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UNIVERSIDAD DE MONTERREY DIVISIÓN DE CIENCIAS DE LA SALUD “Síntesis, adecuación y caracterización de biocompatibilidad de híbrido silica-quitosano para aplicaciones biomédicas” Presenta: Cecilia Rodríguez Martínez 249277 Juan Manuel Garza Rojas 252910 EN OPCIÓN AL TÍTULO DE: INGENIERO BIOMÉDICO Asesor: Dra. Laura Peña Parás 13 de mayo del 2016, San Pedro Garza García, N.L.
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UNIVERSIDAD DE MONTERREY
DIVISIÓN DE CIENCIAS DE LA SALUD
“Síntesis, adecuación y caracterización de biocompatibilidad de híbrido
silica-quitosano para aplicaciones biomédicas”
Presenta:
Cecilia Rodríguez Martínez 249277
Juan Manuel Garza Rojas 252910
EN OPCIÓN AL TÍTULO DE:
INGENIERO BIOMÉDICO
Asesor: Dra. Laura Peña Parás
13 de mayo del 2016, San Pedro Garza García, N.L.
2
Prólogo
Un biomaterial es aquél que interactúa en el cuerpo humano ya sea para
reemplazar alguna parte del cuerpo, mejorar alguna función, o ayudar en el
proceso de curación del cuerpo. Particularmente en este último se han
desarrollado recientemente biomateriales capaces de acelerar el proceso de
curado y/o mejorar el proceso de cicatrización.
En este estudio, los alumnos Cecilia y Juan Manuel han desarrollado biomateriales
híbridos de silica-quitosano, los cuales pueden combinar las propiedades que
muestran de manera individual sus componentes. Después de una ardua
investigación de la literatura y numerosas pruebas de laboratorio los alumnos
desarrollaron un híbrido con excelentes características físicas que le permiten su
aplicación como apósito de tipo hidrogel. Así también, realizaron pruebas de
citotoxicidad para conocer su biocompatibilidad en un ambiente celular.
Agradezco a los co-asesores del proyecto Dr. Román Vidal Tamayo y al Dr
Antonio Sánchez Fernández por todo el apoyo brindado para realizar la
experimentación y análisis de los materiales. A Cecilia y Juan Manuel les
agradezco la confianza brindada y su actitud siempre positiva ante todas las
adversidades encontradas a los largo de la investigación, lo cual les será de gran
provecho al incorporarse al mundo laboral.
Los felicito también a ambos, ya que han combinado conocimientos de química,
materiales, e ingeniería en el desarrollo y aplicación de un biomaterial innovador,
lo cual es una gran área de oportunidad en la actualidad. Muchas felicidades y que
vengan más logros para ambos.
Laura Peña Parás
Mayo de 2016
3
Agradecimientos En primera instancia, quiero agradecer a mis padres, René Rodríguez Garza y
Linda María Martínez Cantú, por haberme apoyado en la decisión de estudiar la
carrera de ingeniero biomédico. No hubiera sido posible cumplir este sueño sin
ustedes. Gracias por darme la oportunidad de tener una excelente formación
académica desde pequeña, pero sobre todo gracias por los buenos valores que
me han inculcado, y que ahora son pilares en mi vida. Gracias por creer en mis
capacidades para lograr cada meta que me proponga. Fueron mi principal
motivación durante todo este tiempo y seguirán siéndolo en cada etapa de mi vida.
No sería el ser humano que soy sin ninguno de los dos; los amo con todo mí ser.
A mi maestra y asesora, la Dra. Laura Peña Parás por confiar en mí y siempre
apoyarme a lo largo del semestre. Gracias por ser la maestra tan divertida e
inteligente que es y por ser la asesora que nunca nos permitió perder la
motivación.
Al Dr. Román Vidal-Tamayo Ramírez por su gran apoyo y sus palabras de aliento
durante el proceso y al Dr. Antonio Sánchez Fernández por compartir todos sus
conocimientos para el desarrollo de este proyecto.
Al Ing. Jorge Takenaga Fukushima, quien estuvo presente desde el primer día de
clases hasta ahora, siempre con ganas de instruirnos y prepararnos para lo que
sigue.
A mis compañeros y amigos, Salvador Flores y Jaqueline Kort, por su apoyo
desinteresado en los momentos donde más los necesité. A Lorena García, Fiorella
Canales, Mara Duran, Luis Javier Sepúlveda y Diego Arsuaga, quienes trabajaron
y convivieron conmigo durante 5 años. Me enseñaron a no caer en la conformidad
y echarle ganas a la escuela. A todos los considero excelentes personas y de gran
corazón.
Quiero agradecer a Juan Manuel Garza, por ser un buen compañero de equipo.
Gracias por compartir conmigo todos aquellos momentos tanto de triunfo como de
angustia e incertidumbre. Gracias por trabajar arduamente para sacar adelante
este proyecto.
4
En especial, quiero agradecer a Juan Pablo Armijo por ser mi soporte; por
aguantar mis días de estrés y por celebrar mis pequeño paso hacia delante.
Nunca creí tener a mi lado a una persona que me inspirara tanto tú. Me haces
querer dar siempre lo mejor y querer encontrar la mejor versión de mí. Por esto y
tantas cosas más, gracias.
Cecilia Rodríguez Martínez
Para realizar un proyecto con este alcance y complejidad, no sólo fueron
necesarias dos personas que conformaron el equipo de trabajo, sino que fue
necesario del apoyo de otros más a los cuales les agradezco tanto esfuerzo e
interés por nuestro crecimiento formativo.
Dentro de estas personas, primero menciono a nuestra asesora, la doctora Laura
Peña, quien nos confió un proyecto que se tenía planeado realizar y nos asesoró
de cómo realizarlo durante todo su proceso; al docto Román Vidal, por enseñarnos
cuales eran los procedimientos a seguir y cómo realizarlos de una manera segura
y correcta. También al doctor Antonio Sánchez, por facilitarnos algunos protocolos
que seguimos y un poco de material utilizado.
A nuestros compañeros y amigos, que siempre nos apoyaron y animaron a seguir
esforzándonos y terminar el camino a la graduación que con nosotros recorrían.
Con una mención especial del grupo “Mathlap”, con todos los miembros
implicados y a “Los10”, que sin ellos no estaría completo.
Y, por último, pero no menos importante, a mi familia, que siempre tuvieron la
confianza puesta en mí, que nunca dejaron de alentarme y darme palabras de
apoyo. Siempre ofreciendo sus oraciones por mí, yo nunca me sentí sólo en el
trayecto hasta este punto y estoy seguro que nunca lo estaré.
Juan Manuel Garza Rojas
5
Contenido
Índice de tablas ..................................................................................................... 10
Resumen ............................................................................................................... 11
1. Introducción .................................................................................................... 13
1.1. Justificación .............................................................................................. 14
1.1. Antecedentes ............................................................................................ 15
1.1.1. Materiales híbridos de silica-quitosano para aplicaciones biomédicas por E. Mendoza y L. Bautista. [7] ................................................................... 15
1.2. Objetivos ................................................................................................... 16
1.2.1. Objetivo general ............................................................................... 16
1.2.2. Objetivos particulares ...................................................................... 16
1.3. Alcance ..................................................................................................... 16
1.4. Metodología de la investigación ................................................................ 16
2. Marco Teórico ................................................................................................ 18
2.1. Cicatrización, infección y tratamiento de heridas ...................................... 18
2.2. Apósitos .................................................................................................... 24
2.3. Biomateriales ............................................................................................ 30
2.3.1. Biomateriales cerámicos .................................................................. 31
2.3.2. Biomateriales poliméricos ................................................................ 32
2.3.3. Hidrogeles ........................................................................................ 34
2.4. Híbridos .................................................................................................... 35
2.4.1. Aplicaciones generales de materiales híbridos ................................ 36
2.4.2. Híbridos producidos por el método sol-gel ....................................... 38
2.4.3. Silica-quitosano ................................................................................ 39
2.4.4. Aplicaciones de silica-quitosano ...................................................... 40
2.5. Medición de biocompatibilidad .................................................................. 43
3. Materiales y Métodos ..................................................................................... 45
3.1. Materiales ................................................................................................. 45
6
3.2. Experimentación ....................................................................................... 46
3.2.1. Síntesis del híbrido .......................................................................... 46
3.2.2. Adecuación de híbrido ..................................................................... 49
3.2.3. Pasos preliminares para pruebas de citotoxicidad ........................... 55
3.3. Prueba de citotoxicidad............................................................................. 60
3.3.1. Deposito del híbrido silica-quitosano para la prueba de citotoxicidad en placa de 96 pozos ..................................................................................... 60
3.3.2. Sembrado de células y el escalamiento de número de células........ 65
3.3.3. Prueba de citotoxicidad por luminiscencia ....................................... 69
4. Resultados ..................................................................................................... 74
4.1. Resultados de pruebas de estabilidad ...................................................... 76
4.2. Resultados de ajuste del pH ..................................................................... 78
4.3. Resultado de esterilización ....................................................................... 79
4.4. Resultados de pruebas preliminares......................................................... 80
4.5. Resultado de prueba de citotoxicidad ....................................................... 84
5. Conclusiones y trabajo futuro ......................................................................... 91
Referencias ........................................................................................................... 93
7
Índice de figuras
FIGURA 1-1 INFECCIÓN EN HERIDA SUPERFICIAL SUTURADA .................... 14
FIGURA 2-1 DIAGRAMA E ETAPAS DEL PROCESO DE CICATRIZACIÓN ....... 18
FIGURA 2-2 TIPOS DE CICATRICES. CICATRIZ A) NORMAL, B)
HIPERTRÓFICA, C) QUELOIDE, D) INSUFICIENTE .................................... 20
FIGURA 2-3 APÓSITOS PASIVOS: A) GASA. B) TRADICIONALES Y C)
ESPUMAS ...................................................................................................... 26
FIGURA 2-4 APÓSITOS INTERACTIVOS: A) TULL, B) ESPUMA HIDROFÍLICA Y
C) TRASPARENTES ...................................................................................... 27
FIGURA 2-5 APÓSITO BIOACTIVOS; A) HIDROCOLOIDE, B) ALGINATOS E C)
HIDROGEL. ................................................................................................... 29
FIGURA 2-6 APÓSITOS MIXTOS: A) ANTIMICROBIANO DESODORANTE Y B)
ABSORBENTE ............................................................................................... 29
FIGURA 2-7 LOS DIFERENTES TIPOS DE MATERIALES HÍBRIDOS [2] .......... 36
FIGURA 2-8 DIFERENCIAS EN EL MECANISMO DEPENDIENDO DEL TIPO DE
CATÁLISIS EMPLEADO EN EL PROCESO DE SOL-GEL BASADO EN
SILICÓN [2] .................................................................................................... 38
FIGURA 2-9 UNIÓN DE SILICA Y QUITOSANO [18] ........................................... 39
FIGURA 2-10 TEJIDO ÓSEO Y MEMBRANA 3 DÍAS DESPUÉS DE LA
IMPLANTACIÓN DE LAS MEMBRANAS; A) QUITOSANO PURO Y B)
HÍBRIDO SILICA-QUITOSANO [24] .............................................................. 41
FIGURA 2-11 SUTURA DE ÁCIDO POLIGLICÓLICO PGA CON
RECUBRIMIENTO DE SILICA-QUITOSANO [7] ........................................... 42
FIGURA 2-12 NANOESFERAS DE SILICA-QUITOSANO PARA LA LIBERACIÓN
CONTROLADO DE FÁRMACOS ENFOCADA A LA TERAPIA DE CÁNCER
DE MAMA [27] ............................................................................................... 42
FIGURA 3-1 MATERIALES PARA LA SÍNTESIS DEL HÍBRIDO SILICA-
QUITOSANO .................................................................................................. 45
FIGURA 3-2 BÁSCULA ANALÍTICA DE ALTA PRECISIÓN PARA MEDIR EL
QUITOSANO EN POLVO .............................................................................. 47
8
FIGURA 3-3 AGREGADO DE QUITOSANO AL MATRAZ .................................... 47
FIGURA 3-4 MATRAZ EN PLANCHA AJUSTADA EN 300 RPM A 90ºC ............. 48
FIGURA 3-5 AGREGADO DE TEOS .................................................................... 48
FIGURA 3-6 MUESTRAS PARA PRUEBA DE ESTABILIDAD ............................. 49
FIGURA 3-7 TUBO FALCON CON MEZCLA ........................................................ 50
FIGURA 3-8 AGITACIÓN ASISTIDO POR EL VÓRTEX MIXER ......................... 51
FIGURA 3-9 ACOMODO DE TUBOS DENTRO DE LA CENTRÍFUGA ................ 51
FIGURA 3-10 TIRAS INDICADORAS DE PH CON COLOR ................................. 52
FIGURA 3-11 DISTINTAS PRESENTACIONES DE SILICA-QUITOSANO A)
MUESTRA EN GEL Y GEL SATURADO EN AGUA DESTILADA B)
MUESTRA EN POLVO .................................................................................. 53
FIGURA 3-12 PROCESO PARA LA OBTENCIÓN DE SILICA-QUITOSANO EN
POLVO A) MUESTRA DE HÍBRIDO EN GEL, B) MUESTRA DE HÍBRIDO
DESHIDRATADO, C) MORTERO Y PISTILO, D) MUESTRA DE HÍBRIDO EN
POLVO ........................................................................................................... 54
FIGURA 3-13 COLOCACIÓN DE TRIPSINA ........................................................ 57
FIGURA 3-14 AGREGADO DE MEDIO A FALCON.............................................. 58
FIGURA 3-15 PELLET DE CÉLULAS ................................................................... 58
FIGURA 3-16 ORDEN DE CONTEO DE CÉLULAS ............................................. 59
FIGURA 3-17 MUESTRA CON AGUA DESTILADA ............................................. 61
FIGURA 3-18. APERTURA DE CAJA DE 96 POZOS ........................................... 62
FIGURA 3-19. PIPETA PARA MOVER 100 µL DE MUESTRA ............................. 62
FIGURA 3-20. MUESTRA DEPOSITADA EN POZOS .......................................... 63
FIGURA 3-21. PLACA SELLADA CON MUESTRA .............................................. 63
FIGURA 3-22. PIPETA PARA MANIPULAR 50 µL ............................................... 64
FIGURA 3-23. AGUA DESTILADA DE POZOS .................................................... 64
FIGURA 3-24. PELÍCULA DE MUESTRA EN POZOS.......................................... 65
FIGURA 3-25. LLENADO DE TUBOS EPPENDORF ........................................... 67
FIGURA 3-26. DISGREGACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES ........ 67
FIGURA 3-27. LLENADO DE POZOS CON DIFERENTES NÚMEROS DE
CÉLULAS ....................................................................................................... 68
9
FIGURA 3-28. BUFFER DE CELLTILTER-GLO ................................................... 70
FIGURA 3-29. AGREGADO DE BUFFER EN FRASCO CON SUSTRATO .......... 70
FIGURA 3-30. RECIPIENTE CONTENEDOR DE MEZCLA BUFFER/SUSTRATO
....................................................................................................................... 71
FIGURA 3-31. DEPOSITO DE MEZCLA EN LOS POZOS ................................... 71
FIGURA 3-32. AGITACIÓN DE PLACA ................................................................ 72
FIGURA 3-33. COLOCACIÓN DE PLACA EN MÁQUINA DE LUMINISCENCIA . 73
FIGURA 4-1 EJEMPLO DE ALMACENAMIENTO DE HÍBRIDO EN FRASCOS.
IZQUIERDA: FRASCO CON MUESTRA, DERECHA: FRASCO CON
MUESTRA SATURADA EN AGUA DESTILADA. .......................................... 76
FIGURA 4-3 PLACA PETRI CON MUESTRA EN POLVO .................................... 81
FIGURA 4-4 PLACA PETRI CON MUESTRA EN GEL ......................................... 81
FIGURA 4-5 POZO CON CONCENTRACIÓN 1 DE MUESTRA EN POLVO: A)
IMAGEN NORMAL E B) IMAGEN EN MICROSCOPIO ................................. 82
FIGURA 4-6 POZO CON CONCENTRACIÓN 1 DE MUESTRA EN GEL: A)
IMAGEN NORMAL E B) IMAGEN EN MICROSCOPIO ................................. 82
FIGURA 4-7 PLACA PETRI DE 6 POZO CON DISTINTAS CONCENTRACIONES
DE SILICA-QUITOSANO Y CULTIVOS CELULARES ................................... 83
FIGURA 4-8 IMAGEN MICROSCÓPICA DE LOS 6 POZOS CON CULTIVOS
CELULARES .................................................................................................. 84
FIGURA 4-9. GRÁFICA DE ESCALAMIENTO DE NÚMERO DE CÉLULAS ........ 87
FIGURA 4-10 GRÁFICA DE RESULTADOS DE PRUEBA DE VIABILIDAD
CELULAR CON SILICA-QUITOSANO ........................................................... 89
FIGURA 4-11 GRÁFICA DE RESULTADOS DE VIABILIDAD CELULAR CON
MONÓMEROS TEOS Y QUITOSANO MEZCLADOS ................................... 90
10
Índice de tablas
TABLA 2.1 FACTORES QUE AFECTAN LA CICATRIZACIÓN DE HERIDAS [7] 21
TABLA 2.2 DOLOR, MALESTAR, TIEMPO DE EPITELIZACIÓN Y RESULTADOS
ESTÉTICOS EN HERIDAS QUIRÚRGICAS DE DIFERENTES
TOPOGRAFÍAS [4] ........................................................................................ 22
TABLA 2.3 ANTISÉPTICOS QUE SE UTILIZAN EN EL TRATAMIENTO DE LA
INFECCIÓN EN HERIDAS [6] ....................................................................... 23
TABLA 2.4 BIOCERÁMICOS MÁS COMUNES Y SUS APLICACIONES [1] ........ 31
TABLA 2.5 BIOPOLÍMEROS MÁS COMUNES Y SUS APLICACIONES [1] ......... 32
TABLA 2.6 DIFERENTES POSIBILIDADES DE COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA
DE MATERIALES HÍBRIDOS [2] ................................................................... 35
TABLA 2.7 ISO 10993 ESTANDARIZACIÓN DE EVALUACIÓN BIOLÓGICA
PARA DISPOSITIVOS MÉDICOS POR PARTES RELEVANTES A ENSAYO
IN VITRO PARA LA COMPATIBILIDAD DE CÉLULAS Y TEJIDOS [1] ......... 43
TABLA 3.1 CANTIDADES DE CADA MUESTRAS ............................................... 46
TABLA 3.2 MODO Y TIEMPO DE ESTERILIZACIONES DE LAS DIFERENTES
MUESTRAS DE SILICA-QUITOSANO .......................................................... 54
TABLA 3.3 CONCENTRACIONES DE SÍLICA-QUITOSANO EN PLACA PETRI . 56
TABLA 4.1 MUESTRAS DE SILICA-QUITOSANO PRODUCIDAS POR EL
MÉTODO SOL-GEL ....................................................................................... 74
TABLA 4.2 RESULTADOS DE LA PRUEBA DE ESTABILIDAD ........................... 76
TABLA 4.3 NÚMERO DE LAVADOS VS PH ......................................................... 78
TABLA 4.4 RESULTADOS DE LA MODIFICACIÓN DEL PH ............................... 78
TABLA 4.5 RESULTADOS ARROJADOS POR LA PRUEBA DE LUMINISCENCIA
....................................................................................................................... 85
TABLA 4.6 RESULTADOS DE ESCALAMIENTO DE CÉLULAS .......................... 86
TABLA 4.7 CONVERSIÓN DE VALORES DE LUMINISCENCIA A NÚMERO DE
CÉLULAS CORRESPONDIENTE .................................................................. 88
11
Resumen
La investigación de nuevos materiales híbridos es una necesidad para el
desarrollo de nuevos productos o dispositivo con aplicaciones biomédicas. Según
la literatura, el híbrido silica-quitosano ha demostrado características favorables
para su aplicación como apósito para la asistencia en el proceso de cicatrización
de heridas por ser altamente biocompatible, tener propiedades antibacteriales,
entre otras. El silica-quitosano está compuesto por un cerámico y un polímero que
se basa en la unión de los grupos funcionales silanol por parte de la silica y los
amino por parte del quitosano. En el presente proyecto, la síntesis de 5 muestras
con distintas concentraciones de quitosano y sus demás componentes (80%-20%,
85%-15%, 90%-10%, 95%-5% y 98%-2%; siendo el primer segundo porcentaje la
concentración de quitosano y el primero el resto de los componentes) se producen
por medio del método sol-gel. Posteriormente, se adecúa para realizar pruebas de
citotoxicidad. Con una prueba de estabilidad, se demostró que la concentración
óptima para su aplicación a las pruebas fue la muestra con concentración 95%-5%
ya que mostraba una mejor consistencia que las demás. Para adecuar el híbrido
se requirió la modificación de su pH, ya que éste presentaba un pH de entre 3 y 4;
lo que lo hacía muy ácido para realizar las pruebas de citotoxicidad. Por medio de
un proceso de “lavados” se logró modificar el pH a 6 y continuar con su desarrollo.
Se trabajaron con 3 presentaciones de silica-quitosano: gel, gel saturado en agua
destilada y polvo. Se mostró que la mejor presentación para esterilizar el material
fue el gel saturado en agua destilada. Se realizaron pruebas preliminares para las
pruebas de citotoxicidad donde se depositó diferentes concentraciones (1, 1/2, 1/4,
1/6 y 1/8) del híbrido con medio celular en una placa Petri de 6 pozos para
analizar su interacción con el medio y verificar la formación de una película
adherida a la superficie de los pozos. Se mostró que la presentación en polvo no
era viable porque se formaban granulaciones de polvo hinchado; sin embargo, la
muestra en gel con una concentración de 1 formó una película adecuada para su
evaluación en las pruebas de citotoxicidad. Más adelante, se sembraron 200,000
12
células C6 de rata en los pozos con silica-quitosano y medio celular; se analizó
después de 24 horas para que las células pudieran adherirse. Se mostró que
todas las concentraciones mostraban muerte celular. Esto pudo ser a causa de
una errada adherencia de las células a la muestra de sílica-quitosano en la
superficie de los pozos. Finalmente, se realizó la prueba de citotoxicidad utilizando
el protocolo de la prueba Celltiter-Glo la cual es una prueba de luminiscencia que
indica la viabilidad de las células. Se depositaron células para su análisis en 6
horas, 3 horas y 1 hora. La prueba de 3 horas se tuvo que descartar por un sesgo
importante. Por lo que se analizaron las células expuestas al silica-quitosano por 6
y 1 hora. Se mostró muerte celular en todas las pruebas realizadas.
Seguidamente, se realizó la misma prueba con células expuestas a los
monómeros TEOS y quitosano por 24, 48 y 72 horas donde se descubrió
proliferación celular, por lo que se determinó que el TEOS y el quitosano sí son
biocompatibles; sin embargo, el proceso de síntesis del silica-quitosano no lo es.
Esto puede ser por la utilización de ácido acético en el método sol-gel el cual no
se “lava” completamente al momento de modificar el pH y perturba a las células
expuestas a este material. Por lo tanto, se concluyó que se deben realizar
modificaciones en el proceso de síntesis de sílica-quitosano.
13
1. Introducción
El desarrollo de nuevos biomateriales ha tenido un gran auge en las últimas
décadas. Una amplia gama de materiales han sido objeto de investigación para
determinar si éstos pueden ser capaces de interactuar con el cuerpo humano sin
causar reacciones negativas en él. Materiales tanto orgánicos como sintéticos se
han desarrollado con el mismo objetivo.
Los últimos avances científicos se han enfocado en crear compuestos que puedan
combinar las propiedades de 2 o más materiales para tener características
superiores que sus constituyentes; a estos compuestos se les conoce como
híbridos. Los materiales híbridos generalmente se componente de un elemento
orgánico y otro inorgánico. Las combinaciones no son mezclas físicas entre los
materiales sino químicas, donde los componentes interactúan a nivel molecular.
Algunos de estos híbridos han demostrado tener características favorables para su
utilización en aplicaciones biomédicas. Específicamente, materiales híbridos que
son conformados a base de silicón y que forman hidrogeles han sido investigados
para aplicaciones como: filtros, liberación de fármacos, sensores, espejos
absorbentes, y apósitos. [1, 2]
En este caso, la aplicación en la que se quiere enfocar es el apósito. Un apósito es
cualquier producto sanitario que se emplea para cubrir y proteger una herida para
fomentar la cicatrización. [3] El proceso de cicatrización tiene como fin el restaurar
la integridad de los tejidos corporales después de una alteración a causa de una
herida en el cuerpo. Propiedades como la biocompatibilidad y la resistencia a
microbios son importantes en los materiales utilizados como apósitos para que
puedan favorecer a la obtención de buenos resultados en el proceso de curación
de una herida y, también, a prevenir riesgos de infecciones.
Cuando una herida se infecta es a causa de bacterias que se infiltran dentro de los
tejidos corporales y se empiezan a multiplicar. Esto puede repercutir en factores
como la presencia de dolor durante el proceso, un aumento en el tiempo de
recuperación y resultados estéticos afectados. [4]
14
En la presente investigación se explica a detalle el desarrollo de la síntesis del
híbrido silica-quitosano, su adecuación, la realización de pruebas para determinar
su citotoxicidad y el análisis de resultados para posible aplicación como apósito
para asistir en el proceso de cicatrización y prevenir infecciones.
1.1. Justificación
Cuando el estado normal de la piel se ve alterada por el resultado de cualquier
herida, el proceso de curación comienza. Se le conoce como proceso de
cicatrización a la secuencia de sucesos que tienen como finalidad la restauración
de la integridad física de la piel a través de la epitelización completa de la lesión.
La duración de este proceso depende de varios factores que se clasifican en dos
categorías: locales y sistemáticos. Uno de los factores locales con mayor riesgo
para el ser humano es la infección. [5]
Figura 1-1 Infección en herida superficial suturada
La infección es el ingreso y la multiplicación de gérmenes y bacterias dentro de los
tejidos corporales. Este factor puede dar lugar a la interrupción del proceso de
cicatrización o a un mal resultado de éste. [6] El riesgo de infección superficial
durante la cicatrización es del 5%, en un ambiente séptico. Sin embargo, el
15
porcentaje puede aumentar dependiendo de las regulaciones de higiene aplicadas
durante las etapas de curación. La infección de una herida puede repercutir de
distintas formas. Son 3 los principales efectos negativos que se pueden
manifestar: presencia de dolor, aumento en la duración del proceso de
cicatrización y resultados estéticos desfavorables. [4]
Es posible prevenir la aparición de infecciones en heridas con tratamientos que:
Optimicen la respuesta del huésped
Reduzcan el número de microorganismos [6]
Biomateriales avanzado en forma de geles o apósitos se han encontrado viables
como aplicación de tratamiento para que éstos impidan la generación de un foco
infeccioso en heridas superficiales.
1.1. Antecedentes
El presente proyecto busca complementar a y proseguir con la investigación que
se describe a continuación.
1.1.1. Materiales híbridos de silica-quitosano para aplicaciones
biomédicas por E. Mendoza y L. Bautista. [7]
En este estudio se realizó la síntesis general de compuestos híbridos de silica-
quitosano a través del método sol-gel y, de acuerdo a las propiedades que se
obtuvieron de cada híbrido, se propone la posibilidad de que se utilice como
biomaterial para aplicaciones biomédicas.
La aplicación seleccionada fue la de recubrimientos de suturas quirúrgicas con los
híbridos en cuestión. El desarrollo del experimento consistió en impregnar dos
tipos de suturas (seda y ácido poliglicólico PGA) con los compuestos de silica-
quitosano.
Posteriormente, se probaron las suturas bajo tensión para reportar resultados y se
detectó un aumento en los valores de elongación de las suturas de seda, por lo
16
que se mostró que mejora la ductilidad de la sutura. Asimismo, se demostró que
los recubrimientos de silica-quitosano en los dos tipos de suturas no alteran las
propiedades mecánicas de éstas.
Se concluyó que el híbrido silica-quitosano puede ser útil cuando se añade en la
superficie de la sutura o como parte de ella para favorecer el proceso de
cicatrización.
1.2. Objetivos
A continuación se declara el objetivo general, así como los objetivos particulares
del proyecto.
1.2.1. Objetivo general
Síntesis y adecuación del hibrida sílica-quitosano para lograr realizar prueba para
la determinación de su citotoxicidad.
1.2.2. Objetivos particulares
Síntesis del híbrido silica-quitosano
Adecuación del híbrido para realizar pruebas de caracterización de
biocompatibilidad
Realización de las pruebas necesarias para determinar la citotoxicidad del
híbrido.
1.3. Alcance
Se busca desarrollar un híbrido con aplicaciones biomédicas. Asimismo, difundir
los resultados obtenidos mediante la preparación de artículos técnicos para su
posible publicación y/o ponencias para congresos.
1.4. Metodología de la investigación
La siguiente lista muestra los pasos que se siguieron para la realización de este
proyecto:
17
1. Investigación el estado del arte
2. Selección de materiales
3. Preparación y adecuación del híbrido
4. Experimentación
5. Análisis de resultados
6. Conclusiones y trabajo futuro
18
2. Marco Teórico
2.1. Cicatrización, infección y tratamiento de heridas
Se le conoce como proceso de cicatrización a la secuencia de sucesos que tienen
como finalidad la restauración de la integridad física de la piel a través de la
epitelización completa de la lesión. Este proceso se divide en 5 etapas que se
superponen parcialmente. Las etapas son: inflamación, proliferación o formación
de tejido, maduración y remodelado de la cicatriz y contracción de la herida. [8]
A B
C D
Figura 2-1 Diagrama e etapas del proceso de cicatrización
La inflamación es la respuesta inmediata a una lesión y es cuando se produce la
hemostasia espontánea. En esta fase se realizan los esfuerzos del tejido para
tratar de limitar los daños como: detener la hemorragia, sellar la superficie de la
19
herida y suprimir el tejido necrótico, cuerpo extraño o bacterias presentes. Para
esto surgen 3 características importantes de la inflamación:
Se aumenta la permeabilidad vascular
Se secretan citosinas y factores de crecimiento
Se activan células migratorias dirigidas hacia la herida por quimiotaxis [8]
Estas células migratorias son neutrófilos los cuales colaboran en la eliminación de
bacterias y cuerpos extraños, así como restos necróticos. Al mismo tiempo los
macrófagos aparecen para mejorar la capacidad de coagulación y asistir en la
formación de la cicatriz. La siguiente etapa es la proliferación o formación de tejido
donde se repara el epitelio dañado. Son necesarias dos procesos para que esta
fase se desarrolle: angiogénesis y fibroplasia. [8]
La angiogénesis es el proceso en el cual se forman nuevos vasos sanguíneos que
se introducen en el centro de la herida de una manera progresiva para ayudar al
cicatrizado. Por otro lado, la fibroplasia se encargan de desarrollar fibroblastos que
forman colágeno y sustancias fundamentales como la fibrina y fibronectina con la
misma finalidad. Estos dos acontecimientos tienen una alta relación ya que la
proliferación fibroblástica depende del desarrollo vascular por el aporte de
oxígeno.
Posteriormente, se conduce a la etapa de maduración y remodelado de la cicatriz.
En esta fase la herida ya cuenta con tejido conectivo reparador, sin embargo, ésta
no ha alcanzado la solidez necesaria para resistir agresiones externar como
compresión o tensión. Por lo tanto, el tejido requiere madurar para adaptarse a las
exigencias mecánicas. En esta etapa el número de capilares y la concentración de
fibroblastos disminuye formando la cicatriz. Por último sucede la contracción de la
herida donde los bordes de la herida se aproximan para disminuir su extensión y
así reducir la necesidad de síntesis de tejido reparador.
El resultado final del proceso de cicatrización puede variar dependiendo de
factores que se mencionan más adelante. Por lo tanto, se puede tener distintos
tipos de cicatrices, lo cuales pueden ser:
20
Cicatriz normal – aquellas donde la piel se restableció con mínimo rastro,
sin distensión, depresión o elevación. No causan dolor ni trastornos
funcionales.
Cicatriz hipertrófica – A raíz de una hiperproducción del tejido conectivo,
estas cicatrices se proyectan por encima de la superficie de la piel,
generalmente engrosadas y enrojecidas.
Cicatriz queloide – son proliferaciones protuberantes de tejido cicatricial.
Esto a causa de una hiperproducción de tejido conectivo también.
Cicatriz insuficiente – son inestables y crónicas donde el tejido conectivo no
llega a cubrir la herida adecuadamente. [3]
A B
C D
Figura 2-2 Tipos de cicatrices. Cicatriz A) Normal, B) Hipertrófica, C) Queloide, D) Insuficiente
Existen factores tanto internos como externos que pueden afectar la cicatrización,
éstos se dividen en 2 categorías: sistemáticos y locales. (Tabla 2.1) [8]
21
Tabla 2.1 Factores que afectan la cicatrización de heridas [7]
Sistemáticos Locales
Edad
Nutrición
Traumatismos
Enfermedades metabólicas
Inmunosupresión
Trastornos del tejido conjuntivo
Tabaquismo
Lesión mecánica
Infección
Edema
Isquemia/necrosis de tejido
Agentes tópicos
Radiación ionizante
Tensión de oxígeno baja
Cuerpos extraños
Uno de los factores que se desea abordar en esta investigación es la infección. La
infección es el ingreso y la multiplicación de gérmenes y bacterias dentro de los
tejidos corporales. Cuando los tejidos de la herida se dañan está ocurriendo una
infección local; al momento de que las bacterias empiecen a causar problemas en
los tejidos vecinos se tiene una infección difusa y cuando causan una enfermedad
sistemática se le conoce como infección generalizada. [6]
En un estudios realizado por el Dr. Bazzan [4] se demostró cómo puede afectar
una infección en la recuperación de una herida. Pueden ser 3 los factores
afectados por un foco infeccioso:
Tiempo de epitelización
Presencia de dolor
Resultado estético
La siguiente tabla muestra los resultados de la investigación mencionada
anteriormente sobre el proceso de cicatrización de 10 casos. Se señala que el
tiempo de recuperación de la piel aumentó en las dos heridas donde se presentó
una infección en comparación con el tiempo de cicatrización de heridas sin
infección. Asimismo, se indicó la presencia de dolor en una de las heridas
22
infectadas y malestar en ambas. También se advierte que una de las heridas
donde la infección ocurrió hubo un resultado estético regular y no bueno.
Tabla 2.2 Dolor, malestar, tiempo de epitelización y resultados estéticos en heridas quirúrgicas de diferentes topografías [4]
El tratamiento eficaz de heridas infectadas es esencial para evitar que evolucione
negativamente. El objetivo de estos tratamientos se divide en dos elementos:
La optimización de la respuesta del huésped
La reducción del número de microorganismos [6]
El optimizar la respuesta del huésped hará que la capacidad del cuerpo para
luchar contra una infección aumente y la capacidad de cicatrización mejore. Para
lograrlo es necesario la aplicación de medidas que aborden los factores que
posiblemente hayan favorecido a la infección de la herida. Por otro lado, la
reducción del número de microorganismos se combate aplicando las medidas de
higiene adecuadas para evitar una nueva contaminación o una contaminación
cruzada. Por lo tanto, se debe de considerar la utilización de un elemento que sea
capaz de proteger la herida.
Existen en el mercado numerosos productos antisépticos que se encuentran en
distintas presentaciones: líquidos, cremas, geles, pomadas, aerosoles y apósitos
23
impregnados. [6] El método de aplicación dependerá de la utilidad práctica de
determinado producto. Algunos se deben de aplicar diariamente, otros requieren
varias aplicaciones al día y otros se dejan durante un determinado tiempo en
contacto con la herida. A continuación se expone una tabla con antisépticos que
se utilizan para tratar infecciones en heridas. Algunos de estos antisépticos son
considerados como biomateriales ya que tratan una parte del cuerpo herido y la
ayudan a sanar. En el apartado 2.3 se definirá a detalle las características
generales de estos materiales que actualmente son investigados para nuevas
aplicaciones médicas.
Tabla 2.3 Antisépticos que se utilizan en el tratamiento de la infección en heridas [6]
Antisépticos Formulaciones Notas
Ácido acético Solución Proteger durante su uso la piel que
rodea la herida
Clorhexidina Solución, polvo, apósitos,
impregnados
Se utiliza como alternativa e
pacientes alérgicos a los preparados
que contienen yodo
Hipoclorito sódico Solución No se recomienda salvo que no se
disponga de alternativas adecuadas
Miel Aplicación directa, apósitos
impregnados
Se atribuyen efectos antimicrobianos
a algunos componentes y
propiedades físicas. Pero, la
composición es muy variable, lo que
dificulta la comparación entre
estudios clínicos
Permanganato
potásico
Solución, comprimidos que se
disuelven en agua
Se usa como remojo para reducir la
carga bacteriana de la herida
Tiene efecto astringente, es útil en
heridas con exudado abundante
Peróxido de
hidrogeno
Solución, crema Se recomienda tener precaución al
utilizar la solución porque se han
descrito de embolia gaseosa
Plata Sulfadiazina argéntica; crema,
apósitos impregnados,
Plata iónica: apósitos
impregnados, plata
Disponible en varias presentaciones
que contienen sulfadiazina argéntica
(combinación de plata y antibiótico)
24
nanocristalina Mas recientes son los apósitos que
liberan átomos de plata cargados al
entrar en contacto con el exudado de
la herida
Polihexametil
biguanida (PHMB)
Solución, apósitos
impregnados
Se utiliza sobre todo en quemaduras
Triclosán Solución, apósitos
impregnados
Se utiliza como desinfectante de la
piel o para el lavado quirúrgico
Yodo Povidona yodada: solución,
crema, pomada, aerosol,
apósitos impregnados
Cadexómero yodado: pomada,
pasta, polvo, apósitos
impregnados.
Los productos modernos liberan
lenta y relativamente bajas
cantidades de yodo, lo que reduce la
probabilidad de toxicidad y
pigmentación.
La povidona de yodo es un complejo
de yodo más surfactante
El cadexómero yodado libera yodo a
partir de unas microesferas muy
absorbentes mediante un sistema de
liberación retardada y gradual
La tabla anterior menciona frecuentemente el uso de apósitos impregnados con
distintos antisépticos, lo que lo hace un recurso altamente utilizado y recomendado
para el tratamiento de heridas infecciosas por sus características favorables en
distintas situaciones. En este proyecto se pretende investigar a fondo sobre el
manejo de los apósitos; por ende, en el siguiente apartado se explicara a detalle
las funciones esenciales y los tipos de apósitos que se encuentran actualmente en
el mercado.
2.2. Apósitos
Los apósitos son porciones generalmente rectangulares de material hidrófilo e
hipoalergénico que se utilizan para cubrir y proteger una herida. La finalidad del
apósito es asistir en el proceso de reepitelización del tejido alterado y así concluir
25
en la formación de la cicatriz. Los apósitos son muy utilizados en el cuidado de
heridas. Éstos deben de tomar en cuenta los siguientes atributos:
La habilidad de absolver y contener el exudado sin presentar fugas
La eliminación de partículas contaminantes en la herida por el apósito
Aislamiento térmico
Impermeabilidad a agua y bacterias
Idoneidad del apósito para usarse en diferentes heridas
Evitar trauma en la herida al momento de remover el apósito
Frecuencia con la que se necesita cambiar el apósito
Provisión de alivio del dolor
La estética y comodidad [5]
Los distintos tipos de apósitos se pueden dividir en 4 clasificaciones generales:
Apósitos pasivos
Apósitos interactivos
Apósitos bioactivos
Apósitos mixtos [9]
Apósitos pasivos
Los apósitos pasivos son aplicados para proteger la herida y lograr una sanación
limpia. Dichos apósitos son diseñados para que no se peguen a la cama de la
herida y comúnmente se utilizan para heridas quirúrgicas y heridas superficiales.
Dentro de los apósitos pasivos se extienden 3 categorías:
Gasa: generalmente de algodón 100% o sintéticas, compuestas de
polyester y rayón. Pretende rellenar cavidades, sin embargo presenta
desventajas ya que puede causar trauma al momento de removerla.
Apósitos tradicionales: pueden ser de gasa y algodón 100%. Se utiliza
solamente como apósito secundario para proteger la herida. También
26
existen los apósitos tradicionales especiales los cuales contienen celulosa y
están cubiertas de gasa no tejida.
Espumas: compuestas por materiales como el poliuretano. Consisten de
una malla estrecha que permite absorber el exudado de la herida; sin
embargo, no permite la oxigenación adecuada de la herida. Las espumas
se adhieren fuertemente produciendo olor y trauma al momento de retirar.
A B
C
Figura 2-3 Apósitos pasivos: A) Gasa. B) Tradicionales y C) Espumas
Apósitos interactivos
La principal función de las apósitos interactivos es mantener un ambiente húmedo
en la herida tratada. Éstos favorecen la autolisis y permite eliminar tejido muerto
sin presentar dolor ya que estimula enzimas catalíticas. A esta clasificación de
apósitos pertenecen 3 tipos:
27
Tull: gasa que consiste de una malla ancha que es uniforme y porosa. A
esta gasa se le impregna una emulsión generalmente de petrolato que
permite que el exudado de las heridas fluya libremente. Además lubrica y
mantiene la humedad y los tejidos sin daños. Se puede encontrar tull
(Aparte del petrolato) con sustancias antimicrobianas como ciorhexidina o
ácido fucídico, los cuales estimulan el desarrollo de tejido conectivo.
Espuma hidrofílica: apósito a base de poliuretano, no adherente al tejido, el
cual se utiliza para la absorción de fluidos de capacidad moderado a
abundante. Las espumas hidrofílicas están disponible en 2 presentaciones:
láminas y cojincillos.
Apósitos transparentes: son transparente para favorecer la inspección
visual de la herida. Se presentan en 2 formas: adhesivos y no adhesivos.
A B
C
Figura 2-4 Apósitos Interactivos: A) Tull, B) Espuma hidrofílica y C) Trasparentes
28
Apósitos Bioactivos
Son aquellos que tienen la capacidad de interactuar con la herida. Su diseño
favorece el ambiente húmedo en la herida y la oxigenación. Los 3 tipos de
apósitos bioactivos son:
Hidrocoloides: apósitos autoadhesivos oclusivo o semioclusivo con
partículas hidroactivas y absorbentes. Se compone de carboximetilcelulosa,
gelatina y pectina en una base que es adhesiva. Los apósitos hidrocoloides
brindan una barrera contra bacterias y mantiene húmeda la herida.
Apósito hidrogel: Constituido por un gel amorfo no adherente o por una
macroestructura tridimensional fija en forma de lámina. Contiene polímero
espesante y humectante con una alta cantidad de agua para la humedad
sobre la herida.
Alginatos: formados por un polisacárido natural derivado de la sal de calcio
de ácido algínico. Posee iones de sodio y calcio en distintas proporciones.
Cuando entra en contacto con el exudado de la herida se produce un
intercambio: al alginato absorbe iones de sodio y libera iones de calcio al
medio. Esto formal un gel que mantiene húmeda la herida.
A B
29
C
Figura 2-5 Apósito bioactivos; A) hidrocoloide, B) Alginatos e C) Hidrogel.
Apósitos mixtos
Son apósitos que se caracterizan por tener diferentes niveles de permeabilidad y
que combinan las propiedades de distintos tipos de apósitos como: pasivos,
interactivos y otros componentes. Éstos son:
Antimicrobiano desodorante: compuesto por carbón activo cubierto por una
capa de nylon poroso y contiene plata al interior. El carbón permite la
absorción de microorganismos y otras partículas no deseables para
neutralizar el mal olor. La plata le agrega la propiedad de bactericida al
apósito ya que elimina bacterias adheridas al carbón activo.
Absorbentes: apósito con composición mixta. No se debe de utilizar en
heridas infectadas, cavitadas y con exudado abundante.
A B
Figura 2-6 Apósitos mixtos: A) Antimicrobiano desodorante y B) Absorbente
30
Recientemente ha habido una tendencia de desarrollar nuevos biomateriales para
el desarrollo de nuevos apósitos o para su aplicación a ellos para agregarle
propiedades favorables a estos productos lo cual se discute en la sección 2.3.
2.3. Biomateriales
Un biomaterial se define como cualquier substancia o combinación de substancias
que trata, aumenta, o reemplaza cualquier tejido, órgano, o función del cuerpo en
su totalidad o parcialmente por cualquier periodo de tiempo. [1]
Cuando un biomaterial interactúa con el cuerpo humano, este tiende a inducir una
reacción biológica a la cual se refieren como reacción de cuerpo extraño. La
biocompatibilidad es la habilidad de un material de funcionar con una respuesta
del huésped apropiada en una aplicación específica. [1] Los factores que se
relacionan con la biocompatibilidad de un material son:
1. Toxicidad
2. Organismos extrínsecos
3. Efectos mecánicos
4. Interacciones entre las células y el biomaterial
En el apartado 3.5 se explicará a detalle los diferentes métodos para evaluar la
biocompatibilidad de los materiales.
Los biomateriales pueden ser de origen natural o sintético. Materiales como los
cerámicos, los polímeros y los metales pueden ser considerados biomateriales
sintéticos. El enfoque de este estudio es relacionado a materiales poliméricos y
cerámicos, los cuales se describen a continuación.
31
2.3.1. Biomateriales cerámicos
Se les conocen como cerámicos a los compuestos policristalinos refractarios. Son
compuestos entre elementos metálicos y no metálicos como óxidos, nitruros y
carburos. [10] Estos materiales generalmente son inorgánicos, tienen buena
compatibilidad y respuesta biológica y no transmite enfermedades. Poseen una
alta resistencia a temperaturas, al desgaste y a la fuerza de compresión. Así, las
cerámicos son aislantes térmicos y eléctricos, además de ser estéticos. Sin
embargo, algunas desventajas que presentan son la baja resistencia a la tracción,
baja tenacidad, son difíciles de fabricar y no son aptos para aplicaciones de
soporte de cargas por ser frágiles. [10]
Generalmente, los biocerámicos se emplean para reemplazo o reparación de
partes del sistema musculoesquelético que fueron dañadas o se encuentran
enfermas. También se utiliza para aplicaciones ortopédicas como relleno de
hueso; u odontológicas, como pueden ser restauraciones dentales. A continuación
se muestra una tabla que expone los cerámicos más utilizados en la industria de la
salud, así como aplicaciones comunes. [1]
Tabla 2.4 Biocerámicos más comunes y sus aplicaciones [1]
Biocerámico Aplicación
Alúmina Brackets
Reemplazo de articulaciones (cabeza de femoral,
etc.)
Zirconia Implantes dentales
Cabezas femorales
Vidrio de silicato Implantes cocleares
Implantes vertebrales
Fosfato de calcio Cemento óseo
Recubrimiento de implantes
Reparación de vértebras
Implantes oculares
Dispositivos de suministro de fármacos
Reparación de hernias discales
32
2.3.2. Biomateriales poliméricos
Los polímeros son macromoléculas construidas por la repetición de unidades
químicas simples, llamadas monómeros, que forman cadenas largas. La mayoría
de los polímeros consisten de enlaces de carbón e hidrógeno en la cadena
principal. [10] La polimerización es el proceso químico por el cuál los monómeros
se combinan formando polímeros moleculares. Los polímeros se clasifican en 3
categorías dependiente de su tipo de cadenas: termoplásticos, termoestables y
elastómeros.
En el mercado médico los polímeros no desechables comprenden poco más del
50% del volumen total de los plásticos. Estos son utilizados para diversas
aplicaciones como: equipo de diagnóstico, instrumental quirúrgico, prótesis,
aparatos dentales, entre muchas otras. [1] En la siguiente tabla se muestras los
polímeros más utilizados en la industria médica.
Tabla 2.5 Biopolímeros más comunes y sus aplicaciones [1]
Polímeros Aplicaciones
Polímeros sintéticos no degradables
Polimetilmetacrilato (PMMA) Cemento óseo, dientes artificiales, lentes intraoculares
Polimetacrilato de hidroxietilo (PHEMA)
Lentes de contacto blandas
Epoxis Materiales protectores, compuestos de fibra
Fluorocarbonados Injertos vasculares, catéteres y parches periodontales y abdominales
Hidrogeles Catéteres y anti-adhesivos
Poliacetales Válvulas cardiacas, partes estructurales
Poliamidas Suturas
Elastómeros de poliamida Catéteres y para tapar heridas
Policarbonatos Membranas de oxigenación y hemodiálisis, conectores
Poliésteres Injertos vasculares, globos para angioplastia, suturas y reparaciones para hernias
Elastómeros de poliéster Catéteres
Poli (etercetonas) Componentes estructurales y ortopedia
Poli (imidas) Componentes estructurales, catéteres
Poli (metilpenteno) Materiales protectores para dispositivos extra corporales
Poli(olefinas) Suturas, globos de angioplastia, catéteres, jeringas
Elastómeros de poli(olefinas) Tubos, corazones artificiales, catéteres
Películas de poliolefinas de alta cristalinidad
Globos de angioplastia
Poli(sulfonas) Componentes estructurales y ortopedia
Poli(uretanos) Catéteres, corazón artificial, prótesis vasculares, recubrimientos para heridas y revestimiento compatible
33
con la sangre
Poli (cloruro de vinilo) Tubos y bolsas de sangre
Siliconas Implantes de cirugía plástica, catéteres, válvulas de corazón, membranas permeables al oxígeno, prótesis faciales y de la oreja
Polietileno de ultra alto peso molecular
Tejidos de alta resistencia
Copolímero de estireno y acrilonitrilo (SAN)
Prótesis mamarias
Poliestireno Kit de diagnóstico, material monouso del laboratorio
Poliacrilonitrilo Membranas para diálisis
Bioabsorbibles
Poli (aminoácidos) Liberación controlada, peptidos de adhesión celular
Poli(anhídridos) Liberación controlada
Poli(caprolactonas) Suturas y liberación controlada
Copolimeros de ácido láctico y glicólico
Suturas, liberación controlada, discos óseos
Poli(hidroxibutiratos) Liberación controlada, discos óseos
Poli (ortoesteres) Liberación controlada
Colágeno Recubrimientos y reconstrucción tisular
Macromoléculas bioderivadas
Albúmina entrecruzada Recubrimientos de injertos vasculares y agente para contraste de ultrasonidos
Acetatos de celulosa Membranas de hemodiálisis
Celulosa cuproamonica Membranas de hemodiálisis
Citosina Recubrimientos y liberación controlada
Colágeno Recubrimientos y órganos híbridos
Elastina Recubrimientos
Gelatina entrecruzada Recubrimiento para corazón artificial
Ácido hialurónico Recubrimientos, anti-adhesivos, antiinflamatorio ocular y articular
Fosfolípidos Liposomas
Seda Suturas, recubrimientos experimentales de proteínas tipo seda
Recubrimientos pasivos
Albúmina Tromboresistencia
Cadenas alquílicas Adsorbe albúmina para la tromboresistencia
Fluorocarbonados Reduce el rozamiento en catéteres
Hidrogeles Reduce el rozamiento en catéteres
Siliconas libres de sílice Tromboresistencia
Aceites de silicona Lubricación para agujas y catéteres
Recubrimientos bioactivos
Anticoagulantes (ej.: heparina) Tromboresistencia
Antimicrobianos Resistencia a la infección
Peptidos de adhesión celular Mejora adhesión celular
Proteínas de adhesión celular Mejora adhesión celular
Adhesivos tisulares
Cianoacrilatos Microcirugía
Pegamento de fibrina Recubrimiento para injertos vasculares y microcirugía
34
En relación a los biomateriales polimérico, la presente investigación pretende
enfocarse en materiales hidrogeles, por ello el concepto se explica a detalle en el
siguiente apartado.
2.3.3. Hidrogeles
Los hidrogeles son estructuras poliméricas unidas como gel hinchado de agua por:
entrecruzamientos primarios covalentes, fuerzas iónicas, enlaces de hidrógeno,
interacciones de afinidad; interacciones hidrofóbicas, cristalizaciones de
polímeros, enredos físicos de las cadenas de polímeros individuales o una
combinación de 2 o más de las interacciones anteriores. [1] Numerosos estudios
se han realizado sobre la preparación, estructura, caracterización y aplicaciones
de los hidrogeles. [11, 12] Diversos polímeros naturales como el colágeno, la
gelatina, la fibrina, la heparina, la pectina, el quitosano, entre otros se pueden
utilizar para formar hidrogeles y ser utilizados para aplicaciones biomédicas. [1]
Los hidrogeles se pueden clasificar en base a el método de preparación, la carga
iónica o la estructura física. La clasificación más común es en base al método de
preparación, las cuales son:
Hidrogeles homopolímero: redes entrecruzadas de un tipo de unidad
monómera hidrofílica.
Hidrogeles copolímero: entrecruzamiento de cadenas compuestas de 2
unidades monómeras.
Hidrogeles multi-polímero: se producen de 3 o más comonómeros
reaccionando juntos.
Hidrogeles de red interpenetrante: se producen por 2 métodos, uno dentro
de una red preformada, y el otro en solución; la manera más común es
polimerizar un monómero dentro de una diferente red de hidrogel reticulado.
El monómero se polimeriza para formar un polímero o una segunda red
reticulada que esta entrelazado con la primera red. [1]
35
Algunas aplicaciones de los hidrogeles son: entrega de fármacos, entrega
controlada de fármacos, sensores de pH. sensores de temperatura, lentes de
contacto e ingeniería de tejidos. [1]
En ocasiones los hidrogeles son combinados con otros tipos de materiales para
aumentar y mejorar sus propiedades y así darle aplicaciones biomédicas más
específicas; a estos compuestos se les llaman híbridos.
2.4. Híbridos
Los materiales que se componen de más de un tipo de material son conocidos
como híbridos. Estas combinaciones no son mezclas físicas entre los materiales
sino químicas, donde los componentes interactúan a nivel molecular. [13] La
composición y la estructura de cada material híbrido varía dependiendo del
material considerado la matriz, el niveles de interacción y el tipo de interacción.
(Tabla 2.6) Generalmente los materiales híbridos son combinaciones de un
componente inorgánico y otro orgánico. Dichos materiales se crean para tener
propiedades superiores a las de sus constituyentes o combinar propiedades
específicas. [2]
Tabla 2.6 Diferentes posibilidades de composición y estructura de materiales híbridos [2]
Matriz: cristalino ↔ amorfo
orgánico ↔ inorgánico
Niveles de interacción: moléculas ↔ macromoléculas ↔ partículas ↔ fibras
Tipo de interacción: fuertes ↔ débiles
Estos materiales se clasifican en dos clases:
Materiales híbridos clase I
Son aquellos que muestran interacciones débiles ente sus dos fases, por
ejemplo van der Waals, enlaces de hidrógeno o interacciones débiles
electroestáticas.
36
Materiales híbridos clase II
Son aquellos que muestran interacciones químicas fuertes entre sus
componentes. [13]
Híbridos clase I
Mezclas Redes de interpenetración
Híbridos clase II
Bloques conectados covalentemente Polímeros conectados covalentemente
Figura 2-7 Los diferentes tipos de materiales híbridos [2]
2.4.1. Aplicaciones generales de materiales híbridos
La combinación de componentes orgánicos e inorgánicos casi no tiene límites
para la formación de materiales híbridos. Las propiedades y aplicaciones de cada
híbrido depende de las propiedades de sus precursores.
Actualmente las propiedades ópticas para la transmisión de datos y su
almacenamiento juegan un rol importante en muchas aplicaciones de alta
tecnología. Materiales híbridos a base de silicato preparados por el método sol-gel
37
muestran ventajas sobre otros materiales por ser transparentes y no dispersar la
luz para, por ejemplo, aplicaciones en dispositivos electrocrómicos. [14] Otra uso
de estos materiales en la industria es el revestimiento decorativo obtenido por el
empotramiento de tintes orgánicos en revestimientos híbridos. Además, una de las
mayores ventajas de los materiales híbrido es la posibilidad de incluir mas de una
función en un material simplemente incorporando un segundo componente con
otra propiedad dentro de la formulación del material Por lo tanto, se puede
introducir a estos revestimientos propiedades de antivaho, propiedades
hidrofóbicas y la capacidad de ser resistentes a ralladuras. [2]
Otras aplicaciones son la de dispositivos basados en nanocompuestos para
aplicaciones electrónicas y optoelectrónicas incluyendo diodos emisores de luz,
fotodiodos, celdas solares, sensores de gas y transistores de efecto de campo.
Por otra parte, las propiedades mecánicas y térmicas de algunos híbridos ofrece la
posibilidad de sustituir componentes clásicos basados en metales o en
compuestos tradicionales en la industria del transporte y como materiales
retardantes de fuego en aplicaciones industriales. [2, 15]
Dispositivos médicos son de igual manera un área de aplicación típica de los
materiales híbridos ya que sus propiedades mecánicas pueden ser adaptados en
combinación con su biocompatibilidad, como por ejemplo, nanocompuestos para
material de relleno dental. El alto contenido de partículas inorgánicas de estos
materiales provee la dureza necesaria y baja contracción, mientras que los
componentes orgánicos proveen propiedades curativas y la consistencia
adecuada. Además, la incorporación de otros grupos orgánicos puede mejorar las
propiedades de adhesión entre el nanocompuesto y la dentina. [2]
Estos son algunas aplicaciones de los materiales híbridos y hay un campo
inmenso de desarrollo para aplicaciones futuras en diversos campos; como por
ejemplo dentro de la medicina regenerativa, como substratos para inmovilizar
especies biológicas de enzimas y virus; así como sistemas de entrega de
fármacos. [16]
38
2.4.2. Híbridos producidos por el método sol-gel
El método sol-gel esta químicamente relacionado con una reacción de
policondensación orgánica en el cual pequeñas moléculas forman estructuras
poliméricas por la pérdida de sustituyentes. Generalmente esta reacción resulta en
una red de entrecruzamiento tridimensional. Se muestra como una ventaja que las
pequeñas moléculas sean usadas como precursoras para la formación de
materiales entrecruzados, esto porque se demuestra un alto control en la pureza y
la composición del material final y el uso de la química a base de un solvente es
favorecedor para el procesamiento del material formado. [2]
El proceso sol-gel basado en silicón ha sido de los más investigados. Este proceso
ha sido predominante en la formación de materiales híbridos ya que simplemente
incorpora grupos orgánicos utilizando silanos orgánicamente modificados. Este
método utiliza un medio acuoso donde los enlaces Si-C han alcanzan estabilidad
contra la hidrólisis, así es posible incorporar una variedad de grupos orgánicos en
la red que se forma. Se utilizan moléculas precursoras de SiX, en el cual el enlace
Si-X es lábil hacia reacciones hidrolíticas formando grupos de silanol inestables
que se condensan llevando a enlaces Si-O-Si.
Figura 2-8 Diferencias en el mecanismo dependiendo del tipo de catálisis empleado en el
proceso de sol-gel basado en silicón [2]
En el primer paso de la reacción oligo- y polímeros así como cíclicos se forman
subsecuentemente para resultan en coloides que definen el sol. Posteriormente,
39
partículas sólidas en el sol se someten a una reacción de entrecruzamiento y se
forma el gel. Este proceso es catalizado por ácidos o bases resultando en
diferentes mecanismos de reacción por la velocidad de la reacción de
condensación.
2.4.3. Silica-quitosano
La silica-quitosano es un ejemplo de un material híbrido a base de silanos
producido por el método sol-gel, el cual está compuesto por un cerámico y un
polímero que se basa en la unión de los grupos funcionales silanol por parte de la
silica y los amino por parte del quitosano. (Figura 2-9)
Las características más sobresalientes de este híbrido son:
Suprime el desarrollo de bacterias y hongos
Los silanos funcionan como agentes de entrecruzamiento “crosslinking”
para el quitosano, por lo tanto, las propiedades mecánicas se ven
mejoradas.
La biocompatibilidad aumenta.
La permeabilidad al oxigeno aumenta alrededor de 150 veces más al
compararse con la que presenta el quitosano en su estado natural. [17]
Figura 2-9 Unión de silica y quitosano [18]
40
2.4.3.1. Quitosano
El quitosano es un derivado de la quitina la cual es un polisacárido lineal
compuesto de cadenas N-acetil-glucosamina. El quitosano presenta un alto grado
de biocompatibilidad y se obtiene por medio de la deacetilación parcial de la
quitina, localizada en conchas de crustáceos, exoesqueletos de insectos y
paredes celulares de ciertos hongos, levadura y algas. Sus funciones principales
son su actividad antimicrobiana y la aceleración de formación de fibroblastos. Por
ende, el quitosano tiene gran aplicación comercial y biomédica. Por ejemplo, se
utiliza para la preservación de alimentos por su alta solubilidad en disoluciones
acuosas de ácidos orgánicos y disoluciones acuosas de ácido clorhídrico.
Además, su composición química D-glucosamina posee 3 tipos de grupos
funcionales que ofrecen la posibilidad de modificar químicamente su estructura
para producir materiales con propiedades físicas y diversas aplicaciones como:
material de sutura [19], liberación de fármacos, [20] piel artificial [21], membranas
de hemodiálisis y apósitos para heridas. [22]
2.4.3.2. Silanos
El silano es un hidruro de silicio cuya composición química es SiH4. Éste es
derivado del silicio y consiste en una cadena de átomos de silicio unidos
covalentemente a átomos de hidrógeno. Se producen a nivel industrial a partir de
silicio grado metalúrgico en un proceso de dos etapas. Primero el silicio e polvo
reacciona con ácido clorhídrico a una temperatura superior a los 300ºC y se
obtiene triclorosilano e hidrógeno. Después, el triclorosilano se hace bullir sobre
resina la cual posee un catalizador que causa su disproporcionación a silano y
tetracloruro de silicio. Otra reacción puede ser que el ácido clorhídrico reaccione
con el siliciuro de magnesio para producir hidruro de silicio.
2.4.4. Aplicaciones de silica-quitosano
En los últimos años la silica-quitosano se ha estudiado para diferentes
aplicaciones tanto biomédicas como industriales. En el área industrial la silica-
41
quitosano fue evaluada como agente absorbente de desechos tóxicos en el agua
como iones metálicos y colorantes. [23, 24] En un estudio realizado por S.
Muniyappan (2011), se evaluó la capacidad de absorción de iones de cobre y
plomo del híbrido silica-quitosano preparado por el método sol-gel y entrecruzado
con glutaraldehido. Se concluyó que el compuesto de silica-quitosano fue útil para
la absorción de estos iones en soluciones acuosas. De igual manera, R. Darvishi
(2013), evalúo la absorción de nanopartículas de silica-quitosano para remover
AR88 (Rojo ácido 88) en fase acuosa teniendo resultados favorables.
Dentro del área biomédica el híbrido a sido investigado para la regeneración de
hueso. [25] Por ejemplo, Eun-Jung Lee (2008) caracterizó la habilidad de
regenerar hueso de una membrana de silica-quitosano fabricada por método sol-
gel.
Figura 2-10 Tejido óseo y membrana 3 días después de la implantación de las membranas; a) quitosano puro y b) híbrido silica-quitosano [24]
Las pruebas in vivo realizadas en un modelo de bóveda craneal de rata mostraron
una significativa mejora en la regeneración ósea usando la membrana de silica-
quitosano comparada a el uso de una membrana de quitosano puro. (Figura 2-10)
Otra aplicación común del híbrido es el revestimiento de implantes metálicos y de
suturas [26, 27]. Shin-Hee Jun (2013) condujo un estudio donde se utilizó silica-
quitosano para recubrir titanio para la liberación de factores de crecimiento. Los
resultados indicaron que el recubrimiento del hibrido es potencialmente útil en la
mejora de la bioactividad de implantes metálicos mediante la entrega de factores
de crecimiento de manera controlada.
42
Figura 2-11 Sutura de ácido poliglicólico PGA con recubrimiento de silica-quitosano [7]
Por otra parte, A. Sánchez (2013) realizó una investigación donde se usó silica-
quitosano para recubrir suturas de seda y de ácido poliglicólico PGA concluyendo
que éste no altera significativamente las propiedades mecánicas de las suturas;
además de que su implementación se puede aprovechar para favorecer el proceso
de cicatrización de la herida suturada [7]. (Figura 2-11)
Figura 2-12 Nanoesferas de silica-quitosano para la liberación controlado de fármacos enfocada a la terapia de cáncer de mama [27]
43
Las investigaciones más recientes se encuentran dentro del área de la
nanomedicina. Se busca emplear nanoesferas y nanotubos para la liberación de
fármacos en terapia de cáncer [28] (Figura 2-12) y sensores de colesterol [29],
entre otras.
2.5. Medición de biocompatibilidad
Existen diversos pruebas para medir la biocompatibilidad de los biomateriales.
Éstas principalmente se dividen en 2: pruebas in vitro (dentro del vidrio) y pruebas
in vivo (dentro de lo vivo). Las pruebas in vitro se realizan en tubos de ensayo
generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo. Por el
contrario, la prueba in vivo se refiere a experimentación realizado dentro o en el
tejido de un organismo vivo.
La organización internacional para la estandarización (ISO) tiene una serie de
normas consolidadas internacionalmente para la evaluación biológica de
dispositivos médicos: ISO 10993. Está se mantiene en continuo desarrollo y
actualmente se compone de 20 partes distintas. La norma ISO 10993 está
preparada en colaboración con el Comité Técnico ISO/TC 194 y el comité técnico
CEN/TC 206.
En la tabla 2.7 se muestran las partes relevantes a pruebas in vitro para la
compatibilidad celular y de tejidos.
Tabla 2.7 ISO 10993 Estandarización de Evaluación Biológica para Dispositivos Médicos por partes relevantes a ensayo in vitro para la compatibilidad de células y tejidos [1]
Parte Título (Año publicado:
estatus)
Enfoque Pruebas in vitro para
compatibilidad celular y de tejido
3 Pruebas para genotoxicidad,
carcinogenicidad y toxicidad
reproductiva (2003: CD)
In vitro e in vivo Ensayo de mutación inversa de
bacterias
Ensayo in vitro de linfoma de
ratón
Aberración cromosómica en
células de mamífero
44
Ensayo de transformación de
células de embrión de hámster
sirio
Ensayo de transformación
enfocados a balb/c 3T3
Ensayo de células madre
embrionarias
4 Selección de pruebas para
interacciones con sangre
(2006: para ser revisado)
In vitro e in vivo Hemólisis
Sugerencias generales respecto
a las pruebas de trombosis,
coagulación, función de las
plaquetas, hematología e
inmunología
5 Pruebas para citotoxicidad in
vitro (1999: bajo revisión)
In vitro Pruebas en extractos
- Prueba de elución en L929
- Prueba de captación de rojo
neutral
- Prueba de formación de colonias
- MTT y pruebas relacionadas
Prueba de contacto directo
Prueba de contacto indirecto
- Prueba de difusión agar
- Filtro de difusión
13,14,1
5
Identificación y cuantificación
de productos de degradación
de dispositivos médicos
poliméricos (1998: bajo
revisión); de cerámicos
(2001); y de metales y
aleaciones (2000)
In vitro Información para la
caracterización de materiales y
la evaluación del riesgo
toxicológico
17 Establecimiento de límites
permisibles para sustancias
lixiviables (2002)
19 Caracterización química de
materiales (2005)
19 Caracterización físico-
químico, morfológico y
topográfica de materiales
45
3. Materiales y Métodos
3.1. Materiales
Dentro de esta sección se hará mención a los materiales que se incluyeron en la
elaboración del híbrido silica-quitosano. Se enfatizará en alguno de ellos, por ser
parte importante del compuesto.Los elementos necesarios para que se realizara el
proceso de sol-gel fueron los siguientes:
Agua Destilada
Ácido Acético
Etanol (95%)
Después tenemos los componentes clave de nuestro compuesto, que son:
Quitosano: producto de la marca Sigma-Aldrich. Las características
mencionadas en sus especificaciones incluyen: soluble en un diluido
ácido, biocompatible, antibacterial y amigable con el ambiente.
Tetraetil Ortosilicato: Es un componente altamente insoluble en agua,
se debe tratar con una solución ácida para que cumpla con la función
de inducir la hidrólisis de los enlaces etoxi y liberar los grupos
silicatos.
Figura 3-1 Materiales para la síntesis del híbrido silica-quitosano
46
3.2. Experimentación
El presente apartado describe todos y cada uno de los procedimientos que se
realizaron para el desarrollo de la investigación: desde la síntesis del híbrido, las
pruebas para adecuar el material; hasta las pruebas de citotoxicidad para evaluar
al híbrido silica-quitosano.
3.2.1. Síntesis del híbrido
Como ya se mencionó, la síntesis para la obtención de silica-quitosano es a través
del método sol-gel explicado anteriormente. Antes de realizar la síntesis del
híbrido, es importante verificar que se cuente con todos los materiales ya
presentados. También se debe asegurar que se cuente con equipo de medición
requerido para cuantificar correctamente las cantidades exactas de cada material.
Se realizó la síntesis de 5 muestras con diferentes concentraciones para variar la
cantidad de quitosano en un rango de variaciones de 20% a 2%. (Tabla 3.1)
Tabla 3.1 Cantidades de cada muestras
TEOS (ml)
Etanol (ml)
Agua destilada (ml)
Ácido Acético (ml)
Quitosano (g)
No. de
muestra
7.52% 3.01% 37.59% 1.88%
1 (20%) 14.28 5.71 71.43 3.57 1
2 (15%) 15.17 6.07 75.89 3.79 0.75
3 (10%) 16.06 6.42 80.36 4.02 0.5
4 (5%) 16.96 6.78 84.82 4.24 0.25
5 (2%) 17.49 6.99 87.50 4.37 0.1
A continuación se presentan los pasos para la síntesis del hibrido silica-quitosano:
1. Pesar/Medir la cantidad de Quitosano (Colocar con espátula sobre papel
delgado)
47
Figura 3-2 Báscula analítica de alta precisión para medir el quitosano en polvo
2. Verter agua destilada en un matraz Erlenmeyer con una concentración de
5% v/v de ácido acético.
3. Agregar el quitosano en el matraz.
Figura 3-3 Agregado de quitosano al matraz
4. Colocar un agitador magnético dentro del matraz con la mezcla.
48
5. Colocar el matraz con la mezcla sobre la plancha/agitador ajustada en 300
RPM con una temperatura de 90°C.
Figura 3-4 Matraz en plancha ajustada en 300 RPM a 90ºC
6. 1 hora después, agregar etanol a la mezcla 1 hora y reajustar velocidad a
400 RPM.
7. Agregar TEOS gota a gota 30 minutos después de agregar el etanol y
reajustar a 340 RPM (Utilizar pipeta)
Figura 3-5 Agregado de TEOS
49
8. Detener reacción 24 horas después.
3.2.2. Adecuación de híbrido
La adecuación del híbrido silica-quitosano consistió de 4 etapas:
3.2.2.1. Pruebas de estabilidad
La prueba de estabilidad se realizó en las 5 muestras de silica-quitosano de
diferentes concentraciones con el fin de seleccionar la concentración con
determinadas características físicas que le proporcionaran la posibilidad de
realizar pruebas de citotoxicidad en ella. Específicamente se analizaron las
consistencias de cada muestra para elegir aquella que creara una película
homogénea y uniforme. Esta prueba consistió en 4 pasos:
1. Saturar las 5 muestras de sílica-quitosano en gel con agua destilada.
2. Agitar hasta homogenizar.
3. Verter 5mL de muestra líquida en frasco.
4. Dejar reposar por 3 días.
Figura 3-6 Muestras para prueba de estabilidad
50
3.2.2.2. Ajuste de pH
El pH es la medida estándar de la acidez o la basicidad de una solución. El pH
neutro es de 7; debajo de 7 se tiene una solución ácida y arriba de 7 se tiene una
solución básica. Se detectó que el silica-quitosano era significativamente ácido
(pH 3-4); desfavorable para las pruebas de citotoxicidad. Por lo tanto, se demandó
realizar un tratamiento para reducir la acidez al híbrido (pH 5-6). Para ello, se llevó
a cabo un proceso de “lavado” que consistió en lo siguiente:
1. Colocar 4 mL de muestra del híbrido en tubo Falcon de 15 mL.
2. Agregar 4mL de agua destilada y 4mL de etanol al tubo Falcon con la
muestra. (Asegurarse de que el tubo Falcon no esté completamente lleno o
por encima de la marca de los 13 mL.)
Figura 3-7 Tubo Falcon con mezcla
3. Agitar mecánicamente o con agitador hasta conseguir una mezcla lo más
homogénea posible.
51
Figura 3-8 Agitación asistido por el Vórtex Mixer
4. Centrifugar tubo Falcon a 3000 RPM por 3 minutos a temperatura
ambiente. (Colocar contrapeso)
Figura 3-9 Acomodo de tubos dentro de la centrífuga
5. Retirar líquido restante del tubo para dejar solamente la muestra de silica-
quitosano. (Cuidar que no se pierda muestra en el proceso.)
52
6. Repetir proceso desde el paso 2 hasta que se indique un pH entre 5 y 6.
Para la comprobación del pH de la muestra se utilizaron tiras indicadoras de pH-
Fix con color de 0 - 14 de la marca CRISA. Ésta medición se hizo entre el paso 3 y
el paso 4 sumergiendo por 5 segundos la tira en la mezcla homogénea de silica-
quitosano y los demás componentes usados para los lavados. Después de retirar
la tira se verificó el pH al empatar los colores adquiridos con la guía de escala de
colores en el empaque. Es importante mencionar que el hibrido se puede llegar a
despolimerizar si alcanza un pH de 7 o más, por lo tanto es preciso no llegar hasta
ese valor, sino mantener el pH por debajo de lo neutro.
Figura 3-10 Tiras indicadoras de pH con color
3.2.2.3. Presentaciones del híbrido
Se realizaron 3 distintas presentaciones de silica-quitosano:
1. Gel
2. Gel saturado en agua destilada
53
3. Polvo
A B Figura 3-11 Distintas presentaciones de silica-quitosano A) Muestra en gel y gel saturado
en agua destilada B) Muestra en polvo
Las primeras dos presentaciones se obtuvieron del mismo proceso de síntesis del
silica-quitosano; la única diferencia es que a la segunda presentación se le agregó
agua destilada. La presentación en polvo del híbrido se obtuvo dejando muestra
de silica-quitosano en gel a temperatura ambiente sin tapar por 24 horas para que
se deshidratara y así, con mortero y pistilo, pulverizar la muestra seca y obtener
un polvo fino. (Figura 3-12)
A B
54
C D Figura 3-12 Proceso para la obtención de silica-quitosano en polvo A) Muestra de híbrido en gel, B) Muestra de híbrido deshidratado, C) Mortero y pistilo, D) Muestra de híbrido en
polvo
3.2.2.4. Esterilización
Se esterilizaron las 3 muestras de silica-quitosano en las distintas presentaciones
utilizando un autoclave de laboratorio / horizontal automatizada ubicada en el
laboratorio de microbiología de la Universidad de Monterrey. La tabla 3.2 muestra
el modo y el tiempo de esterilización de cada muestra.
Tabla 3.2 Modo y tiempo de esterilizaciones de las diferentes muestras de silica-quitosano
Muestra Polvo Gel Gel saturado en agua destilada
pH 5-6 5-6 5-6
Modo Paquete 1 Líquido 1 Líquido 1
Tiempo 1 hora 1 hora 30 min 1 hora 30 min
Para esterilizar la muestra en polvo se utilizó el modo “Paquete 1” con duración de
una hora el cual es un ciclo de esterilización en seco para materiales sólidos. Las
presentaciones en gel se esterilizaron con el modo “líquido 1” el cual es un ciclo
húmedo con duración de 1 hora y 30 minutos para materiales líquidos.
55
3.2.3. Pasos preliminares para pruebas de citotoxicidad
Antes de proceder con la prueba de citotoxicidad, se realizaron pruebas
preliminares para la selección de la presentación (polvo o gel) de la muestra de
silica-quitosano a utilizar. En estas pruebas se analizó la interacción del híbrido
con el medio celular y su capacidad de formar una película homogénea y uniforme
apropiadamente adherida al fondo de la placa. Estos criterios son importantes
para elegir aquella presentación que favorezca la adherencia de las células en ella
y que promueva un ambiente propicio para el cultivo celular.
Asimismo, se analizó la interacción de células C6 de glioblastoma de rata en 5
concentraciones distintas de muestra en gel para además elegir la concentración
más apropiada para formalizar la prueba de citotoxicidad.
3.2.3.1. Depósito de silica-quitosano para pruebas en placa Petri
de 6 pozos
Ya estéril las muestras de silica-quitosano en sus 2 presentaciones se siguieron
los siguientes pasos para la realización de la prueba: (Todos los pasos se
realizaron dentro de la campana de flujo laminar ubicada en el laboratorio de
microbiología de la Universidad de Monterrey)
1. Se saturó la muestra de híbrido con medio celular
2. Se agitó para homogenizar la mezcla
3. Con una pipeta de 5 mL, se depositó la mezcla en una placa Petri de 6
pozos. A 5 de los pozos se les depositó distintas concentraciones de la
mezcla y uno de los pozos se dejó sin mezcla como control.
4. Con una nueva pipeta de 5mL se agregó a cada pozo la cantidad de medio
celular correspondiente para tener 2 mL en cada pozo. Al pozo control se le
depositó solamente 2 mL de medio celular.
La siguiente tabla muestra un diagrama de los pozos con las distintas
concentraciones que se depositaron en cada uno de ellos.
56
Tabla 3.3 Concentraciones de sílica-quitosano en placa Petri
Pozo 1 Pozo 2 Pozo 3
1
2 mL de mezcla
1/2
1 mL de mezcla
1 mL de medio celular
1/4
0.5 mL de mezcla
1.5 mL de medio celular
1/6
0.33 mL de mezcla
1.67 mL de
1/8
0.25 mL de mezcla
1.74 mL de medio celular
Control
2 mL de medio celular
Pozo 4 Pozo 5 Pozo 6
Se realizó el mismo procedimiento en 2 placas Petri de 6 pozos: una utilizando el
híbrido en su presentación gel y otra en su presentación polvo. Se dejó reposar
dentro de una incubadora ubicada en el laboratorio de microbiología de la
Universidad de Monterrey a una temperatura de 37ºC por 72 horas con la finalidad
de que el híbrido se adhiriera en la superficie de cada pozo y formase una película
uniforma.
3.2.3.2. Sembrado de células
Finalizadas las 72 horas en la incubadora, 200,000 células C6 se sembraron en
cada pozo de la placa Petri con muestra del híbrido. Para ello precedentemente se
realizaron 2 protocolos: disociación y conteo de células.
3.2.3.3. Protocolo de disociación celular y conteo celular
El conteo de células se realizó en base a un protocolo ya establecido. Es
necesario realizar la disociación de células antes de realizar el conteo y cómo
paso previo a realizar el cultivo de las células en los pozos donde se desean
sembrar.
Es necesario que este procedimiento se realice siempre dentro de la campana de
flujo laminar, para evitar la contaminación tanto de las células, como de los
materiales que se utilizan.
57
Tomando en cuenta la recomendación anterior, es necesario mencionar que, para
obtener un resultado favorable, se debe seguir las instrucciones correctamente y
se debe asegurar que se cuente con todo lo necesario. Así como, comprobar que
se tienen suficientes pipetas y materiales requeridos.
1. Levantar células con tripsina. Usar 4 ml de tripsina por cada 7 ml de medio
en el que se encuentren las células del Petri.
a. Remover el medio en el que están las células. (Desechar pipeta)
b. Agregar 4 ml de tripsina. (Conservar pipeta y cerrar el contenedor de
tripsina después de agregada.
Figura 3-13 Colocación de tripsina
c. Poner el Petri en la incubadora durante 2:30 minutos. (Prender y
verificar la temperatura de la centrifugadora mientras esperan)
d. Sacar de incubadora y agitar orbitalmente. (Observar si se
desprenden del fondo)
e. Regresar a la incubadora y dejar otros 2:30 minutos.
f. Agitar y regresar a la campana.
2. Poner las células con la tripsina en un tubo Falcon de 15 ml. (Desechar
pipeta)
3. Agregar 6ml de medio al Petri y agitar para atrapar las células restantes.
58
4. Colocar los 6 ml de medio en el tubo Falcon, completando 10 ml. (Colocar
el tubo en la gradilla para mejor manejo.)
Figura 3-14 Agregado de medio a Falcon
5. Centrifugar tubo Falcon a 1290 RPM a 4ºC por 10 minutos (2 repeticiones)
6. Retirar la tripsina y dejar el pellet de células. (Tratar de dejar la menor
cantidad de medio, sin llevarse las células con la pipeta.)
Figura 3-15 Pellet de células
7. Agregar 10 ml de medio al tubo con las células.
8. Disgregar completamente las células en el medio.
59
9. Tomar 1ml del Falcon y poner en un Eppendorf.
10. Tomar un segundo tubo Eppendorf y agregar 90 µl del primero.
11. Agregar 10 µl de azul de tripano al segundo Eppendorf.
12. Disgregar el nuevo stock de 100 µl.
13. Poner 10 µl de células con azul de tripano en la cámara de Neubauer.
14. Realizar el conteo de las células en cada uno de los cuadrantes de la
cámara. (Llevar el orden sugerido en la figura 3-16)
1.
Figura 3-16 Orden de conteo de células
15. Registrar la cantidad de en los 4 cuadrantes.
16. Sumar el número total de células en los cuadrantes.
17. Utilizar la formulas mostrada en la siguiente fórmula y obtener la
concentración por mililitro.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑥 10,000
𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠
Después de que se lleva acabo los protocolos anteriores se procede al sembrado
de células. Dentro de la campana y con una pipeta nueva, se extrae la cantidad de
60
mililitros o microlitros que se requiere para la obtención de 200,000, se depositan
en cada pozo y se deja la placa Petri dentro de la incubadora para su posterior
análisis en 24 y 48 horas.
3.3. Prueba de citotoxicidad
La prueba de citotoxicidad se realizó utilizando un ensayo de viabilidad celular por
medio de luminiscencia llamado CellTiter-Glo®. Dicho ensayo es un método
homogéneo para determinar el número de células viables en un cultivo en base a
la cuantificación del ATP presente (un indicador de las células metabólicamente
activas). La prueba CellTiter-Glo ® está diseñado para su uso con formatos de
múltiples pocillos, lo que es ideal para el cribado automatizado de alto rendimiento
(HTS) y para las pruebas de proliferación celular y citotoxicidad.
El procedimiento implica añadir un reactivo directamente a las células cultivadas
en medio suplementado con suero. El método resulta de la lisis celular y la
generación de luminiscencia proporcional a la cantidad de ATP presente. Por lo
tanto, la cantidad de ATP es directamente proporcional al número de células
presentes en el cultivo. De este modo es posible cuantificar las células que
siguieron vivas en un periodo de tiempo determinado en contacto con el material a
analizar. En este caso, dicha prueba se efectuó para determinar en qué momento
las células empiezan a perecer en una escala de 6, 3 y 1 hora.
Antes de realizar éste análisis se debió depositar el híbrido en una placa de 96
pozos y posteriormente sembrar las células requeridas. En los siguientes
apartados se describe a detalle los pasos que se tomaron para: 1) El depósito del
híbrido, 2) El sembrado de células y 3) el procedimiento para la prueba de
viabilidad celular por medio del método CellTiter-Glo®.
3.3.1. Depósito del híbrido silica-quitosano para la prueba de
citotoxicidad en placa de 96 pozos
Ya que la consistencia del híbrido silica-quitosano no es fácilmente manejable
para este tipo de pruebas, se diseñó un proceso para depositar muestra del
61
híbrido en los pozos de una placa de 96 pozos en donde se realiza la prueba de
citotoxicidad. El procedimiento se compone de los siguientes pasos: (La mayoría
de los pasos se realizaron dentro de la campana de flujo laminar ubicada en el
laboratorio de microbiología de la Universidad de Monterrey para mantener
esterilidad.)
1. Centrifugar muestra estéril en un Falcon de 45 mL a una velocidad de 3000
RPM durante 3 minutos.
2. Retirar con una pipeta toda el agua que resulte del centrifugado. (Dejar sólo
muestra, descartar pipeta)
3. Tomar un nuevo tubo Falcon de 15 ml y colocar en el 5 ml de la muestra.
4. Agregar 5 ml de agua destilada al nuevo tubo. (Figura 3-17)
Figura 3-17 Muestra con agua destilada
62
Figura 3-18. Apertura de caja de 96 pozos
5. Abrir placa de 96 pozos dentro de la campana. (Figura 3-18)
6. Agregar 100 µl de muestra diluida en los pozos asignados. (Utilizar puntas
estériles, como se muestra en la ) (Figura 3-19)
Figura 3-19. Pipeta para mover 100 µl de muestra
63
Verificar que los 100 µl queden dentro de los pozos, que no queden gotas de
muestra en las paredes de los mismos y se llenen las filas y columnas
predeterminadas. (Figura 3-20).
Figura 3-20. Muestra depositada en pozos
7. Sellar con Parafilm la placa para evitar que se abra y contamine al
momento de sacar de la campana. (Figura 3-21)
2.
Figura 3-21. Placa sellada con muestra
8. Dejar sellada en temperatura ambiente durante 24 horas para que se
asiente la muestra y se separe del agua destilada.
64
9. Con una pipeta de rango apropiado y con las puntillas adecuadas quitar el
agua destilada de los pozos.
Figura 3-22. Pipeta para manipular 50 µl
10. Asegurarse de quitar sólo el agua y no afectar a la película de muestra en
el fondo. (Vaciar el agua en un vaso de precipitado. Figura 3-23)
Figura 3-23. Agua destilada de pozos
11. Verificar que no quede agua destilada en los pozos. (Ladear placa para ver
si no queda agua. Figura 3-24)
65
Figura 3-24. Película de muestra en pozos
3.3.2. Sembrado de células y el escalamiento de número de células
Posterior a la realización de la disociación y el conteo celular (ver en apartado
3.2.3.2) se dispuso a sembrar 30,000 células en pozos de la placa de 96 pozos.
Para analizar la proliferación de las células en el tiempo, se sembraron células en
3 momentos distintos para examinar la exposición de células a la muestra de
silica-quitosano por 6, 3 y 1 hora. Esto se hizo por quintuplicada, es decir, en cada
momento se sembraron 30,000 células en 5 pozos para así promediar y evitar
sesgos.
Cómo parte del procedimiento para realizar esta prueba, es necesario tener un
control sobre el número de células. Para esto, se realizan diferentes
concentraciones de células, en donde conociéndola podemos colocar un número
aproximado de ellas por separado.
66
Lo anterior es necesario para tener una curva control de número de células en la
prueba de citotoxicidad, teniendo como referencia los resultados que arrojan
diferentes número de células. Esta curva se depositó 1 hora antes de hacer la
prueba de citotoxicidad.
En nuestro caso se hizo un muestreo de número de células que fue de los 140,000
hasta los 4,400, esto para cubrir todos los posibles números de células restantes.
Los pasos que seguimos para realizar este procedimiento fueron los siguientes:
1. Realizar la disociación y el conteo de las células. (Este procedimiento está
descrito en la sección 3.2.3.2.1)
2. Fijar un número máximo de células.
a. Identificar el número máximo por cada 100 µl. (Dividir entre 10 la
concentración obtenida del conteo, ya que se utiliza solo la décima
parte)
b. Definir un número exacto de células para ajustar la concentración.
(Un número entre 150,000 y 100,000 es lo más adecuado)
c. Cambiar la concentración al número deseado. (Ej. Si se tiene una
concentración de 200,000 células por mililitro y se buscan que sean
150,000; entonces se diluyen 750 µl de la primera concentración con
250 µl de medio adicional, en un tubo Eppendorf)
3. Preparar 5 tubos Eppendorf adicionales y colocarlos en una gradilla.
4. Llenar los 5 tubos adicionales con 500 µl de medio. (Utilizar una misma
puntilla para llenarlos y después descartarla.) (Figura 3-25)
67
Figura 3-25. Llenado de tubos Eppendorf
5. Tomar 500 µl de la primera concentración y colocarlos en el siguiente tubo
Eppendorf.
Figura 3-26. Disgregación de diferentes concentraciones
68
6. Disgregar bien la nueva concentración y repetir el paso 5 con las siguientes.
(El primer tubo es el único que se queda con 500 µl. (Figura 3-26)
7. Separar las 2 últimas filas de la placa de pozos para las diferentes
concentraciones y colocar 100 µl de cada concentración en 3 pozos. (Figura
3-27)
Figura 3-27. Llenado de pozos con diferentes números de células
El diagrama anterior (Tabla 3.4) exhibe la distribución de la placa de 96 pozos. Las
filas y columnas coloreadas en escalas de grises fueron las utilizadas para el
presente proyecto. Los pozos restantes fueron ocupados por un proyecto ajeno sin
relevancia para este.
Se indica que en los pozos correspondientes a la columna 2 y las filas de la “A” a
la “E” se sembraron las células expuestas al silica-quitosano por 6 horas; los
pozos correspondientes a la columna 3 y las mismas filas se sembraron las
células expuestas al híbrido por 3 horas; los pozos correspondientes a la columna
69
4 y las mismas filas se sembraron las células expuestas por 1 hora al híbrido. Por
último La curva control corresponde a las celdas coloreados de gris al inferior del
diagrama.
3.3.3. Prueba de citotoxicidad por luminiscencia
Una vez que se tuvieron las células expuestas por 6, 3 y 1 hora, se procedió con la
prueba de citotoxicidad por medio de luminiscencia. Para realizar la prueba, es
necesario tener todos los componentes del “CellTiter-Glo” Kit, un pipetor
multicanales con capacidad de 100 µl, una caja entera de 96 puntillas adecuadas
para usarlas en el pipetor y una jeringa con capacidad de al menos 10ml. Los
pasos que se siguieron para la realización de esta prueba fueron los siguientes:
1. Con la jeringa de 10 ml extraer 10 ml de Buffer que contiene el Kit. (Figura
3-28)
Tabla 3.4 Diagrama distribución de placa de 96 pozos
70
Figura 3-28. Buffer de CellTilter-Glo
2. Agregar los 10 ml de Buffer en el frasco de Sustrato. Tener cuidado con la
presión ejercida dentro del frasco, ya que al estar sellado y agregar más
líquido, se genera presión hacia fuera en contra del flujo que vacía la
jeringa. (Figura 3-29)
Figura 3-29. Agregado de Buffer en frasco con Sustrato
3. Colocar la mezcla de líquidos en el recipiente ondulado que incluye el Kit,
para poder tomarlo con la pipeta multicanal. (Figura 3-30)
71
Figura 3-30. Recipiente contenedor de mezcla Buffer/Sustrato
4. Con la pipeta multicanal, llenar fila por fila de la placa con la mezcla. Cuidar
de no hacer burbujas en la mezcla quitando el aire de la pipeta en ella.
(Descartar todas las puntillas utilizadas para llenar cada fila) (Figura 3-31)
Figura 3-31. Deposito de Mezcla en los pozos
72
5. Cubrir con aluminio la placa al terminar de llenar todos los pozos. (Si es
expuesto a la luz se afecta a la prueba de luminiscencia)
6. Llevar la placa cubierta a la cámara de agitación, para remover las posibles
burbujas que se hayan creado o quedado dentro de ella por un tiempo de 2
minutos. (Figura 3-32)
Figura 3-32. Agitación de placa
7. Quitar el aluminio en la placa. Asegurarse de prender máquina de
luminiscencia antes.
8. Retirar la tapa de la placa, abrir la máquina y colocar de modo correcto.
(Tomar como referencia el pozo A1, como se muestra en la Figura 3-33)
73
Figura 3-33. Colocación de placa en máquina de luminiscencia
9. Ya que se cierre la compuerta, con la placa dentro, dentro de “Cytotoxicity
Assay” seleccionar la opción de “CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay
(luminescent)” en la máquina de luminiscencia.
10. Exportar los resultados obtenidos a una memoria USB.
11. Abrir la compuerta y retirar la placa.
74
4. Resultados
La síntesis del híbrido silica-quitosano por medio del método sol-gel fue exitosa en
todas las muestras. Sin embargo, cada una de ellas mostró distintas
características físicas en cuanto a consistencia y color. Todas las muestras fueron
almacenadas en 2 frascos: un frasco contenía la muestra y un segundo frasco
contenía muestra saturada en agua destilada. (Figura 4-1) La siguiente tabla
presenta la apariencia física de cada concentración y se mencionan algunas
observaciones significativas.
Tabla 4.1 Muestras de silica-quitosano producidas por el método sol-gel
Muestra Aspecto Observaciones
80%- 20%
Color opaco, ámbar
Consistencia inconsistente,
mayormente sólida y ciertas
partes gel
Complicada manipulación
85% - 15%
Color opaco, blanquecino
Consistencia inconsistente,
parte sólida y parte gel
Complicada manipulación
75
90% - 10%
Color blanquecino
translucido
Consistencia inconsistente,
mayormente gel y escasas
partes sólidas
Complicada manipulación
95% - 5%
Color blanquecino
translucido
Consistencia
completamente gel
homogéneo
Sencilla manipulación
98% - 2%
Color blanquecino
translucido
Consistencia gel
considerablemente espeso
y homogéneo
Complicada manipulación
76
Figura 4-1 Ejemplo de almacenamiento de híbrido en frascos. Izquierda: frasco con muestra, derecha: frasco con muestra saturada en agua destilada.
4.1. Resultados de pruebas de estabilidad
La prueba de estabilidad se realizó para examinar cualitativamente la formación de
una película adherida a la superficie de los frascos de cada una de las 5 muestras
producidas; y así seleccionar la concentración más adecuada para las pruebas
posteriores. Se utilizaron las muestras saturadas en agua destilada ya que su
manipulación era más sencilla al momento de verter las muestras en los frascos
de prueba. Luego de dejar en reposo por 3 días, se observaron los siguientes
resultados. (Tabla 4.2)
Tabla 4.2 Resultados de la prueba de estabilidad
Muestra Aspecto Observaciones
80%- 20%
No se formó película
77
85% - 15%
No se formó película
90% - 10%
Se formó película
uniforme
95% - 5%
Se formó película
uniforme
98% - 2%
Se formó película no
uniforme
Se observa que las muestras 1, 2 y 5 no se consiguió la formación de la película
pretendida. En las muestras 1 y 2 no se observó adherencia del material en la
superficie de los frascos, sino que la muestra siguió fluyendo junto con el agua
destilada. La muestra 5 sí mostró una capa o película al fondo del frasco, sin
embargo ésta no era uniforme, sino rugosa. Por otro lado, las muestras 3 y 4
mostraron películas completamente adheridas a la superficie de los frascos y con
una uniformidad adecuada.
78
4.2. Resultados de ajuste del pH
Se realizaron “lavados” a las muestras de silica-quitosano para conseguir la
modificación del pH, ya que la acidez de la muestra no es propicia para realizar las
pruebas de citotoxicidad. La tabla 4.3 exhibe los “lavados” requeridos para la
obtención de una muestra con pH 6. Como se menciona anteriormente, los
“lavados” se efectuaron agregando agua destilada y etanol. Esta mezcla tiene un
pH 7, es decir neutro, que apoya a reducir aquellas sustancias ácidas utilizadas en
el proceso de síntesis, como es el caso del ácido acético.
Tabla 4.3 Número de lavados vs pH
# de “lavado” pH original 2da 3ra 4ta 5ta 6ta 7ma
pH de muestra
(95% - 5%)
3.5
3.5
4.5
4.5
5
5.5
6
Tabla 4.4 Resultados de la modificación del pH
“Lavado” 0 = pH 3.5 (pH original) “Lavado” 4 = pH 4.5
79
“Lavado” 6 = pH 5.5 “Lavado” 7 = pH 6
Se demandaron 7 “lavados” para que la muestra adquiriera el pH 6. Se reitera que
al alcanzar pH 7 en adelante, el híbrido puede llegar a despolimerizarse por el
rompimiento de algunos de sus enlaces. Por lo tanto, es importante cuidar este
aspecto al momento del procedimiento. A continuación, la tabla 4.4 presenta las
imágenes de las tiras indicadoras y la escala de colores para identificar el pH. Se
pueden apreciar los valores de pH en los “lavados” 0, 4, 6 y 7. Los restantes no se
muestran en tabla por no presentar cambios significativos con respecto al lavado
anterior, por esta razón no se anexaron al documento.
4.3. Resultado de esterilización
Se utilizó un autoclave de laboratorio / horizontal automatizado para esterilizar las
3 presentaciones del híbrido: polvo, gel y gel saturado en agua destilada. Para el
híbrido en polvo se aplicó el modo sólido, en el cual no se percibió alteración
80
alguna de la composición del polvo. Para las muestras en gel se aplicó el modo
líquido el cual es esterilización a base de humedad. Se observó que el gel se
deshidrató por completo perdiendo su estado hidrogel que se pretendía mantener
como se visualiza en la figura 4-2. Esto ocurrió por la evaporación de parte de la
muestra a causa de estar en un ambiente con altas temperaturas. Por ende, se
realizó la esterilización al gel saturado en agua destilada. Esta vez, la muestra en
gel no perdió sus características físicas ya que lo que se evaporó fue parte del
agua destilada que se agregó y evitó la evaporación de la muestra. (Figura 4-2)
A B
4.4. Resultados de pruebas preliminares
Se depositó el híbrido en sus dos presentaciones (polvo y gel) en placas Petri de 6
pozos para observar su interacción con medio celular y su capacidad de formar
una película adherida en la superficie de los pozo. (Cada presentación en diferente
placa). Se depositó la muestra en 5 pozos, cada pozo con diferente concentración.
(Ver concentraciones en la sección 3.3.1) El sexto pozo se dejó como control sin
muestra del híbrido. Después de depositar la muestra, la placa Petri se colocó en
una incubadora a 37ºC por 72 horas. En la figura 4-3 se presenta la placa con
silica-quitosano en polvo y la figura 4-4 muestra la muestra en gel.
Figura 4-2 Pruebas antes y después de esterilizar: A) Muestra y B) Muestra saturado con agua destilada
81
Figura 4-3 Placa Petri con muestra en polvo
Figura 4-4 Placa Petri con muestra en gel
En las figuras 4-3 y 4-4 se observa que el color del medio celular no se alteró. Un
cambio de color indicaría un cambio en el pH de la solución, el cual no favorece a
crear un ambiente propicio para un cultivo celular. La figura 4-3 (muestra en polvo)
indica que la muestra en polvo formó granulaciones de polvo hidratado, sin
presentar uniformidad en los pozos 1 y 3. En las pozos restantes la muestra sigue
fluyendo en el medio celular sin formar una película.
82
A B Figura 4-5 Pozo con concentración 1 de muestra en polvo: A) Imagen normal e B) Imagen
en microscopio
En la figura 4-5 A) se tiene un acercamiento al pozo 1 de la placa Petri con el
híbrido en polvo donde se aprecia aún más las granulaciones formadas. En la
figura 4-5 B) se tiene una imagen microscópica del mismo poso donde se observa
importante irregularidad que lo hace inconveniente para su aplicación en las
pruebas correspondientes.
A B
Figura 4-6 Pozo con concentración 1 de muestra en gel: A) Imagen normal e B) Imagen en microscopio
La figura 4-6 A) presenta un acercamiento en el primer pozo de la placa Petri con
el híbrido en gel donde se observa una capa homogénea y uniforma de muestra
en la superficie. Asimismo, la figura 4-6 B) muestra la imagen microscópica del
83
pozo con concentración 1 donde se aprecia mayor uniformidad comparada con la
imagen microscópica del pozo con la muestra en polvo.
En base a los resultados obtenidos, se sembraron las células en la plaza Petri de
6 pozos con la muestra en gel. Se sembraron 200,000 células en cada pozo,
incluyendo en el pozo control. (Figura 4-7)
Figura 4-7 Placa Petri de 6 pozo con distintas concentraciones de silica-quitosano y cultivos celulares
24 horas después del sembrado de células se analizaron los resultados. Se
observó muerte celular en todos y cada uno de los pozos que contenían muestra
del híbrido. En la figura 4-8 se presentan las imágenes microscópicas de los 5
pozos comparados con la imagen del pozo control. Las porciones oscuras en las
imágenes microscópicas de los pozos 1, 2, 3, 4 y 5 son cúmulos de células
muertas, mientras que en la imagen del pozo control se visualizan las células
correctamente adheridas a la superficie del pozo e indicando proliferación celular.
84
Figura 4-8 Imagen microscópica de los 6 pozos con cultivos celulares
La muerte celular se puede explicar por 2 razones para descartar que es tóxico. 1)
Las células no pudieron adherirse adecuadamente a la muestra del híbrido porque
la superficie no fue lo necesariamente uniforme o 2) la muestra sigue siendo la
suficientemente ácido como para no mantener un ambiente propicio para la
proliferación de las células.
4.5. Resultado de prueba de citotoxicidad
El registro de los valores de luminiscencia se lleva a cabo por el lector Glo-Max®
de microplacas con multimodos de la marca Promega. El sistema de detección del
equipo consta de una unidad de detección modular y unidades funcionales;
dispone de lectura de luminiscencia, fluorescencia y absorbancia. El módulo de
luminiscencia trabaja con un tubo fotomultiplicador avanzado de recuente de
fotones (PMT) que detecta hasta 3x10-21 moles de luciferasa, cubriendo un rango
dinámico de más de 8 registros. La lectura tiene una duración de entre 10 y 15
minutos. Los datos son arrogados en una hoja de datos de Excel para su futuro
análisis. La tabla 4.5 presenta los valores de luminiscencia obtenidos de cada
pozo de la placa de 96 pozos.
1 2 3
4 5
Control
85
Tabla 4.5 Resultados arrojados por la prueba de luminiscencia
Las celdas coloreadas fueron analizadas para los resultados de este proyecto. De
dichos resultados, inicialmente se realizó el análisis de los valores de las celdas
correspondientes a la curva de referencia. Se hizo un reajuste de los datos para
facilitar su visualización. (Tabla 4.6) En esta tabla se expone lo siguiente:
Unidad relativa de luminiscencia (RLU) en cada pozo
Número de células depositadas en cada pozo
Promedio de valores de RLU
Número de células correspondientes a cada valor promediado de RLU
Con la finalidad de evitar sesgos en los resultados, se descartó uno de valores de
luminiscencia arrogados ya que se alejaban del valor esperado. (Valor en rojo)
86
Tabla 4.6 Resultados de escalamiento de células
En la gráfica de la figura 4-9 se observa la distribución de los promedios de RLU
contra la cantidad de células correspondientes. Como resultado del análisis se
obtuvo una R² de 0.9699, lo que nos indica que se tiene una escala que se ajusta
a los valores esperados del número de células depositadas, esto proporciona una
referencia confiable de comparación para cuantificar acertadamente las células en
cada pozo.
RLU Células Promedio RLU Células
13116100 140,000 1.36E+07 140,000.00
13719700 140,000 9121470 70,000.00
14093100 140,000 5157620 35,000.00
9474050 70,000 3036000 17,500.00
9045630 70,000 1502093.333 8,750.00
8844730 70,000 865587 4,375.00
4569540 35,000 427175 2,187.50
5341600 35,000
5561720 35,000
3026380 17,500
3058180 17,500
3023440 17,500
1580330 8,750
1211550 8,750
1714400 8,750
830002 4,375
552041 4,375
901172 4,375
435553 2,187.5
429327 2,187.5
416645 2,187.5
87
Figura 4-9. Gráfica de escalamiento de número de células
El primer conjunto de datos de la tabla 4.6 presenta las RLU de los pozos
utilizados para analizar la viabilidad celular en muestra de silica-quitosano. La
columna amarilla es un conjunto de pozos de control de la placa las cuales
estaban vacías; la columna azul representa los pozos con las células expuesta por
6 horas al híbrido; la columna naranja contiene los pozos con las células expuesta
por 3 horas; la columna verde muestra los pozos con las células expuestas por 1
hora; y la columna roja presenta los pozos sin células como control del híbrido.
En el segundo conjunto de datos se muestran la cantidad de de células
correspondiente al valor de luminiscencia de cada pozo. Prosiguiendo, el tercer
conjunto de datos se señalan los datos descartados de cada columna por
presentar valores que pueden sesgar los resultados por estar fuera del rango
común. Por último se presentan los promedios de los 5 pozos de cada momento.
(6, 3 y 1 hora)
y = 96.681x + 984837 R² = 0.9699
0.00E+00
2.00E+06
4.00E+06
6.00E+06
8.00E+06
1.00E+07
1.20E+07
1.40E+07
1.60E+07
0.00 20,000.00 40,000.00 60,000.00 80,000.00 100,000.00 120,000.00 140,000.00 160,000.00
Promedio RLU
88
Tabla 4.7 Conversión de valores de luminiscencia a número de células correspondiente
Se distingue que la columna, donde las células estuvieron expuestas por 3 horas,
presenta valores discrepantes al resto de los resultados por lo que se vio con la
necesidad de descartar esos resultados.
La figura 4-10 exhibe la gráfica de viabilidad celular en base a los resultados
obtenidos.
A 9824.44 1881050 7056830 3494780 13894.9
B 10012.6 1658150 9805700 3070200 14295.4
C 11235.8 1654680 9055320 3350030 12793.5
D 10240.8 1813060 8272880 3979550 14069.1
E 9992.59 1400460 7466060 3836680 14203.3
Datos
controlplaca 6h 3h 1h control SQ
1 2 3 4 5
A -10084.84149 9269.79448 62804.4083 25961.0782 -10042.7395
B -10082.89529 6964.27426 91236.7787 21569.5225 -10038.597
C -10070.24338 6928.38303 83475.3778 24463.8864 -10054.1316
D -10080.53496 8566.55392 75382.3709 30975.1968 -10040.9377
E -10083.10226 4298.91085 67037.1945 29497.4504 -10039.5497
Descarte
controlplaca 6h 3h 1h control SQ
1 2 3 4 5
A -10084.84149 9269.79448 25961.0782 -10042.7395
B -10082.89529 6964.27426 91236.7787 -10038.597
C -10070.24338 6928.38303 83475.3778 24463.8864 -10054.1316
D -10080.53496 8566.55392 75382.3709 30975.1968 -10040.9377
E -10083.10226 67037.1945 29497.4504 -10039.5497
6 7932.251425
3 79282.93046
1 27724.40293
89
Figura 4-10 Gráfica de resultados de prueba de viabilidad celular con silica-quitosano
Se muestra como el número de células se reduce desde la primera hora de
exposición al híbrido. Para la sexta hora de exposición la cantidad de células ya se
había reducido en un 73.56%, llegando a una cantidad de cero células a las 24
horas. En este caso el ácido acético presente en el híbrido podría haber
ocasionado que se tuviera muerte celular. Ante la anterior situación es viable
inhibir tales efectos agregando un buffer, tal como hacen en la síntesis de otros
hidrogeles ya existentes. Una de las posibles opciones es la de un buffer PBS, que
se refiere a una Solución Buffer de Fosfatos, la cual ya es usado con el propósito
de adecuar el pH de hidrogeles, con el propósito de favorecer la curación de
heridas [30]. Otra método posible es la utilización de ácido cítrico, el cual
demuestra tener diferentes niveles de pH según la concentración por moles en la
que se presente [31] y que ya es aplicado en productos para la obtención de una
mejor interacción entre el biomaterial y la herida.
Según la literatura, el silica-quitosano se distingue por su alta biocompatibilidad.
Los resultados obtenidos en el presenta proyecto difieren de esta afirmación. [17,
24, 25, 27] Por ende, se realizó una prueba de viabilidad con el mismo método a
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 1 6 24
Nú
me
ro d
e c
élu
las
Tiempo (horas)
90
los monómeros de TEOS y quitosano mezclados. La figura 4-11 presenta la
gráfica de viabilidad celular de las células expuestas a los monómeros TEOS Y
quitosano mezclados.
Figura 4-11 Gráfica de resultados de viabilidad celular con monómeros TEOS y quitosano
mezclados
Se observa proliferación celular linear, concluyendo que el TEOS y el quitosano no
inhiben la proliferación celular, sino algún otro componente utilizado en el proceso
de desarrollo del híbrido.
91
5. Conclusiones y trabajo futuro
En este proyecto se realizó la síntesis, la adecuación y la evaluación de
biocompatibilidad de híbridos de sílica-quitosano. Se llevó a cabo la síntesis de 5
muestras de silica-quitosano con distintas concentraciones de monómeros. Debido
a su consistencia de hidrogel, fue necesario su adecuación para las pruebas de
citotoxicidad.
Se saturaron las muestras con agua destilada y se colocaron cada una en un
frasco de laboratorio para dejar reposar por 72 horas. La muestra con la
concentración con 5% de quitosano mostró una capa adherida al fondo del frasco
con mayor uniformidad y resulto apropiadamente homogéneo, siendo esto una
ventaja para realizar las pruebas de citotoxicidad del material. Sin embargo,
poseía un pH significativamente ácido (3-4) que ponía en riesgo la prueba. Lo
anterior se puede deber a la presencia de ácido acético sin evaporar durante la
síntesis que puede llevar consigo efectos negativos a las células. Por lo tanto, se
realizaron “lavados” para disminuir la acidez de la muestra y así proseguir con el
desarrollo. Se requirió de 7 “lavados ” para logar la modificación de un pH 3-4 a un
pH 6 mediante el método ya mencionado. Posteriormente, se realizó la
esterilización del material utilizando un autoclave horizontal de laboratorio. Se
determinó que la muestra debió de estar saturada en agua destilada para evitar su
deshidratación y mantener su consistencia hidrogel.
Preliminar a las prueba de citotoxicidad, se realizaron pruebas para definir la
óptima concentración del híbrido para su interacción con células. Se depositó el
híbrido en distintas concentraciones en placas Petri de 6 pozos en dos
presentaciones: polvo y gel. Se demostró que la muestra en polvo formó
granulaciones de polvo hinchado que impidieron la formación de una capa
uniforme en la superficie del pozo; por lo que se descartó la utilización de esta
presentación. La razón para el descarte de la muestra en polvo fue porque su
estado no homogéneo probablemente llegaría a ahogar a las células que se le
sembraran. Por el contrario, la muestra en gel mostró la formación de una capa
92
uniforme y homogénea adecuada para realizar las pruebas correspondientes para
evaluar la biocompatibilidad del híbrido. Posteriormente, se sembraron 200,000 en
cada pozo con distinta concentración de muestra y se observó que a ninguna
concentración se tenía viabilidad celular al exponer las células al híbrido por 24
horas.
La prueba realizada para la evaluación de biocompatiilidad fue un ensayo de
viabilidad celular por luminiscencia CellTiter-Glo® de la marca Promega. Se
expusieron células al híbrido por 6, 3, y 1 hora para analizar su viabilidad a través
del tiempo. Se concluyó que la muerte celular era progresiva en el transcurso de 6
horas de haber depositado las células sobre la película del hidrogel previamente
adecuado. Se consideran 2 posibles razón de la muerte celular. Primeramente se
le atribuye a la despolimerización del componente TEOS. Según la literatura, el
material puede sufrir este efecto debido a múltiples factores cómo: el pH,
temperatura o fuerza iónica; que posteriormente produjo la liberación de grupos
carboxilos que contaminaron a las células. Sin embargo, otra razón puede ser por
la utilización del ácido acético que creó un ambiente no propicio para las células
ya que su alta acidez es un factor negativo para ellas.
Como trabajos futuros se propone la investigación del uso de buffers o
estabilizadores de pH, para mayor control sobre el ácido acético que permanece
como parte del híbrido después de realizada su síntesis o la sustitución del ácido
acético por distintas sustancias que sean favorables para la aplicación del híbrido.
Estas propuestas se sustentan con los resultados de la prueba de proliferación
celular que mostraron los monómeros TEOS y quitosano mezclados donde se
concluye que éstos materiales no inhiben la proliferación celular. Por lo tanto, la
muerte celular recae en los demás componentes de la síntesis del hidrogel.
93
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