UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID

ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS

AGRÓNOMOS

Microevolución de esclerófilas mediterráneas:

diferenciación fenotípica y genética en Quercus coccifera L. y

Olea europaea L.

Tesis Doctoral

Rafael Rubio de Casas

Ingeniero Agrónomo

2006

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL.

ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS

AGRÓNOMOS

Microevolución de esclerófilas mediterráneas:

diferenciación fenotípica y genética en Quercus coccifera L. y

Olea europaea L.

Autor: Rafel Rubio de Casas

Ingeniero Agrónomo

Dirigida por:

Luis Balaguer; Doctor en Biología

Pablo Vargas Gómez; Doctor en Biología

2006

Esta Memoria Doctoral ha sido elaborada en las

instalaciones y laboratorios de la Universidad Complutense y

en el Real Jardín Botánico de Madrid (CSIC).

A Lucía

Agradecimientos:

A la hora de escribir estos agradecimientos me he encontrado con dos

dificultades: que no fueran más largos que la tesis (que tiene bastantes páginas) y el

orden en el que debían aparecer los “agradecidos”. Sería imposible incluir aquí a todas

aquellas personas que han hecho posible esta tesis así que puede que haya quien se

sienta ofendido por omisión al leer las siguientes líneas. De antemano, lo siento, tú

sabes que si no estás no es por falta de gratitud sino por falta de espacio. En cuanto al

orden, para evitar interpretaciones he decidido utilizar un criterio temporal, primero

aparecen las personas a las que conozco desde hace más tiempo.

Ante todo tengo que dar las gracias a mi familia: a mis padres, que me han

proporcionado siempre los mejores apoyos emocionales y materiales que hubiese

podido desear y que me han educado en el respeto y admiración a la labor intelectual

más exigente. A mis hermanos casi por las mismas razones, a las que habría que añadir

su permanente interés por mi trabajo, aunque creo nunca han llegado a entender bien

que era lo que yo hacía. También tengo que incluir aquí a mis tíos (Vere, Nina, Gloria,

Félix, Veva) y a sus hijos, mis primos.

Quiero dar también las gracias a mis amigos de toda la vida, por todo lo pasado

juntos y por todo lo que (espero) nos queda por pasar: Pedro Durán, Pedro López, Eric,

Álvaro, Íñigo, Fernando, Juan, Javier, Chus, Marc, Alejandro...

A mis amigos y profesores en la ETSIA de Madrid, gracias por haberme

ayudado a aprender tantas cosas y por haberme hecho disfrutar mientras las aprendía.

Sin vosotros, seguro que no estaría escribiendo esto. Gracias a Pedro Segovia, Pablo

García, Natalia, Nacho, Luis Güemes, Miriam, Bea, Raquel, Merche, Pepe Palacios,

Pablo Rodríguez Palenzuela y Antonio Molina.

A Lucía, gracias por todo. No hay palabras para expresar lo mucho que le debo a

su apoyo, su cariño y su simple presencia.

A mis directores de tesis, y a aquellos que sin serlo oficialmente han respondido

como tales en tantas ocasiones, por todo lo que me habéis enseñado, por todas las

facilidades que me habéis brindado, por todos los buenos ratos que hemos pasado

juntos...gracias, Pablo y Luis, gracias Esther, gracias Esteban.

A mi tutor, Txema Iriondo, tengo que agradecerle su enorme paciencia para

atenderme. A pesar de que siempre he recurrido a él de forma inesperada y precipitada,

en todo momento ha respondido con la mayor de las amabilidades.

En los años de elaboración de esta tesis son muchos los que han compartido

conmigo horas de trabajo y de no tanto trabajo en el RJB, en la Complu, en el campo, en

el vivero...Todos ellos son más que compañeros de trabajo, amigos. Gracias a Carlos

(nothing’s gonna...), a Emilio, a Virginia, a Omar, a Jorge, a Niko, a Iñaki, a Marga, a

Oscar, a Antonio, a Peri, a Gema ...

También son muchos los que me han ayudado fuera de España, en mis estancias

breves o desde la distancia. Gracias a Peter Schönswetter, a Andy Tribsch y al Instituto

y Jardín Botánicos de la Universidad de Viena. Gracias a Deepak Barua, Colleen Butler

y Kathleen Donohue y la Universidad de Harvard y por supuesto: merci beaucoup,

Guillaume.

Este trabajo no hubiese sido posible sin la ayuda financiera proporcionada por

los Ministerios de Ciencia y Tecnología primero y Educación y Ciencia después. No

sólo me han pagado una beca FPI durante cuatro años, sino que han financiado los

proyectos dentro de los que se ha desarrollado la tesis.

I

Índice

Pág.

I. Introducción General 1

I. I La plasticidad fenotípica y el cambio evolutivo. Un

marco histórico 5

I. II Antecedentes del estudio microevolutivo de las

esclerófilas mediterráneas 9

I. II. I Diferenciación genética 10

I. II. II Diferenciación fenotípica 11

I. III Objetivos 12

I. III. I El posible papel de la plasticidad fenotípica 13

I. IV Figura 1 15

Capítulo 1 (en inglés): Molecular evidence for

widespread hybridisation and limited genetic structure

of Quercus coccifera L. in the Iberian Peninsula

revealed by ISSR and ITS sequence data. 16

1. 1 Summary 17

1. 2 Introduction 18

1. 3 Material and Methods 21

1. 3. 1 Plant material and DNA extraction 21

1. 3. 2 ITS amplification and sequencing 21

1. 3. 3 ISSR amplification, electrophoresis and silver

staining 22

II

Pág.

1. 3. 4 Phylogenetic and population genetic analysis 23

1. 4 Results 26

1. 4. 1 ITS sequence analysis 26

1. 4. 2 ISSR fingerprinting analysis 27

1. 5 Discussion 28

1. 5. 1 Hybrids have a small effect on phylogenetic

structure 28

1. 5. 2 Evidence of hybridisation detected in

morphologically unambiguous individuals 29

1. 5. 3 Hybridisation appears to be restricted to crosses

of Q. coccifera with Q. ilex 30

1. 6 Conclusions 31

1. 7 Acknowledgements 31

1. 8 Tables 32

1. 8. 1 Table 1 32

1. 9 Figures 41

1. 9. 1 Figure 1. 41

1. 9. 2 Figure 2. 42

1. 9. 2. 1 Figure 2. A 43

1. 9. 2. 2 Figure 2. B 44

1. 9. 3 Figure 3. 45

Capítulo 2 (en inglés): Ecotypic divergence in the

Mediterranean sprouter Quercus coccifera inferred from 46

III

Pág.

differences in field plasticity

2. 1 Summary 47

2. 2 Introduction 48

2. 3 Methods

2. 3. 1 Environmental data 51

2. 3. 2 Morphological and pigment data 52

2. 3. 3 Genetic sampling and analyses 53

2. 3. 4 Comparisons of the data sets

2. 4 Results 56

2. 4 .1 Environmental, morphological and pigment data 57

2. 4. 2 Genetic data 57

2. 4. 3 Comparisons of the data sets 58

2. 5 Discussion 60

2. 6 Acknowledgements 63

2. 7 Tables 64

2. 7. 1 Table 1 64

2. 8 Figures

2. 8. 1 Legend to figure 1 67

2. 8. 2 Legend to figure 2 67

2. 8. 3 Legend to Figure 3 68

2. 8. 4 Figure 1 69

2. 8. 5 Figure 2 70

2. 8. 6 Figure 3 71

IV

Pág.

2. 9 Appendix S1: Environmental data 72

2. 9. 1 Geographic location of the Quercus coccifera L.

populations sampled and mean photosynthetic photon

flux density 73

2. 9. 2 Monthly mean maximum temperatures 74

2. 9. 3 Monthly mean minimum temperatures 75

2. 9. 4 Monthly mean temperatures 76

2. 9. 6 Annual mean number of days with minimum

temperatures < -5 ºC and < 0 ºC 77

2. 9. 7 Monthly mean rainfall 78

2. 9. 8 Soil characteristics 79

2. 10 Appendix S2: PCR. sequencing and fingerprinting

protocols 80

2. 10. 1 ITS amplification and sequencing 80

2. 10. 2 ISSR amplification, electrophoresis and silver

staining

81

2. 11 Figure S1 82

2. 12 Appendix S3 83

2. 12. 1. Appendix S3 A Correlations between all

populations 84

2. 12. 2. Appendix S3 B Correlations within regions. 85

Capítulo 3 (en inglés): Extensive gene flow blurs

phylogeographic but not phylogenetic signal in Olea 87

V

Pág.

europaea L.

3. 1 Abstract 88

3. 2 Introduction 89

3. 3 Materials and Methods 91

3. 3. 1 Plant material, DNA extraction and AFLP

fingerprinting 91

3. 3. 2 Data analysis 91

3. 3. 3. 2. 1 Phylogenetic relationships in the Olea europaea

complex 92

3. 3. 3. 2. 2 Major lineages within O. europaea subsp.

europaea 92

3. 3. 3. 2. 3 Phylogeography of the W Mediterranean 93

3. 4 Results 94

3. 4. 1 Phylogenetic relationships in the Olea europaea

complex 94

3. 4. 2 Major lineages within O. europaea subsp.

europaea 94

3. 4. 3 Phylogeography in the W Mediterranean 95

3. 5 Discussion 98

3. 5. 1 Congruency of major AFLP lineages and

taxonomy 98

3. 5. 2 Weak phylogeographic structure in the olive tree

across the Mediterranean 100

3. 5 .3 Analysis of genetic structure of W Mediterranean 101

VI

Pág.

populations

3. 6 Conclusions 102

3. 7 Acknowledgements 103

3. 8 Tables 104

3. 8. 1 Table 1. 104

3. 9 Figures 107

3. 9. 1 Figure 1. 107

3. 9. 2 Figure 2. 108

3. 9. 3 Figure Legends 109

3. 9. 3. 1 Figure 1 109

3. 9 .3. 2 Figure 2 109

3. 10 Electronic Supplementary Material 110

3. 10. 1 Table S1 110

3. 10. 2 Table S2 116

3. 10 .3 Table S3. 117

3. 10. 4 Figure S1 119

3. 10. 4. 1 Figure S1 a 119

3. 10. 4. 2 Figure S1 b 120

3. 10. 4. 3 Figure S1 c 121

3. 10. 5 Figure S2 122

3. 10. 5. 1 Figure S2 a 122

3. 10. 5. 2 Figure S2 b 123

3. 10. 6 Figure Legends 124

3. 10. 6. 1 Figure S1. 124

VII

Pág.

3. 10. 6. 2 Figure S2. 125

Capítulo 4 (en inglés): Phenotypic differentiation in

Holocene- and Tertiary-diverged lineages of Olea

europaea

126

4. 1 Abstract 127

4. 2 Introduction 128

4. 3 Materials and Methods 129

4. 3. 1 Environmental data 129

4. 3. 2 Morphological and pigment data 133

4. 3. 3 Genetic sampling and analyses 134

4. 3. 4 Analysis of selection on reaction norms: 134

4. 4 Results

4. 4. 1 Environmental data 137

4. 4. 2 Differences in functional traits 137

4. 4. 3 Differences in molecular markers 138

4. 4. 4 Selection on the reaction norms 138

4. 5 Discussion 139

4. 5. 1 Congruence between genetic and vegetative

patterns in O. europaea

139

4. 5. 2 Correlation of plasticity and mean phenotypic

patterns

140

4. 5. 3 Selection on phenotypic plasticity 141

4. 6 Conclusions 142

VIII

Pág.

4. 7 Acknowledgments 142

4. 8 Tables 143

4. 8. 1 Table 1 143

4. 8. 2 Table 2. 145

4. 8. 3 Table 3. 147

4. 8. 4 Table 4. 149

4. 8. 5 Table 5. 151

4. 9 Figures 152

4. 9. 1 Figure Legends 152

4. 9. 1. 1 Figure 1. 152

4. 9. 1. 2 Figure 2. 152

4. 9. 1. 3 Figure 3. 152

4. 9. 1. 4 Figure 4. 152

4. 9. 1. 5 Figure 5. 152

4. 9. 1. 6 Figure 6. 153

4. 9. 2 Figure 1 154

4. 9. 3 Figure 2. 155

4. 9. 4 Figure 3. 156

4. 9. 5 Figure 4. 157

4. 9. 6 Figure 5. 158

4. 9. 7 Figure 6. 160

II. Discusión General 161

II. 1 Diferenciación genética de esclerófilas

mediterráneas 162

IX

Pág.

II. 2 Divergencia fenotípica en esclerófilas

mediterráneas. 168

II. 3 El papel de la plasticidad fenotípica 171

Conclusiones Generales 174

Bibliografía 177

Apéndices 199

Apéndice 1: Reticulate evolution in the olive tree

complex (Olea europaea L., Oleaceae) 201

Apéndice 2: A set of primers for length and nucleotide-

substitution polymorphism in chloroplastic DNA of Olea

europaea L. (Oleaceae) 249

Apéndice 3: On the historical presence of the wild olive

[Olea europaea L. var. sylvestris (Miller) Lehr.] in the

Eurosiberian region of the Iberian Peninsula . 253

I

Resumen de la Tesis “Microevolución de esclerófilas

mediterráneas: diferenciación fenotípica y genotípica en

Quercus coccifera L. y Olea europaea L.”.

Rafael Rubio de Casas

Ingeniero Agrónomo

II

Introducción:

La esclerofilia es un síndrome funcional característico de muchas especies mediterráneas.

Aparece en grupos taxonómicos diversos, con aparente independencia de su origen

filogenético o del grupo funcional al que pertenezcan. Históricamente, se ha considerado

como el resultado de la adaptación a las condiciones propias del ambiente mediterráneo

(Dunn et al. 1976). Actualmente sin embargo está bien establecido su origen Terciario,

anterior al advenimiento del clima mediterráneo (Palamarev 1989; Herrera 1992; Verdú et

al. 2003). La eslerofilia supone por lo tanto un caso de exaptación (Gould y Vrba 1982).

Cabe entonces plantearse cuál es la habilidad de las plantas esclerófilas para expresar

fenotipos alternativos en respuesta a cambios ambientales, espaciales y/o temporales y en

qué medida estos fenotipos alternativos son síntoma de microevolución (Valladares et al.

2002).

Antecedentes del estudio microevolutivo de las esclerófilas mediterráneas

DIFERENCIACIÓN GENÉTICA DE ESCLERÓFILAS MEDITERRÁNEAS

Tanto en la coscoja como en el acebuche la diversidad genética está condicionada por la

introgresión, en el caso de aquella con otras especies del género Quercus y en el de éste

con el olivo cultivado.

El impacto de la hibridación sobre la estructura genética de la coscoja ha sido abordado

mediante el uso de marcadores genéticos, tanto de tipo huella genética (ISSR) como con

secuencias nucleares (ITS) en el Capítulo 1, y su diferenciación genética poblacional

dentro de la Península Ibérica en el Capítulo 2.

La influencia de la hibridación con el olivo en la estructura genética no sólo poblacional,

sino filogenética del acebuche se ha abordado en el Capítulo 3 usando marcadores

III

dominantes AFLPs. En este mismo capítulo se analiza la estructura filogeográfica del

Mediterráneo occidental para estimar procesos de divergencia cuaternarios en esta región,

así como para localizar de forma precisa los posibles refugios glaciales de O. europaea. Un

análisis filogenético más pormenorizado de este taxon se presenta en los apéndices.

DIVERGENCIA FENOTÍPICA EN ESCLERÓFILAS MEDITERRÁNEAS:

Los caracteres funcionales que se han analizado están todos ellos relacionados con la

respuesta a la luz. La respuesta a la luz integra la respuesta a otros factores ambientales,

puesto que la respuesta fenotípica de las plantas está modulada de forma simultánea por

todos los factores necesarios para su desarrollo (Gleeson y Tilman 1992). Se ha intentado

usar caracteres que reflejaran diferentes escalas de respuesta, desde el ciclo de las

xantofilas, que varía de forma mensurable en cuestión de horas, hasta caracteres

morfológicos de la hoja y la arquitectura de la copa que son el resultado de procesos

ontogenéticos más lentos. Todos ellos se midieron en campo en individuos adultos durante

la parada vegetativa estival.

El análisis de las diferencias fenotípicas existentes entre distintas poblaciones ibéricas de

coscoja se aborda en el Capítulo 2, mientras que las referentes al acebuche se tratan en el

Capítulo 4. En ambos casos además de estimar las diferencias fenotípicas se estudia en qué

medida son congruentes éstas con los patrones genéticos. También se plantea el posible

papel de la plasticidad fenotípica en la respuesta fenotípica de las plantas.

Objetivos

En la presente Memoria Doctoral se ha abordado el estudio de procesos microevolutivos en

especies esclerófilas a través del análisis de la estructura genética y fenotípica de dos

especies emblemáticas del mediterráneo, cómo son la coscoja (Quercus coccifera L.) y el

acebuche (Olea europaea var. sylvestris L.). Los posibles mecanismos causales del cambio

IV

evolutivo se han tomado en consideración de forma independiente y sintética intentando

dar respuesta a una serie de interrogantes:

• ¿En qué medida la estabilidad fenotípica implica una falta de diversificación

genética? O de otra manera ¿es posible detectar procesos de divergencia

genética en esclerófilas mediteráneas? Si la respuesta es afirmativa ¿cuáles

son?.

• La aparente estabilidad evolutiva del síndrome esclerófilo ¿supone la no

existencia de procesos de divergencia fenotípica entre poblaciones?.

• Si estos procesos existen ¿ha jugado en ellos algún papel la plasticidad

fenotípica? ¿es la plasticidad fenotípca un factor importante en la respuesta

evolutiva de las esclerófilas mediterráneas?.

El posible papel de la plasticidad fenotípica:

La importancia evolutiva de la plasticidad fenotípica, la capacidad de un fenotipo para

expresar fenotipos diferentes en situaciones ambientales distintas (Bradshaw 1965), está

actualmente bien establecida. A pesar de este buen conocimiento del tema, todavía son

pocos los trabajos en los que se haya cuestionado el papel que puede haber jugado la

plasticidad fenotípica en la respuesta evolutiva de plantas leñosas a los cambios

ambientales.

La plasticidad fenotípica se midió sobre los mismos caracteres que los valores medios.

Todas las medidas se tomaron en campo. Ahí se consideró a la zona más expuesta a la luz

en orientación Sur de la copa de los árboles como un ambiente diferente (Sol) del

experimentado por los órganos vegetativos en la zona más interna de la orientación Norte

(Sombra). La plasticidad fenotípica se cuantificó como la diferencia de fenotipo para cada

genotipo (árbol individual) entre estos dos ambientes

V

Las diferencias en plasticidad entre poblaciones de coscoja y su relación con los valores

fenotípicos medios y con la estructura genética se estudian en el Capítulo 2.

El acebuche presenta un modelo doblemente adecuado. Además de los procesos de

recolonización del continente europeo durante el Holoceno, la colonización de los

archipiélagos macaronésicos de Canarias y Madeira que dio lugar a dos subespecies

diferentes (cada una endémica de un archipiélago) durante el Terciario permite estudiar los

patrones de diferenciación en condiciones ambientales muy distintas. Esto constituye el

núcleo del Capítulo 4.

Si la plasticidad fenotípica ha mediado en alguna medida el cambio evolutivo es razonable

suponer que fuerzas selectivas hayan actuado sobre ella. Un aproximación analítica a esta

hipótesis se plantea también en el Capítulo 4.

VI

Capítulo 1: Evidencias moleculares de que la hibridación está generalizada

en Quercus coccifera L. y su estructura genética poco determinada en la

Península Ibérica.

La introgesión interespecífica es un proceso frecuente en el género Quercus de

consecuencias genéticas y evolutivas poco claras. Se sabe que puede estar condicinada por

factores ecológicos y que puede originar la aparición de nuevas especies (Dodd y Afzal-

Rafii 2004; Mir et al. 2006).

La información disponible sobre sus efectos e importancia en los Quercus mediterráneos

esclerófilos permite establecer que los híbridos de encina (Q. ilex) con alcornoque (Q.

suber) y coscoja (Q. coccifera) son frecuentes (Belahbib et al. 2001; Lumaret et al. 2002).

En este útimo caso incluso parece que no es posible establecer límites claros entre los dos

taxones usando marcadores plastidiales (Jiménez et al. 2004).

En este Capítulo se ha abordado el impacto y extensión de la hibridación sobre la coscoja

usando dos herramentas molecualres, los ISSR y secuencias de ADN ribosomal (ITS). En

concreto se ha intentado responder a estos interrogantes:

• ¿Cuáles han sidos las consecuencias sobre la situación filogenética de la coscoja?

• ¿Es posible detectar que rastros de introgresión aún en individuos claramente

identificados morfológicamente?

• ¿Está la hibridación restringida a los cruzamientos con Q. ilex?

Los resultados obtenidos muestran que el intercambio genético con otras especies del

género Quercus, particularmente con la encina (Q. ilex) es muy frecuente. Este flujo génico

interespecífico resulta en la coexistencia de varias copias de ITS de secuencia diferente en

el genoma de las plantas. La presencia de estas múltiples copias es fácil de detectar, lo que

VII

indica que los procesos de hibridación son continuos, puesto que la evolución concertada

del ADN ribosómico hace imposible la permanencia de linajes moleculares diferentes en el

mismo genoma más allá de unas pocas generaciones (Muir et al. 2001). Varios trabajos

recientes han establecido la importancia de la hibridación a la hora de ampliar el nicho

potencial de las diferentes especies en Quercus (Petit et al. 2003b; Dodd y Afzal-Rafii

2004) así como sus consecuencias evolutivas (Mir et al. 2006). En el caso de las coscojas

ibéricas nuestros resultados no avalan el que la diferenciación ecotípica se asocie a

diferentes tasas de hibridación, puesto que esta parece estar muy generalizada pero

tampoco podemos afirmar concluyentemente que la hibridación no juegue un papel

ecológicamente importante.

En respuesta las preguntas planteadas, se puede afirmar que:

• La hibridación afecta a la reconstrucción filogenética en Quercus. En el caso de la

coscoja, la presencia de individuos híbridos hace que sea difícil establecer los

límites evolutivos entre esta especie y la encina.

• En general los híbridos no presentan rasgos morfológicos que los identifiquen,

siendo muy poco habitual encontrar plantas silvestres que presenten rasgos

intermedios entre coscoja y otras especies.

• La hibridación parece darse sólo en los cruzamientos con encina.

. Es posible que las modificaciones genéticas debidas los cruzamientos Q. coccifera x Q.

ilex no supongan una modificación observable del nicho de los híbridos respecto de las

líneas puras porque ambas especies presentan características ecológicas similares, aunque

la coscoja tiende a ocupar espacios más áridos (López González 2002). Hay mecanismos

genéticos que pueden explicar este fenómeno, como un silenciamiento generalizado de uno

de los genomas implicados en el híbrido (Chen y Pikaard 1997; Wendel 2000). En

VIII

cualquier caso son necesarios análisis más exhaustivos para poder estimar de forma precisa

la segregación ecológica y genética entre encina, coscoja y sus híbridos y cuantificar su

trascendencia evolutiva.

IX

Capítulo 2: La divergencia ecotípica de la coscoja (Q. coccifera L.) en la

Península Ibérica está mediada por la plasticidad fenotípica.

Uno de los aspectos que más peso ha ganado en lo últimos años en el campo de la ecología

evolutiva de plantas es la plasticidad fenotípica (Pigliucci 2005). Han sido muchos los

autores que han abordado su papel en la ecología vegetal, pero son relativamente pocos

aquellos de entre estos trabajos que, versando sobre especies leñosas, incorporen

componentes evolutivos (Balaguer et al. 2001). Hay una serie de condicionantes que son

difíciles de soslayar en el estudio de las leñosas mediterráneas; por una parte la duración de

las distintas fases vitales convierte casi en imposibles los estudios en condiciones

controladas de caracteres cuantitativos, salvo que se consideren aquellos expresados en la

fase de plántula, cuya repercusión en la descendencia es difícil de estimar. Por otra parte, la

heterogeneidad ambiental que se recoge en los experimentos de jardín común es una

simplificación de la heterogeneidad a la que deben hacer frente las planta en sus

localizaciones naturales (Cavender-Bares et al. 2004). Por añadidura, los fenotipos

expresados en esas condiciones no responden sino a un número reducido de meses de

crecimiento, y pueden no ser representativos del rango fenotípico potencial de seres cuya

longevidad supera con frecuencia el siglo. Sin embargo, estimar cuál es y ha sido el papel

de la plasticidad fenotípica en la respuesta de síndromes de caracteres aparentemente

estáticos a condiciones ambientales cambiantes no deja de ser una cuestión importante para

entender la evolución de la vegetación mediterránea (Balaguer et al. 2001; Valladares et al.

2002).

Otra dificultad que aparece a la hora de abordar ensayos evolutivos con especies que

pueden alcanzar gran tamaño y son de vida larga es la adecuada representación de la

X

variabilidad genética en los experimentos de vivero. Es complicado afirmar que el número

y naturaleza de los genotipos incluidos en cualquier experimento son los debidos para

explicar el comportamiento evolutivo de una población, y mucho menos de una especie.

En este capítulo se ha investigado el posible papel de la plasticidad fenotípica en la

evolución reciente de Quercus coccifera en la Península Ibérica. Posteriormente se estimó

la relación de los patrones inferidos a partir de los valores fenotípicos con la estructura

filogeográfica de la coscoja en la Península Ibérica. Para esto se han plateado las siguientes

cuestiones:

• ¿Existen diferencias en los valores fenotípicos de las distintas poblaciones ibéricas

de coscoja?

• ¿Coinciden estas diferencias con las inferidas a partir del análisis de patrones

genéticos usando marcadores dominantes de tipo ISSR?

• ¿Puede haber jugado la plasticidad fenotípica algún papel a la hora de conformar

evolución reciente de Q. coccifera?

Los resultados obtenidos confirman que existen diferencias fenotípicas entre las

poblaciones consideradas y que esta diferenciación fenotípica correlaciona con los patrones

genéticos.

La variabilidad fenotípica observada se deben a que en cada población son diferentes tanto

el fenotipo de Sombra como el de Sol, y lo que es más importante, ambos cambian de

forma simultánea. La capacidad de un mismo genotipo para generar dos fenotipos

diferentes en respuesta al ambiente es un indicio innegable de la importancia ecológica de

la plasticidad fenotípica. Es posible que las hojas de Sol, al estar más verticales, permitan a

la planta captar la radiación solar durante las primeras horas del día y durante los meses de

invierno, mientras que las de Sombra, al ser más horizontales maximizan la intercepción de

XI

la radiación solar en las horas centrales del día y durante el verano (Falster y Westoby

2003).

Los resultados obtenidos con marcadores dominantes ISSR avalan la diferenciación entre

poblaciones y a nivel regional, con dos áreas bien definidas, una en el NE ibérico que

incluye a cuatro de las nueve poblaciones estudiadas y otra que abarca el resto de la

distribución de la planta (cinco poblaciones).

Las nueve poblaciones ibéricas de coscoja analizadas se agrupan, de acuerdo con sus

valores fenotípicos, en dos conjuntos coincidentes con la agrupación genética señalada más

arriba. Las cuatro poblaciones analizadas en el NE peninsular incluyen individuos más

pequeños y con hojas más gruesas y más espinosas. La plasticidad fenotípica de estas

poblaciones es menor. Todo esto parece indicar que se trata de plantas que han generado

un fenotipo adaptado a situaciones de estrés (Ackerly et al. 2002; Knight y Ackerly 2003).

Durante las fases tempranas del Holoceno las condiciones ambientales de esta región de la

península eran esteparias (Ribera y Blasco-Zumeta 1998) por lo que en el proceso de

recolonización posglacial es probable que las plantas tuvieran que hacer frente a

condiciones que canalizaron la aparición de un fenotipo como el observado que luego

podría haberse fijado por asimilación genética manteniéndose en ausencia del estímulo

ambiental (Waddington 1959; Queitsch et al. 2002).

XII

Capítulo 3: El flujo génico extensivo difumina la señal filogeográfica pero no

la filogenética en Olea europaea L..

El acebuche ha sido objeto de un gran número de estudios de corte filogeográfico. Gracias

a estos trabajos se sabe que existe una diferenciación genética entre las zonas Este y Oeste

del Mediterráneo y que la mayor diversidad se encuentra en esta última. Dentro de la zona

Oeste, parece ser que el Sur de la Península Ibérica y el Norte del Mahgreb son las zonas

donde se concentra un mayor número de linajes (Hess et al. 2000; Besnard et al. 2002b;

Lumaret et al. 2004).

Actualmente la diversidad genética del acebuche está condicionada por la introgresión con

el olivo cultivado. La influencia de la hibridación con el olivo en la estructura genética no

sólo poblacional, sino filogenética de Olea. europaea se ha abordado usando marcadores

dominantes AFLPs. Además se han comparado los resultados con los obtenidos por otros

autores usando también marcadores dominantes (RAPDs; ISSRs) (Besnard et al. 2001;

Vargas y Kadereit 2001). También se ha analizado la estructura filogeográfica del

Mediterráneo occidental para estimar procesos de divergencia cuaternarios en esta región,

así como para localizar de forma precisa los posibles refugios glaciales de O. europaea.

Los resultados obtenidos demuestran que las diferentes subespecies que actualmente se

incluyen bajo O. europaea son efectivamente entidades genéticamente diferenciadas. Es

posible que la identidad genética de estos táxones se deba a su aislamiento geográfico, ya

que también se ha demostrado la existencia de un abundante flujo génico entre ellos. Es

más, en aquellos casos en que dos de las subespecies descritas están próximas es fácil

detectar individuos que presentan rasgos genéticos que los caracterizan como híbridos

(Apéndice 1). Las reconstrucciones filogenéticas obtenidas muestran además situaciones

XIII

conflictivas en varios subespecies. La subespecie de distribución más amplia (cuspidata),

engloba varios linajes bien diferenciados. Otros autores han propuesto la separación de los

individuos asiáticos y africanos de este taxon en subespecies distintas (Green y Wickens

1989). Los resultados no son concluyentes a este respecto. La multiplicidad de linajes es

indudable, pero no parece tan clara la identificación de éstos con zonas geográficas

precisas. Otro punto conflictivo en la resolución de la historia evolutiva de O. europaea es

la interrelación de los endemismos macaronésicos (subspp. cerasiformis y guanchica) con

las subespecies marocanna, laperrinei y europaea. Existe una contradicción entre los

resultados obtenidos con marcadores plastidiales y los obtenidos con marcadores

nucleares. En el primer caso, los endemismos saharianos aparecen como pertenecientes a

linajes diferentes, subsp. marocanna ligada a las subespecies macaronésicas y laperrinei

relacionada con subsp. europaea (Besnard et al. 2002a). En las reconstrucciones obtenidas

con marcadores nucleares subsp. marocanna y subsp. laperrinei se resuelven como

taxones hermanos, lo que también ha sido descrito por otros autores (Angiolillo et al. 1999;

Hess et al. 2000; Besnard et al. 2001). Es difícil plantear una hipótesis concluyente que

explique esta disparidad de resultados. Una posible explicación se puede encontrar en

procesos de hibridación pretéritos sucedidos durante la expansión y retracción de los

diferentes taxones provocados por fluctuaciones climáticas.

Es esperable que si el flujo génico es importante entre táxones separados lo sea aún más

entre linajes del mismo taxon. Los resultados obtenidos en el análisis de la subespecie

europaea son congruentes con esta hipótesis. En el caso del acebuche mediterráneo, el

abundante flujo génico, probablemente facilitado por el olivo cultivado, hace que los

patrones filogeográficos sean difusos. La existencia de linajes distintos en la orilla Este y

Oeste del Mediterráneo demostrada mediante el análisis de haplotipos plastidiales (Besnard

XIV

et al. 2002b; Besnard et al. 2002a) no se hace evidente en análisis realizados con

marcadores dominantes si no se incorporan las estructuras geográfica y poblacional en el

análisis.

Los resultados poblacionales obtenidos dentro de la zona Oeste del Mediterráneo

demuestran la existencia en esta región de áreas con alta probabilidad de albergar refugios

glaciales, en congruencia con lo planteado por otros autores (Besnard et al. 2002a;

Lumaret et al. 2004): las zonas contiguas al Estrecho de Gibraltar y las Islas Baleares. En

ambas zonas se han descrito refugios de otras plantas esclerófilas (Petit et al. 2003a; López

de Heredia et al. 2005), lo que nos lleva a postular estas regiones como reservorios de una

diversidad importante para este tipo de especies. En la Península Ibérica se encontró un

linaje alejado genéticamente de los demás y que agrupa a las plantas muestreadas en la

zona Cantábrica. Este linaje ocupa una zona ambientalmente diferente del entorno típico en

el que medra el acebuche: las plantas del Norte peninsular se encuentran en la región

florística Eurosiberiana, cuando O. europaea es una especie netamente mediterránea

(Takhtajan 1986). La interrelación entre situación ecológica y singularidad genética de este

linaje se analiza en detalle en el Capítulo 4.

XV

Capítulo 4: Diferenciación fenotípica en linajes de Olea europaea de

divergencia Terciaria y holocénica

A pesar de la antigüedad de su origen, no cabe duda de que muchos de los taxones

esclerófilos son exitosos en las condiciones actuales. Su abundancia y frecuencia en

cualquier punto del Mediterráneo no dejan lugar a dudas sobre la validez de su respuesta

funcional. Pero la permanencia a lo largo del tiempo ha supuesto también su conservación

ante factores bióticos y abióticos muy variables, en ocasiones marcadamente distintos de

aquellos frente a los que se desarrollaron muchos de sus caracteres funcionales. El hecho

de que estas variaciones en el ambiente no supongan la alteración del síndrome esclerófilo

como tal parecen indicar que éste esté condicionado por una canalización que modula los

rangos posibles de expresión fenotípica (Meiklejohn y Hartl 2002; Valladares et al. 2002).

Al tener esto en cuenta la cabe cuestionar la medida en que las plantas esclerófilas son

capaces de generar síndromes funcionales alternativos. También es inevitable preguntarse

por los mecanismos que hacen posible la canalización fenotípica de la esclerofilia. El

acebuche presenta un modelo adecuado dar respuesta a estos interrogantes. Además de los

procesos de recolonización del continente europeo durante el Holoceno, la diferenciación

de las seis subespecies diferentes de Olea europaea durante el Terciario generó

experimentos naturales en los que estudiar los cambios fenotípicos asociados a la

diferenciación genética en condiciones ambientales muy distintas. Esta variedad de

escenarios hace posible además estimar de manera precisa si la plasticidad fenotípica

determina en alguna medida la evolución de O. europaea . En caso de que así fuera, la

plasticidad misma, como mediadora del cambio fenotípico, debe ser objeto de presiones

selectivas (Callahan y Scheiner 1999)

En este capítulo se ha estudiado la capacidad de cambio fenotípico de O. europaea, su

XVI

relación con los factores ambientales mas importantes y el posible papel de la plasticidad

fenotípica en el resultado final. En concreto se han abordado los siguientes interrogantes:

• ¿Existen diferencias en los valores fenotípicos de las distintos linajes de O.

europaea?

• ¿Coinciden estas diferencias con las observadas en lo niveles de plasticidad

fenotípica?

• ¿Ha sufrido la propia plasticidad presiones selectivas?

La caracterización de las pautas fenotípicas se ha hecho a dos escalas distintas, entre dos

subespecies (subsp. europaea y subsp. guanchica) y dentro de la subsp. europaea entre

cinco poblaciones ibéricas.

Los resultados obtenidos permite concluir que en O. europaea se han producido procesos

de diferenciación fenotípica recientes. Esto no quiere decir que se hayan observado

cambios en el síndrome esclerófilo que cuestionen su estabilidad, pero sí que hay una

variación en los caracteres vegetativos de los distintos linajes.

La importancia de la plasticidad fenotípica en la evolución de O. eruropaea ha sido

analizada en detalle. Primeramente, se determinó la dependencia de las normas de reacción

del genotipo. En segundo lugar, se investigó si había cambios en los valores de plasticidad

fenotípica asociados con los procesos de colonización de las Islas Canarias y el Norte

peninsular, procesos que tuvieron lugar en momentos separados en el tiempo por varios

millones de años y realizados por linajes distintos. En ambos casos los resultados indicaron

variaciones en la plasticidad fenotípica concomitantes con la divergencia evolutiva.

El análisis de las presiones selectivas sobre la plasticidad mostró, de forma concluyente,

que en el caso de O. europaea la plasticidad fenotípica es objeto de selección y que esta

selección es de manera preponderante estabilizadora. Además, en las dos situaciones en las

XVII

que la divergencia genética es más acusada (poblaciones de subsp. guanchica y del Norte

peninsular) la presión selectiva parece ser más fuerte, ya que la diferencia entre FST y

QST es mayor que en el resto de los casos. La selección estabilizadora sobre la plasticidad

fenotípica puede dificultar la aparición de fenotipos extremos, y por tanto la ruptura del

síndrome esclerófilo.

XVIII

Discusión general y conclusiones:

Los resultados recogidos en esta tesis demuestran que las plantas esclerófilas han sufrido

procesos de divergencia microevolutiva recientes. Estos procesos han desembocado en la

formación de ecotipos diferenciados genéticamente y que presentan rasgos funcionales

distintos. La diferenciación tiene lugar en un contexto genético en el que la introgresión

está generalizada y el flujo génico es relativamente frecuente. Uno de los elementos

vinculados con la aparición de nuevos ecotipos es la variación en la plasticidad fenotípica.

Diferenciación genética de esclerófilas mediterráneas:

Los resultados presentados en todos los Capítulos así como los que aparecen en el apéndice

1 muestran que Olea europaea y Quercus coccifera son entidades genéticamente bien

diferenciadas y que también presentan diferencias significativas las poblaciones de cada

una de las dos especies. Estos resultados corroboran los obtenidos previamente por otros

autores (Besnard et al. 2001; López de Heredia et al. 2005). En ambos casos las tasas de

flujo génico tanto intra como interespecífico son elevadas, pero esto no parece haber

impedido los procesos de diferenciación genética.

Divergencia fenotípica en esclerófilas mediterráneas:

En los Capítulos 2 y 4 se detallan los resultados obtenidos en la medición de caracteres

funcionales de acebuche y coscoja. A la luz de estos se puede concluir que en ambas

especies se han producido procesos de diferenciación fenotípica recientes. La

diferenciación fenotípica observada correlaciona con los patrones genéticos. La

congruencia entre fenotipo y genotipo, aunque esperable, no deja de ser interesante, ya que

demuestra que los fenotipos observados son ecotipos fijados genéticamente. Los resultados

XIX

obtenidos al analizar las condiciones ambientales de cada población apoyan esta idea

puesto que son plenamente congruentes con la diferenciación fenotípica. Así, diferentes

situaciones ambientales tienen su reflejo en la estructura fenotípica de las poblaciones

estudiadas, que a su vez está condicionada genéticamente.

La modificación del fenotipo de respuesta a la luz de O. europaea y Q. coccifera supone la

aparición de dos tipos de hojas en la copa de cada individuo. El primero de ellos es el

característico de las hojas de las partes más expuestas de la copa (fenotipo Sol), mientras

que el otro se genera en la zona más interior de la misma (fenotipo Sombra).

El papel de la plasticidad fenotípica:

La correlación observada en contextos genéticos y ambientales distintos entre patrones

moleculares, fenotípicos y ecológicos pone de relieve la capacidad de las esclerófilas

mediterráneas para generar nuevos ecotipos. Además, los resultados descritos demuestran

que el cambio fenotípico en estas especies no se debe tanto a la diversidad genética

disponible como a la plasticidad fenotípica (Sultan y Bazzaz 1993). Si los procesos de

divergencia descritos fueran debidos exclusivamente a procesos de deriva genéticos, la

congruencia con las condiciones ambientales no sería tan significativa como la encontrada.

Si por el contrario la variabilidad fenotípica no tuviera base genética y se debiese

exclusivamente a los cambios inducidos por el entorno no se observarían diferencias en la

respuesta de distintos genotipos en situaciones ambientales comparables (Sultan 1987).

La importancia evolutiva de la plasticidad fenotípica en las esclerófilas mediterráneas

queda demostrada por los resultados. La plasticidad aparece como el agente causal de la

aparición de nuevos ecotipos de cocoja y cómo responsable del mantenimiento del

síndrome esclerófilo.

XX

Conclusiones:

1. El flujo génico está generalizado en Olea europaea y Quercus coccifera y supone

el intercambio genético no sólo entre poblaciones sino entre táxones próximos.

2. A pesar de la frecuencia de intercambio de material genético existen diferencias

significativas a nivel taxonómico entre las distintas subespecies de O. europaea y

entre Q. coccifera y Q. ilex.

3. La diferencias genéticas entre poblaciones dentro de cada uno de los táxones

estudiados también son estadísticamente significativas.

4. El análisis genético de las poblaciones de coscoja muestra la existencia de dos

regiones diferenciadas. Una de ellas en el NE ibérico y la otra abarcando el centro,

Sur y SO peninsulares.

5. Los resultados obtenidos en la caracterización molecular del acebuche demuestran

la existencia de refugios glaciales de esta planta en ambas orillas del Estrecho de

Gibraltar y en las Islas Baleares. Además se ha identificado un linaje genéticamente

distinto en la zona norte de la Península Ibérica.

6. Diferencias en caracteres vegetativos de respuesta a la luz aparecen asociadas a las

diferencias genéticas encontradas tanto en el caso de la coscoja como del acebuche.

7. Las diferencias fenotípicas observadas entre poblaciones y regiones de coscoja son

plenamente congruentes con las genéticas.

8. Las subespecies guanchica y europaea de O. europaea presentan diferencias en sus

caracteres funcionales. Además, el linaje de la subsp. europaea presente en el norte

de la Península Ibérica es fenotípicamente distinto del resto.

9. En el caso de los dos taxones estudiados, las diferencias en caracteres funcionales

suponen diferencias en la plasticidad fenotípica de esos mismos caracteres, que

XXI

varían simultáneamente en la zona más expuesta y en la más umbría de la copa de

los árboles..

10. La plasticidad fenotípica puede estar mediando el cambio evolutivo. En O.

europaea se observan procesos de selección estabilizadora sobre la plasticidad, de

intensidad proporcional al grado de divergencia genética.

XXII

Apéndices:

Además de los diferentes capítulos, en esta Tesis se recogen tres trabajos en los que

participó de forma muy activa el autor y que, estando muy relacionados con la temática de

la memoria doctoral, la amplian en algunos aspectos.

Apéndice 1: Evolución reticulada en el complejo del acebuche (Olea europaea L.)

Apéndice 2: Un conjunto de iniciadores para polimorfismos de longitud y sustitución

en el ADN cloroplástico de Olea eropaea L. (Oleaceae)

Apéndice 3: Sobre la presencia histórica del acebuche [Olea europaea var. sylvestris

(Miller) Lehr. (Oleaceae)] en el Norte eurosiberiano de la Península Ibérica.

XXIII

Bibliografía

Ackerly, D. D., C. A. Knight, S. B. Weiss, K. Barton y K. P. Starmer. 2002. "Leaf size,

specific leaf area and microhabitat distribution of chaparral woody plants:

contrasting patterns in species level and community level analyses". Oecologia

130:449-457.

Angiolillo, A., M. Mencuccini y L. Baldoni. 1999. "Olive genetic diversity assessed using

amplified fragment length polymorphisms". Theoretical and Applied Genetics

98:411-421.

Balaguer, L., E. Martínez-Ferri, F. Valladares, E. Pérez-Corona, F. J. Baquedano, F. J.

Castillo y E. Manrique. 2001. "Population divergence in the plasticity of the

response of Quercus coccifera to the light environment". Functional Ecology

15:124-135.

Belahbib, N., M.-H. Pemonge, A. Ouassou, H. Sbay, A. Kremer y R. J. Petit. 2001.

"Frequent cytoplasmic exchanges between oak species that are not closely related:

Quercus suber and Q. ilex in Morocco." Molecular Ecology 10:2003-2010.

Besnard, G., P. Baradat, D. Chevalier, A. Tagmount y A. Bervillé. 2001. "Genetic

differentiation in the olive complex (Olea europaea) revealed by RAPDs and

RFLPs in the rDNA genes". Genetic Resources and Crop Evolution 48:165-182.

Besnard, G., B. Khadari, P. Baradat y A. Bervillé. 2002a. "Combination of chloroplast and

mitochondrial DNA polymorphisms to study cytoplasm genetic differentiation in

the olive complex (Olea europaea L.)". Theoretical and Applied Genetics 105:139-

144.

—. 2002b. "Olea europaea (Oleaceae) phylogeography based on chloroplast DNA

polymorphism". Theoretical and Applied Genetics 104:1353-1361.

XXIV

Bradshaw, A. D. 1965. "Evolutionary significance of phenotypic plasticity in plants".

Advances in Genetic 13:115-155.

Callahan, H. S. y S. M. Scheiner. 1999. "Measuring natural selection on phenotypic

plasticity". Evolution 53:1704:1713.

Cavender-Bares, J., K. Kitajima y F. A. Bazzaz. 2004. "Multiple trait associations in

relation to habitat differentiation among 17 floridian oak species". Ecological

Monographs 74:635-662.

Chen, Z. J. y C. S. Pikaard. 1997. "Transcriptional analysis of nucleolar dominance in

polyploid plants: Biased expression/silencing of progenitor rRNA genes is

developmentally regulated in Brassica". Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America 94:3442-3447.

Dodd, R. S. y Z. Afzal-Rafii. 2004. "Selection and dispersal in a multispecies oak hybrid

zone". Evolution 58:261-269.

Dunn, E., F. Shropshire, L. Song y H. Mooney. 1976. The water factor and convergent

evolution in Mediterranean-type vegetation., Pages 492-505 in O. Lange, L.

Kappen y E. Schulze, eds. Water & Plant Life, Springer-Verlag.

Falster, D. S. y M. Westoby. 2003. "Leaf size and angle vary widely across species: what

consequences for light interception?" New Phytologist 158:509-525.

Gleeson, S. K. y D. Tilman. 1992. "Plant Allocation and the Multiple Limitation

Hypothesis". American Naturalist 139:1322:1343.

Gould, S. J. y E. S. Vrba. 1982. "Exaptation; a missing term in the science of form."

Paleobiology 8:4-15.

Green, P. S. y G. E. Wickens. 1989. The Olea europaea complex, Pages 287-299 in K.

Tan, ed. The Davis & Hedge Festschrift. Edinburgh, Edinburgh University Press.

XXV

Herrera, C. M. 1992. "Historical effects and sorting processes as explanations for

contemporary ecological patterns: character syndromes in Mediterranean woody

plants". The American Naturalist 140:421-446.

Hess, J., J. W. Kadereit y P. Vargas. 2000. "The colonization history of Olea europaea L.

in Macaronesia based on internal transcribed spacer 1 (ITS-1) sequences, randomly

amplified polymorphic DNAs (RAPD), and intersimple sequence repeats (ISSR)".

Molecular Ecology 9:857-868.

Jiménez, P., U. López de Heredia, C. Collada, Z. Lorenzo y L. Gil. 2004. "High variability

of chloroplast DNA in three Mediterranean evergreen oaks indicates complex

evolutionary history". Heredity 93:510-515.

Knight, C. A. y D. D. Ackerly. 2003. "Evolution and plasticity of photosynthetic thermal

tolerance, specific leaf area and leaf size: congeneric species from desert and

coastal environments". New Phytologist 160:337-347.

López de Heredia, U., P. Jiménez, P. Díaz Fernández y L. Gil. 2005. "The Balearic Islands:

a reservoir of cpDNA genetic variation for evergreen oaks". Journal of

Biogeography 32:939-949.

López González, G. 2002, Guía de los árboles y arbustos de la enínsula Ibérica y Baleares.

Madrid, Ediciones Mundi-Prensa.

Lumaret, R., C. Mir, H. Michaud y V. Raynal. 2002. "Phylogeographical variation of

chloroplast DNA in holm oak (Quercus ilex L.)". Molecular Ecology 11:2327-

2336.

Lumaret, R., N. Ouazzani, H. Michaud, G. Vivier, M.-F. Deguilloux y F. Di Giusto. 2004.

"Allozyme variation of oleaster populations (wild olive tree) (Olea europaea L.) in

the Mediterranean Basin". Heredity 92:343-352.

XXVI

Meiklejohn, C. D. y D. L. Hartl. 2002. "A single mode of canalization". Trends in Ecology

and Evolution 17:468-473.

Mir, C., L. Toumi, P. Jarne, V. Sarda, F. Di Giusto y R. Lumaret. 2006. "Endemic North

African Quercus afares Pomel originates from hybridisation between two

genetically very distant oak species (Q-suber L. and Q-canariensis Willd.):

evidence from nuclear and cytoplasmic markers". Heredity 96:175-184.

Muir, G., C. C. Fleming y C. Schlötterer. 2001. "Three Divergent rDNA Clusters Predate

the Species Divergence in

Quercus petraea (Matt.) Liebl. and Quercus robur L." Molecular Biology and Evolution

18:112-119.

Palamarev, E. 1989. "Paleobotanical evidences of the Tertiary history and origin of the

Mediterranean sclerophyll dendroflora". Plant Systematics and Evolution 162:93-

107.

Petit, R. J., I. Aguinagalde, J.-L. de Beaulieu, C. Bittkau, S. Brewer, R. Cheddadi, R.

Ennos et al. 2003a. "Glacial refugia: Hotspots but not melting pots of genetic

diversity". Science 300:1563-1565.

Petit, R. J., C. Bodénès, A. Ducousso, G. Roussel y A. Kremer. 2003b. "Hybridization as a

mechanism of invasion in oaks". New Phytologist 161:151-164.

Pigliucci, M. 2005. "Evolution of phenotypic plasticity: where are we going now?" Trends

in Ecology & Evolution 20:481-486.

Queitsch, C., T. A. Sangster y S. Lindquist. 2002. "Hsp90 as a capacitor of phenotypic

variation". Nature 417:618:624.

Ribera, I. y J. Blasco-Zumeta. 1998. "Biogeographical links between steppe insects in the

Monegros region (Aragon, Spain), the eastern Mediterranean, and central Asia".

XXVII

Journal of Biogeography 25:969-986.

Sultan, S. E. 1987. "Evolutionary implications of phenotypic plasticity in plants".

Evolutionary Biology 21:127-178.

Sultan, S. E. y F. A. Bazzaz. 1993. "Phenotypic plasticity in Polygonum persicaria. I.

Diversity and uniformity in genotypic norms of reaction to light". Evolution

47:1009:1031.

Takhtajan, A. 1986, Floristic Regions of the World. Berkeley, University of California

Press.

Valladares, F., L. Balaguer, E. Martínez-Ferri, E. Pérez-Corona y E. Manrique. 2002.

"Plasticity, instability and canalization: is the phenotypic variation in seedlings of

sclerophyll oaks consistent with the environmental unpredictability of

Mediterranean ecosystems?" New Phytologist 156:457-467.

Vargas, P. y J. W. Kadereit. 2001. "Molecular fingerprinting evidence (ISSR, Inter-Simple

Sequence Repeats) for a wild status of Olea europaea L. (Oleaceae) in the

Eurosiberian North of the Iberian Peninsula." Flora 196:142-152.

Verdú, M., P. Dávila, P. García-Fayos, N. Flores-Hernández y A. Valiente-Banuet. 2003.

"‘Convergent’ traits of mediterranean woody plants belong to pre-mediterranean

lineages". Biological Journal of the Linnean Society 78:415–427.

Waddington, C. H. 1959. "Canalization of development and genetic assimilation of

acquired characters". Nature 183:1654-1655.

Wendel, J. F. 2000. "Genome evolution in polyploids". Plant Molecular Biology 42:225-

249.

1

I. Introducción General

2

El ajuste funcional entre los organismos y el medio en el que viven es el principal

motor de la biodiversidad, puesto que no son sino las múltiples estrategias a través de las

que los sistemas biológicos sacan partido de los recursos disponibles las que dan lugar a la

enorme variedad del mundo vivo (Darwin 1859; Ackerly 2004). Cada una de estas

estrategias es, de forma aislada, el resultado de una multitud de factores, algunos difíciles

de cuantificar y aún de aprehender, cuya interacción origina la aparición de fenotipos

específicos. El número de fenotipos posibles es siempre e inevitablemente superior al de

los observables, que se limita a la manifestación en un punto en el tiempo de una cuantía

determinada de genotipos en una serie de ambientes concreta. Las relaciones de causalidad

son complejas, pero es razonable suponer que el elenco de fenotipos observables será

mayor cuanto mayor sea el número de genotipos y de ambientes. Así, la heterogeneidad

espacial y temporal inherentes al entorno Mediterráneo posibilitan la coexistencia en

espacios relativamente reducidos de características fenotípicas múltiples (Blondel y

Aronson 1999). En el mundo vegetal se observan, sin embargo, ciertos patrones

fenotípicos cuya difusión está más generalizada. Algunas de las estrategias que parecen

resultar particularmente exitosas en las plantas mediterráneas son la presencia de órganos

subterráneos de reserva, asociada al gran número de geófitos, los ciclos de vida breves (los

terófitos constituyen el grupo vegetal más diverso con cerca del 50% de las especies) y,

entre la especies leñosas, la esclerofilia. Este síndrome funcional se caracteriza por la

presencia de hojas perennes, rígidas, con cutícula espesa, baja relación área / volumen y en

general de larga permanencia (Font Quer 1982; Blondel y Aronson 1999). La esclerofilia

aparece en grupos taxonómicos diversos, con aparente independencia de su origen

filogenético o del grupo funcional al que pertenezcan. Se observa en matas (Helianthemum

3

spp., Cistaceae; Thymus spp., Labiatae), en arbustos como el arrayán (Myrtus communis,

Myrtaceae), el durillo (Viburnum tinus, Viburnaceae) o las jaras (Cistus spp. Cistaceae), en

trepadoras como la zarzaparrilla (Smilax aspera, Smilacaceae) y por supuesto en árboles

tan importantes en el paisaje ibérico como la encina (Quercus ilex , Fagaceae), la coscoja

(Q. coccifera), el alcornoque (Q. suber) y el acebuche (Olea europaea var. sylvestris,

Oleaceae). El hecho de que taxones de origen tan distinto presenten rasgos fenotípicos

comunes ha sido considerado históricamente como un caso de convergencia evolutiva,

como el resultado de la adaptación a las condiciones propias del ambiente mediterráneo

(Dunn et al. 1976). Un argumento que apoya esta idea es que la esclerofilia es común no

sólo en la cuenca del Mediterráneo, sino que también aparece en muchas especies del resto

de regiones florísticas con clima mediterráneo del globo (la zona central de Chile;

California, EEUU; la región florística del Cabo, África del Sur; sur y sur-oeste de

Australia). Desde un punto de vista funcional se ha asociado la esclerofilia a la resistencia

al estrés hídrico y de esta manera al mantenimiento de la actividad fotosintética aún

durante el periodo de sequía estival (Dunn et al. 1976). Aunque la hipótesis de

convergencia puede parecer convincente, el trabajo de diversos autores a lo largo de los

últimos quince años demuestra que la esclerofilia ya aparecía de manera generalizada

durante el Mioceno tardío, mucho antes del advenimiento del clima Mediterráneo, que se

supone tuvo lugar hace unos tres millones de años (Suc 1984). El registro fósil terciario

muestra gran parte de los taxones exclerófilos como ya diferenciados en aquel momento,

cuando las condiciones ambientales imperantes eran similares a las actualmente asociadas

con ambientes tropicales y subtropicales de laurisilva(Herrera 1992; Uzunova et al. 1997;

Verdú et al. 2003). El conjunto de caracteres que definen al síndrome esclerófilo no supone

entonces una una adaptación a las condiciones selectivas presentes. Se puede considerar

4

que la esclerofilia es un caso de exaptación, en el que un fenotipo aparecido como

respuesta funcional a presiones pretéritas se ha mantenido por inercia hasta nuestros días

(Gould y Vrba 1982).

Independientemente de la antigüedad de su origen, no cabe duda de que muchos de

los taxones esclerófilos son exitosos en las condiciones actuales. Su abundancia y

frecuencia en cualquier punto del Mediterráneo no dejan lugar a dudas sobre la eficacia de

su respuesta funcional. Pero la permanencia a lo largo del tiempo en una determinada

región ha supuesto también una respuesta positiva ante factores bióticos y abióticos muy

variables, en ocasiones marcadamente distintos de aquellos frente a los que primeramente

se desarrollaron muchos de sus caracteres funcionales. Al tener esto en cuenta, cabe

plantearse cuál es la habilidad de las plantas esclerófilas para expresar fenotipos

alternativos en respuesta a cambios ambientales, espaciales y/o temporales (Valladares et

al. 2002).

Uno de los aspectos que más peso ha ganado en lo últimos años en el campo de la

ecología evolutiva de plantas es la plasticidad fenotípica (Pigliucci 2005). Se entiende por

tal la capacidad de un fenotipo para expresar fenotipos diferentes en situaciones

ambientales distintas (Schlichting y Pigliucci 1998). La manifestación de la plasticidad se

suele expresar por medio de gráficos conocidos como “normas de reacción” (reaction

norms) en los que se representa en el eje de abcisas los distintos valores ambientales y en

el de ordenadas los fenotípicos (Figura 1). El concepto de la plasticidad fenotípica en sí

mismo nunca ha sido cuestionado, ya que es fácilmente observable en la naturaleza y en la

agricultura, pero sí ha sido de alguna manera obviado por el cuerpo principal u

“ortodoxo”de la teoría evolutiva hasta los años 80 del s. XX (Schlichting y Pigliucci 1998).

5

I. I La plasticidad fenotípica y el cambio evolutivo. Un marco histórico

En este punto hay que señalar que la importancia evolutiva del cambio fenotípico

fue apreciada desde muy pronto. Se suele considerar que el trabajo que sentó las bases

conceptuales de la plasticidad fenotípica y las “normas de reacción” fue un artículo

publicado por J. M. Baldwin a finales del s. XIX (Baldwin 1896). En él se planteó la teoría,

que luego se ha venido a llamar “efecto Baldwin”, según la cual aquellos individuos

capaces de responder de manera más acusada ante nuevas circunstancias ambientales (más

plásticos diríamos hoy en día) tienen mayor probabilidad de sobrevivir y engendrar

descendientes, condicionando así el proceso evolutivo. El desarrollo posterior de las ideas

de ese trabajo estrictamente teórico, planteado en apoyo del principio darwinista de

selección natural y como una refutación de las teorías lamarckistas, fue paralelo al de la

teoría evolutiva y genética, siendo el propio W. Johannsen, responsable del concepto de

genotipo y fenotipo, uno de los primeros en abogar por la importancia de la evolución

fenotípica (Johannsen 1911). Es difícil establecer el momento en que la aproximaciones

basadas en el cambio fenotípico desaparecen de los planteamientos mayoritarios de la

teoría evolutiva (para una revisión exhaustiva, ver (Sarkar 1999)). Sin duda uno de los

factores que contribuyeron a su salida de los escenarios de debate científico fue el

planteamiento de hipótesis difíciles de asimilar por la teoría sintética de la evolución, si

bien Dobzhansky fue uno de sus paladines. Otros motivos, quizá los más importantes,

estuvieron ligados a la historia política de mediados del siglo XX. Uno de los principales

teóricos de la plasticidad fenotípica, Schmalhausen, era soviético y rival de Lysenko. En el

mundo occidental era difícil defender, e incluso llegar a conocer (aunque su libro de 1946

“Factors of Evolution: the theory of stabilizing selection” se publicó en inglés en 1949), las

ideas de un ruso y en Rusia se le prohibió trabajar a partir del ascenso de Lysenko. A pesar

6

de los impedimentos, un grupo reducido de autores publicó en los años 40, 50 y 60 trabajos

que aún hoy constituyen obras de referencia en el campo de la evolución fenotípica.

Probablemente el más famosos de esos autores sea C. H. Waddington, quien demostró el

fenómeno de la asimilación genética (Waddington 1942; Waddington 1956). Éste consiste

en la capacidad de heredar un fenotipo inducido por el ambiente una vez desaparecido el

estímulo ambiental. Los trabajos de Waddington, como los de otros autores, son de

innegable importancia. Aún así no fueron asimilados realmente por la corriente principal

de la ecología evolutiva hasta los años 80. En el mundo de la ecología vegetal hay que

destacar el trabajo publicado por A. D. Bradshaw en 1965 en Advances in Genetics titulado

“Evolutionary significance of phenoypic plasticity in plants” (Bradshaw 1965) tanto por su

calidad científica como por su papel en el mantenimiento de una corriente de pensamiento.

Los años 80 supusieron el punto de inflexión en la investigación del cambio

fenotípico. A partir de ese momento investigadores como R. Lande, S. Via, S. J. Arnold, C.

D. Schlichting o S. M. Scheiner generaron un marco teórico y experimental que demostró

la importancia innegable de la respuesta fenotípica en la evolución. Desde entonces la

plasticidad fenotípica ha sido un elemento cualitativa y cuantitativamente de primer orden

en la teoría evolutiva. En las dos últimas décadas la plétora de trabajos publicados

relacionados con este tema y sus mecanismos moleculares ha sido formidable. Como

muestra baste señalar que el número de artículos encontrados por el buscador Google

Scholar publicados en los últimos 15 años con “phenotypic plasticity” en el título es de

740. Es muy difícil señalar sólo unos pocos aunque cabe destacar los siguientes: la

demostración del papel de las proteínas de choque térmico en la asimilación genética

(Rutherford y Lindquist 1998; Queitsch et al. 2002), la demostración de la importancia del

efecto Baldwin en la colonización de nuevos nichos (Yeh y Price 2004) y los de evaluación

7

de la importancia de la plasticidad fenotípica en la diferenciación poblacional de especies

vegetales y como mecanismo para la selección de nicho por parte de las plantas (Donohue

et al. 2000; Donohue et al. 2001; Donohue 2003; Donohue et al. 2005). También en el

campo “vegetal” no se puede dejar de mencionar por lo prolífico y la calidad de su obra a

C. D. Schlichting y a M. Pigliucci.

El creciente interés de la ecología evolutiva por la plasticidad fenotípica ha tenido

su reflejo, como no podía ser de otra manera, en el ámbito mediterráneo. En California los

trabajos de D. Ackerly han supuesto interesantes aportaciones experimentales y teóricas

(Knight y Ackerly 2003; Wong y Ackerly 2005). En Europa han sido muchos los autores

que han abordado el papel de la modulación de la respuesta fenotípica en la ecología

vegetal (entre los españoles no puede dejar de mencionarse a F. Valladares, y entre los

mediterráneos, a A. Novoplansky). No obstante, son relativamente pocos aquellos trabajos

que, versando sobre especies leñosas, incorporen componentes evolutivos. Hay una serie

de condicionantes que son difíciles de soslayar en el estudio de las leñosas mediterráneas.

Por una parte la duración de las distintas fases vitales convierte en impracticables los

estudios en condiciones controladas de caracteres cuantitativos, salvo que se consideren

aquellos expresados en la fase de plántula, rasgos cuya repercusión en la descendencia es

difícil de estimar. Por otra parte, la heterogeneidad ambiental que se recoge en los

experimentos de jardín común (common garden) es una simplificación de la

heterogeneidad a la que deben hacer frente las planta en sus poblaciones naturales

(Cavender-Bares et al. 2004). Por añadidura, los fenotipos expresados en esas condiciones

no responden sino a un número reducido de meses de crecimiento, y pueden no ser

representativos del rango fenotípico potencial de seres cuya longevidad supera con

frecuencia el siglo. En cualquier caso, estimar cuál es y ha sido el papel de la plasticidad

8

fenotípica en la respuesta de síndromes de caracteres aparentemente estáticos a

condiciones ambientales cambiantes no deja de ser un reto para entender la evolución de la

vegetación mediterránea (Balaguer et al. 2001; Valladares et al. 2002).

Otra dificultad que aparece a la hora de abordar ensayos evolutivos con especies

que pueden alcanzar gran tamaño y son de vida larga es la adecuada representación de la

variabilidad genética en los experimentos de vivero. Es inapropiado afirmar que el número

y la naturaleza de los genotipos incluidos en cualquier experimento son los adecuaos para

explicar el comportamiento evolutivo de una población, y mucho menos de una especie.

Fenómenos frecuentes tales como la hibridación, de mucha importancia en ecología y

evolución de plantas (Fischer et al. 2003; Hegarty y Hiscock 2005), pueden estarse

obviando inadvertidamente al escoger sólo unos pocos propágulos de naturaleza

taxonómica bien definida. Por supuesto no es posible hablar del devenir evolutivo de un

elemento de estudio, ya sea este una población o cualquier otra unidad taxonómica, sin

tener en cuenta los patrones que lo relacionan con sus parientes y la historia evolutiva de

sus antepasados.

En el presente trabajo de tesis se han escogido dos especies emblemáticas del

mediterráneo, cómo son la coscoja (Quercus coccifera L.) y el acebuche (Olea europaea

var. sylvestris L.) para abordar el estudio de procesos microevolutivos en las especies

esclerófilas.

9

I. II Antecedentes del estudio microevolutivo de las esclerófilas mediterráneas

I. II. I DIFERENCIACIÓN GENÉTICA

La diversidad genética de las plantas mediterráneas se ha visto condicionada por

una serie de procesos históricos que han determinado la estructura de las poblaciones

actuales. En concreto, los procesos subsiguientes al último máximo glacial, tanto los

“naturales” como los relacionados con la actividad humana, han contribuido en gran

medida a la situación presente, particularmente en especies cuya distribución ha cambiado

mucho debido a su expansión durante el Holoceno, como es el caso de las plantas de zonas

mediterráneas (Olalde et al. 2002). La influencia de la recolonización posglacial en la

estructura genética de las especies leñosas de zonas templadas ha sido bien estudiada en

muchos casos, constituyendo el cuerpo básico de lo que se ha venido en llamar

“filogeografía”. En el caso de las dos especies que nos ocupan, han sido muchos los

trabajos que se han ocupado de ellas. Conviene señalar que tanto en la coscoja como en el

acebuche la diversidad genética está condicionada por la introgresión, en el caso de aquella

con otras especies del género Quercus y en el de éste con el olivo cultivado

El acebuche en particular ha sido objeto de un gran número de estudios de corte

filogeográfico (Hess et al. 2000; Besnard et al. 2002c; Lumaret et al. 2002). Gracias a

estos trabajos se sabe que existe una diferenciación genética entre las zonas Este y Oeste

del Mediterráneo y que la mayor diversidad se encuentra en esta última. Dentro de la zona

Oeste, parece ser que el Sur de la Península Ibérica y el Norte del Mahgreb son las zonas

donde se concentra un mayor número de linajes (Lumaret et al. 2004).

La influencia de la hibridación con el olivo en la estructura genética poblacional

tiene su contraparte en la influencia de la reticulación en la estructura filogenética del

10

acebuche. Estos aspectos se han abordado en el capítulo 3 usando marcadores dominantes

AFLPs. En este mismo capítulo se analiza la estructura filogeográfica del Mediterráneo

occidental para estimar procesos de divergencia cuaternarios en esta región, así como para

localizar de forma precisa los posibles refugios glaciales de O. europaea. Un análisis

filogenético más pormenorizado de este taxon se presenta en los apéndices.

En cuanto a la coscoja, el número de trabajos publicados es menor, si bien el género

Quercus es uno de los mejor estudiados por la filogeografía. Los trabajos publicados hasta

el momento no establecen una separación clara a nivel molecular entre encina y coscoja, lo

que podría ser debido a los frecuentes casos de hibridación entre ambas especies (Jiménez

et al. 2004; López de Heredia et al. 2005).

El impacto de la hibridación sobre la estructura genética de la coscoja ha sido

abordado mediante el uso de marcadores genéticos, tanto de tipo huella genética (ISSR)

como con secuencias nucleares (ITS) en el capítulo 1, y su diferenciación genética

poblacional dentro de la Península Ibérica en el capítulo 2.

I. II. II DIFERENCIACIÓN FENOTÍPICA

La literatura sobre los posibles cambios funcionales asociados a la diferenciación

poblacional reciente no es igual de abundante que la generada sobre los cambios en la

estructura genética, a pesar de que la relación entre diversidad genética y variabilidad

fenotípica es de sumo interés para la gestión de recursos fitogenéticos. Hay por supuesto

trabajos interesantes, y en el caso particular de Q. coccifera, hay que destacar el artículo

publicado por Balaguer y colaboradores en 2001 en Functional Ecology que ya planteó la

posibilidad de una diferenciación funcional asociada a diferencias genéticas y relacionada

con diferencias en la plasticidad fenotípica poblacional (Balaguer et al. 2001). No ha sido

posible encontrar un trabajo equivalente en O. europaea, por lo que los resultados

11

presentados en esta tesis pueden constituir la primera caracterización fenotípica de

poblaciones de acebuches.

Los caracteres funcionales que se han analizado están todos ellos relacionados con

la respuesta a la luz. La respuesta a la luz integra la respuesta a otros factores ambientales,

puesto que la respuesta fenotípica de las plantas está modulada de forma simultánea por

todos los factores necesarios para su desarrollo (Gleeson y Tilman 1992). Se ha intentado

usar caracteres que reflejaran diferentes escalas de respuesta, desde el ciclo de las

xantofilas, que varía de forma mensurable en cuestión de horas, hasta caracteres

morfológicos de la hoja y la arquitectura de la copa que son el resultado de procesos

ontogenéticos más lentos. Todos ellos se midieron en campo en individuo adultos durante

la parada vegetativa estival.

El análisis de las diferencias fenotípicas existentes entre distintas poblaciones

ibéricas de coscoja se aborda en el capítulo 2, mientras que las referentes al acebuche se

tratan en el capítulo 4. En ambos casos además de estimar las diferencias fenotípicas se

estudia en qué medida son congruentes éstas con los patrones genéticos.

12

I. III Objetivos

A lo largo de esta tesis se ha intentado determinar los aspectos evolutivos del

cambio en la estructura genética y fenotípica de dos especies esclerófilas (Q. coccifera y O.

europaea) que se pueda vincular con procesos microevolutivos. Por medio del estudio de

la relación entre variabilidad genética y fenotípica en estas dos especies se ha intentado dar

respuesta a una serie de interrogantes sobre los agentes causales y las consecuencias dela

evolución reciente de las esclerófilas mediterráneas.

1- La permanencia del síndrome esclerófilo a lo largo del tiempo está bien

establecida, pero ¿En qué medida implica esta estabilidad fenotípica una falta de

diversificación genética? O de otra manera ¿ cuáles son lo procesos de divergencia

genética en esclerófilas mediterráneas?. La determinación de los procesos de divergencia

genética, así como de los mecanismos condicionantes de la misma, se han visto de alguna

manera reflejados en todos los capítulo de la tesis, pero han sido analizados de manera

específica en los Capítulos 1 y 3 y en el Apéndice 1.

2- La aparente estabilidad evolutiva del síndrome esclerófilo ¿supone la no

existencia de procesos de diferenciación fenotípica entre poblaciones?. La diferencias

fenotípicas existentes entre poblaciones conespecíficas de esclerófilas mediterráneas se han

analizado en los Capítulos 2 y 4. En estos trabajos se han analizado paralelamente las

características ambientales y genéticas de estas poblaciones para esclarecer las causas y

efectos de los posibles procesos de divergencia fenotípica poblacional.

3- Si estos procesos existen ¿en qué medida se deben al papel de la plasticidad

fenotípica? ¿es la plasticidad fenotípica un factor importante en la respuesta evolutiva de

las esclerófilas mediterráneas?.

13

I. III. I EL POSIBLE PAPEL DE LA PLASTICIDAD FENOTÍPICA

La importancia evolutiva de la plasticidad fenotípica está actualmente bien

establecida y se comienzan incluso a conocer los mecanismos moleculares subyacentes

(Queitsch et al. 2002). En organismos modelo como Arabidopsis thaliana se comienzan a

desentrañar los cauces a través de los cuales la plasticidad condiciona el proceso evolutivo

e incluso hay modelos mecanicistas para su estimación (Callahan et al. 2005; Donohue et

al. 2005). A pesar de este buen conocimiento del tema, todavía son pocos los trabajos en

los que se haya cuestionado el papel que puede haber jugado la plasticidad fenotípica en la

respuesta evolutiva de plantas leñosas a los cambios ambientales. El caso de la esclerofilia,

por ser un síndrome funcional terciario, es quizá adecuado como modelo. Es posible

evaluar la respuesta que las plantas mediterráneas a las condiciones climáticas actuales.

Además se puede establecer en qué medida esta respuesta está relacionada con procesos de

colonización más o menos reciente de nuevos hábitats, bien sea debido a la expansión pos-

glacial o a otros motivos. Entonces, si la plasticidad fenotípica es cuantificada, se podrá

estimar si hay cambios fenotípicos o genéticos asociados a variaciones en la plasticidad.

En esta tesis la plasticidad fenotípica se ha medido sobre los mismos caracteres que

los valores medios. Todas las medidas se tomaron en campo. Ahí se consideró a la zona

más expuesta a la luz en orientación Sur de la copa de los árboles como un ambiente

diferente (Sol) del experimentado por los órganos vegetativos en la zona más interna de la

orientación Norte (Sombra). La plasticidad fenotípica se cuantificó como la diferencia de

fenotipo para cada genotipo (árbol individual) entre estos dos ambientes

Las diferencias en plasticidad entre poblaciones de coscoja y su relación con los

valores fenotípicos medios y con la estructura genética se estudian en el capítulo 2.

14

El acebuche presenta un modelo doblemente adecuado. Además de los procesos de

recolonización del continente europeo durante el Holoceno, la colonización de los

archipiélagos macaronésicos de Canarias y Madeira que dio lugar a dos subespecies

diferentes (cada una endémica de un archipiélago) durante el Terciario permite estudiar los

patrones de diferenciación en condiciones ambientales muy distintas. Esto constituye el

núcleo del capítulo 4.

Si la plasticidad fenotípica ha mediado en alguna medida el cambio evolutivo es

razonable suponer que fuerzas selectivas hayan actuado sobre ella. Un aproximación

analítica a esta hipótesis se plantea también en el capítulo 4.

15

I. IV Figura 1

Figura 1: norma de reacción teórica mostrando los valores fenotípcos de dos genotipos en dos ambientes a y b hipotéticos

Ambiente

a b

Val

or F

enot

ípic

o

0

2

4

6

8

10

12

Genotipo 1Genotipo 2

16

Capítulo 1

MOLECULAR EVIDENCE FOR WIDESPREAD HYBRIDISATION AND

LIMITED GENETIC STRUCTURE OF QUERCUS COCCIFERA L. IN THE IBERIAN

PENINSULA REVEALED BY ISSR AND ITS SEQUENCE DATA.

Autores:

Rafael Rubio de Casas * †; Emilio Cano †; Luis Balaguer *; Esther Pérez-Corona

‡; Esteban Manrique §; Carlos García-Verdugo * † and Pablo Vargas †

* Departamento de Biología Vegetal 1, Universidad Complutense de Madrid. José Antonio

Novais 2, 28040 Madrid, Spain. † Real Jardín Botánico de Madrid, CSIC, Plaza Murillo 2, 28014

Madrid, Spain. ‡ Departamento de Ecología, Universidad Complutense de Madrid. José Antonio

Novais 2, 28040 Madrid, Spain. § Centro de Ciencias Medioambientales, CSIC, Serrano 115

Dpdo., 28006 Madrid, Spain.

17

1. 1 Summary

Interspecific introgression in oaks is a well-known phenomenon whose ecological

and evolutionary consequences, although essential, are still unclear. We investigated

molecular evidence for hybridisation in natural populations of kermes oak (Quercus

coccifera L.) in the Iberian Peninsula. Additive patterns in nrDNA ITS sequences revealed

that hybrid individuals showing intermediate genotypes between kermes and holm oak (Q.

ilex L.) are very common, although morphological hybrids are uncommon. Bayesian

analysis of ISSR fingerprinting patterns indicated extensive gene-flow among populations

and neighbouring Quercus taxa. Hybridization appeared to affect actively the pair Q.

coccifera-Q. ilex, but no evidence supporting hybridisation between Q. coccifera and co-

occurring Quercus species other than holm oak was found. The role of canalisation in the

maintenance of a stable morphology in the face of extensive introgression is discussed.

18

1. 2 Introduction

Interspecific gene flow within species complexes is a key question of evolutionary

biology (Arnold 1997). The genus Quercus (oaks) constitutes one of the plant systems

where this subject has been studied in more detail (Muir et al. 2000) since the facility with

which oaks interbreed make them a model of syngamenon, where almost all crosses are

possible within certain groups. The stability of oak species in the face of frequent

interspecific gene exchange has long been regarded as an intriguing phenomenon, leading

some authors to question the validity of the biological species concept in oaks (Van Valen

1976). Recent research has proved the importance of interspecific introgression in Quercus

to enable colonisation of novel habitats and to respond to varying environmental selective

pressures (Petit et al., 2003; Dodd y Afzal-Rafii, 2004).

In the Mediterranean region, evergreen oaks dominate most forest habitats

(Takhtajan 1986). Three species are particularly important in the Iberian Peninsula: Holm

oak (Quercus ilex), cork oak (Q. suber) and kermes oak (Q. coccifera). Although their

distribution and habitat are overlapping, ecological differences among them exist, with Q.

coccifera occupying the most arid and disturbance-prone environments, predominantly on

limestone substrates (Blanco Castro et al. 1997; López González 2002; Cañellas y San

Miguel 2003). Interspecific gene flow has been described for the species pairs Q. coccifera

- Q. ilex and Q. suber – Q. ilex (Belahbib et al. 2001; Lumaret et al. 2002). Gene exchange

between Q. coccifera and Q. ilex appears to be so frequent as to lead to complete sharing

of cpDNA haplotypes (Jiménez et al., 2004; López de Heredia et al, 2005). In spite of the

apparent lack of reproductive barriers, intermediate morphological forms between both

species are rarely observed and diagnostic characters enable the unambiguous assignment

of most individuals. The fact that kermes and holm oak remain distinct species in spite of

19

ecological similarities and frequent hybridisation raise interesting questions concerning the

evolutionary relationships between the two taxa and the causes and consequences of gene

exchange.

Hybrisation in oaks has been studied with several molecular tools, including both

plastid and nuclear DNA. However, few studies have used the internal transcribed spacer

of ribosomal DNA (ITS) sequences at the population level, in spite of its potential as both

a taxonomic tool (Manos et al. 1999) and to determine reticulation processes (Nieto et al.

2001; Fuertes Aguilar y Nieto Feliner 2003). Muir et al. (2001) demonstrated that the

nrDNA of Quercus is subject to concerted evolution, although several paralog ITS copies

co-occur in the genome of oaks (Mayol y Rosselló 2001). Nevertheless, concerted

evolution is not uniform across the ITS region (Fuertes Aguilar et al. 1999) and differences

in homogenisation among sites can supply valuable information to infer patterns of

reticulated evolution (Sang et al. 1995; Vargas et al. 1999). ITS sequences are powerful

tools for detecting hybridisation events, but their lack of variability at the infra-specific

level may be a drawback for their application in population studies. Conversely, nuclear

fingerprinting techniques such as RAPD, ISSR or AFLP provide genome-wide highly

variable information. In particular, ISSR have proved to be good molecular tools for the

study of hybrid complexes (Wolfe et al. 1998; James y Abbott 2005)

In the present paper we used ITS sequences and inter-simple sequence repeats

(ISSR) to estimate the consequences of interspecific hybridisation on the genetic structure

of Q. coccifera populations in the Iberian Peninsula. We particularly addressed the

following questions:

1) Are phylogenetic relationships affected by interspecific gene-flow?.

20

2) Can ongoing hybridisation be detected in morphologically unambiguous

individuals?

3) Is hybridisation restricted to crosses with Q. ilex?

21

1. 3 Material and Methods

1. 3. 1 PLANT MATERIAL AND DNA EXTRACTION

A total of 87 plants were sampled in 9 populations (Figure 1). In each population,

leaf material was collected in the field from 9 individuals of Quercus coccifera and from

all individuals of any other Quercus species found within or adjacent to the Kermes oak

populations. DNA was e