Solicitud de asignación de mesa de arbitraje sinodal para la revisión de tesis terminada.

Morelia, Mich., a 20 de enero de 2006 C. Heriberto Gutiérrez Jefe del Departamento de Titulación de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia P r e s e n t e . Por medio del presente me permito solicitar la asignación de la mesa de arbitraje sinodal para la revisión de mi trabajo de tesis: Efecto de la congelación-descongelación del semen utilizando un diluyente para bovino sobre el estado funcional de la membrana plasmática del espermatozoide ovino, toda vez que mis asesores han considerado que la investigación esta concluida. Agradezco de antemano su atención. ATENTAMENTE Irma A. Toscano Torres

Nombre y firma de los asesores

__________________________________

La presente tesis fue realizada bajo nuestra asesoría, por lo que una vez revisada autorizamos al pasante para que proceda con los trámites subsecuentes para la obtención de su examen recepcional.

AGRADECIMIENTOS

Expreso mis sinceros agradecimientos a mis asesores, el Dr. Jesús Conejo N. y el Dr. José Herrera C. por su empeño, apoyo y colaboración en la realización de esta tesis, a los profesores el Dr. Manuel Jaime Tena M. y el M.V.Z. Javier Jiménez C. por su asesoría y formar parte de mi mesa sinodal así como también al Dr. Octavio Mejía por brindarme asesoría en el montaje de la técnica de congelación del semen ovino. Al Dr. José Segura por impartirme los conocimientos necesarios para la realización del análisis estadístico de este trabajo. Igualmente al Dr. Marco Cajero por proporcionarme el nitrógeno líquido para la realización del trabajo experimental. También quiero agradecer a mis compañeros y amigos que me ayudaron y aprendieron conmigo a trabajar y manejar el equipo del laboratorio de reproducción, a José Alfredo Hernández V. por brindarme de su tiempo y apoyarme en las recolecciones del semen, a Beatriz Villegas por enseñarme la técnica de tinción con clortetraciclina (CTC), a Cesar Almanza por colaborar conmigo y apoyarme en los ensayos de congelación del semen, a mis compañeros y estudiantes de primer año que han prestado sus servicios en el laboratorio de reproducción. También agradezco a la FMVZ-UMSNH por prestarme el espacio y equipo necesario para la realización del proyecto. Y principalmente quiero agradecer profundamente a mis padres, mi hermano y a Rafa por su apoyo moral y económico para mi formación profesional, así como también a mis mejores amigos Ingrid Olivo Z., Edmundo Patiño S. “el peque”, Jatziri Moreno, M., Ornella Barreto B., Francisco Briceño B., Angélica González B., porque siempre han estado conmigo y en general a todas las personas que estimo y que son parte de mi vida. DEDICATORIA El presente trabajo de tesis va dedicado a mi mamá, Irma Torres T. porque sin ella hoy no estaría aquí.

CURRICULUM VITAE

Nombre: Irma Arcelia Toscano Torres Edad: 24 años Fecha de Nacimiento: 19 de 0ctubre de 1981 Dirección: Benito Juárez Num. 879-A, colonia Industrial Ciudad: Morelia, Michoacán Teléfono Cel: 0444433-65-01-43 Curp: TOTI811019MGRSRR00 E-mail: daggetydandy@yahoo.com.mx

ESTUDIOS REALIZADOS

PRIMARIA: Esc. Prim. Urb. Fed. “Lázaro Cárdenas” de 1987-1993 en la ciudad de Huetamo Michoacán. SECUNDARIA: Esc. Sec. Fed. Nº 2 “Independencia” de 1993-1996 en la ciudad de Huetamo Michoacán. BACHILLERATO: Colegio de Bachilleres Plantel Huetamo de 1996-1999 en la ciudad de Huetamo Michoacán. LICENCIATURA: Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, carretera Morelia-Zinapécuaro, Km. 9.5 del Municipio de Tarímbaro Michoacán, de 1999-2004 (realizando trabajo de tesis). CURSOS: “Introducción a la Etología Animal” impartido del 27 de noviembre al 13 de diciembre del 2000, con duración de 40 horas, en la Ciudad de Morelia, Michoacán. “Temas Selectos en Patología Clínica Veterinaria” con una duración de 8 horas, en la Ciudad de Morelia, Michoacán. “Oftalmología Clínica en Perros y Gatos” impartido del 25 al 27 de agosto de 2003, con una duración de 12 horas, en la Ciudad de Morelia, Michoacán. “Clínica y Zootecnia en Equinos” impartido del 4 de agosto al 26 de septiembre del 2003, con una duración de 60 horas, en la Ciudad de Morelia, Michoacán. “Inseminación Artificial en Bovinos” impartido del 23 al 28 de junio del 2003, con una duración de 40 horas, en la Ciudad de Morelia, Michoacán.

“Reconocimiento de las Principales Enfermedades Exóticas de los Animales, los Sistemas y Planes de Emergencia” celebrado del 8 al 10 de julio de 2004, en la FMVZ de la UMSNH, en la Ciudad de Morelia, Michoacán, con una duración de 24 horas. “Bioestadísticas” impartido del mes de septiembre del 2004 al mes de febrero del 2005, en la Posta Zootécnica de la FMVZ de la UMSNH, en la Ciudad de Morelia, Michoacán. CONSTANCIAS: Participación en la Segunda Semana Nacional de Reforzamiento de Vacunación Antirrábica Canina los días del 23 al 29 de septiembre del 2001, en la Ciudad de Morelia, Michoacán. Las Actividades Realizadas como Voluntario en la Clínica Veterinaria de la UMSNH, del mes de abril del 2001 al mes de junio del 2002, en la ciudad de Morelia, Michoacán. Colaboradora de la Conferencia-Taller: “Los cuidados en tu mascota” en el XII Tianguis de la Ciencia llevado a cabo el 19 y 20 de abril del 2002, en la Unidad de Ciencias, Ingenierías y Humanidades, en la ciudad de Morelia, Michoacán. Por asistir al seminario de “Metodos Participativos Aplicados en Sistemas de Producción a Pequeña Escala” dirigido a profesores y estudiantes de Posgrado de la UMSNH, los días 13, 14 y 15 de octubre del 2004, con una duración de 18 horas, Morelia, Michoacán. Por participar como ponente en el XVI Encuentro de Investigación Veterinaria y Producción Animal con el tema: “Movilidad, viabilidad y estado funcional de la membrana plasmática del espermatozoide ovino congelado en un diluyente para bovino (Triladyl)” realizado el 7 y 8 de diciembre del 2005, con 22 horas crédito, Morelia, Michoacá. RECONOCIMIENTOS: Por haber dado la plática: “Displasia de Cadera”, el 7 de Mayo del 2002 en la Ciudad de Morelia, Michoacán. Por participar como instructor de la Práctica: “Recolección, Manejo y Evaluación de Semen” dirigida a los alumnos de la Unidad de Enseñanza-Aprendizaje, Reproducción y Mejoramiento Animal, de las secciones de la 1 a la 6, con un total de 30 horas; 29 de abril del 2005, en la Ciudad de Morelia, Michoacán.

ÍNDICE

RESUMEN 1

1 INTRODUCCIÓN 2

2 ANTECEDENTES 4

2.1 Conservación del semen de carnero 4

2.1.1 Almacenamiento del semen en estado líquido 5

2.1.2 Almacenamiento del semen criopreservado 7

2.2 Estado funcional de las membranas espermáticas durante el

proceso de criopreservación

9

3 JUSTIFICACIÓN 10

4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 11

5 HIPÓTESIS 11

6 OBJETIVOS GENERALES 12

7 MATERIAL Y MÉTODOS 12

7.1 Localización 12

7.2 Colección y evaluación del semen 12

7.3 Criopreservación del semen 15

7.3.1 Dilución del semen 15

7.3.2 Refrigeración del semen diluido 16

7.3.3 Congelación del semen 16

7.3.4 Descongelación del semen 17

7.4 Evaluación del estado funcional de la membrana plasmática

7.4.1 Determinar el estado funcional de la membrana plasmática

mediante clortetraciclina (CTC) fluorescente

17

17

7.5 Análisis estadístico

8 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

9 CONCLUSIÓN

10 LITERATURA CITADA

19 20 24 24

ÍNDICE DE CUADROS:

CUADRO 1. COMPOSICIÓN DEL DILUYENTE A BASE DE TRIS………....6

CUADRO 2. VALORACIÓN DE LAS ONDAS DE MOVIMIENTO ………….13

CUADRO 3. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS

DEL SEMEN OVINO (N=16) …………...........................................................20

CUADRO 4. MEDIAS (±EE) PARA EL EFECTO DEL TRATAMIENTO DEL

SEMEN OVINO SOBRE EL PORCENTAJE DE MOVILIDAD PROGRESIVA Y

ESPERMATOZOIDES VIVOS EN TRILADYL…………………………………21

CUADRO 5. MEDIAS (±EE) PARA EL EFECTO DEL TRATAMIENTO SOBRE

EL ESTADO FUNCIONAL DE LA MEMBRANA ESPERMÁTICA DEL SEMEN

OVINO CRIOPRESERVADO EN TRILADYL………………………………….21

1

RESUMEN Se determinaron los porcentajes de movilidad progresiva (MP), porcentajes de

espermatozoides vivos (EV), así como el estado funcional de la membrana

plasmática del espermatozoide ovino en el semen fresco (SF), refrigerado (SR) y

congelado (SC). Se utilizaron dos moruecos adultos de la raza Kathadín, y se

colectaron 16 eyaculados durante los meses de junio, julio, agosto y septiembre

de 2005. Se utilizó como diluyente el Triladyl (diluyente originalmente utilizado en

la conservación del semen bovino) con yema de huevo al 20% y se envasó en

pajillas de 0.5 ml; el semen se refrigeró durante 24 horas y después se congeló en

nitrógeno líquido a -196°C. El estado funcional de la membrana plasmática se

determinó según el patrón de tinción con clortetraciclina fluorescente:

espermatozoides no capacitados (NC), capacitados (CA) y con reacción

acrosomal (RA). Se encontró que los valores promedio (±DE) de MP y EV fueron

diferentes estadísticamente en cada tratamiento (p<0.05), obteniendo los valores

más altos para el SF (87% ± 0.2% y 85% ± 0.16%, respectivamente), en

comparación con el SR (67% ± 0.2% y 77% ± 0.18%, respectivamente) y el SC

(40% ± 0.26% y 60% ± 0.18%, respectivamente). Durante la refrigeración se

incrementó significativamente (p<0.05) la proporción de espermatozoides CA

(68% ± 0.27%) y RA (13% ± 0.19%), con respecto al SF; mientras que la

congelación redujo significativamente (p<0.05) el porcentaje de espermatozoides

NC, con respecto al SR. El Triladyl es un diluyente capaz de criopreservar el

semen ovino, a pesar de que no logró evitar la disminución de la viabilidad, la

movilidad y el daño de membranas espermáticas. Durante la refrigeración los

espermatozoides experimentan el mayor daño, en movilidad, viabilidad y

funcionalidad de la membrana plasmática. Se sugiere que el semen

criopreservado en Triladyl-yema de huevo se utilice por laparoscopia o

laparotomia intrauterina en la IA de borregas.

PALABRAS CLAVE: capacitación, criopreservación de semen, espermatozoide

ovino, estado funcional de la membrana, reacción acrosomal.

2

1. INTRODUCCIÓN

Las investigaciones realizadas sobre conservación de semen e

inseminación artificial (IA) en ovinos fueron iniciadas a principios de la década de

1930 por el ruso Ivanov, con semen fresco y diluido en gran escala, en programas

de mejoramiento genético en ovinos (Salamon y Maxwell, 2000).

Varias son las razones por las cuales es necesario estimular la

investigación para conservar el semen ovino por periodos largos. Primero, la

necesidad de obtener el semen y transportarlo desde los centros de colección a

las granjas más distantes, para inseminar un gran número de ovejas con semen

de carneros sobresalientes. Segundo, un eyaculado de un macho genéticamente

superior puede ser usado para preñar un gran número de hembras y maximizar la

distribución de genes favorables. Tercero, se elimina el contacto físico entre

animales, evitando las enfermedades de transmisión sexual (Bailey et al., 2000).

Los métodos de conservación del semen disponibles buscan reducir o

detener el metabolismo del espermatozoide y así prolongar su vida fértil. Existen

dos métodos de conservación: 1) En estado líquido en refrigeración (0º a 15ºC), y

2) criopreservado (-196ºC).

La fertilidad del semen refrigerado por espacio de 24 h de almacenamiento,

experimenta una reducción en un 10% a 35% por cada día de almacenamiento

(Salamon y Maxwell, 2000). También, la IA con semen criopreservado produce un

3

descenso de la fertilidad, con respecto al semen fresco. Donovan et al., (2004),

encontraron en ovejas inseminadas por IA cervical, una tasa de fertilidad a parto

con semen criopreservado de 34%-52% y con semen fresco recién colectado de

70%-82%. Salamon y Maxwell, (2000), en una amplia revisión reportaron una

fertilidad del 54% en ovejas inseminadas tanto por vía intrauterina, como por

laparoscopia.

El proceso de criopreservación del semen reduce la movilidad y genera

cambios en la membrana plasmática del espermatozoide, semejantes a la

capacitación; por lo cual, una vez descongelados, la sobrevivencia de los mismos

se ve disminuida (Salamon y Maxwell, 1995; Maxwell y Watson, 1996).

El Triladyl es un diluyente comercial que contiene agua bidestilada, glicerol,

TRIS (hidroximetil aminometano), ácido cítrico, fructosa, tilosina, gentamicina,

espectinomicina y lincomicina. A este diluyente se le adiciona yema de huevo al

20%, como crioprotector; fue desarrollado originalmente para conservar el semen

bovino (Hinsch et al., 1997; Gil et al., 2000) y ha sido empleado en la

criopreservación de semen ovino con aparentemente buenos resultados (Mejía,

2000). Sin embargo, no se ha estudiado el efecto de su almacenamiento sobre el

estado de la membrana plasmática del espermatozoide ovino.

4

2. ANTECEDENTES

2.1 Conservación del semen de carnero.

El éxito de la IA en ovinos depende en gran medida del desarrollo de

diluyentes que conserven el semen satisfactoriamente. Las propiedades de un

buen diluyente son las siguientes (Hafez, 1985):

• Debe ser isotónico al semen (tener la misma concentración de iones libres):

citrato sódico deshidratado a 2.9%.

• Debe tener capacidad amortiguadora (evitar cambios en el pH al neutralizar

los ácidos producidos por el metabolismo de los espermatozoides): solución

isotónica de citrato de sodio.

• Los diluyentes deben proteger a los espermatozoides de las lesiones del

choque por frío durante el enfriamiento de temperaturas a 5ºC: lecitinas y

lipoproteínas de la yema de huevo o leche.

• Debe proporcionar nutrientes para el metabolismo de los espermatozoides:

yema de huevo, leche y algunos azúcares simples.

• Se deben controlar los contaminantes microbianos: antibióticos como la

penicilina y la estreptomicina.

• Los espermatozoides deben estar protegidos contra daño durante la

congelación y descongelación: glicerol.

• El diluyente debe preservar la vida de los espermatozoides con un mínimo

de efecto sobre la fertilidad.

5

2.1.1 Almacenamiento del semen en estado líquido.

El semen en estado líquido se almacena a temperaturas de 15ºC y a 5ºC.

Cuando el semen se conserva a temperaturas cercanas a los 0ºC produce

cambios irreversibles en el espermatozoide (shock térmico). Milovanov en 1931

encontró dos procedimientos para evitar éste problema; mediante la reducción

gradual de la temperatura de enfriamiento y por la adición de lípidos al diluyente

(yema de huevo, testículos, cuerpo lúteo, cerebro y harina de soya). Antes de

1940, el principal diluyente utilizado en el almacenamiento de semen de carnero

en estado líquido, en la ex Unión Soviética, se elaboró con glucosa-fosfato-

extracto de soya, el cual fue reemplazado por otro a base de glucosa-citrato-yema

de huevo (Salamon y Maxwell, 2000).

En este diluyente la glucosa es la principal fuente de energía. El citrato de

sodio funciona como un amortiguador del pH y la yema de huevo protege al

espermatozoide del shock térmico, ya que reduce la pérdida de enzimas

acrosómicas y previene los cambios degenerativos en el acrosoma (Salamon y

Maxwell, 2000).

El citrato de sodio puede ser sustituido por amortiguadores orgánicos tal

como el Tris, ya que tiene una mayor capacidad amortiguadora, es poco tóxico a

la célula viva y puede penetrar al espermatozoide y actuar como un amortiguador

intracelular. La glucosa también puede ser sustituida por la fructosa y manosa

6

como fuentes de energía. De acuerdo con estos conocimientos se desarrolló un

diluyente a base de Tris (cuadro 1) (Salamon y Maxwell, 2000).

Cuadro 1. Composición del diluyente a base de Tris (Salamon y Maxwell, 2000). Componente Cantidad

Tris (g) 3.63

Fructosa (g) 0.50

Ácido cítrico (g) 1.99

Yema de huevo (ml) 14

Penicilina (UI) 100,000

Estreptomicina (mg) 100

Agua destilada (ml) 100

La leche entera y descremada se han utilizado como diluyentes del semen

de carnero, en especial la leche de vaca. La fracción proteica de la leche actúa

como un amortiguador y como un agente quelante. La leche debe ser sometida a

temperaturas de 90-95ºC durante 8 a 10 minutos para inactivar la lactenina, una

fracción protéica que es tóxica al espermatozoide; la leche se utiliza en una

proporción de 9 g de leche en polvo en 100 ml de agua bidestilada. La leche

ultrapasteurizada es estéril, no requiere calentarse y puede ser usada

7

directamente como un diluyente sin necesidad de ser tratada previamente

(Salamon y Maxwell, 2000).

También se han adaptado diluyentes para la conservación de semen de

carnero, diseñados originalmente para la conservación del semen de toro, tal

como el IVT (Illinois Variable Temperatura) y el CUE (Cornell University Extender).

Maxwell y Salamon (1993) concluyeron que la fertilidad del semen almacenado en

estado líquido por más de 24 horas disminuye a una tasa de 10 a 35% por día de

almacenamiento, cuando se utilizó inseminación cervical. Los principales cambios

que ocurren durante el almacenamiento son reducción de la movilidad y de la

integridad de la membrana plasmática del espermatozoide y consecuentemente

una declinación de la sobrevivencia del espermatozoide. Este problema de la baja

fertilidad del semen de carnero almacenado en estado líquido queda aún sin

resolver.

2.1.2 Almacenamiento del semen criopreservado.

La capacidad de fertilización del esperma de carnero suele reducirse al ser

conservado en nitrógeno líquido a -196ºC. En diversos trabajos se ha comprobado

que la calidad del semen después de la descongelación, se ve afectada por la

osmolaridad del diluyente, su naturaleza, la concentración del agente crioprotector

y los ritmos de congelación y descongelación. La acción protectora de los

crioprotectores como el glicerol, se atribuye fundamentalmente a su “capacidad

8

tampón salina” que hace mínimo daño electrolítico a medida que se congela el

agua (Owen et al., 1994).

Se han utilizado varios diluyentes para la criopreservación del semen de

carnero. Los diluyentes a base de citrato-glucosa o fructosa-yema de huevo

producen tasas de parto bajas y moderadas (17% y 40%, respectivamente), con IA

cervical. Los diluyentes a base de leche-citrato-fructosa o lactosa-yema de huevo,

también producen tasas de parto bajas (0-23%) y moderadas (30-45%), cuando se

emplea IA cervical. Igualmente, los diluyentes a base de lactosa (lactosa-yema de

huevo), resultan en una pobre (12-29%) a moderada (40-50%) fertilidad, cuando

se realiza por fertilización in vitro (Salamon y Maxwell, 2000).

A los diluyentes basados en sacarosa se les debe de añadir antioxidantes

(vitamina E) y agentes quelantes (EDTA) y realizarse el proceso de congelación

en condiciones anaeróbicas, para prevenir la lipoperoxidación. Las tasas de parto

obtenidas con semen congelado en diluyentes a base de sacarosa, varían del 19%

a 55%. La rafinosa, como el principal componente de los diluyentes para la

congelación, se utiliza en combinación con el citrato-yema de huevo-glicerol,

generando tasas de parto del 40% al 50% después de inseminaciones cervicales

(Salamon y Maxwell, 2000).

El Tris, un componente de los diluyentes para la conservación del semen de

carnero fue utilizado por primera vez por Salamon y Visser en 1972. Estos autores

encontraron que el espermatozoide de carnero tolera concentraciones de Tris de

9

250 a 400 mM, y obtuvieron tasas de parto del 30 al 57% después de

inseminaciones cervicales.

El Triladyl (glicerol-tris-ácido cítrico-fructosa-antibióticos) es un diluyente

elaborado a base de Tris, disponible comercialmente, y elaborado originalmente

para la conservación del semen de toro (Hinsch et al., 1997; Gil et al., 2000). En

estudios in vitro éste diluyente proporcionó valores iguales o superiores al medio

de congelación basado en lactosa-yema de huevo y sacarosa-yema de huevo. La

adición de 2% de albúmina sérica bovina al Triladyl mejoró el efecto protector de la

integridad del acrosoma. Sin embargo, después de la inseminación la tasa de

concepción fue mejor en un medio basado en sacarosa que en Tryladyl.

Recientemente se encontró que el semen congelado en éste diluyente promete

mejorar la fertilidad después de la inseminación transcervical (Salamon y Maxwell,

2000). No obstante, no se conocen estudios sobre los cambios que experimentan

los espermatozoides congelados-descongelados en Triladyl.

2.2 Estado funcional de las membranas espermáticas durante el proceso de

criopreservación.

El espermatozoide no es capaz de fertilizar hasta que experimenta los

procesos de capacitación. La viabilidad y movilidad del espermatozoide se

mantienen durante más tiempo que su capacidad fertilizante. Esto puede ser a que

los cambios de las membranas del espermatozoide durante el almacenamiento,

eventualmente, hagan a las células incapaces para la fertilización por acelerar los

10

procesos de capacitación normales y así acortar el período de vida fértil de la

célula (Maxwell y Watson, 1996).

El daño ultraestructural y bioquímico que ocurre en muchos

espermatozoides durante la congelación y descongelación está causado por: 1) la

formación de cristales de hielo internos que afectan a la estructura del

espermatozoide, 2) por la concentración del soluto que se produce conforme el

agua pura se quita del medio de suspensión del interior y del exterior de las

células, y 3) por las interacciones de esos dos factores físicos (Salisbury et al.,

1978). Sin embargo, un número pequeño de espermatozoides permanecen

móviles y probablemente funcionalmente intactos, los cuales pueden participar en

la fertilización y resultar en altas tasas de fecundación (85%-93%) después de la

IA intrauterina, lo cual se debe a la proximidad de los espermatozoides a los

ovocitos venciendo el problema perjudicial del transporte del semen (Maxwell y

Watson, 1996).

3. JUSTIFICACIÓN

Se ha encontrado que el semen de carnero experimenta un descenso de la

fertilidad cuando es criopreservado a -196ºC. En efecto, Donovan et al (2004),

encontró una tasa de fertilidad a parto con semen fresco de 70-82% vs 34-52%

con semen congelado. Esto se debe a que el semen criopreservado experimenta

un incremento en la proporción de espermatozoides capacitados, lo que acorta su

periodo de vida en el tracto genital de la oveja y consecuentemente un descenso

11

de la capacidad fertilizante (Maxwell y Watson, 1996; Gillan et al., 1997; Salamon

y Maxwell, 2000).

En México, el Triladyl ha sido utilizado para la congelación de semen de

carnero con buenos resultados (Mejía, O. Comunicación personal, 2004). No

obstante, no se han realizado estudios que evalúen los cambios que experimentan

los espermatozoides durante el período de refrigeración y la congelación-

descongelación.

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

¿Cuál será el efecto de la criopreservación del semen ovino sobre el estado

funcional de la membrana plasmática del espermatozoide, utilizando un diluyente

comercial para bovinos (Triladyl)? ¿En qué momento del proceso de congelación

ocurre la mayor proporción de espermatozoides con alteraciones de membrana

plasmática?

5. HIPÓTESIS

Se espera que el espermatozoide ovino criopreservado en un diluyente

comercial (Triladyl) mantenga una elevada proporción de membranas intactas, así

como de espermatozoides vivos y móviles, con respecto al semen fresco. Así

mismo, durante la etapa de refrigeración se observará un mayor porcentaje de

capacitación espermática que durante la congelación-descongelación.

12

6. OBJETIVOS GENERALES

1. Evaluar el estado funcional de la membrana plasmática del espermatozoide

ovino criopreservado a -196ºC, utilizando un diluyente comercial para bovinos

(Triladyl).

2. Determinar si el mayor porcentaje de capacitación espermática y/o reacción

acrosomal se presenta durante la refrigeración o la congelación.

3. Determinar los porcentajes de movilidad progresiva y viabilidad espermática en

semen refrigerado y congelado, con respecto al semen fresco.

7. MATERIAL Y MÉTODO

7.1 Localización.

El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Reproducción

Animal y en el sector de ovinos de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

de la U.M.S.N.H., misma que se ubica en el Km. 9.5 de la carretera Morelia-

Zinapécuaro, en el municipio de Tarímbaro.

7.2 Colección y evaluación del semen

El semen se obtuvo de 2 sementales de la Posta Zootécnica, de la raza

Kathadin de 3 y 5 años de edad. Se realizaron 16 colecciones durante los meses

julio, agosto, septiembre y octubre del 2005 mediante la técnica de la vagina

artificial descrita por Mejía (2004). Posteriormente el semen fue evaluado macro y

13

microscópicamente en el laboratorio. La evaluación macroscópica analizó las

siguientes características en el semen fresco: volumen, color y consistencia según

lo describe Mejía (2004). En la evaluación microscópica del semen fresco, se

analizó: movilidad masal, movilidad progresiva, concentración espermática,

viabilidad y anormalidades morfológicas.

La movilidad masal se determinó inmediatamente después de la recolección del

semen y para ello se utilizó un microscopio compuesto u óptico común con

objetivos de 10x y 40x (aumentos), manteniendo el semen y el material a una

temperatura de entre 30 a 35°C. Se colocó una gota de semen sin diluir con una

pipeta pasteur en un portaobjetos y se calificó con la escala que se presenta en el

cuadro 2.

Cuadro 2. Valoración de las ondas de movimiento (Evans y Maxwell, 1990).

Valor Clase Descripción

5 Muy buena Ondas muy rápidas

4 Buena Ondas rápidas

3 Regular Ondas lentas

2 Pobre Sin ondas (movimiento aislado

1 Muy pobre Sin movimiento

0 Mala Muertos

14

La movilidad progresiva se evaluó de forma individual, mediante la

determinación del porcentaje de espermatozoides con movimiento progresivo o de

avance, para lo cual se colocó una gota de semen en un portaobjetos con

cubreobjetos.

La concentración espermática se determinó con una cámara de Neubauer; se

realizó una dilución del semen 1:200 en una pipeta de Thoma, utilizando citrato de

formalina y se colocó una gota sobre la cuadrícula de la cámara. El conteo

espermático se realizó con el objetivo 40x. Para obtener la concentración total de

espermatozoides se utilizó la siguiente fórmula (Mejía, 2004):

número de espermatozoides contados

Conc. espermática = -------------------------------------------------------------------

(altura cámara) (dilución) (superficie evaluada)

1/10 1/200 5/25 = 1/5 = Esp./mm3 = (No. Promedio) (10,000) Esp./ml = (esp./mm3) (1000) Conc. total de espermatozoides = (esp./ml) (volumen eyaculado) Conc. total de espermatozoides móviles = (esp./ml) (volumen eyaculado) (mov.

progresiva)

La morfología y viabilidad espermática se evaluaron por separado, mediante un

frotis. Se colocó una gota de semen sobre un 30°C y se mezcló con una gota de la

tinción eosina-nigrosina y se realizó la extensión, dejándola secar a temperatura

15

ambiente durante 1 a 2 minutos. La muestra se observó con el objetivo de 100X y

se contaron 100 espermatozoides para determinar el porcentaje de

espermatozoides vivos y muertos y el porcentaje de espermatozoides con

anormalidades, respectivamente.

7.3 Criopreservación del semen.

7.3.1. Dilución del semen.

El semen se diluyó en Triladyl1; para preparar 50 ml de diluyente, se utilizó:

Diluyente Triladyl: 10 ml

Agua bidestilada: 30 ml

Yema de huevo: 10 ml

El diluyente así preparado, se filtró y se mantuvo a baño maría a una

temperatura de 30°C durante una hora antes de ser agregado al semen.

Posteriormente se envasó el semen en pajillas de 0.5 ml y se usó una dosis de

200X106 espermatozoides.

Para determinar el número de pajillas que se van a preparar se dividió la

concentración espermática del semen entre el número de espermatozoides/dosis

1 Triladyl, MR por Minitube, hecho en Alemania.

16

(200X106); después se multiplicó por 0.5 ml para determinar la cantidad en ml de

diluyente que fue agregado al semen.

Finalmente se adicionó el diluyente al semen con una jeringa y se

homogenizó; después se llenaron las pajillas y se sellaron en uno de sus extremos

con alcohol polivinílico para ser colocadas dentro de los goblets, para su

refrigeración.

7.3.2. Refrigeración del semen diluido.

El semen diluido en Triladyl-yema de huevo se mantuvo a una temperatura

de 5°C durante 24 horas. Período de equilibrio, en el cual las lipoproteínas de la

yema de huevo se incorporan a las membranas plasmáticas de los

espermatozoides, para su protección contra el shok térmico.

7.3.3. Congelación del semen.

Las pajillas con semen refrigerado se colocaron sobre una rejilla de acero

inoxidable y fueron sometidas a vapor de nitrógeno durante 8 minutos y luego se

sumergieron en nitrógeno líquido a -196°C durante 2 minutos y se almacenaron en

termos criogénicos de 20 lts hasta su evaluación.

17

7.3.4. Descongelación del semen.

Para descongelar el semen, se tomó una de las pajillas y se mantuvo 10

segundos a temperatura ambiente y 1 minuto a baño maría a 35ºC. Después se

realizó la evaluación del semen post-descongelación, como se explicó

anteriormente.

7.4 Evaluación del estado funcional de la membrana plasmática.

El estado funcional de la membrana plasmática se evaluó según se indica a

continuación.

7.4.1. Determinación del estado funcional de la membrana plasmática

mediante clortetraciclina (CTC) fluorescente.

Se tomaron 0.5 ml de semen, se depositaron en un tubo de ensaye y fueron

centrifugados a 2000 revoluciones por minuto durante 10 minutos. El botón de

espermatozoides se resuspendió en 100 µl de glutaraldehido al 0.2%, en Tris 0.5

M y pH final de 7.4 para su fijación y se procedió a la tinción con CTC para

determinar el estado funcional de las membranas plasmáticas del semen fresco,

refrigerado y congelado-descongelado, de acuerdo con el procedimiento de Fraser

y Herold (1990). La CTC se preparó a una concentración de 750 µM, en un

amortiguador de Tris 20 mM, NaCl 130 mM, L-cisteína 5 mM, a un pH final de 7.8.

La solución fue preparada en fresco y se mantuvo en oscuridad. Una suspensión

18

de 5 µl de espermatozoides fijados se mezcló con 5 µl de CTC en un portaobjetos

y se dejó reposar 60 segundos. Finalmente, se añadió una gota de 1.4-Diaza-

biciclo (2.2.2) octano (DABCO) 0.22 M en glicerol al 90%, para conservar la

fluorescencia. Después, el campo fue iluminado con luz ultravioleta a 495 nm para

excitar a la CTC y determinar el estado funcional de los espermatozoides de

acuerdo con los siguientes patrones de tinción:

a) Espermatozoides no capacitados, con fluorescencia uniforme en la cabeza

y acrosoma intacto.

b) Espermatozoides capacitados, con fluorescencia concentrada en la región

acrosomal, una banda sin fluorescencia en la región postacrosomal y

presencia de acrosoma intacto.

c) Espermatozoides con reacción acrosomal, sin fluorescencia en la cabeza,

excepto, una delgada banda en la región ecuatorial.

Se contaron como mínimo 200 células espermáticas por preparación.

Para alcanzar los objetivos del presente trabajo el semen se evaluó en

diferentes momentos: fresco, refrigerado y congelado, en los cuales se determinó

la movilidad progresiva, la viabilidad y el estado funcional de la membrana.

19

7.5 Análisis estadístico.

Se realizó un análisis de varianza para un diseño completamente al azar y

una comparación de medias mediante la prueba de Duncan a una p<0.05,

utilizando el procedimiento de modelos lineales generales (GLM) y el paquete

estadístico SAS.

Modelo:

Уіјκ= µ+tj+Єіjκ

Donde:

Уіјκ= es una observación de cada variable evaluada

µ= promedio común de la observación

tj= efecto de tratamiento (i= 1, 2, 3)

Єіjκ= efecto aleatorio atribuible a cada observación Єіjκ~NID (O, r2)

20

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el cuadro 3 se muestran los valores promedio de las características

macroscópicas y microscópicas de los eyaculados colectados.

Cuadro 3. Características macroscópicas y microscópicas del semen ovino (n=16).

Semen fresco

Color

Vol (ml)

Concentración espermática/ml

Movilidad progresiva

(%)

Viabilidad

(%)

Anormali-dades (%)

1 Blanco lechoso 1.5 5,400X106 90 79 20 2 Blanco lechoso 2 3,528X106 80 81 20 3 Blanco lechoso 2.5 5,096X106 90 92 19 4 Blanco cremoso 1.5 3,855X106 90 89 8 5 Blanco cremoso 0.5 736X106 80 91 10 6 Blanco cremoso 0.5 854X106 80 93 5 7 Blanco lechoso 0.8 2,029X106 80 84 12 8 Blanco cremoso 0.8 838X106 80 84 13 9 Blanco cremoso 0.5 1,254X106 80 92 6 10 Blanco lechoso 0.5 1,282X106 90 86 4 11 Blanco lechoso 1.5 4,772X106 90 85 4 12 Blanco cremoso 0.3 525X106 90 70 20 13 Blanco lechoso 0.8 1,649X106 90 92 10 14 Blanco lechoso 0.5 1,055X106 90 74 6 15 Blanco lechoso 1 3,865X106 90 77 3 16 Blanco cremoso 1 1,845X106 90 87 3

Promedio -------- 1.01

2411X106

86.25

84.75

10.18

El análisis de varianza reveló que existen diferencias altamente

significativas (p<0.0001) en cada una de las variables como son movilidad

progresiva (MP), porcentaje de espermatozoides vivos (PEV), espermatozoides no

capacitados (NC), capacitados (CA) y con reacción acrosomal (RA), con respecto

a cada una de los tratamientos: semen fresco (SF), semen refrigerado (SR) y

semen congelado (SC).

21

Las comparaciones de medias entre cada uno de los tratamientos con su

error estándar para las variables de MP y PEV se muestran en el cuadro 4.

Cuadro 4. Medias (±EE) para el efecto del tratamiento del semen ovino sobre el porcentaje de movilidad progresiva y espermatozoides vivos en Triladyl. Tratamiento Movilidad progresiva (%) Espermatozoides vivos (%) Semen fresco 87 ± 0.2 a 85 ± 0.16 a

Semen refrigerado 67 ± 0.2 b 77 ± 0.18b

Semen descongelado 41 ± 0.2 c 60 ± 0.18c

Literales diferentes entre columnas son estadísticamente significativas (p<0.05).

Se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre los tres tratamientos

para MP y PEV, obteniendo el SF un porcentaje mayor (87% ± 0.2% y 85% ±

0.16% respectivamente), en comparación con el SR (67% ± 0.2% y 77% ± 0.18%,

respectivamente) y el SC (41% ± 0.2% y 60% ± 0.18%, respectivamente).

En el cuadro 5 se observan las medias y su error estándar para las

variables que miden el estado funcional de las membranas espermáticas (NC, CA,

RA).

Cuadro 5. Medias (±EE) para el efecto del tratamiento sobre el estado funcional de la membrana espermática del semen ovino criopreservado en Triladyl.

Estado funcional Tratamiento No capacitados Capacitados Reacción acrosomal

Semen fresco 57% ± 0.24% a 40% ± 0.26%a 3% ± 0.18% a

Semen refrigerado 19% ± 0.25% b 68% ± 0.27%b 13% ± 0.19% b

Semen congelado 12% ± 0.24% c 72% ± 0.26%b 16% ± 0.18% b

Literales diferentes entre columnas son estadísticamente significativas (p<0.05).

22

Se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre tratamientos, siendo

el SF el que mostró un porcentaje menor de membranas dañadas (40% ± 0.26%

de espermatozoides CA y 3% ± 0.18% de espermatozoides con RA). El SR y el

SC mostraron un incremento significativo de espermatozoides CA y con RA, en

comparación con el SF. No se encontraron diferencias estadísticamente

significativas (p>0.05) entre los tratamientos SR y SC.

En el semen fresco los porcentajes de movilidad progresiva y viabilidad

coinciden con los mencionados en la literatura. Hafez (1985), mostró un porcentaje

de movilidad progresiva del 60 al 90%. Hernández et al (1975) encontraron una

movilidad del 87.1% y una viabilidad de 87.8% en semen de borregos pelibuey,

obtenido con vagina artificial. Respecto al daño que sufren las membranas

plasmáticas y acrosomal en el semen fresco, los valores encontrados en el

presente trabajo son similares a los de Gillan, et al (1997), quienes obtuvieron

39% de espermatozoides CA+RA, pero fueron superiores a los reportados por

Pérez et al (1996), de 19% de espermatozoides CA+RA. Estas variaciones en los

resultados pueden ser un efecto de la época del año en que se trabajaron los

sementales, ya que la calidad de los eyaculados varia con la estación del año

(Courot, 1979).

En el presente trabajo, la refrigeración del semen en Triladyl, después de 24

horas de almacenamiento, produjo un descenso de la movilidad progresiva y

viabilidad espermática con respecto al semen fresco. Estos resultados son

similares a los de Cardoso (2004), que obtuvo una movilidad progresiva de 69.8 %

23

y una viabilidad de 81.2%, después de un día de almacenamiento a 5ºC en un

diluyente basado en Tris-fructosa-yema de huevo. También se observó que,

durante la refrigeración se produce una mayor alteración de las membranas

espermáticas y no en la etapa de congelación.

La congelación del semen ovino en Triladyl-yema de huevo al 20%, en el

presente trabajo, produjo un porcentaje de viabilidad superior al obtenido por

Boretto et al (2002), del 46.7%. Angulo et al (1999), en un diluyente con tris-ácido

cítrico-fructosa-glicerol-yema de huevo, encontraron 51.3% y 48% de movilidad

progresiva en el semen descongelado en dos grupos, respectivamente. La

congelación por si sola no logró incrementar la proporción de espermatozoides

capacitados y con reacción acrosomal, pero si se observó una menor proporción

de espermatozoides no capacitados, con relación al semen refrigerado. La

magnitud y el tipo de alteraciones producidas por la congelación del semen en

Triladyl son similares a las reportadas en la literatura. Gillan, et al (1997)

obtuvieron 92% de espermatozoides CA+RA en semen congelado-descongelado.

Maxwell y Watson (1996) indican que los procesos de almacenamiento del semen,

ya sea en refrigeración o criopreservado a -196°C, reducen la movilidad y alteran

la integridad de la membrana del espermatozoide, teniendo como consecuencia

una pérdida de la capacidad fertilizante. Los espermatozoides capacitados

conservan su capacidad fertilizadora por un periodo más corto que los

espermatozoides no capacitados (Salamon y Maxwell, 2000). Por eso se

recomienda que el semen criopreservado se deposite cerca del ámpula, mediante

24

inseminación por laparoscopia o laparotomía intrauterina (Salamon y Maxwell,

2000; Mejía, 2004).

9. CONCLUSIONES

• El Triladyl es un diluyente capaz de criopreservar el semen ovino,

manteniendo un porcentaje de movilidad progresiva arriba del 40%, una

viabilidad espermática del 60% y 85% de espermatozoides fértiles.

• El momento en que ocurre la mayor capacitación de espermatozoides, es

durante la etapa de refrigeración del semen.

• El semen fresco presentó una elevada proporción de espermatozoides

capacitados.

10. LITERATURA CITADA

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