UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES...
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UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES UNIANDES FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA TEMA: EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL Y EXTRACTO ETANÓLICO DE ZANAHORIA (Daucus carota) FRENTE A STREPTOCOCCUS MUTANS AUTOR: Q.F TUMBACO LINO PAUL LEONEL ASESORES: DR. VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO, MSc. ING. OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, MSC PHD (C) . AMBATO-ECUADOR 2018
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UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES
UNIANDES
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO
ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL Y
EXTRACTO ETANÓLICO DE ZANAHORIA (Daucus carota) FRENTE A
STREPTOCOCCUS MUTANS
AUTOR: Q.F TUMBACO LINO PAUL LEONEL
ASESORES: DR. VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO, MSc.
ING. OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, MSC PHD(C).
AMBATO-ECUADOR
2018
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN:
Quienes suscribimos, legalmente CERTIFICA QUE: El presente Trabajo de
Titulación realizado por el Q.F Paul Leonel Tumbaco Lino, maestrante del
Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias
Médicas, con el tema “EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE
ESENCIAL Y EXTRACTO ETANÓLICO DE ZANAHORIA (Daucus carota)
FRENTE A STREPTOCOCCUS MUTANS ”, ha sido prolijamente revisado, y
cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente de la
Universidad Regional Autónoma de los Andes -UNIANDES-, por lo que
apruebe su presentación.
Ambato, Mayo del 2018
___________________________________ _______________________________
Dr. Viteri Rodríguez Juan Alberto. Ing. Oña Cisneros Fabián David.
ASESOR ASESOR
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Q.F Paul Leonel Tumbaco Lino, maestrante del Programa de Maestría de
Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que
todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a
la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLINICA Y
HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a
excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.
Ambato, Mayo 2018
______________________________
Q.F. Paul Leonel Tumbaco Lino
CI. 1312677931
Autor
DERECHOS DEL AUTOR
Yo, Q.F Paul Leonel Tumbaco Lino, declaro que conozco y acepto la
disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad
Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El
patrimonio de la UNIANDES está constituido por:” La propiedad intelectual
sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos
profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de
ella;
Ambato, Mayo 2018
______________________________
Q.F. Paul Leonel Tumbaco Lino
CI. 1312677931
Autor
DEDICATORIA
El presente proyecto de investigación se la dedico a mi Mamá (Gladys Lino), a
mi Hermano (Freddy Tumbaco), a mi Esposa (Denisse Moran), A mi hijo (Ian
Tumbaco), quiénes supieron guiarme por el buen camino, darme fuerzas para
seguir adelante y por ayudarme a enfrentar las adversidades sin perder nunca
la esperanza, ni rendirme en el intento.
Paul Tumbaco
RESUMEN
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que el 80 por ciento de la
población mundial utiliza actualmente hierbas medicinales para algún aspecto
de la atención primaria. Por la cual se evaluará el efecto in vitro antimicrobiano
de aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota frente a Streptococcus
mutans. La misma se basó en tres etapas: estudio etnofarmacológico,
preparación de extracto y aceite esencial, y análisis microbiológico. La presente
investigación indagó, a través de una encuesta aplicada en la ciudad de
Guayaquil con una población de 2450 personas, dando como resultado un
tamaño de muestra de 96 personas, sobre el uso de plantas medicinales. Entre
ellas, Daucus carota obtuvo un nivel de uso significativo del 50 % y un índice
de valor de uso igual a 0.03%, lo cual cumple con la aceptación cultural para
ser utilizado como tratamiento en los problemas de salud en la población. El
análisis fitoquímico de Daucus carota realizada mediante cromatografía líquida
mostró que la raíz contenía en mayor cantidad flavonoides y fenoles como
metabolitos secundarios. En el estudio microbiológico se utilizó el método de
difusión en disco para evaluar el efecto antimicrobiano en todas las
concentraciones; al 100% se obtuvo el mayor promedio de halo inhibitorio para
el aceite esencial y extracto etanólico, de 11,33mm y 12,33mm
respectivamente. Se realizó ANOVA para la estadística determinándose un
P<0,0001 para el extracto etanólico y aceite esencial de la zanahoria,
comprobándose que si existe un efecto antimicrobiano frente a Streptococcus
mutans.
Palabras clave: Daucus carota, Streptococcus mutans, aceite esencial,
extracto etanólico, halos de inhibición, concentración mínima inhibitoria
ABSTRACT
The World Health Organization (WHO) estimates that 80 percent of the world's
population currently uses herbal medicines for some aspect of primary care. By
which the in vitro antimicrobial effect of essential oil and ethanol extract of
Daucus carota against Streptococcus mutans will be evaluated. It was based on
three stages: ethnopharmacological study, preparation of extract and essential
oil, and microbiological analysis. The present investigation investigated, through
a survey applied in the city of Guayaquil with a population of 2450 people,
resulting in a sample size of 96 people, on the use of medicinal plants. Among
them, Daucus carota obtained a significant use level of 50% and an index of
use value equal to 0.03%, which meets the cultural acceptance to be used as a
treatment in the health problems in the population. The phytochemical analysis
of Daucus carota by means of liquid chromatography showed that the root
contained in greater quantity flavonoids and phenols as secondary metabolites.
In the microbiological study the disc diffusion method was used to evaluate the
antimicrobial effect in all concentrations; At 100%, the highest average inhibitory
halo was obtained for the essential oil and ethanolic extract, 11.33mm and
12.33mm respectively. ANOVA was performed for the statistics, determining a
P <0.0001 for the ethanolic extract and essential oil of the carrot, proving that
there is an antimicrobial effect against Streptococcus mutans.
Keywords: Daucus carota, Streptococcus mutants, essential oil, ethanol
extract, halos of inhibition, minimum inhibitory concentration
ÍNDICE GENERAL
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
DERECHOS DEL AUTOR
DEDICATORIA
RESUMEN
ABSTRACT
ÍNDICE GENERAL
INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1
Antecedentes de la investigación .................................................................... 1
Planteamiento del Problema ............................................................................ 2
Formulación del Problema ............................................................................... 3
Delimitación del Problema ............................................................................... 3
Objeto de Investigación ................................................................................... 4
Campo de Acción ............................................................................................ 4
Identificación de la Línea de Investigación ...................................................... 4
Objetivo General .............................................................................................. 4
Objetivos Específicos....................................................................................... 4
Hipótesis….. .................................................................................................... 5
Justificación Del Tema ........................................................................................ 5
Metodología ..................................................................................................... 6
Resumen de la estructura de la tesis ............................................................... 6
Marco teórico ................................................................................... 6
Epígrafe I. Estudio de la zanahoria ............................................................... 6
Epígrafe II. Preparación de extractos y aceites de zanahoria....................... 6
Epígrafe III Estudio de cepas de microorganismos ...................................... 6
Epígrafe IV. Métodos de extracción en fitoquímica ............................................. 7
Elementos de novedad .................................................................................... 7
Aporte Teórico ................................................................................................. 7
Significación Práctica ....................................................................................... 8
Novedad Científica........................................................................................... 8
CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO .................................................................... 9
1. Epígrafe I. Estudio de la Zanahoria ................................................. 9
1.1. Generalidades ................................................................................. 9
1.1.1. Taxonomía ...................................................................................... 9
1.1.2. Descripción botánica ....................................................................... 9
1.1.3. Usos ................................................................................................ 9
1.1.4. Funciones Medicinales .................................................................. 10
1.2. Epígrafe II. Preparación de Extractos y Aceites de Zanahoria ...... 10
1.2.1.Selección y recolección de especímenes de Daucus carota.................... 10
1.2.2. Obtención de Aceite Esencial y Extracto Etanólico de Daucus carota.. .. 10
1.3. Epígrafe III. Estudio de cepas de microorganismos ...................... 11
1.3.1. Streptococcus mutans ................................................................... 11
1.3.2. Morfología ..................................................................................... 11
1.3.3. Reproducción ................................................................................ 11
1.3.4. Crecimiento ................................................................................... 11
1.3.5. Clasificación del Streptococcus Mutans ........................................ 13
1.3.6. Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans
en cavidad oral .............................................................................................. 14
1.3.7. Patogenicidad ................................................................................ 16
1.3.8. Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana ................................... 16
1.3.9. Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus Mutans ................. 17
1.3.10. Potencia o actividad antimicrobiana .............................................. 18
1.3.11. Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales ....................... 19
1.3.12. Cepas Control ............................................................................... 19
1.4. Epígrafe IV. Métodos De Extracción En Fitoquímica ..................... 19
1.4.1. Extracción sólido-líquido ................................................................ 20
1.4.2. Maceración .................................................................................... 20
1.4.3. Percolación o lixiviación ................................................................ 20
1.4.4. Extracción líquido-líquido .............................................................. 21
1.4.5. Compuestos fenólicos ................................................................... 21
1.4.5.1. Análisis de fenoles totales. ............................................................ 22
1.4.5.2. Tamizaje fitoquímico ...................................................................... 22
1.5. Conclusiones del capítulo. ............................................................. 23
CAPÍTULO II. MARCO METODOLÓGICO ....................................................... 24
2. Caracterización del sector ............................................................. 24
2.1. Descripción del proceso metodológicos ........................................ 24
2.1.1. Etapa I: Estudio etnofarmacológico ............................................... 24
2.1.1.1. Criterios de inclusión ..................................................................... 24
2.1.1.2. Criterios de exclusión .................................................................... 24
2.1.1.3. Materiales y métodos: ................................................................... 25
2.1.2. Universo y muestra........................................................................ 25
2.1.3. Etapa II: Obtención de extracto y aceite esencial .......................... 26
2.1.3.1. Caracterización Botánica ............................................................... 26
2.1.3.2. Criterios de inclusión: .................................................................... 26
2.1.3.3. Criterios de exclusión: ................................................................... 26
2.1.3.4. Materiales y métodos: ................................................................... 26
2.1.3.4.1. Muestreo de una proporción ...................................................... 27
2.1.3.4.2. Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies. ................ 27
2.1.3.5. Recolección y acondicionamiento de la materia prima vegetal. .... 28
2.1.3.6. Operaciones previas: ..................................................................... 28
2.1.3.7. Material vegetal y obtención de los extractos. ............................... 28
2.1.3.8. Extracto Etéreo .............................................................................. 29
2.1.3.9. Extracto Etanòlico.......................................................................... 29
2.1.3.10. Destilación por arrastre de vapor................................................... 29
2.1.4. Pruebas analíticas ......................................................................... 29
2.1.5.Humedad ........................................................................................... 29
2.1.6. Cenizas totales .............................................................................. 30
2.1.6.1.Cenizas Totales en Agua ................................................................ 30
2.1.6.2.Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico. ............................................ 30
2.1.7.Obtención del aceite esencial vegetal ............................................... 31
2.1.8.Preparación y Obtención de extractos ............................................... 31
2.1.4. Etapa III: Procedimiento microbiológico para determinar el efecto
antimicrobiano de la zanahoria frente a S. mutans ........................................ 31
2.1.4.1.Cepa de microorganismo ................................................................ 31
2.1.4.2. Procedimiento Microbiológico ........................................................ 31
2.1.4.3. Evaluación de la actividad bacteriana del aceite y extracto
preparados con la técnica de difusión en disco. ............................................ 31
2.1.4.4. Materiales y métodos .................................................................... 32
2.1.4.5. Pruebas microbiológicas. .............................................................. 33
2.1.4.6. Diluciones del aceite esencial y extracto etanólico ........................ 34
2.1.5. Conclusiones del capítulo. ............................................................. 34
CAPÍTULO III. ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................... 35
2.ESTUDIO ETNOFARMACOLÓGICO DE PLANTAS MEDICINALES ............ 35
Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies. ................................ 37
Nivel de uso significativo (UST) .................................................................. 37
3.1.ANÁLISIS DE RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS. ................................ 39
3.2.Conclusiones del capítulo ........................................................................... 49
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
1
INTRODUCCIÓN
Antecedentes de la investigación
La Organización Mundial de la Salud (OMS), define a la Medicina Tradicional
(MT) como la suma de conocimientos, técnicas y prácticas fundamentadas en
las teorías, creencias y experiencias propias de diferentes culturas que se
utilizan para mantener la salud física y mental (1). Es importante mencionar
que la MT, también se conoce como: complementaria, alternativa, popular,
blanda, marginal, no oficial, no ortodoxa y no convencional (1).
Es un hecho que, en las últimas décadas la MT se ha difundido ampliamente a
nivel global incluyendo los países desarrollados, esto debido a los aspectos
migratorios, económicos, ineficacia e ineficiencia de la Medicina “convencional”
(MC) (1).
La medicina tradicional en Ecuador, al igual que en otros países andinos, es
una antigualla. Sus raíces pertenecen a un pasado de más de 10 mil años, su
vigencia ha continuado a lo largo de cinco siglos de regímenes coloniales y
republicanos. Dicha permanencia ha sido sostenida por los pueblos de más
bajos recursos: indios, mestizos, montubios y campesinos, quienes han
encontrado en la medicina tradicional una alternativa menos costosa y más
coherente con su cosmovisión (2)
Las plantas presentan un metabolismo secundario que les permite producir y
acumular compuestos de naturaleza química diversa. Estos compuestos se
denominan metabolitos secundarios, se distribuyen diferencialmente entre
grupos taxonómicos, presentan propiedades biológicas, desempeñan funciones
ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como
medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes y colorantes (3)
Los aceites esenciales se han estudiado como agentes antimicrobianos por su
amplio espectro de inhibición microbiana y su origen natural. Existe una gran
variedad de alimentos que contienen una mezcla de terpenos, terpenoides,
aldehídos y alcoholes que pueden actuar como antimicrobianos, tal es el caso
de la zanahoria, rábanos picantes, apio, ajo, cebollas entre muchos otros (4).
2
La zanahoria es una planta que se fija al suelo mediante una raíz ahusada, de
color entre blanco (variedades silvestres) y rojo-anaranjado, de la que brota un
tallo ramificado, anguloso, con hojas recortadas alternas. Su fruto es un
diaquenio (5). El extracto de zanahoria contiene un porcentaje considerable de
terpenos como el pineno, caratol, daucol, ácido isobutírico y asarona (6), estos
metabolitos secundarios son de conocida actividad antimicrobiana. Los
constituyentes mayoritarios del aceites esencial de semilla de zanahoria fueron
carotol (66.78%), dauceno (8.74%), (Z,Z)-farneseno (5.86%), germacreno D
(2.34%), trans-bergamoteno (2.41%), y -selineno (2.20%). Por su parte, carotol
(30.55%), ducol (12.60%) y capaenol (0.62%) fueron los componentes
principales del aceite comestible (7). La función conservadora de los aceites
esenciales se debe a que en su composición poseen compuestos tipo eugenol
o aldehído cinámico con poder antimicrobiano (8). La efectividad antimicrobiana
de los aceites esenciales se evidenció en el estudio realizado en Argelia, 2016,
para el aceite esencial obtenido de las partes aéreas (hojas, tallo) de D.
gracilis, el cual fue sometido a evaluación de su actividad antimicrobiana contra
cinco bacterias y tres hongos mediante difusión en agar método, producto de
este estudio se comprobó que el aceite esencial de D. gracilis inhibió
significativamente el crecimiento de Bacillus cereus y Proteus mirabilis con
concentraciones inhibitorias mínimas de 17,15 μg / ml mediante el método de
dilución en agar y 57,05 μg / ml y 114,1 μg / ml, respectivamente, mediante
microdilución líquida (9)
Planteamiento del Problema
La resistencia a los antimicrobianos, pone en peligro la eficacia de la
prevención y el tratamiento de las morbilidades provocadas por bacterias,
siendo una amenaza cada vez mayor para la salud pública, prolongando las
estadías hospitalarias, la utilización de fármacos más caros elevando los costos
médicos y aumentando la mortalidad (10)
El uso indiscriminado de antibióticos ha generado resistencia bacteriana, por lo
cual es preciso tener alternativas preventivas y terapéuticas, como los
propóleos a los cuales no se les ha descrito resistencia alguna (11)
3
Streptococcus mutans es un microorganismo cariogénico, cuenta con alta
prevalencia en el mundo entero (afectando del 95% al 99% de la población),
situándose como la principal causa de pérdida de dientes (10). Este
microorganismo en asociación con el Streptococcus sobrinus son
colonizadores tempranos del biofilm que rodea a los dientes mediante procesos
de adhesión y co-adhesión, su patogenicidad se ha demostrado en relación a la
producción de caries del esmalte, debido a la capacidad que poseen de
producir ácidos dando la característica fundamental de ser acidogénicos,
acidúricos y acidófilos a partir de la sacarosa (12)
El uso de los aceites esenciales de frutas y hortalizas como agentes
antibacterianos es bien conocido a nivel empírico (13), sin embargo, hay
escasas investigaciones de los metabolitos secundarios de Daucus carota
frente a Streptococcus mutans.
La falta de estudios completos de fitofármacos y difícil acceso a los
medicamentos a gran parte de la población obliga a desarrollar más
investigaciones fitoquímicas y farmacognósticas en Ecuador a fin de aportar al
desarrollo nacional y a la salud de la población.
Formulación del Problema
¿Cuál será el efecto antimicrobiano del aceite esencial y extracto etanólico de
la zanahoria (Daucus carota) frente a Streptococcus mutans?
Delimitación del Problema
La presente investigación se llevará a cabo en la ciudad de Guayaquil, Ecuador
con la muestra de zanahoria recolectada en los mercados del norte de la
ciudad, Mercado de Sauces 9 y Mercado de Sauces 4; misma que es
consumida como jugos y ensalada principalmente para comida, pero que no ha
merecido suficiente atención en su actividad antimicrobiana.
4
Imagen 1. Ciudad de Guayaquil, Ecuador. Tomado de Google Earth Pro bajo
licencia institucional.
Objeto de Investigación
Actividad antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de Daucus
carota frente a Streptococcus mutans
Campo de Acción
Actividad antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de Daucus
carota frente a Streptococcus mutans.
Identificación de la Línea de Investigación
Estudios Microbiológicos
Objetivo General
Evaluar el efecto in vitro antimicrobiano de aceite esencial y extracto etanólico
de Daucus carota frente a Streptococcus mutans
Objetivos Específicos
• Indagar sobre el uso de plantas medicinales en la población rural y
urbana de la ciudad de Guayaquil mediante la aplicación de una
encuesta.
5
• Analizar los compuesto fitoquímicos de Daucus carota mediante revisión
bibliográfica.
• Extraer el aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota
mediante destilación de arrastre de vapor.
• Medir la actividad bactericida y/o bacteriostática del extracto etanólico y
aceite esencial de Daucus carota mediante un ensayo microbiológico in
vitro frente a Streptococcus mutans.
Hipótesis
Hipótesis alternativa (H1): El aceite esencial y extracto etanólico de Daucus
carota a diferentes concentraciones tiene efecto antimicrobiano frente al
Streptococcus mutans.
Hipótesis nula (H0): El aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota a
diferentes concentraciones no tiene efecto antimicrobiano frente al
Streptococcus mutans.
Justificación Del Tema
Las enfermedades periodontales tienen una alta prevalencia constituyendo un
problema de salud pública, el uso de aceites esenciales se han estudiado como
agentes antimicrobianos por su amplio espectro de inhibición microbiana y su
origen natural, además tienen una probada actividad antimicrobiana contra las
bacterias de la cavidad oral, pero también han manifestado efectos secundarios
adversos, no satisfaciendo completamente los requerimientos para el
tratamiento de la enfermedad periodontal.
Con el estudio etnofarmacológico se pretende determinar el valor de uso de las
plantas y cuales acorde a la experiencia de las comunidades vale la pena
emprender una investigación.
La originalidad de este trabajo de investigación radica sobre la actividad
antimicrobiana del aceite esencial y del extracto etanólico de la zanahoria
frente a Streptococos mutans.
6
Metodología
En la presente investigación estuvo dividido en tres etapas: mediante el estudio
etnofarmacológico está dado bajo la modalidad cuali-cuantitativa de tipo
descriptiva y exploratoria, se utilizó la encuesta como instrumento. La segunda
etapa consiste en la obtención del aceite esencial y el extracto etanólico de la
zanahoria mediante destilación de arrastre de vapor y la tercera etapa está
basado en el análisis microbiológico mediante la técnica de difusión en disco
por triplicados embebidos en concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%, con
un control positivo la Amoxicilina y con el control negativo agua destilada. Para
terminar con un análisis estadístico ANOVA que permitirá establecer la
discusión final.
Resumen de la estructura de la tesis
• Marco teórico
Epígrafe I. Estudio de la zanahoria
1.1 Generalidades
1.1.1. Taxonomía
1.1.2. Descripción botánica
1.1.3. Usos
1.1.4. Funciones Medicinales
Epígrafe II. Preparación de extractos y aceites de zanahoria
1.2.1. Selección y recolección de especímenes de Daucus carota
1.2.2. Obtención del Aceite Esencial y extracto etanólico de Daucus carota
Epígrafe III Estudio de cepas de microorganismos
1.3.1. Streptococcus mutans
1.3.2. Morfología
1.3.3. Reproducción
7
1.3.4. Crecimiento
1.3.5. Clasificación del Streptococcus mutans
1.3.6. Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en
cavidad oral
1.3.7. Patogenicidad
1.3.8. Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana
1.3.9. Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus mutans
1.3.10. Potencia o actividad antimicrobiana
1.3.11. Actividad Antimicrobiana de los aceites esenciales
1.3.12. Cepas de control
Epígrafe IV. Métodos de extracción en fitoquímica
1.4.1. Extracción sólido-líquido
1.4.2. Maceración
1.4.3. Percolación o lixiviación
1.4.4. Extracción líquido-líquido
1.4.5. Compuestos fenólicos
1.4.5.1 Análisis de fenoles totales
1.4.5.2 Tamizaje fitoquímico
1.5. Conclusiones Parciales
Elementos de novedad
Aporte Teórico
La investigación aportará en reforzar los conocimientos de los mecanismos de
acción antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de la zanahoria
Daucus carota frente a la cepa de Streptococcus mutans, mediante el análisis
de los diversos metabolitos, en las diferentes revisiones bibliográficas tanto en
libros, artículos científicos, metaanálisis con la finalidad de proporcionar
información valiosa para futuras investigaciones y el desarrollo de fitofármacos
que presenten efectos adversos de menor frecuencia y menor intensidad.
8
Significación Práctica
El estudio fitoquímico de la zanahoria y la demostración del efecto
antimicrobiano del aceite esencial y extracto etanólico de esta raíz sobre
Streptococcus mutans aportará al desarrollo de fitofármacos que puedan ser
usados para prevenir y/o restaurar la salud oral. Un adecuado conocimiento de
las bondades terapéuticas de esta hortaliza de amplio cultivo en Ecuador
contribuirá al desarrollo de la industria fitoterapéutica aplicando el conocimiento
científico en los productos existentes en la naturaleza.
Novedad Científica
La determinación de la actividad antimicrobiana del aceite esencial y del
extracto etanólico de la zanahoria permitirá establecer su comportamiento en
Streptococos mutans. Este tipo de estudios son un pendiente en
fitofarmacología y microbiología a nivel nacional. Tanto los estudios
etnobotánicos como los farmacognósticos en Ecuador están en desarrollo y
pretenden utilizar el valioso recurso vegetal nacional como una fuente
inagotable de antimicrobianos que sustituyan a la medicina tradicional y que no
causen efectos secundarios.
9
CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO
1. Epígrafe I. Estudio de la Zanahoria
1.1. Generalidades
La carota, es una planta herbácea, bienal, que crece entre 30 y 60 cm,
con un tallo sólido, rígido. Las hojas son de forma triangular finamente
divididas y pinnadas. Las flores son pequeñas de un color blanco opaco,
agrupadas en planos, con umbelas densas. Estas umbelas son
terminales y de aproximadamente 8-10 cm de ancho (17).
1.1.1. Taxonomía
La zanahoria pertenece a la división magnoliophyta, del orden de las
apiales, familia apiaceae, género daucus, especie daucus carota (18).
1.1.2. Descripción botánica
El fruto de la Daucus Carota es pequeño, seco y duro, con pilosidades
alrededor. Presenta dos mericarpos y su endospermo crece antes del
embrión (19)
1.1.3. Usos
Como zanahoria cultivada, la raíz de D. carota es comestible mientras
joven, pero rápidamente se vuelve muy dura como para consumir. Las
flores a veces son aplastadas y fritas. Las hojas también son
comestibles pero no en grandes cantidades (20)
La recolección de la D. carota debe ser realizada con precaución porque
guarda una cercana similitud con la cicuta. Adicionalmente, las hojas de
la zanahoria salvaje pueden causar fitofotodermatitis (21). Las semillas
de zanahoria han sido utilizadas tradicionalmente en la elaboración de
preparados abortivos (22)
10
1.1.4. Funciones Medicinales
Existe reciente evidencia que apunta que gran cantidad de las
enfermedades padecidas por el ser humano aparecen en respuesta al
estrés oxidativo. El extracto oleico de la Daucus carota presenta alto
contenido de fenoles y flavonoides con altísimo poder antioxidante (23)
Se ha demostrado que la fracción de aceite de zanahoria exhibe una
composición química única, con significativo poder antioxidante incluso
con efecto hepatoprotector en células hepáticas con daño previamente
inducido (23).
El aceite esencial de la Daucus carota L. obtenido de las partes aéreas
al final del estadio de florecimiento fue reportado como antimicrobiano
en contra del germen enteropatógeno Campylobacter jejuni. La molécula
responsable de esta acción fue identificada como (E)-metilisoeugenol y
la elemicina (24).
1.2. Epígrafe II. Preparación de Extractos y Aceites de Zanahoria
1.2.1. Selección y recolección de especímenes de Daucus carota
Para la obtención de una muestra representativa de la especie vegetal
se tomaron alrededor de 500 gramos de planta. Se incluyeron todos los
rizomas frescos, sin cortes y sin daños. Se excluyen los rizomas
partidos, con daños de putrefacción o inmaduros.
1.2.2. Obtención de Aceite Esencial y Extracto Etanólico de Daucus
carota
La droga agotada con el éter etílico se extrae por maceración con etanol
al 75% (tres veces el peso del residuo en volumen) durante 48 horas se
obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar) (15)
11
1.3. Epígrafe III. Estudio de cepas de microorganismos
1.3.1. Streptococcus mutans
Se ha demostrado que está directamente involucrado en la patogénesis
de la caries dental. Sin embargo, utilizando sondas moleculares para la
identificación de genes específicos demuestran que los sujetos con
actividad de caries poseen una abundancia de especies como S.
mutans, lactobacillus y actinomices sp, en contraste con una disminución
de especies asociadas al estado de salud como S. parasanguis,
abiotrophia defectiva, gemella hemolysans, S. mitis/oralis y sanguis;
estas modificaciones en los componentes de la flora y el
microecosistema bucal, refleja lo complejo que es la valoración de la
actividad y el riesgo de desarrollo de caries dental (25)
1.3.2. Morfología
Streptococcus mutans es un estreptococo α-hemolítico o no hemolítico,
que se visualiza como bacilo cuando se aísla de un medio con pH ácido
y como cocácea cuando se sub-cultiva en un medio neutro o alcalino (a
lo que debe su nombre) (25)
1.3.3. Reproducción
La reproducción del S. mutans es asexual binaria (26).
1.3.4. Crecimiento
En general hay muchas dificultades técnicas para obtener muestras
representativas de diferentes sitios orales y para aislar, cultivar y contar los
microorganismos. No existe un solo método de cultivo para examinar la
variable y compleja placa dental que satisfaga todas las condiciones
necesarias. En algunos casos se requieren procedimientos estrictamente
anaeróbicos. Afortunadamente, muchas de las especies de estreptococos
orales pueden aislarse de varios sitios usando medios selectivos como el
Agar Mitis Salivarius (MS). Aunque el Agar MS fue originalmente
desarrollado para aislar enterococcus faecalis, su uso ha predominado
12
sobre otros medios de cultivo para el aislamiento de estreptococos orales,
incluyendo Streptococcus mutans. En el agar MS, muchos estreptococos
orales muestran una morfología característica de las colonias
(blanquecinas, de bordes definidos, colonias firmes muy adherentes al
medio de cultivo) lo cual permite su diferenciación inicial. Usualmente, la
placa de agar se cultiva en una atmosfera del 95% de nitrógeno y 5% de
dióxido de carbono a 37°C por 1 o 2 días seguida de una incubación en aire
por 1 o 2 días. Además de la morfología característica de las colonias, los
estreptococos orales pueden diferenciarse por su habilidad para fermentar
ciertos azucares (especialmente manitol y sorbitol) y por adherirse a
superficies lisas en presencia de sacarosa (27).
El cultivo en agar es considerado como el estándar de oro ya que permite
realizar recuentos bacterianos para establecer proporciones relativas,
mediante métodos cuantitativos en medios no selectivos. Actualmente hay
5 medios de cultivo diferentes para el aislamiento de Streptococcus mutans.
Estos son: Agar Mitis salivarius con bacitracina (MSB), Agar
Mitis Salivarius con bacitracina y kanamicina (MSKB) Agar glucosa-
sacarosa-telurito bacitracina (GSTB) Agar Tripticasa de soya con sacarosa
y bacitracina (TYS20B) y Agar triptona extracto de levadura cisteína con
sacarosa y bacitracina (TYCSB). El agar MS es el medio más ampliamente
usado para aislar S. mutans y otras especies orales de estreptococos. El
agar MS ha sido modificado para ser más selectivo en el aislamiento de
S. mutans adicionando tanta sulfonamida (Agar MC), bacitracina (Agar
MSB), polimixina o aun sacarosa (MS40S). Los métodos de recuento de
colonias permiten determinar el grado de colonización producida
por Streptococcus mutans según las edades, siendo de gran utilidad para
identificar la población de alto riesgo de caries dentales y su aplicación
permitiría desarrollar programas de prevención en salud oral en poblaciones
específicas y vulnerables (27).
13
1.3.5. Clasificación del Streptococcus Mutans
Con base en la composición y los enlaces de los polisacáridos de la pared
celular, estreptococos del grupo mutans se pueden clasificar en 8
serotipos: Streptococcus mutans (serotipos c, e, f y k), Streptococcus
sobrinus (serotipos d y g), Streptococcus cricetus (serotipo a),
Streptococcus rattus (serotipo b), Streptococcus ferus (serotipo c),
Streptococcus macacae (serotipo c) y Streptococcus downei (serotipo h).
Se sabe que el serotipo c de S mutans es el tipo predominante en la
cavidad oral humana más que las cepas e, d, f y k (27).
Los polisacáridos de la pared celular juegan un papel importante en la
colonización de sus nichos ecológicos. Las diferencias en las afinidades
para la unión de los antígenos de polisacáridos a los tejidos humanos
pueden ser la causa de esta distribución tan variada. Por otro lado, se cree
que el ancestro de S mutans haya sido el serotipo c y que las cepas f y e
pueden haberse originado por mutaciones del determinante del serotipo c
(27).
Previamente se ha clasificado en tres serotipos c, e y f debido a la diversa
composición química de los polisacáridos específicos de los serotipos los
cuales están compuestos por un esqueleto de ramnosa y cadenas laterales
de glucosa. Recientemente se designó una cepa de S. mutans con serotipo
no c/e/f como serotipo k el cual se caracteriza por una drástica reducción
en la cantidad de cadenas laterales de glucosa. Un rasgo biológico común
del serotipo k es su bajo nivel de cariogenicidad debido a las alteraciones
de varios de los mayores antígenos proteicos de superficie. En cuanto a la
virulencia en sangre, estas cepas sobreviven en la sangre por mayor
tiempo debido a su baja antigenicidad. Otros estudios revelan la
participación de este serotipo en la patogénesis de enfermedades
cardiovasculares, en la cuales se ha detectado su alta frecuencia (27).
14
1.3.6. Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans
en cavidad oral
La caries dental es una enfermedad dental transmisible en la cual los
Streptococos del grupo mutans juegan un papel principal. Como en muchas
enfermedades infecciosas, se requiere la colonización de un patógeno
antes de que ocurra la infección. Hay un rango de factores de virulencia
importante para el establecimiento de Streptococcus mutans en la compleja
comunidad microbiana de la biopelícula dental. Estudiar los factores de
virulencia de Streptococcus mutans y su correlación con la biodiversidad de
especies es fundamental para entender el papel que juega en la
colonización por los diferentes genotipos en el mismo individuo y la
expresión de las características que puedan o no influenciar su capacidad
de virulencia y su habilidad para sobrevivir bajo diferentes condiciones
ambientales. El papel de los estreptococos del grupo mutans,
especialmente Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus, en la
etiología de la caries dental ha sido extensamente investigado y claramente
demostrado. La evidencia indica que una forma importante de transmisión
de Streptococcus mutans durante los primeros años de vida es la que se
produce de madre a hijo por contacto directo (transmisión vertical),
mientras que el contacto con otros familiares, incluidos el padre, los
hermanos y demás posibles cuidadores constituye otra vía de transmisión
(transmisión horizontal) que cobra importancia durante edades posteriores.
Una característica importante de Streptococcus mutans es la persistencia
de sus genotipos en la cavidad oral de adultos, adolescentes y niños
mayores de cinco años. Este fenómeno es conocido como persistencia
“intraindividual” y revela la relativa estabilidad que estos alcanzan en un
hospedador y la relación con la expresión de características fenotípicas que
les pueden dar ventajas para la supervivencia, como la capacidad de
formar biopelículas, de adherirse y soportar fluctuaciones del pH. Se ha
considerado comúnmente que la colonización de la cavidad oral de los
niños por S. mutans (“ventana” de infección) ocurre al producirse la
erupción del primer diente, es decir, alrededor de los seis meses de edad.
Sin embargo, es lógico pensar que en niños expuestos a factores que
15
facilitan los procesos de transmisión, la colonización se produzca antes de
la aparición de los primeros dientes. Hay dos factores que sugieren que S.
mutans pueda aparecer durante la etapa predental: 1) Streptococcus
mutans y Streptococcus sobrinus son capaces de colonizar superficies
mucosas. 2) Algunos niños desarrollan lesiones de caries poco después de
la erupción dental. La colonización temprana de la cavidad oral (antes de la
erupción dental) por S. mutans puede aumentar el riesgo de caries y hacer
que su desarrollo se produzca a edades más tempranas (27).
Se han identificado unos 52 genotipos diferentes en niños, pero las madres
trasmiten cerca de 16 de ellos. Se observa una tendencia hacia la
estabilidad de los genotipos transmitidos por las madres, en parte, porque
la colonización del genotipo materno pueda interferir con la colonización de
otros genotipos. Se ha observado que los niños albergan de uno a cinco
genotipos diferentes de S. mutans en diferentes edades. La diversidad
genotípica de Streptococcus mutans en cuatro sitios de muestreo (saliva,
dorso de la lengua, mucosa alveolar y biopelícula dental) de niños parece
ser homogénea, sin embargo, la biopelícula dental es un lugar muy
importante dado el gran número de genotipos de Streptococcus mutans y
las cepas aisladas. Se ha demostrado un alto grado de homología entre
cepas de S. mutans recuperadas de miembros de la misma familia
indicando tanto la transmisión vertical y horizontal y una persistente
colonización de Streptococcus mutans adquiridos previamente hasta la
adultez temprana (27).
La colonización inicial por Streptococcus mutans fue investigada en un
estudio prospectivo de 46 niños estadounidenses desde el nacimiento a 5
años de la edad cuyas madres portaban altos niveles de Streptococcus
mutans. De aquel estudio, la ventana de infectividad fue definida como el
período a partir de 19 a 31 meses de edad, cuando el riesgo de adquisición
de Streptococcus mutans era alto (27).
16
1.3.7. Patogenicidad
Se ha demostrado que Streptococcus mutans está directamente
involucrado en la patogénesis de la caries dental. Sin embargo, utilizando
sondas moleculares para la identificación de genes específicos demuestran
que los sujetos con actividad de caries poseen una abundancia de
especies como además del S. mutans, el lactobacillus y actinomices sp, en
contraste con una disminución de especies asociadas al estado de salud
como S. parasanguis, abiotrophia defectiva, gemella hemolysans, S.
mitis/oralis y sanguis; estas modificaciones en los componentes de la flora
y el microecosistema bucal, reflejan lo complejo que es la valoración de la
actividad y el riesgo de desarrollo de caries dental (26).
1.3.8. Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana
La resistencia antimicrobiana de las bacterias ha devenido problema de
salud, tanto para los países del norte como para los del sur. Cuando se
desarrollaron por primera vez, los antibióticos fueron vistos como "balas
mágicas" que cambiarían radicalmente el tratamiento de la enfermedad
infecciosa. Desde la introducción de la penicilina en la terapéutica hace
más de 50 años, se inició una incesante búsqueda de nuevos compuestos
antibacterianos con el fin de erradicar las enfermedades infecciosas que
iban surgiendo. La mayoría de estas enfermedades se deben a infecciones
respiratorias agudas, enfermedades diarreicas, tuberculosis, paludismo,
sarampión y VIH/SIDA. La resistencia a los antimicrobianos amenaza
actualmente la capacidad existente de solucionar con eficacia por lo menos
4 de los procesos antes mencionados: las infecciones respiratorias agudas
(neumonía), las enfermedades diarreicas, el paludismo y la tuberculosis. En
algunas regiones del planeta, más de la mitad de todos los casos de
neumonía estreptocócica son resistentes a la penicilina. La eficacia de la
cloroquina, considerada como la piedra angular del tratamiento del
paludismo, hoy día es discutida en muchos países (28).
17
Sin dudas, el uso excesivo y con frecuencia empírico de los
antimicrobianos para el tratamiento de diferentes situaciones clínicas ha
conducido a modificaciones de la ecología bacteriana, lo que puede
determinar consecuencias fatales para la salud pública (28).
Las bacterias adquieren la capacidad de resistir la acción de los antibióticos
por medio de varios mecanismos como la variabilidad genética, la
modificación de la permeabilidad de la membrana interna, la extracción del
compuesto y la inhibición enzimática, así como por la modificación del
blanco ribosomal o la alteración de la composición y el contenido de
glicoproteínas de la pared bacteriana (28).
Esta resistencia es transmitida entre microorganismos de un mismo género
(transmisión horizontal) y entre microorganismos de géneros diferentes
(transmisión vertical). A todo lo anterior se adiciona el hecho de que se
dispone de escasos datos de susceptibilidad a los antibióticos y la
vigilancia de la resistencia no se lleva a cabo en todos los países (28).
1.3.9. Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus Mutans
Los estreptococos orales, normalmente no patógenos, son residentes de la
microflora humana; pero pueden actuar como “reservas genéticas” y
transferir genes de resistencia a las bacterias transitorias de la cavidad
oral, punto de entrada para una gran variedad de microorganismos (29)
Barrientos et al, realizaron un estudio con el propósito de establecer si la
prevalencia de resistencia a la amoxicilina de S. mutans varía según el
consumo o no de antibióticos β-lactámicos. Los resultados muestran que el
tratamiento con este tipo de antibióticos produce una baja sustancial en la
recuperación de cepas de S. mutans, lo que significa que continúa siendo
un tratamiento efectivo de la mayoría de infecciones odontogénicas y para
profilaxis de endocarditis; pero es evidente que producen un desequilibrio
en los ecosistemas orales. El grupo de pacientes en el que se encontró
menor frecuencia de aislamiento de cepas de S. mutans fue en quienes
reportaron uso de β-lactámicos durante más de tres semanas (46,4 %), lo
18
cual muestra el efecto de los antibióticos sistémicos sobre la flora
constitutiva de la cavidad oral, que podría generar la aparición de
infecciones oportunistas como la candidiasis. Cabe anotar que se debe
determinar si esta disminución es permanente o transitoria, dadas las altas
tasas de recambio bacteriano en el medio oral, ya que en la población
general es frecuente encontrar portadores de cepas de S. mutans
resistentes que pasarán inadvertidas mientras no se requiera el uso de
amoxicilina. En cuanto a la resistencia a penicilinas, en esta investigación
se encontró que el 4,4 % de los individuos eran portadores de cepas de S.
mutans resistentes a amoxicilina, lo que corresponde al 5,2 % de las cepas
aisladas. Estos resultados contrastan con diferentes investigaciones que
han evidenciado porcentajes de cepas resistentes de microrganismos
aerobios y anaerobios aisladas de infecciones orofaciales entre el 29 % y el
39 % —incluso a la amoxicilina con ácido clavulánico (12,16-19) —, lo que
indica que existen mecanismos diferentes a la producción de β-lactamasas.
En estreptococos obtenidos de infecciones odontogénicas agudas en
niños, el porcentaje de cepas del S. mutans resistentes a la amoxicilina se
encuentra en el 45 % con concentraciones inhibitorias mínimas superiores
a los 8 μg/ml, lo que evidencia que, independientemente de la edad, la
resistencia de S. mutans se asocia con la ingesta de antibióticos (29)
La resistencia a la penicilina (esto es, Concentración Mínima Inhibitoria –
CIM- > 4µg/mL) entre los streptococos mutans ha estado incrementándose
alrededor del mundo. La resistencia se debe a alteraciones en las proteínas
de unión a la penicilina (PBPs) (30)
1.3.10. Potencia o actividad antimicrobiana
Los productos naturales de las plantas pueden poseer una nueva fuente de
agentes antimicrobianos con un posible novedoso mecanismo de acción.
Son efectivos en el tratamiento de enfermedades infecciosas mitigando
muchos de los efectos colaterales que son frecuentemente asociados con
antimicrobianos convencionales (31)
19
1.3.11. Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales
Los ensayos antimicrobianos de los aceites esenciales son en la mayoría
de los casos realizados con un objetivo específico y/o aplicación en mente.
El seteo experimental debería ser hecho en vista de este objetivo, porque
mientras más cerca la situación experimental emule a la situación práctica,
más fuerte será su valor predictivo. Los aceites esenciales han sido
evaluados para los siguientes propósitos:
- Para monitorear aceites esenciales antimicrobianos o sus constituyentes;
- Para monitorear actividades antisépticas o desinfectantes;
- Para monitorear propiedades conservantes para alimentos.
- Para estudiar el posible rol de los aceites esenciales en las interacciones
biológicas.
- Para estudiar el posible uso de los aceites esenciales como agentes
terapéuticos (31)
1.3.12. Cepas Control
Para que los resultados del antibiograma de discos sean realmente
confiables es de primordial importancia, además de los aspectos técnicos,
introducir un control de calidad interno mediante el uso de cepas de control
(32)
1.4. Epígrafe IV. Métodos De Extracción En Fitoquímica
Al iniciar un estudio fitoquímico es necesario considerar qué tipo de
metabolitos es posible determinar en la especie a estudiar, y de manera
más específica la parte de la planta de la que se realizará la extracción.
La correcta selección de estos factores será importante al momento de
seleccionar el método de extracción. Una extracción realizada con
material seco y pulverizado permite una mayor permeabilidad del
solvente y de este modo existe un mayor rendimiento en la extracción.
Muchos compuestos permanecen intactos en la estructura de la planta,
20
sin embargo, en algunos estudios como aquellos relacionados con
aromas consideran la absoluta necesidad de la utilización de material
vegetal fresco. La polaridad de las sustancias a extraer determina el tipo
de solvente, por ende, si se desean extraer mayoritariamente
compuestos como esteroles, se requerirá utilizar un solvente como éter
de petróleo; el hexano permite una extracción de las cumarinas y para
los alcaloides primero se emplea alcohol etílico y posteriormente un
ácido diluido. El etanol es un solvente muy utilizado, permitiendo la
extracción de sustancias de todas las polaridades, además resulta
estable (poco reactivo), se evapora fácilmente y no es caro (33)
1.4.1. Extracción sólido-líquido
Es extraer un componente sólido con el contacto de un disolvente, en
fitoquímica la fase portadora sólida sería el material vegetal, y el
producto de esta extracción conocido como soluto sería el extracto
resultante de este disolvente (33)
1.4.2. Maceración
Se obtienen extractos gracias a un amplio tiempo de contacto que el
solvente debe tener con el material vegetal, el cual debe estar
pulverizado o molido para lograr una mayor superficie de contacto con el
solvente, todo esto a temperatura ambiente. Las agitaciones son
recomendables para la homogenización del producto y de este modo
influenciar el rendimiento de la extracción; el poder de extracción del
solvente se reducirá al pasar el tiempo de contacto con el material
vegetal; para este tipo de extractos es útil la protección del recipiente de
extracción de la luz solar, debido a la descomposición de sustancias
fotolábiles. Después de la filtración se requiere lavar el material vegetal
restante con más solvente para la obtención del extracto total (33)
1.4.3. Percolación o lixiviación
El disolvente pasa a temperatura ambiente por gravedad sin necesidad
de presión a través del material vegetal finamente molido, el paso
21
detenido del solvente por las partículas del sólido hace que disuelvan la
mayor cantidad de metabolitos que sean posibles y por la continua la
adición de solvente se logra una alta efectividad
1.4.4. Extracción líquido-líquido
La extracción líquido-líquido se basa en la transferencia de una o varias
sustancias desde una fase líquida a otra líquida que no puede mezclarse
con la primera sustancia. Esto sucede por el reparto entre las dos fases
de compuestos de diversas polaridades. Una fase suele ser acuosa y la
otra conocida llamada extractarte es orgánica, esta última es la que
transfiere los compuestos.
1.4.5. Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos, entre los cuales se encuentran los
flavonoides, presentan una amplia ubicuidad en la naturaleza. Son
responsables del buen funcionamiento de las plantas y, en su relación
con el hombre, son utilizados para tratar desordenes cardiovasculares y
prevenir algunos cánceres. Poseen una estructura química adecuada
para ejercer actividad antioxidante, la cual está íntimamente relacionada
con tales propiedades. Para su extracción se utilizan solventes polares
cuyo extracto posteriormente se concentra. Los compuestos fenólicos
constituyen una de las principales clases de metabolitos secundarios de
los vegetales, donde desempeñan diversas funciones fisiológicas
Los flavonoides, uno de los dos grandes grupos de compuestos
fenólicos junto con los ácidos fenólicos, son un grupo extenso de
compuestos derivados del benzo-γ-pirano. Dependiendo del grado de
oxidación y de sustitución del anillo pirano central pueden subdividirse
en flavonas, flavonoles, flavononas, isoflavonas, flavanos y antocianinas.
Está comprobado que los flavonoides son importantes para el desarrollo
y buen funcionamiento de las plantas al protegerlas contra agentes
agresores externos, como la radiación UV, microorganismos, animales
herbívoros y del medio ambiente (34)
22
1.4.5.1. Análisis de fenoles totales.
La concentración de fenoles totales en extractos fue medida por
espectrofotometría, basándose en una reacción colorimétrica de óxido-
reducción. El agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin-Ciocalteu
(38).
El ensayo Folin-Ciocalteu se utiliza como medida del contenido en
compuestos fenólicos totales en productos vegetales. Se basa en que
los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu,
a pH básico, dando lugar a una coloración azul susceptible de ser
determinada espectrofotométricamente a 765 nm. Este reactivo contiene
una mezcla de wolframato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico,
y reacciona con los compuestos fenólicos presentes en la muestra. El
ácido fosfomolibdotúngstico (formado por las dos sales en el medio
ácido), de color amarillo, al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar
a un complejo de color azul intenso (35)
El mecanismo de reacción es una reacción redox, por lo que además
puede considerarse también, como un método de medida de la actividad
antioxidante total. La oxidación de los polifenoles presentes en la
muestra, causa la aparición de una coloración azulada que presenta un
máximo de absorción a 765 nm, y que se cuantifica por
espectrofotometría en base a una recta patrón de ácido gálico (35)
1.4.5.2. Tamizaje fitoquímico
Con el propósito de sintetizar la amplia información referente al tamizaje
fitoquímico se ha elaborado la Tabla 4 que resumen los distintos
métodos que se emplean para la citada técnica.
23
1.5. Conclusiones del capítulo.
➢ El extracto de la Daucus carota presenta alto contenido de fenoles y
flavonoides con poder antioxidante.
➢ Los polifenoles pueden transformarse en una herramienta para sustituir
los antibióticos, suministrando un producto de origen natural inocuo para
la salud humana.
➢ El S mutans es una bacteria cariogénica que habita en el biofilm de la
cavidad bucal, y las cepas más frecuentes son e, d, f y k y su
colonización se da alrededor de los seis meses de edad en el primer
diente.
➢ El etanol es estable, adecuado y de fácil evaporación durante la
extracción de sustancias de diversas polaridades.
➢ El etanol atraviesa las membranas de las células de las muestras
orgánicas extrayendo así las moléculas polares.
24
CAPÍTULO II. MARCO METODOLÓGICO
2. Caracterización del sector
Este trabajo de investigación fue realizado bajo la modalidad cualitativa y
cuantitativa, siendo su diseño del tipo cuasi experimental, dado el alcance de la
misma.
Se realizó el estudio etnofarmacológico de plantas medicinales en el barrio
urbano de Bastión Popular es una cooperativa de vivienda de Guayaquil,
cuenta con una población total de 73.655 según el Instituto Nacional de
Estadisticas y Censo (INEC 2010)., siendo su temporada de cosecha el cuarto
trimestre del año, fueron adquiridas en el Mercado de Sauces 9, al Norte de la
ciudad; Guayaquil, es la ciudad más grande y habitada de Ecuador, está
ubicada a 4.0 msnm, localizada a una latitud y longitud: -79.9332613, -
2.0854446 respectivamente.
2.1. Descripción del proceso metodológico
Existen tres etapas para realizar la investigación:
• Estudios etnofarmacològico
• obtención del extracto etanólico y aceite esencial
• Procedimiento microbiológico para determinar el efecto antimicrobiano
de la zanahoria frente a S. mutans.
2.1.1. Etapa I: Estudio etnofarmacológico
2.1.1.1. Criterios de inclusión
o Grupo etario de 30 a 60 años de edad, madres de familia y
abuelas, conocedoras del uso ancestral de plantas para tratar
dolencias.
o Para las encuestas se incluyeron a personas oriundas o que
hubieran radicado en Bastión Popular por no menos de 5 años.
o Personas sin problemas mentales.
2.1.1.2. Criterios de exclusión
o Habitantes de otras zonas.
25
o Personas menores de edad.
o Personas con problemas mentales o discapacidades mentales
2.1.1.3. Materiales y métodos:
El presente trabajo de investigación es de tipo transversal y descriptivo,
después se realizó la aplicación de las encuestas etnofarmacológicas de
plantas medicinales en la ciudad de Guayaquil en el sector Bastión Popular. Es
descriptivo porque se describió la utilización de plantas medicinales por las
personas encuestadas y es transversal porque se estudia de forma simultánea
en un momento dado.
Las personas encuestadas fueron muestreadas por el método no probabilístico
del tipo cuotas, ya que tienen que cumplir con todos los criterios de inclusión.
En primer lugar, por medio de encuestas se verificará los usos potenciales de
la planta en base al conocimiento popular de los informantes.
Universo y muestra
El sector Bastión Popular de la ciudad de Guayaquil cuenta con un universo de
73.655 personas según el Instituto Nacional de Estadisticas y Censo (INEC
2010).
La utilizada fue una población 2450 personas que se ubican en un grupo etario
de mujeres de 30 a 60 años de edad, se aplica la siguiente ecuación:
𝑛 =𝑁𝑧2 𝑝𝑞
𝑑2 (𝑁 − 1) + 𝑧2 𝑝𝑞
Donde:
N= Tamaño de la población
Z = 1.96 para I.C. igual a 95%
E = d = Margen del error es el 5% que es igual a 0.05.
P = Proporción de ocurrencia del evento es el 50% que es igual a 0.5.
26
q = 1 - p = Proporción de no ocurrencia del evento
𝒏 = (2) 2450 (0.5)(0.5)
(0.1) 2 (2449 − 1) + (2)2 (0.5)(0.5)
𝒏 = 2450
20.79
El tamaño de la muestra es: 𝒏 = 96,1
Resultando la muestra 96 personas que serán encuestadas, se ubican en un
grupo etario de mujeres de 30 a 60 años de edad, madres de familia y abuelas,
conocedoras del uso ancestral de plantas para tratar dolencias.
2.1.2. Etapa II: Obtención de extracto y aceite esencial
2.1.2.1. Caracterización Botánica
Se realizó la identificación botánica de la Daucus carota en el Herbario de la
Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Guayaquil, anexo 2.
2.1.2.2. Criterios de inclusión:
• Todos los rizomas frescos, sin cortes, sin daños
2.1.2.3. Criterios de exclusión:
• Rizomas partidos, con daños de putrefacción, inmaduros
2.1.2.4. Materiales y métodos:
• Equipo de destilación por arrastre con vapor
• Balón de extracción
• Cilindros 250ml
• Balón 250 ml
• Rotavapor
27
La selección de la Daucus carota se lo hizo mediante un estudio
etnofarmacológico, utilizado las fórmulas de muestreo de una proporción,
índice de valor de uso (IVU) y nivel de uso significativo (UST).
2.1.3.4.1. Muestreo de una proporción
2.1.3.4.2. Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies.
Índice de valor de uso (IVU)
Para evaluar las preferencias del pueblo hacia las plantas utilizadas, se empleó
el concepto de Valor de Uso (Philips y Gentry, 1993). Esta valoración muestra la
cantidad de usos que se otorga a una determinada planta. La fórmula es la
siguiente:
𝑉𝑈𝑖𝑠 =𝛴𝑈𝑖𝑠
𝑁𝑖𝑠
Donde:
VUis= es el valor de uso atribuido a una especie particular (s) por un informante
(i)
Uis = número de usos mencionado por el informante.
Nis= número total de eventos.
Nivel de uso significativo
Para estimar el nivel de uso significativo para cada especie y verificar su
aceptación cultural, se utilizó la metodología propuesta por Germosén Robineau
(1995). Esta metodología, expresa que aquellos usos medicinales que son
citados con una frecuencia superior o igual al 20%, por las personas
encuestadas que usan plantas como primer recurso para un determinado
problema de salud, pueden considerarse significativos desde el punto de vista
de su aceptación cultural y, por lo tanto, merecen su evaluación y validación
científica. El UST se calcula dividiendo el número de citaciones de uso para
28
cada especie (s), entre el número de informantes encuestados, se propone la
siguiente ecuación:
𝐔𝐒𝐓 = 𝐔𝐬𝐨𝐄𝐬𝐩𝐞𝐜𝐢𝐞(𝐬) 𝟏𝟎𝟎 /𝐍𝐢𝐬
Donde:
Uso Especie (s) = número de citaciones para cada especie.
Nis = número de informantes encuestados.
2.1.2.5. Recolección y acondicionamiento de la materia prima vegetal.
Esta investigación será realizada en la ciudad de Guayaquil, Ecuador con la
muestra de zanahoria recolectada en los mercados del norte de la ciudad,
misma que es consumida como alimento, pero que no ha merecido la suficiente
atención como antimicrobiano. Se adquirieron 5 kilos de zanahoria (Daucus
carota) fresca en el mercado de Sauces 9 (Guayaquil-Ecuador).
2.1.2.6. Operaciones previas:
• Limpieza: Se eliminaron cuidadosamente las raíces y la tierra adherida,
se utilizó cuchillos de acero inoxidables de hoja roma con el fin de
separar también las raicillas (14)
• Preparación de la muestra: Se toman las zanahorias y son peladas y
cortadas en hojuelas de 1cm de espesor. Se almacena en refrigeración
hasta el siguiente proceso.
2.1.2.7. Material vegetal y obtención de los extractos.
Luego de la recolección de las zanahorias bajo el criterio de inclusión se
procedió a su secado a 40°C, posteriormente se trituraron manualmente hasta
lograr una cantidad de 72 g. Se da preferencia al uso de etanol como solvente
porque los compuestos alcohólicos rompen la membrana celular y pueden dar
lugar a la extracción de grandes cantidades de material endocelular
29
2.1.2.8. Extracto Etéreo
Pesar 25 g. de droga seca y molida y extraerlos con 200 ml de éter etílico por
maceración durante 48 horas. Se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y
pesar) (15)
2.1.2.9. Extracto Etanòlico
A la droga agotada con el éter etílico, extraer por maceración con etanol al 75%
(tres veces el peso del residuo en volumen) durante 48 horas se obtiene el
extracto y el residuo sólido (secar y pesar) (15)
2.1.2.10. Destilación por arrastre de vapor
Se toman 100g de zanahoria secada y triturada bajo criterios de inclusión. Se
conservan en refrigeración por un máximo de 2 horas, previo a la destilación.
Colocar en el balón A agua destilada, en el balón B la muestra, ensamblar el
equipo de destilación para arrastre de vapor y proceder a recoger el destilado,
verificar que el lugar tenga ventilación adecuada. Una vez colectado el líquido
que debe tener un color blanco lechoso, se procede a sangrarlo con Cloruro de
Sodio y extraerlo con cloroformo. Guardar el Aceite esencial obtenido en
frascos ámbar de tapa rosca. Repetir el procedimiento hasta agotar la muestra.
El proceso llevará alrededor de 3-5 días (35).
2.1.3. Pruebas analíticas
Para todas las pruebas analíticas se trabajaron las muestras por triplicado.
2.1.4. Humedad
Llevar al horno secador las zanahorias previamente trituradas para extraer la
humedad de las mismas a 60ºC durante 4 horas (14)
Porcentaje de humedad de la muestra:
% H = (p – p”)/ p x 100
p = peso inicial de la muestra
p”= peso final de la muestra
30
2.1.5. Cenizas totales
Con la ayuda de 2 crisoles previamente tarados, pesamos 2 gr. de muestra
vegetal seca y molida en cada crisol, y llevamos a la mufla por el lapso de 3
horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (14)
C=𝑀2−𝑀
𝑀1−𝑀𝑋100
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
2.1.5.1. Cenizas Totales en Agua
Pesar 2 g de muestra vegetal seca y molida en dos crisoles respectivamente,
llevar a la mufla por 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y
pesar (Guanoluisa, 2017).
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
C=𝑀2−𝑀
𝑀1−𝑀𝑋100
2.1.5.2. Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico.
En el crisol con ceniza colocar 2 mL de HCl al 10 %, tapar el crisol con papel
aluminio, poner agua a hervir previamente en un vaso de precipitación,
posteriormente procedemos a filtrar el contenido del crisol con papel filtro
tarado, con la ayuda del agua caliente realizamos varios enjuagues al papel
filtro con residuo descartando el líquido del filtrado, en la último enjuague
tomamos una muestra el líquido y le adicionamos 1 gota de HNO3 y de 1-2
gotas de AgNO3, si se obtuviese un color blanco en el líquido se procederá a
seguir los enjuagues del papel filtro con agua caliente hasta que el líquido al
adicionarle las gotas de reactivo no tomasen ningún color es decir queden
31
transparente. Luego de esto poner el papel filtro con residuo en el crisol
correspondiente para llevarlo a la mufla por 2 horas a 750 ºC (14).
2.1.6. Obtención del aceite esencial vegetal
Se procedió a realizar una Destilación por Arrastre de Vapor, se trataron los 5
kilos de zanahoria en un total de 5 días.
2.1.7. Preparación y Obtención de extractos
Estos se obtienen mediante la separación de porciones biológicamente activas
presentes en los tejidos de las plantas, con el uso de un solvente (alcohol,
agua, mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de extracción
adecuado (15)
2.1.4. Etapa III: Procedimiento microbiológico para determinar el efecto
antimicrobiano de la zanahoria frente a S. mutans
2.1.4.1. Cepa de microorganismo
Streptococcus mutans ATCC25175
2.1.4.2. Procedimiento Microbiológico
El estudio se realizará con cepas de bacterias de Streptococcus mutans (ATCC
25175), en las cuales no se ha evidenciado contacto alguno con bacterias o
solución antimicrobiana; la manipulación de las cepas se hará considerando las
respectivas medidas de Bioseguridad.
El aceite esencial y el extracto hidroalcohólico de Daucus Carota al 25%, 50%,
75% y 100% serán embebidos en discos blanco. Se conoce que con el control
positivo experimentalmente los halos se inhiben con una dispersión de
alrededor de 16 mm.
2.1.4.3. Evaluación de la actividad bacteriana del aceite y extracto
preparados con la técnica de difusión en disco.
Posterior a la selección de las concentraciones para el aceite esencial y los
extractos, se preparan inóculos bacterianos de Streptococcus mutans con un
32
criterio de sensibilidad positivo de difusión de 16 mm sembrado en cajas Petri
con agar Mueller Hinton. Se rotularán las placas indicando el número de
ensayo y la posición de los discos, así como también el control positivo (16).
Se harán cultivos bacterianos de Streptococcus mutans (ATCC 25175) usando
como medio el agar Mueller Hinton con 5% de sangre desfibrinada de oveja a
los cuales se les colocaron discos blanco embebidos con el aceite esencial y
extracto hidroalcohólico al 25%, 50%, 75% y 100% (16).
2.1.4.4. Materiales y métodos
Equipos, materiales, instrumentos y sustancias
Equipos
• Incubadora
• Autoclave
• Balanza de precisión
Materiales
• Discos: sensidiscos estériles
• Hisopos estériles
• Gasas
• Bioseguridad: Mascarilla, guantes, mandil
Instrumental
• Placas Petri
• Tubos de ensayo
• Mechero
• Varilla de vidrio
• Gradilla
33
• Pipetas
• Calibrador Vernier
Reactivos y muestras
• Extracto alcohólico al 75%
• Aceite esencial Daucus carota en emulsión de 25%, 50% y 75%
• Amoxicilina
• Agua destilada
• Agar sangre desfibrinada de cordero al 5%
• Agar Muller Hinton
• Alcohol antiséptico
• Cepa liofilizada de Streptococcus mutans ATCC 25175
2.1.4.5. Pruebas microbiológicas.
Se procede al cultivo de las cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 en
tubos de ensayo con tapa rosca que contienen el medio Soya Tripticasa,
procediéndose a incubarlos a 37°C y así de esta manera obtener colonias
jóvenes. Al cumplirse las 24 horas de cultivadas se agrega solución salina
estéril, hasta obtener una turbidez semejante al tubo número 1 de la escala de
Mac Farland. Es recomendable tratar de girar entre las manos los tubos que
contienen a la bacteria estudiada antes de proceder al sembrado, para distribuir
los microorganismos adecuadamente.
Para el método de difusión en disco, se sembró masivamente por triplicado las
cepas diluidas sobre el agar y los discos fueron colocados en la superficie,
impregnados con 0,2 mL de cada una de las diluciones de los aceites
esenciales y extractos (al 25%, 50%, 75% y 100%) usando agua destilada
como control negativo y Amoxicilina como control positivo. Se incubó a 37 ° C,
por 24 horas. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento de los
microorganismos fue medido para realizar el cálculo del porcentaje del efecto
inhibitorio relativo respecto al control positivo, utilizando para esto la siguiente
expresión (36).
34
% 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜 =𝑀𝑎𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑋 100
2.1.4.6. Diluciones del aceite esencial y extracto etanólico
Se realizaron las diluciones para el aceite esencial y extracto etanólico al 25%,
50%, 75% y 100%, aplicando la siguiente ecuación:
V1C1=V2C2
Tabla 1. Diluciones de Extracto etanólico de zanahoria (Daucus Carota)
ACEITE ESENCIAL/EXTRACTO
ETANOLICO
Volumen inicial mL
DILUCION
%
VOLUMEN DE DILUCIÓN
Ml
33.33 mL 25 8.33 mL
33.33 mL 50 16.66 mL
33.33 mL 75 24.99 mL
33.33mL 100 33.33 L
2.1.5. Conclusiones del capítulo.
1. La destilación por arrastre de vapor demuestra ser un método eficiente
dando como resultado un aceite esencial de alta pureza.
2. El etanol es un solvente muy utilizado, permitiendo la extracción de
sustancias de todas las polaridades, además resulta estable (poco
reactivo), se evapora fácilmente y no es caro.
3. El extracto etanólico de zanahoria por ser polar, favorecerá la
preparación de las diluciones para el procedimiento microbiológico.
4. El extracto etanólico será el vehículo de los polifenoles totales presentes
en la muestra.
5. La técnica de difusión de disco permite realizar una evaluación
microbiológica cuantitativa y puede jerarquizar la efectividad de un
producto antimicrobiano.
35
CAPÍTULO III. MARCO PROPOSITIVO
ESTUDIO ETNOFARMACOLÓGICO DE PLANTAS MEDICINALES
Las zanahorias se pueden consumir de muy diversas formas, Es un alimento
excelente desde el punto de vista nutricional gracias a su contenido en
vitaminas y minerales. El presente estudio etnofarmacológico fue realizado en
el sector Bastión Popular de la ciudad de Guayaquil. La muestra de
encuestados es de 96 personas se ubica en un grupo etareo que comprende
las edades de 30 a 60 años de edad, que incluyeron madres de familia y
abuelas, conocedores del uso ancestral de plantas para tratar dolencias.
GRAFICO 1. ¿CONOCE UD ALGUNA(S) PLANTA(S) UTILIZADA (S) CON
FINES MEDICINALES?
Fuente: Encuesta Etnofarmacologica Elaborado por el Autor
De acuerdo a la información recabada en una muestra de 96 personas
encuestadas, se pudo establecer que existe un grupo de alrededor de nueve
plantas de amplio uso por sus propiedades terapéuticas.
Así mismo, en la tabla del uso de la planta medicinal que se encuentra a
continuación se aprecia que la Zanahoria es una de las plantas cuya raíz se
usa para tratamientos direccionados a mejorar el cutis, en caso de que en el
rostro se presenten lesiones por acné, patología que suele estar asociada con
infecciones microbianas.
0102030405060708090
100
PLANTAS MEDICINALES
36
Tabla 2. ¿LA (S) HA UTILIZADO UD ALGUNA VEZ? ¿PARA QUÉ?
PLANTA
MEDICINAL
SI/NO INDICACIÓN
ALBAHACA SI CÓLICO MENSTRUAL, INFLAMACION VIENTRE
COLA DE CABALLO
SI CISTITIS, CÁLCULO RENAL
ESTEVIA SI ENDULZANTE NATURAL, DIABETES
EUCALIPTO SI BRONQUITIS, PROBLEMAS RESPIRATORIOS
HIERBA BUENA SI CÓLICO MENSTRUAL, NERVIOS
LLANTÉN SI CISTITIS
MANZANILLA SI DOLOR ESTÓMAGO, INFLAMACIÓN, INSONMIO
ORÉGANO SI CÓLICO DE GASES
PELUSA DE CHOCLO
SI CISTITIS, CÁLCULOS RENALES
ROMERO SI CAIDA DE CABELLO, PROBLEMAS DIGESTIVOS
RUDA SI DESINFLAMATORIO, CÓLICOS DE GASES, INFECCIONES
SÁBILA SI QUEMADURAS, CÁNCER
VETERABA SI ANEMIA
ZANAHORIA SI PROBLEMAS DE VISIÓN, PIEL, ACNÉ
Fuente. Autor
37
Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies.
• Índice de valor de uso (IVU)
La fórmula es la siguiente:
𝑉𝑈𝑖𝑠 =𝛴𝑈𝑖𝑠
𝑁𝑖𝑠
𝑉𝑈𝑖𝑠 =3
96= 0.03
• Nivel de uso significativo (UST)
𝐔𝐒𝐓 = 𝐔𝐬𝐨𝐄𝐬𝐩𝐞𝐜𝐢𝐞(𝐬) 𝟏𝟎𝟎 /𝐍𝐢𝐬
UST= 48* 100/96
UST= 50
Aplicada las ecuaciones del muestreo de una población se obtuvo el 96, el
índice de valor de uso dio 0,03% y un nivel de usó significativo de 50 %. Estos
resultados determinan que la zanahoria está óptimo como muestra para
continuar con los estudios de sus metabolitos secundarios y cumple con la
aceptación cultural para ser utilizado como tratamiento en los problemas de
salud en la población.
38
TABLA 3. INFORMACIÓN ETNOFARMACOLÓGICA DE ZANAHORIA
ZANAHORIA Daucus carota
¿Quién se
la indicó o
sugirió su
uso?
¿En qué
forma la ha
utilizado?
(Modo de
Uso)
Parte
Utilizada
¿Cómo la
preparó?
¿Dónde
encuentra
Ud. las
plantas?
¿Durante qué tiempo
la utilizó? (Duración
del tratamiento)
¿Qué
resultado
obtuvo
con su
empleo?
¿La ha
consumido
sola o
conjuntamen-
te con otras
sustancias?
¿Conoce Ud si esa
planta se ha
estudiado
científicamente?
SI …..( 83)
No …( 13)
¿Por qué vía llegó la
información de
dicho(s) estudio (s)?
¿Conoce
alguna
precaución
que
debe
tomarse
durante
el
tratamiento?
¿En qué
personas
las ha
usado?
Familiares Mascarilla
(acné)
Alimento
crudo y
cocido
Raíz,
sin piel
Como
mascarilla y
aplicar en
rostro por 20
minutos.
Como
ensaladas
crudas o
cocidas,
sopas, arroz
Compra.
En tienda
de
abastos y
mercados
Un
día
Menos
de una
semana
Un
mes
Mejoró Sola. televisión
Internet,
con
ayuda de
terceros
No
exponerse al
sol
En
Niños
Adultos
Ancianos
96 48
96
96 48
96
96 40 35 21 40 96 65 18 45 96
96
96
Fuente. Encuesta Etnofarmacològica Elaborado por: Paul Tumbaco L.
39
De la información recabada en la tabla se puede apreciar que la zanahoria
forma parte de la medicina natural en Ecuador, pero es obvio que aún es bajo
su uso como un antimicrobiano que ayude al control de las lesiones causadas
por acné. Es de fácil adquisición en los centros de abastos, además, el tiempo
que duró el tratamiento es amplio, desde un día hasta un mes, pero en todos
los casos se apreció mejora de la condición, pero no cura total. No se
consumió ni aplicó ningún tratamiento conjunto.
La información es trasmitida de generación en generación, aunque los
encuestados afirman que en los tiempos actuales se ha formalizado dicha
información con estudios científicos de los cuales han tenido conocimiento por
medio de informes en programas de Televisión, y otros por medio de Internet,
con ayuda de terceras personas en el manejo de la tecnología.
El uso de la zanahoria como medicina natural varía según su indicación, ya sea
para tratar afecciones de la piel, donde prevalece su uso en adolescentes;
mientras que en el caso de proveedor de Vitamina A, el consumo es general.
3.1. ANÁLISIS DE RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS.
Se determinó el efecto inhibidor del aceite esencial y extracto etanólico de
Daucus Carota al 25%,50%,75% y 100%, sobre el crecimiento in vitro de
Streptococcus Mutans, realizando un análisis estadístico de los datos mediante
la aplicación de a prueba estadística de ANOVA de dos vías (two way-ANOVA)
Por cada dilución bacteriana de Streptococcus mutans se utilizaron 3 placas de
agar Mueller Hinton con sangre desfibrinada de oveja al 5%, se aplicaron los
discos previamente impregnado con el aceite esencial y extracto etanólico de
Daucus Carota, para una posterior incubación a temperatura de 37 ° C. A las
18 horas se leyeron los halos de inhibición, verificándose el nivel de inhibición
de la cepa de Streptococcus mutans con el aceite y el extracto al 25%, 50%,
75% y 100%. La determinación de los intervalos en milímetro de los halos de
inhibición de crecimiento de microorganismos fue determinada por medio la
escala de Duraffourd que demuestra la sensibilidad de la bacteria frente al
aceite esencial y extracto etanólico.
40
Tabla 4. Escala de Durafford
Nula si es inferior a 8 mm
Sensible de 8 - 14 mm
Sensibilidad mediana de 14 - 20 mm
Sumamente sensible superior a 20
mm
Realizándose así las siguientes tablas correspondientes al aceite esencial y
extracto etanólico de Daucus Carota.
41
Tabla 5. Promedios de halos de inhibición del S mutans frente al aceite esencial de Daucus carota
HALOS DE INHIBICIÓN (mm)
TOTAL
PROMEDIO
MÍNIMO
MÁXIMO
MEDIANA
DESVIACIÓN
ESTÁNDAR CONCENTRACIÓN % P1 P2 P3
CONTROL
BLANCO
CONTROL
POSITIVO
25 7 6 6 0 16 19 6,33 6 7 6 0,577
50 9 7 7 0 16 23 7,67 7 9 7 1,155
75 11 9 10 0 16 30 10,00 9 11 10 1,000
100 12 10 12 0 16 34 11,33 10 12 12 1,155
En la tabla 5 se muestra la media de los resultados obtenidos de halos de inhibición para Streptococcus mutans frente a Daucus
carota se obtiene como promedio los halos de inhibición correspondientes a las concentraciones de 6.33mm (25%), 7.67mm
(50%), 10mm (75%) y 11.33mm (100%), por lo que su desviación estándar se conservó en 0.557 al 25%, 1.155 al 50%, 1 al 75% y
1.155 al 100%.
42
Tabla 6. Promedios de halos de inhibición del S mutans frente al extracto alcohólico de Daucus carota
HALOS DE INHIBICIÓN
(mm)
TOTAL
PROMEDIO
MÍNIMO
MÁXIMO
MEDIANA
DESVIACIÓN
ESTÁNDAR CONCENTRACIÓN % P1 P2 P3
CONTROL
BLANCO
CONTROL
POSITIVO
25 8 7 7 0 16 22 7,33 7 8 7 0,577
50 10 8 8 0 16 26 8,67 8 10 8 1,155
75 12 10 11 0 16 33 11,00 10 12 11 1,000
100 13 11 13 0 16 37 12,33 11 13 13 1,155
En la tabla 6 se muestra la media de los resultados obtenidos de halos de inhibición para Streptococcus mutans, frente al extracto
alcohólico de Daucus carota se obtiene como promedio 7.33mm (25%), 8.67mm (50%), 11mm (75%) y 12.33mm (100%), Por lo
que su desviación estándar se conservó en 0.557 al 25%, 1.155 al 50%, 1 al 75% y 1.155 al 100%.
43
Tabla 7. Comparación de control positivo versus los tratamientos con las
distintas diluciones del aceite esencial.
Bonferroni's multiple
comparisons test
Mean
Diff,
95,00% CI of
diff,
Adjusted P
Value
Control (Amoxicilina) vs. T1 (25%) 9,333 6,025 to 12,64 0,0064
Control (Amoxicilina) vs. T2 (50%) 8 2,27 to 13,73 0,0258
Control (Amoxicilina) vs. T3 (75%) 5,667 2,358 to 8,975 0,0172
Control (Amoxicilina) vs. T4
(100%) 4,333 1,025 to 7,642 0,0293
Control (Amoxicilina) vs. Blanco 15,39 12,08 to 18,7 0,0023
En este análisis se buscó comparar el control positivo (amoxicilina); frente a las
distintas diluciones del aceite esencial (25%,50%, 75% y 100%), con el
propósito de evaluar si existe diferencia estadística. El análisis estadístico
llevado a cabo a partir de los datos obtenidos en la experimentación in vitro se
muestra en la tabla 7. Determina que existe diferencia estadística al 25% y en
blanco con valor de p <0,0023.
Tabla 8. Comparación de efectos entre todos los tratamientos empleados en
los ensayos experimentales.
Tukey's multiple comparisons
test
Mean
Diff,
95,00% CI of
diff,
Adjusted P
Value
Control (Amoxicilina) vs. T1
(25%) 9,333 9,193 to 9,474 <0,0001
Control (Amoxicilina) vs. T2
(50%) 8 7,859 to 8,141 <0,0001
Control (Amoxicilina) vs. T3
(75%) 5,667 5,526 to 5,807 <0,0001
44
Control (Amoxicilina) vs. T4
(100%) 4,333 4,193 to 4,474 <0,0001
T1 (25%) vs. T2 (50%) -1,333 -1,474 to -
1,193 <0,0001
T1 (25%) vs. T3 (75%) -3,667 -3,807 to -
3,526 <0,0001
T1 (25%) vs. T4 (100%) -5 -5,141 to -
4,859 <0,0001
T2 (50%) vs. T3 (75%) -2,333 -2,474 to -
2,193 <0,0001
T2 (50%) vs. T4 (100%) -3,667 -3,807 to -
3,526 <0,0001
T3 (75%) vs. T4 (100%) -1,333 -1,474 to -
1,193 <0,0001
Se buscó comparar las diferencias entre cada uno de los tratamientos
aplicados en los ensayos experimentales. Los resultados de este análisis se
pueden observar en la tabla 8, del mismo modo fue observada esa
significancia estadística con el p<0.001.
45
Gráfico 2. Muestra el efecto de los distintos tratamientos empleados y la
significancia estadística encontrada a partir de los análisis.
En el grafico 2 se concluye indicando que el aceite esencial de Daucus carota
en sus diferentes concentraciones, los halos de inhibición de crecimiento no
son mayores al control positivo. Acorde a la escala de Duraffourd el aceite
esencial en sus concentraciones 25% y 50 % presentaron sensibilidad nula; y
en las concentraciones al 75% y 100% resultaron ser sensibles para las cepas
de Streptococcus mutans.
46
Tabla 9. Comparación de control positivo versus los tratamientos con las
distintas diluciones del extracto etanólico
Bonferroni's multiple comparisons
test
Mean
Diff,
95,00% CI of
diff,
Adjusted P
Value
Control (Amoxicilina) vs. T1 (25%) 8,417 5,435 to 11,4 0,0064
Control (Amoxicilina) vs. T2 (50%) 7 1,27 to 12,73 0,0337
Control (Amoxicilina) vs. T3 (75%) 4,667 1,358 to 7,975 0,0253
Control (Amoxicilina) vs. T4 (100%) 3,333 0,02505 to 6,642 0,0493
Control (Amoxicilina) vs. Blanco 15,39 12,08 to 18,7 0,0023
Por otra parte, en este análisis se buscó comparar el control positivo
(amoxicilina); frente a las distintas diluciones del extracto etanólico (25%,50%,
75% y 100%), con el propósito de evaluar si existe diferencia estadística o
similitudes. El análisis estadístico llevado a cabo a partir de los datos obtenidos
en la experimentación in vitro se muestra en la tabla 9. Determina que existe
diferencia estadística al 25% y en blanco con valor de p <0,0023.
Tabla 10. Comparación de efectos entre todos los tratamientos empleados en
los ensayos experimentales.
Tukey's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Adjusted P Value
Control (Amoxicilina) vs. T1 (25%) 8,417 8,213 to 8,62 <0,0001
Control (Amoxicilina) vs. T2 (50%) 7 6,797 to 7,203 <0,0001
Control (Amoxicilina) vs. T3 (75%) 4,667 4,463 to 4,87 <0,0001
Control (Amoxicilina) vs. T4 (100%) 3,333 3,13 to 3,537 <0,0001
T1 (25%) vs. T2 (50%) -1,417 -1,62 to -1,213 <0,0001
T1 (25%) vs. T3 (75%) -3,75 -3,953 to -3,547 <0,0001
T1 (25%) vs. T4 (100%) -5,083 -5,287 to -4,88 <0,0001
T2 (50%) vs. T3 (75%) -2,333 -2,537 to -2,13 <0,0001
T2 (50%) vs. T4 (100%) -3,667 -3,87 to -3,463 <0,0001
T3 (75%) vs. T4 (100%) -1,333 -1,537 to -1,13 <0,0001
47
Mediante ensayos posteriores se buscó comparar las diferencias entre cada
uno de los tratamientos aplicados en los ensayos experimentales. Los
resultados de este análisis se pueden observar en la tabla 10, del mismo modo
fue observada esa significancia estadística con el p<0.001.
Gráfico 3. Muestra el efecto de los distintos tratamientos empleados y la
significancia estadística encontrada a partir de los análisis.
48
En el gráfico 3 se concluye indicando que el extracto Etanólico de Daucus
carota en sus diferentes concentraciones, los halos de inhibición de crecimiento
no son mayores al control positivo. Acorde a la escala de Duraffourd el extracto
etanólico en sus concentraciones 25% presentaron sensibilidad nula; y en las
concentraciones al 50%,75% y 100% resultaron ser sensibles para las cepas
de Streptococcus mutans.
49
3.2. Conclusiones del capítulo
1. De acuerdo al estudio etnofarmacológico se concluye que el nivel de uso
significativo fue del 50 % en la zanahoria (Daucus carota) y un índice de
valor de uso de 0,03%, lo cual cumple con aceptación cultural para ser
utilizado como tratamiento en los problemas de salud en la población.
2. La presente investigación demostró que el Daucus carota presenta alto
contenido de fenoles y flavonoides con valioso poder antioxidante, cuyas
propiedades medicinales son desconocidas en la población.
3. Las concentraciones al 100% de aceite esencial y extracto etanólico
presentaron un mayor halo de inhibición, obteniéndose valores de 11,33
mm y 12,33 mm respectivamente.
50
CONCLUSIONES GENERALES
• La presente encuesta fue aplicada en la ciudad de Guayaquil en el
sector de Bastión popular con una población de 2450 personas, dando
como resultado un tamaño de muestra de 96 personas, sobre el uso de
plantas medicinales. Entre ellas, Daucus carota obtuvo un nivel de uso
significativo del 50 % y un índice de valor de uso igual a 0.03%, lo cual
cumple con la aceptación cultural para ser utilizado como tratamiento en
los problemas de salud en la población.
• La zanahoria dentro de los parámetros físicos químicos es abundante en
alcaloides, carbohidratos, ácido clorogénico, flavonoides, fenoles,
aceites esenciales, terpenoides y cumarina.
• Acorde a la escala de Duraffourd el aceite esencial es sus
concentraciones al 25% y 50%; y el extracto etanólico en su
concentración al 25% presentaron sensibilidad nula para la cepa
Streptococcus mutans.
• De acuerdo a la escala de Duraffourd el aceite esencial al 75% y 100%,
y el extracto etanólico al 50%, 75% y 100% resultaron ser sensibles para
la cepa de Streptococcus mutans.
• Los efectos antimicrobianos sobre Streptococcus mutans presentados
tienen orígenes diferentes, por un lado, el aceite esencial de la
zanahoria debe su comportamiento a los terpenoides, mientras que el
extracto etanólico debe su actividad antimicrobiana a los polifenoles.
• El análisis estadístico ANOVA determinó que existen diferencias
significativas entre los valores promedio de los halos de inhibición, con
un valor de P= ˂0.0001 para el extracto y el aceite esencial, por lo tanto,
se confirma que el aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota
a diferentes concentraciones tiene efecto antimicrobiano frente al
Streptococcus mutans.
51
RECOMENDACIONES
1. Realizar una valoración completa de los compuestos presentes tanto en
el aceite esencial como el extracto etanólico de zanahoria
2. Determinar las moléculas de activo comportamiento antimicrobiano
3. Realizar un estudio comparativo de la efectividad antimicrobiana de
otros extractos, por ejemplo, acuoso y metanólico.
4. Determinar las concentraciones tolerantes en un fitofármaco para
humanos.
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ANEXOS
Anexo 1. CUESTIONARIO ETNOFARMACOLÓGICO
La Universidad Regional Autónoma de los Andes (UNIANDES), se encuentra
desarrollando un proceso de investigación sobre el uso tradicional de las
plantas medicinales por la población ecuatoriana, es por ello que, teniendo en
cuenta la experiencia acumulada por usted al respecto le solicitamos su valiosa
cooperación, la cual se materializará llenando el siguiente cuestionario.
1.- ¿Conoce Ud. alguna(s) planta(s) utilizada(s) con fines medicinales?
Si: __ No: __ ¿Cuáles? _________________, _______________,
_________________
__________________, ______________________, _________________,
___________________,
2.- ¿La(s) ha utilizado Ud. alguna vez? ¿Para qué? (Indicación) Si: __ No:
__
Nombre de la Planta Indicación o Uso
a) a)
b) b)
c) c)
d) d)
3.- ¿Quién se la indicó o le sugirió su uso?
a) Médico___ b) Curandero ___ c) Familiares ___ d) Vecinos o amigos ___
4.- ¿En qué forma la ha utilizado? (Modo de uso)
a) ___Infusión b) ___Cocimiento c) ___Planta cruda d)
___Otra forma ¿Cuál? ________________________
5.- ¿Cómo la preparó? (Describa el modo de preparación del remedio
especificando la parte de la planta empleada: hojas, tallo, raíces, flores,
frutos.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
__________________________________
6.- ¿Dónde encuentra Ud. las plantas?
a) ___ El patio b) ___ Fuera de la casa c) ___ Las compra.
¿Dispone de un ejemplar a su alcance? Si: ___ No ___ (Recolectar
muestra).
7.- ¿Durante qué tiempo la utilizó? (Duración del tratamiento)
a) ___ Un día b) ___ Menos de una semana c) ___ Más de una semana
d) ___ Un mes e) ___ Varios meses f) ___ Un año g) ___ Más de un año
8.- ¿Qué resultados obtuvo con su empleo?
a) ___ Mejoró b) ___ No mejoró c) ____ Empeoró
9.- ¿La ha consumido sola o conjuntamente con otras sustancias? En el
caso de que la haya consumido con otras sustancias responda:
Con medicamentos ¿cuáles? __________________, ___________________,
__________________
Con otras plantas medicinales ¿cuáles? _______________,
________________, _______________
10.- ¿Conoce Ud si esa planta se ha estudiado científicamente? Si: __ No:
__
¿Por qué vía le llegó la información de dicho(s) estudios (s)?
a) ___La radio b) ___T.V c) ___ Libros, revista, periódico d) ___ Internet
11.- ¿Conoce alguna precaución que debe tomarse durante el
tratamiento? (Contraindicaciones) Si: ___ No: ___ ¿Cuál
(s)?______________, _____________, _____________
12.- En qué personas las ha usado:
En niños: ___
En adultos: ___
En ancianos: ___
OBSERVACIONES:
ANEXO 2
Caracterización Botánica De La Zanahoria
Fuente: Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Naturales Elaborado por : el autor
Fuente: Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Naturales Elaborado por: el autor
ANEXO 3
Certificación Extracto Etanólico De Zanahoria
Fuente: Laboratorios UBA Elaborado por: el autor
