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UNIVERSIDAD DE MURCIA FACULTAD DE MEDICINA Valor Predictivo y Pronóstico de la Determinación de Células Tumorales y ADN Libre Circulantes en Plasma en Carcinoma Epitelial de Ovario en Estadio Avanzado D. Jerónimo Martínez García 2017

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UNIVERSIDAD DE MURCIA

FACULTAD DE MEDICINA

Valor Predictivo y Pronóstico de la Determinación de Células Tumorales y ADN Libre Circulantes en Plasma

en Carcinoma Epitelial de Ovario en Estadio Avanzado

D. Jerónimo Martínez García

2017

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TUTOR

Dr.D.JoaquínGarcía-EstañLópez

CatedráticodeFisiologíaMédica.UniversidaddeMurcia

DIRECTORES

Dr.D.JoséLuisAlonsoRomeroJefedeServiciodeOncologíaMédica.HospitalC.U.VirgendelaArrixacaProfesorasociadodelAreaMedicina.UniversidaddeMurcia

Dr.D.AlfredoMinguelaPurasJefedeSeccióndelserviciodeInmunologíaClínica.HospitalC.U.VirgendelaArrixacaProfesorasociadodelAreaMedicina.UniversidaddeMurcia

Dr.D.PedroAntonioCascalesCamposF.E.A.deldepartamentodeCirugíaGeneral.HospitalC.U.VirgendelaArrixacaProfesorasociadodelAreaMedicina.UniversidaddeMurcia

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A mis padres

A Hugo y Marco

A Mª Carmen

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AGRADECIMIENTOS

La realización del presente trabajo solo ha sido posible por la colaboración y participación de muchas personas a quiénes debo un enorme agradecimiento.

A las pacientes y a las voluntarias sanas que han participado en este estudio, las primeras, son la base de nuestro trabajo. Su participación desinteresada por el bien de futuras mujeres es un

encomiable ejemplo a seguir.

Al Dr. José Luis Alonso Romero, director de esta tesis, por haber sido el pilar fundamental para realizar este estudio, por sus sabios consejos y por haber confiado en mí.

Al Dr. Alfredo Minguela Puras, codirector de esta tesis, por su gran trabajo con las células tumorales circulantes y por transmitirme el entusiasmo de un espíritu investigador.

Al Dr. Pedro Cascales, codirector de esta tesis, por su continua inquietud científica y dedicación.

Al Dr. Joaquín García-Estañ López, tutor de mi tesis, por su gran amabilidad y disposición, me ha permitido y ayudado en la consecución de este trabajo.

A todos los miembros del comité de tumores ginecológicos y carcinomatosis del Hospital Clínica Universitario Virgen de la Arrixaca (HCUVA), formado por ginecología oncológica, cirugía

peritoneal, oncología médica, oncología radioterápica, radiología y anatomía patológica. A todos ellos les tendré siempre una enorme gratitud por su colaboración. Es un honor y un placer trabajar en este

formidable equipo.

Al Dr. Daniel Carbonell de radiología, que siempre me aceptaba con gran amabilidad la realización de las biopsias que le pedía con tanta urgencia.

A la Dra. Edith Braun, del servicio de Oncología Médica del Hospital Universitario Santa Lucía de Cartagena, por su gran disposición a participar en este estudio.

A Vicky Martínez Sánchez, bióloga investigadora del servicio de Inmunología del HCUVA, por sus enseñanzas y por recibirme siempre con una sonrisa cuando le llevaba muestras.

Al equipo de Biobanco, dirigidos por la Dra. Teresa Escámez, por su continua ayuda y disponibilidad en todo momento.

A Anabel Antón García, coordinadora científica de la plataforma de genómica del IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria), por sus grandes conocimientos y por tanta

energía positiva que me ha transmitido.

A Guadalupe, estadística de la Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias de la Región de Murcia, por sus enseñanzas y ayuda de los procedimientos estadísticos, y por hacer fácil

lo que parece difícil.

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A mis compañeros del servicio de Oncología Médica del HCUVA, tanto adjuntos como residentes, por su participación en este proyecto, por estar ahí cuando los he necesitado y por esos

buenos momentos que siempre paso junto a ellos.

A mis queridas Ana y Paula, nuestras coordinadoras de proyectos, por todo el trabajo que les he dado con mis “renos” y el ánimo que siempre me han transmitido para continuar con este estudio.

A mi familia, y en especial a mis padres, por su entrega durante toda la vida y los valores que me han transmitido, y por haberme dado y seguir dándome tanto y tanto cariño.

Y muy especialmente a mis hijos Hugo y Marco, por ser la luz y el alma de todos mis días, y a mi amada Mª Carmen, por haber hecho de mi vida en un sueño maravilloso. Gracias por tu apoyo, tu

paciencia y por tu amor.

Gracias.

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INDICE DE CONTENIDOS

Abreviaturas ..............................................................XVIIListadetablas ..............................................................XIXListadefiguras ..............................................................XXI1. Resumen............................................................12. Introducción..........................................................5

2.1. CáncerEpitelialdeOvario 72.1.1. Epidemiología 92.1.2. Factoresderiesgoyfactoresprotectores 132.1.3. Patogeniaycarcinogénesis 152.1.4. Anatomíapatológica 202.1.5. Historianatural 242.1.6. Diagnóstico 272.1.7. Estadificación 292.1.8. Factorespronósticos 292.1.9. Manejoterapéutico 33

2.1.9.1. Planteamientoterapéuticoenestadioprecoz 332.1.9.2. Planteamientoterapéuticoenestadioavanzado 362.1.9.3. Tratamientodelarecaídatumoral 40

2.2. Biomarcadores 432.3. CélulasTumoralesCirculantes 492.4. DNAcirculanteplasmático 58

3. Hipótesisyobjetivos...................................................713.1. Justificaciónypertinenciadelestudio 733.2. Hipótesis 743.3. Objetivos 74

4. Materialymétodos....................................................774.1. Diseñodelestudio 794.2. Poblaciónaestudio 794.3. Duraciónycentrosderealización 814.4. Variablesdelestudio 814.5. Metodología 84

4.5.1. Plandetrabajo 844.5.2. Tratamientodelaspacientes 874.5.3. Valoraciónderespuesta 874.5.4. Metodologíadeprocesamientoyanálisisdeparámetrosbioquímicos

ydehemograma 87 4.5.5. MetodologíadeprocesamientoyanálisisdeCTC 904.5.6. MetodologíadeprocesamientoyanálisisdecfDNA 914.5.7. Recogidadedatos 944.5.8. Planificacióndelanálisisdelosdatos 95

4.6. Diseñoestadístico 974.7. Consideracioneséticas 984.8. Financiación 98

5. Resultados...........................................................995.1. Estudiodelascaracterísticasclínicasdelaspacientes ......................101

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5.1.1. Estudiodescriptivodelascaracterísticasclínicasdelamuestrapacientes. 102

5.1.2. Estudiocomparativodelaedadycaracterísticasanalíticasentrelamuestrapacientesylamuestracontrol. 106

5.1.3. Análisisunivariantedelvalorpredictivodelasvariablesclínicas. 1085.1.3.1. Valorpredictivoderespuestatumoralaquimioterapia

neoadyuvante. 1085.1.3.2. Valorpredictivodecirugíaóptima. 1095.1.3.3. Valorpredictivoderespuestatumoralalfinalizarel

tratamiento. 1105.1.4. Análisisunivariantedelvalorpronósticodelasvariablesclínicas. 111

5.1.4.1. Valorpronósticodesupervivencialibredeprogresión. 1115.1.4.2. Valorpronósticodesupervivenciaglobal. 113

5.2. Análisisdelosbiomarcadoresplanteadosenestetrabajo....................116

5.2.1. Estudiodescriptivodelnivelbasaldelosbiomarcadoresenelgrupodepacientes. 116

5.2.2. Estudiocomparativodelosbiomarcadoresentreelgrupopacientesyelgrupocontrol. 117

5.2.3. Estudiodelainfluenciadelascaracterísticasclínicasdelaspacientesenelvalordelosbiomarcadores. 122

5.2.4. EstudiodelainfluenciadelostratamientosenelniveldelosBM. 1265.2.5. Correlaciónentrelosdiferentesbiomarcadores. 1295.2.6. Análisisunivarianteymultivariantedelvalorpredictivoderespuesta

delosbiomarcadores. 1325.2.6.1 Valorpredictivoderespuestaaquimioterapianeoadyuvante.1325.2.6.2 Valorpredictivodecirugíaóptima. 1355.2.6.3 Valorpredictivoderespuestafinal. 137

5.2.7. Análisisunivarianteymultivariantedelvalorpronósticodelosbiomarcadores. 1415.2.7.1. Valorpronósticodesupervivencialibredeprogresión. 1415.2.7.2. Valorpronósticodesupervivenciaglobal. 145

6. Discusión............................................................151

6.1. Característicasclínicasdelossujetosincluidos 1536.1.1. Estudiodescriptivodelascaracterísticasclínicasdelamuestrapacientes1536.1.2. Comparacióndeedadyparámetrosanalíticosentrepacientesygrupo

control 1556.1.3. Análisisunivariantedelvalorpredictivodelasvariablesclínicas 1556.1.4. Análisisunivariantedelvalorpronósticodelasvariablesclínicas 156

6.2. Biomarcadoresplanteadosenestetrabajo 157

6.2.1. Estudiodescriptivodelnivelbasaldelosbiomarcadoresenelgrupodepacientes 158

6.2.2. Estudiocomparativodelosbiomarcadoresentreelgrupopacientesyelgrupocontrol 159

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6.2.3. Influenciadelascaracterísticasclínicasdelaspacientesenelvalordelosbiomarcadores 161

6.2.4. InfluenciadelostratamientosenelniveldecfDNA 1646.2.5. CorrelaciónentrelosdiferentesbiomarcadoresenelCEO 1646.2.6. Análisisunivarianteymultivariantedelvalorpredictivoderespuesta

delosbiomarcadores 1666.2.7. Análisisunivarianteymultivariantedelvalorpronósticodelos

biomarcadores 168

6.3. Limitacionesdelestudio 170

7. Conclusiones........................................................1738. Implicacionesclínicasyperspectivasfuturas..............................1779. Anexos............................................................183

I. EstadificaciónTNMyFIGO 185II. ECOG 186III. CriteriosRECIST1.1 187IV. CriteriosderespuestayprogresiónencáncerdeovariodelGCIG2011 188V. Indicedecarcinomatosisperitoneal(PCI)deSugarbaker 190VI. EvaluacióndelCEIC 191VII. ConsentimientoinformadodeBioBanc-Mur 192VIII. Consentimientoinformadodelestudio 193

10. Referenciasbibliográficas.............................................195

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XVII

ABREVIATURAS ADN AcidoDesoxi-ribo-NucleicoAN AcidosNucleicosARN AcidoRibo-NucleicoASCO SociedadamericanadeOncologíaMédica(AmericanSocietyofClinical

Oncology)AUC AreabajolaCurva(AreaUnderCurve)BAG Biopsia-aspiraciónconAgujaGruesaBM BioMarcadoresCAM Matrizdeadhesióncelular(CellAdhesionMatrix)CAPP CArcinomatosisPeritonealPrimariaCDI CirugíaDeIntervaloCEA AntígenoCarcino-EmbrionarioCEO CarcinomaEpitelialdeOvariocfDNA ADNlibrecirculante(freecirculatingDNA)CKs CitoqueratinasCOPR CarcinomaepitelialdeOvarioPlatino-ResistenteCOPS CarcinomaepitelialdeOvarioPlatino-SensibleCPP CirugíaPeritonealPrimariaCRD CuadernodeRecogidadeDatosCTC CélulasTumoralesCirculantesctDNA ADNtumoralcirculanteDAPI 4,6-idamidino-2-fenilindol-2DLP DoxorubicinaLiposomalPegiladaECOG EstadogeneraldelpacientesegúnlaclasificacióndelaEORTCEE EnfermedadEstableEpCAM MoléculadeAdhesióndeCélulasEpitelialesESP EspecificidadFDA FoodandDrugAdministrationG GradohistológicoGCIG GynecologicCancerInterGroupGE EquivalentesgenómicosHb HemoglobinaHCUVA HospitalClínicoUniversitarioVirgendelaArrixacaHE4 HumanEpididymalProtein4HIPEC Quimioterapiaintraperitonealhipertérmica(HyperthermicIntraPEritoneal

Chemotherapy)HR HazardratioIC IntervalodeConfianzaIHQ InmunoHistoQuímicaILP IntervaloLibredePlatinoIMC IndicedeMasaCorporalIMIB InstitutoMurcianodeInvestigaciónBiosanitariaLDH LactatoDesHidrogenasa

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LSN LímiteSuperiorNormalmRNA AcidoRibo-NucleicoMensajeromL MililitroMS MedianadeSupervivenciaMS MedianadeSupervivenciang nano-gramosNLR RatioNeutrófilo-Linfocito(Neutrophil-to-LymphocyteRatio)OC Tortaepiploica(Omentalcake)OR OddsratioPCI Indicedecarcinomatosisperitoneal(PeritonealCancerIndex)PCR ReacciónenCadenadelaPolimerasaPE ProgresióndeEnfermedadPET/TC TomografíaporEmisióndePositrones/TomografíaComputerizadaPMN PoliMorfo-NeutrófilosPNI IndicePronósticoNutricional(PrognosticNutritionalIndex)qPCR PCRcuantitativaQT QuimioterapiaQTA QuimioterapiaAdyuvanteQTNA QuimioTerapiaNeoAdyuvanteRC RespuestaCompletaRMN ResonanciaMagnéticaNuclearRP RespuestaParcialRR RiesgorelativoRT-PCR ReversetranscriptionpolymerasechainreactionSG SupervivenciaGlobalSG5a SupervivenciaGlobala5añosSLE SupervivenciaLibredeEnfermedadSLP SupervivenciaLibredeProgresiónSLT SupervivenciaLibredeTratamientoSS SensibilidadTC TomografíaComputerizadaTIL Infiltradolinfocitarioperitumoral(Tumor-infiltratinglymphocytes)TR TasadeRespuestaVN ValorNormalvs Versus

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XIX

LISTA DE TABLAS INTRODUCCION

Tabla2.1. Clasificaciónhistológicadelostumoresováricos. . . .8Tabla2.2. CincoprincipalestiposdecáncerdemayormortalidadenEstados

Unidosen2012,poredad. . . . . . .11Tabla2.3. Factoresderiesgo,protectoresycontrovertidosenelCEO. . .13Tabla2.4. Clasificacióndeloscarcinomasováricosen5gruposdiferentesdePrat..18Tabla2.5. CaracterísticasclínicasymolecularesdelcarcinomadeovarioTipoIyTipoII19Tabla2.6. Tiposdetumoresepitelialesováricos. . . . . .20Tabla2.7. Frecuenciadepresentaciónysupervivenciaa5añosenfuncióndelestadio

tumoral. . . . . . . . .29Tabla2.8. FactorespronósticosdelCEO. . . . . . .30Tabla2.9. Guíaquirúrgicaenestadiosiniciales. . . . . .34Tabla2.10. Potencialesbiomarcadoresenelcarcinomaepitelialdeovario. . .43Tabla2.11. EstudiossobreCTCenCEO. . . . . . .55Tabla2.12. EstudiosconcfDNAendiversasneoplasias. . . . .64Tabla2.13. EstudiosconcfDNAencarcinomadeovario. . . . .67

MATERIALYMETODOS

Tabla4.1. Determinacionessanguíneasengrupo1(CPPyQTA). . . .86Tabla4.2. Determinacionessanguíneasengrupo2º(QTNAyCDI).. . .86Tabla4.3. Determinacionessanguíneasengrupo3º(QTpaliativa,sincirugíaprevista).86Tabla4.4. ValoresesperadosdeintegridaddelADN. . . . .93Tabla4.5. CondicionesdefuncionamientodelequipoLightCycler480(Roche). .93

RESULTADOS

Tabla5.1. Estudiodescriptivodelascaracterísticasclínicasdelamuestrapacientes..103Tabla5.2. Estudiodescriptivodevariablesdeseguimiento. . . .105Tabla5.3. Comparacióndeedadyvariablesanalíticasentrepacientesygrupo

control. . . . . . . . .106Tabla5.4. AnálisisunivariantedelvalorpredictivoderespuestaaQTNA. . .108Tabla5.5. AnálisisunivariantedelvalorpredictivoderesultadoquirúrgicoóptimoR0.109Tabla5.6. Análisisunivariantedelvalorpredictivoderespuestaalfinalizarel

tratamiento. . . . . . . . .110Tabla5.7. Análisisunivariantedelvalorpronósticodelasvariablesclínicasen

relaciónconlasupervivencialibredeprogresión. . . .111Tabla5.8. Análisisunivariantedelvalorpronósticodesupervivenciaglobal

delasvariablesclínicas. . . . . . .114Tabla5.9. Descripcióncuantitativadelosnivelesbasalesdelosbiomarcadores. .116Tabla5.10. Descripcióndebiomarcadoresporintervalosdevalor. . . .116Tabla5.11. EstudiodescriptivodelosvaloresdeCTC. . . . .117

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Tabla5.12. ComparacióndeBMentregrupodepacientesygrupocontrol. . .118Tabla5.13. ComparacióndeBMentrepacientes,tumoresbenignosycontrolessanos.119Tabla5.14. ComparaciónCTCentrepacientes,tumoresbenignosycontrolessanos.121Tabla5.15. ValoresdeROC,sensibilidadyespecificidadparalosBM. . .122Tabla5.16. InfluenciadelascaracterísticasclínicasenelvalordecfDNA. . .122Tabla5.17. InfluenciadelascaracterísticasclínicasenlapresenciadeCTC. . .123Tabla5.18. InfluenciadelascaracterísticasclínicasenelvalordeCa125. . .124Tabla5.19. InfluenciadelascaracterísticasclínicasenelvalordeHE4. . .125Tabla5.20. Correlacionesdelosbiomarcadoresconlasvariablesanalíticasgenerales.125Tabla5.21. Resumendelainfluenciadecaracterísticasclínicasenelvalordelos

biomarcadores.. . . . . . . .126Tabla5.22. ValoracióndelefectodelaCPPsobreelvalordelosBM. . .126Tabla5.23. ValoracióndelefectodelprimerciclodeQTsobreelvalordelosBM. .128Tabla5.24. ValoracióndelefectodelaQTNAsobreelvalordelosBM. . .128Tabla5.25. Correlacionesentrelosdiferentesbiomarcadores. . . .129Tabla5.26. RelacióndeCTCconelrestodeBM. . . . . .130Tabla5.27. ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestaaQTNA.132Tabla5.28. ValorpredictivodelareduccióndelosBMtrasunciclodetratamiento

respectoalarespuestaaQTNA. . . . . .134Tabla5.29. ValorpredictivodeCTCrespectoalarespuestaaQTNA. . .134Tabla5.30. AnálisismultivariantedelosfactoresrelacionadosconrespuestaaQTNA.134Tabla5.31. ValorpredictivoderesultadoóptimodelvalorprevioacirugíadelosBM.135Tabla5.32. ValorpredictivodeCTCrespectoacirugíaóptimaR0. . . .136Tabla5.33. Análisismultivariantedelvalorpredictivoderesultadoquirúrgico

óptimoR0. . . . . . . . .137Tabla5.34. ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestafinal..137Tabla5.35. ValorpredictivodelniveltrascirugíadelosBMrespectoalarespuesta

final. . . . . . . . . .139Tabla5.36. ValorpredictivodeCTCrespectoalarespuestafinal. . . .139Tabla5.37. Análisismultivariantedelosfactoresrelacionadosconrespuestafinal. .140Tabla5.38. ValoresdeROC,sensibilidadyespecificidaddelosBMparaSLP. .141Tabla5.39. ValorpronósticodelosBMrespectoalaSLP. . . . .142Tabla5.40. Análisismultivariantedelvalorpronósticodesupervivencialibrede

progresión. . . . . . . . .144Tabla5.41. ValoresdeROC,sensibilidadyespecificidaddelosBMparaSG. .145Tabla5.42. ValorpronósticodelosBMrespectoalaSG. . . . .146Tabla5.43. Análisismultivariantedelvalorpronósticodesupervivenciaglobal. .149

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XXI

LISTA DE FIGURAS INTRODUCCION

Figura2.1. IncidenciaanivelmundialdelCEO. . . . . .9Figura2.2. Tasadeincidenciadecáncerdeovarioporperiodo.RegióndeMurcia

1983-2012. . . . . . . . .10Figura2.3. Tasadeincidenciadecáncerdeovarioporgrupodeedad.Regiónde

Murcia2003-2007. . . . . . . .10Figura2.4. MortalidadanivelmundialdelCEO. . . . . .12Figura2.5. Tendenciasdemortalidadenpaisesdesarrolladosyenpaisesenvíasde

desarrollo. . . . . . . . .12Figura2.6. ModelodualistainicialdeShihyKurman. . . . .17Figura2.7. ModelodualistadeKurmanyShihexpandido. . . . .18Figura2.8. PatogénesisdelmodelodualdeKurmanyShih. . . .19Figura2.9. RutasmolecularesalteradasenelCEOSerosoaltogrado. . .21Figura2.10. Mecanismosdemetástasisencáncerdeovarioylasproteínasimplicadas.26Figura2.11. Supervivenciaenfuncióndelestadio. . . . . .30Figura2.12. Supervivenciaglobalestratificadoenfuncióndelaenfermedadresidualtras

cirugía.. . . . . . . . .32Figura2.13. SG5aenpacientesestadioprecoz.AnálisisconjuntoestudioACTION

eICON-1. . . . . . . . .35Figura2.14. CurvadeSGcomparandotratamientointravenosoconintraperitoneal..39Figura2.15. Procesodemetástasisdelascélulastumorales.. . . .49Figura2.16. SistemaCellSearch. . . . . . . .51Figura2.17. Imagendecélulastumoralescirculantes. . . . .52Figura2.18. PrevalenciadeCTCen7.5mLdesangreendiferentespoblaciones. .53Figura2.19. AcidosnucleicosenplasmadeMandelyMétais(1948). . .58Figura2.20. MecanismosdeproduccióndelcfDNA. . . . . .60Figura2.21. Acidosnucleicoslibresenlacirculación. . . . .61Figura2.22. EficienciarelativadelacuantificacióndecfDNAentérminosdelongitud

deADN. . . . . . . . .62Figura2.23. MetodologíasdeestudiodelctDNA. . . . . .63

MATERIALYMETODOS

Figura4.1. Tubosdeextracciónsanguínea. . . . . .85Figura4.2. AnalizadorCellTracksAnalyzerII®. . . . . .90Figura4.3. CurvaestándarAlu115. . . . . . .94Figura4.4. CurvaestándarAlu247. . . . . . .94

RESULTADOS

Figura5.1. Diagramaconlasmujeresincluidasenelestudio. . . .101Figura5.2. Histogramaconladistribucióndeedadesporgruposetarios. . .102Figura5.3. Diagramadecajasdelasvariablescuantitativasentrepacientesygrupo

control. . . . . . . . .107

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Figura5.4. Curvasdesupervivencialibredeprogresiónenrelaciónavariablesclínicas. . . . . . . . .112

Figura5.5. Curvasdesupervivenciaglobalenrelaciónalasvariablesclínicas. .115Figura5.6. DiagramadecajasconlosBMenelgrupopacientes,grupotumores

benignosygrupodecontrolessanos. . . . . .120Figura5.7. CurvaROCdelosBMrespectoalacapacidadparadiferenciarpacientes

ygrupocontrol. . . . . . . .121Figura5.8. ValoracióndelefectodelaCPPsobreelvalordelosBM. . .127Figura5.9. ValoracióndelefectodelprimerciclodeQTsobreelvalordelosBM. .127Figura5.10. ValoracióndelefectodelaQTNAsobreelvalordelosBM. . .128Figura5.11. Gráficoconlacorrelaciónentrevariablescontinuas. . . .129Figura5.12. GráficodecajasdelosBMenfuncióndeCTC. . . . .131Figura5.13. ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestaaQTNA.133Figura5.14. ValorpredictivodelniveldelosBMrespectoalresultadoóptimode

cirugía. . . . . . . . .135Figura5.15. ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestafinal..138Figura5.16. AreabajolacurvadelosBMrespectoaSLP. . . . .141Figura5.17. CurvasdeSLPrespectoalvalorbasaldelosBM. . . .143Figura5.18. CurvasdeSLPenfuncióndelareduccióndelvalordelBMtrasunciclo

deQT. . . . . . . . . .144Figura5.19. AreabajolacurvadelosBMrespectoaSG. . . . .145Figura5.20. CurvasdesupervivenciaglobalenfuncióndelvalorbasaldelosBM. .147Figura5.21. CurvasdeSGenfuncióndelareduccióndelvalordelBMtrasunciclo

deQT. . . . . . . . . .148

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1. Resumen

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Resumen

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Español

El carcinoma epitelial de ovario (CEO) es la segunda neoplasia ginecológica másfrecuenteylademayormortalidad.Apesardeunaaltaquimiosensibilidadinicial, lamayoríade pacientes con estadio avanzado presentarán recaída tumoral. La recurrencia supondrágeneralmente una enfermedad incurable que precisará tratamiento indefinido conquimioterapia y, finalmente, desarrollará resistencia a quimioterapia y tendrá unasupervivencia reducida. La valoración de la respuesta tumoral se basa en criterios clínicos,radiológicosyserológicos.Losdosúnicosbiomarcadores(BM)aprobadosenlaprácticaclínicasonelCa125yHE4,peropresentanlimitacionesdesensibilidadyespecificidad.

Debido a estas limitaciones, al alto índice de recaída del CEO avanzado y al malpronóstico de la enfermedad resistente, en los últimos años hay numerosas investigacionesqueevalúannuevosBMynuevasestrategiasterapéuticasparamejorar losresultadosde lostratamientos.Senecesitannuevosindicadorescapacesdelograrunavaloraciónmássensibleyespecíficadelaenfermedad.

Una de las vías de estudio es analizar el papel que juegan las células tumoralescirculantes(CTC)yelADNlibrecirculante(cfDNA)enplasmaenlosprocesosoncológicos.Enelpresente trabajo hemos realizado un estudio observacional prospectivo durante 3 años, enpacientes con carcinoma epitelial de ovario en fase avanzada de enfermedad o recaídasensible,paradeterminarelvalorpronósticoypredictivodelosnuevosbiomarcadoresCTCycfDNA.

Sehan incluidopacientesprocedentesdelHospital ClínicoUniversitarioVirgende laArrixacay,enelaño2016,sehaañadidoelHospitalUniversitarioSantaLucíadeCartagena.Sehaincluidoungrupocontroldetumoresbenignosygrupocontroldemujeressanas.Tambiénse han realizado determinaciones basales de BM antes del inicio del tratamiento yextracciones seriadas a lo largo de él, y se han comparado con las características clínicas yevolucióndelaspacientes.

El presente trabajo ha sido posible gracias a la colaboraciónmúltiples personas y laparticipacióndepacientesyvoluntarias.Elestudio recibiódictamen favorabledel comitédeéticadelHospitalClínicoUniversitarioVirgendelaArrixaca.

Losdatosexpuestosaquísonelresultadodeestetrabajo.

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Resumen

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Inglés

Ovarianepithelialcarcinomaisthesecondmostfrequentgynecologicalcancerandhasthe highest mortality. Despite a high initial chemosensitivity, most patients with advanceddisease will relapse. Recurrent disease is usually incurable and need several lines ofchemotherapyuntil itdevelopresistance.Theevaluationofthetumourresponseisbasedonclinical, radiological and serological criteria. The only two biomarkers approved in clinicalpracticalareCa125andHE4,buttheyhavelimitationsinsensitivityandspecificity.

Due to these limitations, thehigh rateof relapseof theadvancedCEOand thepoorprognosis of the resistant disease, new BMs and new therapeutic strategies are needed toimprove the prognosis. New indicators are needed to achieve more sensitive and specificassessmentofthedisease.

Oneof the research lines is toanalyse the roleof circulating tumour cells (CTC)andcirculatingfreeDNA(cfDNA)inplasmainoncologicalprocesses.Wehavecarriedouta3yearsprospective observational study in patients with advanced ovarian epithelial carcinoma orsensitive relapsed tumour to determine the prognostic and predictive value of the newbiomarkersCTCandcfDNA.

WehaveincludedinthisinvestigationprojetpatientsfromClinicalHospitalVirgendela Arrixaca and -from 2016- patients from University Hospital Santa Lucía de Cartagena. Acontrol group of benign tumours and control group of healthywomen have been included.Baseline biomarkers determinationswere also performedbefore the start of treatment andserialextractionsthroughthetreatmentandhavebeencomparedwithclinicalcharacteristicsandtumourevolution.

Thisworkhasbeenpossibleduetocollaborationofmanyresearchers,physiciansandtheotherclinicians,andtheparticipationofpatientsandvolunteers.ThisstudywasapprovedbyHospitalClinicalUniversityVirgendelaArrixacaEthicsCommittee.

Thedatapresentedherearetheresultofthisresearch.

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2. Introducción

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Introducción

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Introducción

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2.1. CANCER EPITELIAL DE OVARIO

Lasneoplasiasováricasenglobanelconjuntodetumoresquesurgendelasestructurasanexiales del aparato reproductor femenino. Suponen un grupo muy heterogéneo en suhistogénesis e historia natural. Podríamos dividirlos en 4 grandes categorías: tumoresepiteliales (65-70%), tumores de los cordones sexuales-estroma (15-20%), tumores de lascélulasgerminales(5-10%)ymetástasis(5%)1(tabla2.1).

Lostumoresepitelialessonlosmásfrecuentes,pudiendoserdesubtiposeroso(46%),mucinoso (36%), endometrioide (8%), células claras (3%), transicional (2%), indiferenciado(2%)ymixtos(3%)1.Cadasubtipopuedepresentarseconcomportamientobenigno,borderlineodebajopotencialmaligno,ymaligno.

Los tumoresde cordones sexuales y estromaderivande los cordones sexuales ydelestroma ovárico. Suponen el 15-20% de las neoplasia malignas ováricas y suelen darse enjóvenesyadultos.Elmásfrecuenteeseltumordecélulasdelagranulosa.

Los tumores de células germinales derivan de las células germinales primitivas delovario. Suponen el 5-10% de las neoplasias malignas ováricas y suele darse en pacientesjóvenes. En sumayoría son teratomas quísticosmaduros y benignos. El resto sonmalignos,siendoelmásfrecuenteeldisgerminoma.

Lasmetástasispuedenprocederdecualquiertumorsistémico,siendoelmásfrecuenteelcarcinomadecolonseguidodelcarcinomademama.Suelensertumoracionesbilateralesyde tamaño menor a 10 cm. El tumor de Kruckenberg clásico se refiere al carcinomametastásicodecélulasenanillodesellodeprimariogástrico,apéndiceocolon,yqueafectaalosovariosdeformasecundaria.

Elpresentetrabajosebasaenelestudiodelostumoresepitelialesmalignosdeovario.Todoloquesecomenteacontinuaciónharáreferenciaaellos.

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TABLA2.1.Clasificaciónhistológicadelostumoresováricos.TipoHistológico SubtiposHistológicosTumoresepiteliales Seroso

Tumorserosobenigno(cistoadenofibroma)TumorserosoborderlineodebajopotencialmalignoCarcinomaseroso

CarcinomaserosodebajogradoCarcinomaserosodealtogrado

MucinososTumormucinosobenignoTumormucinosoborderlineodebajopotencialmaligno

TipogastrointestinalTipoendocervical,seromucinosooMülleriano

CarcinomamucinosotipointestinalTumormucinosoconPseudomixomaPeritoneal

EndometrioideTumorendometrioidebenignoTumorendometrioideborderlineodebajopotencialmalignoCarcinomaendometrioide

CarcinomaendometrioidedebajogradoCarcinomaendometrioidedealtogrado

CélulasclarasTumorcélulasclarasbenignoTumorcélulasclarasborderlineodebajopotencialmalignoCarcinomadecélulasclaras

Tumordecélulastransicionales(Brenner)Tumordecélulastransicionalesbenigno(Brenner)TumordeBrennerborderlineodebajopotencialmalignoTumordeBrennermalignoCarcinomadecélulastransicionales

IndiferenciadoMixto

Tumores de los cordonessexuales-estroma

TumoresdecélulasdelagranulosadeladultoTumoresdecélulasdelagranulosajuvenilTumordecélulasdeSertoli-LeydingTumordeloscordonessexualescontúbulosanularesGinandroblastomaFibroma-tecomaTumoresestromalesesclerosantesTumoresdecélulasesteroideassinotraespecificaciónTumoresdecélulasdeLeydigyluteomasestromales

Tumoresgerminales TeratomaquísticomaduroTeratomainmaduroDisgerminomaTumordelsacovitelino(YolkSac)GonadoblastomaCarcinomaembrionario

Miscelánea ParagangliomaMixomaCarcinomadecélulaspequeñastipohipercalcemianteCarcinomadecélulaspequeñastipopulmonarCarcinomaneuroendocrinodecélulasgrandes

Metástasis Adaptadode:KongCS,LongacreTAandHendricksonMR.Pathology.En:Berek&Hacker’s.GynecologicOncology.Sixthedition.Philadelphia:WoltersKluwer;2015

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2.1.1. EPIDEMIOLOGÍA

El cáncer epitelial de ovario (CEO) suponeun importante problemade salud para elsexofemenino.Enpaísesdesarrolladoseslasegundaneoplasiaginecológicamásfrecuenteylaprincipalcausademuerteporcáncerginecológico.Enlamortalidadporcáncerenlamujerocupaelquintolugar,conun5%deltotal2.

INCIDENCIA

A nivel mundial, el CEO se sitúa como el séptimo tumor más frecuente en el sexofemenino, con un total de 238.719 casos en 20123. Dentro de las neoplasias ginecológicas,ocupael tercer lugar,pordetrásdel carcinomadeúteroydecérvix (figura2.1)2,3.Enpaísesdesarrollados es el segundo a nivel ginecológico, sólo por detrás del cáncer de endometrio,debidoaladisminucióndeincidenciadelcarcinomacervical.

LatasadeincidenciaesmayorenEuropadeleste,Rusia,CanadáyArgentina,conunaincidenciaestandarizadaalaedadmayorde8.4casos/100.000personasyaño,siendomáximaenBulgaria,LetoniaeislasJiji,conunatasadeincidenciaanualde14casos/100.000.Lamenorincidencia corresponde a Africa, Arabia y países del sur de Asia, con una tasa menor de 6casos/100.000(figura2.1).

FIGURA2.1.IncidenciaanivelmundialdelCEO.

Hay una tendencia a una disminución de la incidencia en los últimos 30 años. En elregistroSEER4seapreciauna tasade incidenciaanualde16.32casos/100.000en1975,yen2007sereducea12.97casos/100.000.Lareducciónesmayorenlarazablanca.

LaincidenciadelCEOaumentaconlaedad,pasandodesde3.2casos/100.000entrelos30-34añoshasta55.6casos/100.000entrelos80-84años.Laedadmediaesde63años,conunriesgoalolargodelavidadepadeceruncáncerdeovariode1.43,4.Entrelos50y70añossedael50%deloscasos,siendoraropordebajodelos40años(menosdeun10%)5.

EnEspañaen2014, según laRedEspañoladeRegistrosenCáncer6,elCEO fueel5ºcáncer más frecuente en el sexo femenino, con un total de 3276 casos, con una tasa deincidencia ajustada por edad de 10,2 casos/100.000 personas, situándose en la 4ª tasamásbajadeEuropa,porencimasolodePortugal,ChipreyHolanda.

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EnlaRegióndeMurcia,elCEOsuponeel6ºcáncerenfrecuenciaenlamujer,conun4%, siendo tambiénel2ºdelaparatogenital,pordetrásdel cáncerdeútero7.Enelperiodo1983-2007sehandiagnosticado1498nuevoscasosen la regióndeMurcia. La incidenciahaido aumentando de forma lenta en los últimos 30 años, pasando de una tasa ajustada a laedadde7,5casos/100.000en1984y7,9en1985,aunatasa12,5en2006y9en2007,conunporcentajedecambioanualde1,59(figura2.2)8.

FIGURA2.2:Tasadeincidenciadecáncerdeovarioporperiodo.RegióndeMurcia1983-2012

De:BoletínepidemiológicodeRegióndeMurcia.

Respecto a la distribución por edad, en la figura 2.3 vemos también un aumentoprogresivoconlaedad,conunaelevaciónenlaincidenciaapartirdelos45-50años,conunatasade20-25/100.000,yporencimade65añossuperandolos30casos/100.000.

FIGURA2.3:Tasadeincidenciadecáncerdeovarioporgrupodeedad.RegióndeMurcia2003-2007

De:BoletínepidemiológicodeMurcia.

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MORTALIDAD

En países desarrollados, el CEO supone la principal causa demortalidad por cáncerginecológico.Globalmente,eslaquintacausademortalidadglobalporcáncerenmujeres,conun5%deltotal,quedandopordebajodelcáncerdepulmón,mama,colorrectalypáncreas.Enla5ªy6ªdécadadelavida,seelevaala4ªcausademortalidadoncológicaenmujeres(tabla2.2).Seestimaqueen2016habránenEEUU14.240muertesporCEO2.

Laelevadamortalidadglobalporcáncerdeovariopareceexplicarse,enparte,porquelamayoríade laspacientessondiagnosticadasenestadiosavanzadosde laenfermedad(70-80%),endondeyalasposibilidadesdecuraciónsonescasasylasupervivenciaa5añosesentorno al 40%9. La falta de especificidad de los síntomas iniciales de la enfermedad, lalocalizaciónintraperitonealylaausenciademétodoseficacesdediagnósticoprecoz,parecenserlosprincipalesresponsablesdelretrasoeneldiagnóstico10.

TABLA2.2.CincoprincipalestiposdecáncerdemayormortalidadenEstadosUnidos(2012),poredad

NHL:non-HodgkinlymphomaDe:SiegelRL,MillerKDandJemalA.CancerStatistics,2016.CaCancerJClin2016;66:7-30

A nivelmundial, el CEO es la 8ª causa demortalidad por cáncer, con un 4,3%, y lasegundadeorigenginecológico trasel carcinomade cérvix11. La tasademortalidad, al igualque la incidencia, tambiénesmayorenpaísesdeEuropadelEsteyCanadá, siendo tambiénaltaenelnortedeAsia,enalgunospaísesafricanosyenEstadosUnidos.EnEspañayen lospaísesdelsurdeAmérica,AfricayAsiasedalamenortasademortalidad(figura2.4).

Unaspectomuyimportanteadestacar,esqueenlosúltimos30añossehaobservadounamejoríaenlasupervivenciaglobala5años,pasandodeun36%enelperiodo1975-1977,aun46%en2005-20112,4.EnelregistrodelaFIGOtambiénseconstataestamejoría,pasandodeunasupervivenciaglobala5añosdeun30%en losaños70,aun50%en losaños1999-20015.Estatendenciasehavistoenlospaísesdesarrollados,sinembargoenpaísesenvíasdedesarrollo, como Sudáfrica y países de Sudamérica, la tendencia semantiene o incluso estáaumentando(figura2.5).

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FIGURA2.4:MortalidadanivelmundialdelCEO.

FIGURA2.5.Tendenciasdemortalidadenpaisesdesarrolladosyenpaisesenvíasdedesarrollo.

EnEspaña,latasadesupervivenciaajustadaporedadalos5añosenelperiodo2000-

2007(EUROCARE-5)fuedel34.76%,ylatasadesupervivenciarelativaajustadaalaedadalos1, 3 y 5 años, fue de 69.63%, 45.77% y 36.80% respectivamente. Comparando la tasa desupervivenciaajustadaa laedaddelperiodode1995-1999(EUROCARE-4)yelperiodo2000-2007, se observa una estabilización con un 36.90% y 36.80% respectivamente, con unavariaciónsólode-0.10%.LamortalidadenEspañaporcáncerdeovarioen2014presentóunatasabrutade9.11/100.000,conedadmediade70años12.Comparandoconelrestodepaíseseuropeos, Españapresentauna tasade supervivencia relativaajustadaporedad similar a lamediaeuropea13.

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2.1.2. FACTORES DE RIESGO Y FACTORES PROTECTORES

Hayunaseriedefactores, llamadosfactoresderiesgoy factoresprotectores,queserelacionan con aumentoo disminuciónde la incidencia deCEO respectivamente (tabla 2.3).Unagranpartedelosfactoresderiesgoserelacionanconlahistoriareproductivadelamujerysuduración.Factoresqueconllevanmayoractividadovárica,comolanuliparidad,menarquiaprecozymenopausiatardía,serelacionanconaumentodelriesgodeCEO.Sinembargo,otrosfactores en donde hay periodos de descanso ovulatorio ovárico, como la gestación y lalactancia,parecenserfactoresprotectores.EstarelaciónentrelaactividadováricayelriesgodeCEOhallevadoalahipótesisdequelaovulaciónpuedetenerunaimportanterelaciónconla incidenciadeCEO14,yqueunambienteconaumentode laexposiciónaprogestágenosserelacionaconefectoprotector15.

Unaspectomuyinteresanteescomolosdiversosfactoresafectandeformadiferentesegúnel tipohistológico16. Los factores reproductivoscomo laparidadyelnúmerodehijos,suelen ser factores protectores en todos los subtipos, aunque con diferente fuerza deasociación. El uso de anticonceptivos orales se relaciona con todos los subtipos histológicosmenos con el mucinoso. La obesidad parece relacionarse solo con los tumores maldiferenciadosynoconelresto16.

TABLA2.3.Factoresderiesgo,protectoresycontrovertidosenelCEO

FACTORESDERIESGO FACTORESPROTECTORES FACTORESCONTROVERTIDOS

Factoresgenéticos(mutacionesBRCA,MMR,otros)

Anticonceptivosorales Menarquiaprecoz

Historiafamiliardecáncerdeovarioomama

Gestación Estrategiashormonalesreproductivas

Edad Lactancia Dieta

Nuliparidad Ligaduradetrompas Talco

Endometriosis Histerectomía Tabaco

Síndromedeovariopoliquístico Salpingo-oforectomíabilateral Alcohol

Edaddelprimerhijodespuésdelos35años

Consumodesoja Antiinflamatoriosnoesteroideos

Menopausiatardía Exposiciónalsol

Terapiahormonalsustitutiva Vinotinto

Obesidad Aspirina

Dietaricaengrasasanimales

Asbesto

FACTORESDERIESGO

Dentrodelosfactoresderiesgo,podríamosagruparlosenaquellosrelacionadosconlacarga genética de la paciente, los relacionados con el ambiente hormonal y otros demecanismodiverso.

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Dentrodelosprimeros,hayquedestacarqueunporcentajeconsiderabledemujerestendrán predisposición genética para desarrollar CEO. Se han descritos varias alteracionesgenéticas, como las mutaciones BRCA, Síndrome de Lynch y otros, en donde aumenta deformaimportantelaincidenciadeCEO.LasmásimportantessonlasmutacionesdelgenBRCA.ParamujeresconmutacionesBRCA1,laprobabilidadacumuladaabsolutahastalos70añosdepadecerCEOesdel39%(95%IC22-51%)yenmutacionesBRCA2del11%(95%IC4.1-18%),con un riesgo relativo de CEO de 21 para mutación BRCA1 (95%IC 12-36) y de 7 para lamutaciónBRCA2(95%IC3.1-16)17.LaprevalenciadelamutaciónBRCAenpacientesconcáncerdeovarioessolodel10-15%,aunqueenlosserososdealtogrado,puedellegaral17%18.

Otra alteración genética importante es el Síndrome de Lynch o cáncer colorrectalhereditarionoasociadoapoliposis.Sedebeaunamutaciónenlalíneagerminaldelosgenesdereparacióndeapareamientosomismatch(MMR).Estamutaciónproduciráunaumentoderiesgoacumuladoabsolutodeun6-8%depadecerCEO,siendoresponsabledel10-15%deloscánceresdeovariohereditarios19,20.Presentaunaprevalenciaentrelaspacientesdecáncerdeovariodesoloun0.9-2.7%20.

Sehandescritootrosfactoresgenéticosmenosprevalentes,comolosgenesRAD51yBRIP121,y también laexistenciadepacientesconunahistoria familiardecáncerdeovarioocáncerdemamasinafectaciónde losgenesdesusceptibilidadconocidosdecáncer.El tenerun familiar afecto enprimer gradode cáncerdeovariopresentaun aumentode riesgo conriesgorelativo(RR)de1.48(95%IC1.26-1.75),sobretodoenelsubtiposeroso16.

Otro grupo importante de factores de riesgo son aquellos relacionados con unaumentodelaactividadhormonalovárica.Situacionescomolanuliparidad22,23,endometriosis23,24, síndrome de ovario poliquístico25, edad del primer hijo después de los 35 años26,menarquiaprecozymenopausiatardía27,28,sehanrelacionadoconaumentode la incidenciadeCEO.Unaspectocontrovertidodurantemuchosañosha sidoelusode terapiahormonalsustitutiva. A pesar de que hay resultados contradictorios, con algunos estudios que nomostraron relación29, la mayoría de trabajos muestran un pequeño aumento del riesgo deCEO30.El riesgoparecedisminuiralmínimocuandoseañadenprogestágenosal tratamientohormonalsustitutivo,pasandodeunRRde1.22(95%IC1.18-1.27),cuandoseusanestrógenosdurantealmenos5años,aunRRde1.10(95%IC1.04-1.16)15.Otroaspectopolémicohasidoelusocadavezmayordeestrategiashormonalesreproductivasenparejascondificultadparagestación.Lavaloracióndelriesgodeestetipodetratamientosesmuycomplejo,puestoquehaymuchossesgos,desdelosfactoresqueproducenlapropiadificultaddegestación,queasuvezpuedenasociarse conaumentodel riesgodeCEO,hastauna faltadebasesdedatosdepacientesparaunadecuadoestudiopoblacional.Noobstante, estas estrategiashormonalesnohanmostradorelaciónconelcarcinomainvasivo,ysiconelserosobordeline23.

Por último, hay otra serie de factores que presentan un mecanismo variado. Entreellosestaría laedad,queeselprincipal factorderiesgoparapadecercáncerengeneralyelCEOenparticular3,4.Laincidenciaaumentadeformaexponencialapartirdelos40años,conun 50% de pacientes entre 40 y 70 años, y una edad media de 55 años5,31. Otro factorimportanteeslaobesidad,queseharelacionadoenlamayoríadeestudiosconunincrementodeCEO,conunaoddsratioentre1,2-1,332.Otrosfactoresderiesgocomunicadoshansidounadietaricaengrasas33yelasbesto34.

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FACTORESPROTECTORES

Alcontrarioqueen losfactoresderiesgo,aquellassituacionescondisminuciónde laactividadováricaymayorexposiciónaprogestágenos,comolagestación16,26ylalactancia35,36,sehanrelacionadoconreduccióndelriesgodeCEO.

La tomadeanticonceptivosoralespresentaefectoprotector.Desdehacemásde30años numerosos estudios han demostrado una relación inversa entre la toma deanticonceptivosoralesylaincidenciadeCEO,conunareduccióndelriesgodehastaun29-40%en los 10 años posteriores a dejar de tomarlos22,37,38. Este efecto protector se relaciona contodos los subtipos histológicos menos el mucinoso16. Sin embargo, este beneficio en lareducción del CEO hay que sopesarlo con el pequeño aumento de riesgo que parecenpresentar de cáncer demama (RR1.24; 95% IC 1.15-1.33)39. Estudiosmás recientes, pareceque lasnuevasformulacionescondosisbajasdeestrógenospudieranoaumentareseriesgo(OR1.0;95%IC0.6-1.7)40.

Hayciertasmaniobrasquirúrgicasquesehandescritocomo factoresprotectores. Laligaduradetrompas22,41,histerectomía41,42y,sobretodo,lasalpingo-ooforectomíabilateral,sehan relacionado con menor incidencia de neoplasia ovárica. Esta última opción quirúrgicasupone una medida agresiva pero que en población con alto riesgo de CEO, como losportadoresdemutaciónBRCA,hasupuestounareduccióndel80%depadecerCEO.Unmeta-análisis muestra una hazard ratio (HR) de 0.21 (95% IC 0.12-0.39) en esta población43. Sinembargo, esta actitud hay que valorarlo individualmente con la paciente, puesto que unamenopausiaprecozconllevariesgosparalapacientecomosofocos,osteoporosis,dispareunia,enfermedadescardiovasculares,etc44.

Otrosfactoresprotectoresdescritoshansidounadietaconsuplementosdecalcio45ysoja46, y la exposición al sol45. También parece que el consumode vino tinto47y la tomadeaspirinayotrosantiinflamatoriosnoesteroideos tambiénpudieran reducirel riesgodeCEO,perolosestudiossoncontradictorios.

2.1.3. PATOGENIA Y CARCINOGÉNESIS

En el desarrollo embrionario, del mesodermo primitivo surge el epitelio celómicoembrionario,delquederivanelepiteliode superficieováricoyel tejidoMülleriano.Deesteúltimo sedesarrollarán las trompasdeFalopio,útero, cérvix yparte superiorde vagina48. El90% de las neoplasias ováricas surgirán de células derivadas del epitelio celómicoembrionario14.

Es importante tener en cuenta todos los procesos por los cuales los factoresetiológicos pudieran interferir en la célula para promover cambios que terminarán en latransformación maligna. Veremos primero aquellos procesos fisiológicos que se hanrelacionado con el favorecimiento de la acción de los agentes oncogénicos y, después, losprocesosdecarcinogénesisováricaquefinalizanenlaetapadecarcinoma.

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PROCESOSPATOGENICOS

Diversasobservacionesepidemiológicasypreclínicashanrelacionadociertosfactorescon un aumento o disminución del riesgo de transformación maligna ovárica, tal y comohemos expuesto en el apartado anterior 2.1.2. Pero el proceso por el cual estos factoresinteractúan con las células normales no está bien establecido, por lo que se han postuladovariashipótesisqueintentanexplicarlos49:

- Hipótesisdelaovulaciónincesante.Propuestaen1971porFathalla50,indicaelriesgode desarrollar mutaciones en relación a los microtraumatismos y posterioresmecanismos de reparación del epitelio ovárico debido a los ciclos ovulatorios. Estahipótesis justificaría el hecho de que mujeres con menos ovulaciones (múltiplesgestaciones,lactancia,anticonceptivosorales,menarquiatardíaymenopausiaprecoz,etc)tienenmenosriesgodeCEO,yaquellassituacionesconmásovulacionesaumentaelriesgo.

- Estimulación gonadotrófica51. La estimulación excesiva del epitelio ovárico por lasgonadotrofinas FSH/LHpromoveríael crecimientoy ladivisión celular, y facilitaría lasusceptibilidadamutaciones.SerelacionaconelaumentoderiesgodeCEOencasosde infertilidad y tras la menopausia48. También se ha visto que la FSH in vitropromuevediversosoncogenesypromotoresdelcrecimiento.

- Hipótesis de estimulación hormonal. Explicaría el hecho de que situaciones conaumentodeandrógenoscirculantes(síndromeovariopoliquístico,acné,hirsutismo)serelacionanconaumentodelriesgodeCEO.Secreequeunaexposiciónprolongadaaaltasconcentracionesdeandrógenosenelmicroambiente,promoveríanmecanismosoncogénicos.Otroscambioshormonalestambiéntendríanunpapelpatogénico,comolareducciónderiesgodeCEOanteunaumentodeprogestágenos.

- Papeletiológicodelosprocesosdeinflamación52.Eldañoenelepiteliodesuperficieovárico con cada ovulación produciría inflamación y cambios en el potencial redox,que conllevaría a mecanismos de reparación y mayor susceptibilidad amutaciones.Justificaría el hecho de que la toma crónica de antiinflamatorios se relacione conmenor riesgo de CEO y, por otro lado, inductores de inflamación, como el talco yasbesto,serelacionenconmayorriesgodeCEO.

- Factores genéticos. Hay un número creciente de factores genéticos con un papelpatogénico en el CEO. Losmás relevantes son lasmutaciones de BRCA 1/2 y de losgenesdereparacióndelADN53.

- Otras hipótesis han propuesto otros procesos patogénicos, con mayor o menorevidencia, tales como la teoría de la contaminación pélvica y mecanismosinmunológicos relacionados con la ovulación53. Nuevas evidencias abogan sobre unpapelcadavezmásimportantedelmicroambientetumoral54.

Aunque cadamecanismo tengaun ciertopapelpatogénicoenel desarrollodelCEO,probablementesealaasociacióndemúltiplesprocesoslaqueconllevefinalmentealprocesodetransformaciónmaligna49.

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CARCINOGENESISOVARICA

Lavisiónclásicadelacarcinogénesisováricaeracomounprocesoqueseoriginabaenel epitelio de la superficie ovárica (mesotelio peritoneal) que se invaginaba y formabainclusionesquísticas,despuéspresentabacambiosmetaplásicosy finalmente transformaciónmaligna,ydesdeallíseextendíaalrestodelacavidadabdominal,estandorepresentadocomocasi única enfermedadel serosode alto grado55. Sin embargo, posteriormente se vioque lapatogénesis del CEOeramás compleja y heterogénea de lo que se pensaba, con diferentessubtipostumoralesconcaracterísticaspropias.

Kurman y Shih56proponen en 2004 un modelo dualista de desarrollo basado en elanálisis morfológico y molecular. Según ellos habrían 2 vías de carcinogénesis diferentes,llamadas tipo I y tipo II, que conducirían al desarrollo de diferentes CEO (figura 2.6). LostumoresdetipoIcorresponderíanatumoresdebajogrado,endondese incluiríanelserosodebajogradoytambiénelendometrioide,mucinoso,tumortransicionaldeBrennermalignoyeldecélulasclaras.Songenéticamentemásestablesqueel tipo IIy seasociaríanacambiosmolecularesquesonrarosenlostipoII,comomutacionesBRAF,KRAS,PTEN,PIK3CAyotros.Laoncogénesissemejalasecuenciaadenoma-carcinomadelcáncercolorrectal,endondehayuna lesión precursora reconocida (cistoadenoma, tumor borderline) que presentarátransformaciónmaligna.

FIGURA2.6.ModelodualistainicialdeShihyKurman.

MPSC:carcinomaserosobajogrado(micropapilares).De:ShihandKurman.AmJPathol2004;164:1511–8

Lostumorestipo IIcorresponderíanatumoresdealtogrado,comoelserosodealtogrado,elcarcinosarcomayelcarcinoma indiferenciado.Suelenpresentarmutacióndep53yraramente presentan mutaciones de BRAF o KRAS. Tienen también un alto nivel deinestabilidadcromosómica,inclusodesdeetapastempranasdeldesarrollo.

Estenuevomodeloconllevaimplicacionesclínicasimportantes,puesnosenfrentamosadosprocesoscondiferentehistorianatural,conrepercusióndiagnósticayterapéutica.

Noobstante,algunosautoreshandudadodelarelevanciapronósticadeestemodelodualista,proponiendounanuevaclasificaciónen5grupostumoralesconmarcadasdiferenciasensuscaracterísticaspatogénicas,moleculares,morfológicasyclínicas57,58(tabla2.4).

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TABLA2.4.Clasificacióndeloscarcinomasováricosen5gruposdiferentesdePrat.TIPO Serosoalto

gradoSerosobajogrado

Mucinoso Endometrioide Célulasclaras

Frecuencia(%) 70 <5 3 10 5-10FactordeRiesgo BRCA1-2 ¿? ¿? SíndromeLynch SíndromeLynchPrecursor Carcinoma

serosointraepitelialtubárico

Serosoborderline

Mucinosoborderline

Endometriosis Endometriosis

Anormalidadmolecular

p5396%BRCA22%

BRAF5-38%KRAS19%

KRAS86%HER218%

Beta-catenina48%PTEN20%ARID1A33%MSI19%

HNF1b95%ARID1A46%PIK3CA33%MET24%

Extensión Rápidatranscelómica

Transcelómica Confinado enovario

Confinado enovario

Confinado enovario

Quimiosensibilidad Alta Intermedia Baja Alta BajaPronóstico Desfavorable Intermedio Favorable Favorable IntermedioAdaptadode:PratJ,VirchowsArch2012yDevouassouxetal,BullCancer2016

Sin embargo, en el año 2016 el grupo de Kurman y Shih publican una revisión yactualizacióndesumodelodual,manteniendosubasemorfológicapero integrandotambiénlosavancesmoleculares(figura2.7)59.AdaptanelTipoIa3subgrupos:tumoresrelacionadosconendometriosis,comoelendometrioide,célulasclarasycarcinomaseromucinoso,tambiénllamadotumorMüllerianomixto;tumoresserososdebajogrado;ysubtipomucinosoytumormalignodeBrenner.Seoriginaríadeestructurasbenignasextraováricasque implantanenelovarioypuedesufrirtransformaciónmaligna.EltipoIIsiguecompuestoporelsubtiposerosoaltogrado,queahorasesubdivideporsubtiposmolecularesymorfológicos,elcarcinosarcomay el indiferenciado. Su origen sería el carcinoma intraepitelial seroso tubárico y sudiseminaciónseríaaovarioyrestodeestructurasperitoneales.

FIGURA2.7.ModelodualistadeKurmanyShihexpandido.

EltumorseromucinosocorresponderíaaltumorMüllerianomixto.SET:transiciónpseudoendometrioidesólidaDe:KurmanandShih.AmJPathol2016;186(4):733-747

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Cadagrupotieneunascaracterísticasclínicaspropias(tabla2.5).EltipoIsontumoresde bajo grado (excepto el subtipo células claras que se considera de alto grado), de cursoindolente, habitualmente unilaterales con gran masa quística. En la presentación precoz elpronósticoesexcelente,peroenfaseavanzadaelpronósticoespobreporsuescasarespuestaa quimioterapia. Los tumores de Tipo II son de alto grado, crecimiento rápido y conmayorafectación del estado general. Se presentan habitualmente en estadio avanzado condiseminaciónperitoneal.Sonresponsablesdel90%delasmuertesporCEO59.

TABLA2.5.CaracterísticasclínicasymolecularesdelcarcinomadeovarioTipoIyTipoII

*Elcarcinomadecélulasclarasnotienegrado,seconsideradealtogradoAdaptadode:KurmanandShih.AmJPathol2016;186(4):733-747

Laprincipaldiferenciaanivelmolecularentreambosgruposes larelativaestabilidad

genéticadel tipo I comparadacon la inestabilidadcromosómicadel tipo II59. Lasmutacionesinactivadoras de p53 son características del tipo II pero raras en el tipo I. También suelenpresentar, al menos en un tercio de los pacientes, deficiencias en los mecanismos dereparacióndelADN.Sinembargo,eneltipoIsonfrecuentesotrasmutacionescomolasdelavíaERBB2/KRAS/BRAF/MEK,víaPI3K/AKT,inactivacióndePTEN,ARID1A,etc(figura2.8).FIGURA2.8.PatogénesisdelmodelodualdeKurmanyShih.

De:KurmanandShih.AmJPathol2016;186(4):733-747

Características TipoI TipoIIEstadiodepresentaciónhabitual Estadioprecoz EstadioavanzadoGradotumoral Bajogrado* SiemprealtogradoKi-67 Bajo,10-15% Alto,engeneral>50%Presentación Masaováricaquísticaunilateral,de

grantamañoMasaováricabilateral,menor tamañoquetipoI

Ascitis Raro ComúnRespuestaaquimioterapia Mala BuenaEvolución Lentaeindolente RápidayagresivaPrecursores Tumoresborderline La mayoría carcinoma seroso

intraepitelialtubáricoInestabilidadcromosómica Baja AltaMutacióntp53 Infrecuente MuyfrecuenteMecanismosreparaciónhomóloga Raramenteafectados FrecuentementeafectadosMutacionesaccionables Puedenestarpresentes RaroPronóstico Favorable Desfavorable

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2.1.4. ANATOMÍA PATOLÓGICA.

Lostumoresepitelialesováricossonlostumoresováricosmásfrecuentes,suponiendoun65-70%del total1. Se handivididopor su aspectomorfológico en6 subtiposhistológicos(tabla2.6)ycadaunopuedeserbenigno,borderlineodebajopotencialmaligno,ymaligno.

En el presente trabajo sólo nos referiremos a los tumores epiteliales malignos deovario, que suponen una enfermedad heterogénea y representan el 90% de los tumoresmalignosováricos60.Tambiéncomentaremosbrevementeel carcinomaperitonealprimarioyeltubáricoprimario,debidoaque,comoveremosdespués,conformanconelCEOunaúnicaentidad.

LaclasificacióndelostumoresginecológicosdelaOMSde2014introduceunanuevacategoríadeneoplasiasováricas,lostumoresseromucinososotumoresMüllerianosmixtos61.

TABLA2.6.TiposdetumoresepitelialesováricosSubtipoHistológico(demayoramenorfrecuencia)

Subtipos

Seroso(46%) Tumorserosobenigno(cistoadenofibroma)TumorserosoborderlineodebajopotencialmalignoCarcinomaseroso

CarcinomaserosodebajogradoCarcinomaserosodealtogrado

Mucinosos(36%)

TumormucinosobenignoTumormucinosoborderlineodebajopotencialmaligno

TipogastrointestinalTipoendocervical,seromucinosooMülleriano

CarcinomamucinosotipointestinalTumormucinosoconpseudomixomaperitoneal

Endometrioide(8%)

TumorendometrioidebenignoTumorendometrioideborderlineodebajopotencialmalignoCarcinomaendometrioide

CarcinomaendometrioidedebajogradoCarcinomaendometrioidedealtogrado

Célulasclaras(3%)

TumorcélulasclarasbenignoTumorcélulasclarasborderlineodebajopotencialmalignoCarcinomadecélulasclaras

Tumordecélulastransicionales(Brenner)(2%)

Tumordecélulastransicionalesbenigno(Brenner)TumordeBrennerborderlineodebajopotencialmalignoTumordeBrennermalignoCarcinomadecélulastransicionales

Indiferenciado(2%)Mixto(3%)

Adaptadode:KongCS,LongacreTAandHendricksonMR.Pathology.En:Berek&Hacker’s.GynecologicOncology.Sixthedition.Philadelphia:WoltersKluwer;2015

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CARCINOMASEROSODEALTOGRADO

Suponeel 35-40%de todas laneoplasiasováricas serosas, el 90%de los carcinomasserosos58, y el 75% de los carcinomas epiteliales ováricos1. Es el subtipo habitual en lospacientes con mutación BRCA58. La apariencia macroscópica es un tumor sólido o sólido-quístico. A nivelmicroscópico presenta estructuras papilares que pueden fundirse y formarláminasdecélulassólidasconespaciossimilaresaunahendidura.Hayungranpleomorfismonuclear, con numerosas figuras mitóticas y atipias1. Pueden presentar un patrón papilar,glandularycribiforme,avecesacompañadodenecrosis59.

Clínicamente se caracteriza por ocurrir en la 6ª-7ª década de la vida, con una edadmediade56años,tumoraciónbilateralenel60%deloscasos,presentaciónenfaseavanzada,altaquimiosensibilidadyfrecuenteadquisiciónderesistenciasencadarecurrencia9.

En el nuevo modelo dual de Kurman y Shih de 201659, se establecen dos subtiposhistológicos, el tipo usual y el tipo SET (transicional pseudoendometrioide sólido) y cuatrosubtipos moleculares. El subtipo SET se presenta en mujeres más jóvenes, se observa unmayoríndicemitóticoymayorinfiltracióndelinfocitoseneltumor,ytienemayorsensibilidadaquimioterapiayunmejorpronóstico59.

Alteracionesgenéticasasociadas

ElCEO serosodealto grado se caracterizaporunagran inestabilidadgenómica, conpérdidaygananciasdesegmentosdegenoma,confrecuentesamplificacionesydelecciones,yconmutacionesdep53enmásdel96%deloscasos.Presentadeficienciadelarecombinaciónhomólogaenlamitaddeloscasos,siendolomáshabitualmutacionesycambiosepigenéticosenBRCA1-2(33%decasos)59,62,63.ElsubtipoSETserelacionaconmásmutacionesBRCA-159.

Un estudio de expresión génica con microarrays sobre 285 CEO seroso yendometrioide,establece4subtiposmoleculares(inmunoreactivo,proliferativo,diferenciadoy mesenquimal), con expresión génica, comportamiento y pronóstico diferentes64 . Estossubtipos fueron confirmados por el proyecto ATLAS sobre 489 CEO seroso alto grado62.También presentan diferente nivel y patrón de infiltración tumoral inmune. Parece que elsubtipoinmunoreactivoeselmásfavorable,conmejorsupervivencia59.

El proyecto ATLAS muestra que la inestabilidad genómica del seroso alto gradoconllevaa laafectacióndemúltiplesvíasdeseñalizacióncelular,como lavíaRB1enel67%,PI3K/KRTASenel45%,NOTCHenel22%,BRCAenel33%(figura2.9)62.

FIGURA2.9.RutasmolecularesalteradasenelCEOSerosoaltogrado.

De:TheCancerGenomeAtlasResearchNetwork.Nature2011

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CARCINOMASEROSODEBAJOGRADO

Sonmuchomenosfrecuentesquelosdealtogrado(<10%deloscarcinomasserosos),se presenta a edad más joven y con una evolución más indolente9,60. A nivel microscópicomuestran papilas finas y ramificadas que invaden el estroma, pero con moderada atipia yescasa actividad mitótica1. Comparte muchas características con los tumores serososborderline,tantoanivelgenéticocomohistológicoyclínico,loquehallevadoalahipótesisdeque el seroso de bajo grado pudiera ser la progresión natural del tumor borderline58,60. Enocasionespuedendarsedeformasincrónicaambostipostumorales58.Traslacirugía,latasaderecurrencia es sólo del 10%, la mayoría de bajo grado, siendo raro la progresión a un altogrado59.Presentanescasarespuestaaquimioterapia9,58.

LasalteracionesgenéticasasociadassuelensermutacionesdeBRAFyKRAS,deformasimilaralosserososborderline59.

CARCINOMAMUCINOSO

ElCEOmucinosorepresentasóloel10%detodaslasneoplasiasováricasmucinosas,ehistológicamentesemejaelepiteliointestinal1.Suelepresentarselimitadoapelvis,unilateral,con tamaño del tumor grande, con unamedia de 18-20 cm60. Suele ser bien diferenciado yheterogéneo, con áreas de cistoadenoma y proliferación atípica y áreas de carcinoma59.Presentanunamucosecrecióndetipointestinal58.

Elsubtipomucinosoprimariopuedeserdifícildediferenciardeunametástasisdeuntumor mucinoso de origen intestinal, sobre todo apendicular60. Esta dificultad es mayorcuandosepresentaenestadioavanzadoy/obilateral1.Eltumormucinosoconpseudomixomaperitonealsueleserunprocesometastásicodeuntumormucinosoprimarioapendicular1.Esrarasocasionessuorigenprimarioeselovario.

LasalteracionesgenéticasmásfrecuentessonlasmutacionesactivadorasdeKRASenel65%deloscasos.EncontrasteconelrestodetumoresdetipoI,lamutacióndep53sedaenel57%,adiferenciatambiéndelostumoresborderlinemucinososquesolosepresentaenel11%65.

CARCINOMAENDOMETRIOIDE

Suelepresentarseaedadmásjovenqueelcarcinomaseroso,generalmenteenestadioprecozyconescasaascitis66.Anivelhistológicoessimilaralcarcinomaendometrial.Suelenserdebajogrado,aunqueavecespresentanunaltogradohistológico,conpatrónmássólido,ylos cambios metaplásicos son frecuentes, principalmente metaplasia escamosa. Puedenpresentar una gran variedad de patrones que a veces pueden dificultar el diagnósticodiferencial.Enun40%seasociaconendometriosisyenun20%delospacientespresentanuntumorsincrónicoprimarioendometrial1.

La alteración genéticamás frecuente es lamutación en ARID1A, sobre todo cuandoestáasociadoaendometriosis67.TambiénsehandescritootrasalteracionescomomutacionesdePTEN,PIK3AyKRASyBRAF59.

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CARCINOMADECELULASCLARAS

Lostumoresdecélulasclarasrepresentansóloel3%detodoslostumoresepitelialesováricos, pero la mayoría son malignos1. Suelen presentarse en la 5ª-7ª década de la vida(edad media 55 años), en estadio precoz y con una masa ovárica unilateral generalmentegrande68.Lamayoríademujeressuelensernulíparasyenlamitaddeloscasosseasociaconendometriosis. En los casos de endometriosis puede haber de forma sincrónica carcinomaendometrioideydecélulasclaras.Presentanescasarespuestaaquimioterapia9.Serelacionaconsíndromesparaneoplásicoscomohipercalcemiaoeventostromboembólicos9.

A nivelmicroscópico, se caracterizan por glándulas revestidas de células poligonalesconcitoplasmaclaroogranulareosinófiloynúcleosalargadoshipercromáticosypleomórficos.Loscarcinomadecélulasclarasnoestánclasificadosporgrados,siendotodosdealtogrado1.

A nivel genético son relativamente estables y no presentan mutación de p5358. Lamutación más frecuente es la de ARID1A, en el 46% de CEO de células claras, sobre todoasociadoaendometriosis67.LavíaPI3K/AKT/mTORtambiénsueleestaralterada58,69.

CARCINOMASEROMUCINOSO(CARCINOMAMÜLLERIANOMIXTO)

EltumorseromucinosohasidoañadidoenlaclasificacióndetumoresginecológicosdelaOMSde2014.Corresponderíaalpreviocarcinomaserosodetipoendocervical58.Puedeserdividido en cistoadenoma, tumor borderline y carcinoma. Se asocia frecuentemente aendometriosis. Está compuesto por una mezcla de células epiteliales, incluyendo epitelioserosoymucinosodetipoendocervical,epitelioendometrioideyescamoso55.Presentanenelestudio inmunohistoquímico un fenotipo “Mülleriano”, con expresión alta de receptoresestrogénicosyprogesterona,escasodeWT1yausenciadeCK20yCDX255.

Por estas características clínicas, morfológicas, inmunohistoquímicas, junto con lapérdidadeexpresióndeARID1Aenunterciode loscasos,el tumorseromucinososeparecemásauntumorendometrioideocélulasclarasqueauntumormucinosooseroso.Porello,algunosautorescreenqueseríamáscorrectollamarlotumorMüllerianomixto55.

TUMOR DE CELULAS TRANSICIONALES (BRENNER) MALIGNO Y CARCINOMA DE CELULASTRANSICIONALES

Sontumorespocofrecuentesdepequeñotamaño,conmasassólidasconmetaplasiadelepiteliosuperficialdelovario.Lamayoríasonbenignos(95%),raroborderline(4%)ymuyraroelcarcinoma(<1%)1,58.Suelenpresentarseenestadioprecozypresentangransensibilidada quimioterapia basada en platinos, con un excelente pronóstico58. A nivel molecularpresentaninmunohistoquímicaconp16enel92%deloscasos59.Notienenmutacióndep5358.

CARCINOMAINDIFERENCIADO

Sontumorespocofrecuentesquecarecendecaracterísticashistológicasidentificablesconuntipoespecíficodecélula.Siempresondealtogrado1.

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CARCINOMAMIXTO

Se diagnostica de carcinomamixto cuando hay presentes 2 omás tipos histológicosdiferentes, y cada uno ocupa al menos un 10% del tumor1,60. Inicialmente se creía querepresentaban al menos un 3% de los tumores epiteliales, pero estudios recientesmorfológicosymoleculareshanreducidoestaincidenciaamenorde1%70.

CARCINOMAPERITONEALPRIMARIO

Tambiénllamadocarcinomaseroso-papilardeperitoneo,esmorfológicamentesimilaral carcinoma seroso de alto grado de ovario. Los criterios establecidos por el GynecologicOncology Group americano para definirlo son: 1) tamaño normal del ovario; 2) afectaciónextraovárica mayor que la afectación ovárica; 3) histología serosa predominante y 4)afectacióndelasuperficieováricamenorde5mmenprofundidadyanchura60.

ParecenderivarderesiduosMüllerianosodelasfimbriasdelastrompasdeFalopio14.ElcomportamientoymanejoterapéuticoessimilaralCEO60.Noobstante,comparadoconelCEOseroso,elcarcinomaperitonealprimarioparecetenerpeorpronóstico,connecesidaddemayorquimioterapia,menorestasasdereseccióncompletaymenorsupervivenciaglobal71.

CARCINOMATUBARICOPRIMARIO

Tumor muy poco frecuente, con una tasa de 0.41/100.00072, su diagnóstico estábasadoenlaausenciadeenfermedadováricaoendometrialprimaria.Deformaarbitrariasehaestablecidoquedebehabermenosde5mmdeafectacióndelparénquimaováricoy,enelcaso de estadio precoz, por la ausencia de afectación ovárica. El tipo más frecuente es elseroso,pero tambiénpuedehaberendometrioide. Sinembargo, está actualmenteaceptadoque el epitelio tubárico es el origen del carcinoma seroso de ovario1, por lo cualprobablementelaincidenciaseamayordeloconsideradohastaahora.

TUMORESBORDERLINEODEPROLIFERACIONATIPICA

Suponenungrupoheterogéneodetumoresquesebasanenunaproliferaciónepitelialatípica sin invasión estromal60. Representan un 10% de tumores epiteliales de ovario. Lamayoríasonserosos, lospacientessuelensermás jóvenesqueenelcasode loscarcinomas,generalmente premenopáusicas, y la mayoría se presentan como estadio localizado14,60.Tienenunpronósticoexcelente,consupervivenciaalos5añosmayordel85%5.Enocasionespueden presentar implantes peritoneales, que a veces podrán ser invasivos14. En esta tesisdoctoralnoabordaremosestegrupodetumores.

2.1.5. HISTORIA NATURAL DEL CANCER EPITELIAL DE OVARIO

Los tumores de la trompa de Falopio y el carcinoma peritoneal primario presentancaracterísticashistológicasyclínicassimilaresalCEO,puestodosderivandelatransformaciónmaligna del mismo precursor de origen, el epitelio celómico embrionario, formando un

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continuo en la superficie ovárica, trompas y la superficie peritoneal. Por ello, estas tresentidades se suelen englobar conjuntamente como una misma enfermedad, con manejoclínico,estadificaciónytratamientosimilares14.

EnelpresentetrabajonosreferiremosalCEO,incluyendoenelmismoacarcinomadelatrompadeFalopioyalcarcinomaperitonealprimario.

PRESENTACIONCLINICA

La presentación clínica suele ser unamujer posmenopáusica, de 55 a 65 años, conmolestiasabdominalesinespecíficasdesde3-4meses,sobretododistensiónabdominalydolorpélvico9,14,73. La mayor parte de los síntomas se deben a la extensión extrapélvica de laenfermedad, de ahí que en estadio inicial la paciente suele estar asintomática, exceptoquepresente alguna complicación como torsión ovárica48, 74 . Sólo un 15% de los casos sediagnosticaenfaseprecoz,habiéndosellamadoalCEOcomoel“asesinosilencioso”60.Másdel90% refiere almenos un síntoma y esto fue elmotivo de consulta en lamayoría de veces,conduciendoaldiagnósticodelCEOenel74%,mientrasqueeldiagnósticocasualatravésdeunaexploraciónfísicarutinariasoloesel12%75.

En la exploración podrán presentar distensión abdominal, ascitis, derrame pleural ymasapalpablepélvicaoabdomino-pélvica14,48.

Se han intentado usar tablas basadas en la clínica para identificarmujeres con altoriesgodepadecerCEO.Goffetal76realizanunestudiodecasos-controlessobreuntotal637personasentrepacientesycontroles,desarrollandouníndiceconsolosíntomasquepresentauna sensibilidad de 57% en enfermedad precoz y 80% en enfermedad avanzada, conespecificidad mayor del 86%. Este índice considera los síntomas dolor pélvico/abdominal,distensiónoaumentodeltamañoabdominal,anorexiaysaciedadprecoz,cuandoocurrenmásde12vecesalmesyhanaparecidoenelúltimoaño.

Loseventosparaneoplásicossonpocofrecuentes,habiéndosedescritohipercalcemia(asociada al subtipo células claras), degeneración cerebelosa, queratosis seborreica ytrombosisarterialesyvenosas73.

PATRONDEDISEMINACION

El CEO suele propagarsepor el compartimentoperitoneal, por vía linfática y por víahematógena14.

VíaPeritoneal

Lavíaperitonealotranscelómicaes la formamáshabitualyprecozdediseminación.Ocurre por la exfoliación de células desde la superficie del tumor primario al resto de lacavidad,concirculacióndeestascélulasporelabdomenypelvis,yfinalmenteimplantaciónenalgúnlugardelasuperficieperitoneal14,60.Lascélulastumoralesexfoliadassedistribuiránportodoelcompartimentoabdominalsiguiendoelsentidocirculatoriodellíquidoperitoneal,porlosespaciosparacólicosyelmesenteriointestinal,subiendohastalascúpulasdiafragmáticas,sobre todo laderecha.Porello,es fundamentalen lacirugíadelCEOrealizarunacuidadosa

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exploracióndetodalacavidadabdominal,incluyendolascúpulasdiafragmáticas,sobretodolacápsulahepática14.

VíaLinfática

Ladiseminaciónagangliospélvicosypara-aórticosesfrecuente,sobretodoenestadioavanzado14. En una serie retrospectiva sobre 276 pacientes, la frecuencia de afectaciónlinfáticafuedel44%,estandoafectoslosgangliospélvicosenel30%ylospara-aórticosenel40%77.EnelestadioIestabanafectadosenun20%,40%enestadioIIy55%enestadioIIIyIV.En IA13%, IB 33%y IC 38%,peroen IAG1ningunoafecto.Ningúnmucinosoestadio I teniaafectación linfática. Ladiseminación linfática a gangliosextra-abdominaleses rara, siendo lomásfrecuenteanivelinguinalysupraclavicular,yconelsubtipoCEOserosodealtogrado78.

VíaHematógena

Ladiseminaciónvíahematógenahasidoduranteañospocoimportante,teniendomásprotagonismo la víaperitoneal.Noobstante,en losúltimosañosestán surgiendodatosqueindicanquequizástengamayorrelevanciadeloquesepensaba.Algunosautoresaboganporunimportantepapeldelavíahematógenaenlasmetástasisperitoneales,conpredilecciónenelomento54(figura2.10).

FIGURA2.10.Mecanismosdemetástasisencáncerdeovarioylasproteínasimplicadas.

De:Yeungetal.AmJPhysiolCellPhysiol2015.

Al diagnóstico la afectación visceral es poco frecuente (2-3% de las pacientes)14. Sinembargo, en la evolución tumoral esta diseminación aumentará con metástasis sistémicashastaenel38%delaspacientes,siendolomáshabituallaafectaciónpleuralenun25%delospacientes,seguidadelahepáticaenun9.4%79.Sedioconmayorfrecuenciaenloscasosconenfermedadperitonealextensayafectacióndegangliosretroperitoneales79.Unestudiosuizosobre197autopsiasdepacientesfallecidosporcáncerdeovario,muestraquelasmetástasissistémicas pudieran ser inclusomás frecuentes. Los autores encontraron en el 66.% de loscasosrealizados,siendoelhígadoyespaciopleuropulmonarlomásfrecuente80.

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2.1.6. DIAGNOSTICO

Unaspecto quehay que tener presente es que el diagnóstico de certeza de CEO serealizaatravésdelexamenhistológicodelovarioresecado14.Enlaprácticaclínica,tendremosen cuenta el diagnóstico de CEO ante una mujer de 55-65 años con distensión abdominalprogresiva en los últimos meses, con o sin otros síntomas abdominales generalmenteinespecíficos.Alaexploraciónpodrápresentardistensiónabdominalymasapélvica.

SitraslaclínicaylaexploracióntenemossospechadeCEO,solicitaremosunaseriedeexploracionesquenosorienteneldiagnósticoantesdeplantearunaactitudquirúrgica.

ANALITICA

Dentro de los parámetros analíticos, hay dosmarcadores tumorales con uso clínico.PorunaparteelCa-125,queeselmásutilizado,esunaglicoproteínadealtopesomolecularqueseencuentraelevadoenel80%delospacientesconCEOavanzado,enel50%enestadioprecozyenel1-2%delapoblaciónnormal60.Entumoresserosossueleserpresentarvaloresaltos, mientras que en mucinosos suelen estar bajos. En presencia de carcinomatosis, unarelacióndeCa125/CEA>25essugestivadecáncerdeorigenovárico81.Noobstante,elCa-125noesespecíficodeCEO,ypuedeestarelevadoenotrosprocesosconafectaciónperitoneal,tales comoendometriosis,enfermedadpélvica inflamatoria, yenotrosprocesosneoplásicoscomocáncerdepáncreasyendometrial60.

El otro biomarcador es la glicoproteína epididimal humana HE4, que ha sidoincorporadarecientemente48.ElHE4noseexpresaentejidonormaldelovarioysuelevaciónsugieremalignidad.

Conelobjetivodemejorarlaprecisióndeldiagnósticodiferencialdeunamasaanexial,sehanplanteadopanelescondiferentescombinacionesdebiomarcadores.UnodeelloseselalgoritmoROMA,quesebasaenelvalordeCa-125,HE4yelestadomenstrual.Sesitúacomouna importante herramienta diagnóstica que posee mayor sensibilidad y especificidad quecada uno de losmarcadores usados por separado. Da un valor que representa el riesgo demalignidad de una masa ovárica, alcanzando un área bajo al curva (AUC) de 0.90982. Unrecientemeta-análisisvalidadefinitivamentesuusoenlaprácticaclínica,conunAUCde0.921(95%IC0.855-0960)83.EstáaprobadoporlaFDAyenEuropaparasuusoenlaprácticaclínica.

ECOGRAFIAVAGINAL

Laecografíavaginaleslatécnicadeimageninicialenelestudiodemasasanexiales84.ElabordajevaginalesmássensiblequeelTCparalavaloracióndemasaspélvicas48,ytambiénpresenta mejor resolución que la ecografía trans-abdominal14. La presencia de una masacompleja mayor de 8-10 cm con componente sólido y quístico, con septos densos eirregulares,ysombrasecográficas,esaltamentesugestivodemalignidad14,48.

Con la intención de aportar herramientas para diferenciar una masa anexial entrebenigna ymaligna, se han hecho varios índices de riesgo85,86,87. La base de todos ellos es lacreación de un modelo con variables clínicas y ecográficas que mejoren la sensibilidad yespecificidad.Sealcanzanáreasbajolacurca(AUC)dehasta0.9585.

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No obstante, hay que tener en cuenta que la mayoría de masas anexiales sonbenignas.Sóloel30%delasneoplasiasováricasenmujerespost-menopausiasseránmalignasyenpremenopáusicasel7%14.

TOMOGRAFIACOMPUTERIZADA(TC)yRadiografía/TCdetórax

Un TC abdomino-pélvico y una prueba de imagen torácica (radiografía o TC) suelenhacerseen laprimera líneadel estudiode laextensiónextrapélvicayextra-abdominalde laenfermedad9,14.Esunapruebafundamentalparavalorarelretroperitoneoyenlaevaluaciónde la resecabilidad quirúrgica84,88. La sensibilidad para detectar carcinomatosis peritoneal sesitúaentornoal60-76%,sinembargo,lasensibilidadparanódulosmenoresde1cmesmuybaja,subiendoconformeaumentaeltamañodelosnódulos89.

RMNPELVICA

Supapelestásiendocadavezmás importanteen lavaloracióndeunamasapélvica,conaplicacióndenuevassecuenciasfuncionalescomodifusióneimágenesdinámicas,conun94%desensibilidady97%deespecificidadparadetectarCEO90.LadifusiónaportaunamejorcaracterizacióndeltumoryladiseminaciónperitonealqueelTCyelPET/TC91.

PET/TCyPET/RM

La técnica de PET/TC combina imagen metabólica con su correspondiente imagenanatómica, con lo que podría mejorar la valoración de masas pélvicas92. Una captaciónaumentada delmarcador 18-fluor-desoxi-glucosa en unamasa anexial esmuy específico demalignidad en una mujer postmenopáusica48. En comparación con TC y ecografía trans-abdominal, parecemejorar tanto la valoración de lasmasas pélvicas, como la detección deenfermedad a distancia, sobre todo adenopatías, y detección de recurrencias 93 , 94 . Noobstante,supapelnohasidoaúnbienestablecido,puesparecequepudierapresentarmenossensibilidaden lavaloraciónde laenfermedadperitoneal respectoalTC95.Hayquetenerencuenta la posibilidad de falsos negativos en lesiones quísticas y de falsos positivos en lacaptacióndeF-FDGenlesionesinflamatoriasyciertaslesionesbenignas92.

Nuevas técnicas como el PET/RM mezclan la imagen metabólica a la imagen de laRMN, con una mejor caracterización de las partes blandas, pudiendo ayudar a mejorar lavaloracióndelesionespélvicas,yaportarunposiblepapelpredictivoypronóstico96.

En investigaciónestáelposibleusode imágenesmolecularesusandomarcadoresdep53,KRAS,BRAF,etcpara la valoracióndeenfermedady suactividadbiológica, así como lamonitorizacióndelarespuestaaquimioterapia.

OTRASPRUEBAS

Sedeberíanplantearotraspruebasdiagnósticas,talescomoendoscopias,mamografía,etc,paradescartarotroorigendeltumordeformaindividualizadaenfuncióndelaclínicadelapaciente14. No se aconseja la punción externa del componente quístico, por el riesgo dediseminacióntumoralperitonealqueconlleva48.

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2.1.7. ESTADIFICACION

LaestadificacióndelCEO,enausenciadeenfermedadmetastásicaextra-abdominal,esquirúrgica. La Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO) y el ComitéEstadounidense Conjunto sobre el Cáncer han establecido unos estadios relacionados y queagrupa tanto al CEO, como al carcinoma de la trompa de Falopio y al carcinoma peritonealprimario(verANEXOI)97.

Lafrecuenciadepresentaciónsegúnestadiosseexponeenlatabla2.75.

Tabla2.7.Frecuenciadepresentaciónysupervivenciaa5añosenfuncióndelestadiotumoral.Estadio Frecuencia(%) Supervivenciaglobala5años(%)

IA 13,1 89,6

IB 1,4 86,1

IC 13,7 83,4

IIA 1,5 70,7

IIB 1,9 65,5

IIC 5,0 71,4

IIIA 2,6 46,7

IIIB 5,6 41,5

IIIC 42,1 32,5

IV 13,0 18,6

2.1.7. FACTORES PRONOSTICOS

Unfactorpronósticoesaquelaspectoocaracterísticaqueprediceelcomportamientode una enfermedad. El conjunto de factores pronósticos de una determinado pacientecondicionará la evolución de su cáncer, presentando una mayor o menor supervivencia.Influyendeformadiferentesilaenfermedadsepresentaenunestadioprecozoenunestadioavanzado(tabla2.8).ElestadioprecozescuandoelCEOseconfinaalosórganosdelaparatoginecológicoenlapelvis,correspondiendoalestadioI-IIA.Enlaenfermedadavanzadahabríaextensiónalacavidadperitonealoafectaciónextra-peritoneal(estadiosIIB-IV)98.

Detodoslosfactorespronósticos,elprincipalfactorquedeterminalasupervivenciadelas pacientes con cáncer de ovario es el estadio quirúrgico al diagnóstico. La supervivenciaglobala5años(SG5a)varíadesdeun80-90%enestadioI,hastaun65-70enestadioII,30-45%enestadioIIIyun20%enestadioIV(tabla2.7yfigura2.11)5.

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TABLA2.8.FactorespronósticosdelCEOESTADIOPRECOZ ESTADIOAVANZADO

Gradohistológico Estadio

Estadio Enfermedadresidualtrascirugía

Tipohistológico:COCC,indiferenciado,epitelialmixto

Gradohistológico

Roturacápsula Tipohistológico:COMU,COCC,indiferenciado

Edad Edad

Citologíaperitonealpositiva ECOG

Ca125 CA125

Númerodecromosomas Ascitis>500ml(intraoperatoria)

PCI(IndicedeCarcinomatosisPeritoneal)

FIGURA2.11.Supervivenciaenfuncióndelestadio.

De:Heintzetal.CarcinomaoftheOvary.FIGO26thAnnualReportEditorialOffice,EIOMilan.2006

FACTORESPRONOSTICOSENESTADIOPRECOZ(I-IIA)

Gradohistológico

Elfactorpronósticomásimportanteloconstituyeelgradohistológico(G).EnelanálisisdefactorespronósticosdeVergoteetal99sobre1545pacientesconestadioI,laSG5aparaelgrado1(G1)fuesuperioral90%,81%paramoderadamentediferenciadoy60%paraaquellaspacientes con tumoresgrado3. LaHRentreG1yG2 fuede3.13 (95%IC1.68-5.85), y laHRentreG2yG3fuede8.89(95%IC4.96-15.9).EnelregistroFIGO5sobre1837pacientes,tantoelG2comoelG3supusieronunaHR1.9deformasignificativarespectoalG1.

Estadio

Presentandiferente pronóstico el estadio IA frente al IB, IC y IIA, con SG5adel 90%paraelestadioIA,del86%paraIB,83%paraICydel71%paraIIA5,99,100.

S176 APM HEINTZ, F ODICINO et al

Stage Patients(n)

Mean age(yr)

Overall survival (%) at

1 year 2 years 3 years 4 years 5 years

Hazards ratio a

(95% CI)

Ia 632 53.5 98.4 96.2 93.5 91.1 89.6 Reference

Ib 69 54.1 100 93.9 93.9 88.6 86.1 0.8 (0.4−1.6)

Ic 663 52.8 96.3 91.4 87.9 85.6 83.4 1.1 (0.8−1.4)

IIa 72 56.1 93.0 87.2 79.7 78.1 70.7 1.8 (1.1−3.0)

IIb 93 57.4 93.4 84.5 76.6 71.9 65.5 2.1 (1.4−3.1)

IIc 241 56.3 93.6 85.6 82.3 75.8 71.4 1.8 (1.4−2.5)

IIIa 128 57.1 88.1 72.6 63.1 52.8 46.7 4.0 (2.9−5.4)

IIIb 271 58.2 85.7 70.6 56.8 47.7 41.5 4.4 (3.4−5.7)

IIIc 2030 59.7 84.8 64.5 50.3 39.3 32.5 5.8 (4.7−7.0)

IV 626 60.4 72.4 48.4 35.2 24.8 18.6 8.9 (7.2−11.0)

aHazards ratio and 95% Confidence Intervals obtained from a Cox model adjusted for age and country

Fig. 9. Carcinoma of the ovary: patients treated in 1999–2001. Survival by FIGO stage, obviously malignant, n= 4825.

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Subtipohistológico

Parecenpresentarpeorpronósticoelindiferenciado,célulasclarasyepitelialmixto5,98.

Roturadelacápsulaenestadioprecoz

La rotura de la cápsula, tanto si estaba presente antes de la cirugía comode formaiatrogénicaenelactoquirúrgico,sehavistoqueimplicaunapeorsupervivencia,conHR2.65(95%IC1.53-4.56)yHR1.64(95%IC1.07-2.51)respectivamente99,100.

Edad

EneltrabajodeVergoteetal99,lospacientesconmásde50añosteníanunaumentoderiesgodeHR1.02(95%IC1.00-1.03).

Ca125

El valor prequirúrgico de Ca-125 se ha relacionado en algunas series con lasupervivencia.Una serie retrospectivaaustraliana sobre518pacientes conestadio I,mostródiferenciasenSG5acuandoelvalordeCa-125eramayoromejora30UI/mL,pasandode82%a95%(p=0.028)101.Nageleetaltambiéncomunicasobre201pacientesconestadioIqueCa-125fueelmásimportantefactorpronósticodesupervivenciaenelanálisismultivariado,conunHR6.37(95%IC2.39-16.97)102.

Otros

NoestáclaroelpapelpronósticoenestadioIdelapresenciadeascitis,eltamañodeltumor o el crecimiento extracapsular99. No obstante, se han descrito mayores recaídasperitoneales en los pacientes con citología peritoneal positiva, con influencia en lasupervivencia100yaquellosquepresentananeuploidía103.

FACTORESPRONOSTICOSENESTADIOAVANZADO(IIB-IV)

En losestadiosavanzados,elestadiotumoraly laenfermedadresidualtras lacirugíasonlosdosprincipalesfactorespronósticos.

Estadiotumoral

Laestadificacióntumoralmarcarálaevolucióndelapaciente.LaSG5apasadesdeun67%enelIIB,hastaun50%enIIIA,42%enIIIB,33%enIIICy18%enestadioIV5.

Enfermedadresidualtraslacirugía

La enfermedad residual tras el gesto quirúrgico determina también la evolución delpaciente.Cuandoelresiduoesmayorde2cmtendráunaSG5adel25%,quesubiráal33%siesmenorde2cmyal62%cuandonoquedaenfermedadmacroscópica5.

Enun análisis deduBois et al104de 3 estudios aleatorizados sobreun total de3126pacientes,observaronqueoptimizandolaresecciónanuloresiduotumoral,aúnseconseguían

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mejores resultados. Cuando la resección era completa (residuo tumoral de 0 mm) habíadiferenciaenlaSG5arespectoalresiduode1-10mmymayorde10mm(figura2.12).

FIGURA2.12.Supervivenciaglobalestratificadoenfuncióndelaenfermedadresidualtrascirugía.

De:duBoisetal.Cancer2009.Gradohistológico

Enelestadioavanzadohabríadosgrupospronósticosenrelaciónalgradohistológico,el formadopor el grado1 debiendiferenciado, conuna SG5ade 57%, y el otro grupoqueseríanelgrado2,3ydesconocido,quepresentanunaSG5adeun30%5,104.

Subtipohistológico

Presentan peor pronóstico el mucinoso, células claras y el indiferenciado, y mejorpronóstico el endometrioide 5, 105 , 106 , 107. En la serie de Mackay et al107 la mediana desupervivenciafuede51,41,21y15mesesparaelsubtipoendometrioide,seroso,mucinosoycélulasclaras,respectivamente.

Edad

Constituyeun importante factorpronóstico,pasandodeunaSG5adel60%entre los40-49años,ade44%entrelos60-69añosyde33%entrelos70-79años5.

Ca125

El valor pronóstico de la disminución del antígeno tumoral CA 125 durante laquimioterapia en estadios avanzados ha sido objeto de estudio de numerosos estudios,mostrándosecomounimportantefactorpronóstico108,109.

ECOG

ElECOG1-2presentaunHR1.12(95%IC1.01-1.24)respectoalECOG0104,106.

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Otros

Enel estudiodeduBois et al104 la presencia deuna ascitis intraoperatoriamayorde500mlsupusoenelanálisismultivarianteunaHRde1.36(95%IC1.22-1.51).

La extensión de la enfermedad, medida por el índice de carcinomatosis peritoneal(anexoV),tambiénseharelacionadoconelpronóstico.

2.1.9. MANEJO TERAPEUTICO

Anteunapacienteconsospechadecáncerdeovario,trascompletarelestudioclínicoy radiológico, el siguiente paso será presentar el caso clínico ante el comité de tumoresginecológicosy carcinomatosisdel centrohospitalarioquecorresponda.Estecomité seráunequipo multidisciplinario formado por todas aquellas especialidades involucradas en lapatología tumoral ginecológica. En el participarán especialistas de ginecología oncológica,cirugíaperitoneal,oncologíamédica,radiología,patología.

Trasvalorarelcasoclínico,seadoptaráunadecisióninterdisciplinariaparaabordarlapatologíadelapacientedeunaformaconsensuada.

En general, nos enfrentaremos a tres escenarios clínicos diferentes: cuando laenfermedad sepresente en estadioprecoz limitada a pelvis, cuando sepresente en estadioavanzadacondiseminaciónperitonealylassituacionesderecaídatumoral.

Estas situaciones las abordaremos de forma separada, para unamejor comprensióndelabordajeterapéutico.

2.1.9.1.PLANTEAMIENTOTERAPEUTICOENESTADIOPRECOZ(I-IIA)

Enaquellassituacionesendondesesospecheunaneoplasiaováricaenestadioprecoz,correspondiendoestoaaquella limitadaalaparatogenital(estadioI-IIA),elprimerpasoseráplantear una laparotomía para diagnóstico histológico, estadificación y resección tumoralóptima14,48,60,110,111. Hay que tener en cuenta que la estadificación del CEO se basa en loshallazgos quirúrgicos, siguiendo las guías de la International Federation of Gynecology andObstetrics (FIGO)97. El abordaje quirúrgico en estadios iniciales deberá plantearse según lasrecomendaciones del GCCG-EORTC, realizando resección tumoral óptima y estadificaciónquirúrgica completa (tabla 2.9) 112 . La laparoscopia está mostrando similares resultadosoncológicos y de seguridad que la laparotomía, por lo que podría ser un procedimientoalternativo113.

Una cirugía inicial sub-óptima puede conllevar a una infraestadificación hasta en un31%deloscasos,porserpacientesconaparenteenfermedadlimitadaapelvisperoquetienenenfermedadmetastásicaocultaenelabdomensuperioroganglios linfáticos.Esteaspectoesdesumaimportancia,puesimplicaríaconsecuenciasnegativasparalapacientedesdeelpuntodevistaterapéuticoypronóstico14,48,112.Elgradohistológicoserelacionacon lapresenciademetástasisocultas,puessedanenel16%delG1,34%deG2yenel46%deG314,112.

La realización de linfadenectomía sistemática es un tema discutido, pues aunquepuedehaberafectaciónhastaenel13%delospacientes,sobretodoentumoresG3114,aúnno

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sehademostradoquesupongabeneficioensupervivenciaparalapaciente115.Enlostumoresdebajogradoyenlostumoresmucinososlaafectaciónlinfáticasuelesermuyrara116,117.

TABLA2.9.Guíaquirúrgicaenestadiosiniciales.

– Histerectomía abdominal total con salpingo-ooforectomía bilateral. La salpingo-ooforectomíaunilateralestapermitidaenpacientesjóvenesconestadioIAquedeseenmantenersufertilidad.

– Lavadoperitonealparaestudiocitológico.– Inspeccióncuidadosaypalpacióndetodaslassuperficiesperitoneales.– Biopsiadecualquierlesiónsospechosademetástasistumoral.– Omentectomíainfracólica.– Biopsiaoreseccióndecualquieradherenciaadyacentealtumorprimario.– Biopsiaaciegas(>2)delperitoneovesicalyfondodesaco.– Biopsiasaciegas(>3)delosreplieguesparacólicosderechoeizquierdo.– Biopsiasaciegas(>2)oextensionesparacitologíadelhemidiafragmaderecho.– Biopsias a ciegas (>2) del peritoneo de la pared pélvica adyacente al tumor primario (fosa

ovárica).– Muestreoganglionaralolargodelasarteriasyvenasilíacasexternasycomunes.– Muestreoganglionaralolargodelaaortaydelavenacava,incluyendoelnivelentrelaarteria

mesentéricainferiorylavenarenalizquierda.De:SubcomitéquirúrgicodelGCCGEORTC(Youngetal,JAMA1983)

Enlostumoresmucinososserecomiendarealizarestudiodelaparatodigestivoyenlacirugíasedeberácompletarapendicectomía.Noprecisalinfadenectomía14,110,111,118.

VALORACIÓNDEADYUVANCIA

Traselestudiohistológicoyestadificaciónquirúrgica, sepodránestablecer todos losfactorespronósticosdelapaciente.Enestadioprecoz,latasaderecaídavaríaentreun10%yun40%,laSLEa5años55-89%ylaSG5ade70-90%,dependiendodelconjuntodefactoresderiesgoquepresente5.

Para buscar terapias que reduzcan ese riesgo, se pusieron en marcha una serie deensayosclínicosqueevaluarondiversostratamientoscomplementarios,talescomomelfalan,fósforo-32 intraperitoneal, radioterapia abdominal total, alquilantes y otros, pero fueronestudios pequeños y con resultados desiguales119 , 120 . El tratamiento que mostró mayorbeneficiofueeltratamientosistémicoconcisplatino121.

La demostración definitiva del beneficio de administrar tratamiento frente aobservación, llegó con dos grandes estudios europeos aleatorizados, el estudio ACTION y elICON-1122,123.Elanálisisconjuntodelosdatosdelascasi900pacientesincluidasenestosdosestudios(ACTIONeICON-1)demostróqueeltratamientoadyuvanteconunesquemabasadoenplatino(carboplatinoocisplatino)produceunbeneficiotantoenSLEcomoenSG124.LaSLEa5añosmejoróun11%,pasandode65%a76%,conunHR0.64(95%IC0.50-0.82;p=0.001).LaSG5amejoróun8%,pasandode74%a82%,conunaHR0.67(95%IC0.50-0.90;p=0.008)(figura2.13).Debidoa lamejor toleranciadel carboplatino frenteal cisplatino, se sugiereelprimero como el tratamiento de elección. Tras estos resultados, se establece que el

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tratamiento complementario basado enplatino aporta beneficio en el CEOprecoz98,103. EstebeneficioenSGseconfirmóenelmeta-análisisdeCochranne2012125yde2015126.

Unaspectodesumaimportanciaseráidentificarbienaaquellaspacientesconmayorriesgoderecaídaydemuertequesepuedanbeneficiardeltratamiento.Diversostrabajoshananalizadoestacuestión,siendo lomásaceptadoplantear tresgruposde riesgo:ungrupodebajoriesgoconexcelentepronósticoquenosebeneficiaríadeQTadyuvante(estadioIAG1);ungrupodemedioriesgoendondenohaydatosconcluyentes(estadioIBoICG1,IAG2);yungrupodealtoriesgoendondelaQTsípareceaportarbeneficioenSG(estadioIBoICG2-3,ycélulas claras)103,124,125,126,127. Las pacientesmal estadificadas también sebeneficiaríande laquimioterapia103, 125, 126. No obstante, dada la heterogeneidad de los estudios, los autoresexpresanqueestossubgruposhabíaqueanalizarlosconprecaución.

FIGURA2.13.SG5aenpacientesestadioprecoz.AnálisisconjuntoestudioACTIONeICON-1.

De:Trimbosetal.JNatlCancerInst2003;95(2):105-112

Otracuestióndiscutidaeselnúmerodeciclosqueseríaprecisoadministrar.ElensayoGOG-157128comparóen427pacientesestadioIadministrar3versus6ciclosdepaclitaxel175mg/m2ycarboplatino7.5AUC.Aunqueenlaramade6cicloshubounatendenciaamenoresrecaídas, esto no fue significativo (HR 0.76, 95% IC 0.51-1.13; p=0.18), y tampoco hubodiferenciasenel riesgodemuerte (HR1.02, 95% IC0.66-1.57). Los tumores serososdealtogradopresentaronmenosrecurrenciascuandoreciben6ciclosfrentea3ciclos(HR0.33,95%IC0.14-0.77;p=0.04)129.

Por lo tanto, como conclusión al tratamiento en estadios localizados, tenemos queplantearnosenestaspacientes la realizacióndeunacirugíaperitonealprimaria conexéresistumoralcompletayestadificaciónoperatoriacorrecta.Traselabordajequirúrgico,habráqueexaminar el conjunto de factores pronósticos para clasificarla en un grupo de riesgo y asíplantear la mejor terapia adyuvante y seguimiento posterior. Debido a que hay aspectoscontrovertidos,lasdiferentesguíasclínicas110,111,118varíanrespectoasusrecomendaciones.

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2.1.9.2.PLANTEAMIENTOTERAPÉUTICOENESTADIOAVANZADO

CuandoelCEOsepresentaenestadioavanzadosuponeunaenfermedadqueyasehadiseminadoporelperitoneoabdominal,presentandounamayorcargatumoralymayorriesgoderecaída.NosreferiremosalosestadiosIIB-IV.Suponenel75%deCEO60ypresentaránunasupervivencia libredeprogresión (SLP)de16mesesymedianade supervivencia (MS)de44meses130.LaSG5avaríadesde65%enestadioIIBa47%enelIIIA,41%enIIIB,32%enelIIICy18%enelIV5.

El planteamiento terapéutico se basará en una cirugía peritoneal de citorreducciónóptimayquimioterapiacomplementaria.

CIRUGIAPERITONEALPRIMARIAYDEINTERVALO

El consenso de 2004 de la GCIG-OCCC recomendaba un esfuerzo quirúrgico inicialmáximodecitorreducción,conelobjetivodenodejarenfermedadresidual98.Inicialmenteseconsiderabacirugíaóptimaaaquellaquedejabaunresiduomenorde1cm,peroenelúltimoconsenso internacional del Gynecologic Cancer InterGroup de 2010 se considera la cirugíaóptima cuandono queda enfermedad residualmacroscópica131, es decir, una citorreduccióncompleta“R0”,siendounodelosprincipalesfactorespronósticos48,60,84,130.LaMSpasaenelestadioIIICde34mesescuandoquedaalgúnresiduohasta81mesescuandonoquedarestotumoral104. Para ello, se precisan de equipos quirúrgicos especializados con una adecuadacurvadeaprendizaje132.

En aquellas situaciones en donde una cirugía primaria óptima no fuera factiblealcanzarla (vercriteriosdecirugíasubóptimamásabajo)oelpacientepresentaraaltoriesgodemorbimortalidadoperatoria,seaconsejaquimioterapianeoadyuvante(QTNA)ycirugíadeintervalo(CDI)enaquellospacientesquenoprogresentras3-4ciclosdeQTNA98,133.Enestoscasosseránecesariaunabiopsiapreviaparaeldiagnósticohistológico.

Cuatro ensayos aleatorizados han mostrado resultados similares entre cirugíaperitoneal primaria (CPP) y CDI, incluso con menor morbimortalidad y menor estanciahospitalariaconlaCDI134,135,136,137.EnellossecomparóeltratamientoconCPPseguidode6-8ciclosdeQTadyuvantebasadaenplatino,frenteaQTNAbasadaenplatinodurante3-4ciclosseguido de CDI y después QT adyuvante 3-4 ciclos con elmismo esquema. Los criterios deinclusión se basaron en la presencia de metástasis de al menos 2 cm fuera de la pelvis,afectación adenopática regional o estadio IV, y un ratio CA-125/CEA mayor de 25. LosresultadosenSLEySGfueronsimilaresenambosbrazos.Hubomenormorbimortalidadenelbrazo de QTNA y CDI. Se consiguiómayor cirugía con resultado óptimo en la CDI, llegandohastaun70-80%frenteal40%en laCPP.Enelmeta-análisisdeCochranede2016tampocoencuentradiferenciaentreambasalternativasenSLPniSGnicalidaddevida138.En lasguíasASCOde2016 se aconsejaofrecer enaquellaspacientes resecablesde formaóptimaybajoriesgooperatorio,laposibilidaddeelegirentreCPPoCDI133.

Noobstante,unestudiodesubgruposnoplanificadodelestudioEORTC-55971,indicaque pudiera haber mayor beneficio en SG en pacientes estadio IIIC con lesiones <45 mmcuando reciben CPP, y los pacientes con estadio IV y IIIC con lesiones mayores de 45 mm

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parece tener mejor supervivencia cuando se someten a CDI139. Pero estos datos son sóloexploratoriosysólorepresentanunahipótesisdetrabajo.

Analizando losdatosde losensayospublicadoshasta la fecha, revisionesCochraneymeta-análisis,Makar et140al sugiere dividir a los pacientes en 5 categorías en función de laextensión de la enfermedad, biología tumoral y situación clínica, para justificar una mejortomadedecisionesentreCPPyCDI.

En otro orden, en algunos centros se viene aplicando la técnica intraoperatoria deHIPEC (Hipertermia ). Esta técnica consiste en la aplicación de quimioterapia a temperatura41.5ºdurante60-90’directamenteenelcampooperatoriotrasrealizarunacirugíaperitonealóptima.Losestudiosobservacionalesmuestranquesetratadeunatécnicaseguraconescasamorbilidad, aunque dado que todavía no está avalada por estudios fases III, no se deberecomendarfueradeensayoclínico141.

En pacientes con estadio IV e inoperables, se debería plantear QT de enfermedadavanzada60.EncasosseleccionadosdemetástasisúnicasconopcionesdereseccióncompletaR0,sepodríaplanteartratamientoquirúrgicocomoenestadioIII142.

CRITERIOSDECIRUGIASUBOPTIMA

Nosedisponenhastalafechadeparámetrospreoperatoriospredictivosderesecciónóptima de suficiente fiabilidad. Hay varios criterios de irresecabilidad propuestos en base aparámetrosclínicos,valordeCa-125yloshallazgosradiológicosenTC:

- Anivelclínico,unaedadmayorde60añosyunavaloraciónderiesgoanestésico(ASA)3-4,serelacionaconcirugíasubóptima143.

- Envaloresserológicos,elvalordeplaquetassanguíneo144yunvalordeCa-125mayorde500U/mL145serelacionaconmayorriesgodecirugíasubóptima.

- RadiológicamenteenelTC,lapresenciadeadenopatíasretroperitonealesporencimade las arterias renales mayores de 1 cm, carcinomatosis difusa en mesenterio deintestino delgado, afectación de tronco de arteria mesentérica superior y áreaperiesplénica,serelacionanconbajaprobabilidadderesecciónóptima143.Lapresenciadeascitisimportantetambiénserelacionaconcirugíasubóptima144.

Algunosautoreshanplanteadounscorepredictivoqueserelacionaconlaposibilidadderesecciónóptima143,aunquetodavíanoestáimplantadoenlaprácticaclínica.

En algunos centrosusan laparoscopiapara valorar resecabilidad comopasoprevio aunacirugíaperitoneal,peronoestáaúnestandarizado133,146.Hayquetenerencuentaquesehandescritometástasisenelpuertodeentradahastaenel17%delospacientes,aunquenoparececomprometerelpronóstico147.

Lospacientesconmetástasispulmonaresyhepáticasmúltiples,masasvoluminosasenraízdemesenterioqueafectenalaarteriamesentéricasuperior,conglomeradosadenopáticosretroperitonealesvoluminososporencimade losvasos renales,granafectaciónde la serosaintestinalqueobligaraaextensaresecciónintestinal,nódulosdiafragmáticosvoluminososconpenetraciónentóraxylospacientesinoperablesporcomorbilidadosituaciónclínica,noseríancandidatosacirugía,indicandoiniciodeQTconesquemadeenfermedadavanzada84.

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QUIMIOTERAPIACOMPLEMENTARIA

Losestadiosavanzadospresentandeporsíunaltoriesgoderecaída(75-80%),porloque siempre estará indicado un tratamiento complementario. En el desarrollo de laquimioterapia dos hitos muy importantes han marcado el tratamiento. El primero fue laaparicióndeloscompuestosdeplatino,enlosaños70,yelsegundoeldescubrimientodelostaxanosenlosaños8014.Elesquemapaclitaxel/cisplatinodemostróquemejorabatantolaSLPcomo la SG frente al esquema de ciclofosfamida/cisplatino148. Después, en el año 2003, elesquemadeQTdepaclitaxel/carboplatinodemostrósuequivalenciaenresultadosalesquemadepaclitaxel/cisplatino,peroconmejortolerancia149.Actualmente,eltratamientoestándardeQT es la combinación de paclitaxel 175 mg/m2 y carboplatino 5-7.5 AUC cada 3 semanasdurante6ciclos98,ylavaloracióndeQTintraperitonealendeterminadoscasos60.

Posteriormente se han intentado modificaciones del esquema para mejorar losresultados, ya fuera cambiando el acompañante al platino o asociando un tercer fármacocomoenelestudioICON-5130,peroningunaestrategiahaconseguidomejorarlacombinacióndepaclitaxelycarboplatinoenprimeralínea.

Otravíahasidoelusodedosisdensasdepaclitaxel.ElestudiojaponésJGOC-3016150demostró beneficio tanto en SLP como en SG en población japonesa del esquema decarboplatinotrisemanalypaclitaxelsemanalfrentealesquemaclásicotrisemanal.Porello,sepusieronenmarchadiferentes estudios enpoblacióneuropeapara intentar reproducir esosresultados,comoelestudioMITO-7151yelGOG-262152.Lamentablemente, losresultadoshansido similares entre los dos brazos de tratamiento, por lo que en población europea eltratamiento con dosis densas de paclitaxel y carboplatino sólo debe plantearse dentro delmarcodeunensayoclínico.Quizáslascaracterísticasgenéticasdelapoblaciónasiáticapuedajustificarestasdiferenciasdeactividad14.

Unimportanteavanceeneltratamientodeestaspacientesocurreenelaño2006conlapublicacióndeltrabajodequimioterapiaintraperitonealdeAmstrongetal153.Pacientesconenfermedadavanzadaquerecibencirugíaprimariaconresultadoóptimoconresiduotumoralmenorde1cm,sonaleatorizadasaesquemaconQT intraperitonealoesquemaintravenosoestándar. Con un total de 429 pacientes incluidas, se obtiene una gran mejoría en SLP,pasandode18.3a23.8meses (p=0.05),ydeSG,pasandode49.7a65.6meses (p=0.03).Lacalidaddevidafuepeorduranteeltratamiento,peroalañofuesimilarenlosdosgrupos.Estetrabajo confirmaba los datos de 2 trabajos previos de QT peritoneal que también habíanlogradomejorar la supervivencia respecto al tratamiento estándar intravenoso154,155. Variosmeta-análisisCochraneconfirmanestebeneficioenSGconlaaplicacióndeQTintraperitonealen pacientes con cirugía primaria óptima, constituyendo el tratamiento estándar en estapoblación(figura2.14)156,157.Unaseriedefactorespronósticossehandescritoenrelaciónconmayor SG, tales comohistología serosa vs células claras/mucinoso, ausenciadeenfermedadresidualvspresencia,y6ciclosdeQTperitonealvs3ciclos158.

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FIGURA2.14.CurvadeSGcomparandotratamientointravenosoconintraperitoneal

De:Amstrongetal,NEJM2006

Otroimportanteavancehasidolainclusióndeunanticuerpoantiangiogénicollamadobevacizumabencombinaciónconquimioterapia.Dosensayos fase IIImuestranbeneficiodeañadirbevacizumabalesquemaestándardepaclitaxel/carboplatinodurante6ciclosseguidodemantenimientoentre12-22ciclos159,160.EnlosdostrabajossedemuestraunaumentodelaSLPalusarbevacizumab,aunquelaSGfuesimilar161.Noobstante,enunodelosestudios,elICON7159,sediferenciaunsubgrupodenominadodealtoriesgo,caracterizadoporserestadioI-III con enfermedad residual >1cm, estadio III irresecable y los estadio IV, en donde sepresentóun importantebeneficio: laSLPpasóde14.5mesesa18.1meses, y laSGpasóde28.8meses a 36.6meses. Tras estos resultados, se sugiere estandarizar el tratamiento conbevacizumab junto a QT con paclitaxel/carboplatino y mantenimiento 12-22 ciclos en estapoblacióndealtoriesgo110,118.

RespectoalabordajeconQTneoadyuvante,elesquemausadoseráelmismoqueenadyuvancia,esdecir,paclitaxelycarboplatinotrisemanal.Aunquenoestáclaroelnúmerodeciclosaadministrar,sesugiereusarnomásde4ciclos133.Posteriormentealactoquirúrgicosecompletaría QT adyuvante hasta un número empírico total de 6-8 ciclos, aconsejándose almenos2cicloscomomínimotras lacirugía. Lospacientesqueprogresarandurante laQTNApresentaránunmalpronóstico, tratándosedeunaenfermedad refractaria y sedesestimaríagesto quirúrgico salvo el meramente paliativo. Se podrían recomendar varias alternativas,comootrorégimendeQT,participarenensayoclínico,cuidadospaliativos133.

Otra opción investigada es el tratamiento demantenimiento con QT tras conseguirrespuesta completa a primera línea. Lamentablemente los ensayos realizados no handemostrado claro beneficio frente a observación, por lo que no se puede recomendar estaestrategia60,162,salvoelmantenimientoconbevacizumabenaltoriesgocomentadoantes.

EnpacientesconmalasituaciónclínicaperoendondelaQTpodríaaportarlebeneficio,sepodríavalorarunesquemasemanaldequimioterapiaconpaclitaxelycarboplatino163.

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Como conclusión, tendremos en cuenta estas consideraciones con respecto altratamientosistémicoenlospacientesconestadioavanzadoIIB-IV:

− Tratamientoadyuvanteestándarconpaclitaxelycarboplatinotrisemanaldurante6-8ciclos.

− En los pacientes con estadio III, buen ECOG, no comorbilidad y enfermedadresidual<1cmestaríaindicadalaquimioterapiaIntraperitoneal.

− En aquellos pacientes de alto riesgo (enfermedad residual>1cm, III-irresecable yestadio IV)pareceaportarbeneficioenSGel añadirbevacizumabal tratamientoestándar.

− SirecibeQTNAsedeberíanadministrar3-4ciclosdeQTestándary,traslacirugíaperitoneal,completarhasta6-8ciclos.

SEGUIMIENTO

La base del seguimiento es la situación clínica de la paciente (anamnesis yexploración),analíticaypruebasdeimagen111.Noobstante,nosehademostradoaúncualesla mejor estrategia de seguimiento, por ello, las diferentes guías varían en susrecomendaciones84,110,111.Unaspectoimportanteatenerencuenta,esrealizarunaadecuadaeducacióndelpacienteacercadelossíntomasysignossugestivosderecaída111.

Lamonitorización de Ca-125 en el seguimiento es un tema discutido. Rustin et al164muestran que el tratamiento precoz de la paciente en base al aumento del Ca-125 sin otrodato de progresión, no mejora la supervivencia en comparación al tratamiento cuando sedemuestre progresión clínica o radiológica. No obstante, posiblemente algún subgrupo depacientessepudierabeneficiardelseguimientoconCa-12560.

El PET/TC parece detectar más lugares de metástasis a nivel abdominal y másafectación adenopática que el TC normal, por lo que estaría especialmente indicado si elpacienteescandidatoacirugía165.

2.1.9.3.TRATAMIENTODELARECAÍDATUMORAL

ApesardequeelCEOpresentaunagransensibilidadinicialaltratamiento,un20%depacientes no responderán a la QT de primera línea y de los que respondan una mayoríapresentaránrecaídatumoral.Enconcreto,recaeránhastaun20-30%delosestadiosprecocesyun80%depacientesenestadiosavanzados103,130.

La recaídapodrásersospechadaporeldesarrollodenuevossíntomas,porhallazgosradiológicosy/oporaumentodeCa-125,quepuedeprecedera laprogresión radiológicaenvariosmeses (2-6mesesdemedia)48,60. Los criterios de respuesta serológica sebasanenelvalordeCa-125yloscriteriosderespuestaradiológicaenloscriteriosRECIST1.1(anexoIyIIrespectivamente). Para valorar respuesta o progresión se valorarán según los criteriospropuestosporelGCIG(anexoIII).

Lamayoríadeestaspacientesconrecaídaseráncandidatasauntratamientosistémicode segunda línea, pero teniendo en cuenta que no será curativo9, 60,166. El objetivo del

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tratamientoseráelaliviosintomático,mejoradelacalidaddevida,retrasodelaprogresiónyaumentodelasupervivencia14,48,60.Laeleccióndeltratamientodependerádemuchosfactoresa considerar: númerode lugaresde recaída, tipohistológico, intervalo libredeplatino (ILP),tratamientoprevioy respuestaalmismo, toxicidad residualdelpaciente,estadogeneraldelpaciente,comorbilidadesypreferenciasdelpaciente14,166,167.

ElILPsedefinecomoeltiempoentrelafinalizacióndeltratamientopreviodeplatinoyla recaída actual. En el trabajo deMarkman et al de 1991 se observó que la posibilidad derespuesta a un esquema basado en platino dependía en gran medida del tiempo desde elúltimo ciclo de platino hasta la recaída actual168. Desde entonces, tanto el tipo como laduracióndelarespuestaalaQTpreviasehanconstituidocomolosdosfactorespronósticosmás importantes14,169. Basándose en estos dos criterios, Thigpen et al169 propusieron unaclasificaciónparaenfocarelpronósticoyeltratamiento:porunaparteaquellaspacientesquenorespondanaltratamientooquerespondanperopresentenunILPmenorde6mesesseránclasificadoscomo“recaídaplatinoresistente”yconllevanunmalpronóstico,conunaTR10-20%yunaMSde9meses170.Raravezalcanzaránuna respuestacompleta60.Porotraparte,aquellas pacientes que presenten respuesta al tratamiento y un ILP mayor de 6 meses seclasificaráncomo“recaídaplatinosensible”, conmejorpronóstico, conTR27-70%yunaMS12-24 meses14,168, 171. En los casos de conseguir remisión completa, ésta será de menorduraciónquelaanteriorenel97%deloscasos172.

Posteriormente se han realizado varias modificaciones a esta clasificación paraadaptarla mejor al comportamiento de la enfermedad y consensuar diferentes poblacionesparasu inclusiónenensayosclínicos131.Enel4ºconsensodel Intergroupde2010sesugiereconsiderarcuatrosubgrupos:pacientesplatino-refractarias,aquellasqueprogresanduranteeltratamientooen las4semanassiguientesafinalizarlo,siendolasdepeorpronósticoconTR10%14; pacientes platino-resistentes, aquellas con ILP menor de 6 meses; pacientesparcialmente sensibles a platino, con ILP 6-12 meses, que presentarían una sensibilidadmoderadaaplatino;yotrogrupodeplatino-sensiblesconILPmayorde12meses,quetendránmayor sensibilidad a un esquema con platino y mejor pronóstico131. Sin embargo, otrosautoresconsideranelILPcomounavariablecontinua,conaltasTRasociadosalargosILP48.

El momento para iniciar el tratamiento de 2ª línea es otro tema controvertido: enaquellasmujeres sintomáticas debería ser de forma inmediata, con el objetivo de paliaciónclínica,peroenaquellasqueseencuentrenasintomáticasysólopresentenaumentodeCa-125eltratamientonohademostradobeneficio,inclusoconllevadeterioroencalidaddevida9,60,164.

En algunas pacientes podría considerarse la cirugía de rescate, con beneficioimportante en supervivencia cuando se alcanza una resección completa9, 131,173,174,175. Paraello, será fundamental realizar una buena selección de la paciente, evitando cirugíasinnecesariascuandonoseaprevisibleunresultadoóptimo.

Las pacientes platino sensibles (ILP de 6 o más meses) presentan aún una altasensibilidad al re-tratamiento con platino, por lo que éste debería ser el tratamiento deelección. La combinaciónbasadaenplatino sehademostrado superior a lamonoterapiadeplatinoennumerososestudios,tantoenTRcomoenSLPySG,alcanzandocifrasdeTR50-80%,SLP 8-2 meses y MS de 18-33 meses166, 171, 176 , 177 . Tendríamos diferentes opciones detratamiento, sin clara evidencia de superioridad de una combinación respecto a otra178.

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Recientemente, se han añadido nuevos fármacos como bevacizumab 179 , olaparib 180 yniraparib181.

UngrupodeespecialanálisiseselformadoporaquellaspacientesconILPentre6-12meses.Estegruposedenomina“recaídaparcialmentesensibleaplatino”ypresentasolounamodestasensibilidadaesquemasdeplatino,porlocualsebuscannuevasvíasdetratamiento.Una interesante estrategia es el uso de una combinación sin platino, aumentando de estaformaelILPyasísepodríaelevarlasensibilidadaunposteriorre-tratamientoconplatino14.Enun ensayo randomizado, aquellas pacientes en recaída con ILP 6-12 meses tratados contrabectedin-doxorubicinaliposomalpegilada(DLP)mejoraronlaSLPylaSGencomparaciónalostratadossóloconDLP182.EstospacientesmejoraronsuILP,obteniendomayorbeneficioenlasiguientelíneadetratamientoconplatino.Noobstante,aquellospacientesnocandidatosaestacombinaciónsinplatino,unestudiorandomizadomuestraquelamonoterapianoplatinoresulta inferior en SLP y SG a una combinación con platino183. Por ahora, no hay datosconcluyentesqueavalenestateoría14.

Lamayoríadepacientesconenfermedadrecurrentedesarrollaráfinalmentecondiciónplatino-resistente9,60.Corresponderáaaquellaspacientesquepresentenrecaídaoprogresiónantesde6mesesdehaber finalizadoel tratamiento conplatino (ILP<6meses). Representaunaenfermedadconescasastasasderespuestayprogresiónprecoz,conllevandoaunamenorsupervivencia.Elobjetivoprincipaldeltratamientoserámejorarlacalidaddevidaycontrolarlasintomatología,pasandoasegundoplanoprolongarlaSLPySG14,166.

En estas pacientes estará indicado el tratamiento en monoterapia con paclitaxel,topotecan, gemcitabina o DLP. No hay diferencias significativas en eficacia entre estosfármacos, con TR 10-20%48, 60. Será de suma importancia la valoración de los perfiles detoxicidad de los fármacos, dado que nuestro objetivo principal será la calidad de vida de lapaciente48.

La adición de bevacizumab junto a QT, en aquellas pacientes que no lo hubieranrecibidoantes,mejoralaTRde12%a27%(p=0.001)ylaSLPde3.4a6.7meses(p<0.001),conmejoríadelacalidaddevida184,185.NohaybeneficioenSGdeformasignificativa.

Estos tratamientos podrán mejorar la supervivencia y calidad de vida del paciente,peronoseráncurativos,desarrollandofinalmenteprogresióntumoralrefractariayfalleceránporlaenfermedad9.

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2.2. BIOMARCADORES

DadalaaltatasaderecaídadelCEOyelmalpronósticodelaenfermedadrecurrente,seestán investigandonuevasestrategiasparamejorarelresultadode lostratamientos,talescomo añadir un tercer fármaco, mantenimiento, radioterapia, inmunología, etc. Para ello,también necesitaremos herramientas que nos den una adecuada valoración tanto de laenfermedadcomodelostratamientos.Deaquísurgenlosllamadosbiomarcadores(BM),quesonindicadoresbiológicosmediblesrelacionadosconprocesosbiológicos,ennuestrocasoconprocesosoncológicos.PodránserBMcirculantesotisulares(tabla2.10).Buscaremosaquellosquenosaporteninformaciónpronósticadelaenfermedad,valorenlarespuestaaltratamientoo que nos ayuden en la monitorización de la terapia. Sin embargo, cada uno presentalimitaciones en su aplicación clínica, por lo que en los últimos años hay numerosasinvestigacionessobrenuevosBM.

TABLA2.10.PotencialesbiomarcadoresenelCarcinomaEpitelialdeOvario.

En este apartado abordaremos diferentes BM circulantes y su relación con el CEO,dejandoparalossiguientesapartadosdosnuevosBMmuyprometedoresyquesonobjetodenuestrainvestigación,lascélulastumoralescirculantes(CTC)yelADNlibrecirculante(cfDNA).

Biomarcadorescirculantes

APROBADOSENELCEOCa125,HE4

ProteínascirculantesCEA,Ca19.9LDHAlbúminaCitoqueratinassolublesKalikreínasReceptordefolatoCitoquinasVEGF

HematológicosRatiopolimorfo/linfocitoRatiopolimorfo/plaquetasTrombocitosis

AcidosnucleicosADNcirculanteARNcirculanteMetilacióndeADNmiRNA

CélulascirculantesCélulastumoralescirculantesCélulastumoralesdiseminadasCélulasendotelialescirculantes

OtrosDímeroD

Biomarcadorestisulares

Proteínas reguladoras de apoptosis yciclocelular

Kinasas dependientes deciclinasProteínadelretinoblastomaP53

TranscriptasasdelatelomerasasReceptoresdemembranatirosin-kinasaMetaloproteinasasInfiltradoLinfocitarioTumoral

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BIOMARCADORES CIRCULANTES ONCOLOGICOS

Los BM circulantes oncológicos, también llamados marcadores tumorales, sonmoléculasosustanciasproducidasporoenrespuestaaprocesosneoplásicosyseencuentranenlacirculaciónsanguíneaencantidadesdetectables186.Suelenrelacionarseconlapresenciadecélulasneoplásicasy/oaportaninformaciónsobresucomportamiento186.Ladeterminacióndemarcadorestumoralescirculantesenplasmaesunaopciónmuyatractivapuestoquesonmuyaccesiblesyporunmétodopocoinvasivo(venopunción),suresultadoesundatoobjetivoypuedenhacersemúltiplesrepeticioneseneltiempo.

El valor de un BM estará determinado por su sensibilidad (proporción de cánceresdetectados por una prueba positiva) y su especificidad (proporción de casos no neoplásicosidentificadosporunapruebanegativa)186.Lo idealseríaquetuvieraun100%desensibilidad,de especificidad y valor predictivo positivo y negativo, pero esto no existe186. La mayorlimitaciónserálafaltadeespecificidad,puestoquelamayoríadeBMnosonespecíficosdeuncáncerconcreto,estandohabitualmenteaumentadosenvariostipostumorales,asícomoenpatologíabenignayensituacionesfisiológicas186.Porello,enlamayoríadesituacioneslosBMno son diagnósticos, especialmente cuando no hay clínica acompañante relacionada. Suprincipalmisióneslamonitorizacióndelapacienteycontribuiraldiagnósticodiferencial186,187.

SehanestudiadounagrancantidaddesustanciasconpotencialpapelcomoBM,talescomo enzimas, hormonas, receptores, etc, pero sin embargo, el número de ellos querealmente tiene aplicación clínica es muy limitado186. Esto se puede deber o bien porquerealmente ese BM no tiene utilidad clínica, o bien porque los estudios de ese marcadorestabanmaldiseñados.

Con el objetivo de estandarizar y mejorar los estudios de validación clínica demarcadores tumorales, han surgido una serie de guías que orientan sobre su diseño ypublicación.LasrecomendacionesSTROBEyREMARKestablecenunosprincipiosbásicosparadiseñar estudios observacionales de calidad sobre BM, y poder ofrecer una informacióncompleta y transparente, para así realizar una adecuada valoración de los datospresentados188,189,190.Consideranunaseriedeítemsaseguir(20enlaguíaREMARKy22enlaguía STROBE) repartidos en 4 apartados principales: introducción, material y métodos,resultados y discusión. Se definemarcador pronóstico comoaquel que tiene asociación conalgún resultado clínico, tal como tiempo hasta un evento, SLP o SG189. Se definemarcadorpredictivocomoaquelquenosindicaelbeneficioprobableenunpacientedeuntratamientoconcreto, para poder elegir mejor entre varias opciones de tratamiento189. No obstante,algunos autores ven a los marcadores predictivos como una clase especial de marcadorespronósticos190. Otras guías para la elaboración de estudios de BM son las guías PRoBE(prospective-specimen-collection, retrospective-blinded-evaluation), que incorporan recogidademuestrasbiológicasdeformaprospectivadelacohorteaestudio191.

UnaspectomuyimportanteatenerencuentaesvalorarlautilidadclínicadeeseBM,entendidaéstacomolacapacidadqueposeeparamejorarlatomadedecisionesclínicasylosresultadosenelpaciente192.UnBMpuedetenerunavalidezanalíticayclínicasobresaliente,perosinoaportaunbeneficiooinformaciónadicionalfrentealosBMyaestablecidosenesapatología, finalmente no tendrá utilidad clínica 192. Es un parámetro difícil de evaluar, pues

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depende por múltiples factores, tales como situación clínica, disponibilidad y magnitud delbeneficiodelostratamientos,repercusiónencalidaddevidaparaelpaciente,etc192.

Todas estas premisas han llevado a establecer una serie de requisitos que todo BMdeberácumplir.LaAcademiaNacionaldeBioquímicaClínicadeEstadosUnidosexponequelosmarcadores tumorales sólo son útiles si cumplen 3 circunstancias: que los resultados seanadecuados precisamente para la aplicación requerida (screening, diagnóstico, pronóstico,seguimiento o predictivo); que los resultados del BM separen a los pacientes en dos omáspoblaciones cuyos resultados difieran de tal forma que permitiera aplicar tratamientosdiferentes a cada grupo; y que la estimación de la separación para un resultado positivo ynegativoseafiable193.

El Instituto de Salud Americano (NIH por su siglas en inglés) señala las siguientescircunstancias que un factor pronóstico debería cumplir: proporcionar un significante eindependientevalorclínicopronóstico,validadoportestclínicos;sudeterminacióndeberáserfactible, reproducible y ampliamente disponible, con control de la calidad; y los resultadosdeberíanserfácilmenteinterpretadosporlosmédicos194.

Porúltimo,algunosautoresproponenunagradaciónennivelesdeevidenciadecadabiomarcador,paraasíevaluarsuutilidadclínicaysuincorporaciónenlaprácticadiaria195.

CEA

El antígeno carcinoembrionario (CEA) es una proteína que se encuentra en el tejidofetal o embrionario, pero tras el nacimiento solo persiste en pequeña cantidad en el colon.RepresentaunimportanteBMpronósticodelcarcinomacolorrectal196,197,yeselmarcadordeelección en el seguimiento196. Sin embargo, en el CEO presenta escasa utilidad, pues soloaumenta en el subtipo mucinoso y en los tumores metastásicos en ovario198. Un valor porencimade5ng/mLsóloestápresenteenel14%delaspacientes199.Además,puedeaumentarenotrasneoplasias,comocáncerdemama,páncreas,tiroidesypulmón,asícomoenprocesosbenignos, tales como colecistitis, cirrosis hepática, enfermedad inflamatoria intestinal,cistoadenomamucinoso,etc200.Tambiénseharelacionadoconelhábitotabáquico200.

Ca19.9

ElantígenotumoralCa19.9esunaproteínamucinosaqueseusaprincipalmenteenelmanejode lasneoplasiasbiliopancreáticas,aunquetambiénsehadescritoenotros tiposdeneoplasiasypatologíabenigna.Enlossujetossanossehadescritoaumentadaenel0.6%201.Enel CEOmuestraescasautilidad, con soloun29%de sensibilidad, relacionándosemás conelsubtipomucinoso,dondepuedellegaral50%202.

CA-125

ElCa125esunaglicoproteínadealtopesomoleculardescritaporBastetal199en1981que se ha constituido como el BM básico en el CEO, aunque no es específico de él186. Seexpresa en tejidos derivados del epitelio celómico (endocérvix, endometrio y trompa de

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Falopio) y delmesotelio (pleura, pericardio y peritoneo)203. Se podrá encontrar en el ovarioadultoyenelepiteliodecolon,páncreas,pulmón,riñón,próstata,mama,estómagoyvesículabiliar186,204. La concentración sérica de Ca-125 dependerá de dos factores principales: delaumentodelasíntesisporpartedeltejidoydelapresenciadealteracionesenlamembranabasalquepermitanelpasodeCa-125alacirculación204,205.Porello,entumoresbenignosseveráescasamenteaumentado,debidoalaintegridaddelamembranabasal,mientrasqueenCEOseencontraráelevadoenlamayoríadeocasiones,tantoporaumentodelasíntesiscomoporlainvasióntisular206.

El CA-125noes completamenteespecíficodel CEO.Hayuna seriedeenfermedadesbenignas que también presentan elevación del nivel sérico de Ca-125, tanto patologíasginecológicas (endometriosis, infecciones, enfermedades inflamatorias y fibromas) como noginecológicas (cuadros inflamatorios como pancreatitis, hepatitis, pericarditis, etc, einfeccionescomotuberculosis),asícomoaumentaráenotrostiposdeneoplasiascomocáncerde endometrio, mama, páncreas, colon y pulmón60, 186, 204. Además, los valores de Ca-125presentan una gran variabilidad dependiendo de la raza, edad, embarazo, ciclo menstrual,hábitossocialescomoeltabaquismoylaingestadecafeína186,204.

En el CEO se encuentra elevado en el 80-90% de las pacientes, aunque fluctúadependiendodelestadiodelapaciente,variandodeun50-78%delaspacientesconestadioIamásdeun90%enestadioIII-IV,delsubtipohistológico,siendomayorenelserosoaltogradoy menor en el mucinoso, y del grado de diferenciación207, 208. Un estudio de Bast et al209establecióel valorde cortemásadecuadode la concentración séricaen35UI/ml. Conestevalor el 82% de CEO presentó cifras superiores a 35 UI/ml, mientras que solo el 1% de lapoblaciónsanayel6%depatologíanoneoplásicapresentóvaloressuperiores.

ElCa-125sehasituadocomoelBMmásimportanteenelCEO,conunpapelcrucialenelscreening,diagnóstico,pronóstico,monitorizaciónydetecciónderecaídas48,186.SuevoluciónduranteeltratamientoformapartedeloscriteriosderespuestayprogresiónenCEOdelGCIG(anexoIV).

Respecto al screening, losmétodos de detección precoz que se están evaluando sebasanenlacombinacióndeCa-125yecografíavaginal,alcanzandocifrasde89%sensibilidad,99%especificidadyvalorpredictivopositivode40%210.

En el diagnóstico, el Ca-125 por sí solo presenta escasa rentabilidad,mostrando enestadios III y IV una sensibilidad del 77%, una especificidad del 80% y un valor predictivopositivo del 69%211. Estos resultados mejoran de forma importante cuando se incluye enalgoritmosdiagnósticos juntoaotros factores, como lospaneles comentadosanteriormenteROMA83, RMI86 y ADNEX87. También se ha visto que en presencia de carcinomatosis, unarelacióndeCa125/CEA>25essugestivadecáncerdeorigenovárico,porloquepodríaorientareldiagnóstico81.

ElCa-125presentaunimportantevalorpronóstico.ElvalorprequirúrgicodeCa-125seharelacionadoenalgunasseriesconlasupervivenciadelaspacientes.EnestadioI,unaserieretrospectivaaustralianasobre518pacientes,mostródiferentesupervivenciaenfuncióndelvalordeCa-125,pasandolaSG5ade82%cuandoelvalordeCa-125eramayora30UI/mL,aunaSG5ade95%cuandoeramenor (p=0.028)101.Nageleetal tambiéncomunica sobre201pacientesconestadioIqueCa-125fueelmásimportantefactorpronósticodesupervivencia

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enelanálisismultivariado,conunHR6.37(95%IC2.39-16.97)102.Sinembargo,otrosestudiosnohanconfirmadoestevalorpronóstico212.

ElvalordeCa-125antesde laQTtambiéntienevalorpronóstico.Unestudiofrancéssobre 553 pacientes estadios IIC-IVmostró un beneficio en SLP y SG cuando el Ca-125 eramenorde230UI/mLantesde laQT(MSde48.6mesesversus25.1meses,p<0.0001)213.Noobstante,enelestudiodeGadduccietal212unvalordeCa-125mayorde500UI/mLantesdelprimer ciclo de QT fue factor predictivo demenor respuesta patológica completa, pero noalcanzólasignificaciónparaSG.

OtromomentoendondeelCa-125 tienevalorpronóstico,ha sido sudeterminacióntras la cirugía. Makar et al214muestran que en pacientes sin enfermedad residual un valormeno de 35 UI/mL omenor de 65 UI/mL en aquellos con cirugía sub-óptima, es un factorpronósticoindependiente.

Pero quizás uno de los aspectos más importantes del uso del Ca-125 es lamonitorizacióndel tratamiento.Yadesdeel trabajo inicialdeBastetal199 seobservóque lacinéticadelCa-125durantelaquimioterapiaserelacionabaconlaevolucióndelaspacientes,postulándosequeladeterminaciónseriadadeCa-125podríaayudarenelmanejoterapéuticodelCEO.Desdeentoncessehanplanteadovariosparámetrosparaanalizarmejorlaevoluciónde Ca-125, presentando diferentes resultados. Las dos variables más validadas han sido suvalormásbajoalcanzadodurantelaQT,tambiénllamadonadir,ylasemividadeCa-125(Ca-125half-life), consideradoun indicador tempranodequimio-sensibilidad212,213.CrawfordandPeace215analizanelvalordelnadiren79pacientes,obteniendoqueunnadirde<10UI/mLserelacionaba conunaMSde 2968días frente a 537días en los que tenían un valor superior(p<0.001).EnelestudiofrancésdeRiedingeretal213unnadirdemenorde20UI/mLytiempoparaalcanzarlomenorde72díasserelacionaroncon laSLPy laSG.Enestemismoestudio,unaCa-125half-lifeigualomenorde14díasfueelfactorpronósticomásimportantedeSLPySG,siendolamediade15.8días.EnelestudioitalianodeGadduccietal212tambiénlaCa-125half-lifemenorde25díasfueunfactorpronósticoimportantedeSGydealcanzarrespuestapatológica completa. Estemismo autor volvió a analizar en otro trabajo la Ca-125 half-life,obteniendoqueelcuartil50%correspondíaa14días,relacionándoseconlarespuestatumoralylaSG216.

No obstante, hay que recordar que el Ca-125 no presenta una sensibilidad óptima.Niloffetal217encontraronquehastaun60%depacientesquealcanzaronunvalormenorde35UI/mL trasQT tuvieron tumor residual en la cirugía de second-look, aunque los tumoresfueronmenoresde1cm.Sinembargo,unvalormayorde35predijolapresenciadetumorenel95%deloscasos.

HE4

ElsegundobiomarcadoraprobadoporlaFDAenelCEOeslaglicoproteínaepididimalhumanaHE4(HumanEpididymalProtein4)48.TambiénconocidacomoWFDC2,pertenecealafamilia de proteínas ácidas séricas nucleares de 4 enlaces disulfuro (WFDC)218. Aunque fueaislado originalmente de células epiteliales del epidídimo humano, se ha comprobado su

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presencia en el epitelio de muchos tejidos normales y varios tipos de neoplasia, estandoespecialmenteelevadoenelCEO219.

LosestudioshanmostradoquesunivelséricorepresentaunnuevoBMpronósticoconsensibilidad equiparable a Ca-125 pero con mayor especificidad 220 . Otros estudios hanmostradomayorsensibilidadqueCa-125,tantoenestadioprecozcomoavanzado,consimilarespecificidad221.Enelcasodelaendometriosishayunaespecialdiferencia,estandoelevadoelHE4sóloenel3%mientrasqueCa-125seelevaenel67%(p<0.0001)222.FerraroetalrealizanunarevisiónsistemáticaqueencuentraqueHE4parecesersuperioraCa-125entérminosderendimiento diagnóstico de CEO en mujeres con sospecha de patología ginecológica 223 .También presenta un importante valor en el seguimiento, con alta sensibilidad para ladetecciónderecurrencia,especialmentecuandosecombinaconCa-125224,225.

TROMBOCITOSIS

Lasplaquetasproducenfactoresquepromuevenelcrecimientocelular,comoelfactorde crecimiento derivado de las plaquetas, y factores que facilitan adhesión de las células,comolatrombospondina226.Lapresenciadetrombocitosispre-quirúrgicamayorde400célulasx 10(9)/L se ha relacionado con peor pronóstico en el CEO227. Se comporta como factorpredictivo, con más cirugía subóptima en aquellos con trombocitosis, y como factorpronóstico,conmenorSLE(12vs34meses,p<0.001)ymenorSG(28vs79meses,p<0.001)228.

LDHyALBUMINA

Algunos parámetros analíticos generales como LDH y albúmina presentan relaciónpronóstica en cáncer, principalmente por su papel como reactantes de fase aguda. En elcarcinoma renal el valor de albúmina sérica y lactato deshidrogenasa (LDH) tienen undestacadopapel pronóstico229,230,231. Enel CEO,Deebaet al232analizóel valorde LDH comoBM diagnóstico, con sensibilidad de 57% y especificidad 82% para tumor ovárico maligno,mejorandocuandosecombinabaconCa-125.

El valor de albúmina sérica se relaciona con el estado nutricional de la paciente.Ataseven et al233demostraron en un estudio retrospectivo sobre 604 pacientes con CEOintervenido con cirugía primaria, que la hipoalbuminemia prequirúrgica era un factorpredictivo independientede complicacionespost-quirúrgicas y tambiénun factorpronósticode SG. Chi et al234desarrolló un nomograma para predecir la SG5a en CEO tras la cirugíaperitonealprimaria,endondeelvalorséricodealbúminaesunodelos7parámetros.Tambiénformapartede índicesnutricionalescon importantepapelpronóstico.Recientemente, sehaplanteado el uso del Indice Pronóstico Nutricional (PNI-Prognostic Nutritional Index), queincluyeelniveldealbúminayelnúmerodelinfocitos,yquehademostrandoserunmarcadorpronósticoindependienteenvariosestudios235,236,237.

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2.3. CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES (CTC).

Los tumores sonheterogéneos en su habilidadmetastásica, siendo la proporcióndecélulas que puede dar metástasis muy baja238. Precisan adquirir competencia metastásica,mediantelaintegracióndealteracionesgenéticas,queposibilitentodoslospasosparallegaradarmetástasissistémicasviables239.Larecaídametastásicaenpacientescontumoressólidosserá causada por la diseminación sistémica de las células tumorales240. En pacientes contumores localizados sin enfermedad a distancia visible, la detección de la enfermedadmicrometastásica oculta, también llamada enfermedad mínima residual, será de sumaimportanciaporlasimplicacionespronósticasqueconlleva240.Lamédulaóseafueel lugarendonde inicialmente se estudió esta enfermedad oculta, apareciendo el concepto de célulastumorales diseminadas. La presencia de células epiteliales tumorales enmédula ósea se harelacionado con mayores recaídas y peor SG en varios estudios prospectivos y metanálisis240,241.Laincidenciasueleserdel20-40%depacientesconuncáncerepitelial238.Sinembargo,dadalamayoraccesibilidadycomodidadparaelpacientedelavenopunciónfrentealabiopsiademédulaósea,elestudiodeestascélulasepitelialestumoralesenlacirculaciónperiféricahaidoaumentando.

Las células tumorales circulantes (CTC) seránaquellas células viablespresentesen lasangre periférica que posean características antigénicas o genéticas de un específico tipotumoral242.LasCTCtendríanunpapelcríticoenelprocesodeprogresiónymetástasis(figura2.15). El análisis de CTC podría mejorar el conocimiento sobre la fisiopatología de laenfermedadyelprocesodediseminaciónsistémica,aumentarlasensibilidaddeldiagnósticode la enfermedad micrometastásica, aportar información pronóstica y predictiva, y tenerprobableinfluenciaenlatomadedecisionesterapéuticas240,242,243.

FIGURA2.15.Procesodemetástasisdelascélulastumorales.

De:Panteletal.JNatlCancerInst1999.

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Muchos estudios en diferentes tumores han relacionado la presencia de CTC conresultados clínicos desfavorables243. En pacientes metastásicos, trabajos en tumores comocáncer de mama244 , 245 , 246, cáncer de próstata 247, cáncer de pulmón microcítico248 y nomicrocítico249,ycáncerdecolonmetastásico250,hanestablecidoquelapresenciaypersistenciadeCTCes elmáspotente factor pronósticode SLP y SG, y en algunos casos también factorpredictivoderespuestaa laterapia.Además,sehavistoquelavariacióndelnúmerodeCTCduranteel tratamientoserelacionaconelpronósticodelpaciente,pudiendo convertirseenunbiomarcadordemonitorización,valorandodeformaprecozunabuenaomalarespuestaaltratamiento251,252.

TambiénsehandetectadoCTCenpacientesconcáncerdemamaprecoz,siendofactorpronóstico253. Enun fase II en cáncerdemamaoperableavanzado, ladetecciónde1omásCTCenlacirculaciónsedioenel23%,yserelacionódeformaindependienteconunarecaídaprecoz254.Enelestudiomásgrandeencáncerdemamalocalizado,elestudioalemánSUCCESSsobre 2026 pacientes, el valor de CTC antes y después de la QT adyuvante fue un factorpronósticoindependientedeSLPySG255.Estoindicaquelostumoresprimariosenvíancélulascancerosasenlafaseinicialdelaenfermedad.Dadoqueelpapeldelaterapiaadyuvanteeslaeliminación de las células tumorales diseminadas ocultas antes de evolucionar a unaenfermedad clínicamente metastásica, la detección temprana de micrometástasis podríaidentificaraquellospacientesquemássebeneficiendeltratamientoadyuvante240.

Algunos autores han analizado características de las CTC, como patrones detransportadores de membrana256,257, vías proteínicas258o caracterización fenotípica de lascélulas257,259, en busca de indicadores de sensibilidad y resistencia a la quimioterapia. Estacaracterización biológica podría ser factor predictivo de respuesta y mejorar nuestroconocimientodelacapacidadmetastásicadeestascélulasydelaenfermedadensí243.

SehapostuladoqueelvalordeCTCpudieraservirpara laseleccióndel tratamiento.Porello,sehaniniciadovariosensayosprospectivosqueevalúanlaelecciónde laterapiaenfuncióndelvalordeCTC260.ElestudioSWOGS0500comparaapacientesconcáncerdemamametastásico que tras inicio de la primera línea de quimioterapia presentan aumento delnúmero de CTC, siendo aleatorizados a seguir con el mismo esquema o un régimenalternativo261.ElestudioconfirmaelvalorpronósticonegativodelapresenciadeCTC,peronoencuentradiferenciasenSGconelcambioderégimenterapéuticoenbasea laevolucióndeCTC,aunqueestehechopudieraindicarunaquimiorresistenciadelapropiaenfermedad,porloquesesugierelaparticipaciónenensayosclínicosdenuevosagentes.

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE CTC

HastalafechaactualsehanempleadodiferentesmétodosparaladeteccióndeCTCenlacirculaciónperiférica,cadaunocondiferentesensibilidadyespecificidad240,242,243.DebidoaqueenlasangrehaymuybajaconcentracióndeCTCyalapresenciadediferenteselementoscomoleucocitos,plaquetas,hematíes,célulasepiteliales,célulasapoptósicasyfragmentosdecélulas,etc,habríaunaprimerafasedeseparaciónyenriquecimientodeaquellascélulasquefuerancandidatasaCTCydespuésotrafasede identificaciónde lasverdaderasCTC243.En laprimeraetapasehanempleadodiferentes técnicas,comoenriquecimientocelularmediantecentrifugación por gradiente de densidad 262 , 263 , separación por tamaño 264 y la mayoría

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separacióninmunomagnética265,266.Estaúltimasebasaenelempleodepartículasmagnéticasrecubiertasporunanticuerpoespecíficoqueseunealascélulasquesequierendetectar,enestecasocélulasneoplásicas.UnavezdetectadaslasprobablesCTC,seaíslanysecaracterizanporIHQopormétodosdeexpresióngénicaparaseleccionarfinalmentelasverdaderasCTC.Enesta identificación se han usado sobre todo citoqueratinas (CKs), que son queratinas de losfilamentos intermediospresentesenel citoesqueletode las célulasepiteliales243. Labasedetodosestosmétodoseselusodeunacombinacióndeantígenoscelulares242.

Un aspecto muy importante es estandarizar la determinación de CTC para que seareproducible y validada en todos los centros243. Por ello, en el 2004 la US Food and DrugAdministración(FDA)aprobóyvalidóelsistemaCellSearch®CTCTest(Veridex,LLC,aJohnson& Johnson Company; Raritan, NJ)(http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf3/k031588.pdf) para estandarizar ladeterminación de CTC en cáncer de mama, colon y próstata. El CellSearch es un métodosemiautomático de enumeración de las CTC en sangre periférica mediante separacióninmunomagnética y detección por IHQ (figura 2.16). Hay una primera fase que empleapartículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo frente a la molécula de adhesión decélulasepiteliales(EpCAM),paraasírealizarlacapturadelaspotencialesCTC242.LaEpCAMesunaglicoproteínatransmembranaquesóloseexpresaencélulasepiteliales,tantoenepitelionormal como en la mayoría de tumores epiteliales267,268. La proliferación activa tumoralaumenta la expresión de EpCAM, aunque su papel en la carcinogénesis se desconoce268.DespuéshabráunasegundafasedetinciónconanticuerposdeCKs8,18y19yelanticuerpoCD45, que se une al antígenodediferenciación leucocitario. La tinción con4,6-idamidino-2-fenilindol-2(DAPI)confirmalapresenciadeunnúcleocelular.LadeteccióndeCTCsebasaráenlatinciónparaCKsyDAPI,faltadeexpresióndeCD45ymorfologíacelular(figura2.17)242.

FIGURA2.16.SistemaCellSearch.

De:https://www.cellsearchctc.com/product-systems-overview/cellsearch-system-overview

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FIGURA2.17.Imagendecélulastumoralescirculantes.

EnlaimagendelaizquierdaCTCviables.AladerechafragmentosdeCTCyCTCapoptósicasnoviables.De:Allardetal.CCR2004

Una validación multicéntrica independiente del sistema CellSearch en tumores demamaconfirmasuestandarización,conunatasadehastaun80%deconcordanciaentre losdiferentes centros269. También se obtuvo que las CTC semantenían estables a temperaturaambientedurantealmenos72horasantesdesuanálisis.Suusoactualmentesehaextendidoaotrostipostumorales.

Noobstante, existen controversias acercade las limitacionesdelmétodoCellSearch.SehandescritofalsospositivosportinciónanormaldeCKsencélulasnoepitelialesyencélulasepitelialescirculantesensujetossanosyenpatologíabenigna, loque implicaríadisminuciónde la especificidad243, 269. Una limitación es que la sensibilidad del método se basa en ladeteccióndeCTCporlaexpresiónúnicadeEpCAM,porcuallasCTCquenoexpresenEpCAMno serán detectadas, aunque éstas representan una minoría 267, 268, 269. Por ejemplo, en elfenotiponormal-likedelcáncerdemama, laexpresióndeEpCAMesmuybaja,con loque lasensibilidad de CellSearch en este subtipo es mínima270. También se ha descrito que laexpresiónpudieraservariableydependientedelmicroambiente,pudiendodisminuirhasta10veceslaexpresióndeEpCAMenCTCrespectoasuexpresióneneltejido271.Porello,elsistemaCellSearch incorpora avidina-biotina que mejora la captura magnética de EpCAM, paracompensarestabajadensidaddeantígeno269.OtraposibilidadesquelacélulaexpreseEpCAMpero tengauna faltadeexpresióndeCKs. Enel procesode transiciónepitelio-mesenquimalnecesarioparalamigracióneinvasióncelular,sehavistounadisminucióndelaexpresióndeCKs272.ParaamortiguarestadisminucióndeCKs,elsistemaCellSearchusaunpanelconvariasCKs,paracompensar lafaltadealgunaenparticular269.OtracríticadelmétodoCellSearchesquedebidoaqueseproduceunadestruccióndelacélula,nopermiterealizarestudiosinvitrodeviabilidadconesascélulas273.

Anteestaslimitaciones,diferentestecnologíashanintentadomejorarlaslimitacionesdel abordajeCellSearch. El sistemaAdnaTestBreastCancer usa separación inmunomagnéticacondosanticuerpos(EpCAMyotrofrentealantígenoMUC1),despuésaislamientodemRNAypasoacDNA,yposterioridentificacióndediferentespanelesdegenestumoralesmedianteRT-PCR,entrelosqueseincluyenEpCAM,MUC1yHer2274.Latecnologíamicrofluídicacombinaladetección de marcadores de superficie con el aislamiento con flujo laminar en función del

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tamañoycaracterísticashidrópicasdelasCTC,capturandolascélulasvivas273,275.Otrométodoes la detección directa en sangre completa usando una combinación de marcadores, sinnecesidadde aislar primero las CTC comoenCellSearch,mediante el usodeuna tecnologíamuysensiblequeeslaresonanciamagnéticamicro-nuclear276.Otravíademejoraesoptimizarlaidentificacióndelascélulasusandopanelesconnuevosgenesquemejorenlasensibilidadyespecificidad277.Noobstante,apesardeestosinconvenientes,lacuantificaciónporelmétodoCellSearchesactualmenteelmásestandarizadoyvalidado,yelúnicoaprobadoporlaFDA.

Por otro lado, la detección de CTC por el método CellSearch en sujetos sanos y enpatologíabenignaes sumamente rara. Enunestudiopara analizar la prevalenciadeCTCendiferentespoblacionesporelmétodoCellSearch,seincluyeron964pacientesconcarcinomasmetastásicos, 199 pacientes con enfermedades benignas y 145 controles sanos278. Entre lossujetossanos,un5.5%presentaron1CTCpor7.5mLdesangreperiférica,peroninguno2omás.Entrelospacientesconpatologíabenigna,sóloun7.5%presentaron1CTCen7.5mL,yunpaciente con patología tiroidea obtuvo 3 CTC/7.5 mL. Por lo tanto, situando el nivel depositividaddeCTCen2omáscada7.5mLdesangreperiférica,solo1personadelas344noneoplásicas dio positivo, lo que supone un 0.3% del total y una especificidad del 99.7%. Laprevalenciaenlosdiferentestumorestambiénesdiferente,conun57%encáncerdepróstata,37%encáncerdemama,30%encáncerdecolony37%encáncerdeovario(figura2.18).

FIGURA2.18.PrevalenciadeCTCen7.5mLdesangreendiferentespoblaciones.

De:Allardetal.CCR2004.

CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES EN CÁNCER DE OVARIO.

Enel carcinomaepitelial deovario (CEO)haymásdiscusiónen tornoa la relevanciaclínica de las CTC, debido a su peculiar historia natural de diseminación principalmente víaperitoneal, con larga evolución dentro de la cavidad abdominal y bajo porcentaje demetástasisvíahematógena279.Noobstante,ladiseminaciónsistémicaestacobrandocadavezmásimportancia54.Variostrabajosmuestranunporcentajemayordemetástasisocultasdelo

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esperado, especialmente en médula ósea, en donde alcanza hasta un 27-54% de laspacientes280,281.LapresenciadecélulastumoralesenmédulaóseaserelacionaconmenorSLEymenorSG(MSde51mesesvs33meses,p=0.023)280.

Al igualqueenelrestodetumores,debidoalaescasaaceptaciónderealizarbiopsiademédulaóseaylamayorcomodidadyaccesibilidaddelavenopunción,tambiénenCEOsefocalizóelestudiodedeteccióndelaenfermedadocultaatravésdelasCTCenlacirculación.Losprimerostrabajostuvieronbajastasasdedetección(12y19%)ynohallaronrelaciónconlaSG282,283.Posteriormente,conlaaparicióndemejorestécnicasdedetección,otrostrabajoshantenidotasassuperioresal20%(tabla13)ysíhanmostradorelaciónentrelaenumeraciónde CTC con el pronóstico de la enfermedad. Dos metanálisis en 2015 sobre 1164 y 1129pacientesconfirmanelvalorpronósticodelapresenciadeCTC,condisminucióndelaSLP(HR1.44-2.52)ylaSG(HR1.61-1.97)284,285.EneldeCuietal284muestraquelapresenciadeCTCserelacionóconelestadio(OR1.90,95%IC1.02-3.56)yconlarespuestaaltratamiento(OR0.55,95%IC0.34-0.90)peronoconlahistologíaserosa,afectaciónlinfáticaoenfermedadresidual.

Unodelosproblemasprincipalesesquenohayunmétodoespecíficovalidadoparaladetección y caracterizacióndeCTCenCEO, por lo quehaymucha variaciónde los sistemasempleados (tabla 2.11). Los principalesmétodosde aislamientodeCTC son losmismosquehemos expuesto previamente, pudiendo ser separaciónpor tamaño, densidad celular, cargamagnética o propiedades físico-dinámicas, siendo el más usado el enriquecimiento porpartículasinmunomagnéticas286.Respectoalosmétodosdeidentificación,losdosprincipalessonporRT-PCRoporIHQ,aunqueparecequelaRT-PCResmássensible284,286.

Desde la aprobación del método CellSearch en cáncer de mama, su uso se haextendido también a CEO, aunque hay que tener en cuenta las limitaciones comentadasanteriormente. Además, la expresión de EpCAM en CEO es controvertida, con autores queencuentran reducción y otros aumento286,287. Por otro lado, la mayoría de estudios hanmostrado resultados negativos en cuanto su papel pronóstico286,288 ,289 ,290, incluso en elmetanálisis de Zhou et al285 el subgrupo de estudios realizados con CellSearch no obtuvorelación con la SG. Behbakht et al288 analizó su papel en un fase II sobre 54 pacientes enrecaída, obteniendouna tasadedeteccióndel 44%usandoundintel de ≥ 1/7.5ml, peronohubo relaciónpronóstica conSLPni SG.Enalgunospacientes sehizounamonitorizacióndeCTC,perolamuestrafueescasa.UnodelosestudiosmásgrandesfuecomunicadoporPovedaet al289 sobre la determinación de CTC del fase III OVA-301. Sobre una muestra de 216pacientesenrecaídaobtuvounatasadedetecciónde14.4%usandoeldintelen≥2/7.5ml.LapresenciadeCTCserelacionóconelECOG,elCa-125y lapresenciadeascitis.SealcanzarondiferenciassignificativasenelanálisisunivarianteenSLP(3.2mesesvs6.6meses,p=0.0024)yenSG(12.4mesesvs20.6meses,p=0.0017),peronoseconfirmaronenelmultivariante(HR1.58,p=0.058,yHR1.54,p=0.096respectivamente).Liuetal290analizanelpapeldeCTCporCellSearchen30pacientesdenuevodiagnósticoy48recaídas.Usandoundintelde≥2/7.5ml,encuentranCTCenel60%depacientes,tantoaldiagnósticoinicialcomoenrecaída,peronoencontraron relación con características clínicas ni con supervivencia. La determinaciónseriadatampocofuepredictivoderespuestatumoral.

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Tabla2.11.EstudiossobreCTCenCEO.Estudio Método Nº

PacientesTasaCTC

NivelCTC

ValorPronóstico Relación

Marth2002

Inmunomagnético(Dynabeads)

90 12% ≥2rosetas

No

Judson2003

CuerpoInmunomagnético

59 19% ≥1 No

Allard2004

CellSearch 53 38% ≥2/7.5ml NR

Wimberger2007

OncoQuick 57P

21% ≥1 No

Fan2009

CAM+ 66PyR

60% ≥1/3ml SiSLP(HR1.44)

Ca-125,estadio

Behbakht2011

CellSearch 54R

44% ≥1/7.5ml No Problemas devalidez

Poveda2011

CellSearch 216R

14% ≥2/7.5ml No Ca-125, ascitis,ECOG

Aktas2011

AdnaTest 122P

19% ≥2/5ml SiSG(HR4.56)

Cirugíasubóptima

Obermayr2013

GradientedensidadyARNextracción(QiacubeSystem)

216P

24% ≥1 SiSLP(HR3.5)SG(HR2.3)

Ca-125 y HE4,ascitis, cirugíasubóptima

Liu2013

CellSearch 78PyR

60% ≥2/7.5ml No

Kuhlmann2014

AdnaTest 143P

14% ≥1/7.5ml SiSG(HR1.85)

Pearl2014

CAM+ 129P

88% ≥5/1ml SiSLP(p0.0024)SG(p0.0219)

Ca-125,estadio

Kolostova2015

MetaCell+cultivo 118P

65% ≥1 NR

Cui.2015Metanálisis

1164 SiSLP(HR2.52)SG(HR1.97)

Zhou.2015Metanálisis

1129 SiSLP(HR1.44)SG(HR1.61)

SLP=supervivencialibredeprogresión;SG=supervivenciaglobal;NR=NoreportadoP=PacienteconPrimerdiagnósticoactual,tratamientoPrimario;R=PacientesenRecaída

Aktas et al291aplican el sistema AdnaTest BreastCancer, basado en enriquecimientoinmunomagnético detectando EpCAM y MUC1 y posterior identificación por RT-PCR de unpanel con genes de EpCAM, MUC1, Her2 y Ca-125. Incluyen 122 pacientes en total, condeterminación antes de cirugía (n=86) y/o 4-6 meses después del tratamiento conquimioterapia (n=70). Con un dintel de ≥ 2/5ml, encuentran una tasa de detección del 19%antesdelacirugíayde27%despuésdeQT.Serelacionóconresecciónquirúrgicaóptima(21%vs34%).ObtuvieronquelapositividadparaCTCserelacionabaconSGdeformasignificativa,tantoantesdecirugíacomodespuésdeQT,aunquenoserelacionóconSLP.

ParasolventarelproblemadeladependenciadelaexpresióndeEpCAMdisponemosde losmétodosde gradientededensidad yde filtraciónpor tamaño, comopor ejemplo losmétodosOncoQuick®yMetaCell®.Wimbergeretal281usanelmétodoOncoQuick®yposteriordetecciónporIHQconanticuerpodeCKsA45-B/B3yEpCAM,aunqueladetecciónsóloalcanzóun21%de lasmuestras(12de57).Kolostovaetal292empleanelmétododeaislamientoportamañoMetaCell®,loquelespermiteobtenercélulasviablesydespuéshacerunaevaluacióncito-morfológica y caracterización de su expresión génica a través de cultivos. Consiguieron

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CTCpositivasenel65%depacientes293.EstegrupoobtuvoquelosgenesmásfrecuentementeelevadosenCEOserosofueronEpCAM,KRT19yMUC1,presentesenel90%deloscasos293.

UnnuevosistemadedetecciónyenriquecimientodeCTCeselusodeunamatrizdeadhesión celular (Cell AdhesionMatrix – CAM), en donde la CTC se uniría a unamatriz decolágenotipoIydespuésingeriríalaproteínadelamatrizmarcada(CAM+),identificandounasubpoblación de CTC con fenotipo invasivo (iCTC)286. Con este método la identificación serealizamediantecitometríade flujomultiparamétricaysemantienen lascélulasviables,conmínimapérdidacelular, loquepermitiríarealizarcultivoscelularesposteriores286.Unestudiosobre 129 pacientes usando la tecnología CAM y confirmando la identidad de iCTC conmarcadoresepiteliales(EpCAM,Ca125,DPP4yCKs)yCD45,aumentódeformaconsiderablelasensibilidad294.Detectó lapresenciade iCTCenel41%deCEOenestadios I y II yenel83%entre todos losestadios,mostrandomejorcorrelaciónconSLEySGqueCa-125.Fanetal295usandolamismatecnologíaen66pacientesdetectóCTCenel61%depacientesytambiénfuefactorpronósticodeSLPaunquenodeSG,aunqueelseguimientofueescaso.LosmarcadoresepitelialesqueusaronfueronEpCAM,ESAyvariasCKs,juntoconCD45.

OtrométodoestudiadotambiénenCEOes laresonanciamagnéticamicro-nuclear276.Se comparóen15pacientes ladeteccióndeCTCporelmétodoCellSearch ypor resonanciamicro-nuclear,presentandomayorsensibilidadlasegunda.LapositividaddeCTCsedioenel20%y87%respectivamente,usandodinteldeCellSearchen≥2/7.5ml,yobteniendounrangodeCTCde0-18(media2)y0-170(media40)respectivamente.

El umbral de positividad de CTC en CEO es otro tema discutido, variando según latécnica empleada. En tumores con mayor diseminación vía hematógena como cáncer demama, el dintel con CellSearch se sitúa en ≥ 5CTC/7.5ml244, pero en tumores con menosdiseminaciónsistémica,comoelCEO,sedisminuyesegúnlostrabajosa≥2CTC/7.5mL288,289,290o≥1CTC/7.5mL277,284, intentandocompensarsensibilidadyespecificidad(vertabla2.13).EneltrabajodeAllardetal278seobtieneentodoslostumoresqueconundintelde1CTC/7.5mlhay una especificidad del 87%, pero con el dintel en ≥ 2CTC/7.5ml subía la especificidad al99.7%.Fanetal295incluye5pacientesbenignosensuestudio,sinqueningunomostraraCTCpositivas (≥1). En el estudio de Obermayr et al277 situando el dintel en ≥1 CTC/7.5 mL,encuentranCTCen2de39sujetossanos(especificidaddel95%).

La detección se ha realizado en lamayoría de estudios al diagnóstico inicial o en larecaída,peroenalgunostambiénseharealizadounadeterminaciónseriadadurantelaQT286.EneltrabajodeWimbergeretal281elvalordeCTCvarióconlaQT.Hubounsubgrupode30pacientesaloscualesseanalizaronCTCantesydespuésdeQT,siendopositivasen5/30(16%)antes y solo uno después, por lo que ellos plantean que se debería analizar su papel comomonitorización del tratamiento. Pearl et al296monitorizaron las CTC durante la QT en 31pacientesdesuseriede123pacientes,encontrandomayorsensibilidaddelasCTCrespectoaCa-125parapredecirprogresiónorecaída.Sinembargo,eneltrabajodeLiuetal290,usandoelmétodoCellSearch, no encontraron relación de la variación de CTC con la QT respecto a larespuestatumoral.

LarelacióndeCTCconelniveldeCa-125tambiénhasidoanalizadayseconfirmaunarelación positiva en la mayoría de las series277, 293, 295 y en el metanálisis de Zhou et al285.Kolostova et al293 observan que CTC se relaciona con el estadio tumoral, ascitis y

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especialmenteconCa-125,ydadoqueenlospacientesconascitistiendenatenernivelesmásaltos de Ca-125, incluso con CTC negativos, postulan que CTC podría reflejar mejor ladiseminaciónhematógenayCa-125elcrecimientoperitoneal.

Además de su enumeración, otro aspecto muy importante es la caracterizaciónfenotípica y genotípica de las CTC. Diversos trabajos han buscado expresiones génicas quepudieran mejorar la detección de CTC, predecir comportamientos de la enfermedad osensibilidad/resistencia a la quimioterapia286. Kuhlmann et al 297 encuentran una relaciónpositiva entre la expresión de ERCC1 (excision repair cross-complementation group 1) y laresistencia a platino al diagnóstico, aunque la expresión fue solo en el 8%de las pacientes,sobreuna tasadedeteccióndeCTCde14%.Obermayret al298estudiannuevosmarcadoresgénicosespecíficosdelasCTCenCEOparamejorarsudetección.Incluyen39controlessanosy216pacientes,haciendodeterminaciónantesdeliniciodeltratamientoy6mesesdespuésdefinalizar la QT. Emplean una técnica de gradiente densidad y extracción de ARN llamadoQiacubeSystem. Sitúaneldintelen≥1/7.5ml,detectandoCTCenel24.5%depacientes. LapresenciadeCTCserelacionóconlapresenciadeascitis,cirugíasub-óptimaynivelesséricoselevadosdeCa-125yHE4,ytambiéntuvoimpactotantoenSLPcomoenSG,aunquesololadeterminaciónhechaenelseguimiento,nolabasal.ElanálisisdeexpresióngénicaserealizópormicroarraysyRT-PCR,obteniendofinalmente11genescomoposiblesmarcadoresdeCTCademásdeEpCAM,siendoelgenCyclophilinaCelmás frecuente,con importante influenciapronóstica. Kolostova et al287 también analizan la expresión génica de CTC para mejorar ladetección,encontrandodiferencias significativasenunpanelde8genes, incluidaEpCAM.ElpanelgénicoplanteadoenambostrabajossólocoincidenenlaproteínaEpCAM.

CONCLUSION

Las CTC serán aquellas células viables presentes en la sangre periférica que poseancaracterísticasantigénicasogenéticasdeunespecíficotipotumoral.Suanálisispodríamejorarnuestro conocimiento sobre la biología del cáncer y el proceso de metástasis, y ser unpotencialvalorpronósticoypredictivoparaindividualizarestrategiasdetratamientoparalospacientes.Sehademostradoserunimportantefactorpronósticoentumorescomocáncerdemama, colon y próstata, pero en CEO el estudio de CTC no ha sido tan concluyente. Losestudios han sido pequeños, losmétodos diferentes, los resultados de los estudios a vecescontradictorios y no siempre han demostrado ser factor pronóstico o predictivo. Losmetanálisisderivadosdeellosmuestran relaciónconelpronóstico,peroestán limitadosporesepequeñotamañodelosestudiosylavariedaddemetodología.

Así pues, el papel de la determinación de CTC en CEO no está bien establecido,necesitandomásestudiosprospectivos.

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2.4. ADN CIRCULANTE PLASMATICO

El estudiode ácidosnucleicos (AN) libres en la circulaciónha sido un área activadeinvestigaciónenmúltiplesdisciplinasmédicasdesdehacemásde60años,conlacomunicacióninicial deMandel y Métais en 1948 (figura 2.19)299,300. El incremento de los niveles de ANcirculantesen lasangre(ADN,mRNAymiRNA)refleja laexistenciadeunprocesopatológicodeaumentodelrecambiocelular,incluyendopatologíasbenignasymalignas301.Duranteestosprocesos, los AN son liberados a la sangre principalmente por células necróticas y restosapoptóticos301.

FIGURA2.19.AcidosnucleicosenplasmadeMandelyMétais(1948).

De:Thierryetal.CancerMetastasisRev2016

Se ha descrito aumento de ADN libre circulante (cfDNA) en diversas patologías noneoplásicas como enfermedades inflamatorias302, traumatismos303, hemodiálisis304, sepsis305,infartoagudodemiocardio306,accidentecerebrovascularagudo307.Engeneral,correspondenapatologíasosituacionesquepresentanunaumentodeldañocelularynecrosis300,301. InclusosehadescritocfDNAelevadoensituacionesdeejerciciofísicointenso300.Unáreadeaplicaciónquepresenta gran interés es el estudiodeADN fetal enplasmade lamujer embarazada308,abriendolapuertaalasesoramientogenéticoprenatalnoinvasivo309.

En oncología, desde hace más de 3 décadas varios trabajos han relacionado lapresencia de AN circulantes libres en plasma con la carga y progresión tumoral301,310. Los

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tumores liberan ADN a la circulación sistémica principalmente a través de la necrosis yapoptosis celular, pero tambiénpor secrecióndirectadesde las células tumoralesdel tumorprimario, de las CTC y de las propias metástasis301,311. Este ADN libre proveniente de lostumoressemezclaconADN liberadoporcélulasnormales, formandoelADNcirculante libretotal (cfDNA). Los pacientes con cáncer tienen niveles de cfDNA mayores que los sujetossanos300. También se ha visto que cuando los niveles de cfDNA semantienen altos tras unacirugíacurativa,podríanindicarlapersistenciadecélulastumorales,conloquepodríaserunmarcadorde laenfermedadmínima residual301. Losniveles varíanentremenosde10ng/mlhastamásde1500ng/ml312.Noobstante,algunosautores indicanqueelcfDNAnoseríaútilcomo biomarcador aislado, debido a su supuesta falta de especificidad, sugiriendo sucombinaciónconotrosbiomarcadores301.

ElADNespecíficodeltumorenelplasma,llamadoADNtumoralcirculante(ctDNA)esunapequeñafraccióndelcfDNAtotalcaracterizadoporlapresenciadealteracionesgenéticasyepigenéticasespecíficasdeltumorprimario300,301,311.Estehecholeconfiereunaespecificidadidóneacomobiomarcadortumoral300.Hastahacepoco,debidoalabajaproporcióndectDNAdentrodelcfDNAtotal,aveces<1%313,ylalimitadasensibilidaddelastécnicasdisponibles,suestudio no ha sido viable, detectándolo sólo cuando había altos niveles de ctDNA300. Laaparición de nuevas técnicas genómicas digitales ha aumentado de forma considerable lasensibilidaddedetección,permitiendoelanálisisdelgenotipodelcfDNA,inclusoenpresenciadefraccionesmuypequeñasdectDNA300.Estohacedeélunadianaatractivaparaeldesarrollocomobiomarcadoryabreunnuevoyprometedorcampodeaplicaciónclínica300.

Otros tipos deAN circulantes son los ARNmensajero ymicroRNA (miRNA), que sonpequeñas moléculas que han mostrado tener un papel importante en la carcinogénesis ytambiénpodríanserbuenoscandidatosabiomarcadores314,315.Variostrabajoshanmostradounimportantevalorpronósticoypredictivoenvariostiposdecánceres316,317,318.

También se han descrito otros elementos circulantes relacionados con procesosneoplásicoscomosonlosnucleosomas,ADNviralyADNensuperficiecelular.Cuandohayunaalta destrucción celular como en tumores de rápido crecimiento o tras quimioterapia, hayaumentoensangrede los llamadosnucleosomas,quesonconjuntosdehistonayunahebradeADNqueencondicionesfisiológicassuelenseratrapadosporlosmacrófagos319.Tambiénseha descrito un aumento deADN viral libre circulante con papel diagnóstico y pronóstico enprocesosneoplásicos.Serelacionanconaquellostumoresendondesonfactoresetiológicos,comovirusEpstein-BarrparalinfomadeBurkittycarcinomanasofaríngeo,virusdehepatitisBpara algunas formas de hepatocarcinoma, y virus del papiloma humano para carcinoma decabezaycuelloycarcinomacervical301,320.SehadescritootrotipodeADNcirculante,queseencuentra situado en la superficie de las células sanguíneas, pudiendo ser otro candidato abiomarcador312. Por ultimo, comentar que está habiendo un creciente interés por losexosomas,micropartículas estables portadoras dematerial genético y proteico, habiéndosedemostradoqueposeenunimportanteyactivopapelenlacarcinogénesis321.

MECANISMOS DE PRODUCCION DE ADN CIRCULANTE

Encircunstanciasfisiológicas,losfagocitoslimpianlamayoríadecuerposnecróticosyapoptósicos de los tejidos, siendo la cantidad de cfDNA normalmente baja301. En procesos

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neoplásicos,debidoal aumentodel recambio celular ydel volumende lamasa celular, estesistema se hace insuficiente, conduciendo a la acumulación de detritus celulares y suinevitableenvíoalacirculación300.

LacantidaddeADNprovenientedeltumordentrodeltotaldecfDNAvaríaenfunciónde múltiples circunstancias, como localización y tamaño del tumor, crecimiento,vascularización300. Se han descrito grandes variaciones de su proporción, pudiendo ir desdemenosdel1%hastaun93%,enfuncióndelacargaydinámicatumoraldeesemomento301,313,322. Los dos principales mecanismos de liberación de ADN tumoral a la circulación son laapoptosis y la necrosis tumoral 301,323. Algunos estudios indican que la apoptosis sería elprocesopredominante,debidoaquelalongitudpredominantedelcfDNAesalrededorde180paresdebases,quese relacionaconcuerposapoptóticos300,322,324,325. Lanecrosisda lugarafragmentosmáslargos324.Otrosmecanismosdeproduccióndescritossonlasecrecióndirectaporpartedeltumorprimario,desdeCTCydesdelascélulasdeloslugaresmetastásicos(figura2.20)301,311,323,.

LacantidaddecfDNAtambiénestá influidaporelaclaramiento,degradaciónyotroseventosfisiológicoscomolacirculaciónsanguíneaylinfática301.Laeliminacióndelacirculaciónse realiza principalmente por vía hepática326. Estudios realizados comparando voluntariossanosconpacientesconinsuficienciarenalcrónicayendiálisis,indicanqueelaclaramientovíarenal es poco relevante 327 . Generalmente, los AN son eliminados de la circulaciónrápidamente. La vida media del ctDNA se estima en aproximadamente 114 min tras lacirugía313.

FIGURA2.20.MecanismosdeproduccióndelcfDNA.

Se muestran diferentes mecanismos de producción del cfDNA, desde las células normales, tejidoinflamatorioycélulasneoplásicas.EnlacirculaciónsecombinanelementoscelularescomoCTC,hematíes,fagocitos,yANcondiferentesalteracionescomomutacionesyanomalíascromosómicas.De:Crowleyetal.NatRevClinOncol2013.

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El cfDNA de origen no tumoral proviene de los tejidos normales, procesosinflamatorios y también se ha indicadoque una proporción importante pudiera provenir decélulas periféricas al tumor, que se destruyen por el propio crecimiento tumoral322, 323. Elmecanismos principal de producción es casi exclusivamente por apoptosis. Por ello, lafragmentaciónensujetosserámásuniformequeenprocesostumorales,endondelafuentedecfDNAesmásvariada328.

METODOS DE ESTUDIO DEL ADN CIRCULANTE

ElcfDNAestácompuestoporADNgenómicoyADNmitocondrial.UsualmenteelADNgenómicocirculaenplasmaenformalibre,peroelADNmitocondrialpuedeirenformalibreoasociadaapartículas301.ElestudiodecfDNApodráfocalizarseenlaenumeracióndelafracciónlibreoladeteccióndealteracionescomometilaciones,alteracióndemicrosatélites,anomalíascromosómicasomutacionespuntuales(corresponderáactDNA)(figura2.21)301,312.

FIGURA2.21.Acidosnucleicoslibresenlacirculación.

El cfDNA puede presentar diversas alteraciones como mutaciones, polimorfismos, metilaciones, alteración demicrosatélites y otros. También en los procesos tumorales de rápida destrucción celular hay presentes en lacirculacióndenucleosomas.De:Schwarzenbachetal.NatRev2011.

LosmétodosquesehanempleadoparamedirelcfDNAhansidovariados,tantoparaelaislamientoypurificacióndecfDNAdelacirculacióncomoparaladetección.DentrodelosprimerossepuedenemplearelmétodoQIAampyprotocoloQAIampmodificado,elprotocoloTritón/Calor/Fenol,laamplificacióndelgenomaenteromediadaporligaduradelosextremosciegos (BL-WGA) o elmétodoNucleoSpin326. Dentro de losmétodos de detección están losbasados en fluorescencia, como PicoGreen y espectrometría ultravioleta, los cuantitativos,comolaPCRensusvariasopciones,sobretodoPCRcuantitativa(qPCR),olatécnicaqMAMBA,ylosmétodosdesecuenciación301,326.

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Una de las formas más extendidas de determinar la concentración de cfDNA esmediante ladeteccióndelafragmentacióndelcfDNA,atravésdesecuenciasnocodificantesdelADNgenómico301.Estassecuenciassonseriesdenucleótidosrepetidos intercaladosenelADN, pudiendo ser secuencias cortas (ALU) o largas (LINE1). Las secuencias ALU(Arthrobacterluteus) son las más abundantes del genoma humano 329 . Naoyuki et al328desarrollan unmétodo para cuantificar la cantidad de cfDNA y su integridad, basándose enestafragmentacióndelADN.ConellointentancuantificarelcfDNAcirculantetotalytambiénintentan hacer una aproximación al cfDNA relacionado con origen tumoral. Parten de lapremisaqueelcfDNAensujetossanosderivaprincipalmentedeapoptosis,estandolamayoríaen torno a 180-200 pares de bases, y el cfDNA de origen tumoral presentará unafragmentaciónmásvariadapuessuorigenesmásdiverso(apoptosis,necrosis,secreción),porloquehabrámásporcentajedefragmentoslargosqueenpersonassanas.Diseñan2primersocebadores para secuencias ALU: el primero con 115 pares de bases (ALU115) amplificasecuencias cortas, generalmente derivadas de apoptosis, y fragmentos largos, de otrosorígenes;elsegundoprimersestáformadopor247paresdebases(ALU247)yamplificasolofragmentoslargosdeADN(figura2.22).Recogen1mldemuestrasanguíneayrealizanunaRT-PCR de las secuencias de ambosprimers para cuantificar el cfDNA (ALU-qPCR) y calculan laintegridad del ADN mediante la razón entre ALU247/ALU115. Como la ALU115 puedenamplificar lamayoríade fragmentosdeADN,suvalordeALU-qPCRrepresentará lacantidadtotaldecfDNA.Lafraccióndelaintegridadserámáspróximaa1cuandomáscercaestátododefragmentoslargos,yseaproximarámása0cuantomásfragmentospequeñospredominen.Latendenciaalvalorde1serelacionaráconprocesotumoral,y latendenciaavalorde0serelacionará con sujeto sano. En el estudio de Naoyuki et al la cuantificación de cfDNA porALU115envoluntariossanosfuede0.34ng/mcLylamediadeintegridadfuede0.13,siendoindependientesdelsexoylaedad.EnpacientesconcarcinomacolorrectalavanzadoelcfDNAfuede1.73ng/mcL,siendosignificativamentemayoresqueensanos(p=0.004),ylaintegridadde0.22,tambiénmáselevadaqueensanos(p=0.006).LascurvasROCdelvalorabsolutoylaintegridad fueron similares, indicando que ambos parámetros tienen un interesante valorcomobiomarcadores.

FIGURA2.22.EficienciarelativadelacuantificacióndecfDNAentérminosdelongituddeADN.

De:Naoyukietal.JClinOncol2006.

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El análisis de ctDNA se realiza mediante la detección en cfDNA de alteracionesespecíficas del tumor, como mutaciones, alteraciones epigenéticas o cromosómicas. Lamayoríadeestudiossefocalizanenladeteccióndemutacionespresenteseneltejidotumoral.Debidoalabajafrecuenciadealgunasdeestasmutaciones,hastahacepocosuestudionoerafactibleolosresultadoserancontradictorios323.Graciasalaaparicióndenuevastécnicasconunamuyaltasensibilidad,comolosmétodosdeplataformadigitalysecuenciacióndenuevageneración, actualmente se puedan realizar estudios viables de ctDNA (figura 2.23). Laapariciónde laPCRdigitalhapermitidoaumentar lasensibilidadde ladeteccióna límitesde0.1%omayores, y realizar una cuantificación absoluta en lugar de relativa que se hace conqPCR300, 326. Una de las plataformas digitales es la llamada BEAMing (Beads, Emulsions,AmplificationandMagnetics),quealcanzaunfactordedetecciónde10.000a1.

FIGURA2.23.MetodologíasdeestudiodelctDNA.

De:DíazyBardelli.JClinOncol2014

UnodelosproblemasprincipalesenlaevaluacióndecfDNAeslagranvariedadyfaltadeestandarizacióndelosmétodos,desdelastécnicasdeaislamientohastalaidentificación.Laextracción de cfDNA se puede realizar por varios métodos (diversos kits comerciales,protocolos individuales), incluso hay discusión sobre si es mejor el estudio sobre plasma osuero.Debidoa la existenciadediferentesprotocolos yplataformasparael análisis, resultadifícillacomparación.Porello,esdesumaimportanciaestandarizartodoelproceso193,301,330.

ADN LIBRE CIRCULANTE

Los pacientes con cáncer tienen niveles de cfDNAmayores que los sujetos sanos300.EstudiosendiferentestumoreshanmostradoquelaconcentraciónycaracterísticasdelcfDNApuedentenerundestacablepapelcomopotencialbiomarcador(tabla2.12).ElprimertrabajopublicadofuedeLeonetal310en1977.CompararonlacuantificacióndecfDNAmedianteradio-inmunoensayo de 173 pacientes con varios tipos de cáncer frente a 55 sujetos sanos.Obtuvieron cifras más altas en pacientes neoplásicos que en sanos, y en pacientesmetastásicos más que en enfermedad localizada. Resultó interesante que tras tratamientopresentaron reducción de las cifras de cfDNAque se relacionó con la respuesta tumoral. LapersistenciaoelevacióndecfDNAserelacionóconmalaevoluciónclínica.

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Introducción

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TABLA2.12.EstudiosconcfDNAendiversasneoplasias.Trabajo Método Pacientes Cuantificación

cfDNA

IntegridadcfDNA

Valor

Leonetal1977

RIA 55sanos173variostm

13ng/ml180ng/ml

Pronóstico

Sozzietal2003

hTERT-qPCR 100sanos100pulmón

3.1ng/mL24.3ng/mL

DiagnósticoMonitorizaciónScreening

Herreraetal2005

Actina-qPCR 11sanos51benignos83torácicos

11mcg/L432mcg/L819mcg/Lp=0.02

Diagnóstico

Naoyukietal2006

ALU-qPCR 51sanos32colon

0.34ng/mcL1.73ng/mcLp=0.004

0.130.22p=0.006

Predictivo

Naoyuki et al2006

ALU-qPCR 51sanos83mama

p.130.29p<0.001

Schwarzenbach2008

Espectrofotometría 20sanos55colon

7ng/mL868ng/mL

Pronóstico

Schwarzenbach2009

Espectrofotometría 10sanos69próstataL12próstataM

21ng/mL186ng/mL562ng/mLp=0.03

Comparación entrecfDNA, CTC einestabilidadmicrosatélites

Parketal2012

ALU-qPCR 59sanos54gástrico

29.8ng/ml71.4ng/mlp<0.001

Diagnóstico

Hashadetal2012

hTERT-qPCR 27sanos42mama

PronósticoPredictivo

Salviantietal2012

APP-qPCR 63sanos76melanoma

DiagnósticoMonitorización

Delgadoetal2013

ALU-qPCR 20sanos19próstata

Monitorización(integridadcfDNA)

El-Gayaretal2016

ALU-qPCR 20sanos10benignos50colon

2.8ng/mcL2.0ng/mcL4.6ng/mcLp=0.002

0.1730.31.54p<0.001

DiagnósticoMonitorización

Fawzyetal ALU-qPCR 30sanos25benignos50próstata

0.1ng/mcL17.2ng/mcL408ng/mcLp<0.001

0.030.100.29p<0.001

Diagnóstico

RIA=radioinmunoensayo;Tm=tumores;próstataL=próstatalocalizada;próstataM=próstatametastásicaqPCR:Reacciónencadenadelapolimerasacuantitativa

Desdeentoncessehanrealizadomuchosestudiosenmúltiplestumores,aunquecondiferentesmétodosydiferentemetodología.Herreraetal331proponenelusodeqPCRusandolasecuenciadeADNgenómicadebeta-actinaparalamedicióndecfDNAentumorestorácicos.Para ello comparan 83 pacientes con tumores torácicos (esofágicos y de pulmón) con 51pacientesdeenfermedadbenignaporreflujoy11sanos.Obtuvieronmayorescuantificaciones

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enpacientesconcáncerqueenfermedadporreflujodeformasignificativa(819mcg/Lvs432mcg/L, p=0.02). No obstante, el mismo grupo analizó otras muestras obtenidas de formaprospectivasinhallardiferenciasentrelostresgrupos.

Nayouki et al328 comparan mediante ALU-qPCR el valor absoluto de cfDNA y laintegridad de ADN en 32 pacientes con carcinoma de colon frente a voluntarios sanos,obteniendo diferencias significativas en los dos valores analizados, con valor predictivo. El-Gayaretal332aplicanelmismométodoen50pacientestambiénconcarcinomadecolonyloscomparancon20personassanasy10pacientesconpóliposdecolon,obteniendodiferenciassignificativasencuantificaciónyvalordeintegridaddelcfDNA.ObtienenquelaintegridaddelcfDNAesuníndicesuperioralacuantificación,conmejorperfilcomobiomarcadortantoparadiagnóstico comoparamonitorización, incluso también con valor en screening. Presenta unAUCdelacurvaROCde0.9frentea0.73delacuantificación.

Delgadoetal333midenelcfDNAenpacientesdepróstatatambiénmedianteALU-qPCR.Comparan19pacientesconcáncerdepróstatacon20sujetossanos.Recogen4mldesangreal diagnóstico y a los 3 y 6mesesdespués.Hubo correlaciónentrePSA y cfDNAa los 3 y 6meses,peronoaldiagnóstico.HubounaumentodelacuantificacióndecfDNAalos3mesesquenoserelacionóconelniveldePSAniotrosparámetrosclínicos.Noobstante,laintegridadde cfDNA tuvomejor correlación con la evolución. El ratio de integridadALU247/ALU115 aldiagnósticoesmenorde1%soloenel8.5%,a los3mesesde74%ya los6mesesde100%.Estehechoindicalaprogresivadisminucióndefragmentoslargos,porreduccióndelanecrosiscomo fuente de cfDNA, y el aumento del origen en cuerpos apoptósicos. Se sugiere que elratiodeintegridadpodríaseruncandidatoabiomarcadorparamonitorizarlaenfermedad.

Fawzyetal334tambiénencarcinomadepróstata,comparaungrupode50pacientescongrupodetumoresbenignosycontrolessanos.EncuentrandiferenciassignificativasentrelostresgruposparacfDNA115,cfDNA247ylaintegridaddecfDNA.ObtuvieronqueelvalordecfDNA115fueelquepresentabamayorvalorclínicoparadiferenciarpacientemetastásicodelnometastásico.

Encarcinomadecolon,Schwarzenbachetal335analizanlarelevanciaclínicadecfDNAusando espectrofotometría (fotómetroNanoDrop). Comparan 55 pacientes con enfermedadmetastásica y 20 controles sanos, obteniendo diferencias significativas de concentración decfDNAentreelgrupodepacientesyelgruposano(868ng/mlvs7ng/ml).LospacientesconmayoresnivelesdecfDNApresentaronpeorsupervivencia(p=0.02).Nohuborelaciónconlosparámetrosclínicosdelospacientes.TambiénhacendeterminacionesposterioresdecfDNAen14delospacientes,sugiriendounpapelenlamonitorizacióntraseliniciodeltratamiento.

Parketal336analizan54pacientesconcáncergástricocon59controlessanosmediantela tecnología ALU-qPCR, pero usando secuencias deALU con 81 pares de bases en lugar de115. Obtienen que el cfDNA fue 2.4 veces más alto en pacientes que en el grupo control.Alcanzaronunasensibilidadde75%,especificidadde63%yunáreabajolacurvaROC0.78.ElmismogrupocomparóALU-qPCRconespectrofotometría (NanoDrop1000,NanoDrop3300),siendo superior ALU-qPCR. También compararon lamedición en suero y en plasma, siendoestaúltimamásfiablequeensuero,endondehabíaunamayorvariabilidad.

Sozzietal337tambiénempleanRT-PCRperoamplificandoelgenhTERT(hTERT-qPCR),con98paresdebases.Comparan100pacientesconcáncerdepulmónnomicrocíticoy100

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controlessanos.EncuentrannivelesdecfDNAmayoresenpacientesfrenteacontroles(24.3vs3.1 ng/mL), con un AUC de la curva ROC de 0.94 (95%IC 0.91-0.97). Los valores se vieroninfluidosporlaedad,peronoserelacionaronconotrosdatosclínicosnipatológicoscomoelvalordeKi67olaexpresióndeEGFR.Unasegundamuestraen35pacientesserelacionóconlaevoluciónclínica,presentandounamayorcfDNAlosquepresentaronrecaídafrentealoslibresde enfermedad (7.1 vs 24.7 ng/mL, p=0.002). Los autores valoran su papel diagnóstico y demonitorización,ysugierenunposiblepapeldescreeningensujetosdealtoriesgo.

En cáncer de mama, Hashad et al338también usan hTERT-qPCR para comparar 42pacientesconcáncerdemamacon27sujetossanosy30pacientesconlesionesbenignas.ElcfDNAfuesignificativamentemayorenlospacientesconcáncerqueenlosotrosdosgrupos,yestuvo asociado con el estadio, tamaño tumoral, afectación ganglionar y grado histológico,sugestionando un valor pronóstico. La curva ROC para diferenciar lesiones malignas decontrolessanos,presentóunasensibilidadde97.6%,especificidaddel96.3%,valorpredictivopositivode97.6%ynegativode96.3%.

Debido a la falta de especificidad del cfDNA frente al ctDNA para discriminar entrepacientes y sanos, Salvianti et al339intentan responder a esta cuestión en pacientes conmelanoma.ComparanelvalordiagnósticodelaconcentracióneintegridaddecfDNAfrenteactDNA basado en la mutación BRAF-V600E y en la metilación de RASSF1A. Incluyen 76pacientesconmelanomacon63controlessanosyempleanqPCRcondossecuenciasdelgenAPP,con67y180paresdebases.ObtienenqueelparámetroconmejorcapacidaddiagnosticafuelaconcentracióndecfDNAseguidadelaintegridadydespuésdectDNA.LaconcentracióndecfDNAalcanzóenelanálisisunivarianteunAUCde0.85yunaOddsRatio (OR)de5.6, laintegridad180/67unáreade0.76yunaORde4.8, lametilaciónRASSF1AunAUCde0.69yunaORde1.4ylamutaciónBRAFunAUCde0.64yunaORde6.1.Tambiénvieronqueestosnuevosbiomarcadorespudierantenerpapeldemonitorizaciónconeltratamiento.

Naoyukietal340realizanunestudiosimilaralanteriordecolonperoenpacientesconcáncer demama conqPCRde secuenciasALU. También encuentrandiferencias entre grupocontrolypacientes,conaumentodelvalorabsolutodecfDNA115,cfDNA247ylaintegridaddecfDNA.Lacomparaciónde lostresvaloresmuestraque la integridaddecfDNApresentaunamejorcorrelaciónconelestadiotumoral.Laintegridadserelacionóconelestadio,lainvasiónlinfovascular,afectaciónganglionaryeltamañotumoral.

Otra cuestión es la comparación cfDNA con otros biomarcadores. Schwarzenbach etal 341 estudian en 10 sujetos sanos y en 81 pacientes con cáncer de próstata, 69 conenfermedad localizada y 12 metastásica, el valor de cfDNA, CTC y la inestabilidad demicrosatélites. El ADN fue evaluado por espectrofotometría (espectrómetro NanoDrop ND-1000),lasCTCporelsistemadeinmunospotsPSA-EPISPOTylainestabilidaddemicrosatélitescon un panel de 14 marcadores. Obtienen diferencias significativas de la cuantificación decfDNAentresanosypacientes,yentreenfermedadlocalizadaymetastásica,inclusoobservanrelación con el estadio de la enfermedad (p<0.005). La detección de CTC fue del 71% enlocalizados y de 92% en metastásicos, y ninguno en la cohorte sana. La detección deinestabilidaddemicrosatélitesfuedel45%enlocalizadosyde58%enmetastásicos,yningunoenlossujetossanos.LapresenciadeCTCnoserelacionóconcfDNAperosiconlapresenciadeciertasalteracionesdemicrosatélites,reflejandolarelaciónentreCTCyctDNA.

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Enconclusión,dadalafácilaccesibilidadalplasmayADNsérico,sualtasensibilidadylaposibilidaddeserreflejofiabledelacargatumoral,hahechoquesuanálisishayaatraídoelinterés científico, pudiendo ser el cfDNA un biomarcador diagnóstico, pronóstico y demonitorización301.

ADN LIBRE CIRCULANTE EN CÁNCER DE OVARIO

En cáncerdeovario tambiénestánapareciendoestudiosqueaboganporunposiblepapelcomobiomarcador(tabla2.13).EnmodelomurinodecáncerdeovariosehavistoqueelcfDNA se relaciona con la carga tumoral y se modifica en función de la respuesta altratamiento,mostrándosecomounpotencialbiomarcadordemonitorización311.

TABLA2.13.EstudiosconcfDNAencarcinomadeovario.Trabajo Método Pacientes CuantificacióncfDNA ValorKamatetal2006

qPCR(varios-1)Plasma

12sanos19CEOIII-IValtogrado

1010529918p=0.009

Diagnóstico

Zachariahetal2008

GAPDH-qPCRPlasmaysuero

36sanos24benignos23endometriosis21CEO

1708GE/mL(p=0.01)2000GE/mL(p=0.03)2185GE/mL(p=0.63)3690GE/mL

DiagnósticoNovalorpronóstico

Capizzietal2008

hTERT-qPCRPlasma

22CEOenQTNA50sanos

29,6ng/mL6,4ng/mL

PronósticoPredictivo

Wimbergeretal2010

PicoGreenSuero

28sanos62CEOIB-IV

PronósticoPredictivo

Kamatetal2010

Globina-qPCRPlasma

75sanos49benignos164CEO

1912GE/mL2365GE/mL10113GE/mLp<0.0001

PronósticoPredictivo

Noetal2012

RT-PCR(varios)Suero

16benignos36CEOI-IV

Novalorpronóstico

Schilderetal2012

RT-PCR(varios-1) 23CEOresistentes Novalorpronóstico

Steffensenetal2014

Ciclofilina-qPCRPlasma

144CEOresistentes-BV 5150alelos/mL Pronóstico

CEO=CarcinomaEpitelialdeOvario;GE=Equivalentegenómico;BV=bevacizumab;qPCR:Reacciónencadenade lapolimerasacuantitativa;varios-1=GADPH,beta-actinaybeta-globina;QTNA=quimioterapianeoadyuvante

Wimberger et al342analizaron en 62pacientes conCEOestadios IB-IV y 28 controlessanoselvalordelacuantificaciónséricadecfDNA,determinadomedianteQuant-iTPicoGreendsDNA Kit-Invitrogen, y lo relacionaron con otros biomarcadores (nucleosomas circulantes,actividaddeproteasasycaspasas,célulastumoralesdiseminadasenmédulaósea).Realizóladeterminaciónantesydespuésdeltratamientoadyuvante.ElgrupodepacientespresentóunaconcentraciónmáselevadadecfDNAqueelgrupocontrol(p=0.0001),yen lospacientesfue

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mayor antes que después de la quimioterapia (p=0.048). Un nivel alto antes de la QT serelacionó conmayor riesgode recaída (p0.02), presenciademetástasis (p0.05) y conpeorsupervivencia(p=0.01).Unacirugíaprimariasub-óptima(enfermedadresidualmayorde1cm)se relacionó con niveles altos de cfDNA de forma significativa (p=0.0001). Los autoresconcluyen que el cfDNA podría representar un nuevo biomarcador pronóstico y predictivo,mejorquelosotrosbiomarcadorescomparados.

Hay que tener muy presente la metodología usada. No et al 343 usaron qPCRamplificando4genes(B2M,RAB25,CLDN4yABCF2),nohallandodiferenciasdecfDNAentre36pacientes conCEOy16controles con tumoresbenignosdeovario. Sinembargo,enotroestudio usando también qPCR pero amplificando otros genes (GAPDH, beta-actina y beta-globina), Kamat et al344encuentran niveles de cfDNA mayores en el grupo de pacientesrespectoalgrupocontrolconlostresgenes.

Zachariah et al345incluyen en su estudio a 36 controles sanos, 24 tumores ováricosbenignos,23endometriosisy21pacientesconCEO.EmpleanqPCRamplificandoGAPDHsobre500 mcL de plasma y suero. Los valores en suero no mostraron diferencias significativas,probablementeporelposibleartefactodebidoalprocedimientodeaislamientodelsuero.Losvalores en plasma simostraron diferencias, encontrando nivelesmás elevados en pacientesconCEOqueenel grupocontrol (p=0.009) yde tumoresbenignos (p=0.027), y también fuemayorqueenelgrupodeendometriosisperonollegóallímitedelasignificación(p=0.63).Lacurva ROC entre cáncer y sanos/tumores benignos muestra una sensibilidad de 74%,especificidadde69%yunAUCde0.72.Sinembargo,noencontraronrelacióndelosnivelesdecfDNAconlaevolución,volumentumoralyestadio.

Capizzietal346estudianelpapeldelacuantificacióndecfDNAantesydespuésdelaQTen pacientes con CEO. Incluyen 22 pacientes que reciben QT neoadyuvante y cirugía deintervalo. Lasmuestras se obtienen antes de cada ciclo, y antes y después de la cirugía deintervalo.EmpleanqPCRamplificandoelgenhTERT.Encuentranquelamonitorizaciónduranteel tratamientoconQTNApresentavalorpredictivoderespuestaacirugía.Además,obtienenque también presenta valor pronóstico de supervivencia libre de progresión. En su estudio,cfDNAalcanzóunasensibilidaddel77%yespecificidaddel96%paradiferenciarpacientesdecontroles.

En un estudio prospectivo alemán en pacientes con CEO resistente tratados con elantiangiogénico bevacizumab, Steffensen et al347analizan el valor de la concentración decfDNAenpacientesenrecaídaresistente.UsaronRT-PCRcon1mldeplasmaamplificandoelgenciclofilina-A.NohallarondiferenciasentreelvalordecfDNAyelvalordeCa125niotrosparámetros como el estadio, histología, grado tumoral o tasa de respuesta con criteriosradiológicos RECIST, pero sí mostraron relación con el estado general ECOG, la respuestatumoral serológica por medición de Ca125 y el pronóstico. Los valores altos de cfDNA serelacionaron fuertemente con la supervivencia libre de progresión (p=0.0004) y lasupervivenciaglobal,conSGde8.1mesesfrentea5.0mesesparabajoyaltoniveldecfDNA(p=0.005).LaHRfuede1.98(p=0.002)paraSLPyde1.66(p=0.02)paraSG.

Sin embargo, en un fase II del GOG de evaluación de dasatinib en 26 pacientesresistentes, se analizó la concentración de cfDNA medida por qPCR con los genes GADPH,

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beta-actinaybeta-globina,no relacionándosecon laevolucióndelpaciente,ni con la SLPniconlaSG348.

Kamatetal349estudianelvalordecfDNAcomobiomarcadorpredictivodel resultadode la cirugía peritoneal. Incluyen a 164 pacientes con CEO, 49 neoplasias benignas y 75controles. La metodología usada fue qPCR amplificando beta-globina y se determinó elnúmerodeequivalentesgenómicos(GE)pormL.ElgrupodeCEOpresentaronunvalormayorde cfDNA (10113 GE/mL), comparado con el grupo de neoplasias benignas (2365 GE/mL,p<0.0001)yconelgrupocontrol(1912,p<0.0001).Lasdiferenciasentreelgrupodeneoplasiasbenignasycontrolesnofuesignificativo.Valoresaltosserelacionarondeformasignificativaenelanálisismultivarianteconelestadioycon lacirugíasub-óptima.Losvaloresaltostambiénfueron factores pronósticos independientes tanto de SLP como de supervivencia global (HRparamortalidadde2.83(p<0.001).Sesituólasensibilidaden87%ylaespecificidaden87%.

Un reciente metanálisis de 9 estudios, incluyendo 462 pacientes y 407 controles,muestra que el análisis cuantitativo de cfDNA presenta una baja sensibilidad (0.70; 95% IC0.65-0.74)peroaceptableespecificidad (0.90;95% IC0.87-0.93)350. LaORdiagnostica fuede26.05(95%IC14.67-46.26)yelAUCfuede0.89(95%IC0.83-0.95).Noobstante,losestudiosson pequeños, la mayoría retrospectivos y existen gran heterogeneidad. Sugieren que senecesitandeestudiosprospectivosgrandesparavalidar laaplicaciónclínicadecfDNA, tantoindividualcomoencombinaciónconotrosbiomarcadores.

Así pues, la detección de cfDNA puede ser una nueva herramienta para mejorar elmanejoclínicodelpacienteconcáncerdeovario,conpapeltantoeneldiagnósticocomoeneltratamiento y pronóstico. No obstante, los resultados aún no son concluyentes, todavíaquedanmuchaspreguntasporresponder,por loquesenecesitanmásestudiosprospectivosque avalen los resultados. Adicionalmente, el cfDNA es una fuente para la identificación demutacionesrelacionadasconeltumordeunaformanoinvasiva,algunasdelascualespodránsercandidatasanuevasdianasterapéuticas.

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3. Hipótesis y Objetivos

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Hipótesis y Objetivos

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Hipótesis y Objetivos

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JUSTIFICACIÓN Y PERTINENCIA DEL ESTUDIO

El carcinomaepitelialdeovario (CEO) supone la segundaneoplasiaginecológicamásfrecuente y la demayormortalidad. Se trata de una enfermedad inicialmentemuy quimio-sensible,conaltastasasderespuestaaquimioterapia(QT)basadaenplatinoyaltosíndicesderesección quirúrgica completa. Sin embargo, aproximadamente un 20-30% de pacientes noresponderán al tratamiento inicial con QT y, de las pacientes en estadios avanzados querespondan al tratamiento, hasta un 75% presentarán recaída tumoral. La enfermedadrecurrenterepresentará,enlamayoríadeocasiones,unaenfermedadincurablequeprecisarátratamientoindefinidoconquimioterapia.Finalmentedesarrollaráresistenciaaltratamientoyfalleceránporlaenfermedad.

La valoración de la respuesta tumoral se basa en criterios clínicos, radiológicos yserológicos. Los dos únicos biomarcadores (BM) aprobados en el CEO son el Ca 125 y HE4,aunque presentan limitaciones de sensibilidad y especificidad. Su utilidad principal será lamonitorizacióndelarespuestaaltratamientoyelseguimientodelapaciente.

El alto índice de recaída del CEO avanzado y el mal pronóstico de la enfermedadresistente,juntoconlaslimitacionesdelosBMactuales,hallevadoaunabúsquedadenuevosindicadoresynuevasestrategiasterapéuticasparamejorarlosresultadosdelostratamientos.NumerosasinvestigacionesevalúannuevosBMcapacesdelograrunavaloraciónmássensibley específica de la enfermedad. Algunos presentan resultados prometedores pero,lamentablemente, los estudios actuales son de pequeño tamaño y con resultados a vecescontradictorios, empleando diferentes técnicas y metodología de análisis que dificultan lacomparación y validación de sus resultados. Son necesarios estudios que aporten másinformaciónsobresurelevanciaclínica.

Una de las vías de estudio es analizar el papel que juegan las células tumoralescirculantes(CTC)yácidosnucleicosenlosprocesosoncológicos.ElestudiodeCTCyADNlibrecirculante (cfDNA) puede mejorar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de laenfermedad y el proceso de diseminación sistémica, aportar información pronóstica ypredictiva,ytenerprobableinfluenciaenlatomadedecisionesterapéuticas.

En el presente trabajo se ha analizado de forma prospectiva el valor clínico de dosnuevosBMcirculantescomosonlasCTCycfDNA,ysehancomparadoconlosbiomarcadoresya establecidos Ca125 y HE4. Hemos comparado su valor predictivo de respuesta a la QTbasada en platino y el resultado de cirugía, y su valor pronóstico de supervivencia libre deprogresiónysupervivenciaglobal.

Porello,hemosplanteadoelsiguienteestudioobservacionalprospectivoenpacientesconcarcinomaepitelialdeovario,trompadeFalopioyperitonealprimario,enfaseavanzadadeenfermedad.

MuchosesfuerzosdebenserañadidosparamejorarnuestroconocimientodelCEOyasí aportar beneficios en esta devastadora enfermedad. SegúnMichaelM. Gottesman et al(NatRevCancer2002),“Lamutabilidadyheterogeneidaddelascélulastumoralessiemprelesproporcionará lamanera de superar la resistencia, no importa lo nuevo o importante de ladrogaanti-cáncer”.Nuestramisiónseráaprenderaidentificarymanejaresasituación.

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Hipótesis y Objetivos

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HIPÓTESIS DE TRABAJO

El análisis de células tumorales circulantes y ADN libre circulante plasmático puedesuponer dos nuevos biomarcadores con mayor capacidad predictiva y pronóstica delcarcinomaepitelialdeovarioavanzadoquelosbiomarcadoresactualmenteestablecidos.

En caso de confirmarse nuestra hipótesis, aportaríamos dos nuevos biomarcadoresque mejorarían la valoración clínica de la paciente y nos ayudarían a optimizar nuevasestrategiasdiagnósticasyterapéuticasdirigidasaestapoblaciónneoplásica.

OBJETIVOS DEL ESTUDIO

ObjetivoPrincipal

Determinar el valor pronóstico de las células tumorales circulantes y ADN librecirculanteenplasmaenelCEOavanzado.

Se determinará la capacidad pronóstica que presentan los BM respecto a lasupervivencialibredeprogresiónysupervivenciaglobaldelaspacientes.Seanalizarátantosuvalorbasalycomolavariaciónentreelvalorbasalytraselprimerciclodequimioterapia.Elresultado se comparará con los BM de referencia Ca-125 y HE4, para valorar el verdaderobeneficioqueaportaríanenlaprácticaclínica.

ObjetivosSecundarios

1. DeterminarelvalorpredictivoderespuestadelosnuevosBMenelCEOavanzado.

Paraanalizaresteobjetivo,sedeterminaráelvalorquepresentanlosBMrespectoalarespuestatumoraldelapacienteentresaspectos:

- Respuesta tumoral tras finalizar todo el tratamiento de quimioterapia y cirugíaplanificado.

- Respuestatumoraltrascompletareltratamientoconquimioterapianeoadyuvanteprevioacirugíadeintervalo.

- Resultadodelacirugíaperitoneal.

El resultado se comparará con los BM de referencia Ca-125 y HE4, para valorar elverdaderobeneficioqueaportaríanenlaprácticaclínica.

2. Determinar la influencia que tienen las características clínicas de las pacientes en elvalordelosBM.

Se analizarán cuales son las características del tumor y de las pacientes quedeterminanunvalordiferentedelosBM.

3. DeterminarlainfluenciaquetienenlostratamientosenelvalordelosBM.

VamosaestudiarcomolostratamientosaplicadosinfluyenymodificanelvalordelosBM, para valorar su papel en la monitorización de la terapia. Para ello, se hanestablecidodeterminacionesseriadasduranteeltratamiento.NosehanevaluadoCTC.

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Hipótesis y Objetivos

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4. Estudiocomparativode losnuevosBMen lamuestrapacientes respectoaungrupocontroldetumoresováricosbenignosygrupodesujetossanos.

Se valorará en qué medida los BMmuestran diferencias en el grupo de pacientes,respecto a un grupo control de tumores ováricos benignos y un grupo control desujetos sanos. Se determinará la capacidad de cada BM para discriminar entrepacientesysujetossinCEO,juntoconsusensibilidadyespecificidad.

5. DeterminarlarelaciónexistenteentrelosdiferentesBManalizados.

Serealizaráanálisisdecorrelacióndevariablesparadeterminarsi lavariaciónen losvaloresdelosBMenlaspacientessiguealgúnpatrónodinámicacomún.

6. Estudio descriptivo de las variables clínicas de nuestra serie y análisis de su valorpredictivoypronóstico.

Vamos a realizar un análisis descriptivo de las diferentes variables clínicas paraconocer las características de nuestra serie y hemos estudiado su valor predictivo ypronóstico,paraintegrarlasenunanálisismultivariantefinalyvalorarsuinfluenciaenlosBMplanteados.

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Hipótesis y Objetivos

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4. Material y métodos

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Material y métodos

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Material y métodos

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4.1. DISEÑO DEL ESTUDIO.

Estudio observacional prospectivo longitudinal no aleatorizado multicéntrico paradeterminación del valor predictivo y pronóstico de dos nuevos biomarcadores (BM)plasmáticosenel carcinomaepitelialdeovario, trompadeFalopioyperitonealprimario,enestadioavanzadodepresentación(estadios II-Bal IV)orecaídasensible.LosnuevosBMhansidocélulastumoralescirculantes(CTC)yADNlibrecirculanteplasmático(cfDNA).

Enelpresentetrabajo,nohahabidoningúntratamientoexperimentalaestudio.Laspacientes fueron valoradas por un comité de tumores ginecológicos y carcinomatosis ytratadassegúnlasguíasclínicas.

SeharealizadodeterminaciónbasaldelosnuevosBMantesdeliniciodeltratamientoydeterminacionesseriadasduranteelmismo,paravalorarsupapelenlamonitorizacióndelaterapia. Los valores se han comparado con los BM de referencia Ca-125 y HE4. El estudioincluyeungrupocontrolde15pacientescontumoresováricosbenignosy15sujetossanos.

La medición de cfDNA se ha realizado mediante las secuencias Alu-115 y Alu-247,estableciendo3valoresaestudiar:cfDNA115sehadeterminadoporelvalordelasecuenciaAlu-115, cfDNA247 por el valor de la secuencia Alu-247 y la integridad de cfDNA ha sidodefinidaporelcocientedecfDNA247/cfDNA115328.ElestudiodecfDNAseharealizadoen1mldeplasmamediantePCRcuantitativa(qPCR).

Las CTC se han analizado mediante el método CellSearch®. Se ha considerado unresultado positivo de CTC cualquier presencia confirmada de CTC en la muestra sanguínea(mayoroiguala1CTC/7.5mLdesangreperiférica).

Sehaestimadountamañomuestraltotalde90pacientes,arazónde30pacientesporaño durante un periodo de 3 años. Los estudios estadísticos se han llevado a cabo con elsoftwareSPSSv.20.0.

El estudio ha sido valorado por el Comité de ética del Hospital Clínico UniversitarioVirgendelaArrixacaemitiendodictamenfavorableel27demayode2013(anexoVI).

4.2. POBLACIÓN A ESTUDIO.

Se han incluido pacientes con diagnóstico actual de carcinoma epitelial de ovario,trompadeFalopioyperitonealprimario,enestadioavanzadodepresentación(estadioIIB-IV)orecaídasensiblequeiniciantratamientoconquimioterapia.

CRITERIOSDEINCLUSION

1. Diagnóstico actual de carcinoma epitelial de ovario, trompa de Falopio yperitonealprimario,confirmadoydocumentadohistológicaocitológicamente,enestadioavanzadodepresentación(IIB-IV).

Dadoquelaestadificaciónesquirúrgica,sehasupuestoquepresentabanestadioavanzadoaldiagnósticoenestasdossituaciones:

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Material y métodos

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- HallazgosenpruebasdiagnósticasdeimagendeunaestadificacióncompatibleconIIBosuperior.Sehaadmitidodiagnósticoporimagenmedianteecografíavaginal,tomografíacomputerizada(TC),resonanciamagnética(RM)oPET/TC.LaclasificaciónTNMyFIGOdelCEOseexponenenelanexoI.

- Hallazgos de tumoración ovárica sugestiva de origen neoplásico conestadificación por imagen inferior a IIB pero que con un valor de Ca-125superiora350.

2. Carcinomaepitelialdeovario,trompadeFalopioyperitonealprimario,enrecaídatumoralsensibleaquimioterapiabasadaenplatino.

Se ha considerado recaída sensible aquella que ocurre tras respuesta a unesquemadequimioterapiabasadoenplatinoyquepresentanrecaídatumoraloprogresión tras 6 meses de intervalo libre de tratamiento. Se ha admitido eldiagnósticoderecaídaatravésdeconfirmaciónhistológicaporcitologíaobiopsia,o a falta de estudio patológico, por pruebas de imagen y clínica compatible oaumentodeCa-125(anexoIV).

3. Sehanadmitidode formaprovisionalpacientes sin confirmaciónhistológica,enaquellas situaciones en donde se indicó cirugía primaria aún sin estudiopatológico, debido a una alta sospecha de CEO por la presentación clínica,analíticayradiología.Enestoscasos,paralainclusióndelapacienteenelestudio,se revisaron de forma exhaustiva que cumplieran el resto de criteriosestablecidos.Seadmitióestepuntoparaobtener lasmuestrassanguíneasantesdelacirugía.ParaelanálisisderesultadossolosehanincluidoaquellasendondeseconfirmóelCEOenelestudiopatológico.

4. Elpacientedebesercandidatoyaceptartratamientoconquimioterapia.

5. Otorgarelconsentimientoinformadoparaparticiparenelestudio.

6. Mujeresmayoresoiguala18añosdeedad.

7. NoprecisalesióndianaparacriteriosRECIST.

8. No se determinan límites en los valorares de laboratorio necesarios paraparticiparenelestudiodadoquenohaymedicaciónaestudio.

CRITERIOSDEEXCLUSION

1. Tumoresnoepitelialesdeovariooepitelialesdebajopotencialmaligno.

2. Carcinomadeovario,trompasdeFalopiooperitonealprimario,enestadiomenordeestadioIIByquepresentenunvalordeCa-125menoroiguala350.

3. PacienteentratamientoactualconquimioterapiaparaCEOoconrecaídaplatino-resistente.

4. Pacientequenodesea recibir o no sea candidata a tratamientooncológico conquimioterapia.

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Material y métodos

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5. Pacientediagnosticadodeotrapatologíaneoplásicade relevanciapronósticaenlos dos años anteriores. Se exceptúan el carcinoma in situ de cérvix omama, ycarcinomabasocelularoescamosodepiel.

6. Patologíanoneoplásicaconpronósticovitalinferiora1año.

7. Incapacidadparacooperaryrealizarelprotocolodelestudio.

Sehanincluidoenelpresentetrabajo2gruposcontroles.Porunaparte,ungrupodepacientes con tumores benignos. Se han seleccionado entre las pacientes con patologíaovárica sugestivadebenignidadque seprogramabanpara cirugíaginecológicaporpartedelservicio de ginecología. Tras ser informada de las condiciones del estudio, la paciente hafirmado los dos consentimientos informados (anexos VII y VIII) y se ha realizado extracciónsanguínea antes de la intervención, junto a analítica solicitada por indicación médica, paraevitarunanuevavenopunciónalapaciente.

Por otro lado, se ha incluido un grupo demujeres sanas voluntarias, seleccionadosentre familiares y compañeras del centro hospitalario, atendiendo a criterio de edad parahacer lamuestrasimilaralgrupodepacientes. Igualqueconelgrupodetumoresbenignos,tras ser informada de las condiciones del estudio, la paciente ha firmado los dosconsentimientosinformados(anexosVIIyVIII)yseharealizadoextracciónsanguíneaantesdela intervención. Esta analítica ha sido solicitada expresamente para el presente trabajo,suponiendounavenopunciónalapaciente.

Enambosgruposdecontrolessedescartaronaquellasmujeresquepresentabanenelmomentodelainclusióncualquierprocesoagudoquesupusieraunaumentodeladestruccióncelular, tales comounproceso infeccioso o inflamatorio agudo, traumatismoo intervenciónquirúrgicareciente.

4.3. DURACIÓN Y CENTROS DE REALIZACIÓN.

Elestudioseplanificóparainclusióndepacientesduranteunperiodode3años,desdenoviembrede2013hastaoctubrede2016.Serealizaráseguimientoposteriordelaspacientesincluidashastafallecimientoounperiodomínimode5años.

El estudio se centraliza en el servicio de oncología médica del Hospital ClínicoUniversitarioVirgendelaArrixaca.Desdemarzode2016seincorporaenelestudioelserviciodeoncologíamédicadelHospitalUniversitarioSantaLuciadeCartagena.

4.4. VARIABLES DEL ESTUDIO.

VARIABLEPRINCIPAL:

Para analizar el valor pronóstico de los nuevos BM propuestos que supone nuestroobjetivoprincipal,sehanestablecidodosvariablesprincipales:

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- Supervivencia libre de progresión (SLP). Se define como el tiempo transcurridodesdeeliniciodeltratamientohastalaprogresióntumoralomuerteporcualquiercausa.Sehancensuradoaquellaspacientesconpérdidadeseguimiento.

SedefineprogresióntumoralsegúnloscriteriosdelGCIG2011(anexoIV).

- Supervivencia global (SG). Se define como el tiempo transcurrido desde el iniciodeltratamientohastaelfallecimientoporcualquiercausa.

Elestudiodelvalorpronósticoseharealizadosobreelvalorbasalde losnuevosBMantesdeliniciodetratamientoysobrelavariaciónentreelvalorbasalytraselprimerciclodequimioterapiaenloscasosderecibirQTneoadyuvante.

VARIABLESSECUNDARIAS:

- Respuestatumoraltrasfinalizareltratamiento.

Hace referencia a la respuesta tras finalizar todo el tratamiento previsto,incluyendo cirugía y quimioterapia. Se considera “respuesta tumoral” cuando elpacientehayapresentadorespuestacompleta(RC)oparcial(RP),y“norespuesta”cuandopresenteenfermedadestable(EE)oprogresióndeenfermedadduranteeltratamiento(PE).SehaestablecidolarespuestatumoralsegúnloscriteriosRECIST1.1(anexoIII).

- Respuestaaquimioterapianeoadyuvante(QTNA).

Hace referencia a la respuesta tras finalizar el tratamiento con QTNA previstoantes de la cirugía de intervalo (CDI). Al igual que en el punto anterior, seconsidera respuesta tumoral cuando el paciente haya presentado respuestacompleta(RC)oparcial(RP),ynorespuestacuandopresenteenfermedadestable(EE)oprogresióndeenfermedadduranteeltratamiento(PE).SehaestablecidolarespuestatumoralsegúnloscriteriosRECIST1.1(anexoIII).

- Resultadodecirugíaperitoneal.

Hace referencia al resultado del procedimiento quirúrgico. Se considera cirugíacito-reductoraóptimaaaquellaqueconsiguecito-reduccióntumoralcompletasinresiduo tumoral macroscópico (cirugía R0). Se considera cirugía sub-óptima aaquella con residuo tumoral menor o mayor a 1 cm (cirugía R1 y R2respectivamente).

- Edad.Sehaanalizadocomovariablecontinuaycomointervalomenor/iguala65añosymayorde65años.

- EstadogeneralECOG(anexoII).

- Indice demasa corporal (IMC). Se determina por la fórmula peso en kilogramosdividida por la talla en metros al cuadrado. Se analizará su valor continuo yestratificadoporobesidad(IMCmayoroiguala25).

- Sensibilidad a platino. Se considera paciente sensible a platino a aquel quepresenta respuesta tumoral (RC o RP) y no presenta recaída tumoral en los 6

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meses siguientes a la finalización de un esquema de quimioterapia basado enplatino.Seconsiderapacienteresistenteaplatinoaaquelquepresentaprogresióndurante el tratamiento, estabilización de enfermedad tras finalizar elmismoo aaquel que tras haber alcanzado respuesta, presenta recaída tumoral antes de 6mesesdefinalizarunesquemadequimioterapiabasadoenplatino.

- Origen del tumor. Se divide el origen del tumor en dos categorías: enfermedadprimaria cuando sin presentar antecedentes de neoplasia ovárica presentadiagnóstico actual de CEO, y recaída tumoral cuando se trata de una pacientetratada anteriormente de un CEO y que presenta actualmente recaída tumoraldespuésde6mesesdefinalizareltratamientoanterior.

- Estadiotumoral(veranexoI).

- Histología tumoral. Según se expuso anteriormente en el apartado “AnatomíaPatológica”delaintroducción.

- Tipo histológico I o II de Kurman según se expuso previamente en el apartadopatogeniaycarcinomatosisdelaintroducción59.

- Gradohistológico.Seestablecen3gradoshistológicos:grado1, también llamadodebajogradoobiendiferenciado;grado2,tambiénllamadodemoderadogradoomoderadamentediferenciado;ygrado3,altogradooindiferenciado.

- Presentación radiológica de adenopatías ilíacas o para-aórticas. Se consideranpatológicasaquellasadenopatíasconejemenorqueseamayorde1,5cmsegúnloscriteriosRECIST1.1(veranexoIII).

- Tamañodelatumoraciónovárica.

- Tamañodelosimplantesperitoneales.

- Presencia de ascitis. Se estratifica la presencia de ascitis por TC como ascitisausenteoleve,cuandonohaypresenciadeascitisoestaesleve,yascitissevera,cuandolapresenciadeascitisesnotoria.

- Presenciadeomentalcake. TerminoradiológicocaracterísticoquedeterminaunengrosamientopatológicodelmesenterioenlaimagenTC.Secodificaenpresenteoausente.

- Plandetratamientoprevisto.Sehancomparadolospacientesendondeseindicacirugía peritoneal primaria y en los que se indica quimioterapia neoadyuvante ycirugíadeintervalo.

- Tipodecirugíarealizada.Sehancomparadoentrelospacientesquefinalmentesehanrealizadocirugíaprimariaycirugíadeintervalo.

- IndicedecarcinomatosisperitonealdeSugarbaker(PCI).Valoraciónquirúrgicadelaextensióndecarcinomatosisperitonealmedianteunapuntuaciónentre0y3de13regionesenlasquesepuedevalorarlacavidadabdominal.Lapuntuaciónhacereferenciaalvolumendel implantetumoralencadaregión,correspondiendo0acuandonoestáafecto,1cuandoelimplantetieneundiámetromenora2,5cm,2cuandoeldiámetrotiene2,5–5cm,y3cuandoeldiámetrodelimplanteesmayor

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de 5 cmo existen implantes confluentes. La sumade todas las puntuaciones decada región es el valor de PCI, variando entre 1 y 39 (ver anexo V). No hay unpunto de corte establecido, variando según las publicaciones. En el presentetrabajohemosanalizadolosresultadosenfuncióndelvalordePCI12351.

- Presencia de ganglios linfáticos afectos en el estudio patológico de lalinfadenectomía.Secodificacomoafectosynoafectos.

- OrganosmetastásicosafectosenelestadioIV.

- Reseccióndigestivaovisceralenelactoquirúrgico.

- AplicacióndelatécnicaquirúrgicaHIPEC.

- Realizacióndelinfadenectomía.

- NºdeciclosaplicadosdeQTneoadyuvante,adyuvanteytotal.

- TipodeQTaplicada.

- Valores de niveles sanguíneos de albúmina, lactato deshidrogenasa (LDH),hemoglobina(Hb),polimorfo-neutrófilos(PMN)yplaquetas.

4.5. METODOLOGÍA

4.5.1.PLANDETRABAJO

Duranteelpresentetrabajosehanrealizadolossiguientespasosencadapaciente:

Paso1.Elegibilidaddelapaciente

- Todas laspacienteshansidovaloradasporel comitéde tumoresginecológicosycarcinomatosisdecadacentrohospitalarioparticipanteenelestudio.

- Seha comprobadoque la paciente cumplía los criterios de inclusión y no los deexclusión.

- La paciente debía firmar dos consentimientos informados: el consentimiento deBioBanc-Mur de procesamiento de muestras biológicas (ver anexo VII) y elconsentimientodeparticipaciónenelpresenteestudio(veranexoVIII).

Paso2.Recogidademuestrassanguíneasbasales.

Se han recogido muestras sanguíneas antes del inicio de cualquier tratamientooncológico. Todas las muestras para el estudio fueron obtenidas mediante punción venosaantecubitalytras12hdeayunoyunperiododereposode20minutos.Laextracciónsellevóacaboporpersonaldeenfermeríacualificadoyrealizadaenelmismoactodeextraccióndelaanalíticasanguíneaindicadaporprácticahabitual,paraquenosupusieraningunavenopunciónañadidaalapaciente.Seharealizadoenlos7díaspreviosaliniciodeltratamiento.

Ladeterminaciónbasalhaincluido(figura4.1):

- TubodehemogramaparadeterminacióndeHb,PMNyplaquetas.

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- Tubosecoparaestudiobioquímicodealbúmina,LDH,Ca-125yHE4.

- TubodeEDTAde5mlparaprocesamientoyestudiodecfDNA.

- TuboCellsave®(JanssenDiagnostics,LLC,Raritan,NJ,USA)de10mlparaestudiodeCTC.

FIGURA4.1.Tubosdeextracciónsanguínea.

La muestra sanguínea de bioquímica y hemograma se ha procesado siguiendo elcircuito habitual del hospital. La muestra de EDTA para estudio de cfDNA se ha procesadoantesde4horastras laextracciónen launidaddeBioBanc-Mur(Nodo1)denuestrocentro(BiobancoenreddeInvestigaciónBiosanitariade laRegióndeMurcia,InstitutoMurcianodeInvestigaciónBiosanitaria(IMIB)).Lasmuestrassehanalmacenadoenultracongelacióna-80ºynitrógenovapor.

La enumeracióndeCTC se ha realizadousando el sistemaCellSearch® dentro de lasprimeras48horastrassuextracción,en laUnidaddeCitometríae InmunologíaTumoral,delServiciodeInmunologíadelhospital.

Paso3.IniciodetratamientooncológicoyestablecimientodelasrecogidasseriadasdeBM.

Concadapaciente,trasservaloradaencomitédetumores,sehaestablecidounplande tratamiento específico, pudiendo ser cirugía peritoneal primaria (CPP) y quimioterapiaadyuvante (QTA), quimioterapia neoadyuvante (QTNA) y cirugía de intervalo (CDI) o, enalgunoscasos,solosehaindicadoquimioterapia(QT)paliativa,sincirugía.

En función el planteamiento terapéutico de la paciente se ha establecido un planespecífico de recogidas seriadas de BM (ver tabla 4.1-3). Como se comentó anteriormente,todas las extracciones se han realizado en el mismo acto de extracción de la analíticasanguíneaindicadaporprácticahabitual,paraquenosupusieraunavenopunciónañadida.

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TABLA4.1.Determinacionessanguíneasengrupo1º(CPPyQTA).

Determinación BASALAntesdecirugía

Trascirugía,en1ºcicloQTA

En2ºcicloQTA

Analítica1 X CIRUGIA

X X

BioBanco(tuboEDTA)

X X X

CTC(tubopropio)

X

TABLA4.2.Determinacionessanguíneasengrupo2º(QTNAyCDI).

Determinación BASALEn 1º ciclodeQTNA

En 2º cicloQTNA

Antesdecirugía

Un mes trascirugía

Analítica1 X

1ºcicloQTNA

X X CIRUGIA

X

BioBanco(tuboEDTA)

X X X X

CTC(tubopropio)

X

TABLA4.3.Determinacionessanguíneasengrupo3º(QTpaliativa,sincirugíaprevista).

Determinación BASALEn1erciclodeQT

En2ºcicloQT

Analítica1 X X

BioBanco(tuboEDTA)

X X

CTC(tubopropio)

X

1ANALITICA: tubo secoparadeterminaciónde Ca-125yHE4. Enelmomentobasal sehadeterminado tambiénalbúmina,LDHyCEA,ysehaextraídountubodeEDTAparahemogramaparavaloracióndeHb,PMNyplaquetas.

Paso4.AnálisisdelasmuestrasalmacenadasparaestudiodelcfDNA.

Unavezfinalizada la inclusióndepacientes,sehaprocedidoalanálisisde losnivelesdecfDNAdelasmuestrasalmacenadasenbiobanco,siguiendolametodologíaexpuestamásadelante.

Paso6.Recogidadedatosclínicos,analíticosyevolutivos.

Sehanrecogidolosdatosplanteadosenelpresentetrabajoparasumanejoestadísticoyelaboraciónderesultados,discusiónyconclusiones.

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Material y métodos

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4.5.2.TRATAMIENTODELASPACIENTES.

Eltratamientodelaspacientesseharealizadosegúnprácticahabitual.Elesquemadequimioterapiahabitualde inicioenelCEOsueleserelesquemaformadopor lacombinacióndepaclitaxeladosisde175mg/m2ydecarboplatinocon5-6AUCcada21días.LaspacientesentratamientoconQTAsuelenrecibir6ciclosdeQTtraslaCPP.LaspacientesentratamientoconQTNAsuelenrecibir4ciclosdeQTantesdelaCDI,y2ciclosdespués,paracompletaruntotal de 6-8 ciclos. En función de la tolerancia clínica se puede modificar dosis y esquemasegúnrecomendacionesestablecidasenlasguías.EnpacientesconestadioIIIyresecciónunaopciónterapéuticaeselusodequimioterapiaintraperitoneal.

En las pacientes con recaída tumoral se suele indicar quimioterapia de combinaciónbasadaencarboplatino.

Lacirugíaperitoneal seha realizadosiguiendo lasguíasestablecidas.EnelHCUVA lacirugíaserealizaencolaboracióndelequipodeginecologíaoncológicaycirugíaperitoneal.EnloscasosdeestadioIIIconresecciónóptimasueleaplicarselatécnicaHIPECsegúnprotocolo:se usa citostático paclitaxel a dosis de 60mg/m2 o cisplatino 75mg/m2, en función de lascaracterísticasde laspacientes,diluidopara superfusiónen3.000ccde líquidoparadiálisis(Dialisan®), manteniéndose en el circuito de perfusión un flujo constante de 0,5 – 0,7litros/minutodurante60minutos,conunatemperaturaconstantede42-43º.

EnlaspacientesquerecibenQTNAynopresentenprogresióndeenfermedad,sesueleindicarCDItrasel4ºciclodeQT.

Trasfinalizartratamiento,serealizaseguimientodelaspacientessegúnprotocolodecadahospital.

4.5.3.VALORACIÓNDERESPUESTA

EnlaspacientesquerecibenQTNAyQTpaliativa, lavaloraciónderespuestatumoralserealizamediantepruebadeimagen(TCoPET/TC)traseltercerciclodequimioterapia.Lospacientes en donde se indica CPP y QTA se realiza TC tras la cirugía y tras finalizar QTA.Posteriormente se realiza seguimiento de las pacientes según protocolo de cada centrohospitalario.

4.5.4. METODOLOGÍADEPROCESAMIENTOYANÁLISISDEPARÁMETROSBIOQUÍMICOSYDEHEMOGRAMA.

Se han analizado los siguientes parámetros, indicando los valores de normalidad denuestrocentro:

- Hemograma: Hb en gr/dL (VN 12 – 16), PMN en cel/mcL (VN 2.000-4.000) yplaquetasen103/mcL(VN150–350).

- Bioquímica(suero):albúminaengr/dL(VN3,5–5,5),LDHenU/L(VN135–214),Ca125enU/mL(VN≤35)yHE4enpmol/L(VN10-60enpremenopáusicasy10-80enpost-menopáusicas).

Sehaprocedidodelasiguienteforma:

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Paso1.Recogidadelasmuestras.

Todas las muestras para el estudio fueron obtenidas mediante punción venosaantecubitalytras12hdeayunoyunperiododereposode20minutos.Laextracciónsellevóacaboporpersonaldeenfermeríacualificado.

La sangre se recogió en tubos de vacío vacutainer (Becton Dickinson and company,Nueva Jersey, E.E.U.U.) condiferentesaditivos. Seobtuvieronmuestrasde suero (tubo secoconsilicona)ysangretotal(tuboconácidoetilendiaminotretracéticotripotásico,EDTAK3).

Lamuestradesangre totalpreviaagitaciónseutilizópara realizarelhemograma.Lamuestra de suero tras la retracción del coágulo de fibrina, fue centrifugada a 3500revoluciones por minuto durante 20 minutos en una centrifuga Kubota 5900 (KubotaCorporation,Osaka,Japón)a4°C.

Paso2.Procesamientoanalíticodelasmuestras.

El procesamiento analíticode lasmuestras se realizó íntegramente enel Servicio deAnálisisClínicosdelHospitalUniversitarioVirgende laArrixacayenelHospitalUniversitarioSantaLuciadeCartagena.

Los servicios de análisis clínicos y hematología están acreditados por ENAC según lanormaUNE-EN-ISO15189(nº579/LE1193).

Hemograma

El tubode EDTApara la realizacióndel hemograma, se analizó en el equipo SysmexXE5000(RocheDiagnostic®).Esteautoanalizadorutiliza lastecnologíasdecitometríadeflujofluorescenteyenfoquehidrodinámico.Enelprocesamientodelasmuestrassehanseguidolasrecomendacionesdelfabricante.

Bioquímica

Para el análisis bioquímico se utilizaron tres analizadores automatizados, el Cobas8000 (Roche Diagnostic®), el BN ProSpec (Siemens Healthcare Diagnostics®) y el AdviaCentauroCP(SiemensHealthcareDiagnostics®).

MarcadorséricoCa-125

SehadeterminadoelvalorséricodeCa-125medianteelanalizadorCobas8000(RocheDiagnostic®)segúnprocedimientohabitual.

ParasuanálisissehautilizadoeltestElecsysCa-125II®,queesuntestinmunológicoinvitro para la determinación cuantitativa en suero y plasma humanos de los determinantesreactivos del anticuerpo OC 125 en suero y plasma humanos. Emplea un anticuerpomonoclonalOC-125obtenidodelinfocitosderatóninmunizadoconlíneacelulardecarcinoma

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deovarioOVCA-433.EltestconsisteenunatécnicadeELISAtiposándwichconunaduracióntotalde18minutosyconsistenteenlossiguientespasos:

- 1a incubación: 20 μL de suero se incuban con un anticuerpo biotiniladomonoclonal anti-CA 125 y un anticuerpo monoclonal anti-CA 125 marcado conquelatoderutenioa,paraformaruncomplejosándwich.

- 2a incubación: Después de incorporar las micropartículas recubiertas deestreptavidina,elcomplejoformadosefijaalafasesólidaporinteracciónentrelabiotinaylaestreptavidina.

- Lamezcladereacciónestrasladadaalacéluladelecturadonde,pormagnetismo,lasmicropartículassefijana lasuperficiedelelectrodo.Loselementosnofijadosse eliminan posteriormente con el reactivo ProCell/ProCell M. Al aplicar unacorriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuyaemisióndeluzsemideconunfotomultiplicador.

- Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración generada por elsistemaapartir deuna calibracióna2puntos yuna curvamaster incluidaenelcódigodebarrasdelreactivo.

ParaelcontroldecalidadseusaelPreciControlTumorMarker.

ElanalizadorcalculaautomáticamentelaconcentracióndeanalitodecadamuestraenUI/mL.Valordenormalidad≤35UI/mL(percentil95).

MarcadorséricoHE4

SehadeterminaciónelvalorséricodeHE4medianteelanalizadorCobas8000(RocheDiagnostic®)segúnprocedimientohabitual.

Para su análisis se empleael testElecsysHE4®, queesun test inmunológicopara ladeterminacióncuantitativadelaHE4ensueroyplasmahumanos.ConsisteenunatécnicadeELISAtiposándwichconunaduracióntotaldeltestde18minutos:

- 1.aincubación:6μLdesueroseincubanconunanticuerpomonoclonalbiotiniladoanti-HE4yunanticuerpomonoclonal anti-HE4marcado conquelatode rutenioaparaformaruncomplejosándwich.

- 2a incubación: Después de incorporar las micropartículas recubiertas deestreptavidina,elcomplejoformadosefijaalafasesólidaporinteracciónentrelabiotinaylaestreptavidina.

- Lamezcladereacciónestrasladadaalacélulademedidadonde,pormagnetismo,lasmicropartículassefijana lasuperficiedelelectrodo.Loselementosnofijadosse eliminan posteriormente con ProCell II M. Al aplicar una corriente eléctricacontrolada se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz semideconunfotomultiplicador.

- Los resultados se determinan mediante una curva de calibración generadaespecíficamenteparael instrumentoapartirdeunacalibracióna2puntosyunacurvamastersuministradaatravésdecobaslink.

ParaelcontroldecalidadseusaelPreciControlHE4.

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Material y métodos

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Elanalizadorcalculaautomáticamentelaconcentracióndeanalitodecadamuestraenpmol/L.Valordenormalidad≤80pmol/Lenmujerespost-menopáusicasyde≤60pmol/Lenmujerespre-menopáusicas.

4.5.5. METODOLOGÍADEPROCESAMIENTOYANÁLISISDECTC.

Paso1.Recogidadelasmuestras.

La enumeración de CTC en sangre periférica se ha realizado usando la tecnologíaCellSearch (Veridex)® a travésdelanalizadorCellTracksAnalyzer II® (figura4.2).LamuestrasanguíneaseharecogidoentubosespecíficosCellsave®(JanssenDiagnostics,LLC,Raritan,NJ,USA),precisandounmínimode7,5mLdesangreperiférica,yprocesándoseenlasprimeras48horasdesdelaextracción(lasmuestrassepuedenmanteneratemperaturaambientedurante72horassinalterarsusresultados).Laextraccióndeestamuestraserealizóenúltimolugar,paraevitarcontaminaciónporcélulasepitelialesyendotelialesarrastradasenlavenopunción,einmediatamentesemezclaronporinversiónsuave(6veces)conelpreservantecontenidoeneltubodeextracción.

FIGURA4.2.AnalizadorCellTracksAnalyzerII®.

Paso2.Procesamientoanalíticodelasmuestras.

El procesamiento analítico de lasmuestras se realizó íntegramente en la Unidad deCitometría e Inmunología Tumoral, del Servicio de Inmunología del hospital. El servicio deInmunología está acreditado por la European Federation of Immunogenetics (EFI) para larealizacióndeestudiosserológicos,celularesymoleculares(EFI09-ES-009.991).

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LadeteccióndeCTCserealizóíntegramenteconelsistemaCellSearch,consistenteenunprocesosemiautomatizadoquesedesarrollaenvariasetapas:

1. Elprimerpasoesmezclar7,5mldesangreperiféricade lapacientecon6mldetampónysecentrifugaa800g/10minutos.Despuésseaspiraelplasmaylacapablancaporelinstrumento.

2. DespuéssedebenaislarlasposiblesCTCdeentretodaslascélulaspresentesenlasangre. Se realizamediante enriquecimiento inmunomagnético basándose en laexpresión del antígeno epitelial de superficie EpCAM. El kit CTC de CellSearchincorporaanticuerposacopladosaunferrofluidoquesedirigeaunamoléculadesuperficiedelascélulasepitelialesllamadaEpCAM,conelobjetivodeseleccionarlascélulasepitelialespresentesenlasangreydescartarlasnoepiteliales.Trasunperiododeincubación,serealiza,atravésdeuncampomagnético,elaislamientode estas células captadas por las partículas férricas unidas al anticuerpo deEpCAM.SeobtieneasíunamuestraenriquecidadecélulasepitelialescandidatasaCTC.

3. Posteriormente, se deben identificar las verdaderas CTC dentro de todas lascélulas epiteliales aisladas. Para ello se añade una mezcla de 3 anticuerposconjugados con un fluorocromo. Incorpora dos anticuerpos que se unen a lascitoqueratinas 8, 18 y 19, un anticuerpo para CD45 y una tinción nuclear 4, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar fluorescentemente las células connúcleo.Despuésdelaincubaciónenelsistema,serepitelaseparaciónmagnética

4. Enlaetapafinal,lascélulassonsuspendidasenundispositivodepresentacióndecélulas,queconstadeunacámaraydosimanes.

5. Lasmuestras son leídasenelmicroscopio robotizadoymostradasenelmonitorparainterpretaciónfacultativavisual,parainformarcomocélulasCTCaquellasquecumplan criterios de morfología compatible con CTC, positividad paracitoqueratinas y DAPI, y negatividad para CD45, así como una morfologíacompatibleconCTC(tamañoyformacelularydisposicióndelnúcleo).

El facultativode Inmunologíaalcargode la interpretaciónde los resultadosacumulaañosdeexperienciayparticipaenlosprogramadeformaciónsemestralesqueproporcionaelfabricante de los reactivos para la correcta interpretación de los resultados. Además, enaquellos casos dudosos se remitieron las imágenes a un evaluador externo para una doblelectura(Dr.JoséVidal,HospitalDoctorPeset,Valencia).

4.5.6. METODOLOGÍADEPROCESAMIENTOYANÁLISISDEcfDNA.

ParaelestudiodecfDNAsehaprocedidoalaextraccióndeunamuestrasanguíneade5 ml en un tubo con ácido etilendiaminotretracético tripotásico, EDTA K3. La muestra setrasladóalasinstalacionesdeBiobancoparasuprocesamientoyalmacenamientoantesdelas4horas siguientes a suextracción. Tras finalizar el periodode inclusiónenel estudio, sehaprocedidoalanálisissimultáneodetodaslasmuestrasporpartedelaplataformadegenómicadelIMIB.

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Paso 1. Registro, procesamiento y almacenamiento en Biobanco de muestras biológicashumanas.

ElBiobancodelaRegióndeMurciaesunadelasplataformasdeserviciodelInstitutoMurciano de Investigación Biosanitaria Virgen de la Arrixaca y es un biobanco autorizadosegúnlalegislaciónvigente.EstáinscritoenelRegistroNacionaldeBiobancosconreferenciaB.0000859yformapartedelaPlataformaNacionalreddeBiobancosdelISCIIconnúmerodeexpedientePT13/0010/0018.

Enestebiobancosehangestionado lasmuestras sanguíneasparaestudiodecfDNAdelaspacientesreclutadasenelestudio.Todaslaspacientescuyasmuestrassongestionadaspor el biobanco han firmado un consentimiento informado específico de Biobanco quepermitaelusodeestasencualquierproyectode investigaciónbiomédicaaprobadosporuncomitédeética(anexoVII).

Cuando las muestras son recibidas en el biobanco, se registran en el sistemainformáticopropiodeestaplataforma,dondequedanregistradostodoslosdatosrelacionadoscon la donación y con las muestras asociadas de manera codificada, manteniendo latrazabilidaddelasmuestrasentodomomento.

LamuestradesangreEDTAsecentrifugaa1500rpmdurante15minutos.Elplasmayla capa blanca así obtenidos se alicuotan en tubos con codificación QR de 750 µl con unvolumenfinaldemuestrade500µlysealmacenana-80ºC.

Todos los ultracongeladores y tanques de nitrógeno del biobanco se encuentranmonitorizadosparaasegurarelmantenimientodelacadenadefrío.

Paso2.ProcesamientoyanálisisdecfDNA.

EnunaprimerafasedelproyectosehaextraídoycuantificadoelADNlibrecirculante(cfDNA)procedentede lasmuestrasdepacientesdecáncerdeovarioygrupocontrol.Sehaanalizadoaproximadamente1mldelosplasmasprocedentesdelBiobanco.

Para la extracción de cfDNA se ha utilizado el kit "Qiamp Circulating Nucleic Acid"(Qiagen)segúnlasrecomendacionesdelfabricante.Elvolumenfinaldeeluciónhasidode100μL.

La cuantificación del cfDNA se ha determinado mediante PCR en Tiempo Realutilizando el fluorocromo SYBR Green (Takara).Las secuencias Alu (muy abundantes en elgenomahumano) sepuedenutilizar para la cuantificación sensibledel cfDNA. Se amplificandosampliconesdediferentestamaños:ampliconescortos(Alu115de115pb)ylargos(Alu247de247pb)apartirderepeticionesgenómicasdeAlu.

ComoelcfDNApresentaunaestrechadistribucióndetamañoalrededorde165pb,losresultadosAlu115-qPCRdetectanconprecisiónlacantidadtotaldecfDNAydeADNgenómicodealtopesomolecular.MientrasquelosresultadosAlu247-qPCRindicansólolapresenciadeADNgenómicocontaminantedealtopesomolecular.Porlotanto,larelaciónAlu247/Alu115indica el Índice de Integridad de ADN de lamuestra. Se espera que el ADN de alta calidadtengaun Índicede IntegridaddeADNde1,0,mientrasqueelADNdemenorcalidadtendráunapuntuaciónentre1,0y0.

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Basándoseen los resultadosdeHaoet al352, los valores esperadosde IntegridaddelADNsonlosexpuestosenlatabla4.4.

Tabla4.4.ValoresesperadosdeintegridaddelADNMuestra MedianadelosvaloresdeintegridaddelADN

cfDNAnormal 0,38(0,29-0,49)

cfDNAencáncerdecolonprimario 0,62(0,51-0,65)

ADNgenómico 1,0

La reaccióndeamplificaciónpara cadamuestra seha realizadoporduplicadoenunequipoLightCycler480(Roche)enlascondicionesexpuestasenlatabla4.5.

TABLA4.5.CondicionesdereacciónenelequipoLightCycler480(Roche).Reactivo VolumenSYBRGreenMix(Takara) 2.5μlPrimersAlu115oAlu247 0.4μlADN 1μlAgua 1.1μlFinal 5μl PRIMERS Alu115 Forward:5’-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3’

Reverse:5’-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3’Alu247 Forward:5’-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3’

Reverse:5’-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3’ Programa

Amplificación: 95°C–30seg95°C–5seg40ciclos62°C–30seg

Acquisitionmode: singleReadSYBRGreen Meltingcurve: 95ºC-5seg

60ºC–1min95ºC-acquisitionmodecontinuous(5acquisitionsperºC)

Se aplica el análisis de la curva de disociación (melting curve) para comprobar laamplificaciónespecíficadelosfragmentosAlu115yAlu247.

Para determinar la cantidad de ADN de cada muestra, hay que generar una curvaestándarparacadaparejadeprimers,yapartirde losvaloresCtdeunadiluciónseriadadeuna muestra de concentración conocida (11 ng, 1,1 ng, 0,11 ng, 0,011 ng, 0,0011 ng)determinarlaintersección(YIntercept)ylapendiente(Slope)delacurva(figura4.3y4.4).

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FIGURA4.3.CurvaestándarAlu115.

FIGURA4.4.CurvaestándarAlu247.

Lafórmulaparadeterminarlaconcentraciónes:

ng/μl=10^(muestramediaCt-Yintercept)/pendiente

LaconcentraciónparaelamplicónAlu115sepuedeusarparadeterminar lacantidadtotaldeADNválido.LasconcentracionesdeambosampliconesAlu247yAlu115determinanelvalordeIntegridaddeADN:

ValordeIntegridaddeADN=(ng/μldeAlu247)/(ng/μldeAlu115)

NOTA:ElvalordeIntegridaddeADNseutilizacomounindicadordelacalidaddelamuestrayprobabilidaddeéxitoenposterioresensayos,comopuedeserlaconstruccióndelibreríasensecuenciaciónmasiva.LasrecomendacionesespecíficassobrelageneracióndelibreríasylasmétricasdesecuenciaciónsondifícilesdedefinirentérminosdeunÍndicedeIntegridaddeADN,debidoa ladiversidaddetiposdemuestrasyprotocolosquesepuedenutilizar.Noobstante,debeconsiderarselacomplejidaddelgenomaylacalidaddelamuestraparadefinirlacantidaddecfDNAnecesariaparalageneracióndelibrerías352.

4.5.7. RECOGIDADEDATOS.

Sehanrecogidolasvariablesclínicasdelaspacientesenuncuadernoderecogidade

datosdiseñadoespecíficamenteparaelestudio (anexo IX), codificándoseposteriormenteenunatablatipoExcel.Sehaprocedidoaladepuracióndedatosparaladetecciónycorrecciónde posibles errores, con análisis de los valores fuera de rango o no permitidos. Aquellos

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valores que no se han podido obtener o no se realizaron se han codificado como valoresperdidos.Laidentificacióndelaspacienteshasidoanonimizada.

Finalmente,losdatosclínicossehanunidoalosvaloresdelosbiomarcadoresenunabase de datos conjunta para su análisis. Todos los BM han sido variables de tipo continuomenoselvalordeCTCquehapresentadovaloresdiscretos.

Elcierredelabasededatosserealizóel15/02/2017.

4.5.8. PLANIFICACIONDELANALISISDEDATOS.

Primero sehan analizado las variables clínicas denuestra serie. Sehan realizado lossiguientesapartados:

- Estudio descriptivo de las variables clínicas y de tratamiento de la muestra depacientes,paraconocerlascaracterísticasbásicasdenuestraserie.

- Comparacióndelaedadyciertasvariablesanalíticasentrelamuestrapacientesylosdosgruposcontrol.Laeleccióndeestasvariablesanalíticasseharealizadoporser indicadores del estado general (albúmina y Hb) y otros son consideradosreactantesdefaseagudayserelacionanconlasituacióninflamatoriageneraldelapersona(LDH,poli-morfoneutrófilos(PMN)yplaquetas).

- Análisis univariante de las diferentes características clínicas, con el objeto deestudiarsucapacidadpredictivaypronósticayvalorarsuposibleinfluenciaenlosBMestudiados(objetivosecundario6denuestrotrabajo).

Despuésseharealizadoelanálisisespecíficodelosbiomarcadores(BM)planteadosenestetrabajo.Sehaorganizadoenlossiguientesapartados:

- EstudiodescriptivodelosnivelesbasalesdelosBMenlamuestrapacientes.

- Comparaciónde losvaloresentreel grupopacientesyel grupocontrol (objetivosecundario4).Sehanrealizadolassiguientescomparaciones:

o Comparaciónentregrupopacientesygrupocontrol.

o Comparaciónentregrupopacientes,grupotumoresbenignosygruposujetossanos.

o ComparacióndeCTCentregrupopacientesygrupocontrol.

o Análisis de la capacidad diagnostica, sensibilidad y especificidad paradiscriminarentrepacientesygrupocontrol.

- AnálisisdecomolascaracterísticasclínicasdelaspacientesinfluyenenelvalordelosBM(objetivosecundario2).Correlaciónconlasvariablesanalíticasgenerales.

- Análisisdecomo los tratamientos influyenenelvalorde losBM,paravalorarsuposiblepapelenlamonitorizacióndelaterapia(objetivosecundario3).NosehanevaluadoCTCenestepunto.Sehancomparadotresaspectos:

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o Influencia de la cirugía peritoneal primaria (CPP): hemos comparado elvalor de los BM antes y después de la intervención. La determinaciónpreviahacorrespondidoalaextracciónbasaldentrodelos7díasantesdelinicio del tratamiento, y la posterior se ha realizado al mes del actoquirúrgico,aliniciodelaQTadyuvante.

o InfluenciadelprimerciclodeQT:hemoscomparadolosvaloresdelosBMantesdel primer ciclo y antesdel segundo ciclodeQT.Antesdel primerciclo ha correspondido a la determinación basal antes del inicio deltratamiento,exceptoenlospacientesquerecibenCPPquecorrespondealadeterminacióntraslacirugía.LadeterminaciónensegundociclodeQTseha realizado a los 21días despuésde recibir el primer ciclodeQT. Elanálisis se ha realizado sobre todas las pacientes que han recibido almenos1ciclodeQT.

o InfluenciadeQTNA:hemoscomparadosusvaloresantesdelprimerciclode QT y la determinación antes de cirugía de intervalo (CDI). Se harealizadosoloenaquellaspacientesendondeelplanterapéuticohasidoQTNAyCDI.

- AnálisisdelarelaciónexistenteentrelosdiferentesBM(objetivosecundario5).

- Estudio univariante y multivariante del valor predictivo de los BM (objetivosecundario1). Sehadeterminadoel valorpredictivo respectoa los tres tiposderespuesta que se han propuesto en nuestro objetivo secundario 1, quecorresponden a las variables secundarias respuesta tumoral final, respuesta aquimioterapianeoadyuvanteyrespectoalresultadodecirugíaóptima:

o Respuestatumoralfinal.SuanálisisseharealizadosobreelvalorbasaldelosBMantesdeliniciodetratamiento.ConcfDNAtambiénsehaanalizadoelvalortraslacirugía.

o RespuestaaQTNA.Suanálisis seha realizado sobreel valorbasalde losBM antes del inicio de tratamiento. Con cfDNA también se ha realizadosobreelporcentajedereducciónentreelvalorbasalytraselprimerciclodequimioterapia.

o Resultadodecirugíaperitoneal. Suanálisis seha realizado sobreel valorde los BM previo a la cirugía, correspondiendo a la determinación basalpreviaalaCPPyaladeterminaciónrealizadaantesdelaCDI.

Los resultado se han comparado con los BM de referencia Ca-125 y HE4, paravalorarelverdaderobeneficioqueaportaríanenlaprácticaclínica.

Con cada variable secundaria se ha realizado estudio multivariante con lasvariables clínicas de la primera parte que resultaron significativas, paradeterminar así las verdaderas variablespredictivas independientesde respuestadenuestraserie.

- Estudio univariante y multivariante del valor pronóstico de los diferentes BMrespecto a la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global de las

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pacientes (objetivo secundario 1 y objetivo principal). El análisis se ha realizadosobreel valor basal y la reduccióndeun50%enel valor del BM tras el primerciclodeQT.

Respecto a los valores basales de los BM se han calculado por métodosestadísticoselmejorniveldecorteparahacerlaagrupacióndecomparación.ParaCTCsehancomparadolapresenciaoausenciadecélulascirculantes.

Se ha seleccionado el dintel del 50% para valorar la reducción por ser elestablecidoenelGCIGdevaloraciónderespuesta(anexoIV).

El análisismultivariante deCox se ha realizado en funciónde las característicasclínicas que han presentado valor significativo en el estudio univariante de laprimeraparte.

4.6. DISEÑO ESTADÍSTICO

Todas las variables han sido incluidas en una base de datos con la identidad de lospacientes anonimizada. Se ha realizado un estudio descriptivo en el que las variablesnuméricas se han resumido como media, desviación típica, mediana, mínimo y máximo, ylasvariablescualitativasconfrecuenciasyporcentajes.

Para la aplicación del contraste de hipótesis en variables continuas, se ha valoradoinicialmente la normalidad de la muestra mediante el test de Kolmogorov-Smirnoff y lascondicionesdehomogeneidaddevarianzasmediantelapruebadeLevene.Enfuncióndeestosresultados,sehaaplicadolacomparacióndemediasdeT-StudentparadosfactoresoANOVAparacuandohahabidomásde2factores,conaplicacióndeltestdeBonferroniparadetectardiferenciasentresubgrupos,cuandoladistribucióndelavariablehasidonormal.CuandonosehademostradonormalidadenlavariablehemosusadoeltestnoparamétricoUdeMann-Whitneypara2gruposyeltestdeKruskal-Wallispara3omásgrupos.Paralacomparacióndevariables continuas de muestras relacionadas se ha utilizado la prueba T-Student paramuestrasrelacionadasolapruebadeWilcoxoncuandoladistribuciónnohasidonormal.

Para la comparación de variables cualitativas hemos aplicado el test de la Chi-CuadradoypruebasexactadeFisherencasodesernecesario.

La magnitud de asociación entre variables cualitativas se ha realizado mediante elcálculodel riesgo relativoy los residuos tipificados corregidosdeHaberman.Parael análisisunivariante hemos aplicado la estimación de riesgo (odds ratio y riesgo relativo) y para elmultivariante la regresión logística binaria multivariante, con valoración de coeficientes dedeterminaciónR2ypruebasdebondaddeajustedeHosmer-Lemeshow.

Se han utilizado procedimientos de curva operativa del receptor (ROC) paradeterminar la capacidad de predicción de los biomarcadores, junto con su sensibilidad yespecificidad,ycalcularelpuntodecorteóptimo.

Para estudiar la relación entre variables continuas hemos usado el coeficiente dePearsonyelcoeficientedecorrelacióntaudeKendall.

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El análisis de supervivencia se ha realizado mediante el método de estimación deKaplan-Meier.SeharealizadoanálisisunivariantedelainfluenciadelasdiferentesvariablesenlascurvasdesupervivenciamedianteeltestdeLog-Rank(Mantel-Cox)oconeltestdeBreslowsi el factor estudiado acumula casos con poco tiempo de supervivencia censurados en losdiferentesgruposdefinidos.Conelfindeconocerlaasociacióndelosfactoresestudiados,seha realizado un análisismultivariante de regresión logística de Cox (riesgos proporcionales)conlosfactoresqueenanálisisunivariantesemostraronasociadosdeformaestadísticamentesignificativa.DeesteanálisismultivariantesehaobtenidolaHazardRatioconsuintervalodeconfianzadel95%.

Losbiomarcadoresplanteadosenestetrabajosehantratadocomovariablecontinua,a excepción del estudio de CTC, debido a que se trata de una variable discreta con escasosvalores. Para mejorar su poder estadístico, se ha realizado el análisis entre sujetos conpositividadparaCTCfrentealosquenopresentanCTC.

Todos los resultados sehanconsiderado significativosparaunniveldep<0.05. LosanálisissehanllevadoacaboconelprogramaIBMSPSSStatisticsv20(SPSSInc.,Chicago,IL)con el apoyo estadístico de la Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias de laRegión deMurcia.El cierre de la base de datos para el estudio estadístico se realizó el 15-febrero-2017.

4.7. CONSIDERACIONES ÉTICAS

El proyecto ha sido valorado con dictamen favorable por el Comité Etico deInvestigación Clínica (CEIC) del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca el 27 demayode2013(anexoVI).

4.8. FINANCIACIÓN

Elpresenteproyectohasidoposiblegraciasalossiguientesrecursoseconómicos:

- ElpromotoreconómicoprincipalhasidoelserviciodeoncologíamédicadelHCUVA.

- AporteeconómicodelaasociacióncontraelcáncerdeYeclaparainvestigación.

- ColaboraciónenestudiodeCTCconbecadel InstitutodeSaludCarlos-III,expedientePI13/02297, titulado “Regulación de la respuesta anti-tumoral de células NK y surelación con la susceptibilidad, diseminación y respuesta al tratamiento del cáncer”,siendo el investigador principal elDr. AlfredoMinguela Puras, y duraciónde 2014 a2016.

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5. Resultados

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Resultados

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Resultados

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5.1. ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS CLINICAS DE LAS PACIENTES

Elpresentetrabajohatenidounaduraciónde38meses,desdenoviembre/2013hastadiciembre/2016. Laprimerapaciente fue incluidael15/nov/2013y laúltimael28/dic/2016.Han participado un total de 125mujeres, correspondiendo 97 al grupo de pacientes, 15 algrupocontroldetumoresováricosbenignosy16algrupodesujetossanos(figura5.1).

FIGURA5.1.Diagramaconlasmujeresincluidasenelestudio.

(*)Lostumoresbenignosmalincluidosenelgrupodepacientes,seincorporaronalgrupode“Tumoresbenignosdeovario”parasuanálisis.

En el grupo de pacientes hubo 9 fallos de inclusión, correspondiendo éstos a 3cánceresde colon, 1 cáncer gástrico, 1 strumaovari, 1mesoteliomaperitoneal y 3 tumoresbenignos.Por lo tanto, al finalhanquedado88pacientes válidos con carcinomaepitelial deovario (CEO). Para el análisis de resultados y con el objetivo de optimizar recursos, estos 3tumoresbenignossehanincorporadoalgrupode“Tumoresbenignosdeovario”.

Lasmujeresconpatologíabenignacorrespondena1pacienteconascitisidiopática,3con cistoadenoma mucinoso, 1 cistoadenoma seroso, 2 con quiste seroso simple, 3 conteratoma quístico maduro, 1 tumor benigno hemorrágico, 1 tumor borderline, 2 conendometriomay1pacienteconendometriosis.

TOTALINCLUIDOSn=125

SUJETOSSANOSn=16 TUMORESBENIGNOSDE

OVARIO*n=15

1AscitisIdiopática

3CistoadenomasMucinosos1CistoadenomaSeroso2QuistesSerososSimples3TeratomasQuísticos

Maduros1TumorBenignoHemorrágico

1TumorBorderline2Endometriomas1Endometriosis

PACIENTESCONCARCINOMAEPITELIAL

DEOVARIOn=88

GRUPODEPACIENTESn=97

FALLOSINCLUSIONn=9

3CáncerdeColon1CáncerGástrico1StrumaOvari1MesoteliomaPeritoneal

3TumoresBenignos(*)

GRUPOCONTROLn=31

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Resultados

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Losdatosmostradosenelpresentetrabajocorrespondenaunseguimientomediode14,30meses(mínimo0meses,máximo38meses).

5.1.1. ESTUDIO DESCRIPTIVO DE LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LA MUESTRA PACIENTES.

En latabla5.1semuestran lascaracterísticasclínicasprincipalesanalizadassobre las88 pacientes incluidas. La edadmedia de lamuestra ha sido de 57 años (DT 11,2), conunamediana también de 57 años (mínimo 28 años y máximo de 79 años). El pico de mayorincidenciahasidoentrelos55y65años(figura5.2).

FIGURA5.2.Histogramaconladistribucióndeedadesporgruposetarios.

ElestadogeneralECOGhasidode0-1enel77,3%,conun12,5%ECOG2yun10,2%conECOG3.Elíndicedemasacorporal(IMC)mediodenuestraseriefuede28,06,conunaDTde5,95.Lamedianafuede26,57(mínimo18,13ymáximode47,56),perohayquedestacarquedospacientespresentaronIMCmayorde40.

La histología predominante fue el seroso alto grado con un 68,2%, seguido por elendometrioide con 9,1% y el carcinoma de células claras con el 8%. Agrupándolas según elmodelo dualista de Kurman, correspondieron 24 pacientes al tipo I (27,3%) y 64 al tipo II(72,7%).Elgradohistológicohasidomoderado-alto(grado2-3)enel84,1%,ydebajogrado(grado1)enel15,9%.

Encuantoalorigendel tumor, se incluyeron71pacientesconenfermedaddedebut(80,7%)y17pacientesconrecaída(19,3%).Dentrodelaspacientesconenfermedadprimaria,57 fueron de origen ovárico (80,3% de entre las pacientes con enfermedad primaria), en 3pacientes se presentó en trompa y 11 pacientes presentaron carcinomatosis peritonealprimaria(CAPP).Dentrodelaspacientesconrecaída,en14pacientesfuerecaídasensibley3pacientesfuerecaídaresistente.

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Resultados

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TABLA5.1.Estudiodescriptivodelascaracterísticasclínicasdelamuestrapacientes.Variable Frecuencia(%) Variable Frecuencia(%)Edad ECOG Menorde40 3(3,4%) 0 17(19,3%)40-49 23(26,1%) 1 51(58,0%)50-59 21(23,9%) 2 11(12,5%)60-69 26(29,5%) 3 9(10,2%)IgualoMayorde70 15(17%) Histología HistologíaelmodelodualistadeKurmanSerosoAltoGrado 60(68,2%) TipoI 24(27,3%)Endometrioide 8(9,1%) TipoII 64(72,7%)CélulasClaras 7(8,0%) SerosoBajoGrado 5(5,7%) Gradohistológico Mucinoso 3(3,4%) Grado1 14(15,9%)Otros 5(5,7%) Grado2-3 74(84,1%)Origendeltumorprimario EstadiotumoralOvario 57(64,8%) EstadioIA-IIA 8(9,1%)Trompa 3(3,4%) EstadioIIB-IIC 6(6,8%)CAPP 11(12,5%) EstadioIIIA-IIIB 11(12,5%)RecaídaSensible 14(15,9%) EstadioIIIC 49(55,7%)RecaídaResistente 3(3,4%) EstadioIV 14(15,9%)PresenciaradiológicadeOmentalCake PresenciadeAscitis NO 50(58,1%) NO 32(36,4%)SI 36(41,9%) LEVE 32(36,4%)Total 86(100,0%) SEVERA 24(27,3%)Novalorable 2 Plandetratamientoprevisto(*) TipodecirugíarealizadafinalmenteCirugíaprimariayQTA 28(31,8%) CirugíaPrimaria 28(32,9%)QTNAycirugíaintervalo 50(56,8%) CirugíaIntervalo 37(43,5%)QTpaliativa 10(11,4%) CirugíaPaliativa 1(1,2%)Total 88(100,0%) NoserealizaCirugía 19(22,4%) Total 85(100%) PendientesdeCDI 3Resultadodecirugía(†) PCIquirúrgico R0 51(77,3%) Igualomenora12 49(76,6%)R1 6(9,1%) Mayorde12 15(23,4%)R2 9(13,6%) Total 64(100,0%)Total 66(100,0%) Respuesta Radiológica a quimioterapianeoadyuvante

Situación final tras completar tratamiento decirugíayquimioterapia

RespuestaCompleta 6(13,6%) RespuestaCompleta 58(74,4%)RespuestaParcial 29(65,9%) RespuestaParcial 5(6,4%)EnfermedadEstable 6(13,6%) EnfermedadEstable 3(3,8%)Progresión 3(6,8%) Progresión 12(15,4%)Total 44(100,0%) Total 78(100,0%)NoValorable(todavíaentratamiento)

6 NoValorable 10

Total 50 Total 88*Plandetratamientotrasvaloraciónencomitédetumoresginecológicosycarcinomatosis.†Secomputanlascirugíasrealizadas,aexcepcióndeunacirugíapaliativaCAPP= Carcinomatosis Peritoneal Primaria;QTA= quimioterapia adyuvante;QTNA= quimioterapia neoadyuvante;QT=quimioterapia

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Respectoalestadiotumoral,lamayoríadepacientesincluidaspresentaronestadioIIIC(55,7%). La afectación metastásica supuso el segundo grupo en frecuencia, dándose en 14pacientes(15,9%).En10pacientessoloafectóunórgano(71,4%)yen4hubovariosórganosafectos. El órganomás afectado fue la pleura y el hígado, ambos con 6 pacientes cada uno(42,9%).Detráshaquedadolaafectaciónadenopáticaextra-abdominalen3pacientes(21,4%).Hayquedestacarqueseincluyeron8pacientesconestadioprecozI-IIA(9,1%).

En cuanto al tamaño de presentación de las lesiones tumorales, en nuestra serie lamayoríadetumoresováricoshansidomayoresde5cm(56,8%),conunamediade92,7mm(DT 50,9) y un tamaño máximo de 270mm. Los implantes peritoneales medibles fueronmayoresde2cmenel38,6%delaspacientesyeltamañomediofuede25,5mm(DT22,3).Hubo un 22,7% de pacientes en donde el tamaño no fue valorable por radiología,principalmenteporinfiltracióndifusaperitoneal.Seaprecióimagenradiológicadeinfiltraciónperitonealconocidacomo“omentalcake”enel41,9%deloscasos.Lapresenciadeascitisseconsideró severa en el 27,3%, siendo leve en el 36,4% y en otro 36,4% no hubo ascitis. Lapresenciadeadenopatías radiológicas sedioenel 29,5%anivel ilíaco yenel 36,4%anivelpara-aórtico.

Enrelaciónaltratamientoindicadoennuestraspacientes,elplanteamientoinicialfueindicarcirugíaperitonealprimaria (CPP)yquimioterapiaadyuvante (QTA)enel31,8%de loscasos (28 pacientes), quimioterapia neoadyuvante (QTNA) y cirugía de intervalo (CDI) en el56,8%,ysóloQTpaliativaenel11,4%delospacientes.Finalmente,laCPPserealizóenlos28pacientesprevistos,perolaCDIsóloseharealizadoen37delos50pacientesprevistos(43,5%deltotaldepacientes).Losmotivosdenointervencióndeestas13pacientesasignadasaCDI,fueronen2pacientesporpérdidade seguimiento tras iniciodeQT,2 fallecierondurante laquimioterapia,1portoxicidadgraveporquimioterapia,1pacienteresistente,4refractariasaquimioterapiay3pacientesqueseencuentrantodavíaenQTNAypendientesdeCDIalcierrede la base de datos. Se ha realizado cirugía paliativa en 1 pacientes y en 19 no se efectuóningúngestoquirúrgico.

Respectoalacirugía,elresultadofueconsideradocompletosinningúnresiduo(R0)enel77,3%,conresiduomenorauncentímetro(R1)enel9,1%yresiduomacroscópicomayorauncm (R2)enel13,6%de lospacientes.El índicedecarcinomatosis conocidocomoPCI fuemenoroigualade12enel76,6%,conunamediade8,7(DT8,8)yunamedianade6(mínimo0 y máximo 36). Durante la intervención, se realizó resección digestiva, exceptuando laapendicectomía, en el 30,8% y se aplicó la técnica de quimioterapia hipertérmica conocidacomoHIPECenel32,3%.Serealizó linfadenectomíapélvicay/opara-aórticaen37pacientes(56,9%)yen1pacienteseresecó1adenopatíasospechosasincompletarlinfadenectomía.Lamedia de ganglios extraídos fue 10,76 y una mediana de 8,50 (mínimo 1 y máximo 38),estandoafectosen15pacientes (39,5%de los sometidosa resección linfática). Lamediadegangliosafectosfuede1,47ganglios(0-17).

La QT empleada fue en la mayoría de ocasiones la combinación de paclitaxel ycarboplatino,enconcretoenel82,9%.Elusototaldeunacombinaciónconcarboplatinosedioen78pacientes(88,6%).En2pacientesseusóquimioterapiaintraperitonealyen3seindicóbevacizumab.EneltratamientoconQTNA,hubounamediaymedianadeciclosfuede4,conunmínimo de 1 ymáximo de 8 ciclos. Lomás frecuente fue el uso de 4-5 ciclos (65%). El

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tratamiento global de quimioterapia tuvo una media y mediana de 5,66 y 6 ciclosrespectivamente,conunmínimode0ymáximode22.Elnúmerodeciclosmásfrecuentefue6ciclos(38,2%),siendoentre6y8cicloslomáshabitual(64,5%).

Fijándonosen la respuesta tumoralal tratamiento, tras recibirQTNAhuborespuestacompleta(RC)enel13,6%,respuestaparcial(RP)enel65,9%,enfermedadestable(EE)enel13,6%yprogresión(PE)enel6,8%.6pacientesnohansidoaúnvalorablesporestaraúnentratamiento con QTNA. La respuesta final tras completar todo el tratamiento con cirugía yquimioterapia,fuedeRCenel73,7%yRPenel6,6%,conPEenel15,8%.

VARIABLESDESEGUIMIENTO

Alcierredelabasededatossolo32pacientespresentaronrecaídatumoral(44,4%delos valorables). La sensibilidad a compuestos de platino se pudo valorar en 53 pacientes,mostrando ser sensibles el 50,9% de los pacientes, refractarios a tratamiento el 22,6% y el26,4%resistentes.En35pacienteslasensibilidadaplatinotodavíanohasidovalorada(tabla5.2).

Tabla5.2.Estudiodescriptivodevariablesdeseguimiento.Variable Nºdecasos Porcentajedecasos PacientesconrecaídatumoralNO 40 55,6% SI 32 44,4% Total 72 100,0% Novalorables 16 Sensibilidadaplatino CausadeSensibilidadNovalorableRefractario 12(22,6%) EscasoSeguimiento 28(80,0%)Resistente 14(26,4%) MuerteduranteQT 2(5,7%)Sensible 27(50,9%) Muertetrascirugía 2(5,7%)Total 53(100,0%) Perdido 2(5,7%)NoValorable 35 MuerteOtraCausa 1(2,9%) Total 35(100,0%)EstadodelpacienteenlaultimarevisiónalcierredelabasededatosVivoSinEnfermedad 44 53,0% VivoConEnfermedad 17 20,5% MuertoporTumor 15 18,1% MuertoporOtraCausa 5 6,0% Perdido 2 2,4% Total 83 100,0% EnQT(NAoadyuvante) 5 QT=quimioterapia;NA=neoadyuvante

En la última valoración clínica, 44pacientes estaban vivas sin enfermedad (53%), 17vivasconenfermedad (20,5%),15habían fallecidoporprogresión tumoral (18,1%),5habíanfallecidoporotracausa(6%)yen2pacientessehaperdidoelseguimiento(2,4%).Estasdospacientescorrespondena2mujeresnoespañolasquetraselprimerysegundociclonohanvuelto a la consulta ni se ha registrado actividad en el centro de salud, ni tampoco ha sido

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posibleelcontactoconellas.Delaspacientesquefallecieronporcausanotumoral,dosfueronpor complicaciones graves durante el post-operatorio, otra por episodio de TEP fatal tras elprimerciclo,otraporfalleciódurantelanocheensudomiciliotrasel2ºciclodequimioterapiapor causa no aclarada (causa final de muerte en parte de defunción “paradacardiorespiratoria”) y la última por cuadro de encefalopatía severa que ocasionó elfallecimiento5mesesdespuésdelúltimociclodeQT.Alcierredelabasededatos5pacientesseencuentranaúnenquimioterapia.

Con la limitación de escaso seguimiento, la mediana de SLP se sitúa 7meses (0-28meses).Lamedianadesupervivenciasesitúaen12meses(0-38meses).

5.1.2. ESTUDIO COMPARATIVO DE LA EDAD Y CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS ENTRE LA MUESTRA PACIENTES Y LA MUESTRA CONTROL.

Enel análisisde comparacióndemediasentreel grupopacientes yel grupocontrolhemosobtenidodiferenciassignificativasentodaslasvariablesanalizadas(tabla5.3).Elgrupopacientespresentamayoredadqueelgrupocontrol(mediade57,4vs47,9años),menorniveldealbúmina(mediade3,9vs4,4gr/dL),mayorniveldeLDH(mediade231vs163U/L),menorniveldeHb(mediade12,2vs13,3gr/dL),mayorniveldePMN(mediade6339vs3866cel/uL)ymayorniveldeplaquetas(mediade390vs263x103/uL).

TABLA5.3.Comparacióndeedadyvariablesanalíticasentrepacientesygrupocontrol.VariableGrupo

N Media±DT Mediana(Mín–Máx) Valordep

Edad(años) GrupoPacientes 88 57,4±11,2 57,0(28–79) <0,001*GrupoControl 31 47,9±11,3 48,0(20–74)Albúmina(gr/dL) GrupoPacientes 83 3,9±0,5 4,0(2,1–4,8) <0,001*GrupoControl 30 4,4±0,3 4,4(3,8–5,2)LDH(U/L) GrupoPacientes 78 231±111 196(108–804) <0,001**GrupoControl 27 163±29 160(103–242)Hb(gr/dL) GrupoPacientes 87 12,2±1,5 12,1(9,1–15,7) <0,001*GrupoControl 31 13,3±1,4 13,5(8,8–15,8)PMN(cel/uL) GrupoPacientes 87 6339±4498 4970(660–30400) <0,001**GrupoControl 31 3866±1516 3560(1370–8070)Plaquetas(x103/uL) GrupoPacientes 87 390±143 371(156–830) <0,001*GrupoControl 31 263±67 248(180–468)DT=desviacióntípica;p*=T-Student;p**=testnoparamétrico;Mín=mínimo;Máx=máximo

Para concretar mejor entre que subgrupos había diferencia, se ha realizadocomparaciónentrelamuestrapacientesrespectoaladetumoresbenignosycontrolessanos,

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obteniendodiferenciasignificativaparalaedad,albúmina,Hb,PMNyplaquetas(figura5.3).Laedadennuestroestudiohasidodiferenteentreelgrupopacientesyeldetumoresbenignos,con57añosy45añosrespectivamente,perosindiferenciasentrepacientesysanos.

FIGURA5.3.Diagramadecajasdelasvariablescuantitativasentrepacientesygrupocontrol.

Eneldiagramadecajassemuestraelmínimo,primercuartil,mediana,tercercuartilymáximo.Sehaseñaladounalíneahorizontalconelvalornormaldelparámetro.Sehaindicadoelvalordepdelgrupodetumoresbenignosycontrolsanorespectoalgrupodepacientes.Seharesaltadoconrecuadrocuandohasidosignificativoysinbordescuandonohasidosignificativo.

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La albúmina ha sido diferente entre pacientes y sanos, no habiendo diferencias contumoresbenignos.NohahabidodiferenciasenlosnivelesdeLDHentrelosgrupos.Respectoalosvaloresdelhemograma,sehanvistodiferenciasenelniveldeHbyPMNentrepacientesysanos, pero no con tumores benignos. Finalmente, el nivel de plaquetas ha sidosignificativamentemayorenelgrupopacientesrespectoalosotrosdosgrupos.

No se han visto diferencias en ninguna variable entre tumores benignos y sujetossanos.

5.1.3. ANÁLISIS UNIVARIANTE DEL VALOR PREDICTIVO DE LAS VARIABLES CLÍNICAS.

5.1.3.1. VALORPREDICTIVODERESPUESTATUMORALAQUIMIOTERAPIANEOADYUVANTE.

Seincluyenlas44pacientesconenfermedadavanzada(estadioIIB-IV)endondesehaindicadotratamientoconQTNAycirugíadeintervalo(CDI).

ElanálisisunivariantedelasvariablesclínicasnosmuestraquesólodosvariableshaninfluidodeformaindividualenelresultadoaQTNA.EstasvariableshansidoeltipohistológicoIIsegúnelmodelodeKurman(RR2,018;p<0,009)yelgradohistológico2-3(RR2,115;p<0,050).Laausenciaolevepresenciadeascitishaestadopróximaalasignificación(RR1,410;p< 0,057 con IC-95% de 1,000 – 1,988). El resto de variables no han mostrado diferenciassignificativas(tabla5.4).

TABLA5.4.AnálisisunivariantedelvalorpredictivoderespuestaaQTNA.Característicaclínica

Respuesta*

Norespuesta†

Total

RR(IC95%)

Valordep

TipohistológicoIIdeKurmanTipoII 32(86,5%) 5(13,5%) 37(100%) 2,018

(0,850–4,792)<0,009

TipoI 3(42,9%) 4(57,1%) 7(100%)Total 35 9 44 GradohistológicoGrado2-3 33(84,6%) 6(15,4%) 39(100%) 2,115

(0,717–6,241)<0,050

Grado1 2(40,0%) 3(60,0%) 5(100%)Total 35 9 44 AusenciadeascitisoleveAusencia/leveascitis 22(91,7%) 2(8,3%) 24(100%) 1,410

(1,000–1,988)<0,057

Ascitissevera 13(65,0%) 7(35,0%) 20(100%)Total 35 9 44 RESTOEdad,IMC,ECOG,OrigendeltumorPresenciaradiológicadeadenopatías,Tamañotumorovárico,TamañoimplanteperitonealPresenciadeomentalcakeNivelesanalíticos(albúmina,LDH,Hb,PMNyplaquetas)

DNS

RR=riesgorelativo;IC95%=intervaloconfianza95%;DNS=diferencianosignificativa*Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;†Norespuesta=enfermedadestable+progresión.

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5.1.3.2. VALORPREDICTIVODECIRUGÍAÓPTIMA.

Porúltimo,hemosanalizado lasvariablesclínicasqueserelacionanconunresultadoóptimodecirugíaR0enlas58pacientesconenfermedadavanzada(estadioIIB-IV)quefueronintervenidasconintenciónradical,tantocirugíaprimariacomodeintervalo.

El análisis univariantede las variables clínicas respecto aun resultadoóptimoR0decirugía hamostrado que se relacionan de forma significativa un IMCmenor/igual de 25, unECOG0-1,laausenciaolevepresenciadeascitis,ausenciadeomentalcakeyunPCIquirúrgicomenor/iguala12(tabla5.5).

Tambiénelniveldealbúminaseharelacionadodeformasignificativa,conunvalorde4,076gr/dLparaR0yde3,708gr/dLparaR1-2(p<0,019).

TABLA5.5.AnálisisunivariantedelvalorpredictivoderesultadoquirúrgicoóptimoR0.Característicaclínica CirugíaR0

CirugíaR1-2

Total

RR(IC95%)

Valordep

IMCmenorde25 Menor/iguala25 19(90,5%) 2(9,5%) 21(100%) 1,339

(1,030–1,742)<0,050

Mayorde25 25(67,6%) 12(32,4%) 37(100%)Total 44 14 58ECOG0-1 ECOG0-1 38(82,6%) 8(17,4%) 46(100%) 1,652

(0,924–2,954)<0,019

ECOG2-3 6(50,0%) 6(50,0%) 12(100%)Total 44 14 58Ausenciadeascitisoleve Ascitisausente/leve 37(84,0%) 7(16,0%) 44(100%) 1,682

(0,981–2,884)<0,009

AscitisSevera 7(50,0%) 7(50,0%) 14(100%)Total 44 14 58Ausenciadeomentalcake Ausente 29(87,9%) 4(12,1%) 33(100%) 1,506

(1,050–2,162)<0,011

Presente 14(58,3%) 10(41,6%) 24(100%)Total 43 14 57NiveldePCIquirúrgico Menor/iguala12 37(88,1%) 5(11,9%) 42(100%) 1,888

(1,087–3,280)<0,001

Mayorde12 7(46,6%) 8(53,3%) 15(100%)Total 44 13 57Albúmina Niveldealbúmina(gr/dL) 4,076 3,708 <0,019RESTO Edad,Origendeltumor,TipohistológicodeKurman,GradohistológicoPresenciaradiológicadeadenopatías,Tamañotumorovárico,TamañoimplanteperitonealTipodecirugíarealizada(CPP/CDI),GangliosafectosenestudiopatológicoNivelesanalíticos(LDH,Hb,PMNyplaquetas)

DNS

CPP=Cirugíaperitonealprimaria;CDI=cirugíadeintervalo;RR=riesgorelativo;IC95%=intervaloconfianza95%;DNS=diferencianosignificativa

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5.1.3.3. VALORPREDICTIVODERESPUESTATUMORALALFINALIZARELTRATAMIENTO.

Enesteanálisishemosincluidoa71pacientesconenfermedadavanzada(estadioIIB-IV) en las que ha sido posible valorar la respuesta final. No se incluyen las pacientes conpérdida de seguimiento, las fallecidas por otra causa en donde no ha podido valorarse larespuesta y las pacientes aún en tratamiento. También se han descartado las pacientesincluidasquehanpresentadoestadioprecoz,debidoalsesgoqueocasionaría.

En el análisis univariante se ha obtenido un PCI menor/igual a 12, un resultadoquirúrgicoóptimoR0ypresentarrespuestaaQTNA,hansidovariablesqueserelacionandeformasignificativaconrespuestaparcial/completaalfinalizareltratamiento.Lamayorfuerzade asociación la ha presentado la respuesta a QTNA, con un RR 4,359 (1,282 – 14,823;p<0,001), seguido del resultado quirúrgico, con un RR 1,714 (1,063 – 2,765; p<0,001). Lapresentaciónprimariafrentearecaídatumoralylaausenciadeascitisolevepresenciasehanaproximadoalasignificación(tabla5.6).

TABLA5.6.Análisisunivariantedelvalorpredictivoderespuestaalfinalizareltratamiento.Característicaclínica

Respuesta*

Norespuesta†

Total

RR(IC95%)

Valordep

ValordePCImenor/iguala12Menor/iguala12 40(97,6%) 1(2,4%) 41(100%) 1,330

(0,977–1,812)<0,015

PCImayorde12 11(73,3%) 4(26,7%) 15(100%)Total 51 5 56 ResultadodecirugíaR0R0 44(100,0%) 0(0,0%) 44(100%) 1,714

(1,063–2,765)<0,001

R1-2 7(58,3%) 5(41,7%) 12(100%)Total 51 5 56 RespuestaaQTneoadyuvanteSi 31(96,9%) 1(3,1%) 32(100%) 4,359

(1,282–14,823)<0,001

No 2(22,2%) 7(77,8%) 9(100%)Total 33 8 41 EnfermedadprimariaEnfermedadprimaria 47(83,9%) 9(16,1%) 56(100%) 1,399

(0,911–2,148)<0,044

Recaídatumoral 9(60,0%) 6(40,0%) 15(100%)Total 56 15 71AusenciadeascitisoleveAscitisleve/ausente 44(84,6%) 8(15,4%) 52(100%) 1,340

(0,932–1,925)<0,050

Ascitissevera 12(63,2%) 7(36,8%) 19(100%)Total 56 15 71 RESTOEdad,IMC,ECOG,TipohistológicodeKurman,GradohistológicoPresenciaradiológicadeadenopatías,Tamañotumorovárico,TamañoimplanteperitonealPresenciadeomentalcake,Tipodecirugíarealizada,GangliosafectosenelestudiopatológicoNivelesanalíticos(albúmina,LDH,Hb,PMNyplaquetas)

DNS

RR=riesgorelativo;IC95%=intervaloconfianza95%;DNS=diferencianosignificativa;NC=Nocalculable*Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;†Norespuesta=enfermedadestable+progresión.

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5.1.4. ANÁLISIS UNIVARIANTE DEL VALOR PRONÓSTICO DE LAS VARIABLES CLÍNICAS.

5.1.4.1. VALORPRONÓSTICODESUPERVIVENCIALIBREDEPROGRESIÓN.

Para el análisis de la SLP se han incluido 86 pacientes, habiendo censurado las 2pacientesperdidasdeseguimiento.EnelanálisisunivariantesehaobtenidoquesonfactorespronósticosnegativosdemenorSLPunaedadmayorde65años,larecaídatumoralfrentealaenfermedaddedebut,unestadioIII-IVfrentea I-II,presenciadeomentalcake,nopresentarrespuestaaQTNA,unPCIquirúrgicomayorde12,unresultadosub-óptimodecirugíaR1-2ylapresencia de ganglios linfáticos afectos en el estudio patológico (tabla 5.7). Los valores conmayorniveldelog-rankhansidolafaltaderespuestaaQTNAyunPCImayorde12.ElrestodevariablesnohanmostradodiferenciassignificativasenlaSLP.

Enlafigura4semuestranlasgráficasdeSLPenrelaciónalasvariablesclínicasquehanresultadosignificativasenelanálisisunivariante.

TABLA 5.7. Análisis univariante del valor pronóstico de las variables clínicas en relación con lasupervivencialibredeprogresión.Característicaclínica N Nº

eventosMedia

(estimación)IC95% Log-rank Valordep

Edad Menoroiguala65años 62 21 17,1 13,7–20,4

4,471

<0,034Mayorde65años 24 16 11,1 7,7–14,4Total 86 37 15,5 12,8–18,1Origendeltumor Enfermedaddedebut 70 27 16,1 13,1–19,1

4,344*

<0,037Recaídatumoral 16 10 10,9 6,3–15,4Total 86 32 15,5 12,8–18,1Estadiotumoral EstadioI-II 13 0 NA

6,959

<0,008EstadioIII-IV 73 37 NA Total 86 37 NA Presenciadeomentalcake Ausencia 49 16 18,7 15,3–22,1

7,702

<0,006Presencia 35 19 10,0 7,9–12,2Total 84 35 15,8 13,1–18,5RespuestaaQTNA Respuesta 34 14 16,8 13,6–20,0

29,718

<0,001Norespuesta 9 8 4,7 3,0–6,3Total 43 19 14,3 11,3–17,4PCIquirúrgico Menor/iguala12 49 9 21,7 18,3–25,1

27,126

<0,001PCImayorde12 15 14 9,3 7,1–11,6Total 64 23 17,5 14,6–20,4*TestdeBreslowIC95%=intervaloconfianza95%;QTNA=quimioterapianeoadyuvante;PCI=índicecarcinomatosisperitoneal;NA=noaplica(continúa)

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Resultados

112

TABLA5.7(continuación).Característicaclínica N Nº

eventosMedia

(estimación)IC95% Log-rank Valordep

Resultadocirugía CirugíaR0 51 15 19,0 15,8–22,3

9,796

<0,007CirugíaR1 6 3 12,7 11,4–14,0CirugíaR2 8 5 9,6 1,8–17,4Total 65 23 17,5 14,6–20,4Gangliosafectosenelestudiopatológico Gangliosnoafectos 23 2 24,7 20,5–29,0

7,811

<0,005Gangliosafectos 15 7 12,6 10,2–15,1Total 38 9 19,6 15,5–23,6RESTO IMC,ECOG,HistologíasegúnmodeloKurman,GradohistológicoPresenciaadenopatíasradiológicas,Presenciaascitissevera,TamañotumorováricoTamañoimplanteperitonealTipodecirugíarealizadaNiveldealbúmina,LDH,Hb,PMN,plaquetas

DNS

IC95%=intervaloconfianza95%;NA=noaplica;LDH=lactatodeshidrogenasa;Hb=hemoglobina;PMN=polimorfo-neutrófilos

FIGURA5.4.Curvasdesupervivencialibredeprogresiónenrelaciónavariablesclínicas.

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Resultados

113

FIGURA5.4.(continuación)

5.1.4.2. VALORPRONÓSTICODESUPERVIVENCIAGLOBAL(SG).

Sehanvaloradountotalde86pacientesparaelestudiodeSG,habiendocensuradosololasdospacientesperdidasdeseguimiento.Enelanálisisunivariantesehaobtenidoque,de todas los parámetros clínicos registrados, las variables que se han relacionado de formasignificativaconpeorSGhansidopresentarcondiciónresistenteaplatino,presenciadeascitissevera,presenciadeomentalcake,nopresentarrespuestaaQTNA,unvalordePCImayorde12,nopresentar respuesta al finalizar el tratamiento completo ypresentarunnivel bajodealbúmina y de hemoglobina (tabla 5.8). El resultado quirúrgico sub-óptimo R1-2 se haaproximadoalasignificación(p=0,066).Elrestodevariablesnohansidosignificativas.

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Resultados

114

TABLA5.8.Análisisunivariantedelvalorpronósticodesupervivenciaglobaldelasvariablesclínicas.Característicaclínica N Nº

eventosMedia

(estimación)IC95% Log-rank Valordep

Sensibilidadaplatino Pacientessensibles 25 0 NA

17,184

<0,001Pacientesresistentes 26 15 NA Total 51 15 NA Ausenciaolevepresenciadeascitis Ausencia/leveascitis 63 9 31,3 27,6–35,1

10,050

<0,002Ascitissevera 23 11 17,1 12,5–21,8Total 86 20 28,2 24,6–31,7Ausenciadeomentalcake Ausencia 49 5 30,5 27,8–33,3

13,763

<0,001Presencia 35 14 20,5 14,5–26,4Total 84 19 28,2 24,5–31,9RespuestaaQTNA Respuesta 34 7 30,0 24,9–35,0

6,847

<0,009Norespuesta 9 6 16,0 6,4–25,6Total 43 13 26,3 21,3–31,3PCIquirúrgico Menor/iguala12 49 2 35,6 32,5–38,6

15,457

<0,001PCImayorde12 15 8 18,7 13,9–23,5Total 64 10 31,0 27,2–34,7Respuestaalfinaldeltratamiento Respuesta 63 9 31,6 27,9–35,2

13,741

<0,001Norespuesta 15 9 16,7 10,0–23,4Total 78 18 28,8 25,2–32,3Niveldealbúmina Valornormal(>=3,5) 64 12 30,0 26,2–33,9

6,952

<0,008Bajo(<3,5) 17 8 18,6 11,5–25,7Total 81 18 27,9 24,3–31,5NiveldeHb Valornormal12-16) 50 9 31,4 27,6–35,2

5,730

<0,017Bajo(<12) 35 11 20,9 15,7–26,2Total 85 20 28,1 24,5–31,7RESTO Edad,IMC,ECOG,Origendeltumor,HistologíasegúnmodeloKurman,GradohistológicoEstadiotumoral,Presenciaadenopatíasradiológicas,TamañotumorováricoTamañoimplanteperitoneal,Tipodecirugíarealizada,Resultadodecirugía(0,066)GangliosafectosenestudiopatológicoNiveldeLDH,PMN,plaquetas

DNS

IC95%=intervaloconfianza95%;QTNA=quimioterapianeoadyuvante;PCI=índicecarcinomatosisperitoneal;NA=noaplica;LDH=lactatodeshidrogenasa;Hb=hemoglobina;PMN=polimorfo-neutrófilos

Enlafigura5.5semuestranlascurvasdeSGenrelaciónalasvariablesrelacionadasde

formasignificativasenelanálisisunivariante.

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115

FIGURA5.5.Curvasdesupervivenciaglobalenrelaciónalasvariablesclínicas.

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116

5.2. ANÁLISIS DE LOS BIOMARCADORES PLANTEADOS EN ESTE TRABAJO.

5.2.1. ESTUDIO DESCRIPTIVO DEL NIVEL BASAL DE LOS BIOMARCADORES EN EL GRUPO DE PACIENTES.

Enelpresentetrabajo,sehanrealizadountotalde254determinacionesdecfDNAy80 de CTC. En la tabla 5.9 se muestran las características basales de los BM con valorescontinuos, que corresponden a cfDNA y los BM de referencia Ca-125 y HE4. Los valoresrelacionados con cfDNA han presentado una distribución de tipo normal. La media decfDNA115hasido1,635ng/mcL(rangode0,185–6,365ng/mcL),decfDNA247hasido0,585ng/mcL (rango de 0,109 – 1,637 ng/mcL) y la integridad de cfDNA ha sido 0,430 (rango de0,120 – 0,990). Los valores de Ca-125 y HE4 han mostrado una gran dispersión, con unadistribucióndetipononormal.Ca-125hapresentadounamediade917±1630U/mL(rangode11–11.354U/mL)yHE4unamediade822±1149pmol/L(rangode45–4957pmol/L).

TABLA5.9.Descripcióncuantitativadelosnivelesbasalesdelosbiomarcadores.Parámetro Válidos

(perdidos)Media± Desviación

TípicaMediana Mínimo Máximo

cfDNA-115 86(2) 1,635±1,114 1,363 0,185 6,365

cfDNA-247 86(2) 0,585±0,272 0,537 0,109 1,637cfDNA-Int 86(2) 0,430±0,176 0,425 0,120 0,990

Ca125 88(0) 917±1630 459 11 11364

HE4 82(6) 822±1149 358 45 4957

Enlatabla5.10hemoscalculadolafrecuenciayporcentajedeCa125yHE4segúnsuvalornormalestablecido(parteizquierdadelatabla).

TABLA5.10.Descripcióndebiomarcadoresporintervalosdevalor.Parámetro Frecuencia Porcentaje Parámetro Frecuencia PorcentajeCa125 Ca125

<=35 8 9,1 <=35 8 9,1>35 80 90,9 36–350 29 33,0Total 88 100,0 >350 51 58,0

Total 88 100,0HE4(*) HE4

<=80 7 8,5 <=80 7 8,5>80 75 91,5 81–400 36 43,9

82 100,0 >400 39 47,6 82 100,0

*El límitesuperiornormaldeHE4es80enpost-menopáusicasy60enpre-menopáusica.Sehatenidoencuentaestelímite.

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117

Enlapartederechadelatabla5.10,loshemosagrupadosegúnvalornormalysuvalorde10vecesellímitesuperiornormal(LSN)enCa125y5veceselLSNenHE4.EstoslímitessehanelegidoporrepresentarunaaltacargadelBM.LosvaloresdeCA125yHE4estánelevadosenel91%delaspacientes,presentandounCa125porencimade10veceselLSNel58%yunHE4porencimade5veceselLSNel48%.

Los tresBMrelacionadosconel cfDNAnosehanmostradoen intervalosalnoestarestablecidosvaloresdenormalidadprevios.

Enlatabla5.11seexponenlosresultadosdeCTC.LaenumeracióndeCTCmuestraquehansidopositivasen19pacientesdeun totalde80analizadas, loquesuponeun23,8%denuestra serie.El valorpositivomás frecuenteha sido1CTC/7,5mLde sangreperiféricaen9pacientes(11,3%deltotal),siendomayorde1CTC/7,5mLen10pacientes(12,5%deltotaldepacientes).Elvalormáximohasidode17CTC/7,5mLenunapaciente.

TABLA5.11.EstudiodescriptivodelosvaloresdeCTC.Parámetro Frecuencia PorcentajeCTC Negativas 61 76,3Positivas 19 23,8Total 80 100,0 ValordeCTC Frecuencia Porcentaje0 61 76,31 9 11,32 2 2,53 1 1,36 3 3,87 1 1,311 1 1,314 1 1,317 1 1,3Total 80 100,0

5.2.2. ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS BIOMARCADORES ENTRE EL GRUPO PACIENTES Y EL GRUPO CONTROL

COMPARACIÓNENTREGRUPOPACIENTESYGRUPOCONTROL

La comparación de los BM entre el grupo pacientes y el grupo control sin cáncer(tumoresbenignosycontrolessanos),noshamostradodiferenciassignificativasentodoslosBM.En la tabla5.12 seexpone la comparacióndemediasentreambosgruposyel valordesignificación.

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118

TABLA5.12.ComparacióndeBMentregrupodepacientesygrupocontrol.BiomarcadorGrupo

N Media±DT Mediana(Mín–Máx) Valordep

cfDNA115 GrupoPacientes 86 1,635±1,114 1,363(0,185–6,365) <0,001*GrupoControl 31 0,849±0,449 0,788(0,218–2,086)cfDNA247 GrupoPacientes 86 0,585±0,272 0,537(0,109–1,637) <0,007*GrupoControl 31 0,429±0,255 0,391(0,000–0,992)IntegridadcfDNA GrupoPacientes 86 0,430±0,176 0,425(0,12–0,99) <0,001*GrupoControl 30 0,564±0,236 0,540(0,11–1,16)Ca125 GrupoPacientes 88 917±1630 459(11–11364) <0,001**GrupoControl 31 43±90 12(4–406)HE4 GrupoPacientes 82 822±1149 358(45–4957) <0,001**GrupoControl 29 67±52 54(36–308)DT=desviacióntípica;p*=T-Student;p**=testnoparamétrico;Mín=mínimo;Máx=máximo

COMPARACIÓNENTREGRUPOPACIENTES,TUMORESBENIGNOSYSUJETOSSANOS

LacomparacióndelgrupodepacientesrespectoalgrupocontroldetumoresbenignosyelgrupodecontrolessanosnoshamostradoquecfDNA115hapresentadomayorvalordeforma significativa en las pacientes respecto a los otros dos grupos, pero cfDNA247 solo hasido diferente entre pacientes y benignos, no llegando a la significancia entre pacientes ysanos (tabla 5.13). La integridad de cfDNA ha sido diferente de forma significativa entrepacientesysanos,sinembargonolohasidoentrepacientesytumoresbenignos.

De los BM de referencia, Ca125 ha presenta diferencia significativa en los test noparamétricos (p<0,001), con media de 917 UI/mL en pacientes, de 75 UI/mL en tumoresbenignos y de 12 UI/mL en controles sanos. El biomarcador HE4 también ha presentadodiferenciassignificativastantocontumoresbenignoscomocontrolessanos,concifrasde822,73y62pmol/Lrespectivamente.

NohahabidodiferenciassignificativasentrelosdosgruposcontrolesparaningúnBM.

Enlafigura5.6sepuedenvergráficamentelasdiferenciasentrelostresgrupos.

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TABLA5.13.ComparacióndeBMentrepacientes,tumoresbenignosycontrolessanos.ParámetroGrupo

N Media±DT Mediana(Mín–Máx) Valordep

cfDNA115 Paciente 86 1,635±1,114 1,363(0,185–6,365) 1Benigno 15 0,894±0,552 0,788(0,218–2,086) <0,025*Sano 16 0,807±0,339 0,755(0,392–1,365) <0,008*Total 117 1,427±1,041 1,174(0,185–6,365) cfDNA247 Paciente 86 0,585±0,272 0,537(0,109–1,637) 1Benigno 15 0,372±0,253 0,330(0,000–0,959) <0,016*Sano 16 0,483±0,254 0,456(0,176–0,992) 0,498*Total 117 0,544±0,275 0,516(0,000–1,637) IntegridadcfDNA Paciente 86 0,430±0,176 0,425(0,12–0,99) 1Benigno 14 0,529±0,280 0,535(0,11–1,16) 0,230*Sano 16 0,594±0,192 0,550(0,34–1,08) <0,007*Total 116 0,464±0,201 0,440(0,11–1,16) Ca125 Paciente 88 917±1630 459(11-11364) 1Benigno 15 75±123 16(5-406) <0,001**Sano 16 12±9 10(4-34) <0,001**Total 119 689±1452 238(4-11364) HE4 Paciente 82 822±1149 358(45-4957) 1Benigno 14 73±69 54(40-308) <0,001**Sano 15 62±29 54(36-153) <0,001**Total 111 625±1041 180(36-4957) Lasignificaciónmostradahacereferenciaenlacomparacióndepacientesconlosotrosdosgrupos.p*ANOVAdeunfactor.P**=testnoparamétrico.DT=desviacióntípica;Mín=mínimo;Máx=máximoIC95%=Intervalodeconfianzaparalamediaal95%

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120

FIGURA5.6.DiagramadecajasconlosBMenelgrupopacientes,grupotumoresbenignosygrupodecontrolessanos.

Eneldiagramadecajassemuestraelmínimo,primercuartil,mediana,tercercuartilymáximo. Sehaseñaladounalíneahorizontalconelvalornormaldelparámetro.Sehaindicadoelvalordepdelgrupodetumoresbenignosycontrolsanorespectoalgrupodepacientes.Seharesaltadoconrecuadrocuandohasidosignificativo.DNS=diferencianosignificativa.

COMPARACIÓNDECTCENTREGRUPOPACIENTESYGRUPOCONTROL

ParaelestudiodeCTChemoscomparamoselgrupopacientesfrentealgrupocontrol,obteniendo diferencia significativa (tabla 5.14). Las CTC han sido positivas en 19 personas(23,8%) del grupo pacientes y solo 1 persona (3,3%) del grupo control. Correspondió a unamujerde67añoscontumorbenignohemorrágico,conCTC1/7,5mlyaumentodeCa125de238UI/mL,sinembargoelniveldecfDNA115,cfDNA247ycfDNA-Int fueronmenoresque lamediana. El resto de sujetos del grupo control fueron negativos para CTC. Estos datos nosmuestranunasensibilidadde23,8%,unaespecificidaddel96,7%,unvalorpredictivopositivo

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121

de95,0%yvalorpredictivonegativodel32,2%.Elcocientedeprobabilidadpositivohasidode7,21.

TABLA5.14.ComparaciónCTCentrepacientes,tumoresbenignosycontrolessanos.CTC Pacientes Tumorbenignoy

SanosTotal Niveldep

Positivas 19(23,8%) 1(3,3%) 20(18,2%) <0,013Negativas 61(76,2%) 29(96,7%) 90(81,8%)Total 80(100,0%) 30(100,0%) 110(100,0%)

ANÁLISISDECURVAROCPARADISCRIMINARENTREPACIENTESYGRUPOCONTROL

ParaanalizarlacapacidaddiscriminatoriaquepresentacadaBMrespectoaclasificaralos sujetos en pacientes con cáncer de ovario y sujetos sin cáncer, hemos calculado el áreabajo la curva (AUC) de cada uno de los BM.No se ha incluido el valor de CTC al presentarvaloresdiscretosaisladosyobtenerunacurvanoválida.

HemosobtenidoelvalormásaltoparaCa-125,con0,963(0,928–0,998),seguidodeHE4 con0,936 (0,888–0,984) (figura5.7). El valormás altodeAUCentre losnuevosBMaestudiolohapresentadocfDNA115,conunAUC0,758(0,660–0,855),discretamenteinferioralosBMdereferencia.

El valor de cfDNA-Int presentauna relaciónnegativa, debido aquepresenta valoresmenoresenlamuestrapacientes.ElcálculoinversosobreelvalornocáncerpresentaunAUCde0,677(0,564–0,789).

FIGURA5.7.CurvaROCdelosBMrespectoalacapacidadparadiferenciarpacientesygrupocontrol.

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122

ElvalordecortequemaximizaelAUCennuestraseriesemuestraenlatabla5.15,conlos datos de sensibilidad y especificidad. Ca-125 alcanza una sensibilidad de 90,0% yespecificidad de 92,9%. Para HE4 se alcanza 91,3% y 89,3%, respectivamente. De losbiomarcadores relacionados con cfDNA, los mayores valores los alcanza cfDNA115, consensibilidad76,3%yespecificidad64,3%.

TABLA5.15.ValoresdeROC,sensibilidadyespecificidadparalosBM.Biomarcador AUC Valordecorte Sensibilidad EspecificidadCa125 0,963(0,928–0,998) 38,00 90,0% 92,9%HE4 0,936(0,888–0,984) 83,50 91,3% 89,3%cfDNA115 0,758(0,660–0,855) 0,924 76,3% 64,3%cfDNA247 0,654(0,527–0,781) 0,395 73,8% 53,6%cfDNA-Int* 0,313(0,196–0,429) cfDNA-Int** 0,677(0,564–0,789) 0,485 66,7% 65,1%*NosecalculaelvalordebidoaquepresentaunAUCmenorde0,5.**CalculodecfDNA-Intparaelvalornocáncer.

5.2.3. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LAS PACIENTES EN EL VALOR DE LOS BIOMARCADORES.

cfDNA

Lasvariablesquehan influidodeformasignificativaenelvalordecfDNAhansidoelIMC, el estado general ECOG, origendel tumor, presencia de ascitis y presencia de gangliosafectos(tabla5.16).

TABLA5.16.InfluenciadelascaracterísticasclínicasenelvalordecfDNA.Variableclínica N cfDNA115

Media±DTNivelp

cfDNA247Media±DT

Nivelp

IntegridadcfDNAMedia±DT

NivelpECOG ECOG0-1 67 1,415±1,003 0,539±0,245 0,456±0,182ECOG2-3 19 2,410±1,165 0,746±0,308 0,337±0,116Niveldep P<0,001 P<0,003 P<0,001IMC Menoroiguala25 30 0,506±0,248 Mayorde25 56 0,627±0,277 Niveldep DNS <0,048 DNSOrigendeltumor Enfermedadprimaria 69 1,764±1,152 0,615±0,281 Recaídatumoral 17 1,112±0,770 0,462±0,195 Niveldep P<0,030 P<0,036 DNSPresenciadeascitis Ausente/leve 62 0,546±0,243 Severa 24 0,684±0,321 Niveldep DNS <0,034 DNSPresenciadegangliosafectosenestudiopatológico NO 21 0,486±0,201SI 15 0,333±0,112Niveldep DNS DNS <0,007

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123

DT=DesviaciónTípica;DNS=DiferenciaNoSignificativa

El estado general ECOG se ha relacionado con un mayor nivel de cfDNA115 ycfDNA247, y con un menor nivel de integridad de cfDNA. Un IMC mayor de 25 se harelacionado con un mayor nivel de cfDNA247, sin presentar diferencia significativa encfDNA115 ni en la integridad de cfDNA. La presentación como enfermedad primaria serelaciona conmayoresnivelesde cfDNA tanto115 como247, sin influir en la integridaddelcfDNA.Lapresenciadeascitissolo influyedeformasignificativaenelvalordecfDNA247. ElvalordecfDNA115enausenteoleveascitisfuede1,49371(DT1,040877)yenascitisseverafuemayor,de1,99933(DT1,233368),peroestadiferencianollegóalasignificación(p0,059).LapresenciadegangliosafectosenelexamenpatológicosoloinfluyeenunamenorintegridaddelcfDNA.

Elrestodevariablesclínicasanalizadasnoinfluyendeformasignificativaenelniveleintegridad de cfDNA. Se han evaluado la edad, sensibilidad a platino, tipo histológico deKurman, gradohistológico, estadio tumoral, presencia radiológicade adenopatías ilíacas y/opara-aórticas, tamaño del tumor ovárico y de los implantes peritoneales y presencia deomentalcake.

CTC

Ennuestraserie,lapresenciadeomentalcakehasidolaúnicavariableclínicaquehainfluidodemanerasignificativaenpresentarCTCpositivasonegativas(tabla5.17).El63,2%depacientesconCTCpositivaspresentabanomentalcake.

El resto de variables no han presentado diferencias significativas. Las característicasanalizadashansidoedad,IMC,ECOG,sensibilidadaplatino,presentaciónprimariaorecaída,tipohistológicodeKurman, gradohistológico, estadio, presencia radiológica de adenopatíasilíacas y/o para-aórticas, presencia de ascitis, tamaño del tumor ovárico y de los implantesperitonealesygangliosafectosenelestudiopatológico.

TABLA5.17.InfluenciadelascaracterísticasclínicasenlapresenciadeCTC.Presencia de OmentalCake

SI NO Total Niveldep

PresenciadeCTC CTCpositivas 12(35,3%) 7(15,9%) 19(24,4%) <0,048CTCnegativas 22(64,7%) 37(84,1%) 59(75,6%)Total 34(100,0%) 44(100,0%) 78(100,0%)

Ca125

ElanálisisdelainfluenciadelascaracterísticasclínicasdelaspacientesenelvalordeCa-125, hamostrado que se relaciona de forma significativa con un ECOG 2-3, un IMC>25,presentacióndelCEOcomoenfermedaddedebut,lapresenciadeascitis,untamañomayorde2cmenlosimplantesperitonealesylapresenciadeomentalcake(tabla5.18).

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Resultados

124

Nosehaobtenidodiferenciasignificativaenrelaciónalaedad,sensibilidadaplatino,tipo histológico según modelo de Kurman, grado histológico, estadio tumoral, presenciaradiológicadeadenopatías ilíacasy/opara-aórticas, tamañoováriconigangliosafectosenelestudiopatológico.HemosderesaltarelPCIquirúrgicoquehapresentadounamediade850UI/mL en PCI<=12 y de 1551 UI/mL en PCI>12, pero esta diferencia no ha resultadosignificativa(p0,202).

TABLA5.18.InfluenciadelascaracterísticasclínicasenelvalordeCa125.Característicaclínica N Media Desviacióntípica ValordepECOG ECOG0-1 68 737 1469 <0,003ECOG2-3 20 1528 2011IMC IMC<=25 30 466 609 <0,012IMC>25 58 1150 1925Origendeltumor Enfermedadprimaria 71 1086 1773 <0,001Recaídatumoral 17 211 202Ascitis Ausente 32 270 358 <0,001Leve 32 904 903Severa 24 1796 2718Tamañoimplanteperitoneal Menooiguala2cm 22 860 1954 <0,016Mayorde2cm 35 1142 1995PresenciadeOmentalcake NO 50 708 1379 <0,001SI 36 1253 1930AnálisisrealizadomediantetestnoparamétricoUdeMann-Whitney.

HemosanalizadoelporcentajedepacientesconCa-125mayorde350U/mL,dándoseenel76,5%depacientesconIMC>25,el80%conECOG2-3,el64,8%deenfermedaddedebut,el87,5%conascitissevera,el71,4%conimplantesmayoresde2cmyenel80%conomentalcake.HasidoraroencontrarunvalornormaldeCa-125enloscasosdeascitissevera(solo1pacientede24), implantemayorde2cm (ensolo2de35pacientes).NingúnpacienteconECOG2-3oconpresenciadeomentalcakehapresentadounvalornormaldeCa-125.

HE4

LasvariablesclínicasquehaninfluidodeformasignificativaenelvalordeHE4hansidolapresentacióndelCEOcomoenfermedadprimaria, lapresenciadeascitis,untamañode latumoraciónováricamayorde5cmylapresenciadeomentalcake(tabla5.19).

No se ha obtenido diferencias en relación a la edad, valor de IMC, sensibilidad aplatino, tipo histológico según modelo de Kurman, grado histológico, estadio tumoral,presencia radiológica de adenopatías ilíacas y/o para-aórticas, tamaño de los implantesperitonealesnilapresenciadegangliosafectosenelestudiopatológico.

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Resultados

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TABLA5.19.InfluenciadelascaracterísticasclínicasenelvalordeHE4.Característicaclínica N Media Desviacióntípica ValordepOrigendeltumor Enfermedadprimaria 66 986 1226 <0,001Recaídatumoral 16 147 82Ascitis Ausente 28 337 454 <0,001Leve 32 876 1257Severa 22 1362 1368PresenciadeOmentalcake NO 46 707 1264 <0,002SI 34 1017 987Tamañotumorovárico Menooiguala5cm 17 602 936 <0,033Mayorde5cm 46 1092 1334AnálisisrealizadomediantetestnoparamétricoUdeMann-Whitney.

Un valor de HE4 mayor de 400 pmol/L (5 veces el LSN) se ha dado en el 57% depacientesconenfermedaddedebut,el77,3%conascitissevera,el63,9%conomentalcakey65,2%contumormayorde5cm.Ningunadelaspacientesconascitis,tantolevecomosevera,tuvieronunniveldeHE4normal.

CORRELACIONDEBIOMARCADORESCONLASVARIABLESANALITICASGENERALES

La cuantificación de cfDNA, tanto cfDNA115 como cfDNA247, han sido los BM quemejorcorrelaciónhanpresentadoconlasvariablesanalíticas(vertabla5.20).ElmayorniveldecorrelaciónhasidoconelvalordealbúminaydePMN.

La integridad de cfDNA, sin embargo, no ha presentado correlación con ningunavariableanalítica.

DentrodelosBMdereferencia,HE4hapresentadomayorcorrelaciónqueCa-125,elcual solo ha presentado relación significativa con albúmina y plaquetas. De las variablesanalíticas, laalbúminaha sido laquemejor correlaciónhapresentadocon losBM,mientrasquehemoglobinanoseharelacionadoconningúnBM.

TABLA5.20.Correlacionesdelosbiomarcadoresconlasvariablesanalíticasgenerales. cfDNA115 cfDNA247 Int-cfDNA Ca125 HE4Albúmina -0,343* -0,404* n.s. -0,210** -0,279*Hemoglobina n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.LDH 0,165** 0,171** n.s. n.s. 0,269**PMN 0,194** 0,377* n.s. n.s. 0,164**Plaquetas n.s. 0,311* n.s. 0,220** 0,255**Semuestranlascorrelacionesquehanresultadopositivas.*correlacióndePearson**correlaciónTau-bdeKendallInt-cfDNA=integridadcfDNA;n.s.=nosignificativo;LDH=lactatodeshidrogenasa;PMN=polimorfoneutrófilos

En relación a la presencia de CTC, ésta no se ha relacionado con ninguna variableanalíticageneralanalizada.

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Resultados

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RESUMEN

Hemosresumidoenlatabla5.21lainfluenciadelascaracterísticasclínicasenelvalordelosdiferentesBM.UnestadogeneralECOG2-3serelacionaconunaumentodelvalordelos 3parámetros analizadosde cfDNAydeCa125. La enfermedaddepresentaciónprimariacondicionaunmayorcfDNA115,cfDNA247,Ca125yHE4quelarecaídatumoral.UnvalordeIMCmayorde25condicionaunvaloraumentadodecfDNA247ydeCa125. LapresenciadeascitisserelacionaconaumentodecfDNA247,Ca125yHE4.LapresenciadegangliospositivosenelestudiopatológicosoloserelacionaconlaintegridaddelcfDNA.Lapresenciadeomentalcake resulta el único determinante significativo con CTC, influyendo también en el valor deHE4.Untamañoováricomayorde5cmsoloserelacionaconmayorHE4.

Dentrode lasvariablesanalíticas,elvalordealbúmina,LDHyPMNhansido losquemejor correlación han mostrado con cfDNA. CTC y la integridad de cfDNA no se hanrelacionadoconningunadelasvariablesanalíticasanalizadas.

TABLA5.21.Resumendelainfluenciadecaracterísticasclínicasenelvalordelosbiomarcadores.cfDNA115 cfDNA247 Integridad

cfDNACTC Ca125 HE4

ECOG2-3Enfprimaria

ECOG2-3EnfprimariaIMC>25Ascitis

ECOG2-3Ganglios+

Omentalcake ECOG2-3EnfprimariaIMC>25AscitisImplante>2cmOmentalcake

EnfprimariaAscitisOmentalcakeTamañoovárico>5cm

AlbúminaLDHPMN

AlbúminaLDHPMNPlaquetas

AlbúminaPlaquetas

AlbúminaLDHPMNPlaquetas

Enf=enfermedad;IMC=Indicedemasacorporal;LDH=lactatodeshidrogenasa;PMN=polimorfo-neutrófilos

5.2.4. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LOS TRATAMIENTOS EN EL NIVEL DE

LOS BM.

VALORACIÓNDELAINFLUENCIADELACIRUGÍAPERITONEALPRIMARIA

Elestudiode lavariacióndecfDNAantesydespuésde lacirugíahamostradoqueelvalor de cfDNA115 presentó una disminución significativa, mientras que cfDNA247 y laintegridaddecfDNAnopresentarondiferenciassignificativas(tabla5.22yfigura5.8).LosBMdereferenciaCa-125yHE4hanpresentadoreducciónsignificativaconlacirugía.

TABLA5.22.ValoracióndelefectodelaCPPsobreelvalordelosBM.Biomarcador N Antesdecirugía Despuésdecirugía Niveldep Media±DT Media±DT Ca125 20 467±499 51±65 <0,001*HE4 13 606±974 100±104 <0,001*cfDNA115 14 1,752±1,453 0,993±1,043 <0,016*cfDNA247 14 0,551±0,258 0,409±0,233 0,180**cfDNA-Int 14 0,395±0,184 0,529±0,284 0,119***PruebanoparamétricadeWilcoxon;**T-Studentparamuestrasrelacionadas

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Resultados

127

FIGURA5.8.ValoracióndelefectodelaCPPsobreelvalordelosBM.

LosvaloresdecfDNAsehanmultiplicadox1000paraadecuarsealaescala.*Valorescondiferenciasestadísticamentesignificativas

VALORACIÓNDELAINFLUENCIADELPRIMERCICLODEQT

LacomparacióndelosvaloresantesydespuésdelprimerciclodeQTnohamostradoreducción significativa en ninguno de los valores de cfDNA. Solo presentaron disminuciónsignificativalosBMdereferencia(figura5.9ytabla5.23).

FIGURA5.9.ValoracióndelefectodelprimerciclodeQTsobreelvalordelosBM.

LosvaloresdecfDNAsehanmultiplicadox1000paraadecuarsealaescala.*Valorescondiferenciasestadísticamentesignificativas

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Ca125* HE4* cfADN115* cfADN247 cfADN-Int

M0

M1

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Ca125* HE4* cfADN115 cfADN247 cfADN-Int

1ºcicloQT

2ºcicloQT

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128

TABLA5.23.ValoracióndelefectodelprimerciclodeQTsobreelvalordelosBM.Biomarcador N En1ºcicloQT En2ºcicloQT Niveldep Media±DT Media±DT Ca125 78 829±1725 599±1618 <0,001*HE4 66 759±1193 375±657 <0,001*cfDNA115 74 1,570±1,149 1,450±1,371 0,116**cfDNA247 74 0,563±0,265 0,567±0,422 0,938**cfDNA-Int 74 0,488±0,206 0,481±0,215 0,289**

*PruebanoparamétricadeWilcoxon;**T-Studentparamuestrasrelacionadas;QT=quimioterapia

VALORACIÓNDELAINFLUENCIADEQTNA

La comparación de los BM antes del primer ciclo de QT y antes de CDI solo se harealizadoen9pacientes,sinpresentardiferenciassignificativasenningunodelosvaloresdecfDNA (tabla 5.24 y figura 5.10). Hemos obtenido que laQTNA solo produce una reducciónsignificativaenelniveldeCa-125yHE4.

TABLA5.24.ValoracióndelefectodelaQTNAsobreelvalordelosBM.Biomarcador N En1ºcicloQT(M0) AntesdeCDI(M3) Niveldep Media±DT Media±DT Ca125 40 1378±2260 265±517 <0,001*HE4 39 1076±1380 263±382 <0,001*cfDNA115 9 1,466±0,633 1,252±0,851 0,371**cfDNA247 9 0,590±0,230 0,424±0,198 0,080**cfDNA-Int 9 0,424±0,114 0,420±0,183 0,951***PruebanoparamétricadeWilcoxon;**T-StudentparamuestrasrelacionadasQT=quimioterapia;CDI=cirugíadeintervaloFIGURA5.10.ValoracióndelefectodeQTNAsobreelvalordelosBM.

LosvaloresdecfDNAsehanmultiplicadox1000paraadecuarsealaescala.*Valorescondiferenciasestadísticamentesignificativas

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Ca125* HE4* cfADN115 cfADN247 cfADN-Int

1ºcicloQT

AntesdeCDI

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129

5.2.5. CORRELACIÓN ENTRE LOS DIFERENTES BIOMARCADORES.

Enesteapartado,hemosanalizadolacorrelaciónentrelosBMcuantitativoscontinuosmediantelacorrelacióndePearsonydeKendall.SehaencontradocorrelaciónpositivaentrecfDNA115 y cfDNA247 (r=0,666), y una relación inversa entre cfDNA115 y la integridad decfDNA (r=-0,609). No ha habido correlación de ningún parámetro de cfDNA con los BM dereferencia. Ca125 yHE4hanmostrado correlaciónpositiva conun coeficiente r=0,42. (tabla5.25).Enlafigura5.11sepuedeobservarungráficodedispersióndelascorrelaciones.

TABLA5.25.Correlacionesentrelosdiferentesbiomarcadores. cfDNA115 cfDNA247 Int-cfDNA Ca125 HE4cfDNA115 1 0,666* -0,609* n.s. n.s.cfDNA247 1 n.s. n.s. n.s.Int-cfDNA 1 n.s. n.s.Ca125 1 0,422**HE4 1Semuestranlascorrelacionesquehanresultadopositivas.*correlacióndePearson**correlaciónTau-bdeKendallInt-cfDNA=integridadcfDNA;n.s.=nosignificativoFIGURA5.11.Gráficoconlacorrelaciónentrelasvariablescontinuas.

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ParaelanálisisdelarelacióndeCTCconelrestodeBM,hemoscomparadolasmediasentreelgrupodeCTCnegativasypositivas,encontrandorelaciónsignificativaúnicamenteconelvalordeHE4(tabla5.26).Lamediahasido718±1123pmol/LenelgrupodeCTCnegativasy920±987pmol/LparaCTCpositivas,conniveldesignificaciónp<0,044.ElrestodeBMnomuestradiferenciassignificativas.Enelgráfico5.12puedeverse larepresentacióngráficadelosvaloresdelosBMenfuncióndepositividadonodeCTC.

TABLA5.26.RelacióndeCTCconelrestodeBM.Biomarcador CTC- CTC+ ValordepcfDNA-115 NMedia±DTMediana(mín–máx)

611,621±1,112

1,361(0,185–6,365)

191,843±1,234

1,690(0,564–5,189)

0,463*

cfDNA-247 NMedia±DTMediana(mín–máx)

610,588±0,284

0,550(0,109–1,637)

190,562±0,210

0,516(0,309–0,936)

0,708*

IntegridadcfDNA NMedia±DTMediana(mín–máx)

610,427±0,151

0,420(0,150–0,830)

190,382±0,191

0,300(0,120–0,820)

0,293*

Ca125 NMedia±DTMediana(mín–máx)

611001±1907

409(11–11364)

19741±690

539(83–2408)

0,419**

HE4 NMedia±DTMediana(mín–máx)

56718±1123

238(45–4957)

18920±987

435(106–3718)

<0,044**

*T-Student;**Testnoparamétrico;CTC-:CTCconvalornegativo;CTC+:CTCconvalorpositivo

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131

FIGURA5.12.GráficodecajasdelosBMenfuncióndeCTC.

Eneldiagramadecajassemuestraelmínimo,primercuartil,mediana,tercercuartilymáximo.

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132

5.2.6. VALORACIÓN DEL VALOR PREDICTIVO DE RESPUESTA DE LOS BIOMARCADORES.

5.2.6.1. VALORPREDICTIVORESPECTOALARESPUESTAAQUIMIOTERAPIANEOADYUVANTE.

Sehanincluidolas44pacientesconenfermedadavanzada(estadioIIB-IV)endondesehaindicadotratamientoconQTNAyCDI.SeanalizaelvalorbasalylareduccióntraselprimerciclodeQT.

ValorpredictivodelnivelbasaldelBM

LacomparacióndemediasdelosnivelesbasalesdelosBMentrelosgruposrespuestaynorespuestanoshamostradoquesóloelcfDNA115serelacionadeformasignificativaconrespuesta aQTNA (tabla 5.27 y figura 5.13). Un valormenor de cfDNA115 es predictivo derespuestaaQTNA(p<0,019).

TABLA5.27.ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestaaQTNA.Biomarcador Respuesta†

Norespuesta‡

Valordep

cfDNA115 NMedia±DTMediana(mín–máx)

341,398±0,816

1,298(0,185–4,407)

92,195±1,072

2,321(0,564–3,696)

<0,019*

cfDNA247 NMedia±DTMediana(mín–máx)

340,523±0,212

0,504(0,109–0,986)

90,758±0,422

0,661(0,309–1,637)

0,139*

IntegridadcfDNA NMedia±DTMediana(mín–máx)

340,424±0,145

0,405(0,14–0,77)

90,371±0,111

0,370(0,23–0,55)

0,313*

Ca125 NMedia±DTMediana(mín–máx)

351509±2384

576(18–11364)

9763±719

645(78–2465)

0,673**

HE4 NMedia±DTMediana(mín–máx)

341000±1253

550(86–4957)

91447±1545

1100(90–4879)

0,455**

*T-Student;**Testnoparamétrico†Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;‡Norespuesta=enfermedadestable+progresión.

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133

FIGURA5.13.ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestaaQTNA.

Eneldiagramadecajassemuestraelmínimo,primercuartil,mediana,tercercuartilymáximo.DNS=diferencianosignificativa

ValorpredictivodelareduccióndelBMtrasunciclodeQT

Se han incluido 41 pacientes para el análisis. Primero se ha estudiado el valorpredictivodelareduccióndelniveldecfDNArespectoaunciclodeQT.Lacomparacióndelasmedias del porcentaje de reducción no ha mostrado diferencias respecto a ningún cfDNA(tabla5.28).Unhechoadestacaresqueen laspacientesquenohanrespondidoaQTNA lamediadecfDNA115haaumentado,aunquenoalcanzalasignificación.LamediaenelcasodecfDNA247ylaintegridaddecfDNAhaaumentadoenlosdos.DelosBMdereferencia,ambos

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134

han disminuido su valor en los dos grupos, pero solo una mayor reducción de HE4 se harelacionadodeformasignificativaconrespuestaaQTNA(p<0,38).

TABLA 5.28. Valor predictivo de la reducción de los BM tras un ciclo de tratamiento respecto a larespuestaaQTNA.Biomarcador N Respuesta†

N Norespuesta‡

Niveldep

Mediareducción±DT Mediareducción±DT cfDNA115 31 0,14±75 9 -19±114 0,833**cfDNA247 30 -18±106 9 -30±132 0,973**cfDNA-Int 31 -23±68 9 -22±43 0,859**Ca125 33 36±33 8 32±24 0,599**HE4 31 45±31 7 13±53 <0,038*SemuestralamediadelporcentajedereduccióndelBMyladesviacióntípica(DT)entreelvalorbasalytrasunciclodeQTNA.*T-Student;**Testnoparamétrico†Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;‡Norespuesta=enfermedadestable+progresión.

ValorpredictivodelapresenciadeCTC

El análisis del valor de la presencia de CTC respecto a la respuesta a QTNA no hamostradodiferenciassignificativas(p0,479),esdecir,lapresenciadeCTCnoespredictivoderespuestaaQTNA(tabla5.29).

TABLA5.29.ValorpredictivodeCTCrespectoalarespuestaaQTNA. Respuesta†

Norespuesta‡

Total

RR

(IC95%)Valordep

CTCCTCnegativas 25(80,6%) 6(19,4%) 31(100%) 1,152

(0,741–1,790)0,479

CTCpositivas 7(70,0%) 3(30,0%) 10(100%)Total 32 9 41†Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;‡Norespuesta=enfermedadestable+progresión.Análisismultivariante

ParaelestudiomultivariantehemosvaloradolacapacidadpredictivadelnivelbasaldecfDNA115 en función de las variables clínicas que presentaron relación significativa con larespuestafinal.Sehanincluidountotalde43pacientes.Traselanálisismultivariante,eltipohistológico II deKurmanyunnivelbasalbajode cfDNA115 son lasdosúnicas variables convalorpredictivoestadísticamentesignificativo(tabla5.30).

TABLA5.30.AnálisismultivariantedelosfactoresrelacionadosconrespuestaaQTNA.Característicaclínica:RespuestaaQTneoadyuvante

Valordep OR(IC95%)

Ausenciaolevepresenciadeascitis 0,213 Gradohistológico2-3 0,548 TipohistológicoIIdeKurman <0,026 9,318(1,309–66,353)NivelbasaldecfDNA115bajo <0,041 2,535(1,040–6,179)

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135

5.2.6.2. VALORPREDICTIVODERESULTADOÓPTIMODELVALORPREVIOACIRUGÍA.

Se han incluido 52 pacientes con enfermedad avanzada (estadio IIB-IV) que fueronintervenidasconintenciónradical,tantocirugíaprimariacomodeintervalo(tabla5.31yfigura5.14).

LosresultadosobtenidosmuestranqueelniveldeintegridaddecfDNAhasidoelúnicovalordecfDNAquesehasidopredictivoderesultadoóptimodecirugíaperitoneal.DelosBMdereferenciasóloHE4hamostradorelaciónsignificativaconcirugíaóptima.ElvalordeCa-125muestra diferencia de 564 UI/mL en R1-2 frente a 187 UI/mL en cirugía R0, pero estadiferencianohaalcanzadolasignificaciónennuestraserie(p0,094).

TABLA5.31.ValorpredictivoderesultadoóptimodelvalorprevioacirugíadelosBM.Biomarcador ResultadoR0 ResultadoR1-2 ValordepcfDNA115 NMedia±DTMediana(mín–máx)

211,407±0,730

1,286(0,34–2,73)

71,603±2,135

0,942(0,40–6,36)

0,254**

cfDNA247 NMedia±DTMediana(mín–máx)

210,467±0,176

0,462(0,16–0,76)

70,556±0,349

0,412(0,27–1,29)

0,381*

IntegridadcfDNA NMedia±DTMediana(mín–máx)

210,387±0,156

0,420(0,19–0,73)

70,544±0,224

0,640(0,20–0,83)

<0,050*

Ca125 NMedia±DTMediana(mín–máx)

40187±313

55(10–1436)

12564±721

202(24–1877)

0,094**

HE4 NMedia±DTMediana(mín–máx)

36205±326

94(16–1884)

11465±525

331(69–1875)

<0,021**

*T-Student;**Testnoparamétrico

FIGURA5.14.ValorpredictivodelniveldelosBMrespectoalresultadoóptimodecirugía.

(continúa)

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Resultados

136

FIGURA5.14.(continuación)

Eneldiagramadecajassemuestraelmínimo,primercuartil,mediana,tercercuartilymáximo.

Posteriormente,hemosrealizadoelestudiodelvalorpredictivodelapresenciadeCTCrespectodecirugíaóptima(tabla5.32).Hemosanalizadoa53pacientesconestadioavanzadointervenidosdeCPPoCDI,mostrandoquelapresenciadeCTCtienetendenciaapredecirunresultadodecirugíaóptimaR0,perosinalcanzarlasignificación(p0,066).

TABLA5.32.ValorpredictivodeCTCrespectoacirugíaóptimaR0. CirugíaR0 CirugíaR1-2 Total RR

(IC95%)Valordep

CTCpositivas 8(100,0%) 0(0,0%) 8(100,0%) 1,452(1,193–1,767)

0,066CTCnegativas 31(68,9%) 14(31,1%) 45(100,0%Total 39 14 53

Análisismultivariante

EnelanálisismultivariantehemosanalizadolasvariablesclínicasjuntoconlosBMquehanresultadosignificativosenelunivariante.Sehanpodidoanalizar40pacientesconestadioavanzadoen lasqueseharealizadoCPPoCDI.El resultadomuestra lasdosúnicasvariablespredictivasdecirugíaR0quesemantienensonunPCI≤12yunniveldealbúminamayoroigualde3,5gr/dL(tabla5.33).LamayorasociaciónlapresentaelvalordelPCIquirúrgicoconunaORde77,857(p<0,002).NosehaincluidoelvalordelaintegridaddecfDNAporelescasonúmerodeeventosresultante.

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Resultados

137

TABLA5.33.AnálisismultivariantedelvalorpredictivoderesultadoquirúrgicoóptimoR0.Característicaclínica Valordep OR(IC95%)IMCmenorde25 0,064 3,838(0,923–15,963)ECOG0-1 0,778 Ausenciadeascitisoleve 0,508 Ausenciadeomentalcake 0,735 PCI≤12 <0,002 77,857(4,864–1246,164)Albúmina<3,5gr/dL <0,042 0,063(0,004–0,903)NiveldeHE4antesdelacirugía 0,479 PresenciadeCTCpositivas 0,259 OR=oddsratio;IC95%=intervaloconfianza95%

5.2.6.3. VALORPREDICTIVORESPECTOALARESPUESTATUMORALFINAL.

Se han incluido 71 pacientes con enfermedad avanzada (estadio IIB-IV) en donde esvalorablelarespuestafinal.Sehandesestimadolaspacientesconpérdidadeseguimiento,lasfallecidasporotracausaenlasquenohapodidovalorarselarespuestaylaspacientesqueaúnestánentratamiento.Seanalizaelvalorbasalyelvalorpost-quirúrgicodelBM.

ValorpredictivodelnivelbasaldelBM

LacomparacióndemediasdelosnivelesbasalesdelosBMentrelosgruposrespuestaynorespuestamuestraquenohaydiferenciassignificativasenningúnBM(tabla5.34).Porlotanto,ennuestra serieelnivelbasalde losBMnopresentavalorpredictivode la respuestatumoralalfinalizareltratamientoconquimioterapiaycirugía.

TABLA5.34.ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestafinal.Biomarcador Respuesta†

Norespuesta‡

Valordep

cfDNA115 NMedia±DTMediana(mín–máx)

541,502±0,964

1,333(0,185–5,189)

151,733±1,124

1,738(0,408–3,438)

0,430*

cfDNA247 NMedia±DTMediana(mín–máx)

540,539±0,251

0,514(0,109–1,637)

150,597±0,290

0,648(0,176–1,221)

0,453*

IntegridadcfDNA NMedia±DTMediana(mín–máx)

540,421±0,158

0,425(0,12–0,83)

150,423±0,195

0,380(0,23–0,99)

0,967*

Ca125 NMedia±DTMediana(mín–máx)

56886±2870

415(11–8964)

151234±2879

335(29–11364)

0,844**

(continúa)

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Resultados

138

TABLA5.34.(continuación)Biomarcador Respuesta†

Norespuesta‡

Valordep

HE4 NMedia±DTMediana(mín–máx)

53798±1153

356(45–4957)

15966±1361

160(52–4879)

0,684**

*T-Student;**Testnoparamétrico†Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;‡Norespuesta=enfermedadestable+progresión.

En la figura 5.15podemos ver gráficamente enundiagramade cajas la ausencia dediferenciasentrelosvaloresbasalesdelosBMenfuncióndepresentarrespuestatumoralonotrasfinalizareltratamiento.

FIGURA5.15.ValorpredictivodelnivelbasaldelosBMrespectoalarespuestafinal.

Eneldiagramadecajassemuestraelmínimo,primercuartil,mediana,tercercuartilymáximo.

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Resultados

139

Valorpredictivodelvalorpost-quirúrgicodelosBM

NingúnvalordecfDNAtrascirugíahasidopredictivoderespuesta final.ElúnicoBMquepresentavalorpredictivohasidoCa-125(p<0,001)(tabla5.35).

TABLA5.35.ValorpredictivodelniveltrascirugíadelosBMrespectoalarespuestafinal.Biomarcador Respuesta†

Norespuesta‡

Valordep

cfDNA115 NMedia±DTMediana(mín–máx)

451,187±0,898

0,882(0,214–4,462)

51,610±1,711

1,016(0,607–4,648)

0,370*

cfDNA247 NMedia±DTMediana(mín–máx)

450,430±0,210

0,386(0,141–1,092)

50,446±0,366

0,306(0,197–1,092)

0,881*

IntegridadcfDNA NMedia±DTMediana(mín–máx)

450,448±0,214

0,380(0,17–1,18)

50,314±0,058

0,320(0,23–0,39)

0,174*

Ca125 NMedia±DTMediana(mín–máx)

5251±62

31(5–347)

6533±522

386(34–1534)

<0,001**

HE4 NMedia±DTMediana(mín–máx)

4584±65

64(43–431)

6215±216

124(48–594)

0,128**

†Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;‡Norespuesta=enfermedadestable+progresión.

Elestudiodelarelacióndelarespuestaconunareducciónmayordel50%dasimilaresresultados, siendo significativo sólo con HE4 (RR 1,376, p<0,022). El resto de BMmuestrandiferenciasnosignificativas.

ValorpredictivodelapresenciadeCTC

ElanálisisdelapresenciadeCTCrespectoalarespuestafinalseharealizadosobre65pacientes,noencontrandodiferenciassignificativasenladistribución(tabla5.36).Porlotanto,lapresenciadeCTCnopresentavalorpredictivoderespuestaalfinalizareltratamiento.

TABLA5.36.ValorpredictivodeCTCrespectoalarespuestafinal. Respuesta†

Norespuesta‡

Total

RR

(IC95%)Valordep

CTCCTCnegativas 40(76,9%) 12(23,1%) 52(100%) 0,909

(0,690–1,197)0,546

CTCpositivas 11(84,6%) 2(15,4%) 13(100%)Total 51 14 65†Respuesta=respuestacompleta+respuestaparcial;‡Norespuesta=enfermedadestable+progresión.

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Resultados

140

Análisismultivariante

Para el análisismultivariante se ha incluido el valor post-quirúrgico de Ca-125 y lasvariablesclínicasenfermedadprimaria,ausenciaolevepresenciadeascitis,PCImenoroiguala12yelresultadoóptimodecirugía(tabla5.37).Elestudioseharealizadosobre56pacientes.Hemos obtenido que solo el valor de Ca-125 post-quirúrgico presenta valor predictivo derespuestafinaldeformasignificativa.Elmodeloactualexplicaelresultadoenun82,4%(testde Nagelkerke). No se ha incluido la variable respuesta a QTNA debido a que obtenemosresultadosnoválidos.

TABLA5.37.Análisismultivariantedelosfactoresrelacionadosconrespuestafinal.Característicaclínica:Respuestaalfinalizareltratamiento

Valordep OR(IC95%)

Enfermedadprimaria 0,884 Ausenciadeascitisoleve 0,539 PCImenor/iguala12 0,598 ResultadodecirugíaR0 0,411 Ca125post-quirúrgico 0,032 1,026(1,002–1,050)

OR=oddsratio;IC95%=intervalodeconfianzadel95%

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Resultados

141

5.2.7. VALORACIÓN DEL VALOR PRONÓSTICO DE LOS BIOMARCADORES.

5.2.7.1.VALORPRONÓSTICODESUPERVIVENCIALIBREDEPROGRESIÓN(SLP).

Parael análisis de la SLPhemos incluidoa todas laspacientesmenos los2 casosdepérdidadeseguimientotraseliniciodeQT(tabla5.38yfigura5.16-17).MediantelaaplicacióndecurvaROCsehancalculadolosnivelesdecortedelosBMquemaximizaladiscriminaciónderecaída(figura5.16ytabla5.38).FIGURA5.16.AreabajolacurvadelosBMrespectoaSLP.

TABLA5.38.ValoresdeROC,sensibilidadyespecificidaddelosBMparaSLP.Biomarcador AUC Valordecorte Sensibilidad EspecificidadcfDNA115 0,544(0,411–0,678) 1,633 54,1% 70,7%cfDNA247 0,575(0,447–0,704) 0,569 54,1% 63,4%cfDNA-Int 0,509(0,380–0,639) 0,425 45,9% 51,2%Ca125 0,451(0,322–0,580) 497,5 45,9% 48,8%HE4 0,541(0,410–0,671) 376,0 45,9% 51,2%cfDNAsecalculaenng/mcL;Ca-125enU/mL,HE4enpmol/L.

Conestosvaloresdecorteseharealizadoelanálisisunivariantedelosvaloresbasales,

que ha mostrado que cfDNA115 y cfDNA247 son factores pronósticos de SLP (tabla 5.39 yfigura 5.17). Sin embargo, ni la integridad de cfDNA ni la presencia de CTC han tenidocapacidad pronóstica. Respecto a la disminución de BM con el primer ciclo de QT, unareduccióndelaintegridaddecfDNAmayorde50%hasidofactordemalpronóstico:4delas5pacientesquehanpresentadoestevalorhanprogresado.

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Resultados

142

Respecto a los BM de referencia, los valores basales no han presentado valorpronóstico,perosílareduccióndeun50%delvalordeCa-125yHE4.TABLA5.39.ValorpronósticodelosBMrespectoalaSLP.Biomarcador N Nº

eventosMedia

(estimaciónenmeses)

IC95% Log-rank Valordep

NIVELESBASALESDEBIOMARCADOREScfDNA115 Menor/igualavalordecorte 50 17 18,0 14,4–21,6

7,233

<0,007Mayoravalordecorte 34 20 10,0 7,5–12,5cfDNA247 Menor/igualavalordecorte 45 17 17,3 13,6–20,9

4,029

<0,045Mayoravalordecorte 39 20 11,1 8,2–14,0IntegridadcfDNA Menor/igualavalordecorte 42 20 14,4 10,9–18,0

0,652Mayoravalordecorte 42 17 15,2 11,4–19,1CTC CTCnegativa 61 25 15,9 12,8–19,0

0,526CTCpositiva 18 8 13,0 7,6–18,3Ca125 Menor/igualavalordecorte 45 20 15,5 11,8–19,1

0,875Mayoravalordecorte 41 17 15,1 11,5–18,8HE4 Menor/igualavalordecorte 42 20 13,1 9,9–16,3

0,425Mayoravalordecorte 38 17 15,9 12,2–19,7REDUCCIONDELBIOMARCADORCONELTRATAMIENTO cfDNA115 Reducciónmayora50% 13 4 17,6 11,7–23,5

0,516Reducción≤50% 60 28 14,9 11,9–17,9cfDNA247 Reducciónmayora50% 12 3 11,8 9,6–13,9

0,341Reducción≤50% 60 28 15,2 12,1–18,3IntegridadcfDNA Reducciónmayora50% 5 4 6,4 2,8–10,0

3,885

<0,049Reducción≤50% 68 28 16,0 13,1–19,0Ca125 Reducciónmayora50% 40 9 20,9 17,0–24,7

11,233

<0,001Reducción≤50% 38 26 10,8 8,1–13,6HE4 Reducciónmayora50% 27 8 18,0 13,1–22,9

4,749†

<0,029Reducción≤50% 43 25 12,7 9,5–16,0LosvaloresdecfDNAsehancomparadoenfunciónde lamediana.Ca-125sehacomparadoenfuncióndelvalor500U/mLyHE4respectoalvalor400pmol/L.†TestdeBreslow

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Resultados

143

FIGURA5.17.CurvasdeSLPenfuncióndelvalorbasaldelosBM.

Enlafigura5.18seaprecialadivergenciadelascurvasSLPenfuncióndelareducciónmayordeun50%trasunciclodeQTrespectoalvalorbasaldelaintegridaddecfDNA,Ca-125yHE4.

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Resultados

144

FIGURA5.18.CurvasdeSLPenfuncióndelareduccióndelvalordelBMtrasunciclodeQT.

SolosemuestranlascurvasdelosBMcondiferenciassignificativas.

Análisismultivariante

Parael análisismultivariantemediante regresióndeCox sehan valorado losnuevosBMque han resultado significativos respecto a las variables clínicas. Al cierre de la base dedatossolohanocurrido14recaídasevaluablesportodoslosparámetros.ElresultadomuestraquehansidofactorespronósticospositivosdeformasignificativaunPCImenor/iguala12,larespuestaaQTNAyunadisminucióndelaintegridaddecfDNAmenordel50%(tabla5.40).Ennuestraseriehemosobtenidoquepresentarunadisminucióndela integridadmayorde50%suponeun99%deprobabilidaddepresentarpeorSLP. Enelanálisisno sehan incluido losganglios linfáticos afectos en el estudio patológico debido al bajo número de pacientesresultante.TABLA5.40.Análisismultivariantedelvalorpronósticodesupervivencialibredeprogresión.Característicaclínica Valordep HR(IC95%)Estadiotumoral 0,213 Ausenciadeomentalcake 0,655 Resultadodecirugía 0,655 PCImenor/igualde12 <0,001 8,335(2,370–29,311)RespuestaaQTNA <0,002 16,074(2,781–92,891)ReduccióndelaintegridaddecfDNAmayorde50% <0,020 0,027(0,001–0,560)cfDNA115 0,693 cfDNA247 0,253

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Resultados

145

5.2.7.2.VALORPRONÓSTICODESUPERVIVENCIAGLOBAL(SG).

Sehanvaloradountotalde86pacientesparaelestudiodeSG,habiendocensurado

sololasdospacientesperdidasdeseguimiento.PrimeroseharealizadoanálisisdecurvaROCparaestablecerelvalordelavariablequemaximiceeláreabajolacurva(grafico5.19ytabla5.41).

GRAFICO5.19.AreabajolacurvadelosBMrespectoaSG.

TABLA5.41.ValoresdeROC,sensibilidadyespecificidaddelosBMparaSG.Biomarcador AUC Valordecorte Sensibilidad EspecificidadcfDNA115 0,569(0,406–0,732) 1,703 60,0% 70,7%cfDNA247 0,590(0,430–0,730) 0,651 55,0% 74,1%cfDNA-Int* 0,492(0,344–0,639) cfDNA-Int** 0,517(0,371–0,663) 0,405 56,3% 60,0%Ca125 0,540(0,401–0,679) 497,5 60,0% 55,2%HE4 0,597(0,452–0,742) 309,0 60,0% 50,0%cfDNAsecalculaenng/mcL;Ca-125enU/mL,HE4enpmol/L.*NosecalculaelvalordebidoaquepresentaunAUCmenorde0,5.**CalculodecfDNA-Intparaelvalornocáncer.

Conestosvaloresdecorteseharealizadoelanálisisunivariantedelosvaloresbasales,quehamostradoquecfDNA115ycfDNA247sonfactorespronósticosdeSG(tabla5.42yfigura5.20).Unnivelmayor que el valor de corte ha supuestounadisminuciónde la SGde 6 y 7meses respectivamente. La presencia de CTC también ha presentado valor pronóstico,pasandolaSGde19,8a30,4mesesencasodepositividadoausencia,respectivamente.

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Resultados

146

RespectoaladisminucióndecfDNAconelprimerciclodeQT,ningunodesusvaloreshapresentadovalorpronóstico.LareduccióndelaintegridaddecfDNAmayorde50%nohasidofactordemalpronósticodeSG,perosólohapresentadohastalafecha2fallecimientosdelas5pacientesquepresentanesevalor.

RespectoalosBMdereferencia,ningunodelosvaloresbasalesnilareducciónconlaQThanpresentadovalorpronóstico.TABLA5.42.ValorpronósticodelosBMrespectoalaSG.Biomarcador N Nº

eventosMedia

(estimaciónenmeses)

IC95% Log-rank Valordep

NIVELESBASALESDEBIOMARCADOREScfDNA115 Menor/igualavalordecorte 53 8 28,7 25,5–32,0

7,308

<0,007Mayoravalordecorte 31 12 22,5 16,3–28,8cfDNA247 Menor/igualavalordecorte 55 9 28,4 25,3–31,6

8,707

<0,003Mayoravalordecorte 29 11 21,1 14,2–28,0IntegridadcfDNA Menor/igualavalordecorte 40 12 21,2 17,7–24,7

0,178Mayoravalordecorte 44 8 30,3 25,7–35,0CTC CTCnegativa 60 10 30,4 26,5–34,3

4,649

<0,031CTCpositiva 17 6 19,8 12,7–26,9Ca125 Menor/igualavalordecorte 45 8 28,1 24,5–31,7

0,123Mayoravalordecorte 41 12 25,3 19,8–30,7HE4 Menor/igualavalordecorte 38 8 26,7 22,4–31,0

0,473Mayoravalordecorte 42 12 26,3 21,2–31,4REDUCCIONDELBIOMARCADORCONELTRATAMIENTO cfDNA115 Reducciónmayora50% 13 3 19,5 14,3–24,8

0,622Reducción≤50% 60 14 28,9 25,0–32,9cfDNA247 Reducciónmayora50% 12 2 16,2 14,6–17,9

0,436Reducción≤50% 60 15 26,1 22,7–29,4IntegridadcfDNA Reducciónmayora50% 5 2 20,8 11,8–29,8

0,559Reducción≤50% 68 15 28,9 25,1–32,8Ca125 Reducciónmayora50% 40 6 27,0 22,9–31,1

0,363Reducción≤50% 38 12 27,2 22,3–32,1HE4 Reducciónmayora50% 27 5 26,7 21,6–31,9

0,263Reducción≤50% 43 13 26,3 21,3–31,3IC95%=intervalodeconfianzadel95%

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Resultados

147

FIGURA5.20.CurvasdesupervivenciaglobalenfuncióndelvalorbasaldelosBM.

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Resultados

148

Enlafigura5.21podemosobservarlasgráficasdeSGdelareducciónmayordel50%sobrelosvaloresdecfDNA.Ningunohapresentadopoderpronósticodeformasignificativo.

FIGURA5.21.CurvasdeSGenfuncióndelareduccióndelvalordelBMtrasunciclodeQT.

Análisismultivariantedesupervivenciaglobal

Porúltimo,hemosrealizadoestudiomultivariantemedianteregresióndeCoxdetodoslos factores que en nuestra serie han influido sobre la SG en el univariante, incluyendovariables clínicas y de BM. Para la inclusión de todas las variables, el análisis se ha podidorealizarsobre37pacientes,habiendoocurridosolo9eventos.NosehaincluidolarespuestaaQTNAnilasensibilidadaplatinoporelbajonumerodeeventosresultante.

ElresultadonosmuestraquesólounvalordePCImenor/iguala12eselquemantieneunvalorpronósticosignificativodeSG,conHR0,068(IC-95%0,008–0,557;p<0,012)(tabla5.43).

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Resultados

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TABLA5.43.Análisismultivariantedelvalorpronósticodesupervivenciaglobal.Característicaclínica Valordep HR(IC95%)Ausenciaascitisoleve 0,253 Ausenciadeomentalcake 0,360 Respuestaalfinalizareltratamiento 0,215 Niveldealbúminanormal 0,616 Niveldehemoglobinanormal 0,494 PCImayorde12 <0,012 0,068(0,008–0,557)CTCnegativas 0,358 cfDNA115 0,814 cfDNA247 0,664

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Resultados

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6. Discusión

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Discusión

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6.1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LOS SUJETOS INCLUIDOS

Enlosúltimosañoshahabidouncrecienteinterésenelestudiodecélulastumoralescirculantes (CTC) y ADN libre circulante (cfDNA) como nuevos biomarcadores (BM) en losprocesosneoplásicos.Encarcinomaepitelialdeovario(CEO)losestudioshansidopequeñosy,lamayoríadeveces,conresultadoscontradictorios.Nuestrotrabajopretendeaclararsupapelpredictivoypronósticoenestapatología.

El estudio se ha desarrollado en dos centros hospitalarios de la Región de Murciadurante38meses,habiendoincluidountotalde88pacientes.EstetamañomuestralsuponeeltercermayorestudiodecfDNAenpacientes conCEOque sehacomunicado,quedandopordetrásdeKamatetal349con164pacientesySteffensenetal347con144pacientes.EnrelaciónaCTC,corresponderíaal8ºestudioenordendetamaño.

6.1.1. ESTUDIO DESCRIPTIVO DE LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LA MUESTRAPACIENTES

Elanálisisdelascaracterísticasclínicasdenuestraserienosmuestraunapoblacióndepacientes similar a otros trabajos publicados5, 104, 130, 148, 158, 143,353, y que refleja la actividadhabitual de nuestras consultas. Solo ha habido ciertas diferencias que comentamos acontinuación.

Elíndicedemasacorporal(IMC)hasidomayoraldeotrasseriespublicadas158,353.Ennuestroestudio lamayoríadepacienteshapresentado sobrepesoyhastaun terciodeellasobesidad,segúnladefinicionesdelaOrganizaciónMundialdelaSalud354.Variosestudiosyunmeta-análisishan relacionado laobesidadyel sobrepesoconmayor riesgodeCEO32. Elquehallamospresentadomayor IMCpuedeestarcondicionadoporelalto índicedesobrepesoyobesidadquepresentalapoblacióndelaRegióndeMurcia355yporqueuncriteriodeinclusiónde nuestro trabajo fuera el presentar CEO avanzado, que suele conllevar aumento delperímetroabdominalymayorIMC.

ElestadogeneralECOGhasidoglobalmentepeorqueenotrasseries104,148,158,347,conun22,7%quehanpresentadounECOG2-3.Estopuededeberseaqueennuestroestudionose exigiera el requisito de presentar un buen estado general, que suele ser habitual paraparticipar en los ensayos clínicos104,150. Se precisaba solo que la paciente fuera candidata arecibir QT. Este aspecto ha conllevado que más pacientes de la práctica clínica habitualpudieranparticiparenelestudioy,conello,mayorafectacióndelestadogeneral.

En relación al tratamiento de las pacientes en fases avanzadas, éste suele ser unacombinacióndecirugíaperitonealcompletayquimioterapiabasadaencompuestosdeplatino.No obstante, existe controversia en relación a la mejor secuencia de tratamiento140.Clásicamentesehaindicadocirugíaperitonealprimaria(CPP)yquimioterapia(QT)adyuvanteposterior,peroenlaúltimadécadacuatroestudiosprospectivosyunmetanálisis,comparandoestasecuenciaconladeQTneoadyuvante(QTNA)ycirugíadeintervalo(CDI),hanmostradosimilares resultados de eficacia pero con una menor morbilidad en la CDI, por lo que laaplicacióndeesteplanteamientoterapéuticoestáaumentando134-138.Peseaestosresultados,

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en algunas guías se sigue recomendando CPP y QTA si es factible118. En la guía americanaconjuntadelaño2016de laSociedaddeGinecologíaOncológicay laSociedadAmericanadeOncología Médica, se sugiere realizar QTNA y CDI en aquellas pacientes con alto riesgoperioperatorio y cuando haya baja probabilidad de alcanzar un resultado óptimo R0; en lassituacionesendondelapacientepresentebuenestadogeneralyenfermedadpotencialmenteresecable, laguíarecomiendavalorarentreambasopciones,CPPoQTNA,sinpredominiodeunasobrelaotra133.Ennuestroestudio,trasservaloradaencomitédetumoresginecológicosycarcinomatosis,elplandetratamientoinicialdelaspacienteshasidoprincipalmenteelusodeQTNAyCDI,enun56,8%.Enestosresultadosinfluyendeformaimportanteelhechoqueun 20% de pacientes incluidas fueran por recaída tumoral y que un 22,7% presentaran unestadogeneralECOG2-3.

Respectoalprocedimientoquirúrgico, enlasúltimasguíassehaconsideradocirugíaóptimacomoaquellasinenfermedadresidual,llamadacirugíaR0110,118,131.EnnuestroestudiofueconsideradacirugíaR0enel77,3%de laspacientes, loque indicaunaalta calidadde lacirugía peritoneal realizada en nuestro centro. En otras series publicadas el resultado decirugíaóptimaR0hasidomenor104,130,353.Enestealtoporcentajealcanzadoennuestraserie,influye laaltacualificacióndenuestroequipoquirúrgicocomo lugardereferenciadecirugíaperitonealyelaltoporcentajedeCDIrealizadasennuestrocentro.Estoestáenconcordanciacon los resultados reportados en el brazo de CDI de los estudios de EORTC-55971134 yCHORUS135,en losquealcanzaronporcentajesmayoresdecirugíaóptimaqueenelbrazodeCPP.

Variablesdeseguimiento.

Elacontecimientodeeventosestálimitadoporelcortoseguimientodenuestraseriealcierredelabasededatos.Atendiendoalasrecaídastumoralespresentadashastalafecha,hemosobtenidounporcentajedepacientesresistentesyrefractariosaplatinomáselevadodeloesperado.Estamayortasapuededebersealhechodehaberincluidopacientesenrecaída,incluso 3 de ellas ya eran platino-resistentes a su inclusión, y porque en 35 pacientes lasensibilidadtodavíanohasidovalorable,debidoprincipalmenteaqueaúnnohanpasado6mesesdesdeque finalizaronel tratamiento conQT.Un seguimientomásprolongadopodríamodificarestosresultados.

Hemos tenido 4 muertes durante el tratamiento, un 4,5% de todas las pacientes,siendo2deellasporcomplicacionespost-quirúrgicas,1porepisodiodeTEP fulminante trasiniciarQTNAylaotrapacientedecausanoaclaradamientrasrecibíaQTNA.Esteporcentajehasidomayorqueotrasseriespublicadas,endondehaydescritaunamortalidadde2,5-6%enelbrazodeCPPyde0,7-1%enelbrazodeCDI134,135.Conlaintencióndehallarfactoresclínicosquenosexpliquenestaaltamortalidad,hemosvueltoaanalizarestaspacientes,encontrandorelación solo con un estadio IIIC, presente en las 4, y con la presencia de ascitis severa,omentalcakeehistologíatipoIIdeKurmanquesehadadoen3delaspacientes.EnlasdospacientesintervenidasserealizóCDI,presentandouníndicedecarcinomatosisperitoneal(PCI)de22y17,loquepuedeinfluirensuevolución351.

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6.1.2. COMPARACIÓNDE EDADYPARÁMETROSANALÍTICOS ENTREPACIENTESYGRUPOCONTROL.

Laedad de las pacientes ha sido similar a las series publicadas277,289,342,347,349. En lamuestradepacienteshasidosignificativamentemayorqueenelgrupocontrol,aunqueestadiferencia solo fue respecto al grupo de tumores benignos. Los controles sanos hanpresentado edad similar al grupo pacientes, pues fueron voluntarias seleccionadas bajo esecriterio.Enelgrupodetumoresbenignoshahabidounaedadmediamenordebidoalamayorprevalenciadetumoresbenignosenpacientesjóvenes.

Respectoa losparámetros analíticos generales, lamuestrapacienteshapresentadodiferentesnivelesdeformasignificativadetodaslasvariables.Hanhabidovaloresmásbajosde albúmina y de Hb, y más elevados de LDH, PMN y plaquetas, reflejando la influenciasistémicadelCEOcondeteriorodeparámetrosrelacionadosconelestadogeneralytambiénconsideradoscomoreactantesdefaseaguda.Estoindicaunmayorestrésinflamatoriogeneralen el grupodepacientes, justificadopor el procesoneoplásico.Dehecho, ningunade estasvariableshapresentadodiferenciasentreelgrupodetumoresbenignosyeldesujetossanos.EstonossugierequesepodríaconsideraralCEOcomounprocesoinflamatoriosistémicoynosoloperitoneal.

6.1.3. ANÁLISISUNIVARIANTEDELVALORPREDICTIVODELASVARIABLESCLÍNICAS.

Unaspectodesumaimportanciaesanalizarlosfactorespredictivosderespuestaparaseleccionar el tratamiento más adecuado a cada paciente, pues determinará su evoluciónclínicaposterior.Enlaliteraturasehandescritosnumerososfactoresclínicospredictivos,tantode respuesta a quimioterapia como de cirugía óptima 57, 59, 135, 143, 144,356. En la base a unarevisión de estas variables,Mark et al140 establecen 5 categorías de pacientes en estadio IIIpara sugerir CPP o QTNA, en función de lamejor respuesta esperable: en las dos primerascategoríaseltumorselocalizaenlapelvis,recomendandoCPP;enlacategoría3,eltumorselocaliza en el abdomen superior pero sin ascitis masiva ni precisar resección digestiva,recomendando CPP; en la categoría 4 es similar a la 3 pero precisando resección digestiva,recomendando CPP pero en caso de bajo ECOG o edad avanzada valorar QTNA; y en lacategoría5presentaafectaciónperitonealimportante,recomendandoQTNA.

Ennuestroestudiohemosobtenidounaseriede factorespredictivosquepasamosacomentar.

LarespuestaaQTNAhasidoelfactorpredictivoquehapresentadolamayorfuerzadeasociación con la respuesta tumoral tras completar el tratamiento. Es evidente que en laspacientes que tengan progresión tumoral durante la QTNA se desestimará la cirugía deintervalo, implicando una enfermedad refractaria a QT con muy mal pronóstico48, 60. Lalimitaciónaeste factor,esquenodisponemosdemarcadoresprecocesquenosmidanestarespuesta, debiendo esperar a recibir 2-4 ciclos de QT para valorarla. Por ello, numerosostrabajosbuscanmarcadoresqueprediganlarespuestatraseliniciodeltratamiento.

La histología tumoral también ha presentado un importante valor predictivo. Lapresencia de un tipo histológico II de Kurman o un grado histológico alto se relacionan conmayor respuestaaQT. Esmás, estosdos factoreshan sido losúnicosquehandeterminado

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unarespuestasignificativaaQTNA.Elhechodequeambasvariablesresultensignificativasnosconfirma esta relación con la respuesta, pues el tipo histológico II de Kurman son siempretumoresdealtogradohistológico.NuestrosdatosconcuerdanconladiferentesensibilidadaplatinodescritaenlaclasificacióndeKurmanyShihparaeltipohistológicoIyeltipoII59.Otrosestudios también han confirmado el valor predictivo a QT que presenta el tipo y gradohistológico57,59,135.Por lotanto,esteaspectoesunode loscriteriosatenerencuentaen laindicacióndelplandetratamientoalapaciente.

Laextensiónde la carcinomatosisperitonealhasidoelmayorcondicionanteparaelresultado quirúrgico en nuestro estudio. La ausencia o leve cuantía de ascitis, ausencia deomentalcakeyunPCImenor/iguala12hanpresentadolamayorasociaciónconunresultadoquirúrgico óptimo. Estos datos se han confirmado en otras series publicadas 143,144,357. A suvez,elresultadodecirugíaR0 juntoconlaextensióndelaafectaciónperitonealdeterminanengranmedidalarespuestafinalaltratamiento.Estonosindicalaimportanciaderealizarunexhaustivo abordaje de la afectación peritoneal, tanto diagnóstico como quirúrgico, yseleccionaradecuadamentealaspacientesquesepuedenbeneficiarmásdel iniciodeCPPode QTNA133, 140, 143. En este sentido, el valor de PCI se ha constituido en una herramientafundamentalparavalorarlaextensiónperitonealdelaenfermedad.Inicialmenteplanteadoenelcampooperatorioencarcinomadecolon358,suusosehaidoextendiendoaotraspatologíascondiseminaciónperitonealcomoelCEO351.

La presentación primaria ha sido otro factor predictivo en nuestra serie. Estaspacienteshanpresentadomayorporcentajederespuestaquelaspacientesenrecaída,debidoalamayorsensibilidadaquimioterapiayalamayorindicacióndecirugíaperitoneal48,168.

OtrosfactorespredictivosdenuestroestudiohansidounIMCmenoroigualde25,unECOG0-1ypresentarunnivelnormaldealbúmina.

6.1.4. ANÁLISISUNIVARIANTEDELVALORPRONÓSTICODEVARIABLESCLÍNICAS.

Numerosos trabajos han descrito diversos factores pronósticos en CEO avanzado,siendolosdosmásimportanteselestadiotumoraly laenfermedadresidualtrascirugía5,104.Otras variables con valor pronóstico han sido el grado y el subtipo histológico, la edad, elestadogeneralECOGypresenciadeascitissevera5,104,105,106,107,359.

En nuestro estudio hemos obtenido una serie de factores pronósticos que han sidoconfirmados en la mayoría de series, tales como la sensibilidad al tratamiento conquimioterapia basada en platino9,48,60, la respuesta a QTNA48,60, extensión de la afectaciónperitoneal, el estadio tumoral5,104,130, la enfermedad residual tras la cirugía5,104,130,353,359, laedad104,130, laafectaciónlinfática115yalteracióndeparámetrosanalíticoscomolaalbúminaylaHb233.

Respecto a la sensibilidad a platino, este ha sido el mayor determinante desupervivencia global (SG). De hecho, hasta la fecha ninguna paciente sensible a platino hafallecidoencomparaciónde15de26pacientesresistentes.Estásuficientementedemostradoqueunarecaídaprecozoduranteeltratamientoimplicaunaenfermedadconresistenciaalostratamientosyprecariaevolución9,48,60.

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Elestadiotumoraly laenfermedadresidual tras lacirugíahansidofactorpronósticodesupervivencia libredeprogresión(SLP)peronodeSG,mostrandounatendenciaperosinllegar a la significación. Este hecho puede justificarse por el escaso seguimiento de nuestrotrabajo,conpocoseventoshastalafechaparaSG.

La extensiónde la afectaciónperitoneal,medidapor el valor PCI quirúrgico, ha sidootro importante factor pronóstico de SLP y de SG en nuestra serie, confirmado en otrasseries358. Otros factores relacionados con la diseminación peritoneal como ascitis severa ypresenciadeomentalcake tambiénhansidofactorespronósticosnegativosparaSG.Estohasido descrito en lamayoría de las series 104,359y confirma, como ya dijimos previamente, lagranimportanciadelavaloracióndelaafectaciónperitoneal.

Destacamos también el nivel de albúmina, que se sitúa como un importante factorpredictivo de respuesta y pronóstico de SG. Este parámetro analítico se relaciona con laafectación del estado general y es considerado un reactante de fase aguda, implicando unmayorestrés inflamatoriogeneral.Su implicaciónpronóstica tambiénhasidoencontradaenotrasseries104,233.Dehecho,Chietal234desarrollaronunnomogramaparapredecirlaSGa5añosenCEOtraslacirugíaperitonealprimaria,endondeelvalorséricodealbúminaesunodelos7parámetrosincluidos.

6.2. BIOMARCADORES PLANTEADOS EN ESTE TRABAJO

Losbiomarcadores(BM)Ca-125yHE4sonlosúnicosaprobadosparasuusoclínicoenCEO. Para mejorar las limitaciones que presentan, otros marcadores alternativos se estáninvestigando,perolamayoríanohansidoaúnvalidadosclínicamente186.LaeleccióndelosBMpropuestos aquí sedebea la apariciónen la literaturadenumerosos trabajosendiferentestumores que informan de su papel predictivo y pronóstico, tanto de las células tumoralescirculantes (CTC) como del ADN circulante plasmático (cfDNA) 244, 245, 247, 248, 301, 328, 338. Sinembargo,enCEOhaypocosestudiosqueanalicenestosnuevosBM.

LaeleccióndelmétododeestudiodeCTCmedianteCellSearch©serealizóporqueeselúnicométodoactualmenteaprobadoporlaUSFoodandDrugAdministración.Hansurgidovariacionesqueintentanmejorarlasensibilidadyespecificidad281,286,292,perohastaahoranosehanestandarizado.

Para el análisis de cfDNA en oncología, actualmente hay una enorme diversidad deprocedimientos para su estudio 310, 328, 331, 335, 337, siendo especialmente variable en CEO endondecadagrupodeinvestigaciónhaempleadounametodologíadiferente342,343,345,346,347,348.En el presente trabajo, la cuantificación del cfDNA se ha determinado mediante PCR enTiempo Real utilizando el fluorocromo SYBR Green (Takara).La cuantificación mediantemétodos espectrofotométricos (NanoDrop®) o fluorométricos (Qubit®) puede proporcionaruna evaluación imprecisa del ADN válido en la muestra. Estos métodos normalmentesobreestimanlaconcentracióndeADNyselimitanamuestrasdeconcentraciónrelativamentealta y de buena calidad como, por ejemplo, sangre, muestras congeladas frescas o célulascultivadas, pero tienen un rendimiento bajo con muestras de menor calidad y no puedendistinguir entre ADN circulante y ADN genómico de alto pesomolecular. Por lo tanto, para

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muestrasdebajacalidad(p.ej.,Muestrasfijadasenformalina,parafina)ymuestrasdecfDNAse recomienda lacuantificaciónmedianteunmétodocuantitativo (PCRcuantitativa–qPCR),utilizandoampliconescortosylargosparadeterminarconprecisiónlaconcentraciónycalidaddelADNde lamuestra360.Sehadecididousar ladeterminaciónmediante lassecuenciasALUconqPCRdebidoaquerepresentaunodelosprocedimientosmásempleadoyaceptadoenlamayoríadeestudios328,332,333,334.

Otroaspectoadestacar, esque conesteprocedimiento seobtienen tres valoresdecfDNA (cfDNA115, cfDNA247y la integridadde cfDNA). En los trabajospublicadosnoquedaclaro cual es el quemejor candidato a BM 328,333,334,336, por ello en nuestro estudio hemosanalizadolastresvariables,paradeterminarcualeslaquemejorserelacionaconelCEOysuevoluciónclínica.

6.2.1. ESTUDIODESCRIPTIVODELNIVELBASALDELOSBIOMARCADORESENELGRUPODEPACIENTES.

Las variables de cfDNA han presentado una distribución normal de sus valores conescasadispersión.Lacomparaciónde lacuantificaciónmediadecfDNAconrespectoaotrostipostumorales,comocáncerdecolon,próstataycáncergástrico332,334,336,361,nosmuestraunvalor inferiorennuestraserie.Estonos indicaríaqueenelCEOhabríaunamenorexpresiónsistémicade ladestruccióncelular tumoraly/ounamenordestruccióncelular respectoa losotros tipos tumorales. No obstante, esta comparación hay que tomarla con cautela, puespequeñas diferencias en la metodología usada pueden determinar los resultados. Hay quetener en cuenta que hay muchos factores que pueden influir, desde el tipo de tubos deextracciónempleados,procesamientoycongelaciónde lasmuestras,extracciónyanálisisdecfDNA.Porejemplo,laintegridaddecfDNAencáncerdecolonenunestudioobtienenvaloresmenores y en otro valoresmayores que en nuestra serie 328,332. Una estandarización de losprocedimientos sería fundamental para poder realizar una verdadera comparación deresultadosentrediferentestumores.

RespectoalapresenciadeCTC,ennuestraseriesehandetectadoenel23,8%delaspacientes, considerando un resultado positivo como aquelmayor o igual a 1 CTC/7,5ml desangre periférica. Este porcentaje ha sido similar a otras series publicadas, aunque hay queresaltarlagranvariabilidadenlascomunicaciones,relacionadaprobablementecondiferenciasen lametodologíadedetecciónyanálisisdeCTC283,288.Algunosautoreshanconsideradounresultadopositivocomoladeteccióndemásde1CTC/7,5ml282,289,290.Ennuestroestudio,ladetecciónde2omásCTC/7,5mlhasidode12,5%,enconsonanciaconelestudiodePovedaetal289.EstapresenciadeCTChasidomenorqueloscomunicadosenotrostiposdeneoplasias,comocáncerdemama,próstataocolon244,247,250,278.EstopuedejustificarsedebidoalabajadiseminaciónvíahematógenadelCEOyalaposiblemenorexpresióndeEpCAMqueparecentenerlascélulasdeCEO279,286,287.

Los niveles de Ca-125 y HE4 se han encontrado elevados en la mayoría de laspacientes, con un valor medio similar a otros estudios 134, 143,362,363. Es de destacar la grandispersión que presentan sus valores, que también ha sido pareja a lo publicado en laliteratura.

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6.2.2. ESTUDIOCOMPARATIVODELOSBIOMARCADORESENTREELGRUPOPACIENTESYELGRUPOCONTROL.

ComparacióndeBMentregrupopacientesygrupocontrol

La comparación entre el grupo pacientes y el grupo control nos ha mostradodiferencias significativas de todos los BM analizados (tabla 5.12 y 5.14). Se han obtenidovalores mayores de la cuantificación de cfDNA y mayor presencia de CTC en el grupo depacientesrespectoaloscontroles,aexcepcióndelaintegridaddecfDNAquepresentamenorvalor. Esto refleja la mayor destrucción celular en la muestra pacientes, propio de unapatología neoplásica, que se ha confirmado en todas las series300, 301, 310, 328, 349, 350. Entre elgrupodetumoresbenignosyeldecontrolessanosnohahabidodiferenciassignificativasparaningún BM, lo que indica que la patología benigna no supone un aumento de la actividadcelularquepromuevaunaumentosignificativodeBM.

El biomarcador cfDNA115 cuantifica el cfDNA total circulante, pues mide losfragmentospequeños y grandesdel ácidonucleico circulante328. El hechoque seamayorenpacientesqueencontroles reflejaría lamayordestruccióncelularqueocurreenelgrupodepacientesyqueseexpresaenlacirculación.Estoconcuerdaconlamayoríadepublicacionesen cáncer de ovario342,344,345,346,349y también en otros tipos de neoplasias 328,332,337,338, endondelascifrasdecfDNAenelgrupoconcáncersonmayoresalgrupocontrol.Hayqueteneren cuenta que el cfDNA de las pacientes esta compuesto por la fracción de cfDNA que seproduceencondicionesfisiológicasmáslaparteespecíficaderivadadeltumor.Elaumentodesusvaloresenpacientes implicaqueenelCEOseproduceunacantidadsuficientedecfDNApor parte del tumor que se libera a la circulación para que su valor aumente de formasignificativa.Además,cfDNA115enlamuestrapacientespresentaunamayordispersióndesusvaloresqueentrelosotrosdosgrupos,debidoalamayoractividadcelularqueseproduceenunprocesoneoplásicocomoelCEO,dandolugaraunamayorvariabilidaddesusniveles.Porello,en losotrosdosgruposcontroles ladispersiónesmenor,convaloresmáshomogéneosdebidoaquelaúnicafuentedecfDNAesladestruccióncelularfisiológica.Diversosprocesosinflamatorios como enfermedades sistémicas activas302, traumatismos303, hemodiálisis304,sepsis305, infarto agudo de miocardio306 y otros300, 301, 307, se han descrito que inducen unaumento del cfDNA,motivo por el cual estas alteraciones han sido criterio de exclusión ennuestro estudio, para que el único origen del incremento de cfDNA en el grupo de sujetossanosfueralaactividadfisiológicanormal.

ElbiomarcadorcfDNA247serelacionaconlacuantificacióndefragmentosgrandesdecfDNA,losquemidenmásde247paresdebases328.Ennuestraserie,losvaloresdecfDNA247también han sido mayores en pacientes que en controles, aunque en menor medida quecfDNA115 y centrándose esta diferencia sólo entre el grupo pacientes y el de tumoresbenignos,nohallandodiferenciasconelgrupodecontrolessanos.Ladispersióndelosvaloressemantienesimilarentrelostresgrupos.EstopuedejustificarseporunamenorproduccióndefragmentosgrandesdeADN(cfDNA247)porpartedelCEO.

El valor de integridad de cfDNA, que es la relación cfDNA247/cfDNA115, refleja laproporcióndefragmentosgrandespresentesenelcfDNA328.Ennuestraserielaintegridadha

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sidomayorenelgruposano,queeneldetumoresbenignosyqueenelgrupopacientes,condiferenciaestadísticamentesignificativaentresanosypacientes(tabla5.12,5.13yfigura5.6).

Estosdatossonmuy importantesatenerencuenta.Elhechodequeeste índiceseamenor en el grupo pacientes nos indica que, aunque haya mayor expresión periférica dedestruccióncelularenelCEO,comodeducimosdelaumentodecfDNA115ycfDNA247,éstaproporción de aumento es menor para fragmentos grandes de cfDNA y mayor para losfragmentespequeños(aumentaproporcionalmentemáscfDNA115quecfDNA247).Dadoquelos fragmentospequeñosdecfDNAserelacionanmásconapoptosiscelular 300,322,324,325,328ylosfragmentosgrandesdecfDNAserelacionanmásconnecrosiscelular324,328,nosindicaríaqueelmecanismoprincipaldedestruccióncelularenelCEOseríalaapoptosiscelular,másquela necrosis celular. Derivado de esto y porque es el único que presenta diferenciassignificativasentrepacientesy losotrosdosgrupos,elvalordecfDNA115seríaelquemejorreflejaraladinámicadecfDNAenelCEO.

Otrasneoplasiascomocáncerdecolon,mamaypróstatapresentanmayorintegridadde cfDNAen el grupodepacientes que en el grupo control de forma significativa 328,334,340.Estoindicaríaunpapelpredominantedelanecrosistumoralenladestruccióncelularglobalenestostipostumorales.

Porotro lado,sehacomunicadoqueesteaumentode la liberacióndecfDNAocurreinclusodesdeetapasinicialesdelaenfermedad.EneltrabajodeNayoukietal328encáncerdecolonseconstataunaumentodecfDNAdeformasignificativaenelestadioprecozrespectoalgrupo control. El-Gayar et al332 en cáncer de colon y Sozzi et al337 en cáncer de pulmón,sugieren un posible papel en el screening en sujetos de alto riesgo. Aunque este no era unobjetivo de nuestro trabajo, pues está dirigido al CEO de estadio avanzado, hemos re-analizado a las 8 pacientes que finalmente presentaron un estadio precoz (I-IIA). En estesubgrupo hemos obtenido que cfDNA también ha sido estadísticamentemayor que los dosgruposcontroles,convalordecfDNA1,619vs0,849ng/mcL,respectivamente(p<0,043).Porello,podríahaberunposiblepapeldiagnósticoenlafaseinicialdelaenfermedadquedeberíaserexploradoenfuturosestudios.

Respectoa lapresenciadeCTC,sucomparaciónentrepacientesygrupocontrolnoshamostrado una clara diferencia, pues solo una paciente de tumores benignos presentó 1CTC/7,5ml, yningunodelgrupodesanos.Ennuestra serie, la sensibilidadde lapruebashasidomuybaja,deun23,8%comoyahemoscomentadoenelapartadoanterior,aunquehapresentado una muy alta especificidad y valor predictivo positivo, del 96,7% y 95%respectivamente.Estosdatossonsimilaresaotrasseriespublicadas,mostrandoqueaunqueCTCpresenteunabajasensibilidad,suespecificidadespróximaal99-100%277,278,289.Estonosindica un posible papel en el diagnóstico diferencial de una tumoración ovárica: aunque nopodamosdescartaraunapacientecuandotengaunresultadonegativodeCTC,supresencianosindicaríaconmuyaltaprobabilidadlaexistenciadepatologíaneoplásica.Elinconvenientees su baja sensibilidad, por lo que se deberían promover cambios en la metodología paramejorarlaslimitacionesdedeteccióndeCTCdelmétodoCellSearch©.

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AnálisisdecurvaROCparadiscriminarentrepacientesygrupocontrol

El análisis de la capacidad de discriminación de los BM para el diagnóstico de CEOrespectoanopresentar tumor,noshamostradoquecfDNAnomejora los resultadosde losBMdereferencia.Losvaloresmásaltosdeáreabajolacurva(AUC)correspondenaCa-125yHE4, con 0,96 y 0,94 respectivamente. Estos valores, al igual que los de sensibilidad yespecificidad,hansidosimilaresalosdescritosenotrasseries86,209,211,220,223,362.

LosvaloresdeAUCdecfDNAennuestraseriehansidodiscretos,conelmayorvaloralcanzado por cfDNA115 con 0,76. Consecuentemente, la sensibilidad y especificidad decfDNA115hansidomenoresquelosBMdereferencia(tabla5.15).EstabajaespecificidadhasidounodelosmayoresinconvenientesachacadosalanálisisdecfDNA,puesenélseagrupaADNprovenientedeltumoryADNprovenientedecélulassanas300,301.DentrodelasdiversasseriespublicadasenCEO,algunashanpresentadovaloresdeAUCsimilaresalanuestra328,332,345,mientrasqueenotrashanalcanzadovaloresmayores346,349.EnelmetanálisisdeZhouetal350,con462pacientesconCEOy407controlesprovenientesde9 estudios,sealcanzaunamenorsensibilidadperounamayorespecificidadqueennuestrotrabajo,conunAUCde0,89.No obstante, los estudios fueron pequeños, la mayoría retrospectivos y hubo granheterogeneidad,por loque los resultadoshayque tomarlos conprecaución.Estonos indicaque, aunque los niveles de cfDNA son mayores en pacientes con CEO respecto a tumoresbenignosysujetossanos,esteBMtieneunarelevanciadiagnosticalimitada.Algunosautoresindicanque,debidoaestafaltadeespecificidad,elcfDNAnoseríaútilcomoBMdiagnósticoaislado,sugiriendosucombinaciónconotrosBM301.Enotrostipostumorales,comocáncerdemama y melanoma, pudiera tener mayor utilidad diagnóstica, con valores de AUCgeneralmentemayoresqueennuestroestudio338,339.

LaintegridaddecfDNAennuestroestudiohamostradounAUCmenorquecfDNA115.Enotrostipostumorales,comocáncerdecolonypróstata,laintegridadhamostradounmejorperfil comoBMque la cuantificaciónde cfDNA301,328,329,333. Estopuededebersea lamenornecrosistumoralqueocurreenelCEOrespectoalosotrostipostumorales,comohemosvistopreviamente,yporello,menos influenciasobrecfDNA247y la integridaddecfDNA,ymayorinfluenciasobrecfDNA115quereflejaríamejorlaapoptosiscelularpredominanteenCEO.

Por ello, podemos concluir que cfDNA115 no mejora los resultados de losbiomarcadoresde referenciaCa-125yHE4yque,dadosudiscretovalordeAUC,no tendríautilidadañadidaparaeldiagnósticodiferencialdeuntumorovárico.Noobstante,estetrabajoestádirigidoa laspacientesconestadioavanzado.Unaspectoaevaluaren futurosestudiosseráelpapeldecfDNAenelestadioprecoz,comohemosvistoanteriormente.

6.2.3. INFLUENCIADELASCARACTERÍSTICASCLÍNICASDELASPACIENTESENELVALORDELOSBIOMARCADORES.

Enlosestudiospublicadossehandescritopocosfactoresclínicosrelacionadosconelvalor de cfDNA. En el estudio de No et al343 sólo encontraron asociación con el subtipohistológico seroso,perono conel restodevariables. Enel trabajodeWimbergeret al342 elnivel de cfDNA se relacionó con el residuo tumoral tras la cirugía. Zachariah et al 345 noencontraron influenciadeninguna variable clínico-patológica. Sin embargo, enel estudiode

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Kamatetal349encontraroninfluenciaconvariosfactores,entreelloselestadiotumoral,gradohistológicoalto,ganglioslinfáticosafectosydelapresenciadeascitis.

En nuestra serie, los factores clínicos relacionados con cfDNA han sido el estadogeneral ECOG y el origen primario del tumor frente a recaída tumoral. Otros factoresencontrados como un IMC mayor de 25, la presencia de ascitis y la presencia de ganglioslinfáticosafectoshayquevalorarlosconcautela.

ElestadogeneralECOGseharelacionadocontodoslosvaloresdecfDNA,reflejandoestehechoelefectoquelacargatumoraltendríasobrelasituaciónclínicadelapaciente.UnestadoECOG2-3 seha relacionado conmayores valoresde cfDNAymenor integridad. EstarelacióntambiénhasidodescritaporeltrabajodeSteffensenetal347,ynossugierequecfDNApodría serunbuen indicadorde la carga sistémicade laenfermedad, con repercusiónenelestadogeneraldelapaciente.

Lapresentación primaria tambiénhadeterminadounmayornivelde cfDNA.Quizásesto sea debido al retraso diagnóstico de las pacientes que debutan con la enfermedadrespectoa laspacientesenrecaída,de lasquemuchassondiagnosticadosenlaspruebasdeseguimientoaúnenfaseasintomáticay,porlotanto,conenfermedadmáslocalizadaymenorcargatumoral.

La valoración de la influencia de las otras tres variables que han resultadosignificativassobrelosnivelesdecfDNAdebesercautelosa.UnniveldeIMCmayorde25soloconlleva diferencias en cfDNA247 y no de cfDNA115, que es el parámetro quemás parecerelacionarseconlaactividaddelCEO.TampocoserelacionacondiferenciasenlaintegridaddecfDNA.EstosedeberíaadiferenciasmínimasenlaexpresiónsistémicadefragmentosgrandesdecfDNAquealcanzanlasignificación,peroquenolleganaalterarelíndicedeintegridaddecfDNA.Estehechopodríajustificarsedebidoaquelaobesidadseharelacionadoconmayoresnivelesde radicales libresenelorganismoconpotencial citotóxico.Esteaumentodelestrésoxidativo conllevaría a mayor destrucción celular mediante mecanismos degenerativos einflamatorios364,queaumentaríasolofragmentosgrandesdecfDNA.EsteaumentodecfDNAenlaobesidadsehademostradorecientementeenotraspatologías365.Decualquierforma,laimplicaciónclínicadeestehechoesdiscutible,puestoqueaumentaríaelcfDNAdeorigennotumoralporlapropiaobesidad.

Lapresenciadeascitisseveraydegangliosafectosenelestudiopatológicosolosehanrelacionado con uno de los tres valores de cfDNA, y ninguno con cfDNA115. Estos dosparámetrosclínicoshansidorelacionadosconcfDNAeneltrabajodeKamatetal349,aunquesolo en el estudio univariante, no en el multivariante. En otras neoplasias la afectaciónganglionartambiénseharelacionadoconcfDNA338,339,340,.Decualquierforma,noquedaclaroel motivo de que estos parámetros solo afecten a un valor de cfDNA y no a todos. Segúnnuestros resultados la ascitis se asociaría a un aumento de fragmentos grandes de cfDNA,quizásdebidoaunamayornecrosiscelularomayorcomponenteinflamatoriodelaafectaciónperitoneal.Swisheretal366encontraronqueenlamayoríadeCEOconascitishabíaDNAlibretumoralenelfluidoperitonealyenlamitaddetectaronDNAtumoralenplasma.Estosugiereque la ascitis se relaciona con una mayor liberación de DNA tumoral a la circulación. LaafectaciónganglionarserelacionaríaconvariaciónenlarelacióndefragmentosdecfDNAperosinmodificar su cuantificación total. Enel trabajodeNaoyuki et al340 en cáncerde colon, la

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afectaciónganglionarserelacionómejorconlaintegridadqueconlacuantificacióndecfDNA.Estopodríaserunmarcadorprecozdeafectaciónganglionar.Dehecho,noseharelacionadoconningúnotroBM,nisiquieraconlosBMdereferencia.Loquenoquedaclarosonlascausasdeestehallazgo.

Porotrolado,hayqueseñalarquelaedadnohasidounfactorquehayadeterminadodiferenciasenelniveldecfDNA.Estosehaconfirmadoenlamayoríadelasseries343,344,347,349.Por lo cual, ladiferenciadeedadquehabíaentreCEOy tumoresbenignosno influiríaen ladiferenciadenivelesdecfDNAentrelaspacientesyelgrupocontrol.

Un aspecto interesante a destacar es que, como acabamos de ver, el valor decfDNA115 solo se ha visto influido por la situación de debut de la enfermedad frente a larecaídatumoral.EstonosindicaquelaliberaciónsistémicadecfDNAesindependientedelascaracterísticasdeltumorydelapaciente,siendounmecanismocomúndetodoslossubtiposdeCEO,comosehacomprobadoenotrostrabajos345,349.

El análisis de la relación entre cfDNA y lasvariables analíticas generales planteadasnoshamostradoquecfDNAse relacionaconparámetrosde reactantesde faseaguda, talescomoalbúmina,LDH,PMNyplaquetas,aunqueenungradobajo.Estoserelacionaríaconlosprocesos inflamatorios derivados del proceso neoplásico, conllevando destrucción celular yliberacióndecfDNAycitocinas,queaumentaríanlosnivelesdereactantesdefaseaguda300,301.EstarelaciónhasidomayorconcfDNAqueconlosBMdereferencia,loqueindicaquecfDNAreflejaríamejoreldañocelulareinflamatorioqueocurreeneltumor.Elhechoquelamayorasociación sea con cfDNA247 sería debido a la mayor actividad inflamatoria asociada a lanecrosistumoralfrentealaapoptosiscelular.Losmayoresíndicesdecorrelaciónhansidoconelniveldealbúmina,conunarelaciónnegativamoderada.Esto, juntoconsurelaciónconelvalordeECOG,confirmaríaqueelniveldecfDNApodríaserunbuenBMdelaafectacióndelestadogeneral.Nohemosencontradoningúnotrotrabajoenlaliteraturaquehayaexploradoesteaspecto.

Respectoa lapresencia de CTC,ennuestraseriesolosehavisto influenciadopor lapresencia deomental cake (OC). En estas pacientes las CTC han sido positivas en el 35,3%,frenteal15,9%enlasquenopresentabanOC.Elrestodevariablesnohamostradodiferenciassignificativas.Losestudiospublicadoshanrelacionadodiferentesparámetrosclínicos,comoelestadogeneralECOG289,lapresenciadeascitis289,293,277yelestadiotumoral284,293.Sinembargo,enotrasseriescomoladeLiuetal290nosehaencontradorelaciónconningunacaracterísticaclínica. No obstante, la relación de nuestro estudio con la presencia de OC y la relaciónobservada en otros trabajos con la presencia de ascitis y el estadio tumoral, sugieren unaimportanteasociaciónentrelaafectaciónperitonealylapresenciadeCTC.

Las CTC no han presentado relación con las variables analíticas generales, lo quepodría justificarsepor sudiferenteorigen.Mientrasque lapresenciadeCTC sedeberíaa laliberación de células tumorales viables en la circulación, el aumento de reactantes de faseaguda se debería a la destrucción celular y liberación de citocinas. Esto sugiere que laliberacióndeCTCnoimplicamayordestruccióncelular.

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6.2.4. INFLUENCIADELOSTRATAMIENTOSENELNIVELDEcfDNA.

VariostrabajoshananalizadoelefectodelostratamientoenlosvaloresdecfDNA,conresultadossugerentesdeunposiblepapelen lamonitorizaciónde la terapia310,328,335,342,346,.Incluso en modelo murino se ha visto que también los ácidos nucleicos circulantes semodificanenfuncióndelarespuestaaltratamiento311.

Ennuestraserie,lostratamientosaplicadosenelCEOhaninfluidodediferenteformaen los niveles de cfDNA. La cirugía peritoneal primaria ha producido una reducciónsignificativa del valor de cfDNA115 (ver tabla 5.36 y figura 5.8). Esto refleja la disminucióngeneral de la carga tumoral tras la intervención. Se sabe que los valores de cfDNA semantienenaltoshasta10díasalmenostraslacirugía,peroalmessehannormalizado346.Ennuestroestudio,elanálisistraslacirugíaserealizóalos30díasdelaintervención,porloqueladeterminaciónno reflejaríael componente inflamatoriode lacirugía. LosotrosvaloresdecfDNAnohanmostradodiferencias significativas.Esteaspectohasidopocoexploradoen laliteratura.Capizzietal346analizanelvalordecfDNAencirugíadeintervalo,perosinencontrardiferencias significativas antes y después de la intervención. Nuestros datos indican que ladisminucióndecfDNA115podríaservircomoBMde la reducciónde lacargatumoral tras lacirugía.

Respecto alefecto de la QT, hemosobtenidoque ésta influye de forma leve en losvaloresdecfDNA.ElniveldecfDNA115muestraunatendenciaaladisminuciónperosinllegara ser significativa. Es interesante apreciar que lamayor reducción seproduce tras el primerciclodeQT,siendo ladisminucióntrascompletar laQTNAmás leve (figura5.9y5.10).Enelestudio de Capizzi et al346 realizaron determinaciones de cfDNA en cada ciclo de QT,encontrandodiferenciassolodeladeterminaciónbasalantesdeltratamientoconrespectoalresto de ciclos, pero no de los valores de los siguientes ciclos entre sí. En el estudio deWimberger et al342 determinaron cfDNA antes y después de completar toda la QT,encontrandodiferencias significativas, aunquenohicierondeterminaciones seriadasduranteel tratamiento para poder comprobar esta observación. En otros tipos de neoplasias, comocáncerdecolon, sehavistoque losvaloresseriadosdurante laQTmuestranrelacióncon laevoluciónclínica,peroconmuchasfluctuacionesensusvalores335.

EstaausenciadeefectosignificativodeltratamientodeQTsobreelniveldecfDNA,nosindica que no sería un buen biomarcador de la evolución del tratamiento en el CEO. Sinembargo, los BM de referencia Ca-125 y HE4 si han visto influido sus niveles tanto por lacirugíacomoporlaQT,porloqueseríanmejorescandidatosparamonitorizareltratamientoquecfDNA.

6.2.5. CORRELACIÓNENTRELOSDIFERENTESBIOMARCADORESENELCEO.

LosvaloresdecfDNAsolohanmostradorelaciónsignificativaentreellos.cfDNA115ycfDNA247 han presentado una relación positiva, alcanzando el mayor coeficiente decorrelacióndenuestrotrabajo,conr=0,666,quepuedeconsiderarseunacorrelaciónalta.Estehechonosmuestraquelosdosvalorespresentanunacinéticalineal,debidoalaliberacióndeamboscfDNApor ladestruccióncelularenelCEO.EntrecfDNA115y la integridaddecfDNA(recordemos que es la proporción cfDNA247/cfDNA115) también ha habido una relación

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significativaalta,peromostrandounarelacióninversaconcoeficientedePearson-0,609.EstonosconfirmaqueelmecanismoprincipaldedestruccióncelularenelCEOsería laapoptosiscelular, como hemos visto anteriormente, pues el aumento de cfDNA115 es mayorrelativamenteque cfDNA247, conquién tiene relaciónpositiva. Enel estudiodeEl-Gayar etal332 en cáncer de colon encuentran una débil relación positiva entre cfDNA115 e índice deintegridad(r=0,31;p0,006).Enestecaso,debidoaqueelmecanismopredominantesería lanecrosis celular, conaumentoprincipalmentede fragmentosgrandesdecfDNA,el índicedeintegridadpresenta relación linealpositivaconcfDNA115,pueshaymayoraumento relativodecfDNA247.

RespectoalaposiblerelaciónentrecfDNAy lapresenciadeCTC,ennuestroestudionohemosencontradoasociaciónsignificativa(tabla5.25yfigura5.12).Estonosindicaríaquela dinámica de ambos BM seguiría un proceso diferente y serían independientes en laevolución tumoral. No obstante, recordemos que dentro del cfDNA está incluido el ADNproveniente del tumor, llamado ADN tumoral circulante (ctDNA) y el derivado de ladestrucción fisiológica.EnelestudiodeSchwarzenbachetal341 sobrecáncerdepróstata,noobtuvieron relación entre CTC y cfDNA, pero sí hubo relación entre CTC e inestabilidad demicrosatélites del cfDNA, más relacionado con ctDNA. En el estudio de Dawson et al367encáncer demama, que comparó la presencia de CTC y ctDNA, sí encontraron relación entreambos.Porello,parecequelapresenciadeCTCsoloserelacionaríaconctDNAperonoconelcfDNAtotal.Noobstante,elhechoquenosemodifiquecfDNApodríadeberseobienaquelavariaciónde ctDNA respectoaCTC sea significativaperopequeña,no consiguiendovariar lacuantificación del cfDNA total de forma significativa, o bien a que la proporción de ctDNAsobre el total de cfDNA sea baja para que su modificación represente una alteraciónsignificativa del global. A pesar de que la proporción de ctDNA es variable, se sabe que encasosdealtaactividadtumoralpuedellegaraserpredominante301,313,322,porlocual lafaltade relación con cfDNA se debería más bien al efecto del primer mecanismo propuesto, esdecir,quelavariacióndectDNArespectoaCTCseapequeña.

En relación con los BM de referencia, en nuestra serie no hemos encontradocorrelaciónsignificativaconlosvaloresdecfDNA(tabla5.25yfigura5.12).Enlaliteraturahahabidoresultadoscontradictoriosalrespecto.EnlamayoríadeestudiosnosehaencontradocorrelaciónentrecfDNAyCa-125343,345,347,aunqueenlaseriedeKamatetal349siseencontró.Elhechoqueenlamayoríadetrabajos,incluidoelnuestro,noseencuentrecorrelaciónentreambosseríadebidotambiénasudiferentemecanismodeproducciónydinámicatumoral.

LasCTCsolohanpresentadorelaciónsignificativaconHE4.EnlaseriedeObermayeretal277 también confirman una relación conHE4. Sin embargo, no hemos hallado relación condiferenciasignificativaentreCTCyCa-125,algoquesíhasidocomunicadoenotrasseries277,289, 293, 295 y en el metanálisis de Zhou et al285, aunque en otros estudios no lo hanconfirmado247. No encontramos una razón que justifique esta falta de relación en nuestroestudio. Valorando los datos, quizás la gran dispersión de los datos que han presentado laspacientesconCTCnegativasencomparaciónconlaspacientesconCTCpositivapuedainfluiren esta cuestión.De hecho, lamedia de Ca-125 en las pacientes conCTC negativas ha sidomayorqueenaquellasconCTCpositivas,mientrasquelamedianahasidoalcontrario,debidoaqueestamedidacentralestámenosinfluidaporlosvaloresextremos.Porello,serepitieron

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los cálculos con el logaritmo neperiano de Ca-125 para solventar este problema, pero ladiferenciatampocoalcanzólasignificación.

6.2.6. ANÁLISISUNIVARIANTE YMULTIVARIANTEDEL VALOR PREDICTIVODE RESPUESTADELOSBIOMARCADORES.

En la literaturapodemosencontrarvariostrabajosquehanobtenidovalorpredictivode cfDNA y CTC en diversos tipos neoplásicos, incluido el CEO 230, 284, 310, 328, 333. En nuestroestudio, los resultadosmás relevanteshansidoquecfDNA115presentaun importantevalorpredictivode respuestaaQTNAyque la integridadde cfDNAes factorpredictivode cirugíaóptima.LapresenciadeCTCnohasido factorpredictivoderespuestaaquimioterapianidecirugíaóptima.

ElniveldecfDNA115hasidoelúnicovalorbasalpredictivoderespuestaaQTNA.Unmayor valor se ha relacionado con peor respuesta a QTNA. Este hecho puede justificarsedebidoaquelospacientesconmayorcargatumoral,yconellomayordestruccióntumoralymayorcfDNA,presentanpeorrespuestaclínica212.EsteresultadoesespecialmenteimportantedebidoaquelarespuestaaQTNAhasidoelmayorfactorpredictivoderespuestatumoraldela paciente, como vimos anteriormente. Este papel predictivo de respuesta a QTNA seconfirmaenelanálisismultivariante,endondeelpresentaruntipohistológicoIIdeKurmanyun nivel basal bajo de cfDNA115, han sido los dos únicos factores predictivos positivosindependientes de respuesta a QTNA en nuestra serie. Hay que destacar también elimportante concepto del modelo de Kurman, pues refleja dos poblaciones de CEO con uncomportamiento y con respuesta aQTdiferente59, como ya hemos comentado en el punto6.1.3. Así pues, estas dos variables, el tipo histológico de Kurman y el valor de cfDNA115,podríanservariablesaincluirenelpaneldevaloracióndelapacienteantesdedecidirunplanterapéuticoespecífico.

Ninguno de los niveles basales del resto de BMhan sido predictivos de respuesta aQTNA(tabla5.26,tabla5.28yfigura5.13),loqueremarcalaimportanciadecfDNA115comonuevoBM.

Sin embargo, el valor de cfDNA115 no ha presentado valor predictivo del resultadoquirúrgico.Ladiferenciadesusmediasnoalcanzalasignificación.Elbajonúmerodeeventosdecirugíasubóptimadenuestraserielimitalavaloracióndeesteresultado.Enotrasseriessísehadescritoquepudieraserfactorpredictivodecirugíasubóptima342,346.EnelestudiodeKamatetal349elniveldecfDNAserelacionóconunacirugíasub-óptima, tantoenelanálisisunivariantecomoelmultivariante.

Enunintentodetenerunavaloraciónprecozderespuesta,secomparóelvalorbasalde losBMconelvalor trasunciclodeQT.Enel casodecfDNA115, la reducciónnohasidofactor predictivo de respuesta. No hemos encontrado trabajos en CEO que evalúen estacuestión.Capizzietal346analizanelvalordecfDNAenCEOperotrasfinalizar6ciclosdeQTNA,encontrandovalorpredictivode respuesta ladeterminaciónenelúltimociclo.Porello,esteresultado junto al análisis realizado anteriormente sobre el escaso efecto deun ciclo deQTsobre losnivelesdecfDNA,nos indicaquenodebarecomendarseunadeterminaciónprecoz

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de la variación de su valor en el CEO. Los trabajos sobre otras neoplasias tampoco hanrealizado determinación precoz de la variación de cfDNA. Delgado et al333 en cáncer depróstata planteó determinación cada 3 meses, aunque tampoco encontró relación de larespuesta serológica. Schwarzenbach et al335 en cáncer de colon realizaron determinacionesperodeformaarbitrariaseparadaspor6-12semanas,hallandofrecuentesfluctuacionesdesuvalor.

Ennuestraserie,elúnicoBMcuyareducciónconunciclodeQThapresentadovalorpredictivode respuestaaQTNAhasidoHE4.Haypocos trabajosqueexplorenesteaspecto,pero lamayoríatambiénencuentrancomofactorpapelpredictivo lavariacióndeHE4con laQT368,369. La diferencia con nuestro trabajo, es que lamayoría de trabajos han analizado lavariaciónnotraselprimerciclo,sinoentreantesydespuésdeQTNA368,369.Nosotroshemosdemostrado que con HE4 se puede predecir la respuesta a QTNA de forma precoz tras elprimerciclodeQT.

Porotrolado,unnivelbajodeintegridaddecfDNAhasidofactorpredictivodecirugíaóptima (tabla 5.30 y figura 5.14). Esto puede deberse a que valores altos de integridad serelacionan con la presencia de mayor necrosis tumoral y, por lo tanto, una histología másagresiva,loqueconllevaríaaunamenorprobabilidaddecirugíacompleta.EnCEO,debidoalavariedaddemetodologíasusadas, laintegridadnohasidoanalizadahastalafechaactual.Enotros tumores utilizando las secuencias ALU para estudio de cfDNA, algunos autores hanobtenidoquelaintegridaddecfDNApresentavalorpredictivo329,333.

El valor previo a cirugía de HE4 también ha sido factor predictivo del resultadoquirúrgicoennuestraserie,aligualqueenotrostrabajos,peroCa-125solohamostradounatendencianosignificativa369,370.

Elanálisismultivariantedecirugíaóptima,hamostradoquelasdosúnicasvariablesindependienteshansidoniveldePCImenoroiguala12ypresentarunaalbúminanormal.HE4perdiólasignificaciónenelestudiomultivariante.Asípues,quedapatentelaimportanciaenelresultado quirúrgico de la valoración de la extensión de la enfermedad a través del PCI. Ennuestraseriehasidoel factorpredictivodecirugíaóptimamás importante.Algunosautoresintentan hacer una aproximación del PCI quirúrgico a través de la imagen radiológica, paraestablecer el llamado “PCI radiológico”, que sería una valoración de la extensión de laenfermedadperitonealsiguiendolosmismoscriteriosdepuntuaciónqueelPCIquirúrgico371,

372.Noobstante,enesteanálisismultivariantenosehaincluidolaintegridaddecfDNA,porelbajo número de eventos resultante. Por ello, no hemos podido calcular su grado deindependenciadeotrasvariablesanalizadas.Decualquiermodo,con labasedesupapelenotrasneoplasiasylosresultadosdenuestroestudio,sepodríadecirquelaintegridaddecfDNApresentaunpapelpredictivodecirugíaenCEO.Sudeterminaciónpodríaayudaraseleccionarlamejorsecuenciadetratamientoinicialdelapaciente,entreCPPoQTNA.

Enrelacióna lapresenciadeCTC,ennuestrotrabajonosehamostradoqueseaunfactorpredictivoderespuestanidelresultadodecirugía.Supapelpredictivoenotrosestudiostampocoestáclaro.AlgunosautoressíhanencontradorelaciónsignificativaentreCTCyunamenorrespuestatumoral 277,296, incluidoelmetanálisisdeCuietal284,perootrosautoresnohanconfirmadoestepapel284,289,290,295.Respectoalresultadoquirúrgico, lapresenciadeCTCen nuestro trabajo ha estado próxima a la significación estadística pero sin alcanzarla (p =

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0,066) (tabla 5.36).Noobstante, el bajo número de cirugías realizadas en las pacientes conCTCpositivas ha sido una importante limitaciónde los resultados. En el trabajo deAktas etal291yeldeObermayretal298síserelacionóconresecciónquirúrgicaóptima.Porello,dadalatendenciapróximaa lasignificacióninclusoconbajonúmerodecirugíasy losdatosdeestosdostrabajos,nosindicaríaquelapresenciadeCTCsípudieratenerpapelpredictivodecirugía.Sinembargo,enelanálisismultivarianteenrelaciónalrestodevariablesclínicas,nofuefactorindependiente significativo del resultado quirúrgico (tabla 5.32). Por lo tanto, en nuestrotrabajonopodemosconfirmarunvalorpredictivodecirugíaóptima.

Respecto al valor post-quirúrgico de los BM, ningún valor de cfDNA ha sido factorpredictivoderespuesta.SoloelvalordeCa-125post-quirúrgicohasidofactorpredictivo,tantoen el análisis univariante como en el multivariante, siendo el único factor predictivoindependientederespuestatumoraltrascompletareltratamientoconcirugíayQT.

En conclusión, con los datos aquí presentados, estas 5 variables (albúmina, tipohistológicodeKurman,niveldecfDNA115, integridaddecfDNAyPCI radiológico)sedeberíavalorar su inclusiónen la valoración inicial de las pacientes, para establecer la estrategiadetratamientomásadecuado.

6.2.7. ANÁLISIS UNIVARIANTE Y MULTIVARIANTE DEL VALOR PRONÓSTICO DE LOSBIOMARCADORES.

Los principales resultados de nuestro estudio han sido la demostración del papelpronósticodecfDNAydelapresenciadeCTC.

LaSLPsehavistodeterminadaporlosvaloresbasalesdecfDNA115ycfDNA247,yporlareduccióndeun50%delaintegridaddecfDNA,Ca-125yHE4(tabla5.38,figura5.17y5.18).LaSGhaestadocondicionadaporlosnivelesbasalesdecfDNA115,cfDNA247ylapresenciadeCTC (tabla 5.41, figura 5.20). La variación de los BM tras un ciclo deQT no ha tenido valorpronósticodeSG.

Elnivel basal de cfDNA115 hapresentadoun importante valorpronóstico, tantodeSLPcomodeSG.UnvalordecfDNA115porencimadelvalordecorteestablecidoserelacionaconpeorSLPySGdeformasignificativa.EstosedebealamayorcargatumoraldelpacientequereflejacfDNA115,loqueprovocaundeteriorodelestadogeneralypeorrespuestaaQT,como vimos anteriormente, conduciendo al final a una peor evolución clínica. Este valorpronóstico se ha confirmado en otras series de CEO342, 343, 346, 347, 349 y en otros tipos deneoplasias301,335,373.EnelestudiodeKamatetal349encontraronqueunnivelporencimadelamedianadecfDNAconstituyóun factorpronósticonegativodeSG (3añosvs4,1años,paravaloresporencimaydebajode lamediana respectivamente),queseconfirmóenelanálisismultivariante. Inclusoenpacientes resistentesaplatino,Steffensenetal347encontraronquecfDNA115constituíaunimportantemarcadordeSLPySG.

LavariacióndecfDNA115con laQTnohapresentadovalorpronóstico.Esteaspectoen CEO no ha sido explorado, por lo que no tenemos datos para comparar. En el congresoamericano de oncologíamédica (ASCO) de 2016, se comunicó en cáncer de pulmón que lavariación de cfDNA tras 2 ciclos de QT tenía valor pronóstico373. No obstante, teniendo encuenta este resultado y que en nuestra serie su reducción con QT tampoco fue factor

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predictivode respuesta, ladeterminación seriadaenCEOde cfDNA115noparecepresentarpor ahora utilidad clínica. No obstante, un seguimiento más prolongado de nuestra seriepodríamodificarestosresultados.

Elvalorbasalde cfDNA247 tambiénhasidofactorpronósticotantodeSLPcomodeSG.EsteparámetronohasidoexploradoenCEO.Enotrostiposneoplásicoscomocáncerdemamasehavistoqueesteparámetrotienevalorpronóstico374.Suvalorreflejalapresenciadefragmentos grandes de cfDNA relacionados principalmente conmayor necrosis tumoral. EnCEOyahemosvistoanteriormentequeestemecanismoesunprocesodemenorimportanciaque la apoptosis, pero este resultado pronóstico es muy interesante pues implica que lapresenciadeCEOconnecrosissignificativaconllevaráunpeorpronósticodesupervivencia,nosolodeSLP, sino tambiénSG,conuna importanteseparaciónde lascurvasdesupervivencia(figura5.20).

RespectoalaintegridaddecfDNA,unimportanteynovedosohallazgodeestetrabajoesqueladisminucióndeun50%desuvalorconunciclodeQThasidofactorpronósticodeSLP,tantoenelestudiounivariantecomoenelmultivariante.EstareducciónhasupuestopeorSLP,con4recaídasenlas5pacientesquelapresentaban.Estopodríajustificarseporqueesamayor reducción de la integridad se relacionaría con resistencia al tratamiento debido almantenimiento de la apoptosis tumoral del CEO a pesar de recibir QT, disminuyendorelativamente más cfDNA247 que cfDNA115 y produciendo un mayor descenso de laintegridad. Este hallazgo no ha sido explorado anteriormente y podría representar unmarcadorprecozderesistenciaaltratamiento.Noobstante,elbajonúmerodepacientesquelo presentan nos hace tomar este resultado con cautela. Respecto a la SG, es demasiadoprontoparaobtenerdiferencias,perode las5pacientesconesevaloryahan fallecido2deellas,aunquenoalcanzalasignificación(tabla5.41yfigura5.21).

Su valor basal no ha presentado valor pronóstico, sin embargo, en otros tiposneoplásicoscomocáncerdecolonydepróstatasí lohapresentado328,329,333.EstopuedeserocasionadoporlamenorrelevanciaquepresentalaintegridadenelCEO.

Ennuestraserie,lapresenciadeCTCenCEOhasidofactorpronósticodeSG,peronode SLP. En los estudios publicados ha habido resultados contradictorios. En relación a SLP,unosestudiossíhanencontradorelación277,294,295,296yotrosno288,289,291.Sinembargo,enlosdos metanálisis publicados 284, 285, sí han mostrado que la presencia de CTC tiene valorpronóstico de SLP. Respecto a la SG, el resultado de CTC de nuestro estudio confirma loshallazgosdealgunas series 277,294 y losdosmetanálisis 284,285. Si bienhay trabajosendondeesta relación no se ha demostrado 281,283,288,289,290,295. Incluso en elmetanálisis de Zhou etal285,elsubgrupodeestudiosrealizadosconCellSearchnoobtuvorelaciónconlaSG.Unodelos estudios más grandes con CTC fue comunicado por Poveda et al289, encontraron valorpronóstico para SG en el análisis univariante, pero no mantuvo la significación en elmultivariante.LajustificacióndequeCTCseafactorpronósticodeSGperonodeSLPesdifícilde valorar. Por una parte, dado que las CTC no son factor predictivo de respuesta, podríajustificarquenohalla separación inicial en las curvasdeSLP (figura5.17). Porotraparte, laseparación inicial en las curvasdeSG (figura5.20)nos llevóapensaren laposibilidadde lainfluencia de las muertes ocurridas durante el tratamiento. Por ello, se analizaron estos 4fallecimientos, comprobando que en 2 de las pacientes no se determinaron CTC, en una

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Discusión

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presentóausenciadeCTCyen laotrasíhuboCTCpositivas.Asípues,estasmuertesnohansupuestounsesgoenlavaloracióndelvalorpronósticodeSG.EnelestudiodeAktasetal291tambiénlapresenciadeCTCnoserelacionóconSLPperosíconlaSG.Unmayorseguimientodelaspacientespodríamodificarestosresultados.

Losanálisismultivariantesrealizados,tantoparaSLPcomoSG,hayquetomarlosconprecaución,debidoalescasonúmerodeeventosregistradoshastalafecha.ParaSLPsolotresvariablesmantienen valor pronóstico independiente: un valor de PCImenor o igual a 12, larespuestaaQTNAy lareduccióndela integridaddecfDNAmayordeun50%conelprimerociclodeQT.PierdenlasignificaciónlosvaloresbasalesdecfDNA.RespectoaSG,soloelvalordePCImantienelasignificaciónenelanálisismultivariante.Esdestacableelimportantepapelpronóstico independientequehapresentadoennuestroestudio lavaloracióndelPCI, tantopara SLP como SG, algo que se ha confirmado en otras series104,358,359. No obstante, estosresultadosdeberíanserconsideradosprovisionalesafaltadeunseguimientomásprolongado.

RespectoalosBMdereferenciaennuestroestudio,solohansidofactorespronósticodeSLP lareduccióndeun50%desuvalortrasunciclodeQT,peronoparaSG.Tampocoelvalor basal de ninguno de los dos fue factor pronóstico. En la literatura hay resultadoscontradictorios,mientrasenunasseriessíhanencontradovalorpronósticodeSLPydeSG204,208,213,375,376,enotrasnosehaconfirmado212,349.

Por último, revisando los requisitos que todo BM debe cumplir propuestos por laAcademia Nacional de Bioquímica Clínica de Estados Unidos193 y el Instituto de SaludAmericano194 (ver página 45), podemos comprobar que los nuevos BM analizados en elpresente trabajo cumplen con todos los criterios. Hemos demostrado que presentan unsignificante e independiente valor pronóstico (a falta de un mayor seguimiento), sudeterminación es factible y reproducible, con unametodología propuesta en diversos tiposneoplásicos,ysusresultadossondatosobjetivosfácilmenteinterpretables.

Además, un aspecto importante a tener en cuenta a la hora de valorar nuevos BMpronósticos, es valorar la utilidad clínica de ese BM, entendida ésta como la capacidad queposeeparamejorarlatomadedecisionesclínicasylosresultadosenelpacienterespectoalosBM ya establecidos192. Nuestros resultados han mostrado que tanto cfDNA como CTC hanpresentadomayorvalorpronósticoquelosBMdereferencia,ytambiénconimportantepapelpredictivo.Porello,creemosquepodríanserincluidosenlaprácticaclínicahabitual.

6.3. LIMITACIONES DEL ESTUDIO

Elpresentetrabajohapresentadovariaslimitacionesquedebentenerseencuentaalahoradeinterpretarlosresultados.

Por una parte, lamayor parte del estudio se ha desarrollado en un único centro, elHCUVA, con la participación en el último año del Hospital Universitario Santa Lucia deCartagena. No obstante, las características clínicas y patológicas han sido similares a otras

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Discusión

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series.Losdatoshansidorecogidossóloporeldoctorando,parahomogeneizarlacalidaddelosdatos.

LastécnicasyprocedimientosparaelanálisisdecfDNAyCTCsonfundamentalesparala interpretación de resultados. En ellos influyen multitud de factores, desde la toma ymanipulaciónde lasmuestras,el tuboderecolección (EDTAoespecíficodeDNAcirculante),procesamiento en plasma o en suero, el tiempo en que se procesa, procedimiento decentrifugado y congelación, método de aislamiento y detección de los BM. Todas estasvariables determinarán una mayor o menor calidad de los resultados, que es precisaroptimizar. La variación demetodología entre los diferentes estudios es uno de los grandesproblemas del análisis de cfDNA y CTC. Para que los resultados puedan ser comparables ypoder mejorar los conocimientos sobre estos BM, es necesario estandarizar losprocedimientosyquelacomunidadcientíficaadopteunaúnicametodologíadetrabajo.

El tamañomuestral tambiénha sidouna limitaciónpara la obtenciónde resultados,aunqueelpresentetrabajorepresentaeltercermayorestudiodecfDNAenpacientesquesehacomunicado.Unmayortamañomuestralpodríamodificarlosresultados.

LaheterogeneidaddelCEO,tantoporsusdiferentesescenariosclínicosposiblescomopor su variedad histológica, puede ser una limitación. En nuestro estudio solo se pusieroncomo criterios de inclusión el presentar estadio avanzado o recaída sensible, y que fuerasusceptible de recibir tratamiento con quimioterapia. No se limitó la inclusión por tipohistológicooesquemadetratamientoindicado.

Pero la mayor limitación de nuestro trabajo ha sido el escaso seguimiento queactualmentepresenta,quecomportaaúnunbajonúmerodeeventosvalorables.Serealizaráunseguimientodelospacientesyanálisisperiódicoderesultadosqueseráncomunicadosmásadelanteencongresosnacionaleseinternacionalesyrevistascientíficas.

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7. Conclusiones

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Concluciones

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Conclusiones

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1. Segúnlosresultadosdeesteestudio,losniveleselevadosdeADNlibrecirculanteylapresenciadeCTCenelcarcinomaepitelialdeovarioenestadioavanzadosonfactoresdeletéreosparalasupervivencialibredeprogresióntumoralysupervivenciaglobaldelaspacientes.

2. La reducción de la integridad de ADN mayor del 50% tras tratamiento conquimioterapiaesunmarcadorprecozderesistenciaalmismo,segúnnuestrosdatos.

3. ElnivelbasaldeADNlibrecirculanteyelvalordesuintegridadpodríanserdosnuevosbiomarcadores predictivos de respuesta tumoral. Niveles elevados de ADN librecirculanteserelacionanconunamenorrespuestaaquimioterapianeoadyuvante.UnvaloraltodeintegridaddeADNlibrecirculantepodríapredecirunacirugíaperitonealconresultadosubóptimo.

4. Los niveles de ADN libre circulante en pacientes con carcinoma epitelial de ovarioavanzadosonsignificativamentemáselevadosqueenloscontrolessanosypatologíaovárica benigna. Además, se relacionan con deterioro del estado general de laspacientes. Por otro lado, nomejoran la capacidad diagnóstica demalignidad de losbiomarcadoresdereferenciaCa-125yHE4.

5. La presencia de CTC podría ser un nuevo biomarcador poco sensible pero muyespecíficodemalignidad.

6. LosnuevosbiomarcadoresADNlibrecirculanteyCTCpodríanserútileseincluirseenlos protocolos asistenciales para valoración inicial y tratamiento del CEO, ya que serelacionanmejorconelpronósticoyconlapredicciónderespuestaaltratamientoquelosbiomarcadoresclásicoCa-125yHE4,segúnnuestroestudio.

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Concluciones

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8. Implicaciones clínicas y perspectivas futuras

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Implicacaciones clínicas y perspectivas futuras

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Implicacaciones clínicas y perspectivas futuras

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IMPLICACIONESCLINICAS

Los resultados que aporta este trabajo presentan gran relevancia clínica. Por unaparte, confirma el valor pronóstico de cfDNA y CTC en el CEO avanzado. Este hecho hapresentado resultados desiguales en la literatura. Nuestro trabajo apoya su papel en elpronósticodelaspacientes,mejorandolainformaciónyvaloracióndelaevolucióntumoral.

Además, nos aporta un nuevo BM de valoración precoz de la resistencia a lostratamientosquenohabíasidodescritoanteriormente.Porotrolado,nosaportadosnuevosbiomarcadores predictivos de respuesta. Uno ha presentado valor predictivo independienteparaaquellaspacientesquevanarecibirquimioterapianeoadyuvante,ayudándonosalatomadedecisionesenlavaloracióninicialdelapaciente.Elotrohapresentadovalorpredictivodelresultadoquirúrgico.

Tambiénnospodríaaportarotronuevobiomarcadorparadeterminarlacargatumoralresidual tras la cirugía peritoneal, en cuanto que los niveles de cfDNA se reducen tras laintervención.Porello,esunfactoraexplorarparafuturosproyectos.Sinembargo,nohemoshalladoutilidaddelamonitorizacióncondeterminacionesseriadasduranteeltratamientoconquimioterapia.

En relación a la fisiopatología de la enfermedad, el presente trabajomejoranuestroconocimientosobrelascausasquejustificanelmayoromenordeteriorodelestadogeneraldeunapaciente,encuantoqueserelacionaconlacargatumoralsistémicamedidaporlosnivelesde cfDNA. También, hemos confirmado una situación de mayor destrucción celular en laspacientesconCEOrespectoapacientescontumoresbenignosdeovarioysujetossanos,entrelos que no hay diferencias de lisis celular. Además, hemos confirmado que el mecanismoprincipaldedestruccióncelularenelCEOhasidolaapoptosiscelular.

Por último, hemos demostrado que los valores de cfDNA no mejoran la capacidaddiagnostica de malignidad en el CEO respecto a los BM de referencia, presentando menorsensibilidadyespecificidad.Noobstante, suposiblepapeldiagnósticoen la fase inicialde laenfermedaddeberíaserexploradoenfuturosestudios.Porotro lado, lasCTCpresentanunaelevadaespecificidadyvalorpredictivopositivo.

Conestosresultados, losnuevosBMpodrían incluirseen losprotocolosasistencialesdevaloracióninicialytratamientodelCEO,porsupapelpronósticoypredictivoderespuestaaQTNA, y CTC podría incluirse en el protocolo de diagnóstico diferencial de la enfermedad,aunquenocfDNA.

Eltrabajodetesisdoctoralqueseproponeaquíhaabiertounalíneadeinvestigacióndentro del servicio de oncología médica de nuestro centro, con orientación y disposiciónmultidisciplinar,colaborandoconotrosserviciosydepartamentosen labúsquedadenuevosconocimientosacercadeldesarrolloyevolucióncarcinomaepitelialdeovario,ysirviendodebasepararealizarnuevosproyectos.

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Implicacaciones clínicas y perspectivas futuras

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PLANDEDIFUSION

SeharemitidocomunicaciónalpróximocongresoanualdelaSociedadAmericanadeOncologíaMédica(ASCO)quesecelebraráentreel2yel6dejuniode2017enChicago(USA),siendoaceptadocomo“PosterSession”,conabstractnúmero5566.

Se enviarán comunicaciones de las actualizaciones del seguimiento a congresosnacionales e internacionales. Posteriormente a la lectura de la presente tesis, se redactarátrabajoparasupublicaciónenrevistacientífica.

RELACIONCONOTROSESTUDIOS

Por una parte estamos participando con el servicio de Inmunología Clínica en elestudiodelpapeldeCTCycélulasnaturalkiller(NK)enlacarcinogénesisatravésdeunabecadel InstitutodeSaludCarlos-III,expedientePI13/02297, titulado“Regulaciónde la respuestaanti-tumoral de células NK y su relación con la susceptibilidad, diseminación y respuesta altratamiento del cáncer”, siendo el investigador principal el Dr. Alfredo Minguela Puras, yduración de 2014 a 2016. Fruto de estas investigaciones han sido las siguientescomunicacionesacongresos:

- JerónimoMartinez-García,MVMartinez-Sánchez,A.TorrobaCaronetal.Immunologicalprofileinpatientswithepithelialovariancancer.DataoftheRENOprojectandtheFIS-PI13/02297project.Abstract6795.ESGO 2014, International meeting of the European society of Gynaecological Oncology,Octuber,2014Turin(ItaliaFrancia)InternationalJournalofGynecologicalCancer:October2014-Volume24,supp2-Issue8-pag77doi:10.1097/01.IGC.0000455561.57987.ea;PMID:25251322Comunicacióntipoposter.

- JeronimoMartinez-García,MVMartinez-Sánchez,A.TorrobaCaronetal.

Immunological profile in patients with epithelial ovarian cancer. Updated data of the RENOprojectandtheFIS-PI13/02297project.Abstract0715ESGO 2015, International meeting of the European society of Gynaecological Oncology,Octuber24-27,2015Nice(Francia)Comunicacióntipoposter.

- JeronimoMartinez-García,M.VictoriaMartinez-Sánchez,PilarSánchez-Henarejosetal.Perfil inmunológico en pacientes con cáncer epitelial de ovario. Datos iniciales del proyectolocalRENOyproyectoFIS-PI13/02297.ComunicaciónoralO-18Congreso nacional SEOM (Sociedad Española de Oncología Médica) 2015, 28-30 octubre,Madrid(España)

Duranteelprimerañodedesarrollodeltrabajotambiénsecolaboróconlaunidaddeinvestigacióntraslacionalde laAsociaciónEspañolacontraelCáncersituadaenelHCUVA.Elobjetivo fue individualizarel tratamientomediante cultivo celularde célulasprocedentesdeexcedentedelmaterialbiológicodebiopsiay/ocirugíadelaspacientesincluidasenelestudioRENO. Se relacionó con la evolución clínica y posteriormente se relacionaría con los BM aestudio.Frutodeestasinvestigacionesfueronlassiguientescomunicacionesacongresos:

- JeronimoMartinez-García,MaríaNelaGarcía-Espinosa,MarCarballoSantanaetal.

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Implicacaciones clínicas y perspectivas futuras

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Individualizacióndel tratamientoencáncerdeovariomediantecultivocelular.DatosdelproyectolocalRENO.ComunicaciónoralO-19Congreso nacional SEOM (Sociedad Española de Oncología Médica) 2015, 28-30octubre,Madrid(España)

- JeronimoMartinez-García,MNGarcía-Espinosa,MarCarballo-Santanaetal.

Cellcultureasa tool to individualizechemotherapy inovariancancer.Data fromtheRENOproject.Abstract0828ESGO19, Internationalmeetingof theEuropeanSocietyofGynaecologicalOncology,Octuber24-27,2015Nice(France)

PERSPECTIVASFUTURAS

Nuestrasperspectivasfuturasenrelaciónaesteproyectoson:

- Seguimientoalargoplazodelestudio.Nuestraprincipallimitaciónactualeselescasotiempodeevolucióndelamuestra.Haremosunseguimientoalargoplazoconanálisisperiódico de resultados. Estos se comunicarán a congresos oncológicos y revistascientíficas.

- Realización de estudio demutaciones de tp53 en el cfDNAde nuestro trabajo, paraestablecersuvalorpredictivoypronóstico.Estápendientedeobtenerfinanciación.

- Ampliar el estudio de cfDNA a otros tipos tumorales. Para ello, se está en fase dediseñodelproyectoparalabúsquedadecolaboraciónentreotroshospitalesyobtenerfinanciación.

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Implicacaciones clínicas y perspectivas futuras

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9. Anexos

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Anexos

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Anexos

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ANEXO I. TNM 7ª EDICIÓN DE 2010. FIGO 2014

TNM 7ª ed,2010

FIGO2014

T1N0M0T1aT1b

T1c

T1c1T1c2T1c3

T2N0M0T2aT2b

T3y/oN1T1/2N1T3a2N0/N1T3bN0/N1T3cN0/N1

M1

IIAIB

IC

IC1IC2IC3

IIIIAIIB

IIIIIIA1

IIIA(i)IIIA(ii)

IIIA2

IIIBIIIC

IVIVAIVB

LimitadoalosovariosotrompadeFalopio

Limitado a un ovario o trompa de Falopio con cápsula intacta,ausencia de tumor en superficie ovárica o trompa; líquidoascíticonegativo

Limitado a los dos ovarios o trompas de Falopio con cápsula

intacta, ausencia de tumor en superficie ovárica o trompa;líquidoascíticonegativo

Unooambosovariosotrompasconalgunodelossiguientes:

Derramequirúrgico,roturaquirúrgicadelacápsulaCápsularotaantesdelacirugíaotumorensuperficieovárica

otrompaLíquidoascíticopositivoolavadoperitonealpositivo

Enfermedadconextensiónpélvica, afectandoa1oambosovariosotrompas

UterootrompasuovariosOtrostejidospélvicosintraperitoneales

Enfermedad con diseminación peritoneal extrapélvica y/o afectaciónganglionarregional

Afectación ganglios retroperitoneales exclusiva (por citología ohistología)Metástasisganglionarhasta10mmenladimensiónmayorMetástasisganglionarmásde10mmenladimensiónmayor

Afectación peritoneal extrapélvica microscópica con o sin

afectaciónganglionarretroperitonealAfectaciónperitonealextrapélvicamacroscópicashasta2cmcono

sinafectaciónganglionarretroperitonealAfectaciónperitonealextrapélvicamacroscópica>2cmcono sin

afectaciónganglionarretroperitoneal

Metástasisadistancia,exceptolasperitoneales(1)DerramepleuralconcitologíapositivaMetástasis parenquimatosas y metástasis a órganos extra-abdominales(incluidoadenopatíasfueradelacavidadabdominal)

Gangliosregionales:hipogástricos,ilíacocomún,ilíacoexterno,sacrolateral,paraórticoseinguinales.pN0precisa10gangliosalserlinfadenectomíapélvica(1)LaextensióndeltumoralacápsulahepáticayesplénicasinafectaciónparenquimatosaseconsideraIIIC,ylasmetástasisdelparénquimahepático,infiltracióntransmuralintestinalydepósitoumbilicalcomoM1.

De:JaimePrat;fortheFIGOCommitteeonGynecologicOncology.Stagingclassificationforcanceroftheovary,fallopiantube,andperitoneum.IntJGynecolObstet2014;124(1):1–5.PMID24210074

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Anexos

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ANEXO II. ESCALA ECOG ESTADO GENERAL GRADO Valoración

0 Asintomático.Norestricción

1 Escasasintomatología.

Limitaciónenactividadesintensas,perocapazdedesarrollaractividaddeintensidadleve/moderada

2 Sintomático.Ambulatorioycapazdecuidadospropios,peroincapazderealizaractividadfísicaalgunaPasamenosdel50%deltiemposentadooacostado

3 Muysintomático.Capazderealizarsóloactividadesbásicas.Encamadoosentadomásdel50%desutiempo

4 Completamentelimitado.Encamadoel100%deltiempo

5 Muerte

De:OkenMM,CreechRH,TormeyDC,HortonJetal.ToxicityAndResponseCriteriaOfTheEasternCooperativeOncologyGroup.AmJClinOncol1982;5(6):649-655.PMID7165009

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Anexos

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ANEXO III. CRITERIOS DE RESPUESTA RADIOLÓGICA RECIST 1.1

LesiónDiana(1) LesiónNoDiana(2) Nuevalesión RespuestaGlobal

RC RC No RC

RC NoRC/NoPE No RP

RC Novalorable No RP

RP NoPEonovalorable No RP

EE NoPEonovalorable No EE

Novalorable NoPE No Novalorable

PE PE

PE PE

SI PE

(1) LesiónDiana:RC:desaparicióndelesionesdianaRP:reduccióndealmenosun30%enlasumadediámetrosdelesionesdianadereferenciaPE: aumento de al menos un 20% en la suma de diámetros de lesiones diana de referencia, tomando comoreferencialassumamáspequeñaenestudio.Debetambiénaumentaralmenos5mm.EE:nocumplecriteriosnideRPnidelPE(2) LesiónNoDiana:RC:desaparicióndelesionesnodianaynormalizacióndelmarcadortumoralNoRC/NoPE:persistenciadeunaomáslesionesnodianay/omantenimientodelniveldemarcadortumoralporencimadelnivelnormalPE:progresióninequívocadelesionesnodianaoaparicióndenuevaslesionesnodianaLesionestumoralesmediblesseconsideranaquellasconalmenosunadimensiónmínimode10mmporTC.Losganglioslinfáticosseconsideraránpatológicoscuandoelejecortoseacomomínimode15mm.Lesionesnomediblesseránaquellas lesionesmenoresde10mmyganglios linfáticosentre10y15mm,al igualqueotraslesionescomoascitis,derramepleuralopericárdico,afectaciónleptomeníngea,linfangitispulmonar.RC=RespuestaCompleta;RP=Respuestaparcial;EE=EnfermedadEstable;PE=ProgresióndeEnfermedad

De:EisenhauerEA,TherasseP,BogaertsJ,SchwartzLHetal.Newresponseevaluationcriteriainsolidtumours:RevisedRECISTguideline(version1.1).EurJCancer2009;45(2):228-247.PMID19097774

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Anexos

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ANEXO IV. CRITERIOS DE RESPUESTA Y PROGRESION EN CANCER DE OVARIO DEL GCIG 2011

EvaluacióndelamejorrespuestaenpacientessinlesiónmedibleinicialyquesonvaloradosporCa-125

Ca-125(1) LesionesNoDiana(2) NuevaLesión Respuesta Serológicaglobal(3)

RespuestaoNormalización

RC No RC

Respuesta NoPE No RP

Normalizaciónpornorespuesta

NoRC/NoPE No EE

NoRP/NoPE NoPE No EE

PE Cualquiera Cualquiera PE

Cualquiera PE Cualquiera PE

Cualquiera Cualquiera Si PE

(1) LarespuestadeCa-125sedefineporlareduccióndealmenosun50%desuvalorrespectoalvalorantesdeltratamiento.Larespuestaprecisaconfirmarlaymantenerlaalmenos28días.ElpacientepodráservaloradoporCa-125sólosipresentaunvalorenlas2semanaspreviasaltratamientodealmenos2veceselLSN.El Ca-125 no será valorable si se realiza un procedimiento invasivo en peritoneo o pleura en los 28 díasprevios.La fechade la respuesta será la fecha cuandoel Ca-125bajaporprimera vezdel 50%del valor antesdeltratamiento.

(2) LesiónNoDianaincluyeascitisyderramepleural,quenosonmediblesacordeaRECIST.(3) Larespuestaglobalprecisaconfirmarlaymantenerlaalmenos28días

RC:RespuestaCompleta;RP:RespuestaParcial;EE:EnfermedadEstable;PE:ProgresióndeEnfermedadLSN:límitesuperiornormal.

Definicióndeprogresión

RECIST Ca-125

Comparado con la sumamás baja, aumentode un 20% la suma de los diámetros de laslesionesdiana

O

Nuevalesión(medibleonomedible)

O

Inequívocaprogresiónenlesiónnodiana

Y

/

o

AumentodeCa-125dosomásvecesel LSN o el valor nadir, comprobadoen 2 ocasiones separados al menosunasemana

LafechadelaprogresiónporRECISTserálafechadedocumentacióndelaumentoonuevaslesiones

La fecha de progresión será la fecha delprimer aumento de Ca-125 por encimadelLSN/nadir

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Anexos

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Evaluaciónde lamejor respuestaenpacientescon lesiónmedibleyquesontambiénvaloradosporCa-125

LesiónDiana(1) LesiónNoDiana(2)

Nuevalesión Ca-125 RespuestaGlobal(3)

RC RC No Normal RC

RC NoRC/NoPE No NoPE RP

RC RC No RPperononormal

RP

RC Novalorable No RP RP

RP NoRC/NoPE No NoPE RP

Novalorable NoPE No RP RP

EE NoPE No RP RP

EE NoPEonovalorable

No NoRPynoPE EE

PE Cualquiera Cualquiera Cualquiera PE

PE PE

Si PE

PE PE

(1) LesiónDiana:incluyehasta5lesionesmedibles(2porórgano)segúnRECIST1.1RC:desaparicióndelesionesdianaRP:reduccióndealmenosun30%enlasumadediámetrosdelesionesdianadereferenciaPE: aumento de al menos un 20% en la suma de diámetros de lesiones diana de referencia, tomando comoreferencialassumamáspequeñaenestudio.Debetambiénaumentaralmenos5mm.EE:nocumplecriteriosnideRPnidelPE(2) LesiónNoDiana:incluyeascitis,carcinomatosisperitonealsegúnRECIST1.1RC:desaparicióndelesionesnodianaynormalizacióndelmarcadortumoralNoRC/NoPE:persistenciadeunaomáslesionesnodianay/omantenimientodelniveldemarcadortumoralporencimadelnivelnormalPE:progresióninequívocadelesionesnodianaoaparicióndenuevaslesionesnodiana(3) Seprecisaquesemantengalarespuestaalmenos28días

De:RustinGJS,VergoteI,EisenhauerE,Pujade-LauraineEetal.DefinitionsforResponseandProgressioninOvarianCancerClinicalTrialsIncorporatingRECIST1.1andCA125AgreedbytheGynecologicalCancerIntergroup(GCIG).IntJGynecolCancer2011;21:419-423.PMID21270624

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Anexos

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ANEXO V. INDICE DE CARCINOMATOSIS PERITONEAL (PCI) DE SUGARBAKER.

Supone una evaluación cuantitativa de la extensión abdominal de la carcinomatosisperitoneal. Se basa en la distribución tumoral en las diferentes regiones y el tamaño de laslesiones.

ParaelcálculodelPCIsedividelacavidadabdominalen13regionesanatómicasysegradúaeltamañodelimplantemayorencadazona(verimagen).

De:JacquetP,SugarbakerPH.Clinicalresearchmethodologiesindiagnosisandstagingofpatientswithperitonealcarcinomatosis.In:SugarbakerPH,editor.Peritonealcarcinomatosis:principlesofmanagement.Boston(MA):KluwerAcademicPublishers;996.p.359–74.

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Anexos

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ANEXO VI. EVALUACION POR EL CEIC DEL HOSPITAL CLINICO UNIVERSITARIO VIRGEN DE LA ARRIXACA

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Anexos

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ANEXO VII. CONSENTIMIENTO INFORMADO DE BIOBANC-MUR

Biobanc-Mur. Biobanco en Red de la Región de Murcia

Plataforma Red Nacional de Biobancos – ISCIII. Versión 3 02/06/2014

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DOCUMENTO DE INFORMACIÓN AL DONANTE (v.3)

UTILIZACIÓN DE DATOS CLÍNICOS Y MATERIAL BIOLÓGICO EXCEDENTE DEL PROCESO ASISTENCIAL PARA

INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA Y SU CONSERVACIÓN EN UN BIOBANCO. En el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, igual que en la mayoría de hospitales, además de la asistencia a los pacientes, se realiza investigación biomédica. La finalidad de esta investigación es progresar en el conocimiento de las enfermedades y en su prevención, diagnóstico, pronóstico y tratamiento. Esta investigación biomédica requiere recoger datos clínicos y muestras biológicas de pacientes y donantes sanos para analizarlos y obtener conclusiones con el objetivo de conocer mejor las enfermedades y avanzar su diagnóstico y/o tratamiento. Las muestras y datos clínicos obtenidos para el diagnóstico o control de las enfermedades, una vez utilizadas con esta finalidad, resultan también útiles y necesarias para la investigación. De hecho, muchos de los avances científicos obtenidos en los últimos años en medicina son fruto de este tipo de estudios

Siguiendo lo establecido por la Ley 14/2007, de Investigación Biomédica, la Ley Orgánica 15/1999, de Protección de Datos Personales, y sus normas de desarrollo, le solicitamos que lea detenidamente este documento de información y el consentimiento informado que se le adjunta al final para su firma, si está de acuerdo en participar en esta propuesta ¿Qué es un biobanco?: Institución para favorecer la investigación y la salud. Un biobanco es una institución, regulada por leyes específicas, que facilita la investigación biomédica, es decir, aquella dirigida a promover la salud de las personas. Las muestras incluidas en un biobanco pueden ser cedidas para investigación en Medicina, siempre bajo la supervisión de un comité científico y otro de ética. Las muestras se cederán generalmente sin información personal asociada, aunque a veces podrá ser necesario el acceso a la historia clínica o al resultado de otras pruebas para completar la investigación. La investigación biomédica es, hoy en día, un fenómeno global por lo que ocasionalmente estas muestras podrán ser cedidas a grupos de investigación fuera de España, siempre que se cumplan los requisitos de la legislación española y lo aprueben los correspondientes comités. Muestras biológicas e información asociada: En ningún caso se le practicarán más pruebas de las imprescindibles para su adecuada atención médica. Se guardará y dispondrá del material biológico sobrante que se le extraiga durante el proceso asistencial (muestras de sangre, líquidos biológicos y/o tejidos), sin que este hecho le cause molestias adicionales. La donación de muestras excedentes de este proceso asistencial no impedirá que usted o su familia puedan usarlas, cuando sea necesario por motivos de salud, siempre que estén disponibles. Las muestras y la información asociada a las mismas se custodiarán y/o guardarán en el Biobanco Biobanc-Mur Nodo 1 del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca hasta su extinción. Este Biobanco forma parte de la Plataforma Red Nacional de Biobancos, como nodo de dicha Plataforma del Instituto de Salud Carlos III con la referencia PT13/0010/0018, y esta registrado en el Registro Nacional de Biobancos con número de referencia B.0000859. Este biobanco acoge colecciones organizadas de muestras biológicas e información asociada en las condiciones y garantías de calidad y seguridad que exige la legislación anteriormente referida y los códigos de conducta aprobados

Solicitamos su autorización para incorporar al Biobanc-Mur Nodo 1 del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca el material biológico sobrante de las pruebas que, como parte del actual proceso asistencial, se le

han realizado o se le van a realizar en este centro, con el fin de que puedan ser utilizadas en investigación biomédica.

Biobanc-Mur. Biobanco en Red de la Región de Murcia

Plataforma Red Nacional de Biobancos – ISCIII. Versión 3 02/06/2014

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por los Comités de Ética. Dichas muestras y su información asociada quedan disponibles para aquellos investigadores que lo soliciten al biobanco. Cualquier estudio de investigación para el que se solicite la utilización de estos datos o muestras deberá disponer siempre de la aprobación del Comité de Ética de la Investigación (CEI) competente, que velará para que los investigadores desarrollen sus estudios siguiendo siempre las más estrictas normas éticas y legales. Además, el Comité Científico del biobanco garantizará que los proyectos sean de excelencia científica. A partir de las muestras donadas, en los casos en que la investigación lo requiera, se realizarán estudios genéticos, y a partir de ellos se puede obtener información acerca de su salud y la de sus familiares. Siempre se actuará velando por la protección de esta información (ver apartado de protección de datos y confidencialidad). Por este consentimiento, los responsables del Biobanco del Hospital podrán consultar su historial clínico, solamente en el caso de que ello sea imprescindible para la realización del proyecto para el que se soliciten las muestras y previa autorización por parte del Comité de Ética correspondiente. En caso de ser necesaria alguna muestra adicional, la institución sanitaria se podría poner en contacto con usted para solicitarle nuevamente su colaboración. En este caso se le informará de los motivos y se le solicitará de nuevo su consentimiento. Protección de datos y confidencialidad: Las muestras se conservarán codificadas. Los datos personales que se recojan serán obtenidos, tratados y almacenados cumpliendo en todo momento el deber de secreto, de acuerdo con la legislación vigente en materia de protección de datos de carácter personal. La identificación de las muestras biológicas del Biobanco será sometida a un proceso de codificación. A cada muestra se le asigna un código de identificación, que será el utilizado por los investigadores. Únicamente el personal autorizado por el biobanco podrá relacionar su identidad con los citados códigos. Mediante este proceso los investigadores que soliciten muestras al biobanco no podrán conocer ningún dato que revele su identidad. Asimismo, aunque los resultados obtenidos de la investigación realizada con sus muestras se publiquen en revistas científicas, su identidad no será facilitada. En aquellos estudios en los que no se prevean resultados potencialmente útiles para su salud, y de acuerdo con el correspondiente Comité de Ética, las muestras y datos podrán ser anonimizadas, es decir, no habrá ninguna posibilidad de volver a asociar la muestra con su identidad. Sus muestras y los datos clínicos asociados a las mismas, pasarán a formar parte del fichero del Biobanco, inscrito en la Agencia de Protección de datos.

Responsable del fichero: Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias de la Región de Murcia. Dirección Postal: Calle Luis Fontes Pagan, 9-1, 30003 Murcia Usted podrá ejercer sus derechos de acceso, rectificación, cancelación y objeción, así como obtener información sobre el uso de sus muestras y datos asociados, dirigiéndose a:

Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias de la Región de Murcia Calle Luis Fontes Pagan, 9-1, 30003 Murcia Tel.: 968359757 E-mail: [email protected]

Carácter altruista de la donación. La cesión de muestras biológicas que usted realiza al Biobanco del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca es gratuita. La donación tiene por disposición legal carácter altruista, por lo que usted no obtendrá ni ahora ni en el futuro ningún beneficio económico por la misma, ni tendrá derechos sobre posibles beneficios comerciales de los descubrimientos que puedan conseguirse como resultado de la investigación biomédica. Sin embargo, los conocimientos obtenidos gracias a los estudios llevados a cabo a partir de su muestra y de muchas otras pueden ayudar al avance médico y, por ello, a otras personas.

Biobanc-Mur. Biobanco en Red de la Región de Murcia

Plataforma Red Nacional de Biobancos – ISCIII. Versión 3 02/06/2014

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Participación voluntaria. Su negativa NO repercutirá en su asistencia médica, presente o futura Su participación es totalmente voluntaria. Si firma el consentimiento informado, confirmará que desea participar. Puede negarse a participar o retirar su consentimiento en cualquier momento posterior a la firma sin tener que explicar los motivos y esto no repercutirá negativamente en su asistencia médica, presente o futura. Revocación del consentimiento: si usted decide firmar este consentimiento, podrá también cancelarlo libremente. Si en un futuro usted quisiera anular su consentimiento, sus muestras biológicas serían destruidas y los datos asociados a las mismas serían retirados del biobanco. También podría solicitar la anonimización de las muestras, en cuyo caso se eliminaría la relación entre sus datos personales (que revelan su identidad) y sus muestras biológicas y datos clínicos asociados. Los efectos de esta cancelación o anonimización no se podrían extender a la investigación que ya se hubiera llevado a cabo. Si deseara anular su consentimiento, deberá solicitarlo por escrito al Titular del Biobanco, en la dirección anteriormente indicada. Información sobre los resultados de la investigación: se le proporcionará información si usted desea recibirla En el caso de que usted lo solicite expresamente, el Biobanco podrá proporcionarle información acerca de cuáles son las investigaciones en que se han utilizado sus muestras y de los resultados globales de dichas investigaciones, salvo en el caso de cancelación o anonimización. Los métodos utilizados en investigación Biomédica suelen ser diferentes de los aprobados para la práctica clínica, por lo que no deben de ser considerados con valor clínico para usted. Sin embargo, en el caso que estas investigaciones proporcionen datos que pudieran ser clínica o genéticamente relevantes para usted e interesar a su salud o a la de su familia, le serán comunicados si así lo estima oportuno. Asimismo, podría darse el caso de obtenerse información relevante para su familia, le corresponderá a usted decidir si quiere o no comunicárselo. Si Ud. quiere que se le comunique dicha información relevante debe consignarlo en la casilla que aparece al final de este documento. Si usted no desea recibir esta información, tenga en cuenta que la ley establece que, cuando la información obtenida sea necesaria para evitar un grave perjuicio para la salud de sus familiares biológicos, un Comité de expertos estudiará el caso y deberá decidir si es conveniente informar a los afectados o a sus representantes legales. Le agradecemos su desinteresada colaboración con el avance de la ciencia y la medicina. De esta forma está usted colaborando a vencer las enfermedades y ayudar a multitud de enfermos actuales y futuros.

Por favor, pregunte al personal sanitario que le ha comunicado esta información sobre cualquier duda que pueda tener, ahora o en el futuro, en relación con este consentimiento. Asimismo, puede comentar sus

dudas con su médico, quien le pondrá en contacto con el personal sanitario autorizado.

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CONSENTIMIENTO INFORMADO

UTILIZACIÓN DE DATOS CLÍNICOS Y MATERIAL BIOLÓGICO EXCEDENTE DEL PROCESO ASISTENCIAL PARA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA Y SU CONSERVACIÓN EN UN BIOBANCO

El abajo firmante autoriza al Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca a que el material biológico sobrante de las pruebas que se le han realizado o se le van a realizar como parte del actual proceso asistencial sean incorporadas en el Biobanco Biobanc-Mur Nodo 1, y que sea cedido desde el mismo con la finalidad de llevar a cabo proyectos de investigación biomédica, siempre que éstos cuenten con la obligada aprobación del Comité de Ética de Investigación competente. Esta autorización la concede tras haber sido informado verbalmente y haber leído la información adjunta. Confirmo que: 1. Autoriza al Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca a que el material biológico sobrante de las pruebas que se le han realizado o se le van a realizar como parte del actual proceso asistencial sean incorporadas en el Biobanc-Mur Nodo 1, y que sea cedido desde el mismo con la finalidad de llevar a cabo proyectos de investigación biomédica, siempre que éstos cuenten con la obligada aprobación del Comité de Ética de Investigación competente. Esta autorización la concede tras haber sido informado verbalmente y haber leído la información adjunta. �SI �NO

2. Desea que se le comunique la información derivada de la investigación que realmente sea relevante y aplicable para

su salud o la de su familia �SI �NO Teléfono o E-mail de contacto…………………………………

3. Autoriza a ser contactado en el caso de necesitar más información o muestras biológicas adicionales

�SI �NO Teléfono o E-mail de contacto: ……………………………………

4. He expresado mi deseo de que se respeten las siguientes excepciones respecto al objetivo y métodos de las investigaciones: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

DONANTE PERSONA QUE INFORMA Firma

Firma

En........................., a..…. de…………….. de.............

Nombre y Apellidos (donante)……………………………………….. Etiqueta Identificativa Paciente Edad: Sexo: DNI:…………………………

Si ha comprendido la información que se le ha proporcionado, ha resuelto cualquier duda que pudiese tener y decide colaborar con Biobanc-Mur Nodo 1 en los términos antes explicados, por favor, lea, complete y firme a continuación esta hoja

Persona del centro que informa

………………..………………………………………..

DNI:…………………………

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Anexos

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ANEXO VIII. CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL ESTUDIO. GRUPOCONTROL

Jerónimo Martínez García Comportamiento tumoral y relevancia clínica Tesis Doctoral – Universidad de Murcia de la determinación del perfil de resistencia en CEO Servicio Oncología Médica – HCUVA

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CONSENTIMIENTO INFORMADO DE PARTICIPACION EN EL ESTUDIO PARA LA PERSONA SANA

Título del proyecto: “COMPORTAMIENTO TUMORAL Y RELEVANCIA CLINICA DE LA DETERMINACION

DEL PERFIL DE RESISTENCIA EN CARCINOMA EPITELIAL DE OVARIO, TROMPA DE FALOPIO Y PERITONEAL PRIMARIO, EN ESTADIO AVANZADO”

Investigador Principal: Dr. Jerónimo Martínez García Médico Adjunto del Servicio de Oncología Médica Centro de realización: Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia (HCUVA) 1.- DESCRIPCIÓN DEL ESTUDIO El carcinoma epitelial de ovario, trompa de Falopio y peritoneal primario supone un importante problema de salud en el sexo femenino, siendo la segunda neoplasia ginecológica más frecuente. Gracias a los avances en la investigación tanto de su biología, como su diagnóstico y tratamiento, se va logrando mejorar la calidad de vida de las pacientes y el pronóstico de la enfermedad. En el presente trabajo queremos buscar nuevos biomarcadores que nos ayuden a clasificar mejor esta neoplasia y, así, poder planificar un mejor tratamiento a las pacientes. Pero para extraer conclusiones en este estudio necesitamos un grupo control de personas sanas, para determinar los valores normales de los biomarcadores estudiados en la población sana, y así valorar los resultados de los pacientes. Por ello, se le solicita participar en este proyecto de investigación como sujeto sano. Se precisaría una extracción sanguínea para hacer una determinación de los nuevos biomarcadores plasmáticos que queremos estudiar. Las muestras serán almacenadas en las instalaciones del Biobanco del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, que se encargará de procesarlas de acuerdo con las diferentes necesidades del proyecto y siguiendo la normativa sobre su manipulación. 2.- OBJETIVO La finalidad del estudio es buscar que factores determinan la evolución del cáncer de ovario, trompa de Falopio y peritoneal primario, y su respuesta al tratamiento. Con estos resultados podremos identificar diferentes subtipos tumorales y, así, plantear esquemas de tratamiento específicos dirigidos a cada paciente, con probable beneficio en eficacia de la terapia oncológica y supervivencia para el paciente. 3.- CONDICIONES DE LA DONACIÓN Usted no recibirá ninguna compensación económica ni otros beneficios materiales por donar su sangre. Sin embargo, si las investigaciones que se realicen tuvieran éxito, se podrían mejorar los tratamientos de este tumor y así, podría ayudar en el futuro a otras pacientes con esta neoplasia. La manipulación de las muestras se realizará de acuerdo a la normativa vigente en Biobanco y de la que se le proporciona un consentimiento informado propio. 5.- DERECHO DE REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO La decisión de donar su sangre es totalmente voluntaria. Usted puede negarse a donarlas e incluso puede revocar su consentimiento en cualquier momento, sin tener que dar ninguna explicación y sin que ello tenga ninguna repercusión para usted. Si revoca el consentimiento que ahora presta, los efectos no se extenderán a los datos resultantes de las investigaciones que ya se hayan llevado a cabo antes de la revocación de su consentimiento. 6.- RIESGOS El presente trabajo no implica ningún riesgo para usted, salvo las molestias derivadas de una extracción sanguínea.

Jerónimo Martínez García Comportamiento tumoral y relevancia clínica Tesis Doctoral – Universidad de Murcia de la determinación del perfil de resistencia en CEO Servicio Oncología Médica – HCUVA

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7.- PROTECCIÓN DE DATOS PERSONALES Y CONFIDENCIALIDAD El investigador se compromete a asegurar la intimidad y confidencialidad de los datos de carácter personal de los sujetos incluidos en el estudio, de conformidad a la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal; el Real Decreto 1720/2007, de 21 de diciembre, por el que se aprueba el Reglamento de desarrollo de la misma, así como la Ley 41/2002, de 14 de noviembre, básica reguladora de la autonomía del paciente y de derechos y obligaciones en materia de información y documentación clínica y documentos contenidos en el archivo. La información que se recoja será confidencial y no se usará para ningún otro propósito fuera de los de esta investigación. La cesión a otros centros de investigación, públicos o privados, de sus muestras o de sus derivados, así como de la información contenida en las bases de datos vinculada a las mismas y a su estado de salud, se realizaría mediante un procedimiento de disociación, esto es, suprimiendo la información personal que la identifica y sustituyéndola por un código. 8. DECLARACIÓN DE CONSENTIMIENTO Don/Dña.................................................................., con DNI………………… y teléfono……………….. DECLARO He leído la hoja de información que se me ha entregado. He sido informado por el Dr. ………………………………………………………………………………………………. sobre el proyecto de investigación “comportamiento tumoral y relevancia clínica de la determinación del perfil de resistencia en carcinoma epitelial de ovario, trompa de Falopio y peritoneal primario, en estadio avanzado” y su procedimiento. He comprendido las explicaciones que se me han facilitado en un lenguaje claro y sencillo. He podido realizar observaciones y me han sido aclaradas todas las dudas que he planteado. He comprendido que la participación es voluntaria y puedo revocar mi consentimiento en cualquier momento, sin tener que dar explicaciones y sin que esto tenga repercusión para mi. Que libre y voluntariamente acepto la participación en este proyecto de investigación. CONSIENTO Que el investigador principal u otros centros de investigación, públicos o privados, utilicen mis datos y las muestras donadas en las condiciones establecidas en la hoja de información. Fdo.: Nombre Paciente:......................................................................... Fecha: Fdo.: Nombre Médico: .......................................................................... Fecha: 9. REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO Revoco el consentimiento prestado en fecha......... de...............de 20.......y no deseo proseguir la participación en el presente estudio que doy con esta fecha por finalizada Fdo.: Nombre Paciente:.....................................................................DNI......................... Fecha: Fdo.: Dr/a......................................................................................... DNI.......................... Fecha:

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Anexos

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GRUPOPACIENTES

Jerónimo Martínez García Comportamiento tumoral y relevancia clínica Tesis Doctoral – Universidad de Murcia de la determinación del perfil de resistencia en CEO Servicio Oncología Médica – HCUVA

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CONSENTIMIENTO INFORMADO DE PARTICIPACION EN EL ESTUDIO PARA EL PACIENTE

Título del proyecto: “COMPORTAMIENTO TUMORAL Y RELEVANCIA CLINICA DE LA DETERMINACION

DEL PERFIL DE RESISTENCIA EN CARCINOMA EPITELIAL DE OVARIO, TROMPA DE FALOPIO Y PERITONEAL PRIMARIO, EN ESTADIO AVANZADO”

Investigador Principal: Dr. Jerónimo Martínez García Médico Adjunto del Servicio de Oncología Médica Centro de realización: Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia (HCUVA) 1.- DESCRIPCIÓN DEL ESTUDIO El carcinoma epitelial de ovario, trompa de Falopio y peritoneal primario supone un importante problema de salud en el sexo femenino, siendo la segunda neoplasia ginecológica más frecuente. Gracias a los avances en la investigación tanto de su biología, como su diagnóstico y tratamiento, se va logrando mejorar la calidad de vida de las pacientes y el pronóstico de la enfermedad. En el presente trabajo queremos buscar nuevos biomarcadores que nos ayuden a clasificar mejor la enfermedad, y así, poder planificar un mejor tratamiento a las pacientes. Se le solicita acceder a la muestra tumoral al diagnostico en la biopsia o en la cirugía, así como a la determinación de ciertos biomarcadores en las muestras sanguíneas que se realiza de rutina en la práctica asistencial. Posteriormente, realizaremos un seguimiento de su evolución clínica y la respuesta al tratamiento oncológico, con el objetivo de analizar que determinantes se relacionan con un mejor o peor pronóstico. El estudio no supondrá para usted la realización de nuevas pruebas, puesto que se realizarán sobre la muestra de tejido extraído al diagnostico en la biopsia o en la cirugía, y de la muestra sanguínea que se realiza habitualmente en las consultas antes de la cirugía y antes del primer y segundo ciclo de quimioterapia. Solo será necesario extraer un cilindro de muestra más en el mismo acto de la biopsia y dos tubos más de analítica sanguínea. Se realizará una última determinación sanguínea a los 2 meses de finalizar el tratamiento con quimioterapia, que se hará coincidir con el análisis solicitado por su oncólogo en su visita habitual. No se precisarán nuevas muestras durante el tratamiento. Las muestras serán almacenadas en las instalaciones del Biobanco del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, que se encargará de procesarlas de acuerdo con las diferentes necesidades del proyecto y siguiendo la normativa sobre su manipulación. 2.- OBJETIVO La finalidad del estudio es buscar que factores determinan la evolución del cáncer de ovario, trompa de Falopio y peritoneal primario, y su respuesta al tratamiento. Con estos resultados podremos identificar diferentes subtipos tumorales y, así, plantear esquemas de tratamiento específicos dirigidos a cada paciente, con probable beneficio en eficacia de la terapia oncológica y supervivencia para el paciente. 3.- CONDICIONES DE LA DONACIÓN Usted no recibirá ninguna compensación económica ni otros beneficios materiales por donar sus muestras. Sin embargo, si las investigaciones que se realicen tuvieran éxito, se podrían mejorar los tratamientos y, así, podría ayudar en el futuro a otras pacientes con su mismo tumor. La manipulación de las muestras se realizará de acuerdo a la normativa vigente en Biobanco y de la que se le proporciona un consentimiento informado propio. 4.- OTROS CONDICIONES DURANTE EL SEGUIMIENTO

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Durante el seguimiento podría ser contactada con el fin de recabar información sobre su situación clínica, de cara a completar datos en el proyecto de seguimiento, y así relacionarlo con los factores estudiados en las muestras al diagnostico. Por tal motivo, es importante que comunique al servicio de oncología si cambiara de domicilio y número de teléfono. 5.- DERECHO DE REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO La decisión de donar sus muestras es totalmente voluntaria. Usted puede negarse a donarlas e incluso puede revocar su consentimiento en cualquier momento, sin tener que dar ninguna explicación y sin que ello tenga ninguna repercusión en la atención médica que recibe en el Centro. Si revoca el consentimiento que ahora presta, los efectos no se extenderán a los datos resultantes de las investigaciones que ya se hayan llevado a cabo antes de la revocación de su consentimiento. 6.- RIESGOS El presente trabajo supone un estudio observacional, en ningún caso influirá en su tratamiento oncológico habitual ni se usará nueva medicación experimental. El estudio se basa en la determinación de factores en la muestra de tejido extraída al diagnostico y en las muestras sanguíneas durante los dos primeros tratamientos, que son práctica habitual solicitada por su médico. Su participación no supondrá para usted la realización de nuevas pruebas o extracciones. Por lo cual, el procedimiento no implica ningún riesgo para usted. 7.- PROTECCIÓN DE DATOS PERSONALES Y CONFIDENCIALIDAD El investigador se compromete a asegurar la intimidad y confidencialidad de los datos de carácter personal de los sujetos incluidos en el estudio, de conformidad a la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal; el Real Decreto 1720/2007, de 21 de diciembre, por el que se aprueba el Reglamento de desarrollo de la misma, así como la Ley 41/2002, de 14 de noviembre, básica reguladora de la autonomía del paciente y de derechos y obligaciones en materia de información y documentación clínica y documentos contenidos en el archivo. La información que se recoja será confidencial y no se usará para ningún otro propósito fuera de los de esta investigación. La cesión a otros centros de investigación, públicos o privados, de sus muestras o de sus derivados, así como de la información contenida en las bases de datos vinculada a las mismas y a su estado de salud, se realizaría mediante un procedimiento de disociación, esto es, suprimiendo la información personal que la identifica y sustituyéndola por un código.

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8. DECLARACIÓN DE CONSENTIMIENTO Don/Dña.................................................................., con DNI………………… y teléfono……………….. Don/Dña.................................................................., con DNI………………… y teléfono……………….., en calidad de representante (en caso de minoría legal o incapacidad) del paciente................................................................., con DNI............................. DECLARO He leído la hoja de información que se me ha entregado. He sido informado por el Dr. ………………………………………………………………………………………………. sobre el proyecto de investigación “comportamiento tumoral y relevancia clínica de la determinación del perfil de resistencia en carcinoma epitelial de ovario, trompa de Falopio y peritoneal primario, en estadio avanzado” y su procedimiento. He comprendido las explicaciones que se me han facilitado en un lenguaje claro y sencillo. He podido realizar observaciones y me han sido aclaradas todas las dudas que he planteado. He comprendido que la participación es voluntaria y puedo revocar mi consentimiento en cualquier momento, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en mis cuidados médicos. Que libre y voluntariamente acepto la participación en este proyecto de investigación. CONSIENTO Que el investigador principal u otros centros de investigación, públicos o privados, utilicen mis datos y las muestras donadas en las condiciones establecidas en la hoja de información. Fdo.: Nombre Paciente:................................................................................... En....................... a…...... de................................... de 20... Fdo.: Nombre Médico: ......................................................................................... En....................... a…...... de................................... de 20... 9. REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO Revoco el consentimiento prestado en fecha......... de ...............de 20 .......y no deseo proseguir la participación en el presente estudio que doy con esta fecha por finalizada Fdo.: Nombre Paciente:................................................................................... DNI ................................ En............................... a....... de.................... de........ 20...... Fdo.: Dr/a......................................................................................... DNI................................. En............................... a....... de.................... de........ 20......

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6. Referencias bibliográficas

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Referencias bibliográficas

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Referencias bibliográficas

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