03 (as compared to EN ISO 6888-1 method)

AOAC® INTERNATIONAL Official Method of AnalysisSM

Raw and pasteurized milk Aerobic Count, Coliform Count Plates Method 986.33

Dairy products Aerobic Count, Coliform Count Plates Method 989.10

High-Sensitivity Coliform Count Plates Method 996.02

Foods Aerobic Count Plates Method 990.12

Coliform Count, E. coli/Coliform Count Plates Method 991.14

Yeast and Mold Count Plates Method 997.02

Rapid Coliform Count Plates Method 2000.15

Poultry, meats and seafood E. coli/Coliform Count Plates Method 998.08

Selected foods Rapid S. aureus Count System Method 2001.05

Enterobacteriaceae Count Plates Method 2003.01

Selected processed and prepared foods Staph Express Count System Method 2003.07

Selected dairy foods Staph Express Count System Method 2003.08

Selected poultry, meats and seafood Staph Express Count System Method 2003.11

AOAC® INTERNATIONAL Research InstituteSM

Environmental sampling Environmental Listeria Plates Certification No. 030601

INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION (FIL/IDF)

Dairy products Bulletins 285/1993 and 350/2000

International Recognition


AustraliaDepartment of Agriculture and Fisheries – Australian Quarantine and Inspection Services (AQIS)

ESAM (Carcass Sampling) Aerobic Count Plates Section 4

Meat and Meat Products Methods E. coli/Coliform Count Plate Microbiological Methods for Meat Products for Export

Victorian Dairy Industry Authority (VDIA)

Milk and dairy products Aerobic Count Plates Certificate Number 9503

Coliform Count Plates Certificate Number 9504

BrazilMinistry of Agriculture

Carcass sampling E. coli/Coliform Count Plates IN 40, 2005

CanadaHealth Protection Branch, Compendium of Analytical Methods

Laboratory Procedures:Environmental Sampling

Aerobic Count, Coliform Count, E. coli/Coliform Count, and Yeast and Mold Count Plates

Method MFLP-41A

High-Sensitivity Coliform Count Plates Method MFLP-41B

Environmental Listeria Plates Method MFLP-11

Dairy Products High-Sensitivity Coliform Count Plates Method MFLP-85

Food products and environmental sampling Staph Express Count System Method MFLP-21

Health Protection Branch Methods:

Food products and ingredients Aerobic Count Plates Method MFHPB-33

Coliform Count Plates Method MFHPB-35

E. coli/Coliform Count Plates Method MFHPB-34

Yeast and Mold Count Plates Method MFHPB-32

ChileSAG (Chile Department of Agriculture)

Carcass sampling E. coli/Coliform Count Plates January 2004

ColumbiaIMVIMA

Aerobic Count Plates Certificate No. 2006021775

Coliform Count Plates Certificate No. 2006021761

E. coli/Coliform Count Plates Certificate No. 2006021644

Enterobacteriaceae Count Plates Certificate No. 2006021776

Staph Express Count System Certificate No. 2006021784

Yeast and Mold Count Plates Certificate No. 2006021773

El SalvadorMinistry of Public Health & Social Attendance Central Control Laboratory of Foods and Waters

Use in foods Aerobic Count Plates, Coliform Count Plates, E. coli/Coliform Count Plates, Enterobacteriaceae Count Plates, Staph Express Count Plate System, Yeast & Mold Count Plates

July 2006

France AFNOR (see International Validations)

Recognition by Country


GermanyDIN (Deutsches Institut für Normung) Fachbericht 81 Petrifilm Technik

Foods Aerobic Count, Coliform Count, E. coli/Coliform Count, and Enterobacteriaceae Count Plates

2000 Edition

JapanFood Hygiene Manual

Foods Aerobic Count, Coliform Count, E. coli/Coliform Count, Rapid Coliform Count Plates; Staph Express Count Systems

July 2004

Ministry of Health, Labour and Welfare

Carcass (cattle and swine) swab E.coli/Coliform Count Plates Notification No. 25

Korea KCFR (Korea Code of Federal Regulatory) KFDA2004

All foods Aerobic Count Plates Method 7.8.2.2

Coliform Count Plates Method 7.8.5.4

E. coli/Coliform Count Plates Method 7.8.6.3

MexicoMilk and dairy products Aerobic Count Plates, Coliform Count Plates, E. coli/Coliform

Count Plates, Staph Express Count Systems, Yeast and Mold Count Plates

NMX-F-717-COFOCA LEC-2006

New Zealand AgResearch – Mirinz Meat Industry Microbiological Methods, Edition Four, March 2005

Meat Products Aerobic Count Plates Chapter 6 – Section 6.8

Staph Express Count System (for use with selected foods) Chapter 7 – Section 7.8.5

Enterobacteriaceae Count Plates Chapter 8 – Section 8.2.5

E. coli/Coliform Count Plates Chapter 8 – Section 8.4.5

New Zealand Food Safety Authority

Dairy produce and products Aerobic Count Plates, Coliform Count Plates, E. coli/Coliform Count Plates, Staph Express Count System, Yeast and Mold Count Plates

Approved Methods Lists

National Microbiological Database (farmed animals)

Aerobic Count Plates Chapter 4 – 4.7.3

E. coli/Coliform Count Plates Chapter 4 – 4.8

Nordic Countries NordVal Validation

All foods Aerobic Count Plate Ref. No. 2005-30-5408-00043

Coliform Count Plate Ref. No. 2005-30-5408-00044

E. coli/Coliform Count Plate Ref. No. 2005-30-5408-00045

Yeast and Mold Count Plate Ref. No. 2005-30-5408-00046

Staph Express Count System Ref. No. 2005-30-5408-00047

Enterobacteriaceae Count Plate Ref. No. 2006-30-5408-00057

Select E. coli Count Plate Ref. No. 2006-30-5408-00058

Poland PKN (Polish Normalisation Committee)

Raw milk and dairy products Petrifilm Plates may be used as a method for: • Enumeration of total aerobic microorganisms • Enumeration of coliform microorganisms • Enumeration of Escherichia coli microorganisms • Enumeration of yeast and mold

Commission No. 35 July 1, 1999

Recognition by Country (cont.)


Method approval by private or public organizations (e.g., AOAC INTERNATIONAL or AFNOR) does not guarantee the performance of Petrifilm Plates for any particular food product or process.

To order Petrifilm plates in the U.S., call 1-800-328-1671.

3M Microbiology 3M Center, Building 275-5W-05St. Paul, MN 55144-1000USA1-800-328-6553www.3M.com/microbiology

3M CanadaPost Office Box 5757London, Ontario N6A 4T1Canada1-800-563-2921

3M Europe & MEA3M Deutschland GmbHCarl - Schurz - Strasse 1D41453 Neuss/Germany+49-2131-143000

Latin America3M Center, Building 275-5W-05St. Paul, MN 55144-10001-651-737-2239

3M AsiaPacific9 Tagore LaneSingapore 78747265-6458611

3M Japan31-1, Tamagaradai, 2-ChromeSetagaya-Ku, Tokyo158-8583, Japan81-3-3709-8289

3M Australia/New Zealand9-15 Chilvers RoadThornleigh, NSW 2120Australia1300 363 878

3M and Petrifilm are trademarks of 3M Company.

Please recycle. Printed in U.S.A.© 3M 2007. All rights reserved.70-2008-5431-6

Republic of South AfricaMilk and Dairy Products Aerobic Count, Coliform and E. coli/Coliform Count Plates Government Gazette, No. R. 1555.21 of 21

November 1997

United KingdomCampden Food and Drink Research Association and Leatherhead Food Research Association study

EMMAS assessment 3M Petrifilm E. coli/Coliform Count Plate – 1998EMMAS assessment 3M Petrifilm Enterobacteriaceae Count Plate – 2003CMMAS assessment 3M Petrifilm Staph Express Count system – 2006CMMAS assessment 3M Petrifilm Yeast and Mould Count Plate – 2006

United StatesAOAC INTERNATIONAL (see International Recognition)APHA (American Public Health Association)

Foods Aerobic Count, Coliform Count, E. coli/Coliform Count, Enterobacteriaceae Count, High-Sensitivity Coliform Count, Lactic Acid Bacteria Method, Rapid Coliform Count, Yeast and Mold Count Plate

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th Edition 2001

Dairy Aerobic Count, Coliform Count, Enterobacteriaceae Count, E. coli/Coliform Count, High-Sensitivity Coliform Count, Rapid Coliform Count, Yeast and Mold Count Plate

Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th Edition 2004

USDA (United States Department of Agriculture) Agricultural Marketing Service

Laboratory Methods and Procedures Aerobic Count Plates Dairy Grading Branch DA Instruction 918-RL

USDA FSIS (Food Safety and Inspection Service)

Beef, swine, sheep, goats, horses, mules and other equine carcass sampling

E. coli/Coliform Count Plates (Code of Federal Regulations) 9 CFR Part 310.25

Poultry, ducks, geese and guinea carcass sampling E. coli/Coliform Count Plates (Code of Federal Regulations) 9 CFR Part 381.94

Examination of fresh, refrigerated and frozen prepared meat, poultry and pasteurized egg products

Aerobic Count, E. coli/Coliform Count Plates Microbiology Laboratory Guidebook, 3rd Edition 1998, Chapter 3

US FDA (United States Food and Drug Administration)

All foods Aerobic Count, Coliform Count and E. coli/Coliform Count Plates

FDA/BAM (Bacteriological Analytical Manual), 8th Edition Rev. A/1988, Chapter 4, Section VI and Appendix 1, table 4

Milk Aerobic Count, Coliform Count, High-Sensitivity Coliform Count Plates

FDA Milk Laboratory Evaluation Form 2400a, Revision 3/01

VenezuelaFoods E. coli/Coliform Count Plates Covenin 3276-97

Dairy products and foods Aerobic Count Plates Covenin 3338-97

Dairy products High-Sensitivity Coliform Count Plates Covenin 3339-97

Recognition by Country (cont.)

Published on 3M Newsroom | United States (http://news.3m.com) on 5/19/14 7:07 am CDT

3M Petrifilm Salmonella Express System Receives FirstAOAC Official Methods of Analysis ValidationRelease Date:Monday, May 19, 2014 7:07 am CDT

Terms:Company Product and Brand

Dateline City: ST. PAUL, Minn.

3M Petrifilm Salmonella Express System is adopted as an officialmethod by AOAC INTERNATIONALST. PAUL, Minn.--(BUSINESS WIRE)--3M Food Safety announced today that its 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System hasbeen validated through AOAC INTERNATIONAL as a First Act ion Official Method of Analysis (OMA method number 2014.01) forthe detection of Salmonella in raw ground beef, cooked breaded chicken nuggets, raw ground chicken, raw ground pork,pasteurized liquid whole egg, fresh shrimp, fresh spinach, dry pet food and stainless steel. A complete review of the studyconducted for the AOAC-OMA validation will be published by the Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, onlineat http://eoma.aoac.org/ and in an upcoming edit ion of the Journal of AOAC INTERNATIONAL.

The 3M Petrifilm Salmonella Express System is an easy to use, all in one test method for Salmonella in food andenvironmental samples. Built on 3M Petrifilm technology that is used by 91 out of the 100 top U.S. food processingcompanies and by customers in all regions of the world, it was first introduced in June 2013 as a new addit ion to thecompany’s pathogen portfolio. Prior to launch, the product gained cert ificat ion from the AOAC Research Inst itute as aPerformance Tested MethodSM (PTM), cert ificat ion number 061301.

The Official Methods of Analysis, AOAC INTERNATIONAL’s premier, internationally recognized program for chemical, microbialand molecular biological test ing methods, consists of a mult i-laboratory validation of the method, and review by an expertpanel. Methods assigned AOAC-OMA Final Act ion status are used throughout the world by standards organizations that relyon OMA’s reputation for rigorous scientific and systematic scrutiny.

“Nearly half of pathogen tests focus on Salmonella,” said Tina Bauman, global marketing supervisor with 3M Food Safety. “3MPetrifilm Salmonella Express System provides food processors and reference laboratories presumptive results in as lit t le as40 hours and biochemically confirmed results in as lit t le as 44 hours and is a great example of 3M’s continuous efforts toprovide innovative and effect ive products to its customers.”

With the addit ion of the 3M Petrifilm Salmonella Express System, 3M Food Safety’s pathogen detection portfolio provides atotal solut ion, offering molecular, immunoassay and indicator test ing methods. Other solut ions include the highly innovative3M Molecular Detection System and the 3M Tecra Pathogen and Toxin Visual Immunoassay (VIA).

For more information, please visit www.3M.com/3MPathogenSolut ions/SALXOMA

AOAC INTERNATIONAL is a worldwide provider and facilitator in the development, use and harmonization of validatedanalyt ical methods. AOAC methods are used globally to promote trade and to facilitate public health and public safety.AOAC has two programs by which methods are evaluated and approved. These programs are the AOAC OMA and PTMprograms.

3M Food Safety is a leader of innovative solut ions that help the food and beverage industries optimize the quality andsafety of their products to enable consumer protection. At every step, 3M Food Safety provides solut ions that helpmit igate risk, improve operational efficiencies and impact the bottom line. For more information, visitwww.3M.com/FoodSafety or follow @3M_FoodSafety on Twitter.

About 3M3M captures the spark of new ideas and transforms them into thousands of ingenious products. Our culture of creativecollaboration inspires a never-ending stream of powerful technologies that make life better. 3M is the innovation companythat never stops inventing. With $31 billion in sales, 3M employs 89,000 people worldwide and has operations in more than 70countries. For more information, visit www.3M.com or follow @3MNews on Twitter.

3M, Petrifilm and Tecra are trademarks of 3M.

Language: English

Contact: Kohnstamm Communications for 3MAaron Berst ler, 651-789-1264

http://news.3m.com

http://news.3m.com/category/press-release-category/company

http://news.3m.com/category/press-release-category/product-and-brand

http://www.businesswire.com

http://cts.businesswire.com/ct/CT?id=smartlink&url=http%3A%2F%2Feoma.aoac.org%2F&esheet=50868040&newsitemid=20140519005304&lan=en-US&anchor=http%3A%2F%2Feoma.aoac.org%2F&index=1&md5=936c703fcbee2bd5e14030f2f25c9b07

http://cts.businesswire.com/ct/CT?id=smartlink&url=http%3A%2F%2Fwww.3M.com%2F3MPathogenSolutions%2FSALXOMA&esheet=50868040&newsitemid=20140519005304&lan=en-US&anchor=www.3M.com%2F3MPathogenSolutions%2FSALXOMA&index=2&md5=6ab6a774983b2652ba02d421b8b8520c

http://cts.businesswire.com/ct/CT?id=smartlink&url=http%3A%2F%2Fwww.3M.com%2FFoodSafety&esheet=50868040&newsitemid=20140519005304&lan=en-US&anchor=www.3M.com%2FFoodSafety&index=3&md5=d9a822467607caff38a0a324051d4dee

http://cts.businesswire.com/ct/CT?id=smartlink&url=http%3A%2F%2Ftwitter.com%2F3M_FoodSafety&esheet=50868040&newsitemid=20140519005304&lan=en-US&anchor=%403M_FoodSafety&index=4&md5=212840ababd9991da6e0099c06c82077

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Bird et al.: Journal of aoaC international Vol. 96, no. 6, 2013 1

Submitted for publication June 28, 2013.1 Corresponding author’s e-mail: [email protected] are available on the J. AOAC Int. website, http://aoac.

publisher.ingentaconnect.com/content/aoac/jaoacDOI: 10.5740/jaoacint.13-227

FOOD BIOLOGICAL CONTAMINANTS

The 3M™ Molecular Detection Assay (MDA) Salmonella is used with the 3M™ Molecular Detection System for the detection of Salmonella spp. in food, food-related, and environmental samples after enrichment. The assay utilizes loop-mediated isothermal amplification to rapidly amplify Salmonella target DNA with high specificity and sensitivity, combined with bioluminescence to detect the amplification. The 3M MDA Salmonella method was compared using an unpaired study design in a multilaboratory collaborative study to the U.S. Department of Agriculture/Food Safety and Inspection Service-Microbiology Laboratory Guidebook (USDA/FSIS-MLG 4.05), Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry, Pasteurized Egg and Catfish Products for raw ground beef and the U.S. Food and Drug Administration/Bacteriological Analytical Manual (FDA/BAM) Chapter 5 Salmonella reference method for wet dog food following the current AOAC guidelines. A total of 20 laboratories participated. For the 3M MDA Salmonella method, raw ground beef was analyzed using 25 g test portions, and wet dog food was analyzed using 375 g test portions. For the reference methods, 25 g test portions of each matrix were analyzed. Each matrix was artificially contaminated with Salmonella at three inoculation levels: an uninoculated control level (0 CFU/test portion), a low inoculum level (0.2–2 CFU/test portion), and a high inoculum level (2–5 CFU/test portion). In this study, 1512 unpaired replicate samples were analyzed. Statistical analysis was conducted according to the probability of detection (POD). For the low-level raw ground beef test portions, the following dLPOD (difference between the POD of the reference and candidate method)

values with 95% confidence intervals were obtained: –0.01 (–0.14, +0.12). For the low-level wet dog food test portions, the following dLPOD with 95% confidence intervals were obtained: –0.04 (–0.16, +0.09). No significant differences were observed in the number of positive samples detected by the 3M MDA Salmonella method versus either the USDA/FSIS-MLG or FDA/BAM methods.

For over 100 years, Salmonella, one of the most frequently reported causes of foodborne outbreaks, has been known to cause foodborne illness in humans (1). The bacterium

has been implicated in outbreaks from a variety of foods including raw animal products, such as meat, poultry, eggs, dairy products, seafood, and some fruits and vegetables (2). In order to reduce outbreaks of Salmonellosis, a comprehensive farm-to-fork approach is needed. The detection of Salmonella can often be very time-consuming and expensive, as the presence of the microorganism in food usually does not affect the taste, smell, or appearance (3). The 3M™ Molecular Detection Assay (MDA) Salmonella method, in conjunction with 3M Buffered Peptone Water ISO (BPW ISO; 4), uses a combination of loop-mediated isothermal DNA amplification and bioluminescence detection to detect Salmonella in enriched food, feed, and environmental samples.

The 3M MDA Salmonella method allows for next-day detection of Salmonella species. After 18–24 h of enrichment using prewarmed (37 ± 1°C) 3M BPW ISO medium, Salmonella detection is performed by the 3M MDA Salmonella method. Presumptive positive results are reported in real time; negative results are displayed after completion of the assay.

Prior to the collaborative study, the 3M MDA Salmonella method was certified as a Performance Tested Method (PTM) following the AOAC guidelines for harmonized PTM studies (5). The aim of the PTM study was to demonstrate that the 3M MDA Salmonella method could detect Salmonella in selected foods as claimed by the manufacturer. For the 3M MDA Salmonella evaluation, six matrices were analyzed: raw ground beef (25 g), processed breaded chicken (325 g), liquid egg (100 g), shrimp (25 g), fresh spinach (25 g), and wet dog food (375 g). All other

Evaluation of 3M™ Molecular Detection Assay (MDA) Salmonella for the Detection of Salmonella in Selected Foods: Collaborative StudyPatrick Bird, kiel Fisher, Megan Boyle, travis huFFMan, M. JosePh Benzinger, Jr, Paige Bedinghaus, Jonathan Flannery, erin crowley, JaMes agin, and david goinsQ Laboratories, Inc., 1400 Harrison Ave, Cincinnati, OH 45214deann Benesh1 and John david3M Food Safety Department, 3M Center, Bldg 260-6B-01, St. Paul, MN 55144

Collaborators: D. Awad, M. Bandu, K. Blanchard, D. Bosco, R. Brooks, D. Clark Jr, H. Dammann, J. Dyszel, V. Gill, M. Greenwell, C. Gwinn, M. Horan, J. Jurgens, M. Kelly, D. Lewis, S. Luce, J. Marchent, W. McMahon, I. Mello, S. Montez, S. Moosekian, A. Morey, K. Newman, M. Oltman, M. Ontiberos, K. Rajkowski, J. Ruebl, B. Stawick, L. Thompson, M. Vross

2 Bird et al.: Journal of aoaC international Vol. 96, no. 6, 2013

PTM parameters (inclusivity, exclusivity, ruggedness, stability, and lot-to-lot variability) tested in the PTM studies satisfied the performance requirements for PTM approval. The method was awarded PTM certification number 031208 on March 30, 2012.

The aim of this collaborative study was to compare the 3M MDA Salmonella method to the U.S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service (FSIS)-Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 4.05 (6) for raw ground beef and the U.S. Food and Drug Administration (FDA) Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 (7) method for wet dog food.

Collaborative Study

Study Design

For this collaborative study, two matrices, raw ground beef (80% lean) and wet dog food (canned beef chunks), were analyzed. The matrices were obtained from local retailers and screened for the absence of Salmonella by preparing one bulk sample and analyzing five sample replicates (25 g) by the appropriate reference method. The screening indicated an absence of the target organism. The raw ground beef was artificially contaminated with Salmonella Ohio Sequence Types (STS) 81 and the wet dog food with Salmonella Poona National Collection of Type Cultures (NCTC) 4840. There were two inoculation levels for each matrix: a high inoculation level of approximately 2–5 CFU/test portion and a low inoculation level of approximately 0.2–2 CFU/test portion. A set of uninoculated control test portions was also included for each matrix at 0 CFU/test portion.

Twelve replicate samples from each of the three contamination levels of product were analyzed. Two sets of samples (72 total) were sent to each laboratory for analysis by the 3M MDA Salmonella method and either the USDA/FSIS-MLG (raw ground beef) or FDA/BAM (wet pet food) reference method due to different sample enrichments for the candidate method and the reference methods. For both matrices, collaborators were sent an additional 30 g test portion and instructed to conduct a total aerobic plate count (APC) following the FDA/BAM Chapter 3 on the day samples were received to determine the total aerobic microbial load.

A detailed collaborative study packet outlining all necessary information related to the study including media preparation, method-specific test portion preparation, and documentation of results was sent to each collaborating laboratory prior to the initiation of the study.

Preparation of Inocula and Test Portions

The Salmonella cultures used in this evaluation were propagated in 10 mL of Brain Heart Infusion broth from a Q Laboratories frozen stock culture held at –70°C. The broth was incubated for 18–24 h at 35 ± 1°C. Appropriate dilutions were prepared based on previously established growth curves for both low and high inoculation levels, resulting in fractional positive outcomes for at least one level. For both test portion sizes, a bulk lot of each matrix was inoculated with a liquid inoculum and mixed thoroughly by hand-kneading to ensure an even distribution of microorganisms. The matrices were inoculated on the day of shipment so that all test portions would

be held for 96 h before testing was initiated. For analysis of the raw ground beef, the bulk lot of test material was divided into 30 g portions for shipment to the collaborators. For analysis of the wet dog food, 25 g of inoculated test product was mixed with 350 g of uninoculated test product for shipment to the collaborators for analysis by the 3M MDA Salmonella method. For analysis by the reference method, collaborators received 30 g portions.

To determine the level of Salmonella spp. in the matrices, a five-tube most probable number (MPN) was conducted by the coordinating laboratory on the day of initiation of analysis using the FDA/BAM Chapter 5 reference method for wet pet food or the USDA/FSIS-MLG 4.05 reference method for raw ground beef. From both the high and low inoculated levels, five 100 g test portions, the reference method test portions, and five 10 g test portions were analyzed using the appropriate reference method enrichment broth. The MPN and 95% confidence intervals were calculated from the high, low, and uninoculated levels using the MPN Calculator (www.lcfltd.com/customer/LCFMPNCalculator.exe; 8). Confirmation of the samples was conducted according to either the USDA/FSIS-MLG 4.05 or FDA/BAM Chapter 5 reference method, dependent on the matrix.

Test Portion Distribution

All samples were labeled with a randomized, blind-coded three-digit number affixed to the sample container. Test portions were shipped on a Thursday via overnight delivery according to the Category B Dangerous Goods shipment regulations set forth by the International Air Transport Association. All samples were packed with cold packs to target a temperature of <7°C during shipment. Upon receipt, samples were held by the collaborating laboratory at refrigerated temperature (3–5°C) until the following Monday, when analysis was initiated. In addition to each of the test portions and the total plate count replicate, collaborators also received a test portion for each matrix labeled as “temperature control.” Participants were instructed to record the temperature of this portion upon receipt of the shipment, document the results on the Sample Receipt Confirmation form provided, and fax to the Study Director.

Additional shipments of raw ground beef test portions were made by the sponsoring laboratory when aberrant results were observed. Further investigation of the results indicated that each participating collaborator detected the presence of the target analyte in the uninoculated control samples sent in the first shipment. In each case, the same species was reported for the control samples, which may have been due to cross-contamination. As a result, new test portions of raw ground beef were shipped and analyzed by each of the collaborating laboratories.

Test Portion Analysis

Collaborators followed the appropriate preparation and analysis protocol according to the method for each matrix. For both matrices, each collaborator received 72 test portions of each food product (12 high, 12 low, and 12 controls for each method). For the analysis of the raw ground beef test portions by the 3M MDA Salmonella method, a 25 g portion was enriched with 225 mL of prewarmed (37 ± 1°C) 3M BPW


ISO, homogenized for 2 min and incubated for 18 h at 37 ±1°C. For the wet dog food test portions analyzed by the 3M MDA Salmonella method, a 375 g portion was enriched with 3375 mL prewarmed (37 ± 1°C) 3M BPW ISO, homogenized for 2 min and incubated for 18 h at 37 ± 1°C.

Following enrichment, samples were assayed by the 3M MDA Salmonella method and confirmed following the standard reference method. Both test portion sizes analyzed by the 3M MDA Salmonella method were compared to samples (25 g) analyzed using either the USDA/FSIS-MLG or FDA/BAM reference method in an unpaired study design. All positive test portions were biochemically confirmed by the API 20E biochemical test, AOAC Official Method 978.24, or by the VITEK 2 GN identification test, AOAC Official Method 2011.17. Serological testing was also performed.

Statistical Analysis

Each collaborating laboratory recorded results for the reference method and the 3M MDA Salmonella method on the data sheets provided. The data sheets were submitted to the Study Director at the end of each week of testing for analysis. The results of each test portion for each sample were compiled by the Study Director and the qualitative 3M MDA Salmonella results were compared to the reference method for statistical analysis. Data for each test portion size were analyzed using the probability of detection (POD; 9). If the confidence interval of a dLPOD did not contain zero, then that would indicate a statistically significant difference between the candidate method and the reference method at the 5% confidence level (9).

AOAC Official Method 2013.09 Salmonella in Selected Foods

3M™ Molecular Detection Assay (MDA) Salmonella Method

First Action 2013

[Applicable to detection of Salmonella in raw ground beef (25 g), processed breaded chicken (325 g), liquid egg (100 g), shrimp (25 g), fresh spinach (25 g), and wet dog food (375 g)].

See Tables 2013.09A and B for a summary of results of the inter-laboratory study.

See Appendix Tables A and B for detailed results of the inter-laboratory study.

A. Principle

The 3M Molecular Detection Assay (MDA) Salmonella method is intended for use with the 3M Molecular Detection System for the rapid and specific detection of Salmonella spp. in food, feed, and environmental samples after enrichment. After enrichment in prewarmed 3M Buffered Peptone Water ISO (3M BPW ISO) medium, the 3M MDA Salmonella test utilizes loop-mediated isothermal amplification to rapidly amplify Salmonella target DNA with high specificity and sensitivity, combined with bioluminescence to detect the amplification. Presumptive positive results are reported in real time; negative results are displayed after the assay is completed.

B. Apparatus and Reagents

Items (b)–(g) are available as the 3M MDA Salmonella kit from 3M Food Safety (St. Paul, MN).

(a) 3M Molecular Detection System.—Available from 3M Food Safety.

(b) 3M MDA Salmonella reagent tubes.—12 strips of eight tubes.

(c) Lysis solution (LS) tubes.—12 strips of eight tubes.(d) Extra caps.—12 strips of eight caps.(e) Negative control (NC).—One vial (2 mL).(f) Reagent control (RC).—Eight reagent tubes.(g) Quick start guide.(h) 3M Molecular Detection Speed Loader Tray.—Available

from 3M Food Safety.(i) 3M Molecular Detection Chill Block Tray and Chill Block

Insert.—Available from 3M Food Safety.(j) 3M Molecular Detection Heat Block Insert.—Available

from 3M Food Safety.(k) 3M Molecular Detection Cap/Decap Tool for reagent

tubes.—Available from 3M Food Safety.(l) 3M Molecular Detection Cap/Decap Tool for lysis

tubes.—Available from 3M Food Safety.(m) Empty lysis tube rack.—Available from 3M Food Safety.(n) Empty reagent tube rack.—Available from 3M Food

Safety.(o) 3M BPW ISO.—Available from 3M Food Safety.

Formulation equivalent to ISO 6579:2002 Annex B (4).(p) Disposable pipet.—Capable of 20 µL.(q) Multichannel (eight-channel) pipet.—Capable of 20 µL.(r) Sterile filter tip pipet tips.—Capable of 20 µL.(s) Filter stomacher bags.—Seward Laboratory Systems

Inc., Bohemia, NY, or equivalent.(t) Stomacher.—Seward Laboratory Systems Inc. or

equivalent.(u) Thermometer.—Calibrated range to include 100 ± 1°C. (v) Dry double block heater unit or water bath.—Capable of

maintaining 100 ± 1°C.(w) Incubators.—Capable of maintaining 37 ± 1°C.(x) Freezer.—Capable of maintaining –10 to –20°C, for

storing the 3M Molecular Detection Chill Block Tray.(y) Refrigerator.—Capable of maintaining 2–8°C, for

storing the 3M MDA.(z) Computer.—Compatible with the 3M Molecular

Detection Instrument.

C. General Instructions

(a) Store the 3M MDA Salmonella kit at 2–8°C. Do not freeze. Keep kit away from light during storage. After opening the kit, check that the foil pouch is undamaged. If the pouch is damaged, do not use. After opening, unused reagent tubes should always be stored in the resealable pouch with the desiccant inside to maintain stability of the lyophilized reagents. Store resealed pouches at 2–8°C for no longer than 60 days. Do not use 3M MDA Salmonella past the expiration date.

(b) The 3M Molecular Detection Instrument is intended for use with samples that have undergone heat treatment during the assay lysis step, which is designed to destroy organisms present in the sample. Samples that have not been properly heat-treated during the assay lysis step may be considered a potential


biohazard and should not be inserted into the 3M Molecular Detection Instrument.

(c) Follow all instructions carefully. Failure to do so may lead to inaccurate results.

(d) After use, the enrichment medium and the 3M MDA Salmonella tubes can potentially contain pathogenic materials. When testing is complete, follow current industry standards for the disposal of contaminated waste. Consult the Material Safety Data Sheet for additional information and local regulations for disposal.

Periodically decontaminate laboratory benches and equipment (pipets, cap/decap tools, etc.) with a 1–5% (v/v in water) household bleach solution or DNA removal solution.

D. Sample Enrichment

Prewarm 3M BPW ISO enrichment medium to 37 ± 1°C.Aseptically combine the enrichment medium and sample

following the outline in Table 2013.09C. For all meat and highly particulate samples, the use of filter bags is recommended. Homogenize thoroughly for 2 min. Incubate at 37 ± 1°C.

E. Preparation of the 3M Molecular Detection Speed Loader Tray

Wet a cloth or paper towel with a 1–5% (v/v in water) household bleach solution and wipe the 3M Molecular Detection Speed Loader Tray. Rinse the tray with water. Use a disposable

towel to wipe the tray dry. Ensure the 3M Molecular Detection Speed Loader Tray is dry before use.

F. Preparation of the 3M Molecular Detection Chill Block Insert

Before using the 3M Molecular Detection Chill Block Insert, ensure it has been stored on the 3M Molecular Detection Chill Block Tray in the freezer (–10 to –20°C) for a minimum of 2 h before use. When removing the 3M Molecular Detection Chill Block Insert from the freezer for use, remove it and the 3M Molecular Detection Chill Block Tray together. Use the insert and tray within 20 min.

G. Preparation of the 3M Molecular Detection Heat Block Insert

Place the 3M Molecular Detection Heat Block Insert in a dry double block heater unit. Turn on the dry block heater unit and set the temperature to allow the 3M Molecular Detection Heat Block Insert to reach and maintain a temperature of 100 ± 1°C.

Note: Depending on the heater unit, allow approximately 30–50 min for the 3M Molecular Detection Heat Block Insert to reach temperature. Using a calibrated thermometer, verify that the 3M Molecular Detection Heat Block Insert is at 100 ± 1°C.

Table 2013.09A. POD summary of raw ground beef (25 g) results for the 3M MDA Salmonella methoda

Inoculation level

Uninoculated Low High

Candidate presumptive positive/total No. of samples analyzed 1/120 69/120 120/120

Candidate presumptive (CP) POD 0.01 (0.00, +0.05) 0.58 (+0.48, +0.67) 1.00 (+0.97, +1.00)

srb 0.09 (+0.08, +0.17) 0.51 (+0.45, +0.52) 0.00 (0.00, +0.18)

sLc 0.00 (0.00, +0.04) 0.00 (0.00, +0.14) 0.00 (0.00, +0.18)

sRd 0.09 (+0.08, +0.10) 0.51 (+0.45, +0.52) 0.00 (0.00, +0.24)

Candidate confirmed positive/total No. of samples analyzed 0/120 67/120 120/120

Candidate confirmed (CC) POD 0.00 (0.00, +0.03) 0.56 (+0.47, +0.65) 1.00 (+0.97, +1.00)

srb 0.00 (0.00, +0.17) 0.51 (+0.45, +0.52) 0.00 (0.00, +0.18)

sLc 0.00 (0.00, +0.17) 0.00 (0.00, +0.11) 0.00 (0.00, +0.18)

sRd 0.00 (0.00, +0.24) 0.51 (+0.46, +0.52) 0.00 (0.00, +0.24)

Positive reference samples/total No. of samples analyzed 0/120 68/120 119/120

Reference POD 0.00 (0.00, +0.03) 0.57 (+0.48, +0.66) 0.99 (+0.95, +1.00)

srb 0.00 (0.00, +0.17) 0.50 (+0.45, +0.52) 0.09 (+0.08, +0.17)

sLc 0.00 (0.00, +0.17) 0.00 (0.00, +0.18) 0.00 (0.00, +0.04)

sRd 0.00 (0.00, +0.24) 0.51 (+0.45, +0.52) 0.09 (+0.08, –0.11)

dLPOD (Candidate vs Reference) 0.00 (–0.03, +0.03) –0.01 (–0.14, +0.12) 0.01 (–0.02, +0.05)

dLPOD (CP vs CC) 0.01 (–0.02, +0.05) 0.02 (–0.11, +0.15) 0.00 (–0.03, +0.03)

a Results include 95% confidence intervals.b Repeatability SD.c Among-laboratory SD.d Reproducibility SD.


H. Preparation of the 3M Molecular Detection Instrument

Launch the 3M Molecular Detection Software and log in. Turn on the 3M Molecular Detection Instrument. Create or edit a run with data for each sample. Refer to the 3M Molecular Detection System User Manual for details.

Note: The 3M Molecular Detection Instrument must reach and maintain a temperature of 60°C before a run can be started. This heating step takes approximately 20 min and is indicated by an orange light on the instrument’s status bar. When the instrument is ready to start a run, the status bar will turn green.

I. Lysis

Allow the LS tubes to warm up to room temperature by setting the rack on the laboratory bench for 2 h. Alternatives to equilibrate the LS tubes to room temperature are to incubate the LS tubes in a 37 ± 1°C incubator for 1 h or at room temperature overnight (16–18 h). Remove the enrichment broth from the incubator and gently agitate the contents. One LS tube is required for each sample and the NC sample. LS tube strips can be cut to the desired number. Select the number of individual LS tubes or eight-tube strips needed. Place the LS tubes in an empty rack. To avoid cross-contamination, decap strip at a time and use a new pipet tip for each transfer step. Transfer the enriched samples to LS tubes as described below:

Note: Transfer each enriched sample into individual LS tube first. Transfer the NC last.

Use the 3M Molecular Detection Cap/Decap Tool-Lysis to decap one LS tube strip—one strip at a time. Set the tool with cap attached aside on a clean surface. Transfer 20 µL of sample into an LS tube. Repeat transfer until each individual sample has been added to a corresponding LS tube in the strip. Use the 3M Molecular Detection Cap/Decap Tool-Lysis to recap the LS tube strip. Use the rounded side of the tool to apply pressure in a back-and-forth motion to ensure that the cap is tightly applied. Repeat as needed for the number of samples to be tested.

When all samples have been transferred, transfer 20 µL of NC into a LS tube. Use the 3M Molecular Detection Cap/Decap Tool-Lysis tool to recap the LS tube. Cover the rack of LS tubes with the rack lid and firmly invert three to five times

Table 2013.09C Sample enrichment protocols

Sample matrixSample size,

gEnrichment broth

volume, mLEnrichment

time, h

Raw ground beef (27% fat) 25 225 18–24

Raw shrimp 25 225 18–24

Bagged spinach 25 225 18–24

Pasteurized liquid whole egg

100 900 18–24

Cooked breaded chicken 325 2925 18–24

Wet pet food (dog–beef cuts in gravy, canned)

375 3375 18–24

Table 2013.09B. POD Summary of wet pet food (375 g) results for the 3M MDA Salmonella methoda

Inoculation level

Uninoculated Low High

Candidate presumptive positive/total No. of samples analyzed 1/132 65/132 131/132

Candidate presumptive (CP) POD 0.01 (0.00, +0.04) 0.49 (+0.40, +0.58) 0.99 (+0.96, +1.00)

srb 0.09 (+0.08, +0.16) 0.51 (+0.46, +0.52) 0.09 (+0.08, +0.16)

sLc 0.00 (0.00, +0.04) 0.00 (0.00, +0.14) 0.00 (0.00, +0.04)

sRd 0.09 (+0.08, +0.10) 0.51 (+0.46, +0.52) 0.09 (+0.08, +0.10)

Candidate confirmed positive/total No. of samples analyzed 0/132 65/132 131/132

Candidate confirmed (CC) POD 0.00 (0.00, +0.03) 0.49 (+0.40, +0.58) 0.99 (+0.96, +1.00)

srb 0.00 (0.00, +0.17) 0.51 (+0.46, +0.52) 0.09 (+0.08, +0.16)

sLc 0.00 (0.00, +0.17) 0.00 (0.00, +0.14) 0.00 (0.00, +0.04)

sRd 0.00 (0.00, +0.23) 0.51 (+0.46, +0.52) 0.09 (+0.08, +0.10)

Positive reference samples/total No. of samples analyzed 0/132 70/132 132/132

Reference POD 0.00 (0.00, +0.03) 0.53 (+0.44, +0.62) 1.00 (+0.97, +1.00)

srb 0.00 (0.00, +0.17) 0.52 (+0.46, +0.52) 0.00 (0.00, +0.17)

sLc 0.00 (0.00, +0.17) 0.00 (0.00, +0.09) 0.00 (0.00, +0.17)

sRd 0.00 (0.00, +0.23) 0.52 (+0.47, +0.52) 0.00 (0.00, +0.23)

dLPOD (Candidate vs Reference) 0.00 (–0.03, +0.03) –0.04 (–0.16, +0.09) –0.01 (–0.04, +0.02)

dLPOD (CP vs CC) 0.01 (–0.02, +0.05) 0.00 (–0.13, +0.13) 0.00 (–0.03, +0.03)

a Results include 95% confidence intervals.b Repeatability SD.c Among-laboratory SD.d Reproducibility SD.


to mix. Suspension has to flow freely inside the tube. See Figure 2013.09A.

Verify that the temperature of the 3M Molecular Detection Heat Block Insert is at 100 ± 1°C. Place the rack of LS tubes in the 3M Molecular Detection Heat Block Insert and heat for 15 ± 1 min. An alternative to using dry heat for the lysis step is to use a water bath at 100 ±1°C. Ensure that sufficient water is used to cover up to the liquid level in the LS tubes. Place the rack of LS tubes in the water bath at 100 ± 1°C and heat for 15 ± 1 min. Samples that have not been properly heat-treated during the assay lysis step may be considered a potential biohazard and should not be inserted into the 3M Molecular Detection Instrument.

Remove the rack of LS tubes from the heating block and allow to cool in the 3M Molecular Detection Chill Block Insert for 10 ± 1 min. Remove the rack lid during incubation on the 3M Molecular Detection Chill Block Insert. The LS solution may freeze when processing less than 48 LS tubes. Freezing of the LS solution will not affect your test. If freezing is observed, allow the LS tubes to thaw for 5 min before mixing.

Remove the rack of LS tubes from the 3M Molecular Detection Chill Block Insert/3M Molecular Detection Chill Block Tray system. Replace the lid on the rack of LS tubes and firmly invert three to five times to mix. Suspension has to flow freely inside the tube. Firmly tap the lysis tubes rack on the laboratory bench three to five times. Place the rack on the laboratory bench. Let it sit undisturbed for at least 5 min to allow the resin to settle. Do not mix or disturb the resin at the bottom of the tube. See Figure 2013.09B.

J. Amplification

One reagent tube is required for each sample and the NC. Reagent tube strips can be cut to desired tube number. Select the number of individual reagent tubes or eight-tube strips needed. Place reagent tubes in an empty rack. Avoid disturbing the reagent pellets from the bottom of the tubes.

Select one RC tube and place in rack. To avoid cross-contamination, decap one reagent tubes strip at a time and use a new pipet tip for each transfer step. Transfer lysate to reagent tubes and RC tube as follows:

Transfer each sample lysate into individual reagent tubes first followed by the NC. Hydrate the RC tube last.

Warning: Care must be taken when pipetting LS, as carry-over of the resin may interfere with amplification.

(1) Use the 3M Molecular Detection Cap/Decap Tool-Reagent to decap the reagent tubes–one strip at a time. Discard cap. (2) Transfer 20 µL of sample lysate from the upper portion of the fluid in the LS tube into corresponding reagent tube. Dispense at an angle to avoid disturbing the pellets. Mix by gently pipetting up and down five times. (3) Repeat until individual sample lysate has been added to a corresponding reagent tube in the strip. (4) Cover the reagent tubes with the provided extra cap and use the rounded side of the 3M Molecular Detection Cap/Decap Tool-Reagent to apply pressure in a back-and-forth motion, ensuring that the cap is tightly applied. Repeat steps (1) to (4) as needed for the number of samples to be tested. When all sample lysates have been transferred, repeat steps (1) to (4) to transfer 20 µL of NC lysate into a reagent tube. Transfer 20 µL of NC lysate into a RC tube. Dispense at an angle to avoid disturbing the pellets. Mix by gently pipetting up and down five times. Load capped tubes into a clean and decontaminated 3M Molecular Detection Speed Loader Tray. Close and latch the 3M Molecular Detection Speed Loader Tray lid. See Figure 2013.09C.

Review and confirm the configured run in the 3M Molecular Detection Software. Click the start button in the software and select instrument for use. The selected instrument’s lid automatically opens. Place the 3M Molecular Detection Speed Loader Tray into the 3M Molecular Detection Instrument and close the lid to start the assay. Results are provided within 75 min, although positives may be detected sooner.

After the assay is complete, remove the 3M Molecular Detection Speed Loader Tray from the 3M Molecular Detection

Figure 2013.09A. Transfer of enriched sample to Lysis Solution tube.

Figure 2013.09B. Sample Lysis.

Figure 2013.09C. Transfer of lysate to reagent tube.


Instrument and dispose of the tubes by soaking in a 1–5% (v/v in water) household bleach solution for 1 h and away from the assay preparation area.

Notice: To minimize the risk of false positives due to cross-contamination, never open reagent tubes containing amplified DNA. This includes RC, reagent, and matrix control tubes. Always dispose of sealed reagent tubes by soaking in a 1–5% (v/v in water) household bleach solution for 1 h away from the assay preparation area.

K. Results and Interpretation

An algorithm interprets the light output curve resulting from the detection of the nucleic acid amplification. Results are analyzed automatically by the software and are color-coded based on the result. A positive or negative result is determined by analysis of a number of unique curve parameters. Presumptive positive results are reported in real time; negative and inspect results will be displayed after the run is completed. Presumptive positive results should be confirmed using your preferred method or as specified by the FDA/BAM (http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm) or the USDA/FSIS-MLG (http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_05.pdf; 6, 7), starting from the 3M BPW ISO, followed by secondary enrichment, plating, and confirmation of isolates using appropriate biochemical and serological methods.

Note: Even a negative sample will not give a zero reading as the system and 3M MDA Salmonella amplification reagents have a “background” relative light unit.

In the rare event of any unusual light output, the algorithm labels this as “inspect.” 3M recommends the user to repeat the assay for any inspect samples. If the result continues to be inspect, proceed to confirmation test using your preferred method or as specified by local regulations.

Results

In this collaborative study, the 3M MDA Salmonella method was compared to the to the USDA/FSIS-MLG 4.05 reference method for raw ground beef and to the FDA/BAM, Chapter 5 reference method for wet dog food. A total of 20 laboratories throughout the United States participated in this study, with 14 laboratories submitting data for the raw ground beef and 16 laboratories submitting data for the wet dog food, as presented in Table 1. Each laboratory analyzed 36 test portions for each method: 12 inoculated with a high level of Salmonella, 12 inoculated with a low level of Salmonella, and 12 uninoculated controls. For each matrix, the actual level of Salmonella was determined by MPN determination on the day of initiation of analysis by the coordinating laboratory. The individual laboratory and sample results are presented in Tables 2 and 3. Tables 2013.09A and B summarize the interlaboratory results for all foods tested, including POD statistical analysis (10). The results of the collaborating laboratories’ APC analysis for each matrix are presented in Table C of the Appendix.

Raw Ground Beef (25 g Test Portions)

Raw ground beef test portions were inoculated at a low and high level and were analyzed (Table 2) for the detection of

Salmonella spp. Uninoculated controls were included in each analysis. The results presented for the raw ground beef were from a second shipment of test portions to the collaborating laboratories. The initial shipment of raw ground beef test portions sent to collaborators was discovered to contain contamination of the target analyte in the uninoculated control samples for each laboratory and therefore no data have been presented. Fourteen laboratories participated in the retest analysis of this matrix and the results of 10 laboratories were included in the statistical analysis. For the retest of the raw ground beef, laboratories 12, 16, 18, and 19 detected the presence of Salmonella spp. in either the candidate or reference method control replicates. Because of the potential for error, results from these laboratories were excluded from the statistical analysis. The MPN levels obtained for this test portion, with 95% confidence intervals, were 0.81 CFU/test portion (+0.62, +1.04) for the low level and 4.68 CFU/test portion (+3.22, +6.80) for the high level.

For the high level, 120 out of 120 test portions were reported as presumptive positive by the 3M MDA Salmonella method with all test portions confirming positive. For the low level, 67 out of 120 test portions were reported as presumptive positive by the 3M MDA Salmonella method with 65 test portions confirming positive. For the uninoculated controls, 1 out of 120 samples produced a presumptive positive result by the

Table 1. Participation of each collaborating laboratorya

LabRaw ground beefb

(25 g test portions)Wet dog food

(375 g test portions)

1 Y Y

2 Y Y

3 N Y

4 N Yc

5 N Yc

6 N Y

7 N Y

8 N Y

9 Y Y

10 Y Yc

11 Y Y

12 Yc Yc

13 Y Y

14 Y Y

15 Y Y

16 Yc Yc

17 Y N

18 Yc N

19 Yc N

20 Y N

a Y = Collaborator analyzed the food type; N = collaborator did not analyze the food type.

b Data obtained from additional shipment of raw ground beef. Initial shipment of raw ground beef was not used for evaluation purposes and therefore the data has not been presented.

c Results were not used in statistical analysis due to laboratory error, or uninoculated control test portions were confirmed as Salmonella.


Table 2. Individual collaborator results for raw ground beef (25 g test portions)a

High-level test portions Low-level test portions Uninoculated test portions

Lab 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3M MDA Salmonellab

1 + + + + + + + + + + + + – + – – – + + + + – + + – – – – – – – – – – –- –

2 + + + + + + + + + + + + + – – + – + + + – – – + – – – – – – – – – – – –

3 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA






9 + + + + + + + + + + + + + – + + –c + + + + – – –c – – – – – – – – – – – –

10 + + + + + + + + + + + + + + + – + + + – – – + – – – – – – – – – – – – –

11 + + + + + + + + + + + + + + – – – – – – + + + + – – – – – – – – – – – –

12d + + + + + + + + + + + + – + + + –c –c –c + + + –c – – – –c –c –c –c – –c – –c – –c

13 + + + + + + + + + + + + – + – – – + + – + + + + – – – – – – – – – – – –

14 + + + + + + + + + + + + – – + + + + + – – + – + – – – – – – – – – – – –

15 + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – + – – – – – – – – –c – – – – –

16d + + + + + + + + + + + + –c – + + + – + + + + + + – – – – – – –c –c –c –c – –

17 + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + – – + – – – – – – – – – – – – –

18d + + + + + + + + + + + + –c + + + + + + –c + + –c + –c + –c –c –c –c –c –c –c –c –c +

19d + + + + + + + + + + + + – – – – – – + + – + –c – – – –c –c –c –c – –c –c –c –c –c

20 + + + + + + + + + + + + + – – + + – + + – + + + – – – – – – – – – – – –

USDA/FSIS-MLGb

1 + + + + + + + + + + + + – + – + – + + + – – – – – – – – – – – – – – – –

2 + + + + + + + + + + + + + + + + + – – + + + + – – – – – – – – – – – – –







9 + + + + + + + + + + + + + – – + + + – + – + + + – – – – – – – – – – – –

10 + + + + + + + + + + + + – – – + – + – – + + + + – – – – – – – – – – – –

11 + + + + + + + + + + + + + – + + – + – – + + + – – – – – – – – – – – – –

12d + + + + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + – – – – – – – + – – –

13 + + + + + + – + + + + + + – – + – + + + – – – + – – – – – – – – – – – –

14 + + + + + + + + + + + + + – + + + + + + – – + – – – – – – – – – – – – –

15 + + + + + + + + + + + + – – + + – + + + – + + + – – – – – – – – – – – –

16d + + + + + + + + + + + + – – + – – – – – – + – + – – – – – + – – – – – –

17 + + + + + + + + + + + + – – – – + – + + + – + + – – – – – – – – – – – –

18d + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + – + – – – – – – – – – – – –

19d + + + + + + + + + + + + + + + – – + – – + – + + – + + – – – – – – – – –

20 + + + + + + + + + + + + + – + – + – + + – – – – – – – – – – – – – – – –a + = Salmonella spp. were detected in samples; – =Salmonella spp. were not detected in sample; NA = laboratory did not participate in this matrix, or

results were not received.b Sample results were obtained from the second shipment of raw ground beef test portions.c Sample was presumptive positive on 3M MDA Salmonella, but confirmed negative, indicating a false-positive result.d Results were not used in statistical analysis due to laboratory error.


Table 3. Individual collaborator results for wet dog food (375 g test portions)a

High-level test portions Low-level test portions Uninoculated test portions

Lab 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3M MDA Salmonella

1 + + + + + + + + + + + + – – – – – – – – + + + – – – – – – – – – – – – –

2 + + + + + + + + + + + + + + – – – + + – – + + – – – – – – – – – – – – –

3 + + + + + + + + + + + + – – – – + – – + + – + + – – – – – – – – – – – –

4b + + + + + + + + + + + + + + + – + – – + + – – + – – – – – + – – – – – –

5b + + + + + + – – + + + + + – + + + – + + + – + – + + + – + – – – – – – –

6 + + + + + + + + + + + + – – – + – – + + + + + – – – – – – – – – – – – –

7 + + + + + + + + + + – + + – – + – + + + – + + – – – – – – – – – – – – –

8 + + + + + + + + + + + + + – + + + – – – – + + + – – – – – – – – – – – –

9 + + + + + + + + + + + + + + – – + – – + + – + – – – – – – – – – – – – –

10b + + + + + + + + + + + + + + – + –c + + –c – + + + –c + – – –c –c – – – –c – –

11 + + + + + + + + + + + + – + – – + + + + + + – – – – – – – – – – – – – –

12 NA NA NA NA NA NANA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA

13 + + + + + + + + + + + + – + – + – + + – – + + – – – – – –c – – – – – – –

14 + + + + + + + + + + + + + – + + – – + – + – + – – – – – – – – – – – – –

15 + + + + + + + + + + + + + – + – – + + + – – + – – – – – – – – – – – – –

16b + + + + – – + + + + + + + + –c + – – – + + – + – – –c – + –c –c + + + –c + –





FDA/BAM

1 + + + + + + + + + + + + – + + + + – – – – + + – – – – – – – – – – – – –

2 + + + + + + + + + + + + – – + – + – + – + – + + – – – – – – – – – – – –

3 + + + + + + + + + + + + + – + + – – + – – + + – – – – – – – – – – – – –

4b + + + + + + + + + + + + + – – – – + – + + + – + – – – – – – – – – – + –

5b + + + + – + + + + + + + + + + – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – +

6 + + + + + + + + + + + + – – + – + – – + + + + – – – – – – – – – – – – –

7 + + + + + + + + + + + + + + – + + – – – + + + – – – – – – – – – – – – –

8 + + + + + + + + + + + + – + + – – + + + + + – + – – – – – – – – – – – –

9 + + + + + + + + + + + + – + – + – – + + – + + – – – – – – – – – – – – –

10b + + + + + + + + + + + + + – + – + – – – + + + – – – – – – – – – – – – –

11 + + + + + + + + + + + + – + + – – – + – – + + + – – – – – – – – – – – –


13 + + + + + + + + + + + + + – + – + – – – + – + + – – – – – – – – – – – –

14 + + + + + + + + + + + + + – – – + + + – – + + – – – – – – – – – – – – –

15 + + + + + + + + + + + + + – – + – + – – + + + + – – – – – – – – – – – –

16b + + + + + + + + + + + + – + – – + + + – – + + + – – + – + – – – – – – –




20 NA NA NA NA NA NANA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NAa + = Salmonella spp. were detected in samples; – =Salmonella spp. were not detected in sample; NA = laboratory did not participate in this matrix or

results were not received.b Results were not used in statistical analysis due to laboratory error.c Sample was presumptive positive on 3M MDA Salmonella, but confirmed negative, indicating a false-positive result.


3M MDA Salmonella method with all test portions confirming negative. For test portions analyzed by the USDA/FSIS-MLG Method, 119 out of 120 high inoculum and 68 out of 120 low inoculum test portions confirmed positive. For the uninoculated controls, 0 out of 120 test portions confirmed positive.

For the low-level inoculum, a dLPODC value of –0.01 with 95% confidence intervals of (–0.14, +0.13) were obtained between the 3M MDA Salmonella method and the USDA/FSIS-MLG method. The confidence intervals obtained for dLPODC indicated no significant difference between the two methods. A dLPODCP value of 0.02 with 95% confidence intervals of (–0.11, +0.15) was obtained between presumptive and confirmed 3M MDA Salmonella results. The confidence intervals obtained for dLPODCP indicated no significant difference between the presumptive and confirmed results using either confirmation process.

For the high-level inoculum, a dLPODC value of 0.01 with 95% confidence intervals of (–0.02, +0.05) was obtained between the 3M MDA Salmonella method and the USDA/FSIS-MLG method. The confidence intervals obtained for dLPODC indicated no significant difference between the two methods. A dLPODCP value of 0.00 with 95% confidence intervals of (–0.03, +0.03) was obtained between presumptive and confirmed 3M MDA Salmonella results. The confidence intervals obtained for dLPODCP indicated no significant difference between the presumptive and confirmed results. Detailed results of the POD statistical analysis are presented in Table 2013.09A and Figures 1A and B of the Appendix.

Wet Dog Food (375 g Test Portions)

Wet dog food test portions were inoculated at a low and high level and were analyzed (Table 3) for the detection of Salmonella spp. Uninoculated controls were included in each analysis. Sixteen laboratories participated in the analysis of this matrix and the results of 11 laboratories were included in the statistical analysis. Laboratories 4, 5, 10, and 16 detected the presence of Salmonella spp. in either the candidate or reference method control replicates. Because of the potential for error, results from these laboratories were excluded from the statistical analysis. Laboratory 12 did not submit results due to cross-contamination of sample enrichments as reported by the analyst. The MPN levels obtained for this test portion, with 95% confidence intervals, were 0.72 CFU/test portion (+0.57, +0.90) for the low level and 5.34 CFU/test portion (+3.46, +8.24) for the high level.

For the high level, 131 out of 132 test portions were reported as presumptive positive by the 3M MDA Salmonella method with all test portions confirming positive. For the low level, 65 out of 132 test portions were reported as presumptive positive by the 3M MDA Salmonella method with all test portions confirming positive. For the uninoculated controls, 1 out of 132 samples produced a presumptive positive result by the 3M MDA Salmonella method with all test portions confirming negative. For test portions analyzed by the FDA/BAM method, 132 out of 132 high inoculum and 70 out of 132 low inoculum test portions confirmed positive. For the uninoculated controls, 0 out of 132 test portions confirmed positive.

For the low-level inoculum, a dLPODC value of –0.04 with 95% confidence intervals of (–0.16, +0.09) was obtained between the 3M MDA Salmonella method and the FDA/BAM

method. The confidence intervals obtained for dLPODC indicated no significant difference between the two methods. A dLPODCP value of 0.00 with 95% confidence intervals of (–0.13, +0.13) was obtained between presumptive and confirmed 3M MDA Salmonella results. The confidence intervals obtained for dLPODCP indicated no significant difference between the presumptive and confirmed results using either confirmation process.

For the high-level inoculum, a dLPODC value of –0.01 with 95% confidence intervals of (–0.04, +0.02) was obtained between the 3M MDA Salmonella method and the FDA/BAM method. The confidence intervals obtained for dLPODC indicated no significant difference between the two methods. A dLPODCP value of 0.00 with 95% confidence intervals of (–0.03, +0.03) was obtained between presumptive and confirmed 3M MDA Salmonella results. The confidence intervals obtained for dLPODCP indicated no significant difference between the presumptive and confirmed results. Detailed results of the POD statistical analysis are presented in Table 2013.09B and Figures 2A and B of the Appendix.

Discussion

For this collaborative study, samples were analyzed at both 25 and 375 g test portions as required by the current AOAC Guidelines (5), which require methods with more than one sample preparation or enrichment scheme to analyze one matrix per procedure. No negative feedback was provided by the collaborating laboratories in regard to the performance of the candidate method. Several collaborating laboratories expressed questions in regard to the AOAC study design of the collaborative study; others expressed concern with analyzing 375 g test portions. The concern with handling the larger test portions may have contributed to errors observed during testing that resulted in data not used in the statistical analysis.

During testing, four different laboratories detected the presence of Salmonella spp. in seven raw ground beef uninoculated control test portions. Additionally, four different laboratories detected the presence of Salmonella spp. in 15 wet pet food uninoculated control test portions. Due to detecting positive samples in the control test portions, the data provided by these laboratories were not included during the statistical analysis.

A root cause investigation to determine the source of contamination yielded the following possibilities: Due to the high number of samples analyzed, including test portions inoculated at a high inoculum level, contamination may have occurred during the transfer of enriched samples into the secondary selective enrichments or during the streaking of the reference agar plates. For the wet pet food, based on feedback from the collaborators, issues with storage during the incubation of the larger test portion sizes may have led to cross-contamination of the primary enrichments. Based on the fact that uninoculated control test portions were packaged 1 day prior to the inoculated test portions, contamination during test portion preparation at the coordinating laboratory is not believed to be the cause of the positive control samples.

During the analysis of both the raw ground beef and wet pet food, some laboratories produced false-positive results with the candidate method. The 3M Molecular Detection Assay is intended for use in a laboratory environment by professionals


trained in laboratory technique. Cross-contamination of samples resulting in false-positive results may occur if careful molecular techniques are not followed. To reduce the risk of cross-contamination, 3M recommends the use of sterile, aerosol barrier (filtered) molecular biology grade pipet tips. A new pipet tip should be used for each sample transfer, and the user may choose to add an intermediate transfer step in order to avoid pipet contamination, i.e., each enriched sample can be transferred into a sterile tube before proceeding to the lysis step. Discrepant results may be obtained if deviations from the method occur. Use of calibrated pipettors and thermometers is critical to ensure that correct volumes of samples, especially when hydrating the reagent tubes, and appropriate temperatures are utilized. It is recommended that users read and become familiar with the 3M MDA Salmonella product instructions and follow them carefully.

For either matrix, the collaborative study failed to show a statistically significant difference between the candidate method and the reference method using the POD model when the aforementioned four laboratories were removed from consideration.

Recommendations

It is recommended that the 3M MDA Salmonella method be adopted Official First Action for the detection of Salmonella in selected foods, including raw ground beef (25 g), processed breaded chicken (325 g), liquid egg (100 g), shrimp (25 g), fresh spinach (25 g), and wet dog food (375 g).

Acknowledgments

We extend our sincere thanks to the following collaborators for their dedicated participation in this study:

Joanne Ruebl, Cherney Microbiological Services, Ltd, Green Bay, WI

Jessica Dyszel and Mathew Vross, Richter International, Columbus, OH

Vikas Gill, U.S. FDA Center for Food Safety and Applied Nutrition, College Park, MD

Brad Stawick and Keith Blanchard, Microbac Laboratories, Inc., Warrendale, PA

Mark Horan and Delando Lewis, Microbac Laboratories, Inc., Baltimore, MD

Indaue Mello and Maria Ontiberos, Mars Petcare, US, Kansas City, MO

Jodene Jurgens and Leslie Thompson, Aegis, North Sioux City, SD

David Bosco, Food Safety Net Services, Fresno, CAAmit Morey and Sergio Montez, Food Safety Net Services,

San Antonio, TXKyle Newman, Venture Laboratories, Inc., Lexington, KYMary Bandu and Matt Oltman, Chestnut Laboratory,

Springfield, MO

Robert Brooks, ATC Microbiology, LLC, North Little Rock, AR

Christine Gwinn and Scott Moosekian, Covance Laboratories, Inc., Battle Creek, MI

Joey Marchent, Gulf Coast Seafood Laboratory, FDA, Dauphin Island, AL

Kathleen T. Rajkowski, USDA Agricultural Research Services, Eastern Regional Research Center, Food Safety and Technologies Initiative, Glenside, PA

Shaunti Luce, The National Food Lab, Livermore, CAHondo Dammann and Dorn Clark Jr, Marshfield Food Safety,

Marshfield, WIWendy McMahon and Deena Awad, Silliker, Inc., Crete, ILMichelle Kelly and Megan Greenwell, Q Laboratories Inc.,

Cincinnati, OH

References

(1) Centers for Disease Control and Prevention (October 26, 2011) <http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/> (accessed November 6, 2012)

(2) Hammack, Thomas (2011) Salmonella species in Bad Bug Book – Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins, 2nd Ed., U.S. Food and Drug Administration, College Park, MD

(3) U.S. Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (May 2007) <http://askfsis.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/334/related/1> (accessed November 6, 2012)

(4) International Organization for Standardization (2002) ISO 6579: Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs-Horizontal Method for the Detection of Salmonella spp., 4th Ed., Geneva, Switzerland

(5) Brunelle, S., LaBudde, R., Nelson, M., & Wehling, P. (2012) AOAC INTERNATIONAL Methods Committee Guidelines for Validation of Microbiological Methods for Food and Environmental Surfaces, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, Appendix X

(6) U.S. Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service, Microbiology Laboratory Guidebook, Revision 4.05 (2001) Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry, Pasteurized Egg, and Catfish Products, Washington, DC. http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_05.pdf (accessed July 2012)

(7) Andrews, W.H., & Hammack, T. (February 2011) FDA-Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5 Salmonella. http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm (accessed July 2012)

(8) Least Cost Formulations, Ltd (2011) MPN Calculator-Version 1.6. www.lcfltd.com/customer/LCFMPNCalculator.exe (accessed November 2012)

(9) Wehling, P., LaBudde, R., Brunelle, S., & Nelson, M. (2011) J. AOAC Int. 94, 335–347

(10) Least Cost Formulations, Ltd (2011) AOAC Binary Data Interlaboratory Study Workbook. http://lcfltd.com/aoac/aoac-binary-v2-2.xls (accessed November 2012)

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Reveal® One-Step Listeria Environmental Sampling SystemThe Reveal Listeria One-Step Environmental Sampling System utilizes LESS medium and provides for the rapid recovery of Listeria spp. in environmental samples, allowing detection and presumptive

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Reveal® for Listeria One-Step Test SystemThe Reveal for Listeria One-Step Test System utilizes a single enrichment (LESS medium) and provides for the rapid recovery of Listeria spp. in foods and environmental samples, allowing detection and presumptive identification of the test organism in as little as 27 hours for most food samples, and 24 hours for environmental samples.

A preheated portion (135 µL) of the enrichment culture is placed into the sample port of the Reveal test device. The sample flows through the lateral flow device providing distinct, visible results. If a line develops only in the control zone, the sample is negative for Listeria. If lines are present in the control and test zones, the sample is presumptively positive for Listeria.


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Sistema REVEAL® de Neogen Corp. Detección rápida de patógenos en alimentos

y piensos para animales

El Sistema Reveal® El Sistema Reveal® es un Ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral que combina un clásico inmunoensayo tipo “sandwich” con la tecnología cromatográfica para la detección rápida y precisa, en un solo paso, de patógenos en alimentos, materias primas y piensos para animales. Esta tecnología permite obtener resultados fiables en tan solo 20 minutos (tras un proceso de enriquecimiento mejorado). Fundamento técnico de Reveal® El sistema Reveal® está formado por un conjunto de medios de cultivo selectivos predosificados estériles (para realizar el enriquecimiento selectivo de la muestra) y un cassette inmunocromatográfico en el que se realiza la detección inmunológica del patógeno. Una porción de la muestra enriquecida se dispensa en el “pocillo de muestra” del cassette inmunocromatográfico. La muestra fluye a través de una membrana que contiene anticuerpos específicos contra el patógeno a analizar (zona de reactivos). Estos anticuerpos están conjugados a partículas de látex de color. Si el patógeno está presente en la muestra, los anticuerpos conjugados con las partículas coloreadas se fijan a la fracción antigénica del patógeno, formando un inmunocomplejo antígeno-anticuerpo-partícula coloreada. El inmunocomplejo migra por difusión a través de la membrana hasta una zona (zona de reacción) en la que se haya fijado un segundo anticuerpo anti-patógeno específico. Este anticuerpo fijado captura el inmunocomplejo, mostrándose una línea coloreada producida por la concentración de las partículas de latex que incorpora el inmunocomplejo. En la zona de reactivos, está presente al mismo tiempo, un inmunocomplejo de control que migra conjuntamente con la muestra dispensada. Cuando este complejo control alcanza la “zona de reacción”, se forma una segunda línea coloreada que indica que el procedimiento se ha realizado correctamente.


Ventajas del sistema Reveal® - Sensibilidad y Especificidad La utilización de una selección única de anticuerpos asegura una alta sensibilidad y especificidad en la detección de los patógenos, lo que permite instaurar la técnica como método de screening debiéndose en cualquier caso, confirmar por métodos tradicionales oficiales únicamente un limitado numero de muestras. - Redución de Tiempo El Sistema Reveal® está optimizado para obtener resultados fiables con un importante ahorro de tiempo. En tan solo 20 minutos (tras un periodo de enriquecimiento de la muestra) y sin apenas manipulación, se obtienen resultados concluyentes. La incorporación de medios de cultivo predosificados , estériles en viales monotest reduce sensiblemente el tiempo de preparación. No es preciso pesar el medio de cultivo ni esterilizarlo. - No precisa instalaciones especiales El sistema Reveal® incorpora todo el material necesario para realizar la determinación (medios de cultivo predosificados, bolsas de incubación, pipetas para dosificación de muestras, vaso medidor y cassettes inmuocromatográficos) Únicamente se precisa un reducido espacio y una estufa de cultivo convencional para realizar la técnica con total garantía. La lectura e interpretación de resultados tampoco precisa instrumentación adicional. - No precisa formación o entrenamiento específico La ejecución de la técnica es muy sencilla, y no es necesaria una formación específica en microbiología. Puede ser realizada por cualquier persona de forma rápida y segura. La lectura e interpretación de los resultados es totalmente objetiva (si aparece la línea coloreada en la zona de resultados, la muestra es positiva), por lo que tampoco en este caso se necesita formación específica para interpretar los resultados obtenidos. - Confirmación de resultados El enriquecimiento selectivo de la muestra, realizado previamente con los medios que aporta el kit, puede utilizarse para continuar con el procedimiento tradicional de detección del patógeno, en caso de que fuera necesario confirmar un resultado positivo. Gama de Productos Reveal® Actualmente el Sistema Reveal® lo configuran 4 kits para detección de patógenos:

• Reveal® Salmonella

• Reveal® Salmonella SE

• Reveal® E.Coli 0157:H7

• Reveal® Listeria


Reveal® SALMONELLA - SALMONELLA SE Basado en la técnica de Inmunocromatografia de Flujo Lateral, Reveal Salmonella permite la detección en tan solo 20 horas de Salmonella sp en todo tipo de materias primas para alimentos, alimentos terminados y piensos para animales, lo que supone un importante ahorro de tiempo (más de 24 horas) y recursos en el screening de muestras. El sistema inmunológico utiliza una combinación única de anticuerpos que permite detectar más del 98 % de las especies de Salmonella responsables de infección aliementaria. El kit se suministra con todo el material necesario (medios de cultivo predosificados y estériles, cassettes inmunocromatográficos, bolsas estériles para incubación de la muestra, pipetas dispensadoras y probeta graduada) para realizar la técnica. Únicamente es preciso disponer de agua estéril y una estufa convencional para cultivo por lo que el test es apto para su utilización en cualquier tipo de instalaciones, no siendo preciso disponer de un laboratorio de microbiología especializado. El test se realiza en tres etapas. En primer lugar se realiza un enriquecimiento previo de la muestra (20 horas) en dos etapas para finalizar con la detección inmunológica (20 minutos) del patógeno mediante un cassette inmunocromatográfico . Ello supone un ahorro de más de 24 horas en comparación con los métodos tradicionales de detección de Salmonella sp - Pre-enriquecimiento de la muestra en medio REVIVE®

El medio REVIVE®, diseñado y formulado especialmente para este ensayo, es una de las claves de este kit. Permite una recuperación de las células de Salmonella que pueden estar dañadas en condiciones pobres de oxígeno, con lo que se aumenta sustancialmente la sensibilidad del test al recuperar un mayor número de células viables. El medio REVIVE®se suministra pre-dosoficado en viales monotest y esterilizado debiéndose rehidratar con agua estéril antes de realizar el test. - Enriquecimiento en medio selectivo (Selenito-Cisteina o Rappaport-Vasiliadis) Tras el pre-enriquecimiento en medio REVIVE®, se realiza un enriquecimiento selectivo de la muestra en medio SC (Selenito-Cisteina) o RV (Rappaport-Vasiliadis), dependiendo de la matriz a analizar. También en este caso, los medios selectivos se suministran predosificados en viales monotest , estériles que deben rehidratarse con agua estéril antes de realizar el ensayo. - Test Inmunocromatográfico Finalizado el enriquecimiento de la muestra, se realiza el ensayo inmunológico mediante un cassette inmunocromatográfico que en 20 minutos muestra de forma objetiva la presencia o ausencia del patógeno. La interpretación de los resultados se realiza observando el número de líneas de color azul que aparecen en la ventana de reacción. Es una interpretación objetiva que no precisa de un entrenamiento específico o instrumentación adicional.


Procedimiento del Test

.

Interpretación de Resultados Transcurridos 20 minutos desde que se dispensó la muestra en el cassette inmunocromatográfico, se realiza la lectura de resultados, observando el número de líneas de color azul que aparecen en dicha ventana

1 Rehidratar con 200 ml de agua estéril, el contenido de un vial de medio REVIVE® ,utilizando una de las bolsas de cultivo estériles suministradas.

2 Añadir 25 gramos de la muestra a la bolsa conteniendo el medio Revive rehidratado. Incubar a 37 ºC durante 2-4 horas

3 Rehidratar con 200 ml de agua estéril, el contenido de un vial de medio selectivo SC o RV ,utilizando una de las bolsas de cultivo estériles suministradas.

4 Añadir el contenido de la segunda bolsa (medio selectivo) a la primera bolsa (medio Revive). Incubar a 43ºC durante 16 horas RV) o 18 horas (SC)

5 Extraer una porción del líquido de la bolsa y dispensar 3 gotas en la ventana de muestra del cassette inmunocromatográfico Incubar 20 min. a temperatura ambiente

Resultado Negativo :Solo aparece la línea de control en la ventana de reacción

Resultado Positivo : Aparecen dos líneas de color en la ventana de reacción


Caracterísrticas técnicas de Reveal Salmonella Reveal Salmonella detecta más del 98 % de las espécies responsables de infecciones alimentarias por Salmonella incluyendo Salmonella typhymurium, Salmonella infantis y Salmonella enteritidis

• Límite de detección : 1-5 CFU/25 g de muestra

• Sensibilidad : 106 CFU/ml

• Tiempo de ejecución : Enriquecimiento : 20 horas Test : 20 minutos

• Conservación : Cassettes Inmunocromatográficos : 2-8 ºC Medios de cultivo : temperatura ambiente

• Presentación : Kit 20 test Validaciones El kit Reveal Salmonella ha sido validado por : AOAC-RI Certified and Performance Tested” - Licencia número : 960801 AFNOR – Certificado El método se utiliza por el Ministerio de Agricultura de USA (USDA(FSIS) Reveal® E.coli 0157:H7 La Escherichia coli (E.coli) es una enterobacteria comúnmente presente en el intestino de humanos y ganado. De hecho, el cultivo aeróbico de heces humanas y de ganado muestra que esta bacteria es la especie predominante en las heces. Algunas cepas concretas de la E.coli son capaces, sin embargo, de producir importantes enfermedades por diferentes mecanismos. El serotipo O 157:H7 es una variedad no muy común de la bacteria (afortunadamente) capaz de producir una toxina (verotoxina) extremadamente potente que causa importantes daños en la pared intestinal, produciendo un cuadro clínico conocido como colitis hemorrágica. La enfermedad se caracteriza por la aparición de dolor abdominal, acompañado de intensa diarrea sangrante. En algunos casos, especialmente en población joven, la intoxicación puede desarrollar complicaciones importantes, como anemia hemolítica y síndrome hemolítico renal que puede ocasionar graves daños renales e incluso la pérdida total de funcionalidad de uno o de los dos riñones. La carne (especialmente de ternera) y la leche son dos vehículos tradicionales de la intoxicación por E.coli O157:H7. La ingesta de carne cruda (steak tartare, carpaccio,..) o poco cocinada (hamburguesas, salchichas, ....) y de leche cruda son la causa más común de contagio alimentario. Basado en la técnica de Inmunocromatografia de Flujo Lateral, Reveal E.Coli 0157:H7 permite la detección del patógeno en 8 horas incluyendo el enriquecimiento de la muestra.


El kit se suministra con todo el material necesario (medio de cultivo predosificados y estériles, cassettes inmunocromatográficos, bolsas estériles para incubación de la muestra, pipetas dispensadoras y probeta graduada) para realizar la técnica. Únicamente es preciso disponer de agua estéril, una estufa convencional para cultivo y un pequeño baño maria, no siendo preciso disponer de un laboratorio de microbiología especializado. El test se realiza en dos etapas. En primer lugar se realiza un enriquecimiento previo de la muestra para finalizar con la detección inmunológica (15 minutos) del patógeno mediante un cassette inmunocromatográfico . - Enriquecimiento en medio selectivo La muestra se incuba durante 8 horas en un medio selectivo desarrollado especialmente para este ensayo (“E.coli 8 hour media”). Alternativamente, puede utilizarse un medio de cultivo específico para incubación en 20 horas (“E.coli 20 hour media”) cuando por razones de organización se prefiere utilizar una incubación durante la noche. Ambos medios selectivos se suministran predosificados en viales monotest , estériles que deben rehidratarse con agua estéril antes de realizar el ensayo. - Test Inmunocromatográfico Finalizado el enriquecimiento de la muestra, se realiza el ensayo inmunológico mediante un cassette inmunocromatográfico que en 15 minutos muestra de forma objetiva la presencia o ausencia del patógeno. La interpretación de los resultados se realiza observando el número de líneas de color azul que aparecen en la ventana de reacción. Procedimiento del Test

1 Rehidratar con 225 ml de agua estéril, el contenido de un vial de medio de cultivo ,utilizando una de las bolsas de cultivo estériles suministradas.

2 Añadir 25 gramos de la muestra a la bolsa conteniendo el medio rehidratado. Incubar a 42 ºC durante 8 horas

3 Retirar una porción de 3-4 ml del cultivo y dispensarla en un tubo de ensayo.

4 Incubar en un baño maria a ebullición durante 10 min.

5 Enfriar el líquido y dispensar 5 gotas en la ventana de muestra del cassette inmunocromatográfico Incubar 15 min. a temperatura ambiente


Interpretación de Resultados Transcurridos 15 minutos desde que se dispensó la muestra en el cassette inmunocromatográfico, se realiza la lectura de resultados, observando el número de líneas de color azul que aparecen en dicha ventana Caracterísrticas técnicas de Reveal E.coli 0157:H7

• Especificidad : 98 %

• Límite de detección : 1 CFU/25 g de muestra

• Sensibilidad : 104 CFU/ml

• Tiempo de ejecución : Enriquecimiento : 8 horas Test inmunológico : 15 minutos

• Conservación : Cassettes Inmunocromatográficos : 2-8 ºC Medio de cultivo : temperatura ambiente

• Presentación : Kit 20 test Validaciones El kit Reveal E.coli 0157:H7 ha sido adoptado como método oficial por la AOAC : “AOAC Official Method” - número : 2000.13 (método en 8 horas) “AOAC Official Method” - número : 2000.14 (método en 20 horas) Así mismo, el método ha sido aprobado por el Ministerio de Agricultura de los Estados unidos (USDA/FSIS)

Resultado Negativo : Solo aparece la línea de control en la ventana de reacción

Resultado Positivo : Aparecen dos líneas de color en la ventana de reacción

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