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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y FORESTALES

PRODUCTOS LÁCTEOS

Primeros análisis para determinar la calidad de leche

Objetivo:

-Determinar la composición, las propiedades físico-químicas de la leche y comprender las variaciones comunes

que puede sufrir.

Estos análisis se pueden efectuar en:

A) La planchada del camión:

A1) Control de temperatura

A2) Prueba del alcohol

B) El laboratorio de recibo de la planta industrial:

B1) Densidad a 15 º C

B2) pH

B3 ) Acidez:

a) Grados Dornic

b) Otros métodos

B4). Materia grasa:

a) Método Gerber

b) Método de Babcock

c) Método de Rose – Gottlieb

d) Método turbidimétricos

e) Método basados en espectroscopía de infrarrojo

B5) Proteínas:

a) Método de Kjeldahl

b) Otros métodos instrumentales

B6) Lactosa:

a) Método de la Cloramina T

B7) Extracto seco:

a) Método analítico

b) Por fórmulas y tablas:

b1) Extracto seco total

Fórmula de Fleischmann

Fórmula de la AOAC

b2) Extracto seco desengrasado

Formula Troy

Fórmula AOAC

B8) Ensayos biológicos

B9) Ensayos bioquímicos

B10) Adulteraciones y componentes anormales.

a) Peróxido de hidrogeno

b) Hipoclorito de sodio

c) Inhibidores

Introducción

Se presentan una serie de modificaciones que son causa de inestabilidad o bien de problemas en el

comportamiento de los productos durante el almacenamiento, procesamiento, comercialización o consumo. En este

trabajo práctico desarrollaremos el análisis cuantitativo de los componentes mayoritarios de la leche

determinaremos algunos parámetros físicos y realizaremos ensayos bioquímicos y biológicos a diferentes

muestras. Estos poseen importancia para 1) conocer las propiedades de la materia prima, 2) inferir la

calidad de la materia prima y 3) porque varios de ellos contribuyen en la fijación del precio al productor.

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A 1 Control de temperatura

Se debe controlar la temperatura con que llega a la fábrica la leche, o bien a la salida del tambo, ya que

dicho valor tendrá incidencia en la conservación. Se sabe que la leche recién ordeñada tiene una temperatura

aproximada de 37 º C. Normalmente posee una variada flora microbiana que a dicha temperatura encuentra

condiciones óptimas para su desarrollo, por lo tanto se debe enfriar inmediatamente después del ordeño. En las

primeras horas, la leche no presenta un aumento significativo de su flora microbiana, debido a la presencia de

inhibidores naturales de la leche que se agrupan bajo el nombre de lacteninas. Son heteroproteínas, que se

destruyen por el calor, por lo tanto su acción inhibidora puede prolongarse según la temperatura de conservación.

Esta acción es la que se denomina faz bactericida de la leche.

Existen tres tipos de lacteninas:

A. Lactenina L 1: Presente en concentraciones elevadas en el calostro. Es una sustancia inhibidora

probablemente específica para Streptococcus pyogenes. Se destruye por calentamiento a 70 º C durante 20

minutos.

B. Lactenina L 2: Es menos específica que la anterior. Se muestra activa sobre algunas especies de

Streptococcus, en especial la especie pyogenes y sobre los lactobacilos. Pocos estreptococos lácticos se muestran

sensibles, pero para aquellos que lo son, la inhibición es muy acusada. Los gérmenes no se desarrollan

prácticamente en leche. Se destruye a 72 º C en 30 minutos ó a 82 º C en 20 segundos.

C. Lactenina L 3: Es una aglutinina, anticuerpo susceptible de aglutinar a las bacterias sensibles de una

manera específica. Es activa sobre el Strepotococcus cremoris, cepa 760. Las aglutininas inmovilizan las

bacterias sensibles, formando agregados que son arrastrados a la superficie con los glóbulos grasos o bien se

depositan en el fondo. En la leche descremada, el resultado es una verdadera inhibición de estas bacterias por

separación física.

Tabla 1: Recuentos microbianos (Unidades Formadoreas de Colonias por mL) a diferentes temperaturas y

tiempos esquematizando la faz bactericida de la leche.

Tiempo (h)

Temperat

(ºC)

0 2 ½ 5 7 ½

10

4 ºC 2214 2154 2020 2074 2180

21 ºC 2214 2080 1874 4346 142.000

36 ºC 2214 2216 6214 530.000 1.148.000

De esto se desprende que: a 4 º C puede alcanzar al menos 10 horas

a 21 º C algo más de 5 horas

a 36 º C poco más de 2 ½ horas.

Es decir, la duración de la faz bactericida aumenta en razón inversa a la temperatura. La temperatura que

optimiza el efecto bactericida con mayor duración, es la comprendida entre 4 y 21 º C, es decir, se puede

mantener enfriándola con agua de pozo (15-18 ºC) entre 2 y 5 horas pero siempre dependiendo de la carga

microbiana inicial. Temperaturas superiores a 25 º C acortan la faz y favorecen el desarrollo del microbiano.

Influencia de la temperatura sobre la proliferación de las bacterias de la leche

La influencia de la temperatura es considerable y se ejerce de dos formas:

I) Efecto cuantitativo

Cualquiera sea la composición de la microflora original de la leche o de otros productos lácteos

líquidos, se observa una aceleración del desarrollo microbiano cuando se eleva la temperatura de conservación

hasta 35-40 ºC. Por el contrario, más allá de dicha temperatura, se observa un retraso. La experiencia clásica de

von Freudenreich pone de manifiesto este efecto cuantitativo.

Tabla 2: Microflora total (Unidades formadoras de colonias por mL) de una muestra de leche a diferentes

temperaturas:

Temperatura (ºC)

15 25 35

Inicial 9.000 9.000 9.000

a 3 h 10.000 18.000 30.000

a 6 h 25.000 172.000 12.000.000

a 9 h 45.000 1.000.000 35.000.000

a 24 h 5.000.000 57.000.000 800.000.000

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Cuanto más baja es la temperatura, más se retarda la proliferación microbiana, este conocimiento es de

importancia primordial para la producción de leche.

II) Efecto cualitativo

No son las mismas especies las que predominan a las diferentes temperaturas de conservación o de

tratamiento. La temperatura tiene un papel selectivo importante, que se aprovecha en la industria láctea.

1. A temperaturas de 20 a 40 º C, es en general la flora láctica ‘mesófila’ la que invade la leche y provoca

su coagulación por acidificación, sobre todo los Streptococcus. Las bacterias coliformes, que son muy tolerantes

a las variaciones de temperatura, también pueden intervenir.

2. A temperaturas relativamente bajas predomina una microflora psicrófila constituida por bacterias muy

diversas (Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter), entre los cuales se encuentran los gérmenes proteolíticos y

lipolíticos. La leche se altera entonces muy lentamente y se vuelve generalmente alcalina, por ese motivo la leche

cruda no puede conservarse largo tiempo en frigorífico o en recipientes refrigerados.

3. A temperaturas superiores a los 40 º C, se seleccionan las especies ‘termófilas’; las cuales pueden

subsistir pese a algunos tratamientos térmicos, por ejemplo, en las leches pasteurizadas se encuentran a veces

micrococos resistentes y en las inapropiadamente esterilizadas, las especies esporuladas (Bacillus y Clostridium).

A2 Prueba del alcohol

Por medio de esta prueba se realiza la aceptación de la leche al productor. El alcohol actúa deshidratando las

proteínas, por lo tanto van a tener menor estabilidad, por lo cual si la leche no se encuentra en buenas condiciones

las proteínas precipitan (“cortado”).

Coagulan con el etanol aquellas leches que poseen:

- un elevado contenido iónico (desequilibrio salino)

- composición anormal (por exceso de albúminas)

- alta acidez producida por una alta carga de microorganismos que aparecen por falta de higiene o mala

refrigeración

- composición diferencial por ser de final de lactación.

Esta prueba es indicativa de la estabilidad pero no es definitiva, por lo cual se recomienda hacer además una

comprobación de estabilidad térmica.

Reactivo: Etanol 70 % v /v

Material: Tubos de ensayo

Pistola alcoholera

Técnica: Se mezclan 2 ml de leche con 2 ml de etanol 70 % (v/v) y se observa

Floculación neta...............resultado positivo (se rechaza)

Ausencia de floculación....resultado negativo (se acepta)

B1 Densidad

Es una propiedad física de la materia, que se define como la relación, a una temperatura dada, de la masa

de una sustancia con su volumen. La densidad que medimos en la leche es un valor relativo, es decir el cociente

que resulta de dividir la masa de un volumen de leche por la masa de un volumen de agua a una temperatura dada.

Esta propiedad depende del total de los componentes, considerando para una leche normal a 15 ºC un valor entre

1,028 y 1,034 (Código Alimentario Argentino, CAA), es decir, un litro de leche pesa entre 1.028 y 1.034 gramos.

Las variaciones por causas normales pueden ser debidas a:

1) Que los distintos componentes de la leche no se hallan siempre en la misma proporción y al poseer cada

uno de ellos diferentes densidades, podrán aumentar o disminuir la densidad.

Las densidades son:

Materia grasa 0,930

Proteínas 1,346

Caseína 1,310

Lactosa 1,545

Sólidos no grasos 1,616

Sales minerales 4,120

Como el componente que más varia es la materia grasa, es el que mayor influencia tiene, a mayor cantidad

de materia grasa, menor densidad y viceversa. Por ejemplo: una leche descremada tiene una densidad de 1,036.

2) Al tiempo transcurrido desde el ordeño. La leche recién ordeñada tiene menor densidad que después de

transcurrida 5 o 6 horas, se conoce como fenómeno “Recknagel”. Este fenómeno encuentra su explicación en tres

hechos: a) enseguida del ordeño los glóbulos grasos se encuentran en sobre fusión, aumentando su densidad a

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medida que solidifican; b) hidratación de las proteínas después del ordeño; c) la pérdida de CO2 a medida que

transcurre el tiempo y a la mayor solubilidad en frío del gas que queda.

3) La lectura debe realizarse a 15 ºC. Cuando se realizan mediciones a temperaturas mayores, la densidad

será menor y a menores temperaturas, la misma será mayor; esto se debe a la variación del volumen de la muestra

en función de la temperatura.

4) Temperatura a que fue sometida la leche. Influye por el diferente estado físico de la materia grasa.

5) Por las diferentes partes del ordeño. Las primeras, al ser pobres en materia grasa, tendrán mayor

densidad que las últimas porciones.

6) Tratamientos físicos sufridos, por ejemplo en el centrifugado se incorpora aire en la muestra variando

su valor inicial.

7) Uso de conservadores. Los mismos, hacen variar los valores de densidad.

8) Adulteraciones, se hacen observando cambios en las mediciones de leche que fueron aguadas o

neutralizadas.

Medida de la densidad

A.- Material:

Probeta de 250 ml.

Termolactodensímetro de Quevenne.

B.- Técnica:

Agitar la leche, verter una muestra en la probeta procurando que no se forme espuma.

Introducir el densímetro imprimirle un ligero movimiento de rotación con los dedos pulgar e índice. Esperar que se

estabilice y efectuar las lecturas de temperatura y densidad en las respectivas escalas del densímetro.

Para leer en la escala de densidad se tendrá en cuenta la parte superior del menisco.

C.- Interpretación:

Se debe trabajar a 15 ºC, si ello no ocurriera se debe corregir la lectura de la densidad. Si se carece de tablas,

debemos realizar el siguiente cálculo: si la temperatura es mayor a 15 ºC adicionar 0,0002 por cada grado de

exceso entre 16 y 17 ºC y 0,0003 entre 18 y 28 º C. Si la temperatura es menor a 15 º C se resta 0,0002 entre 7 y

14 ºC. Por. ej.: lectura 1,0305 a 19 º C, queda la lectura corregida igual a 1,0317 a 15 ºC. Los resultados se

expresan en densidad relativa o su equivalente en grados Quevenne por ej. 1,0295 corresponde a 29,5ºQ.

Figura 1: Termo-lacto- densímetro de Quévenne

B2 pH

La leche de vaca tiene una reacción débilmente ácida, con un pH comprendido entre 6,6 y 6,8, como

consecuencia de la presencia de caseína y de los aniones fosfato y citrato principalmente. El pH no es un valor

constante, si no que puede variar. Las leches con calostro suele ser más bajo mientras que en el caso de leches

provenientes de animales mastíticos puede incrementarse. Con todo, la amplitud de las variaciones es pequeña

dentro de una misma especie. En lo que se refiere a leche de vaca, deben considerarse como anormales los valores

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de pH inferiores a 6,5 o superiores a 6,9. El control de pH es fundamental pues de él se desprenden

propiedades importantes como la estabilidad de la caseína (ver prueba del alcohol A2).

Medición del pH

Puede realizarse de dos maneras:

1.-La medición potenciométrica con el pH-metro es la única precisa, el sistema de electrodos generalmente

utilizado está formado por un electrodo de referencia, de calomelanos con cloruro de potasio saturado, y un

electrodo de vidrio. La regulación de estos aparatos se hace con soluciones tampón de pH conocido, para la

leche y sus derivados. Se emplea el tampón de fosfato (KH2PO4/K2HPO4) 0,066 M de pH 7,0 a 25 º C, para la

zona neutra y el tampón de ftalato ácido de potasio 0,050 M de pH 4 a 25 ºC para la zona ácida.

2.- Se realiza con papel indicador, que vira en la zona conveniente. La técnica es muy simple, se coloca una gota

de leche sobre el papel y se compara la tonalidad adquirida con la escala de colores correspondiente a distintos

valores de pH, comprendidos entre 6,4 y 8,0.

B3 Acidez

La acidez total de la leche es la suma de la acidez “natural” y la acidez “desarrollada”. La acidez

“natural” corresponde a los diversos componentes: 1) La acidez debida a la caseína, 2) a sales hidrolizables y

trazas de ácidos orgánicos y 3) a reacciones secundarias debidas a los fosfatos. La acidez “desarrollada” se debe

al ácido láctico y a otros ácidos procedentes de la degradación microbiana de la lactosa en leches en vías de

alteración. Por otra parte, los valores de acidez comprendidos entre 13 y 22 ºD no dan indicaciones precisas sobre

el estado de la leche y resulta prácticamente imposible valorar la acidez desarrollada que es la única que podría

dar un indicio válido de la calidad.

La acidez puede variar por múltiples causas como por ejemplo:

a) Proliferación de bacterias lácticas: ya que fermentan la lactosa produciendo ácido láctico.

b) Deficiente refrigeración.

c) Estado de lactancia del animal.

d) Salud del animal: por ejemplo mastitis.

e) Raza del ganado.

f) Adulteraciones con aguado y neutralizantes, etc.

g) Falta de higiene.

h) Temperatura

La leche posee una acidez normal entre 14 y 18 ºD. Esta acidez corresponde a la acidez natural de la leche

dada por los propios componentes como por ejemplo los fosfatos ácidos, citratos, fosfo-caseinatos, dióxido de

carbono, etc. Todos aquellos valores que se alejen en más o en menos de estos valores normales, nos están

indicando alteraciones sufridas por componentes de la leche.

-Aquellas leches que tienen menos de 14 ºD son las llamadas “leches alcalinas”. Pueden deberse a causas

patológicas (ubres enfermas) o a causas fisiológicas. Estas leches no se aceptan en fábrica.

- Aquellas leches que tienen entre 14-18 ºD, son las llamadas “leches normales”, utilizadas para consumo

directo o cualquier tipo de elaboración.

- Aquellas leches que tienen hasta 20 ºD de acidez se destinan a las elaboraciones.

- Aquellas leches que tienen más de 20 ºD de acidez se aceptarán o no de acuerdo al criterio de cada fábrica.

Método Dornic

Se determinan por titulación directa con NaOH N/9 o 0,1111 N. Lo que en realidad medimos al hacer

una determinación rutinaria de acidez, es la cantidad de álcali necesaria para alcanzar el pH 8,2, que es el punto

donde vira la fenolftaleína, de incolora a rosa. Los grados Dornic expresan el número de décimas de ml de

NaOH 0,1111 N necesarios para neutralizar 10,00 ml de leche. Este método es el más difundido, pues la

solución alcalina para la titulación se prepara de manera que 1 ºD es equivalente al centigramo de ácido láctico en

100 ml de leche o sea 0,01%. Esto está fundado en el peso molecular del ácido láctico (90,048 g) y Dornic

propuso que la titulación se haga con una solución alcalina preparada con 4,4453 g de NaOH. Es decir:

Ácido láctico......... ........ 1N...........90 g/l → N/9...........10 g/l

NaOH............................ 1N...........40 g/l → N/9....4,4453 g /l

Para la neutralización:

1 litro de NaOH 0,1111 N neutraliza una solución de ácido láctico que contienen 10 g de ácido láctico

1 ml de NaOH 0,1111 N ´́ ´́ ´́ ´́ 0,010 g de ácido láctico

0,1 ml de NaOH 0,1111 N ´´ ´´ ´´ ´´ 0,001 g de ácido láctico

De acuerdo a la muestra empleada queda expresado:

0,001 g para 10,00 ml de leche.

0,01 g para 100,00 ml de leche.

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Concluimos:

1 ºD = 0,10 ml de NaOH 0,1111 N = 0,01% de ácido láctico.

Determinación

A. Material

-Pipetas de 1 y 10,00 ml

-Bureta y erlenmeyer.

B. Reactivos

-Solución alcohólica de fenolftaleína al 1%.

-NaOH N/9 ó 0,1111 N.

Preparación de reactivos

Solución de fenolftaleína: disolver 5,00 g de fenolftaleína en 375,00 ml de etanol de 95 º y diluir con agua

destilada hasta 500,00 ml. Neutralizar con NaOH 0,1 N hasta color incipiente.

Solución de NaOH 0,1111 N: Se prepara tomando 111,10 ml de sol. 1N de NaOH y se diluye con agua

destilada hasta 1000,00 ml.

C. Técnica

Colocar 10,00 ml de leche en un erlenmeyer, agregar 2 o 3 gotas de solución de fenolftaleína al

1% y titular con NaOH 0,1111 N hasta aparición de color rosa pálido, leer los ml gastados en la bureta. Para

facilitar la lectura puede diluirse la leche con agua destilada.

D. Interpretación

Si la lectura fue 1,90 ml de NaOH queda expresado: 19 ºD o 0,019 g de ácido láctico en 10,00 ml

de leche, es decir 0,19 % m/v de ácido láctico.

Método Soxhlet-Henkel

Este método no toma al ácido láctico como referencia. El grado Soxhlet-Henkel (º SH) equivale a 1 ml de

NaOH N/4 para valorar 100 ml de leche (la valoración se hace habitualmente sobre 50 ml).

Interpretación

1 ºSH = 0,44 ºD ºSH = 4 x ºD

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1 ºD= 2,25 ºSH ºD = 9 x ºSH

4

1 ºSH = 0,025% de ácido láctico

Por ejemplo: la leche fresca tiene 16 a 18 ºD o 7 a 8 ºSH

B4 Materia grasa

Se la considera como uno de los componentes de mayor importancia, ya que constituye, por un lado, una

de las bases de pago al productor y por otra parte es la materia prima para elaborar distintos subproductos. Si

analizamos someramente su composición química encontramos tres clases de sustancias:

a) La materia grasa propiamente dicha, constituida por triglicéridos (98,0% del total de la grasa)

b) Los fosfolípidos: lecitina (0,5 a 1,0%).

c) Lípidos insaponificables: colesterol, carotenoides, vitaminas liposolubles (alrededor del 1,0%).

Estos dos últimos grupos, aunque se encuentran en pequeñas cantidades, son de suma importancia en el

comportamiento de la grasa de la leche. Los lípidos se encuentran dispersos en la leche en forma de pequeños

glóbulos, cuyo diámetro oscila entre 0,1 y 14 micrones, estando el 80% de los mismos entre 2 y 5 micrones. Estos

glóbulos tienen una estructura peculiar dada por una película o membrana protectora de composición compleja, la

cual está formada por una asociación de triglicéridos, fosfolípidos (lecitina principalmente), proteínas

estructurales y enzimas. Desde el punto de vista biológico, es importante la cantidad de vitamina A presente. La

materia grasa es el componente de la leche que varía en mayor proporción debido a la influencia de distintos

factores entre los que podemos mencionar:

a) Raza de ganado (por ejemplo Holando Argentino 3,3–3,7%, Jersey 4,5–5,0%, etc.)

b) Factores hereditarios.

c) Estado sanitario (por ejemplo en caso de mastitis hay una disminución).

d) Edad del animal: hay una declinación del porcentaje de grasa con la edad.

e) Tipo de alimentación.

f) Período estacional.

g) Período de lactancia: es menor al principio, alcanzando un máximo al final de ella.

h) Número de ordeños: mayor número, mayor cantidad y mejor calidad.

i) Momento de ordeño: el mayor porcentaje de materia grasa se obtiene por la tarde.

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j) Partes del ordeño: las primeras porciones pueden obtener 0,5 % y las últimas 5,5 %.

Para la determinación existen distintos métodos que se pueden agrupar en:

Métodos volumétricos

-Gerber.

-Babcock.

Métodos ponderales

-Rose-Gottlieb

-Soxhlet

-Ratzlaff

Métodos basados en las propiedades de los glóbulos grasos

-Turbidimetría.

-Espectroscopía de infrarrojo (NIR)

a) Método de Gerber

Este método consiste en tratar la muestra de leche con ácido sulfúrico para destruir la película protectora

del glóbulo graso y lograr la hidrólisis de la caseína. Además, empleamos el alcohol amílico para disminuir la

tensión de la interface grasa-agua, facilitando el ascenso de los glóbulos grasos pequeños por centrifugación.

Gerber comprobó que la columna de grasa separada, no era anhidra y que la hidratación estaba regulada por la

densidad del ácido sulfúrico empleado.

A.) Material

Butirómetro calibrado para leche.

Pipetas de 11, 10 y 1 ml aforadas.

Baño a 65 º C ± 2 º C.

Centrífuga 1200 r.p.m.

B) Reactivos

Ácido sulfúrico densidad 1,820 - 1,825.

Alcohol amílico densidad 0,820 - 0,825, libre de furfural.

Dichos reactivos pueden venir formulados comercialmente, si eso no ocurriera, se deben diluir de su

estado puro con ayuda de agua destilada y densímetros específicos, por ejemplo el ácido sulfúrico puro tiene una

densidad de 1,840, para lograr una densidad de 1,820 - 1,825 se le incorpora agua destilada.

Técnica:

Colocar el butirómetro invertido sobre una gradilla, agregándole 10,00 ml de ácido sulfúrico y 11,00 ml

de leche lentamente por las paredes, para evitar que se carbonicen las primeras porciones de leche que entran en

contacto con el ácido. Añadir luego 1,00 ml de alcohol amílico. Si fuera necesario se incorpora agua destilada

tibia para facilitar la lectura en la escala. Se tapa el butirómetro, se toma con un paño debido a que se produce una

reacción exotérmica y asegurando el tapón con el dedo pulgar para que no se proyecte, se invierte hasta total

disolución del coágulo de caseína. Se lleva a baño maría a 65 ºC durante 5 minutos, después 5 minutos a

centrífuga. Cuando se trate de leches homogeneizadas, se repite el calentamiento, y la centrifugación dos veces

más. Transcurrido el procedimiento, se efectúa la lectura de la columna transparente ajustando o aflojando el

tapón. La escala del butirómetro se encuentra dividida en siete partes, las que a su vez se subdividen en diez partes

cada una. La cantidad de materia grasa en la muestra está determinada por la lectura directa en el butirómetro y

expresada en porcentaje (g/100 ml)

b) Método de Babcock

El fundamento de su determinación es igual al anterior, varía únicamente el butirómetro empleado y las

cantidades de reactivo utilizadas.

Técnica:

En un butirómetro de Babcock con 45,00 ml de capacidad se colocan 17,50 ml de leche y 17,50 ml de

ácido sulfúrico, con las mismas precauciones que en la técnica anterior. Se agita hasta total disolución del coágulo

formado, se centrifuga 4 minutos y se agrega agua destilada hirviendo hasta completar el nivel, se centrífuga

nuevamente y se lleva a baño de María 65 ºC durante 5 minutos.

Se mide en la escala la columna transparente y se expresa el resultado como porcentaje de materia grasa.

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c) Método de Rose–Gottlieb (método de referencia FIL)

Es el método oficial adoptado por IRAM para casos de discrepancia o para mayor exactitud.

En este procedimiento se descompone la caseína por medio de los reactivos adecuados, como el hidróxido

de amonio y el alcohol etílico y se extrae la materia grasa con éter. El solvente se evapora y el residuo graso es

pesado.

Material.

Ampollas de decantación.

Pipetas de 2,00 ml.

Pipetas de 10,00 ml y 25,00 ml.

Cápsulas.

Reactivos.

Solución de hidróxido de amonio (densidad 0,880).

Etanol de 95 a 96 % v /v.

Éter etílico (densidad 0,720), libre de peróxido.

Éter de petróleo con un punto de ebullición comprendido entre 40 y 60 º C.

Técnica:

Se colocan 10,00 gramos de la muestra, pesados con la precisión del miligramo, en una ampolla de

decantación y se añaden 1,25 ml de solución de NH4OH y se mezcla (si la leche es ácida se deben agregar 2,00 ml

de solución NH4OH). Se añaden 10,00 ml de etanol, se mezcla, se añaden 25,00 ml de éter etílico y se agita

vigorosamente durante 30 segundos. Se deja reposar aproximadamente durante 30 minutos hasta que la capa

etérea quede clara y completamente separada de la capa acuosa. Se trasvasa a otra ampolla de decantación la fase

acuosa y la capa etérea a una cápsula. Se extrae nuevamente la fase acuosa contenida en la segunda ampolla de

decantación con 15 ml de éter de petróleo, como se indica en los dos pasos anteriores y se trasvasa la capa acuosa

a la primera ampolla de decantación y la capa etérea a la cápsula. Se vuelve a extraer la capa acuosa con 15,00 ml

de éter de petróleo como se indicó anteriormente. Se descarta la capa acuosa y se trasvasa la capa etérea a la

cápsula. En caso de presentarse dudas si la extracción ha sido completa, se una extracción más. Se evaporan con

precaución los solventes de la cápsula y se seca el residuo graso en estufa a una temperatura comprendida entre

los 98 y 100 ºC, hasta peso constante, tomando las precauciones habituales. Para eliminar toda traza de solvente,

se deja enfriar en un desecador y se pesa con la precisión del miligramo, obteniendo así el peso G1. Se extrae

completamente la materia grasa de la cápsula, por lavados sucesivos con éter de petróleo, dejando sedimentar

antes de cada decantación. Se seca la cápsula en una estufa, a una temperatura comprendida entre los 98 y 100 º

C, se deja enfriar y se pesa con precisión del mg. Obteniéndose el peso G2. Se hace un nuevo ensayo en blanco,

empleando las cantidades especificadas de reactivos y agua destilada en lugar de leche.

Cálculo e interpretación.

El contenido de materia grasa se determina por medio de la siguiente ecuación.

G1 - G2 - GB

MR = ------------------- x 100

G

Siendo MR = contenido de materia grasa por método Rose - Gottlieb en %

G1 = peso de materia grasa y la cápsula.

B. Butirómetro BabcockA. Butirómetro Gerber

Figura 2:

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G2 = peso de la cápsula en gramos.

GB= peso de residuos obtenidos en el ensayo en blanco, en g.

G = peso de la muestra.

d) Método basado en la turbidimetría

Este método está basado en la propiedad que tienen los glóbulos grasos de dispersar la radiación. Cuando

un haz de luz atraviesa una capa de leche, se produce una pérdida de energía por dispersión, que es la causa de

turbidez. Está pérdida depende de la cantidad de materia grasa y del tamaño de los glóbulos. En este equipo se

mide la cantidad de luz que pasa por una célula fotoeléctrica y se registra en un galvanómetro, para dar el

porcentaje de materia grasa directamente. La leche es homogeneizada para producir uniformidad en el tamaño de

los glóbulos grasos y luego tratada con una solución de EDTA para disolver las micelas de caseína, pasando luego

por la célula fotoeléctrica donde se mide la dispersión de luz. Estos equipos deben calibrarse con muestras

analizadas por el método de Gerber y Rose-Gottlieb.

Recomendaciones:

No se debe trabajar con muestras ácidas y no debe quedar residuo de muestra en el homogeneizador.

Hacer circular agua una vez finalizadas las mediciones y verificar el buen funcionamiento del equipo cada 2000

muestras. Cada muestra que ingresa al equipo debe agitarse bien para asegurar una distribución uniforme de

materia grasa y precalentarse a 40 ºC, para evitar la separación de la materia grasa.

B5 Proteínas

a) Método de Kjeldahl

Sirve de método de referencia, con el que se comparan los métodos rápidos. En este método la materia

orgánica se destruye con ácido sulfúrico y el nitrógeno pasa a la forma de sulfato de amonio. El amoníaco se

desprende por alcalinización del medio con hidróxido de sodio, se destila, se recoge en una solución de H3BO3 y se

valora con HCl.

b) Otros métodos instrumentales

Los equipos últimamente desarrollados son analizadores infrarrojos que efectúan determinaciones de

proteína, grasa, lactosa y sólidos totales en forma simultánea. Estos equipos trabajan con longitudes de onda de la

zona infrarroja del espectro, que son seleccionadas por filtros ópticos y, en los más recientemente desarrollados, se

utilizan interferómetros con láser para generar un espectro completo de longitudes de onda. Estos equipos pueden

calibrarse adecuadamente y diversificar su uso para la determinación de otros parámetros físico–químicos, tanto

de leche como de productos lácteos.

B6 Lactosa

La determinación de lactosa en leche por el método de referencia de la Federación Internacional de

Lechería se expresa como el contenido de lactosa monohidrato en por ciento en peso y es aplicable a leche normal

fresca. El principio del método de la Cloramina T está determinado indirectamente, previa desproteinización de la

leche, por evaluación volumétrica de la cantidad de halógeno reducida en el curso de la reducción entre la lactosa y

el complejo yoduro de potasio-cloramina T.

B7 Extracto seco total

El extracto seco total representa el peso de materias sólidas, con exclusión del agua. La leche de vaca

presenta un extracto seco medio de 12,5 a 13,0 g / 100 mL y un extracto seco no graso 8,2 g / 100g. Con el

conocimiento del extracto seco podemos calcular el rendimiento probable de queso a obtener en una elaboración.

Para su determinación, lo más corriente es obtenerlo por pesadas sucesivas, pero como es un método delicado y

extenso se simplifica aplicando fórmulas con valores conocidos de densidad y materia grasa, que se obtienen más

rápidamente. Junto al extracto seco total se puede obtener el extracto seco desengrasado, este valor es más regular

que el del extracto seco total porque no consideramos el componente más variable que tiene la leche que es la

materia grasa.

Técnica: Se colocan 10,00 mL de leche en una cápsula y se lleva a baño de María hasta peso constante.

a) Balanza Ultra X

Este equipo determina el contenido de humedad o de sólidos totales en granos triturados, forrajes,

productos pulverulentos, sustancias cremosas, líquidas, etc. Es un calefactor eléctrico que trasmite radiación IR

(transmisión de calor producida por radiación). La fuente de energía es una resistencia eléctrica, obteniéndose

valores entre 500 a 2500 ºC; si trabajamos a 2500 ºC la resistencia del foco eléctrico es de tungsteno, en cambio,

si usamos temperatura de 500 ºC, es una aleación donde la mayor proporción corresponde a platino. La intensidad

de radiación puede regularse en forma continua entre 0 y 220 voltios mediante el regulador. Estos límites de

10

tensión corresponden a límites de temperatura, entre 0 y 170 ºC. Por ello existen tablas que relacionan ambos

parámetros:

220 V 160 - 170 º C 200 V 140 - 150 º C

180 V 130 - 140 º C 160 V 120 - 130 º C

150 V 110 - 120 º C 120 V 85 - 95 º C

100 V 70 - 80 º C

El secador por radiación infrarroja trasmite automáticamente la pérdida de peso, debida a la pérdida de

agua, a una balanza incorporada. Un temporizador permite parar automáticamente el ciclo de secado que es fijado

de antemano de acuerdo a la sustancia tratada. Dependiendo de la composición y consistencia de la sustancia, el

tiempo de secado es de 3 a 20 min.

b) Por fórmulas y tablas:

b1) Extracto seco total

Conociendo los valores de densidad y materia grasa, las fórmulas más conocidas son:

Fleischmann:

EST % = 1,2 x % materia grasa + 2,665 x 100 ( - 1)

: densidad relativa

* Asociación Oficial de Análisis Químicos (AOAC)

EST = 0,25 L + 1,2 F

F = Materia grasa determinada por el método Babcok.

L = Densidad en grados Quevenne.

b2) Extracto seco desengrasado:

* Troy:

ESD = Densidad + Materia Grasa

4

Densidad = º Quevenne

* AOAC:

SNG = 0,25 L + 0,2 F

B9 Ensayos biológicos en leche

Dentro de la composición de la leche de vaca encontramos los componentes biológicos que se encuentran

en suspensión. Estos componentes se clasifican en:

Normales

1. Componentes celulares

Células epiteliales

Leucocitos

2. Componentes microbianos (Microorganismos banales)

Anormales

Microorganismos patógenos

1. Componentes celulares

Básicamente existen en la leche dos tipos de células: las epiteliales y los leucocitos. Las células epiteliales

derivan de los tejidos mamarios (alvéolos del pezón, etc), como resultado del recambio fisiológico durante la

secreción de leche o como resultado de injuria a los tejidos (infecciones o no). Los leucocitos (y en especial los

polimorfo-nucleares), se derivan de la sangre e infiltran los tejidos mamarios y la leche principalmente en

respuesta a la injuria tisular, sobre todo por causas infecciosas. Los leucocitos más comunes poseen núcleo

polimorfo provisto de lobulaciones. El citoplasma ocupa espacio reducido, menos visible y se colorea

someramente. El tamaño de estos leucocitos oscila entre 9 y 24 micrones (en promedio 14). Las granulaciones del

citoplasma muestran distinta afinidad según el tipo de colorante y ello permite clasificarlos en:

eosinófilos o acidófilos......................... .col. ácido (eosina)

neutrófilos.............................................col. neutro

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basófilos................................................col. básicos

Los neutrófilos son los más numerosos y son denominados leucocitos polimorfonucleares.

A través del tiempo se han desarrollado distintos métodos para estimar la concentración de células de la

leche, ya que es una de las técnicas más usadas para el diagnóstico de mastitis subclínica en rodeos, vacas y

cuartos individuales. Hay que considerar que el tipo y número de células somáticas en leche varía bajo condiciones

fisiológicas y patológicas y que hasta cierto nivel son componentes normales del producto. La leche de cuartos

individuales de animales sanos contiene bajo nivel de células somáticas, de 100.000 a 300.000 células por ml,

considerando linfocitos, neutrófilos y células epiteliales. Las bacterias responsables de la mastitis penetran por el

canal del pezón y van ascendiendo por el interior de la ubre hasta colonizar los alvéolos (las unidades productoras

de leche). Cuando las células epiteliales alveolares son expuestas a las toxinas bacterianas, rápidamente sufren un

proceso de degeneración, hinchándose hasta superar varias veces su tamaño normal y terminan desintegrándose

por un proceso conocido como necrosis. Las bacterias viven en la cisterna y desde allí liberan toxinas. El

contenido de leucocitos se incrementa como una respuesta defensiva. La última barrera que deben cruzar es el

estrato de células epiteliales alveolares y para hacerlo estas células deben morir y desintegrarse. Es por eso que el

pasaje de leucocitos desde la sangre hasta la leche es una medida indirecta del daño al potencial productivo de la

vaca. Pero esta no es la única consideración económica de un alto contenido celular, a medida que aumenta el

contenido de células somáticas en la leche, se evidencia un cambio notorio en la composición de ésta, por el pasaje

de elementos de la sangre hacia la leche. Así, se produce una disminución de los componentes deseables de la leche

(lactosa, proteínas totales, caseína). Esto tiene efectos negativos en la elaboración de productos lácteos, dando

lugar a fenómenos tales como rancidez, menor rendimiento en la producción de quesos y disminución de la

estabilidad al calor de la leche fluida, entre otros.

Entre los métodos para estimar la concentración de células de la leche existen:

a) Métodos directos

1. Exámen microscópico directo. Técnica de Breed.

2. Conteo a través de equipos electrónicos (Coulter Counter-Fossomatic).

b) Métodos indirectos:

1. Prueba de Whiteside.

2. Prueba de Schlam o CMT (California Mastitis Test).

3. Conductividad eléctrica

a) Métodos directos

a.1. Método de Breed

Instrumental:

Microscopio con factor correspondiente (FM)

Pipetas de 0,01 ml calibradas

Placas de aberturas cuadradas de 1 cm

Ansa metálica, cuya aguja esté doblada formando un ángulo de 90 grados, con su lado terminal de l cm

Portaobjetos, con tamaño adecuado a la placa

Reactivos

Para realizar esta determinación es necesaria una solución desengrasante y colorante con la composición

siguiente:

Desengrasante:

Xilol

Etanol, 96 grados

Colorante:

Solución madre:

Azul de metileno, 2 g

Etanol 96 grados, 100 ml

Procedimiento:

1-La determinación se efectúa por duplicado como mínimo

2-Se toma la muestra con una pipeta de 0,01 ml, se seca la pipeta exteriormente y se enrasa; se vierte la muestra

sobre el área de 1 cm2, delimitado en el portaobjetos por la apertura de la placa, y se distribuye uniformemente con

la ayuda del ansa.

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3-Se somete la preparación anterior a secado en estufa a 45 ºC durante 10 minutos.

4-Se desengrasa en primer lugar 3 minutos con xilol y luego 1 minuto con etanol de 96 °.

5-Se deja secar a temperatura ambiente.

6-Se colorea dejando actuar el colorante durante 2 minutos.

7-Se enjuaga con agua destilada.

8-Se deja secar a temperatura ambiente.

Recuento:

1-Se observa el preparado al microscopio con objetivo de inmersión previa colocación de aceite de cedro.

2-La observación se realiza por campos.

Cálculo:

El número de células somáticas por mililitro de leche se calcula mediante la siguiente fórmula:

Número promedio de células somáticas por campo x FM = recuento de células somáticas por mililitro

a.2. Conteo a través de equipos electrónicos

Los procedimientos de conteo a través de equipos electrónicos son muy exactos y precisos, automatizados

y de gran capacidad operativa, pero costoso y de cuidadoso mantenimiento. Estas técnicas cuentan partículas a

medida que se desplazan en un campo eléctrico en el cual las células son tratadas con una sustancia fluorescente

que permite la detección.

b) Métodos indirectos

Entre los métodos indirectos los más usados figuran los que estiman la concentración de leucocitos por

formación de gel al agregar sustancias detergentes a la leche, es decir, los llamados métodos viscosimétricos. Se

destacan el CMT (California Mastitis Test) y WMT (Wisconsin Mastitis Test). Sin embargo, la repetitividad de

estos métodos no es la misma para rangos de células distintos, lo que afecta la precisión. Además, la formación de

gel se altera luego de 18 a 24 h de producida la leche, lo que conspira en algunas ocasiones con la practicidad del

método.

b. 1. Prueba de Whiteside

Consiste en tratar un volumen de leche con NaOH 1N y observar la aparición de un floculado que se

produce en el caso de leches patológicas.

Material

Cajas de Petri

Pipetas de1 y 5 ml

Varillas de vidrio

Reactivos

NaOH 1N

Técnica

Sobre una placa de vidrio con fondo negro se depositan 3 ml de la leche problema y sobre ella 1 ml de

NaOH 1 N, mezclando ambas sustancias con una varilla de vidrio y agitando de manera continua durante 30 s.

Observar sobre fondo negro y de acuerdo a la cantidad de flóculos formados se considera positiva la prueba con 1,

2, 3 o 4 signos positivos. Esta técnica es un sencillo método de rutina para el diagnóstico de leches patológicas.

b.2. Prueba CMT

Utiliza para la precipitación, detergentes aniónicos. Entre los distintos medios de posible utilización se ha

mostrado como óptima la solución de dodecil sulfonato sódico (SDS). El SDS desnaturaliza las proteínas de las

membranas celulares. Como consecuencia, el DNA es liberado y forma un gel con el reactivo. A más DNA en la

muestra, más viscosidad del gel.

Material

-Raqueta CMT

Reactivos

-CMT: solución indicadora

Técnica

Se depositan en las paletas cantidades iguales de leche y reactivo, mezclando con cuidado. Si se producen

alteraciones manifiestas con un aspecto viscoso y gelatinoso se considera que la reacción es positiva. Cuanto más

consistente y viscoso es el gel, mayor probabilidad de resultado positivo. De acuerdo con la intensidad, se

distinguen los grados comprendidos entre:

Negativo............ permanece líquido.......................................100.000 cél /ml

Sospechoso........ finos grumos que pueden disolverse...........300.000 cél / ml

13

positivo débil......gruesos grumos ..........................................900.000 cél / ml

positivo...............gel............................................................2.700.000 cél / ml

positivo fuerte....gel espeso que se centraliza .....................8.100.000 cél / ml

2. Componentes microbianos

a) Métodos directos

1. Examen directo al microscópico. Técnica de Breed.

2. Conteo a través de equipos electrónicos.

3. Recuento mediante cultivo

b) Métodos indirectos

1. Lacto-fermentación

a) Métodos directos

a.1. Técnica de Breed

Para determinar el número de gérmenes totales por ml de leche. Haciendo la salvedad que con esta técnica

los recuentos son superiores que los realizados mediante cultivos debido a que se cuentan gérmenes muertos.

Técnica:

Ídem al recuento de celulares.

a.2.Equipos electrónicos

Es una técnica "fluoro-opto-electrónico", basada en el mismo principio que el recuento de células somáticas. La

técnica implica estimar el número de partículas (células somáticas o microorganismos según el caso) en la medida

que estos atraviesan un canal muy pequeño. La detección ocurre, ya sea porque las partículas modifican la

resistencia al flujo de corriente en dicho canal, o bien a través de medidas de dispersión de radiación o

fluorescencia.

a.3. Recuento mediante cultivo

Puede ser:

a) Microflora total (medios no selectivos)

b) Grupos microbianos (medios o condiciones de incubación selectivas)

b.1). Bacterias coliformes

b.2). Gérmenes termorresistentes

b.3). Flora psicrótrofa

b.4). Bacterias esporuladas anaerobias (productoras de gas)

b.5) Flora penicilino - resistente

b) Métodos indirectos

b.1. Lacto-fermentación

La prueba de la lacto-fermentación tiene importancia para la quesería, porque proporciona datos

fehacientes sobre la calidad o tipo de infección predominante en la leche, revelando el grado de contaminación o el

tipo de conservación de la misma. Se considerará la producción gaseosa, escasa coagulación, descomposición

pútrida y demás alteraciones.

Técnica

Colocar leche en un tubo de ensayo alto, esterilizado. Se incuba 24 h a 37 0C. Resultado:

*La leche fresca: no ha coagulado transcurridas 12 h.

*La leche de buena calidad: al cabo de 24 h debe poseer olor y sabor ácido y haber coagulado mostrando un

coágulo homogéneo, blanco y firme.

*Leche contaminada:

-Si el coágulo contiene numerosas burbujas y surcos gaseosos, es señal de gérmenes como Escherichia coli,

Aerobacter aerogenes, etc.

-Si el coágulo es grumoso, muestra la caseína en forma de grumos finos, esto es producido probablemente por

microorganismos proteolíticos.

-Si la leche emite olor pútrido y todavía está líquida, o el coágulo se está licuando, revela un alto grado de

contaminación.

B10) Ensayos bioquímicos en leche

Objetivos: a) Detectar la presencia de microorganismos en la leche

b) Valorar, a través de las enzimas, la calidad del producto

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Estos métodos están basados en la detección del número de microorganismos que pueden estar presentes

en la leche mediante la valoración de ciertas sustancias, como por ejemplo, las enzimas. Las enzimas se

encuentran presentes en la leche en cantidades muy pequeñas, y por lo tanto su papel energético en la alimentación

es nulo, pero dan lugar a ciertas reacciones químicas de carácter catalítico. El origen de la leche explica la

presencia de estas enzimas, existentes en numerosas células y especialmente en los leucocitos, que migran a través

del tejido mamario, por lo tanto se las puede considerar como producto de excreción. A veces es difícil determinar

su origen, ya que las bacterias que frecuentemente se encuentran en la leche producen enzimas del mismo

tipo, el desarrollo de estas bacterias aumenta por consiguiente la cantidad de enzimas presentes o aportan otras

nuevas. La cantidad de estas enzimas es escasa, pero su actividad como "catalizadores bioquímicos" es tal, que

provocan importantes modificaciones a muy baja concentración. Esta actividad depende del pH, y de la

temperatura; el incremento de esta última provoca su destrucción, que en general es rápida por encima de los 70

°C.

Implicancias tecnológicas de estas enzimas:

1) lipasas y proteasas: degradación de materia grasa (favorece indirectamente la lipooxidación) e hidrólisis de la

caseína, respectivamente.

2) reductasa normal, peroxidasa, fosfatasa: su sensibilidad al calor permite el control del calentamiento de la

leche en la zona de la temperatura de pasteurización.

3) catalasa y reductasa microbiana: la cantidad de algunas de estas enzimas depende del número de leucocitos o

bacterias que se encuentran en la leche, obteniéndose de esta manera una estimación sobre la calidad higiénica de

la leche.

4) lactoperoxidasa, lisozima: tienen actividad bactericida y constituyen por ello una protección, desde luego

limitada, de la leche

Enzimas presentes en la leche

1) Hidrolasas:

. Lipasa

. Fosfatasa alcalina

. Lisozima

. Ribonucleasa

2) Oxidoreductasas:

. Peroxidasa

. Catalasa

. Xantina oxidasa

3) Transferasas:

. Lactosa sintetasa

Estimación de actividad microbiana a partir de la reducción de colorantes

La leche fresca normal tiene un potencial "redox" (Eh) positivo comprendido entre 0,20 y 0,30 V. El

potencial redox mide la capacidad oxidante o reductora de la leche en un momento dado. En las propiedades

óxido-reductoras de la leche intervienen los siguientes factores:

I. Factor de oxidación:

El oxígeno disuelto es responsable del potencial redox de la leche fresca cruda. Desaireándola mediante

burbujeo de N2 gaseoso el valor de Eh baja rápidamente a 0,05 V.

II. Factores de reducción:

1. Como se mencionó anteriormente la leche tiene un sistema reductor natural, que es una reductasa aldehídica o

enzima de Schardinger. No se manifiesta en condiciones de aerobiosis. Se la pone de manifiesto en atmósfera

inerte, mediante la determinación del potencial redox, o en presencia de un aldehído (formol) por reducción del

azul de metileno. Se destruye durante el calentamiento hacia los 80 °C.

2. Las bacterias que proliferan en la leche, tienen una actividad reductora por dos fenómenos:

. Consumo del oxígeno disuelto a causa de la respiración, que provoca un descenso del potencial redox

favorable al sistema reductor natural de la leche (reductasa aldehídica).

. Producción de un sistema reductor propio de las bacterias (reductasa microbiana), la actividad reductora

depende del número de bacterias y también de las especies presentes. Algunas son muy activas, como las

coliforrnes (Escherichia, Aerobacter) y otras influyen poco como las bacterias termo-resistentes y las

esporuladas.

3. También los leucocitos tiene una débil acción reductora en la leche normal.

15

En lechería, se determina el potencial redox mediante indicadores que cambian de color o se colorean en

una zona del potencial redox (potencial en que la mitad del colorante se encuentra en forma reducida). Estos

indicadores son el azul de metileno (Eh 0,05 volt) y la resazurina (Eh 0,18 -0,19 volt). En su forma oxidada

poseen color y al ser reducidos se decoloran a sus leucobases. La resazurina es más sensible y decolora antes.

Tanto la prueba de la reductasa como la de la resazurina se basan en el potencial redox normal de la leche y en la

variación que sufre por la densidad de la flora microbiana. El Eh normal es de 0,265 voltios. Los microorganismos

consumen oxígeno y secretan productos oxidables (reductasa microbiana) que reduce fácilmente las sustancias

sensibles (indicadores) puestas en su contacto, en este caso el azul de metileno y la resazurina.

Figura 3: Cambios en el potencial redox de diferentes muestras de leche en función del tiempo de incubación.

Prueba del azul de metileno

En la leche se encuentran presentes la reductasa aldehídica y la reductasa microbiana. La aldehídica o

enzima de Schardinger reduce en presencia de un co-sustrato (formol) al azul de metileno, es la reductasa normal

de la leche por ser un producto normal de la secreción mamaria. En cambio la reductasa microbiana, que es

producida por los microorganismos, reduce directamente al azul de metileno y actúa a pH 5,8 a 8,5. En este caso

el azul de metileno pasa a su forma incolora; el tiempo de decoloración está en relación inversa con el número

de microorganismos presentes en la leche. A mayor cantidad de microorganismos menor tiempo de

decoloración, o sea, estima el grado de contaminación de la leche.

Material:

1. Baño de María a 37 °C

2. Tubos de ensayo estériles

3. Pipetas de 1 y l0 ml estériles

Reactivos

Solución de azul de metileno.

. Azul de metileno..................................... l g

. Etanol 96°........................................... 10 ml

. Agua destilada hasta completar los 100 ml

El reactivo debe tener una concentración tal que al mezclarse con la leche sea de 1:200.000. Para ello se

disuelve el azul de metileno en etanol y luego se lleva a 1000,00 ml con agua destilada hervida o esterilizada. Se

toman 5,00 ml y se llevan a l000,00 ml con agua destilada o esterilizada, llegando a una concentración de

1:20.000. La solución debe conservarse al abrigo de la luz, preferentemente en frascos de vidrio color caramelo.

Técnica:

Colocar en tubos de ensayo estériles 1 ml. del reactivo en concentración 1:20.000, agregar con la pipeta

de l0 ml la muestra de leche a analizar, mezclar haciendo girar el tubo entre las manos y llevarlo a baño de María

37 °C hasta decoloración, anotando el tiempo en que transcurre la decoloración.

Calidad Tiempo de decoloración Bacterias /mL

mala menos de 1 hora 20.000.000

regular entre 1 y 2 horas 4.000.000

buena más de 5 horas 500.000

sospechosa más de 7 horas Presencia de bactericida

Prueba de la resazurina

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La resazurina es otro indicador que se utiliza para detectar la reductasa microbiana. Esta se reduce antes

que el azul de metileno, es más sensible, por lo tanto los resultados se obtienen antes. En su tiempo de

decoloración forma una escala de colores que permite ver las diferentes calidades. La forma oxidada es azul en la

leche normal, la forma reducida es rosa y existe una tercera forma, más reducida e irreversible que es incolora.

RESAZURINA RESORRUFINA HIDRO-RESORRUFINA

azul rosa incolora

oxidada reducida más reducida

Una leche limpia conserva un color azulado, la gama de colores intermedios corresponde a calidades

decrecientes hasta decoloración completa en 1 hora para leches con cargas microbianas muy elevadas.

Coloración calidad

alilado muy buena

alilado rosado buena

rosado alilado regular

rosado mediocre

rosado blanco mala

blanco rosado muy mala

blanco pésima

Material:

1.- Baño de María a 37 °C

2.- Tubos de ensayo estériles

3_ Pipetas de 1 ml. y l0 ml estériles

Reactivos

Resazurina............................. 0,05 g

Etanol 96°............................... l0 ml

Agua destilada.........................cantidad necesaria para completar 100 ml

Se disuelve la droga en etanol y se completa en matraz aforado de 100 ml con agua destilada hervida o

esterilizada. Se guarda en frasco color caramelo, a una temperatura de 5 o 6 °C. En estas condiciones la solución

dura aproximadamente l0 días.

Técnica:

Colocar en tubos de ensayo estériles 1 ml de reactivo según se indicó su preparación y agregarle con

pipeta l0 ml de la leche a analizar, mezclar y llevar a Baño de María a 37 °C e ir observando cada 15 min, anotar

la coloración al cabo de 1 hora.

B8) Adulteraciones y contaminaciones.

Las leches contaminadas y adulteradas son leches anormales. En el primer caso se trata de cualquier

producto que posea componentes químicos o biológicos anormales a su composición sean estos tóxicos o no.

La adulteración implica que el producto ha sido, en forma deliberada, parcial o totalmente privado de sus

elementos característicos, o bien se les han realizado tratamientos o agregado aditivos para disimular u ocultar

alteraciones, deficiente calidad, o para modificar su composición. Las adulteraciones pueden agruparse de la

siguiente forma:

a. Aguado: con agua de abastecimiento, destilada, etc.

b. Neutralización: con soluciones de carbonato o bicarbonato.

c. Adición de conservadores: ácidos benzoico, salicílico, bórico, formol, dicromato de potasio, H2O2, etc.

d. Desnatado: por sustracción de grasa, por adición de leche descremada.

e. Aguado y desnatado simultáneos.

f. Sustitución total o parcial por la leche y /o grasa de otro animal.

g. Adición de espesantes: albúmina, caramelo, emulsiones, harina, goma, dextrina.

h. Adición de colorantes.

i. Falsa denominación: Sustitución de leche normal por homogeneizada, reconstituida, calostros.

En los casos en que las sustancias extrañas se encuentren en la leche en el momento del ordeño se habla de

presencia de residuos. Estos residuos pueden provenir del consumo de sustancias extrañas por el animal o de una

mala manipulación de los elementos de la sala de ordeño (máquina, ambiente, etc.). Según el tipo de residuo, estas

contaminaciones pueden ser:

1. Presencia de detergente

2. Presencia de metales y /o sustancias tóxicas (pesticidas, toxinas microbianas o fúngicas, etc.)

17

3. Presencia de antibióticos

Los residuos de antibióticos y los conservantes actúan sobre la flora natural de la leche inhibiendo su

desarrollo (bacteriostáticos) o produciendo su muerte (bactericidas). Por esta razón se denominan inhibidores.

Los inhibidores se pueden clasificar en: - naturales

- químicos

- fármacos veterinarios

-Naturales: son sustancias antibacterianas que se presentan normalmente en líquidos del organismo (lágrimas,

saliva, leche). En la leche están representados por las lacteninas, y su presencia no constituye una contaminación o

adulteración.

-Químicos: provienen de los productos de limpieza, desinfección de los equipos o de otras causas como:

Pesticidas: Incluye por ejemplo a productos antiparasitarios utilizados en agricultura, en almacenaje de

los productos alimenticios y en la industria, para luchar contra roedores, insectos, malezas, hongos y

microorganismos. En la leche se pueden encontrar restos de pesticidas, su presencia produce efectos nocivos en los

productos lácteos, por ello existen controles de estos residuos con umbrales de tolerancia muy severos, sobre todo

para la exportación.

Metales tóxicos: la contaminación de leche por residuos metálicos se debe sobre todo al contacto con

superficies metálicas o agua contaminada, fundamentalmente, plomo, cadmio y mercurio, para los cuales se han

establecido concentraciones máximas admitidas por kilogramo de leche.

Residuos de detergentes: Provienen del manejo inadecuado de los detergentes o desinfectantes, utilizados

en la higiene del material, que se pone en contacto con la leche. Estos se emplean para eliminar los restos de

materia orgánica y destruir a las bacterias que contaminan las instalaciones y pasan a la leche. Los más comunes

están formados por una mezcla de los siguientes ingredientes: álcalis inorgánicos (carbonato, bicarbonato,

hidróxidos, fosfatos o silicatos de sodio), agentes activos en superficie (mojantes aniónicos), agentes secuestrantes

ablandadores del agua (poli fosfatos, EDTA), ácidos (fosfórico, nítrico y sulfúrico). Dentro de los desinfectantes

se encuentran el hipoclorito de sodio, el hipoclorito de calcio, el amonio cuaternario, etc.

-Fármacos veterinarios: son sustancias utilizadas con fines terapéuticos, que al ser aplicados en período de

lactación dejan un residuo que se elimina a través de fluidos y humores del animal, siendo uno de ellos, la leche.

Las drogas veterinarias están registradas, fijándose las restricciones de uso para cada una de ellas. Las

restricciones consisten en los períodos de tiempo necesarios para asegurar que los niveles de residuo químico de un

producto en particular hayan disminuido lo suficiente en los tejidos y derivados comestibles como para que su

consumo por seres humanos no produzca efecto alguno sobre su salud. La presencia de antibióticos en la leche

para consumo o para la industria puede deberse a no respetar los tiempos de retirada, uso en casos para las que la

droga no está indicada o falta de registro de animales tratados. En el manejo industrial, la presencia de estas

sustancias representa una complicación, ya que interfiere en los procesos de fermentación, por inhibición del

desarrollo de las bacterias lácticas. En la industria quesera se presentan defectos en la elaboración de la cuajada y

la maduración de los quesos. Los antibióticos que aparecen más comúnmente como residuo en leche son las

penicilinas (grupo de los -lactámicos), las tetraciclinas y las sulfonamidas. El de mayor importancia técnica es la

penicilina, por su incidencia sobre los cultivos lácticos.

El Código Alimentario Argentino (anexo MERCOSUR) establece en el artículo 556 las cantidades

máximas permisibles para cada antibiótico. (Codex Alimentarius–Unión Europea–FDA).

- lactámicos 4 µg/L

Tetraciclinas 100 µg/L

Sulfonamidas 100 µg/L

Las micotoxinas son toxinas producidas por los hongos, de alta toxicidad, algunas cancerígenas. Se hallan

principalmente en los alimentos y tortas contaminadas. Estas sustancias son metabolizadas por el animal y pueden

pasar a la leche. Se pueden detectar en leche fluida y en leche en polvo (AOAC 980.21).

Actividades

1. Identificación de bactericidas o inhibidores

1.1. Agua oxigenada:

-método del ácido sulfúrico

-método del ácido vanádico

1.2. Hipoclorito:

-método del KI

1.3. Determinación de la presencia de inhibidores

-prueba del yogurt

-test para la detección de antibióticos

1.1.-Identificación de agua oxigenada

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Los métodos químicos basados en la adición de sustancias bactericidas o antibióticos a la leche han sido

rechazados de una manera general por todos los higienistas. En efecto, vienen a sustituir un peligro por otro. Sin

embargo, la cuestión vuelve a considerarse en la actualidad en lo que se refiere a una de las drogas más antiguas

utilizadas, el agua oxigenada. Los residuos de esta sustancia pueden eliminarse enteramente por la adición de

catalasa. No se trata, desde luego, de sanear la leche de consumo por este procedimiento. En la práctica se usa en

EE.UU. para la leche de quesería. Se añade 0,2 % de agua oxigenada (de 35 volúmenes) a la leche y se mantiene a

35 ºC durante 30 minutos, a continuación se añade la cantidad necesaria de catalasa. Se conoce el efecto

destructor y eficaz del agua oxigenada sobre las bacterias perjudiciales y en especial sobre los clostridios. Pero es

un bactericida difícil de descubrir porque transcurrido un tiempo se descompone y entonces los métodos químicos

clásicos ya no descubren su presencia.

Material

1. Tubos de ensayo

2. Pipetas de 1 y 10 mL

Reactivos

1.Ácido vanádico al 1% en medio sulfúrico

2.Ácido sulfúrico

Técnica

Con ácido vanádico al 1% en medio sulfúrico: se colocan en un tubo de ensayo 10 mL de leche más unas gotas de

ácido vanádico en medio sulfúrico. No agite el tubo, pues la reacción se produce en el fondo del mismo.

Leche pura-------------------------------------------aro amarillo verdoso

Leche adulterada con agua oxigenada-----------aro rojo salmón

2. Con ácido sulfúrico concentrado: en un tubo de ensayo se colocan 10 mL de leche, más 3 mL de ácido sulfúrico

por las paredes del tubo sin agitar.

Leche pura----------------------------------------aro amarillento

Leche adulterada con agua oxigenada--------aro marrón rojizo

1.2.-Identificación de hipoclorito de sodio (lavandina)

Este fraude se reconoce colocando 5 mL de leche en un tubo de ensayo y agregándole 1 mL de solución de

KI al 10%. Coloración parda indica la presencia de hipoclorito.

1.3.-Determinación de la presencia de inhibidores

Prueba del yogur

Materiales

Tubos de ensayo estériles

Pipetas de 1 y 10 mL

Estufa de incubación a 42 º C

Termómetro de 0–100 ºC (con subdivisiones al 0,1)

Púrpura de bromocresol al 0,1 %

Leche descremada estéril reconstituida al 13 %

Fermento de yogur fresco

Procedimiento

Pipetear 10 mL de la muestra de leche a analizar en un tubo de ensayo estéril y tapar el tubo.

Colocar 0,5 mL de púrpura de bromocresol al 1 %.

Colocar 0,5 mL de fermento de yogur previamente diluido (10 mL de fermento con 15 mL de agua destilada).

Se repite el procedimiento anterior para la leche estéril en polvo descremada y reconstituida al 13% como testigo,

y para la segunda muestra aportada para este ensayo (duplicado).

Incubar los 3 tubos a 42 ºC durante 3 horas como mínimo.

Resultados

Se basa en la decoloración del púrpura de bromocresol de acuerdo a la variación de pH de la leche. En pH 6,8

posee un color violeta azulado que vira a amarillo a pH 5,2.

Positivo (+) azul--------------- (tubo sin formación de coágulo))

Negativo (-) amarillo---------- (tubo con formación de coágulo)

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Una dificultad que puede presentarse es que el pH no baje por ser leche con alto porcentaje de mastitis.

Observación: la técnica anteriormente descripta se utiliza para inhibidores en general, en el caso que dicha técnica

quiera usarse para la determinación de antibióticos tratar la muestra térmicamente a 80 ºC durante 10 minutos.

También debe aclararse que para determinar los distintos tipos de inhibidores deberán emplearse técnicas

específicas en cada caso.

Tests para la detección de antibióticos

Para su detección se utilizan tests de “Screening” para detección de antimicrobianos: Delvo-test, AR-test; V-101,

etc. O bien tests de confirmación y de identificación para antimicrobianos: HPLC, Inmunoensayos, etc